JPH0752194B2

JPH0752194B2 - 固体抗原に対する抗体を用いるイムノアッセイ

Info

Publication number: JPH0752194B2
Application number: JP63051863A
Authority: JP
Inventors: 常廣北川
Original assignee: KOTARO PHARMACEUTICAL CO., LTD.
Current assignee: KOTARO PHARMACEUTICAL CO., LTD.
Priority date: 1988-03-05
Filing date: 1988-03-05
Publication date: 1995-06-05
Anticipated expiration: 2010-06-05
Also published as: JPH01227060A

Description

【発明の詳細な説明】［産業上の利用分野］この発明は、固体物質の粉末を抗原として動物に投与
し、免疫応答を誘発し、生成した抗体を試薬として用い
る、イムノアッセイに関するものである。

［従来の技術］医薬、食品等の分野で従来から行なわれている分析法に
は、クロマトグラフィーの原理に基づくものと、互いに
相補的なリガンド（例えば抗原）およびレセプター（例
えば抗体）の反応に基づくもの（いわゆるイムノアッセ
イ）とが含まれる。

しかし、クロマトグラフィーの原理に基づく方法は、感
度が充分でなく微量の物質の検出に適しないという欠点
があり、また操作が繁雑で熟練を要するので非熟練者が
いつでも実施できるものではない。

これに対して、イムノアッセイは、リガンドとレセプタ
ーの特異反応に基づくので、極めて微量の物質をも検出
するとができ、また一度抗体を作りプロトコルを完成し
てしまえば非熟練者も容易に実施できるという利点があ
る。

上記のように、イムノアッセイでは抗体を入手すること
が前提であるが、従来抗体を入手するには、分析対象で
ある化合物の純品を水に溶解して動物に投与し、免疫応
答を誘発して抗体を産生させ、体液（例えば血液）から
抗体を採取していた。

しかし、医薬の中で、生薬のような天然物にイムノアッ
セイを応用しようとすると、生薬の中から適当な有効成
分を抽出し、精製して純品としてから上記のように投与
しなければならないが、生薬成分には多種多様の類似化
合物が含まれるので相互の分離が繁雑であり、また１つ
の化合物については含有量が微量なので、純品として採
取するのが容易でない。さらに、生薬の１成分を分析し
ただけで生薬の種類と量を確認できるかどうかというこ
とも問題である。

［発明が解決しようとする課題］生薬は品質により価格が変動し、また高価な生薬には類
似品（偽物）が出回っているので、生薬を含む医薬品に
ついては、使われている生薬の真偽、等級および含量を
正しく知ることが必要である。ところが、上記のよう
に、生薬については簡単正確な測定法がなかったので、
その開発が強く望まれていた。

［課題を解決するための手段］この発明者は、従来免疫応答を誘発するためには化合物
を水溶液の形で投与するのが常識であったのに対して、
生薬を粉末化してそのまま水にけんだくし、投与するこ
とを試みた。その結果、このような方法でも免疫応答を
誘発することができ、しかも投与した生薬の組織全体に
対する特異抗体が得られることを見出した。そして、こ
の特異抗体を利用して生薬そのものに対するイムノアッ
セイを行ない得ること、および抗体に反応させるものと
して特定のリガンドまたはリガンド群を選択することに
より、特定の成分を検出し得ることを見出し、さらにこ
のような方法が、生薬だけでなくあらゆる植物製品、動
物製品、食品、繊維製品等に広く応用できることを見出
した。

［発明の構成］この発明は、リガンドまたはそれに補助的なレセプター
の少なくとも一部に、測定可能なシグナルを発生し得る
標識またはその前駆体を結合させ、リガンドとレセプタ
ーを競合的または非競合的に反応させ、前駆体を用いた
場合は標識に変換し、発生したシグナルを測定すること
により、リガンドまたはレセプターを分析する標識イム
ノアッセイ法において、レセプターとして、少なくとも
水不溶性固体抗原を含むリガンド混合物を、固体を含ん
だまま動物の抗体産生系を含む体液に接触させることに
より、体液中に産生された抗体を用いることを特徴とす
る方法を提供するものである。

