CN1578839B - 调节酒酵母中的尿素降解 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了转化的酵母菌株，其中，所述转化降低发酵条件下酵母菌株表达的编码尿素降解酶活性的基因的氮分解代谢物抑制。例如，提供具有在酒发酵条件下增强的DUR1，2脲羧化酶-脲基甲酸酯水解酶活性的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)菌株。

Description

调节酒酵母中的尿素降解
技术领域
本发明是微生物生物化学领域。在一方面，本发明涉及对参与生物体中氮分解代谢的生物化学途径的操作，所述生物体具有发酵碳水化合物以产生乙醇的能力。在选定的实施方式中，本发明涉及用于产生酒和其它发酵产物的培养物和方法。
背景技术
精氨酸是葡萄汁中存在的主要氨基酸之一(Henschke和Jiranek，1993)。精氨酸被认为通过GAP1基因编码的普通氨基酸通透酶(Jauniaux和Grenson，1990)或通过CAN1基因编码的精氨酸通透酶(Hoffmann，1985)转运到酵母细胞中。在酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中，据报道通过CAR1基因产物，即，精氨酸酶将精氨酸降解为尿素和鸟氨酸(Middelhoven，1964；Sumrada和Cooper，1982)。
DUR1，2基因编码双功能酶，脲羧化酶-脲基甲酸酯水解酶(Dur1，2；脲酰胺裂解酶)，该酶可以将尿素降解为氨和CO2。在来源于绿藻的酶中单独地编码脲羧化酶功能，其催化反应：ATP+尿素+CO2＝ADP+磷酸+尿素-1-羧酸(EC 6.3.4.6；***名称：尿素：二氧化碳连接酶(ADP-形成)；其它名称：脲酶(ATP-水解)；脲羧化酶(水解)；ATP-脲酰胺裂解酶；CAS登记号：9058-98-4；Roon等，1970；Roon和Levenberg，1972；Sumrada和Cooper，1982)。在来源于绿藻的酶中也单独地编码脲基甲酸酯水解酶功能，其催化反应：尿素-1-羧酸+H2O＝2CO2+2NH3(EC 3.5.1.54；***名称：尿素-1-羧酸酰胺水解酶；其它名称：脲基甲酸酯裂解酶；CAS登记号：79121-96-3；Maitz等，1982；Roon，等.，1972；Sumrada和Cooper，1982)。
在酿酒酵母(S。cerevisiae)中，通过葡萄汁中存在的优选氮源，DUR1，2基因受到氮分解代谢物抑制(Nitrogen eatabolite repression，NCR)(Genbauffe和Cooper，1991)。没有降解的尿素可以通过酵母细胞分泌到发酵的葡萄汁中。分泌的尿素可以与葡萄汁中的乙醇反应以形成氨基甲酸乙酯，已经证明氨基甲酸乙酯可以在各种试验动物中引起各种良性和恶性肿瘤(Mirvisch，1968)，因此可以认为它是人类健康的潜在威胁。
发明概述
一方面，本发明涉及如下认识：在发酵的葡萄汁、酒或蒸馏酒精饮料中，尿素浓度可以通过调节酿酒酵母(S.cerevisiae)中编码脲羧化酶和脲基甲酸酯水解酶活性的DUR1，2基因的氮分解代谢物抑制来控制。因此，在一方面，本发明提供了转化的酵母菌株，所述转化导致可以降低发酵条件下酵母菌株表达的编码尿素降解酶活性的基因的氮分解代谢物抑制。例如，可以用包含编码尿素降解酶活性的编码序列的重组核酸或者用适应于在发酵条件下介导尿素降解酶活性表达的启动子转化酵母菌株。在一些实施方式中，本发明利用了与酿酒酵母(S.cerevisiae)DUR1，2启动子及编码序列同源的天然或修饰的序列。本发明的酵母菌株和核酸可以例如，用在生产发酵的酒精饮料，如酒和其它发酵产品的方法中。
附图的简要说明
图1显示DURI，2基因的上游区域，该上游区域结束于DUR1，2编码序列的起始处。图中信息来源于公开的酿酒酵母(S.cerevisiae)染色体II的完整染色体序列(Genbank LOCUS NC_001134，ACCESSION NC_001134，REGION：complement(635670..643177)，VERSION NC_001134.2，G1：14270686；Feldmann，H.，Aigle，M.，Aljinovic，G.，Andre，B.，Baclet，M.C.，Barthe，C.，Baur，A.，Becam，A.M.，Biteau，N.，Boles，E.等，″酵母染色体II的完整DNA序列，″EMBO J.13(24)，5795-5809(1994)；Goffeau，A.，Barrel，B.G.，Bussey，H.，Davis，R.W.，Dujon，B.，Feldmann，H.，Galibert，F.，Hoheisel，J.D.，Jacq，C.，Johnston，M.，Louis，E.J.，Mewes，H.W.，Murakami，Y.，Philippsen，P.，Tettelin，H.和Oliver，S.G.，″具有6000个基因的生命，″Science 274(5287)，546(1996))。
