JPH07500967A - 筋原ベクター系 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 筋原ベクター系 発明の技術分野 本発明は、一般に、筋原（■ｙ□ｇｅｎｉｃ）細胞中でポリペプチドを発現する のに使用する発現ベクターに関する。さらに詳しくは、本発明は、骨格（ｓｋｅ ｌｔａｌ）アルファアクチン遺伝子プロモーターおよび該遺伝子の対応３°転写 非翻訳領域、および該遺伝子の天然転写終結領域を含む隣接非コードＤＮＡを含 有するベクターに関する。

発明の背景 アクチンは、はとんどの細胞タイプに認められる収縮性タンパク質である。アク チンタンパク質は類似しているが同一ではないイソ形によって表され、これらは 温血を椎動物において多重遺伝子族によってコードされている。アクチンは、時 間の経過により発展的に発現するとともに組織特異的に発現するものであって、 その場合、成人の筋肉組織はもっばら骨格アルファアクチン遺伝子を優勢なアク チンイソ形として発現する。骨格アルファアクチン遺伝子の核酸配列は、ニワト リ、ラット、マウスおよびヒトで特徴付けられている。フォーンワルド（Ｆ　ｏ ｒｎｖａｌｄ）ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　Ｖｏｌ、　１０． ３８６１〜３８７６頁（１９８２）：フレンチ（Ｆ　ｒｅｎｃｈ）ら、Ｇｅｎｅ 、　Ｖｏｌ、　８８．１７３〜１８０頁（１９９０）：ザック（Ｚａｋ）ら、Ｎ ａｔｕｒｅ、　Ｖｏｌ、　２９８．８５７〜８５９頁（１９８２）；ツー（Ｈｕ ）ら、Ｍｏｌ、　Ｃ６１１，Ｂｉｏｌ、、Ｖｏｌ、　６．１５−２５頁（１９８ ６）およびミンティ（Ｍｉｎｔｙ）およびケデス（Ｋｅｄｅｓ）　、Ｍｏ１．　 Ｃｅ１ｌＢｉｏＬ、Ｖｏｌ、　６．２１２５〜２１３６頁（１９８６）。

遺伝子が特徴付けられ配列決定されると、マツピングしてそのタンパク質コード 部分および非コード部分を決定することができる。ＲＮＡ転写は、メツセンジャ ーＲＮＡキャップにあるプロモーター領域開始部位から開始され、タンパク質コ ード領域を経て転写終結に関与する非コード領域まで続く。これらＲＮＡ転写物 の転写後プロセシングにより非コードイントロンが除去されて連続したコード配 列が形成される。さらに、ポリ（Ａ）ノブナル（プロセシングを受けたメツセン ジャーＲＮＡの非コード３°非翻訳部分に認められる）までのＲＮＡ転写物の連 続的な切り取りが存在する。メツセンジャーＲＮＡの生合成および蓄積のレベル は、遺伝子の非発現部分によって決定される。たとえば、遺伝子の非発現部分で あるプロモーターが遺伝子発現の決定に関与している。プロモーターは、発現さ れる遺伝子がいつおよびいかに転写されるかを制御する。しかしながら、ＲＮＡ 転写物の蓄積は、特定細胞タイプ中での該ＲＮＡの固有の安定性と関係している 。

この固有の安定性は、安定化を付与するｍＲＮＡ内の配列に依存する。それゆえ 、特定の遺伝子産物を発現する能力は、転写速度とｍＲＮＡ転写物の安定性との 間のバランスにある。

アクチン遺伝子群の発現は組織特異的である。骨格アルファアクチンタンパク質 は、生として心筋組織および骨格筋組織中で発現される。一過性のトランスフェ クション実験は、−次筋芽細胞での組織限定発現のためには２００ｂｐプロモー ター領域内の領域で充分であることを示した。バーグズマ（Ｂ　ｅｒｇｓｍａ） ら、Ｍｏｌ。

Ｃｅ１１．　Ｂ　ｉｏｌ、、Ｖｏｌ、　６．２４６２〜２４７５頁（１９８６） およびチョウ（Ｃｈｏｗ）およびシュバルッ（Ｓｃｈｗａｒｔｚ）　、Ｍｏ１． 　Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｌ、、Ｖｏｌ、１０．５２８〜５３８頁（１９９０）。さ らに、プロモーター領域には、分化している胚芽細胞において細菌リポータ−遺 伝子のクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）から骨格ア ルファアクチン転写を正確に開始するための保存されたラス作動性（ｃｉｓ−ａ ｃｔｉｎｇ）要素が含まれる。グリクニク（Ｇｒｉｃｈｎｉｋ）、Ｎｕｃｌｅｉ ｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、、Ｖｏｌ、１４．１６８３〜１７０１頁（１９８６） 、骨格アルファアクチンプロモーターを組み込んだトランスジェニックマウスは 、筋原組織においてＣＡＴ遺伝子の優先的な発現を示した。ベトロブラス（Ｐ　 ｅｔｒｏｐｕｌｏｕｓ）ら、Ｍｏ１．　Ｃｅ１１．　Ｂ　ｉｏｌ、、Ｖｏｌ、　 ９．３７８５〜３７９２頁（１９８９）。また、ＣＡＴ活性は、マウス胚におい て胚心臓が最初に形成される１０日目において早くも検出できることがわかって いる。さらに、ＣＡＴ活性は新生の骨格筋において誘発され得る。それゆえ、骨 格アクチンプロモーターは、筋肉に限定された発現を得るために哺乳動物系で転 写活性をスイッチすることができる。しかしながら、ＣＡＴメツセンジャーＲＮ Ａのレベルを内在性骨格アルファアクチンメソセンジャーＲＮＡ　（成人の筋肉 では胚に比べて１０００倍以上も高いレベルで認められている）のレベルと比較 するために測定を行った場合に、ＣＡＴメツセンジャーＲＮＡは標準的なＲＮＡ ブロッティング法で検出することができなかった。これら実験結果は、少量のＣ ＡＴタンパク質が骨格筋中で蓄積するけれども、ＣＡＴメツセンジャーＲＮＡは 内在性骨格アクチン遺伝子からのＲＮＡ転写物のレベルには決して蓄積しないこ とを示した。