上記の方法は、遊離リガンドと、固体担体に少なくとも
水不溶性固体抗原を含むリガンド混合物を結合させてな
る固相リガンドを、レセプターと競合反応させることに
より行なうことができる。またこの場合、固相リガンド
に結合したリガンド混合物として、抗体の産生に用いた
リガンド混合物と別異のものであるが、両者に対して抗
体が交差反応性をもつものを用いることができる。

さらに、この発明は、少なくとも水不溶性固体抗原を含
むリガンド混合物を固体を含んだまま動物の抗体産生機
構を含む体液に接触させることにより産生された抗体、
固体担体に少なくとも水不溶性固体抗原を含むリガンド
混合物を結合させてなる固相リガンドおよび少なくとも
水不溶性固体抗原を含むリガンド混合物からなる、免疫
反応誘発剤を提供するものである。

［定義］この発明で使用する用語を説明すると次の通りである。

標識イムノアッセイ：リガンドまたはそれに相補的なレ
セプターの少なくとも一部に、測定可能なシグナルを発
生し得る標識またはその前駆体を結合させ、リガンドと
レセプターを競合的または非競合的に反応させ、前駆体
を用いた場合は標識に変換し、発生したシグナルを測定
することにより、リガンドまたはレセプターを分析する
ことからなる方法はすべて含まれる。これは、測定対象
（リガンド、レセプター）の違い、標識（酵素、放射性
核種、スピン、蛍光、化学発光等）の違い、反応形式
（競合、非競合）の違い、系（均質、不均質）の違い等
に基づいて種々の方法が含まれる。すなわち、まず、系
の違いによりホモジニアス法とヘテロジニアス法に分類
される。ホモジニアス法は、リガンド・レセプター結合
形と非結合形を分離しない方法であり、ヘテロジニアス
法は両者を分離する方法である。各々には、標識体と非
標識体を競合的に反応させるか否かにしたがって、競合
法と非競合法が含まれる。ヘテロジニアス競合法には、
液相法で第２抗体（すなわち、抗体に対する抗体）を用
いる液相２抗体法と、固相１抗体法、固相２抗体法、固
相化抗原と標識抗体を用いる方法、サンドイッチ法（多
価抗原に対する２種の抗体を用いる方法）およびイムノ
エンザイモメトリック法（未反応の標識抗体を固相リガ
ンドで除去する方法）が含まれる。標識として酵素を用
いる場合を例にとり、これらを簡単に説明すると次の通
りである。

ホモジニアス競合法……酵素標識したリガンドと非標識
リガンドをレセプター（抗体）に対して競合反応させる
方法であり、レセプターと結合する前に活性を有してい
た酵素が結合により活性を失なうか、またその逆の現象
を利用する。前者の場合には非標識リガンド（検体）の
量の増加と共に酵素活性が上昇し、後者の場合は逆に減
少する。この方法には、酵素の代りに阻害剤が結合した
酵素、補酵素、基質を用いる等の変法がある。

ホモジニアス非競合法……β−Ｄ−ガラクトシダーゼで
酵素標識したレセプター（抗体）とリガンドとｏ−ニト
ロフェニル−β−Ｄ−ガラクトシドを反応させ、さらに
サクシニル化抗体を反応させ、サクシニル化抗体の存在
により酵素反応生成物の光散乱を起させて濁度を測定す
る。

ヘテロジニアス液相２抗体法……液相で、酵素標識リガ
ンドと非標識リガンドを第１抗体に競合反応させ、次に
第２抗体（例えば第１抗体がうさぎIgGの場合、やぎ抗
うさぎIgG）を反応させて免疫沈降させ、結合体（Ｂ）
と非結合体（Ｆ）（上清）を分離（S/F分離）し、Ｂま
たはＦの酵素活性を測定する。

ヘテロジニアス固相１抗体法……第１抗体を固体担体に
結合（以下、固相化という）させ、これに酵素標識リガ
ンドと非標識リガンドを競合反応させ、B/F分離後、固
相に結合した酵素活性を測定する。