图2显示了DUR1，2基因上游区域的部分序列，其在DUR1，2起始密码子ATG处终止。突出显示了两个推定的NCR元件GATAA(G)盒子(一个盒子在-54到-58位置，另一个盒子在-320到-324位置)及推定的TATAA盒子。
图3显示在用DUR1，2表达盒子基因工程改造的酵母中DUR1，2转录和翻译的上调。(A)利用α32P-dATP标记的DUR1，2探针，通过总RNA的Northern分析比较含有(泳道2)或缺乏(泳道1)DUR1，2cDNA的转化GVY400细胞中DUR1，2的表达。编码组蛋白4的HHFI用作RNA上样标准。(B)通过从转化体提取的总蛋白质中存在的生物素化蛋白质的Western印迹，观察在含有(泳道3)或缺乏(泳道2)DUR1，2cDNA的转化GVY400细胞中尿素酰胺裂解酶的表达。利用与辣根过氧化物酶偶联的链霉抗生物素蛋白，通过化学发光，在X-射线胶片上进行检测。将高分子量生物素化标准品(每泳道5μg)包含作为分子量标准参照物(泳道1)。
图4是根据DI/TRISEC方法(Dietmaler和Fabry，1995)，克隆DUR1，2基因到pHVX2质粒中以产生PJC1的策略示意图。根据标准方法(Ausubel等，1995)，从酿酒酵母(S.cerevisiae)TCY1制备获得基因组DNA。利用ExTaq(Takara)DNA聚合酶，通过PCR扩增DUR1，2基因的编码序列。
所用的引物是：
对于基因5′末端：5TTAAAAAAATGACAGTTAGTTCCGATACA 3′，和
对于基因3′末端：5TCGAAAAAGGTATTTCATGCCAATGTTATGAC 3′
黑体字指明起始密码子和终止密码子的互补序列。用T4 DNA聚合酶处理扩增产物以除去3’侧翼末端的一些核苷酸。当需要时，通过添加足够的核苷酸终止酶的3′-5′外切核酸酶活性。通过EcoR1和BgIIII限制酶切割质粒pHVX2(VolschenK等，1997)，然后用大肠杆菌(E.coli)聚合酶I的Klenow片段处理。在dATP和dGTP存在的情况下部分补平限制性位点以有和***克隆相匹配的序列。
图5是将腐草霉素抗性基因盒子克隆到含有DUR1，2基因的pJC1(标注的pHVX2或pRUR1，2)中的示意图。利用标准重组方法构建pJC2(标注的pHVX2phleo或pDUR1，2phleo)(Ausubel等，1995)。
图6是质粒pJC2/DUR1，2phleo(在图中标注为pDUR1，2phleo)的示意图，其是来源于pJC2phleo载体的多拷贝游离型酿酒酵母-大肠杆菌(S.cerevisiae-E.coli)穿梭质粒，其中DUR1，2基因插在酵母磷酸甘油酸激酶(PGK1)基因的调节序列(启动子和终止子序列)之间。LEU2标记有利于亮氨酸营养缺陷型转化酵母细胞的筛选。质粒也含有组成型TEF1酵母启动子和CYC1酵母终止子驱动的Tn5B1e基因。带有这种盒子的酵母细胞变得对腐草霉素有抗性。这种阳性筛选标记可能特别适合于与不带有营养缺陷型标记的工业转化酵母菌株一起应用。
图7是表示本发明转化酵母降低培养基中尿素浓度的能力的图示。用pJC2/DUR1，2phleo质粒或者没有DUR1，2基因的pJC2phleo质粒转化DUR1，2染色体座位被破坏的单倍体实验室酵母菌株。这种突变菌株的应用允许在缺少由于尿素酰胺裂解酶内源活性导致的背景的情况下评估此菌株的性能。在含有0.1％谷氨酰胺的基本培养基中生长转化细胞，收获并用于接种新鲜培养基。1小时后，添加33mg/L的尿素。每隔2小时收获等份的培养物，在有玻璃珠的培养基中破坏打开细胞，通过离心除去细胞碎片。一旦收集上清液后，加热使酶失活，测定样品中存在的尿素。该方法有利于同时测定细胞内和细胞外的尿素，从而允许区分细胞摄取的尿素和细胞代谢的尿素。此外，有规律地测定600nm吸收值以检查每个培养物的生长阶段。标准差n＝6。用实心圆形表示的数据是用pJC2phleo转化的实验室菌株接种的培养基中的尿素浓度。用实心方形表示的数据是用pJC2/DUR1，2phleo转化的实验室菌株接种的培养基中的尿素浓度。用空心圆形表示的数据是pJC2phleo菌株的600nm吸收值。用空心方形表示的数据是pJC2/DUR1，2phleo菌株的600nm吸收值。左侧Y轴是以mg/L表示的尿素。右侧Y轴是600nm的吸收值。X轴是接种后的小时数。
发明的详细描述