遺伝子転写ベクターを最適化するための最近の傾向は、ベクター系の転写活性を 増大させることに向けられている。たとえば、ヒトベータグロビン遺伝子系での 観察は、トランスジェニックマウスでの発現が内因性マウスベータグロビン遺伝 子の発現はどには高くないことを示した。グロスベルト（Ｇｒｏｓｖｅｌｄ）お よび共同研究者、Ｃｅ１ｌ、Ｖｏｌ、５１．９７５〜９８５頁（１９８７）。グ ロビン遺伝子座の周囲の部位には優性制御領域（ｄｏｍｉｎａｎｔ　ｃｏｎｔｒ ｏｌ　ｒｅｇｉｏｎ）と称される多数のＤＮＡ５ｅ蝉感受性部位が含まれること が決定された。この領域は、組織特異的なエンハン→−として機能すると思われ る。これら部位の幾つかをミニ遺伝子座（ｍｉｎｉｌｏｃｕｓ）遺伝子中にクロ ーニングしたときに、トランスジェニック動物における赤血球組織特異的な発現 が得られた。優性制御領域と類似の制御配列がヒトＣＤ２について記載されてい る。グリーブズ（Ｇｒｅａｖｅｓ）ら、Ｃｅ１ｌ、Ｖｏ１５６．９７９〜９８６ 頁（１９８８）。鳥類の骨格アクチンプロモーターは、高発現レベルの標準であ るＳＶ４０プロモーターと同じくらい活性であることがわかっている。バーグズ マら、（１９８６）。それゆえ、骨格アクチンプロモーターは低レベルのメツセ ンシャーＲＮＡ蓄積の原因ではない。このように、アクチンプロモーターは、そ れ自体では、完全な骨格アルファアクチンｍＲＮＡに匹敵するレベルで蓄積する ように他の遺伝子産物を発現させるには充分ではない。

ｍＲＮＡ分子の代謝的な分解速度は、遺伝子発現を制御するうえで重要な因子で ある。個々のｍＲＮＡ種の崩壊速度は、細胞質中でのこれら種の定常状聾レベル に大きく影響し得る。従って、所定の遺伝子の発現の程度は（対応タンパク質の 合成速度によって測定される）、該遺伝子からのｍＲＮＡの安定性の程度にかな りの程度依存するであろう。骨格筋からのメソセン／ヤーＲＮＡは、その安定性 に関して２つのグループに分けられることが以前に示されている。メッドフオー ド（Ｍｅｄｆｏｒｄ）ら、Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ％Ｖｏ１．２５８．１１ ０６３〜１１０７３頁（１９８３）。一つのｍＲＮＡのグループは半減期が４時 間未満であり、他方のグループは半減期が１７から５４時間以上である。

を椎動物の骨格アルファ、心臓アルファ、およびベータアクチンｍＲＮＡにおけ る非翻訳領域を比較したところ、これら各アクチンイソ形ｍＲＮＡの３°非翻訳 部分内に高い配列相同性の領域が存在すること、およびこの相同性がアルファ横 絞アクチンイソ形ｍＲＮＡとベータアクチンイソ形ｍＲＮＡとの間よりもアルフ ァー心臓イソ形と骨格アクチンイソ形との間の方が大きいことが明らかとなった 。マイヤー（Ｍａｙｅｒ）ら、Ｎｕｃｌ、Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ５ＳＶｏ１．１２． １０８７〜１１００頁（１９８４）：ホント（Ｐｏｎｔｅ）ら、Ｎｕｃｌ、　Ａ ｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、、Ｖｏｌ、　１２．１６８７〜１６９６頁（１９８４）；チ ャンク（Ｃｈａｎｇ）ら、Ｎｕｃｌ、　Ａｃ１ｄｓＲｅｓ、、Ｖｏｌ、１３．１ ２２３〜１２３７頁（１９８５）、比較スルと、インシュリンやプロラクチンを コードする遺伝子などの他のを椎動物遺伝子には共通コード領域が存在するが、 通常、３′非翻訳領域は互いに異なっている。骨格アルファアクチン遺伝子の３ °非翻訳領域がトリからヒトに至る動物種において保存されていることは、これ ら領域が重要な生物学的役割を有していることを示唆している。本発明において 、筋肉組織中でポリペプチドを発現させるために組換えＤＮＡベクター中に筋原 特異的な３°非翻訳領域を組み込むことは、安定性を増大させることによって筋 肉中の該ポリペプチドのｍＲＮＡ含量を促進させるので非常に有利であることが わかった。