ヘテロジニアス固相２抗体法……上記液相２抗体法にお
いて、第２抗体として固相化第２抗体を使用する方法で
ある。

固相リガンドと標識抗体を用いる方法……固相化リガン
ドと非固相化リガンド（検体）を酵素標識したレセプタ
ー（抗体）に競合反応させ、B/F分離後、固相に結合し
た酵素活性を測定する。

サンドイッチ法……リガンド（検体）を固相化レセプタ
ー（抗体）に結合させ、B/F分離後、酵素標識抗体を固
体に結合させて、B/F分離し、固相に結合した酵素活性
を測定する。この順序の反応をフオワード法という。変
法として、上記と逆の順序に反応を行なうリバース法、
および同時法がある。また、標識抗体の代りにビオチニ
ル化抗体を用い、標識アビジンまたはアビジン＋標識ビ
オチンにより検出する変法がある。

イムノエンザイモメトリック法……リガンド（検体）と
酵素標識レセプター（抗体）を反応させ、未反応のレセ
プターを固相化リガンドとの反応で除去し、上清の酵素
活性を測定する。

上記各方法の実施は、公知方法と同様に行なうことがで
きる。

リガンド：対応するレセプターを製造し得る有機化合物
であるが、この発明で抗体の製造に用いる場合は、特
に、動物性または植物性生薬、乾燥植物、乾燥食品、植
物性調味料、天然繊維等のような動物性または植物性物
質の粉末を含む混合物をいう。代表的な生薬は、大黄、
にくづく、桂皮、附子、鳥頭、黄連、細辛、ぼたん皮、
阿片、甘草、黄柏、五倍子、人参、竹節人形、当薬、吐
根、きささげ、半夏、ぶくりょう、じゃこう、牛黄、熊
胆等が含まれる。食品としては、かつお、いわし、はま
ち、だいず、牛、豚、羊、鶏等が含まれる。繊維として
は、木綿、羊毛、カシミヤ毛、アルパカ毛等が含まれ
る。

レセプター：分子の特定の空間的および電子的構造、例
えばエピトープまたは抗原決定基を認識し結合し得る化
合物。レセプターは、通常抗体すなわち免疫グロブリン
であり、抗血清として得られる。抗体は、抗原を適当な
媒質（例えば緩衝液）にけんだくし、所望によりアジュ
バンドと共に抗体産生系に接触させて産生させる。

標識：測定可能なシグナルを発生する物質であり、酵素
（基質との組合わせとして）、スピン化合物、放射性核
種、蛍光物質、化学発光物質、吸光物質等が含まれる。
好ましい標識は酵素である。酵素としては、ペルオキシ
ターゼ、β−ガラクトシダーゼ、グルコースオキシダー
ゼ、アルカリホスファターゼ、グルコース−６−リン酸
脱水素酵素等が含まれる。酵素活性の測定法には、吸光
度法、蛍光法および化学発光法がある。例えば、ペルオ
キシダーゼは色原体として2,2′−アジノジ（３−エチ
ルベンズチアゾリン）−６′−スルホン酸（ABTS）のよ
うな基質を用い、生じた色素を吸光度法で測定する。グ
ルコースオキシターゼはグルコースを基質として過酸化
水素を生ずるので、ペルオキシダーゼと共役させて上と
同様に測定できる。β−ガラクトシダーゼはｏ−ニトロ
フェニル−β−Ｄ−カラクトシドを基質として測定でき
る。蛍光法としては、例えばペルオキシダーゼはｐ−ヒ
ドロキシフェニルプロピオン酸を基質として、β−ガラ
クトシダーゼはフルオレスセイン−β−Ｄ−ガラクトシ
ドまたは４−メチルウンベリフエリル−β−Ｄ−ガラク
トシドを基質として、またホスファターゼはウンベリフ
エリルりん酸を基質として測定できる。化学発光法とし
ては、例えばペルオキシダーゼはルミノールと過酸化水
素を基質として測定できる。標識（例えば酵素）を抗原
または抗体に結合させるには、例えばビス［２−（スク
シンイミドオキシカルボニルオキシ）エチル］スルホン
（BSOCOES）、ビス（スルホスクシンイミジル）スベラ
ート（BS3）、1,5−ジフルオロ−2,4−ジニトロベンゼ
ン（DFDNB）、4,4′−ジイソチオシアノ−2,2′−ジス
ルホスチルベン・ジナトリウム塩（CDIDS）、アジピン
イミド酸ジメチル・ジ塩酸塩、Ｎ−（γ−マレイミドブ
チリルオキシ）スクシンイミド（GMBS）、Ｎ−（４−ア
ジドフェニルチオ）フタルイミド（APTP）、Ｎ−スクシ
ンイミジル−６−（４′−アジド−フェニル）−1,3′
−ジチオプロピオナート（SADP）、ピリジンジスルフィ
ド、チオフタルイミド等の架橋試薬を用いる。