在各个方面，本发明涉及基因的修饰和重组基因的用途。在本上下文中，术语“基因”以其通常定义使用，意指一组可操作连接的核酸序列。本发明上下文中基因修饰可以包括对基因中可操作连接的各个序列中任一序列的修饰。“可操作连接”意指特定序列直接或间接地相互作用以实现它们预期的功能，如基因表达的介导和调节作用。可操作连接的序列的相互作用可以通过例如蛋白质介导，而该蛋白质又与这些序列相互作用。
基因的表达通常涉及由部分基因编码的多肽的产生。该过程通常包括至少两步：编码序列转录以形成RNA，该RNA本身可以有直接的生物作用或者可以由其中部分mRNA翻译为多肽。尽管还没有完全理解转录和翻译的过程，但是认为DNA的几个区域控制DNA序列转录为mRNA。每个区域都是具有期望顺序的一系列碱基(即，包含腺苷(A)，胸苷(T)，胞苷(C)，和鸟苷(G)的一系列核苷酸残基)。
基因中通常存在的区域包括启动子序列，该启动子序列具有引起RNA聚合酶和其它转录因子与DNA启动子片段结合的区域。在起始转录前，RNA聚合酶通常沿着启动子的间插区域移动，到达可以引导RNA聚合酶开始mRNA合成的转录起始序列位置。据认为，RNA聚合酶在转录起始序列外的适当距离处，如约20到约30个碱基处开始mRNA合成。前述序列一起称作基因的启动子区域，其可以包括其它可以修饰基因表达的元件。这种复杂启动子可以含有一个或多个参与基因诱导或抑制的序列。
在本发明上下文中，“启动子”意指当转录调节区域可操作地连接目的序列时，能够介导或调节目的核苷酸序列以期望的空间或时间模式及期望的程度转录的核苷酸序列。转录调节区域和目的序列“可操作地连接”是指这两个序列功能性地连接，由此使得转录调节区域可以介导或调节目的序列的转录。在一些实施方式中，为了可操作地连接，转录调节区域可以和目的序列位于相同的链上。在一些实施方式中，转录调节区域可以位于目的序列的5’。在这种实施方式中，转录调节区域可以直接是目的序列的5’或这些区域间可以存在间插序列。在一些实施方式中，转录调节序列可以位于目的序列的3’。转录调节区域和目的序列的可操作连接可能需要适当的分子(如转录激活蛋白质)结合到转录调节区域上，因此本发明包括体外或体内提供这种分子的实施方式。
可以被RNA聚合酶转录为信使RNA的DNA序列通常始于不翻译成蛋白质的序列，该序列称作mRNA链5’非翻译末端，其可以结合核糖体。此非翻译序列(帽子)可以在基因转录后添加。在遇到“起始密码子”之前mRNA一直移动穿过核糖体。起始密码子通常是AUG三碱基系列；很稀少地，密码子GUG可以引起翻译的起始。
基因中下一个碱基序列通常称作编码序列或结构序列。起始密码子引导核糖体开始通过肽键将一系列氨基酸相互连接形成多肽，该多肽从形成多肽氨基末端的甲硫氨酸开始(随后，甲硫氨酸残基可以通过其它酶从多肽上除去)。AUG起始密码子后面接着的碱基被分成3个一组，每一组是一个密码子。“阅读框架”由起始密码子确定，其规定了碱基如何聚在一起形成3个一组。每个密码子编码一个将添加到形成中的多肽上的特定氨基酸。三种密码子(UAA，UAG和UGA)通常是“终止”密码子；当终止密码子到达核糖体的翻译机器时，形成的多肽将脱离核糖体，之前最后一个氨基酸残基成为多肽的羧基末端。
位于单顺反子基因中终止密码子3’侧的mRNA区域称为3’-非翻译区。在该区域转录后，该区域可以参与mRNA的加工、稳定性和/或转运。该区域也可以包含可被细胞中酶识别的聚腺苷酸化信号，该聚腺苷酸化信号被所述酶识别后，该酶可以将相当多数量的腺苷残基添加到mRNA分子上形成poly-A尾巴。
本发明的各种基因和核酸序列可以是重组序列。术语“重组”意指重新组合的一些东西，因此提到核酸构建体时此术语指由通过分子生物学技术在某一点连接在一起或形成的核酸序列组成的分子。当与蛋白质或多肽一起提到术语“重组”时指利用通过分子生物学技术产生的重组核酸构建体表达的蛋白质或多肽分子。当与遗传组成一起提到术语“重组”时指具有新的等位基因组合的配子或子代或细胞或基因组，且这种新的等位基因组合在天然存在的亲代基因组中不存在。重组核酸构建体可以包括与如下核酸序列连接或通过操作以和此核酸序列连接的核苷酸序列，所述核酸序列在自然界中没有与该核苷酸序列连接，或者在自然界中所述核苷酸序列在不同位置与该核酸序列连接。因此，称核酸构建体为“重组体”是指利用基因工程通过人为干预操作的核酸分子。
重组核酸构建体可以例如，通过转化引入宿主细胞。这种重组核酸构建体可以包括已经分离出来并重新引入宿主物种细胞中的来源于相同宿主细胞物种或来源于不同宿主细胞物种的序列。
作为宿主细胞最初转化的结果或者作为随后重组和/或修复事件的结果，重组核酸序列可以整合进入宿主细胞基因组。可替代地，重组序列可以作为染色体外元件保持。这种序列例如，可以利用生物体如转化的酵母菌株来复制，而所述菌株可以作为菌株改良方法的起始菌株，并通过突变、混合交配(mass mating)或原生质体融合实现所述的菌株改良。如术语“重组”在本文的使用，由此得到的保留了本发明重组序列的菌株本身被认为是“重组”的。