発明の要約 本発明の目的は、筋原組織中で特定の核酸配列を発現し得る筋原ベクター系を提 供することにある。

本発明の他の目的は、制御し得る筋原ベクター系を提供することにある。

本発明のさらに池の目的は、年老いたヒトにおける筋萎縮症の治療方法を提供す ることにある。

本発明の他の方法は、を髄損傷または筋肉性疾患によって引き起こされた筋萎縮 症の治療方法である。

本発明の別の目的は、アテローム性動脈硬化性心血管疾患の予防または治療方法 を提供することにある。

本発明の別の目的は、遺伝子置換のために筋原ベクター系を導入することにある 。

本発明の別の目的は、ヒトまたは動物におけるワクチンの製造法を提供すること にある。

本発明の別の目的は、成長疾患の治療方法を提供することにある。

それゆえ、上記目的を達成するため、本発明の一つの態様に従い、プロモーター ：５゛末端が該プロモーターの３′に結合し発現すべき核酸配列を含有するカセ ット；筋原特異的３゛非翻訳領域（３°ＵＴＲ）および該３°ＵＴＲの３゛末端 に隣接した非コード領域（ＮＣＲ）（該ＮＣＲは転写終結シグナルを含有する） からなり、該３’ｔＪＴＲの５“末端が該カセットの３゛末端に結合しているこ とを特徴とする、筋原組織中で核酸配列を発現するための筋原ベクター系（ＭＶ Ｓ）が提供される。

本発明のＭＶＳの特別の態様においては、プロモーター領域の後にさらにリーダ ー配列が含まれる。ＭＶＳのさらに別の態様においては、第一イントロン、開始 ＡＴＧおよびプロモーターリーダー領域とカセット領域との間に挿入されたＮｃ ｏｌクローニング部位が含まれる。該カセットの特別の態様において、その３゛ 末端にＥｃｏＲ１部位が含まれる。３’ＵＴＲは、５′末端にＥｃｏＲＶ部位を 有していてよい。

好ましい態様においては、骨格アルファアクチン遺伝子プロモーター、第一ミオ ンンＬ鎖１プロモーター、ミオノンＨ鎖プロモーター、トロピニン（ｔｒｏｐｉ ｎｉｎ）Ｔプロモーター、筋肉クレアチニンキナーゼプロモーター／エン／％ン サー、サイトメガロウィルスプロモーター、Ｒ８Ｖプロモーターおよびラウスサ ルコーマウィルスＬＴＲよりなる群から選ばれた筋原プロモーターを用いるが、 いかなるプロモーターも機能するであろう。好ましい態様においては骨格アルフ ァアクチンプロモーターを用いる。

同様に、３’ＵＴＲおよびＮＣＲも筋原特異的遺伝子から選択する。好ましい態 様において、骨格アルファアクチン遺伝子の３°ＵＴＲ領域およびＮＣＲ領域を 用いる。

特別の態様において、筋原組織中での特定の核酸配列の発現を制御するために制 御プロモーター要素が付加される。好ましい態様において、ビタミンＤが発現を 制御するために用いられる。

カセットには、ポリペプチドを発現する種々の核酸配列のいずれをも含有させる ことができる。これには、ホルモン、成長因子、酵素、アポリポタンパク質、凝 固因子、ＡＩ［Ｓウィルスコートタンパク質、ウィルス成分タンパク質、ウィル ス表面タンパク質、細菌表面タンパク質、寄生虫細胞表面タンパク質、腫瘍サプ レッサーおよびウィルス逆転写酵素が含まれる。

特別の態様において、カセットは、インシュリン様増殖因子■、インシュリン様 増殖因子■、インシュリン増殖因子結合タンパク質、成長ホルモン放出因子、ア ポリポタンパク質Ａ−Ｉまたは抗体応答を誘発し得るタンパク質のための核酸配 列を含有する。

ＭＳＶは、年いったヒトにおける筋萎縮症、をｔｉｉ損傷または神経筋疾患によ り誘発された筋萎縮症、筋萎縮性側索硬化症および成長疾患の治療に用いる。Ｍ ＳＶはまた、アテローム性動脈硬化性心血管疾患の治療または予防、遺伝子置換 、およびワクチン製造にも有用である。

図面の簡単な記載 図１は、独特の制限部位の位置を含むニワトリ骨格アルファアクチン遺伝子の模 式図である。

図２は、鳥類骨格アルファアクチン遺伝子の転写ドメインおよび転写が終結する 隣接非コード領域を表す（外径・ｍｍ／ｋｂ挿入相対ＧＡＰＤＨ）。

図３は、筋原ベクター系の模式図である。

図４は、骨格アルファアクチン／インツユリン様増殖因子Ｌハイブリ・ソド遺伝 子の模式図である。

図５は、安定にトランスフェクションしたＣ２Ｃｌ２筋芽細胞中でのＩＧＦ−１ ＲＮＡの蓄積による、骨格アルファアクチン３°非翻訳領域および隣接する非コ ード領域を含む筋原ＩＧＦ−１ハイブリッドベクターの増加した活性を示す。

図６は、５Ｋ２０２　ＩＧＦ−１−３’ＳＶａ筋原発現ベクターを用いて生成し たトランスジェニックマウス株におけるＩＧＦ−Ｉ　ＲＮＡの蓄積を示す。

図７は、５Ｋ２０２１ＧＦ−１−３’ＳＫ筋原発現ベクターを用いて生成したト ランスジェニックマウス株におけるＩＣＦ−Ｉ　ＲＮＡの蓄積を示す。

図８は、ビタミンＤレセプターを用いた制御可能ＭＶＳの模式図である。

図９は、キメラレセプターを用いた制御可能ＭＶＳの模式図である。

図１０は、異なる３°ＵＴＲを用いたＩＧＦ−１ｍＲＮＡの安定性を示す。

図面は、必ずしもこのスケールである必要はない。明快さおよび正確さのため、 本発明のある特徴をスケール的に強調して示してもよいし、または模式的に示す 本発明の範囲から逸脱することなく、本明細書に開示した本発明に種々の置換お よび修飾をなし得ることは当業者には明らかであろう。