標識前駆体：例えば阻害物質でブロックされた標識のよ
うに、標識に転換され得る物質である。

シグナル：可視光、蛍光、放射能、その他の電磁波等で
あって、測定値をそれを発生した物質の量と関連づける
ことができるものである。

抗体産生系：抗原を認識し、それに基づいて抗体を産生
するに必要な細胞（例えばひ臓細胞、リンパ球）または
その成分のセットを含んだ系であり、一般に生きた温血
動物、特に哺乳類（うし、うま、ひつじ、やぎ、うさ
ぎ、ラット、マウス等。保存臓器以外のひとを除く。）
である。抗体は体液（例えば血液）から分離採取され
る。

固体担体：リガンドまたはレセプターの特性（抗原決定
基またはこれに結合し得る基）を維持したままこれらと
物理的または化学的に結合するかまたは包括し得る物質
であり、通常ガラス、天然または合成ポリマー、菌体、
赤血球等の板または粒である。繁用されるものは、ポリ
スチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、アクリル樹
脂等のプラスチック試験管、マイクロタイタープレー
ト、ビーズ、およびガラス、セファロース、セルロース
等のビーズ等である。リガンドまたはレセプターの固定
は、通常架橋剤によって行なうが、その前に担体表面を
シリル化することがある。架橋剤としては、例えばグル
タールアルデヒド、トリエンジイソシアナート等が用い
られる。

［実施態様］この発明の１つの実施態様によると、乾燥植物例えば生
薬を、好ましくは水性媒質中で例えば超音波破砕器によ
り粉末化する。このけんだく液に、フロインド完全アジ
ュバントを混合乳化し、哺乳類の動物の例えば皮下に投
与する。追加免疫の必要ある時は、好ましくは２−８
回、例えば５回くり返し、採血して特異的抗血清を分離
する。抗血清から得た抗体に架橋試薬で例えばGMBSで酵
素例えばβ−Ｄ−ガラクトシダーゼを結合させる。固体
担体例えばアミノダイラークに架橋剤例えばグルタール
アルデヒドを用いて抗原（生薬）を固定する。抗血清に
検体と固相化抗原を競合反応させ、B/F分離後固相に結
合した抗体を標識抗体の標識により測定する。既知量の
検体を用いて標識曲線を作り、これと比較して未知量の
検体を測定する。

［効果］この発明によると、標識イムノアッセイにおける抗体
を、生薬の破砕物のような組織全体を固体を含んだ抗原
として動物に投与して産生させるので、有効成分を抽出
精製する必要がなく、手間が省ける。また、抗体は組織
全体に対するものであるから、アッセイにおいて組織全
体を抗原として反応できる。さらに、抗体は広範囲の特
異性を有するので、抗体の産生に用いた組織自体だけで
なく、その成分または類似生薬に対しても反応させるこ
とができる。その応用として、例えば抗体に対する特異
性が比較的低い固相抗原と競合させることにより、感度
を上げることができる。しかも、この発明の方法は組織
そのままを抗原として抗体を作るという単純な原理に基
づくから、生薬、食品、繊維等の真偽判定、含有量測定
等に広く利用することができる。