在本发明的各个方面，可以利用例如在Itakura等，美国专利号：4,598,049；Caruthers等，美国专利号：4,458,066；和Itakura美国专利号4,401,796和4,373,071中公开的技术化学合成核酸分子。如这里所用的术语，这种合成的核酸本质就是“重组”的(是用于将分子的各组成部分组合在一起的连续步骤的产物)。
转化是通过在细胞中掺入一个或多个外源核酸从而改变细胞带有的遗传物质的过程。例如，可以利用各种方法转化酵母(Gietz等，1995)。通过将外源核酸掺入到细胞遗传物质中，或者利用由细胞暴露于外源核酸引起的细胞内源遗传材料的改变可以实现这种转化。转化体或转化细胞是通过对外源核酸的摄取已被遗传改变的细胞或细胞后代。如本文所用，这些术语适用于通过随后的细胞世代保持了期望的遗传改变的转化细胞的后代，并与同样可以存在于随后的细胞世代中的其它突变或改变无关。
在可替代的方面，本发明涉及用在发酵中以产生各种产品，如酒、啤酒、生面团、乙醇或醋的酵母菌株。在可替代的实施方式中，本发明可以利用例如酿酒酵母(S.cerevisiae)菌株，贝酵母(S.bayanus)菌株，或者裂殖酵母(Schizosaccharomyces)菌株。例如，用在酿酒中的转化宿主细胞可以包括酿酒酵母(S.cerevisiae)菌株或裂殖酵母(Schizosaccharomyces)菌株，如Bourgovin(RC 212酿酒酵母)，ICV D-47酿酒酵母，71 B-1122酿酒酵母，K1V-1116酿酒酵母，EC-1118贝酵母，Vinl3，Vin7，N96，和WE352。有多个商业来源可获得酵母菌株，如加拿大魁北克省蒙特利尔Lallemand Inc.。
在一些实施方式中，本发明的一些方面可以利用有尿素降解活性，如DUR1，2的脲羧化酶和脲基甲酸酯水解酶活性的内源或外源酶。例如，这些酶可以与DUR1，2或有相关活性的DUR1，2区域同源。
当两序列(如天然DUR1，2蛋白质或天然DUR1，2核酸序列和可替代用在本发明中的蛋白质或核酸序列)最优联配(align)时，序列间同源性程度可以表示为同一性百分比，意指序列间精确匹配的出现。可以利用各种算法，如Smith和Waterman，1981，Adv.Appl.Math 2：482的局部同源性算法，Needleman和Wunsch，1970，J.Mol.Biol.48：443的同源性联配算法，Pearson和Lipman，1988，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：2444的相似性检索方法，和这些算法的计算机化执行程序(如，在Wisconsin GeneticsSoftware Package(Genetics Computer Group，Madison，WI，U.S.A.)中的GAP，BESTFIT，FASTA和TFASTA)进行序列最优联配以实现同一性比较。也可以利用Altschul等，1990，J.Mol.Biol.215：403-10(利用公开的默认设置值)中所述的BLAST算法进行序列联配。从National CenterFor Biotechnology Information(通过互联网在http://www.ncbi.nlm.nih.gov)可以得到进行BLAST分析的软件。BLAST算法涉及首先通过鉴定查询序列中的短长度的字W来鉴定高得分序列对(HSP)，其中所述字当与数据库序列中相同长度的字联配时将匹配或满足一定的正阈值分数T。T被称为相邻字得分阈值。最初的相邻字命中点作为种子被用来起始检索以便发现更长HSP。字命中点沿着每个序列向两个方向延伸，只要累积的联配记分可以增加即可。在每个方向上当下面的参数满足时，字命中点的延伸停止：累积联配得分从它的最大获得值降低了量X；由于一个或多个负得分残基联配的累积，累积得分趋向零或更低值；或者达到任一个序列的末端。BLAST算法参数W，T和X决定了联配的灵敏度和速度。对于双链核酸比较，BLAST程序可以利用如下作为默认值：字符长度(W)11、BLOSUM62记分矩阵(Henikoff和Henikoff，1992，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：10915-10919)、联配(B)50，期待值(E)10(在可替代的实施方式中其可以改变为1或0.1或0.01或0.001或0.0001；尽管远高于0.1的E值不可能鉴定功能相似的序列，但是它可以用于检查具有较低显著性的命中，0.1和10间的E值可以用于短区域的相似性)，M＝3，N＝4。