本明細書において用いる「プロモーター」なる語は、ＲＮＡポリメラーゼが結合 するＤＮＡ鎖上の認識部位をいう。プロモーターは、通常、キャップ部位または 転写開始部位の上流の５゛フランキングＤＮＡ中の約１００〜２００ｂｐのＤＮ Ａ断片である。プロモーターはＲＮＡポリメラーゼと開始複合体を形成して転写 活性を開始および駆動する。この複合体は、「エンハンサ−」を呼ばれる活性化 配列または「サイレンサー」と呼ばれる抑制配列により修飾することができる。

通常、特定の制御配列または要素は、ＤＮＡのタンパク質コード領域に隣接して または該隣接内に埋め込まれる。遺伝子に隣接して位置する要素は、ジス作動性 要素と呼ばれる。これらシグナルは池の拡散性の生体分子によってトランス位に て認識され、転写活性が強化される。これら生体分子はトランス作動性因子と呼 ばれる。トランス作動性因子およびジス作動性要素の存在は、遺伝子のタイミン グおよび発達段階の発現パターンに貢献していることが示されている。ジス作動 性要素は、通常、転写を制御する要素と考えられ、プロモーター領域および他の 上流ＤＮＡフランキング配列内で見つかっている。

本明細書において使用する「リーダー」なる語は、構造遺伝子の５゛末端にあり 該遺伝子と一緒に転写されるＤＮＡ配列をいう。リーダーは、通常、しばしばプ ロ配列と呼ばれるＮ末端側がペプチド伸長したタンパク質となる。細胞外媒質ま たは膜へ分泌されるタンパク質のため、このシグナル配列（大部分疎水性である ）は該タンパク質を小胞体中に運んでいき、そこから適当な方向に放出される。

本明細書において使用する「イントロン」なる語は、遺伝子産物におけるアミノ 酸をコードしない遺伝子中に存在するＤＮＡ部分をいう。イントロンの前駆体Ｒ ＮＡは切り取られ、それゆえｍＲＮＡへ転写もされないしタンノくり質１こ翻訳 もされることはない。

「カセット」なる語は、発現すべき核酸配列を含有する本発明の配列をＬ）う。

カセットは、概念的にカセットテープに類似している。各カセットは、それ自体 の配列を含有しているであろう。それゆえ、カセットを相互に交換すること１こ よりベクターは異なる配列を発現するであろう。５°末端および３°末端の一１ 限部位のため、カセットは容易に挿入、除去、または他のカセットと置換カベで きる。

「３゛非翻訳領域」またはｒ３’ＵＴＲＪなる語は、構造遺伝子の３°末端１こ あり、通常、該遺伝子とともに転写される配列をいう。この３°ＵＴＲ領域１こ １ま、通常、ポリＡ配列が含まれる。３°ＵＴＲはＤＮＡから転写はされる力（ 、タンパク質に翻訳される前に切り取られる。本発明において、筋原特異的３° ＵＴＲを有するのが好ましい。このことにより、筋原組繊中での特異的な安定性 力（得られる。

「非コード領域」またはｒＮＣＲＪなる語は、構造遺伝子の３’ＵＴＲ領域喜こ 隣接する領域をいう。このＮＣＲ領域には転写終結シグナルが含まれる。

３’ｔＪＴＲおよびＮＣＲは、非筋原細胞中ではな（筋原細胞中でのｍＲＮＡの 安定性を増加させることによって高レベルのｍＲＮＡの蓄積を与えるので本発明 の重要な側面である。それゆえ、この増加したｍＲＮＡの安定性力くタンｌ（り 質産生の増加レベルへと導く。

ニワトリ骨格アルファアクチン遺伝子の３゛非翻訳領域は、ヌクレオチド２０６ ０から始まり、２３３１まで続いている。完全な３′非翻訳領域および隣接する 非コードＤＮＡは、さらに２．ＯＫｂ延びている。この２．３Ｋｂ断片は、発現 しようとするポリペプチドをコードするコピーＤＮＡ配列へ天然の翻訳停止コド ンの直後に連結することができる。

「筋原」または「筋原特異的」なる語は、筋肉組織をいう。この筋肉組織は、イ ンビボ組織、インビトロ組織、または筋肉組織に分化し得る細胞のインビトロ組 織培養液であってよい。筋原細胞には、骨格筋細胞、心筋細胞および平滑筋細胞 が含まれる。これらベクターを培養中の筋原細胞中にトランスフエクンコンし、 完全な筋肉組織中に注入する。構造遺伝子を含有するこれらベクターを哺乳動物 の卵母細胞中に注入し、ゲノム中に安定に組み込んでトランスジェニック動物を 生成させることができ、該動物中で該ベクターは筋原細胞中にてポリペプチドを 発現する。

「制限部位」なる語は、制限エンドヌクレアーゼの配列特異的な開裂部位をいう 。

「ベクター」なる語は、ＤＮＡ断片を宿主生物または宿主組織中に導入すること ができるある種の手段をいう。プラスミド、バクテリオファージおよびコスミド を含む種々のタイプのベクターが存在する。