［実施例］以下、この発明を実施例によりさらに詳細に説明する。

実施例１（じゃこう）［方法］抗血清の作製：じゃこう1mg/mlを等量のアジュバンド好
ましくはフロインドのアジュバンドと共に家兎の背部皮
下に感作し、追加免疫を1/4量ずつ計３回同様に感作
し、採血して抗血清を得た。

固相の調整：じゃこうを超音波処理し、これを固相支持
体であるアミノダイラークにグルタールアルデヒドを介
して結合させた。

測定法：固相抗原、および検体のじゃこう、抗血清の３
者を競合させ、固相抗原と反応した抗体を抗家兎IgG−
β−Ｄ−ガラクトシダーゼで標識し蛍光基質と反応後、
その蛍光値を測定した。測定は、下記の手順で行った。

血清0.1mlおよび試料0.1mlを室温で１時間インキュベー
トし、アミノダイラーク結合抗原を加え、室温で１時間
振とうしながらインキュベートした。B/F分離、洗浄
後、固相に抗家兎IgG−β−Ｄ−グルコシダーゼ0.2mlを
加え、室温で３時間振とうしながらインキュベートし
た。分離、洗浄後、固相を別の容器内で基質0.2mlと30
℃で１時間反応させ、0.2M−グリシン−NaOH緩衝液（p
H:10.6）2ml中、励起光365nm、蛍光448nmで測定した。

［結果］抗血清の検討：感作して得られた抗血清に対し力価検定
を行った結果、最終感作後８週目に最高力価が得られ
た。種々検討した結果、この抗血清の10⁴倍希釈の物を
以後の測定に使用した。

測定標準曲線：感作したじゃこう10μg/mlの溶液で作製
した固相抗原を使用してじゃこうを測定した。標準曲線
の測定範囲は、10−10⁴ng/mlである。（第１図）この際の測定精度及び再現性を第１表に示す。変動係数
は日内変動で18.6％以下、日差変動で23.2％以下であっ
た。

交差反応性の検討：ジャコウの50％阻害を100％とした
時の交差反応性を第２表に示す。これにより、じゃこう
に特異性を持つ測定法であることが判明した。

実施例２（竹節人参）［方法］抗血清の作製：竹節人参末を超音波処理した物を感作抗
原とし、家兎に感作して抗血清を得た。

測定方法：超音波処理した竹節人参を固相支持体のアミ
ノダイラークに結合させた固相抗原と、酸素標識したや
ぎの抗家兎IgG抗体を用いて実施例１と同様に測定し
た。

［結果］標準曲線の検討：竹節人参に対する抗血清を用いて得ら
れた竹節人参の標準曲線を第２図に示す。本測定法は、
朝鮮人参も測定できるので、その標準曲線も第２図に示
した。竹節人参の測定範囲は100ng−μｇ、朝鮮人参の
測定範囲は10ng−３μｇであり、測定の精度及び再現性
を第３表に示す。

交差反応性の検討：竹節人参の50％阻害を100％とした
時の交差反応性を第４表に示す。

人参生薬類全てに、特に朝鮮人参に最も強く交差反応性
がみられた。尚、じゃこうや半夏などの他の生薬類には
交差反応性がみられなかった。

応用：漢方製剤中の朝鮮人参エキスの測定法を検討し
た。種々検討した結果、固相抗原に竹節人参末を超音波
処理した物でなく、朝鮮人参エキスを用いると、第３図
に示すような朝鮮人参エキスの標準曲線が得られた。

この結果は、従来の免疫学の常識に反するものであり、
従来測定法のなかった人参製剤の全く新らしい規格検定
法である。

実施例３（半夏）［方法］抗血清の作製：半夏1mg/mlを等量のフロインド完全アジ
ュバンドと共に雌性家兎の背部皮下に感作して得た。追
加家兎は、前回の半量を同様にして行い合計５回行っ
た。