对于蛋白质比较，BLASTP可以利用如下默认值：G＝11(空位开放罚分)；E＝1(空位延伸罚分)；E＝10(在该设置下的期待值，即，预期具有等于或好于定义的联配分数S的得分的10个命中点可以偶然出现在与所检序列具有相同大小的数据库中；可以增加或减少E值以改变检索的严格性)；和W＝3(字长，对于BLASTN，默认值是11，对于其它blast程序是3)。BLOSUM矩阵向联配中的每个位置赋予概率分数，该概率分数基于在相关蛋白质的共有序列模块间出现置换的已知频率。在BLAST2.0中默认使用BLOSUM62(空位存在罚分＝11；每个残基的空位罚分＝1；λ比率＝0.85)置换矩阵。各种其它矩阵可以用作BLOSUM62的替代，该替代矩阵包括：PAM30(9，1，0.87)；PAM70(10，1，0.87)；BLOSUM80(10，1，0.87)；BLOSUM62(11，1，0.82)和BLOSUM45(14，2，0.87)。利用BLAST算法，对两个序列间统计学相似性的一个测量是最小和概率(smallest sumprobability，P(N))，其指示了两个核苷酸或氨基酸序列间偶然出现匹配的概率。在本发明可替代实施方式中，如果在所检测序列的比较中，最小和概率小于大约1，优选小于约0.1，更优选小于约0.01，最优选小于约0.001，则认为核苷酸或氨基酸序列基本等同。
在一些实施方式中，本发明的核酸序列可以基本相同，如与DUR1，2蛋白质或DUR1，2核酸序列基本相同。当最佳联配时，这些序列的基本同一性可以用同一性百分比反映，例如，这些同一性百分比可以是大于50％，80％到100％，至少80％，至少90％或至少95％，在基因寻靶底物的情况下，其可以指基因寻靶底物的一部分和靶序列的一部分的同一性，其中同一性的程度有利于同源配对和重组和/或修复。两个核酸基本相同的可替代指标是在中等严格条件下，或优选严格条件下两个序列互相杂交。例如，在中等严格条件下，可以在0.5M NaHPO4，7％十二烷基硫酸钠(SDS)，1mM EDTA中，在65℃进行与结合滤膜的序列的杂交，并在0.2xSSC/0.1％SDS中及在42℃下洗涤(参见Ausubel等，(编辑)，1989，Current Protocols in Molecular Biology，1卷，Green Publishing Associates，Inc.，和John Wiley & Sons，Inc.，New York，在2.10.3页)。可替代地，例如，在严格条件下，可以在0.5M NaHPO4，7％SDS，1mM EDTA中，在65℃进行与结合滤膜的序列的杂交，并在0.1x SSC/0.1％SDS中在68℃洗涤(参见Ausubel等，(编辑)，1989，同上引文)。根据目的序列，利用已知方法可以修改杂交条件(参见Tijssen，1993，Laboratory Techniques inBiochemistry and Molecular Biology- -Hybridization with Nucleic AcidProbes，Part I，Chapter 2，″核酸探针试验的策略和杂交原则的概览″，Elsevier，New York)。通常，在限定的离子浓度和pH下，选择的严格条件为对于特定序列而言比其热熔点低约5℃。洗涤，例如，对于严格杂交而言，可以为至少15分钟，30分钟，45分钟，60分钟，75分钟，90分钟，105分钟或120分钟。
正如本领域熟知的，可以在多肽，如DUR1，2的结构中进行一些修改和改变，而基本不改变该肽的生物学功能，从而获得生物学上等同的多肽。在本发明的一方面，具有脲羧化酶和/或脲基甲酸酯水解酶活性的蛋白质可以包括通过保守氨基酸替代而不同于天然DUR1，2序列的蛋白质。如这里所用，术语“保守氨基酸替代”指在蛋白质给定位置上用一个氨基酸对另一个氨基酸进行替代，其中可以进行这种替代而不实质上造成相关功能的损失。在进行这种改变时，可以基于侧链取代基，例如，它们的大小、电荷、疏水性、亲水性等的相对类似性进行类似氨基酸残基的替代，并且通过常规测定可以检测这种替代对蛋白质功能的影响。
在一些实施方式中，可以进行将一个氨基酸残基替代为另一个有类似疏水性值(例如，在加或减2.0的值之内)的氨基酸残基的保守氨基酸替代，其中下面可以是有约-1.6亲水指数的氨基酸残基，如Tyr(-1.3)或Pro(-1.6)。氨基酸残基被赋予如下疏水性值(如美国专利号：4,554,101中所详述，这里将其并为参考文献)：Arg(+3.0)；Lys(+3.0)；Asp(+3.0)；Glu(+3.0)；Ser(+0.3)；Asn(+0.2)；Gln(+0.2)；Gly(0)；Pro(-0.5)；Thr(-0.4)；Ala(-0.5)；His(-0.5)；Cys(-1.0)；Met(-1.3)；Val(-1.5)；Leu(-1.8)；Ile(-1.8)；Tyr(-2.3)；Phe(-2.5)；和Trp(-3.4)。