「有効量」なる語は、ポリペプチドを適切なレベルで産生させるのに充分なＭＶ Ｓを筋原組織または培養液中に注入することを意味する。当業者であれば、この 実際のレベルがＭＶＳの使用に依存するであろうことがわかるであろう。これら レベルは、治療、ワクチン製造、または予防接種において異なるであろう。

本発明の一つの態様において、プロモーター；５°末端が該プロモーターの３゜ 末端に結合したカセット、筋原特異的な３’ＵＴＲおよび該３°ＵＴＲの３′末 端に隣接したＮＣＲからなる、筋原組織中で核酸配列を発現させるための筋原ベ クこの基本系は、プロモーターとカセットとの間にリーダー配列を付加すること を含む種々の方法で促進することができる。

好ましい態様において、筋原組織中で核酸配列を発現させるためのＭＶＳは、該 核酸配列を発現する機能単位を含む。この機能単位には、５°から３°へすべて 連続的に連結した要素からなる。これら要素には、その連結順に、プロモーター 、５’ｍＲＮＡリーダー配列、第一イントロンおよび開始ＡＴＧおよびＮｃｏＩ クローニング部位、３′末端にＥｃｏＲ１部位を有するカセット、筋原特異的３ ゜ＵＴＲ（該３’ＵＴＲの５゛末端はＥｃｏＲＶ部位を有する）、および該３° ＵＴＲの３゛末端に隣接したＮＣＲが含まれる。

ＭＶＳには種々のプロモーターを用いることができる。幾つかの例としては、骨 格アルファアクチン遺伝子プロモーター、第一ミオシンＬ鎖１プロモーター、ミ オシンＨ鎖プロモーター、トロピニンＴプロモーター、筋肉クレアチニンキナー ゼプロモーター、サイトメガロウィルスプロモーター、Ｒ８Ｖプロモーターおよ びラウスサルコーマウィルスＬＴＲが挙げられる。好ましい態様において、骨格 アルファアクチン遺伝子プロモーターなどの筋原特異的なプロモーターを用いる 。

３’ＵＴＲおよびＮＣＲは、筋原特異的な遺伝子群から選択することができる。

この群の遺伝子の例としては、骨格アルファアクチン遺伝子、第一ミオシンＬ鎖 １遺伝子、ミオシンＨ鎖遺伝子、トロピニンＴ遺伝子、アセチルコリンレセプタ ーサブユニｙ）遺伝子および筋肉クレアチニンキナーゼ遺伝子が挙げられる。好 ましい態様において、３°ＵＴＲおよびＮＣＲは骨格アルファアクチン遺伝子か らのものを用いる。

本発明の別の態様には、核酸配列の発現を制御するための制御系の付加が含まれ る。

種々の制御系のいずれをも用いることができる。好ましい態様において、２つの 異なる制御系を用いた。

筋原組織中で特定の核酸配列を発現させるための制御ＭＶＳの一つの態様（図７ 参照）は、第一機能単位および第二機能単位からなる。これら第一機能単位およ び第二機能単位は、同じベクター中にあってもよいし、または２つの別々のベク ター中にあってもよい。いずれの場合も、両機能単位は筋原組織中に導入しなけ ればならない。

第一機能単位は、すべて５°から３′へ連続的に連結した以下の要素からなる。

筋原特異的なプロモーター、レセプターをコードする核酸配列、筋原特異的な３ ’ＵＴＲおよび筋原特異的なＮＣＲ０第二機能単位は、すべて５゛から３°へ連 続的に連結した以下の要素からなる二上記レセプターに対応する応答要素、チミ ジンキナーゼプロモーター、目的の特定核酸配列を含有するカセット、筋原特異 的な３°ＵＴＲおよび隣接した筋原特異的なＮＣＲ。

この制御可能なＭＶＳにおいて、第一機能単位がレセプターを継続的に発現する のが好ましい。該レセプターに特異的な因子を鎖糸に導入するときには、筋原組 織では高レベルで認められないレセプターを使用するのが好ましい。レセプター は、上記応答要素および該特異的因子と相互作用を形成する。この結合相互作用 により、チミジンキナーゼプロモーターは特定の核酸配列を発現するようになる 。存在する特異的因子の量を制御することにより、ＭＶＳの活性が制御される。

この制御可能な系において応答要素とレセプターとは通常相補的であり、種々の レセプター群から選択することができる。たとえば、ビタミン、ステロイド、甲 状腺薬、稀用薬（ｏｒｐｈａｎ）　、ホルモン、レチノイン酸およびチロキシン を用いることができる。好ましい態様において、ビタミンＤレセプターおよびビ タミンＤ応答要素を用いる。この場合、たとえばミルクを飲むことによるビタミ ンＤの摂取が血中のビタミンＤレベルを引き起こす。これが筋原組織中で生成し たレセプターと結合し、該複合体がレセプター要素と結合して目的遺伝子の発現 を引き起こす。それゆえ、ＭＶＳは食事の摂取により制御することができる。

ＭＶＳの制御のための別法を図９に示す。この態様において、アルファアクチン プロモーター領域中の血清応答要素の少なくとも一つをレセプター結合部位中に 組み込む。ついで、血清応答因子の通常のＤＮＡ結合ドメインを該レセプターの ＤＮＡ結合ドメインと置換したキメラトランス因子（ｔａｒｎｓｆａｃｔｏｒ） を構築する。血清応答因子のトランス活性化（ｔｒａｎｓａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ）　ドメインは変化させない。それゆえ、レセプターに特異的な因子またはりガ ントが存在する場合、それはレセプターに結合ドメイン中で結合し、血清応答ト ランス活性化因子が転写を活性化することを可能にする。それゆえ、該特異的因 子の量をコントロールすることにより制御をコントロールすることができる。通 常の血清応答因子中に置換されるＤＮＡ結合ドメインは、通常、以下のレセプタ ー結合ドメイン群から選択される：ビタミン、ステロイド、甲状腺薬、稀用薬、 ホルモン、レチノイン酸およびチロキシン。好ましい態様において、ビタミンＤ レセプターを用いる。