固相抗原の調製：粉砕した半夏を超音波で破砕し、これ
を１％グルタルアルデヒド溶液で固相担体のアミン化ダ
イラークに固定した。

酸素免疫測定法：標準半夏と抗体を一次反応させた後
に、残存する遊離な抗体に固体抗原を反応させた、固体
抗原と反応した抗体量を抗家兎IgG抗体−β−Ｄ−ガラ
クトシダーゼ複合体で標識した後、蛍光基質と反応さ
せ、生じた蛍光生成物を蛍光分光光度計で測定した。

［結果］標準曲線の作製：抗半夏抗血清を用いて得られた標準曲
線を第４図に示す。測定範囲は、0.1−10μg/mlであっ
た。本法の測定精度及び再現性を第５表に示す。

交差反応性の検討：感作抗原である半夏（四川501−C09
1）の50％阻害を100とした時の交差反応性を第６表に示
す。産地の異なる半夏も本法で測定が可能であったが、
他の生薬、じゃこう、人参類では交差反応性はみられな
かった。

実施例４（朝鮮人参）［方法］抗血清の作製：朝鮮人参の粉末1mgを超音波処理した
後、等量のフロインドの完全アジュバンドと共に、雌性
家兎の背部皮下に感作した。追加免疫は２週間毎に1/2
量を同様に感作し、これを２回行った。１回目の感作の
日より、１週間毎に耳静脈より採血を行って、抗血清を
得た。

固相抗原の調製：朝鮮人参の粉末を超音波処理し、これ
を１％グルタールアルデヒド溶液で固相担体のアミノ化
ダイラークに固定した。

測定法：基本測定法に従い、酵素標識体としてヤギの抗
家兎IgG抗体−GMBS−酵素β−Ｄ−ガラクトシダーゼを
使用し、基質と反応させた後、の蛍光値を測定すること
により免疫活性を見た。

［結果］抗血清の検討：感作して得られた抗血清に対し、力価の
検討を行った結果を第５図に示す。測定には、最高力価
を有する初回感作より９週目の抗血清を用いた。

標識曲線の作製：測定法に基づいて作製した朝鮮人参の
標準曲線を、第６図に示す。測定範囲は100ng−10μｇ
で、この際の測定の精度及び再現性を第７表に示す。

交差反応性の検討：他生薬、人参類及び朝鮮人参抽出エ
キスについての交差反応を、50％阻害での朝鮮人参を10
0％として、第８表に示す。

【図面の簡単な説明】

第１図は実施例１における標準曲線、第２図および第３
図は実施例２における標準曲線、第４図は実施例３にお
ける標準曲線、第５図および第６図は実施例４における
標準曲線である。

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】リガンドまたはそれに相補的なレセプター
の少なくとも一部に、測定可能なシグナルを発生し得る
標識またはその前駆体を結合させ、リガンドとレセプタ
ーを競合的または非競合的に反応させ、前駆体を用いた
場合は標識に変換し、発生したシグナルを測定すること
により、リガンドまたはレセプターを分析する標識イム
ノアッセイ法において、レセプターとして、少なくとも
水不溶性固体抗原を含むリガンド混合物を、動物の抗体
産生系を含む体液に接触させることにより、体液中に産
生された抗体を用いることを特徴とする方法。
【請求項２】遊離リガンドと、固体担体に少なくとも水
不溶性固体抗原を含むリガンド混合物を結合させてなる
固相リガンドを、レセプターと競合反応させる、請求項
１記載の方法。
【請求項３】固相リガンドに結合したリガンド混合物
が、抗体の産生に用いたリガンド混合物と別異のもので
あるが、両者に対して抗体が交差反応性をもつ、請求項
２記載の方法。
【請求項４】少なくとも水不溶性固体抗原を含むリガン
ド混合物を動物の抗体産生機構を含む体液に接触させる
ことにより産生された抗体。
【請求項５】固体担体に少なくとも水不溶性固体抗原を
含むリガンド混合物を結合させてなる固相リガンド。
【請求項６】少なくとも水不溶性固体抗原を含むリガン
ド混合物からなる、免疫反応誘発剤。