在可替代的实施方式中，可以进行将一个氨基酸残基替代为另一个有类似亲水指数(例如，在加或减2.0的值之内)的氨基酸残基的保守氨基酸替代。在这种实施方式中，可以基于每个氨基酸残基的疏水性和电荷特性来确定氨基酸残基的亲水指数，如下：：Ile(+4.5)；Val(+4.2)；Leu(+3.8)；Phe(+2.8)；Cys(+2.5)；Met(+1.9)；Ala(+1.8)；Gly(-0.4)；Thr(-0.7)；Ser(-0.8)；Trp(-0.9)；Tyr(-1.3)；Pro(-1.6)；His(-3.2)；Glu(-3.5)；Gln(-3.5)；Asp(-3.5)；Asn(-3.5)；Lys(-3.9)；和Arg(-4.5)。
在可替代实施方式中，可以进行将一个氨基酸残基替代为同类的另一个氨基酸残基的保守氨基酸替代，其中将氨基酸分成非极性、酸性、碱性和中性类，如下：非极性：Ala，Val，Leu，Ile，Phe，Trp，Pro，Met；酸性：Asp，Glu；碱性：Lys，Arg，His；中性：Gly，Ser，Thr，Cys，Asn，Gln，Tyr。
在可替代实施方式中，保守氨基酸改变包括根据亲水性或疏水性、大小或体积或电荷考虑的改变。通常可以将氨基酸表征为疏水性或亲水性，这主要取决于氨基酸侧链的特性。根据Eisenberg等(J.Mol.Bio.179：125-142，184)的标准化的共有疏水性标度(consensus hydrophobicityscale)，疏水性氨基酸显示大于零的疏水性，而亲水性氨基酸显示小于零的疏水性。遗传编码的疏水性氨基酸包括Gly，Ala，Phe，Val，Leu，Ile，Pro，Met和Trp，遗传编码的亲水性氨基酸包括Thr，His，Glu，Gln，Asp，Arg，Ser和Lys。非遗传编码的疏水性氨基酸包括叔丁基丙氨酸，而非遗传编码的亲水性氨基酸包括瓜氨酸和高半胱氨酸。
根据疏水性和亲水性氨基酸的侧链特性可以进一步细分它们。例如，芳香族氨基酸是具有包含至少一个芳香环或杂芳香环的侧链的疏水性氨基酸，所述环可以含有一个或多个取代基，如-OH，-SH，-CN，-F，-Cl，-Br，-I，-NO2，-NO，-NH2，-NHR，-NRR，-C(O)R，-C(O)OH，-C(O)OR，-C(O)NH2，-C(O)NHR，-C(O)NRR等，其中R独立地是(C1-C6)烷基，取代的(C1-C6)烷基，(C1-C6)链烯基，取代的(C1-C6)链烯基，(C1-C6)炔基，取代的(C1-C6)炔基，(C5-C20)芳基，取代的(C5-C20)芳基，(C6-C26)烷芳基，取代的(C6-C26)烷芳基，5-20元杂芳基，取代的5-20元杂芳基，6-26元烷杂芳基(alkheteroaryl)或取代的6-26元烷杂芳基。遗传编码的芳香族氨基酸包括Phe，Tyr和Tryp。
非极性氨基酸是具有如下侧链的疏水性氨基酸，该侧链在生理pH不带电荷并且有这样的化学键，在该化学键中通常两个原子中每个原子平均占有两个原子共用的电子对(即，侧链不是极性的)。遗传编码的非极性氨基酸包括Gly，Leu，Val，Ile，Ala和Met。可以将非极性氨基酸进一步细分为包括脂肪氨基酸，其是有脂肪烃侧链的疏水性氨基酸。遗传编码的脂肪族氨基酸包括Ala，Leu，Val和Ile。
极性氨基酸是具有如下侧链的亲水性氨基酸，该侧链在生理pH不带电荷，但是其具有这样的化学键，在该化学键中两个原子之一更近地占有两个原子共用的电子对。遗传编码的极性氨基酸包括Ser，Thr，Asn，和Gln。
酸性氨基酸是具有pKa值小于7的侧链的亲水性氨基酸。通常，酸性氨基酸在生理pH下由于氢离子的失去具有带负电荷的侧链。遗传编码的酸性氨基酸包括Asp和Glu。碱性氨基酸是具有pKa值大于7的侧链的亲水性氨基酸。通常，碱性氨基酸在生理pH下由于水合氢离子的结合具有带正电荷的侧链。遗传编码的碱性氨基酸包括Arg，Lys和His。
本领域技术人员将理解，上述分类不是绝对的，可以将一个氨基酸分在一种以上的类别中。此外，可以基于给定试验或与以前鉴定的氨基酸比较根据特征性化学、物理或生物学特性和/或已知行为，将氨基酸分类。
在本发明的各方面，可以调节宿主的尿素降解活性，以使得它在发酵条件，如酒发酵条件下处于期望水平。术语“发酵条件”指在该条件下，生物体，如酿酒酵母(S.cerevisiae)通过发酵产生能量，即，发生发酵的培养条件。广义地定义，发酵是厌氧反应的总和，在缺乏氧气的情况下该厌氧反应可以为微生物生长提供能量。底物水平的磷酸化提供了发酵中的能量。在发酵中，一种有机化合物(能量源)起到电子供体的作用，而另一有机化合物是电子受体。各种有机底物如，碳水化合物、氨基酸、嘌呤和嘧啶均可以用于发酵。在一方面，本发明涉及具有发酵碳水化合物以产生乙醇的能力的生物体，如酵母。