カセットには、目的核酸配列が含まれていてよく、筋原組織または筋原組織培養 液中で発現すべき核酸配列を含む。これら核酸配列は、種々のポリペプチドを産 生じ得る。このポリペプチドは、公知のタンパク質を含む（これに限られるもの ではない）いかなる所望のポリペプチドであってもよい。たとえば、該配列は、 ホルモン、成長因子、酵素、アポリポタンパク質、腫瘍サプレッサー、腫瘍抗原 、ウィルスタンパク質、凝固因子、およびＡＩＤＳウィルスに付随するタンパク 質、並びにウィルス表面コートタンパク質、細菌表面タンパク質、寄生虫細胞表 面タンパク質、ウィルス逆転写酵素を含む他のウィルスタンパク質、および遺伝 子置換によって置換する必要のある遺伝子をコードしていてよい。

ＭＶＳの特別の態様において、カセットには、インシュリン様増殖因子■、また はインシュリン様増殖因子■またはインシュリン増殖結合タンパク質のための核 酸が含まれる。この特別の態様は、年いったヒトにおける筋萎縮症、を髄損傷ま たは神経筋疾患によって引き起こされる筋萎縮症の治療に用いることができる。

後者の症例の特別の例は、筋萎縮性側索硬化症である。

他の特別の態様は、カセットが成長ホルモン放出因子をコードする核酸配列を含 有するＭＶＳである。このＭＶＳは、年いったヒトにおける筋萎縮症を治療する のに用いることができる。

本発明の他の態様としては、カセットがアポリポタンパク質Ａ−Ｉのための核酸 配列を含有するＭＶＳが挙げられる。このＭＶＳは、アテローム性動脈硬化性心 血管疾、轡の予防または治療に用いることができる。

ＭＶＳ力セントがウィルスタンパク質、細菌タンパク質または寄生虫タンパク質 をコードする配列を含有する場合には、このＭＶＳはワクチンの製造に用いるこ とができる。この場合、ヒトまたは動物ワクチンを製造する手順には、有効量の ＭＶＳを骨格筋中または組織培養中に注入する工程が含まれる。このＭＶＳベク ターにおいて、カセットには抗体応答を引き起こし得るポリペプチドをコードす る核酸配列が含まれる。この手順は、ワクチンを製造するための安全で有効な方 法である。ワクチンは、組織培養液中、またはヒトまたは動物でインビボで製造 することができる。抗体応答を引き起こし得る核酸配列の例としては、ウィルス タンパク質、細菌タンパク質および寄生虫タンパク質のためのものが挙げられる 。特別の例はＡＩＤＳタンパク質である。

本発明の他の特別の態様は、有効量のＭＶＳを骨格筋中に注射する工程からなり 、カセット中の核酸配列が成長ホルモン配列を含有することを特徴とする、成長 疾患の治療方法である。

本発明の他の応用は、遺伝子置換のための方法である。この態様においては、有 効量のＭＶＳを骨格筋中に注射し、カセットには欠損遺伝子をコードする配列が 含まれる。たとえば、グリコーゲンホスホリラーゼ、アルファー１＝抗トリプシ ンおよびシストロフィンの遺伝子をカセット中に挿入することができる。それゆ え、グリコーゲン貯蔵疾患、アルファー１−抗トリプシン不足または肺気腫およ びデュシェン型筋異栄養症の対応疾患を有する個体は、充分量の正常ポリペプチ ドを産生ずるであろう。発現されたタンパク質は、循環血液系によって動物の体 内に全身的に広がってい（し、注射した筋組織中にも貯留される。所望により、 ポリペプチドを回収し、精製することができる。

本明細書に記載したＭＶＳのいずれも、細胞による取り込みを高めるためにさら に修飾することができる。この促進には、コーティングを付加することが含まれ る。コーティングには、ＤＮＡ開始複合体およびヒストンが含まれる。この開始 複合体には、血清応答因子（ＳＲＦ）　、転写開始因子（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ ｉｏｎｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ　ｆａｃｔｏｒ）　（Ｔ　Ｉ　Ｆ）およびトランス 制御因子（ｔｒａｎｓｒｅｇｕｔａｔｏｒｙｆａｃｔｏｒ）　（Ｔ　ＲＦ　）が 含まれる。ＳＲＦは、ＭＶＳのプロモーター領域内の血清応答要素に結合する。

ついで、ＴＩＦおよびＴＲＦは該ＳＲＦおよびプロモーター内のＴＡＴＡボック スと相互作用し、安定なりＮＡ複合体を形成する。ヒストンは、ＭＶＳ中の残り のＤＮＡに非特異的に結合する。

以下の実施例は説明のために提供されるものであり、本発明を制限することを意 図するものではない。

実施例１ ニワトリ骨格アルファアクチン遺伝子の単離ラムダシャロン４Ａベクターから単 離したニワトリゲノムＤＮＡの２５ＫｂＥｃｏＲ１断片には、ｐＢＲ３２２の単 一のＨｉｎｄｌ［ｒ部位上に６．２Ｋｂの骨格アルファアクチン遺伝子を含有す る（図１に示す）。チャンク（Ｃｈａｎｇ）ら、Ｍｏ１．Ｃｅ１１．Ｂｉｏｌ、 Ｖｏ　１．４　：　２４９８〜２５０８　（１９８４）、核転写ランオフ（ｒｕ ｎｏｆｆｓ）を用い、骨格アルファアクチン遺伝子の転写ドメインをマツピング した（図２）。５゛非コード領域、プロモーター領域、コード領域、および隣接 する３′非コード隣接を包含するＤＮＡプローブをＭ１３ベクター中にクローニ ングし、これによりセンスプローブおよびアンチセンスプローブが得られた。

線維芽細胞、胚芽細胞および１９日目の胚筋肉細胞から単離した核をインビトロ 転写アッセイに用い、放射能で標識したヌクレオチドを用いてＲＮＡ転写物を伸 長した。ドツトした（ｄａｔｔｅａ）　ＤＮＡプローブにハイブリダイズした標 識ＲＮＡは、骨格アルファアクチン遺伝子のポリ人付加部位の約１ｋｂ下流で転 写が終了することを示していた。これは、転写の開始から＋２８００および＋３ ６００ヌクレオチドの間の８ＱＱｂｐ　ＰｖｕＩＩ断片内に存在する。

３°非翻訳領域（３°ＵＴＲ）および隣接非コード領域（ＮＣＲ）は、上記６． ２Ｋｂアクチン遺伝子を平滑末端切断手段であるＮａｅｌで制限エンドヌクレア ーゼ消化することにより単離することができ、これにより翻訳停止コドンＴＡＡ の３０ｂｐ上流で切断される。Ｈｉｎｄｌ［［は、ベクターｐＢＲ３２２からア クチン遺伝子の３′側のほとんどの部分を放出する（図３）。３°ＵＴＲおよび ＮＣＲを用いてＤＮＡ構築物を調製した。骨格アルファアクチンプロモーターお よびＤＮＡフランキング配列（ｍＲＮＡキャップ部位から少なくとも４１１ヌク レオチド）、および骨格５°非コードリーダー、第一イントロンおよび翻訳開始 ＡＴＧまで広がるＤＮＡ配列（＋１９６にてＮｃｏＩクローニング部位に変換） を、ＸｂａｌおよびＮｃｏＩ消化によりＭ１３１本鎖ＤＮＡから切り離し、フレ ノウ充填し、ついでｐＢＩｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＫｓ　（ストラタジーン）のＸ 、ｂａ１部位および平滑Ｓｍａ　１部位に連結した。このクローニング工程によ りＮＣｏ１部位が再び生成される。２．３ｋｂ　Ｎａｅ　Ｉ／Ｈｉｎｄｌ１１断 片上の３’ＵＴＲおよびＮＣＲをｐＢＩｕｅｓｃｒｉｐｔＩ［Ｋｓベクターカセ ットの平滑ＥｃｏＲＶ部位および隣接するＨｉｎｄｍ部位中に方向付けてクロー ニングした。これらＥｃ。

ＲＶ部位およびＮａｅ１部位を破壊する。回復させたＮｃｏ１部位を用いてポリ ペプチドをコードするｃＤＮＡ配列を挿入した。他のクローニングベクターの構 築を、−４１１から−１１の骨格アルファアクチンプロモーターを３’ＵＴＲお よびＮＣＲに隣接して挿入することにより行った。この筋原ベクターは、第一イ ントロンおよび骨格アクチン５゛リーダー配列が省かれている。３’ＵＴＲおよ びＮＣＲの効力を試験するため、これら２つのベクターをＤＮＡ構築物を調製す るのに用いた。

実施例２ ヒトＩＧＦ−１を含有するＭＶＳの構築骨格アクチンプロモーターを含有する構 築物を標準組換えＤＮＡ法によりヒトＩＧＦ−Ｉ　ｃＤＮＡに連結した。マニア チア、　（Ｍａｎｉａｔｉｓ）　、７リツチユ（Ｆ　ｒｉｔｃｈ）およびサンプ ルツク（Ｓ　ａｍｂｒｏｏｋ）　、モレキュラー・クローニング、ア・ラボラト リ−・マニュアル、コールド・スプリング・ハーバ−・ラボラトリ−、コールド スプリングハーバ−、ニューヨーク、１９８２゜−膜化したＭＶＳの構造の例を 図３に示す。特別の構築物ＩＧＦ−１を図４に示す。ＳＶ４０ポリＡ付加部位お よび小さなｔ−イントロンがＩＧＦ−１ｃＤＮＡの３゛非翻訳領域に連結される ように構築を行った。これらＳＶ４０配列は、核ＩＣＦ−Ｉ　ＲＮＡ転写物の安 定性を増加させるために付加した。５Ｖ４０−ｔ−イントロンは筋肉細胞中にお けるＩＧＦ−１の発現に完全には適していないかもしれないので、他の５つのベ クターを作製した。５Ｋ７３３Ｎｃａｌベクターには、骨格アルファアクチンプ ロモーターの約４１１ヌクレオチド、天然のキャップ部位、５°非翻訳リーダー および第一イントロンが含まれている。ＩＧＦ−Ｉ　ｃＤＮＡを含有するカセッ トのための唯一の挿入クローニング部位を創設するためにＮｃｏ　Ｉ部位を操作 し、該ｃＤＮＡ中の開始ＡＴＧもＮｃｏ１部位に変換した。５Ｋ７３３１ＧＦ− １構築物ではそれ自体のポリＡ部位を利用する。骨格アルファアクチン３゛非翻 訳領域、ポリＡ付加部位および終結配列を組み込んだＮａｅＩ／Ｈｉｎｄ１１ｒ 断片を、５Ｋ２０２．５Ｋ７３３Ｎｃｏｌ、ＩＧＦ−１および５Ｋ７３３１ＣＦ −Ｉに連結した（ｒＧＦ−１ポリＡ部位が欠失し、骨格アルファアクチンのポリ Ａ部位で置換されていた）。このようにして、骨格アルファアクチン３゛非翻訳 領域を含有するＩＧＦ−Ｉ　ＲＮＡ転写物が安定化され、骨格筋細胞中に蓄積す る。加えて、隣接３′非コードＤＮＡを提供することにより、ＩＧＦ−■は外部 ゲノム配列に対して緩衝され、それゆえゲノム中に組み込まれた場合に位置効果 から一層保護される。加えて、天然の終結配列を提供することにより、骨格アル ファアクチンの転写ドメインをマークする付加制御配列は、組織特異性、発達の タイミングおよび転写活性を改善する。