在酒发酵中，新酒(must)的培养条件来源于用作原料的果汁。例如，葡萄汁的主要组分是葡萄糖(通常约75到150g/l)，果糖(通常约75到150g/l)，酒石酸(通常约2到10g/l)，苹果酸(通常约1到8g/l)和游离的氨基酸(通常约0.2到2.5g/l)。然而，在主要反应是将碳水化合物转化成乙醇的方法中，实际上可以将任何水果或含糖的植物体汁液加工成酒精饮料。
酒酵母通常在pH约4到4.5的范围中生长和发酵，并且需要约0.85的最小水活性(或者约88％的相对湿度)。可以让发酵自发进行，或者通过用先前发酵的新酒接种以开始发酵，在这种情况下，可以用约106到约107cfu/ml果汁的酵母群接种果汁。可以给新酒通气以增大酵母群。一旦发酵开始，二氧化碳的快速产生通常将维持厌氧条件。发酵的温度通常是10℃到30℃，发酵的持续时间可以例如，延长至几天到几周。
在一个方面，本发明提供了能够降低发酵的酒精饮料中氨基甲酸乙酯浓度的酵母菌株。例如，本发明可以用于提供具有小于40ppb(μg/L)，35ppb，30ppb，25ppb，20ppb，15ppb，10ppb或5ppb(或50ppb和1ppb间的任何整数值)氨基甲酸乙酯浓度的酒。在可替代实施方式中，本发明可以用于提供具有小于约500ppb，400ppb，300ppb，200ppb，150ppb，100ppb，90ppb，80ppb，70ppb，60ppb，50ppb，40ppb，30ppb，20ppb或10ppb(或500ppb和10ppb间的任何整数值)氨基甲酸乙酯浓度的加度酒或精馏酒精。
在可替代实施方式中，本发明可以提供能够在葡萄汁中维持降低的尿素浓度的酵母菌株。例如，尿素浓度可以维持在约15mg/l，10mg/l，5mg/l，4mg/l，3mg/l，2mg/l或1mg/l以下。
在一方面，本发明提供了筛选发酵条件下具有期望水平的尿素降解活性的发酵生物体的天然突变体的方法。例如，可以筛选缺少DUR1，2的NCR的酵母菌株。酵母突变和筛选方法的一个例子参见2000年10月31日发给Mortimer等的美国专利号6,140,108。在该方法中，可以用诱变剂如乙基甲磺酸、亚硝酸或羟胺处理酵母菌株，产生具有碱基对替代的突变体。可以例如，通过在适合培养基上涂平板筛选具有改变的尿素降解活性的突变体。
在可替代的实施方式中，可以利用定点诱变改变宿主中尿素降解活性的水平。例如，利用定点诱变可以从DUR1，2启动子中除去NCR介导元件。例如，可以通过替代修饰或缺失如图2所示的天然DUR1，2启动子序列中的GATAA(G)盒子。在一个实施方式中，例如，可以通过将G替代为T修饰一个或两个GATAA(G)盒子，这样序列变为TATAA。例如，在Rothstein，1991；Simon和Moore，1987；Winzeler等，1999；和Negrittoet等，1997中公开了定点诱变的方法。在可替代实施方式中，也可以突变酿酒酵母(S.cerevisiae)中介导NCR的编码Gln3p和Gat1p的基因以调节NCR。
可以相对于非转化的亲本菌株测定本发明酵母菌株的相对尿素降解酶活性。例如，可以筛选本发明的转化酵母菌株以在发酵条件下比亲本菌株具有更高的尿素降解活性，或者在相同发酵条件下，活性以一定比例大于亲本菌株的活性，如活性为亲本菌株活性的至少150％，200％，250％，300％，400％或500％。类似地，可以相对于本发明重组核酸所来源的非重组序列，利用类似的活性倍数确定本发明重组核酸表达或编码的酶活性。
在本发明的一方面，可以提供包含具有DUR1，2编码序列或其同系物的重组核酸分子的载体，所述核酸分子处于可以介导调节DUR1，2多肽表达的异源启动子序列的控制下。为了提供这种载体，可以将来源于酿酒酵母(S.cerevisiae)的DUR1，2可读框(ORF)***含有可调节重组DUR1，2基因表达的表达盒子的质粒中。可以将重组分子引入选定的酵母菌株以提供具有改变的尿素降解活性的转化菌株。在可替代的实施方式中，也可以通过用其它启动子置换天然启动子实现宿主，如酿酒酵母(S.cerevisiae)中天然DUR1，2编码序列同系物的表达。利用内源编码序列时，也可以用其它调节元件构建重组表达盒子。可以将重组基因或表达盒子整合进入宿主如酿酒酵母(S.cerevisiae)的染色体DNA中。
可以从适宜的天然酿酒酵母(S.cerevisiae)启动子筛选用在本发明的可替代方面中的启动子，如PGK1或CAR1启动子。这种启动子可以与其它调节元件如PGK1或CAR1终止子一起使用。可以利用各种天然或重组启动子，其中筛选或构建启动子以便在选定的条件下，如酿酒条件下，其可以介导尿素降解活性，如DUR1，2活性的表达。
根据本发明的一个方面，提供了利用宿主，如酵母菌株发酵碳水化合物的方法，如发酵酒的方法，其中所述宿主用可以调节宿主尿素降解活性的重组核酸转化。例如，在酒酿造酵母菌株中，可以调节DUR1，2基因的NCR以增强尿素降解为氨和二氧化碳。根据本发明的该方面，可以利用酵母菌株进行葡萄汁发酵以引起有限量的氨基甲酸乙酯产生。
在一个实施方式中，利用标准重组方法(Ausubel等，1995)，将腐草霉素抗性基因盒子克隆进入酵母穿梭载体，产生称为pJC2phleo的质粒。通过PCR扩增DUR1，2基因的可读框(ORF)，并将其克隆进入pJC2phleo质粒，以产生称为pJC2/DUR1，2phleo的载体。pJC2/DUR1，2phleo载体是多拷贝游离型酿酒酵母-大肠杆菌穿梭质粒，其中DUR1，2编码序列插在酵母磷酸甘油酸激酶(PGK1)基因的调节序列间，以致PGK1启动子和终止子序列可操作地连接DUR1，2编码序列。LEU2标记允许亮氨酸营养缺陷型的转化酵母细胞的筛选。pJC2/DUR1，2phleo质粒还含有组成型TEF1酵母启动子和CYC1终止子驱动的Tn5Ble基因。转化体的体内分析表明，通过对培养基中尿素浓度的测定，与用pJC2phleo转化的细胞比较，用pJC2/DUR1，2phleo质粒转化的酿酒酵母(S.cerevisiae)细胞的尿素降解能力显著增加。
尽管这里公开了本发明的各种实施方式，但是可以根据本领域技术人员的常识在本发明范围内进行许多改变和修改。这种修改包括为了达到相同的效果以基本相同的手段对本发明任一方面进行已知等同物的替代。数字范围包含定义范围的数字在内。在说明书中，词“包含”用作开放式术语，基本上等同于短语“包括，但不限于”，并且词“包括”有相应的意思。这里对参考文献的引用不应该理解为承认这些参考文献是本发明的现有技术。这里通过参考文献形式并入本说明书中引用的所有公开出版物，包括但不限于专利和专利申请，就如同特异单独地指明在此通过参考文献形式并入每一份单独出版物并且如同每一份出版物均在此进行了完全的陈述。本发明包括参考实施例和附图基本如此前所述的所有实施方式和变体。
参考文献
特此，并入下面的文献作为参考：
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Figure IYZ000004152786000011
Figure IYZ000004152786000021

Claims (18)

1.一种用重组核酸转化的酵母菌株，所述重组核酸包含在宿主细胞中发酵条件下不介导氮分解代谢物抑制的对DUR1，2异源的启动子，其中所述启动子与编码尿素降解酶活性的基因可操作连接，从而降低发酵条件下酵母菌株表达的所述尿素降解酶活性的氮分解代谢物抑制，其中所述启动子是PGK1启动子或CAR1启动子。
2.权利要求1所述的酵母菌株，其中尿素降解酶活性是脲羧化酶或脲基甲酸酯水解酶活性。
3.权利要求1或2所述的酵母菌株，其中用包含编码序列的重组核酸转化该菌株，该编码序列编码尿素降解酶活性，且其中所述编码序列与所述启动子可操作连接。
4.如权利要求1或2所述的酵母菌株，其中所述启动子适应于介导发酵条件下尿素降解酶活性表达。
5.如权利要求3所述的酵母菌株，其中编码序列包含与DUR1，2可读框同源的可读框。
6.如权利要求1所述的酵母菌株，其中在发酵条件下酵母菌株发酵碳水化合物以产生乙醇。
7.如权利要求1所述的酵母菌株，其中酵母菌株是酿酒酵母(S.cerevisiae)菌株。
8.如权利要求1至7任一项所述的酵母菌株，其中在发酵条件下酵母菌株产生具有小于30ppb浓度氨基甲酸乙酯的酒。
9.权利要求1的酵母菌株，其中所述启动子是PGK1启动子。
10.权利要求1至9任一项所述的酵母菌株在生产发酵的酒精饮料中的用途。
11.制备发酵的酒精饮料的方法，包括在发酵条件下维持权利要求1至9任一项所述的酵母菌株。
12.通过权利要求10的用途或通过权利要求11中的方法获得的所述的发酵的酒精饮料。
13.如权利要求12所述的发酵的酒精饮料，其中饮料是酒或蒸馏的酒精饮料。
14.如权利要求13所述的发酵的酒精饮料，其中饮料是酒，并且所述酒具有小于30ppb的氨基甲酸乙酯浓度。
15.权利要求1至9任一项所述的酵母菌株在生产发酵产品中的用途。
16.制备发酵产品的方法，包括在发酵条件下维持权利要求1至9任一项所述的酵母菌株。
17.通过权利要求15的用途或通过权利要求16中的方法获得的所述的发酵产品。
18.修饰酵母菌株的方法，包括用重组核酸转化酵母菌株，所述重组核酸包含在宿主细胞中发酵条件下不介导氮分解代谢物抑制的对DUR1，2异源的启动子，其中所述启动子与编码尿素降解酶活性的基因可操作连接，从而降低发酵条件下酵母菌株表达的所述尿素降解酶活性的氮分解代谢物抑制，其中所述启动子是PGK1启动子或CAR1启动子。
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