実施例３ ＭＶＳ構築物の活性 マウス筋原細胞におけるアクチンプロモーター／遺伝子ＩＧＦ−Ｉハイブリッド 遺伝子の効力を決定するため、哺乳動物Ｃ，Ｃ，□筋芽細胞胚芽ックグラウンド 中でこれら遺伝子を用い、安定なトランスフェクションしたＣ４Ｃ１２筋芽細胞 の集団を作製することによりＭＶＳを研究した。変化したＩＧＦ−Ｉ発現レベル をこれら安定な胚芽細胞株中で直接評価した。各ＩＧＦ−１構築物（図４）を薬 剤選択ベクターＥＭＳＶ−ハイグロマイシンとともにマウスＣ２Ｃ，□細胞中に 同時トランスフェクションした。２週間の選択の後、安定な胚芽細胞の集団を選 択した。ＥＭＳＶ−ハイグロマイシンでのみ安定にトランスフェクションされた Ｃ　２　Ｃ＋□筋筋線細胞集団は、コントロールとして働いた。トランスフェク ションした胚芽細胞の視覚検査により、筋肉細胞の分化に対するＩＧＦ−１の役 割についての幾つかの洞察が得られた（トランスジェニックマウスでは明らかで はなかった）。一般に、ＩＧＦ−１遺伝子を含有する筋原細胞株はすべて、増殖 培地（１０％０％ラン血清）中にある胚芽細胞をコントロールに比べて一層激し く複製させた。培地を２％ウマ血清に変えると分化過程が開始される。この過程 において、コントロールのＣ２Ｃ１筋芽細胞は４日間の間に融合して多核節管を 形成する。

培養皿当たり同一の細胞密度では、５Ｋ７３３１０Ｆ−１，５Ｋ２０２１０Ｆ− １−３Ｋ、５Ｋ７３３１ＧＦ−Ｉ−５ＫＩおよび５Ｋ７３３１ＧＦ−１−８Ｋ２ を含有する胚芽細胞は、Ｃ２Ｃｌ２またはＥＭＳＶ−ハイグロマイシンコントロ ール胚芽細胞に比べて少な（とも２〜３日早く融合した。

図５は、Ｃ２Ｃ１１筋芽細胞におけるＩＧＦ−Ｉ　ｍＲＮＡの定常状態蓄積を示 す。

増殖培地（Ｇ）または分化培地（Ｄ）中で増殖する安定にトランスフェクション したＣ２Ｃｌ２筋芽細胞から等量の全細胞ＲＮＡを単離した。このＲＮＡを電気 泳動により変性アガロースゲル上で分離し、ナイロンフィルターに移し、標準ハ イブリダイゼーション技術下、均一に３２ｐ標識した完全長ヒトＩＣＦ−Ｉ　ｃ ＤＮＡでプローブした。Ｘ線フィルム上のオートラジオグラフシグナルの強度は 、ｍＲＮＡ蓄積の相対測定、筋原発現ベクター系の転写活性およびｍＲＮＡ安定 性の全体的指標を与える。ベクター５Ｋ２０２１ＧＦ−１３’ＳＶａ中のＩＧＦ −１ｍＲＮＡは、胚芽細胞レベルを越えて節管中に蓄積することはなかった。こ れは典型的な発現活性である。５Ｋ７３３ＩＧＦ−１ベクターはＩＧＦ−１の３ ゛非翻訳領域を含有する。このベクターからのＩＧＦ−１ｍＲＮＡは節管中に蓄 積したが、５Ｋ２０２ＩＧＦ−Ｉ−３Ｋまたは５Ｋ７３３１ＧＦ−Ｉ−ＳＫ２よ りも実質的に低いレベルであった。これら後者の２つのベクターは、骨格アクチ ン３°ＵＴＲおよび隣接非コード領域を含有している。これらベクターの主要な 違いは３°ＵＴＲであるので、骨格３’ＵＴＲによるｍＲＮＡ転写物の増加した 安定化がｍＲＮＡ含量における約１００倍の違いを説明している。

実施例４ ＭＶＳからのＩＧＦ−Ｉの分泌レベルの測定合成され培地中に分泌されたＩＧＦ −１の量を測定するため、分化した節管培養液を最小培地（ＤＭＥＭおよび領０ ５％ウソ血清アルブミンＲＩＡグレード）中で増殖させた。５Ｋ７３３１ＧＦ− Ｉ−３Ｋ２が筋肉細胞中にＩＧＦ−１を発現する最も有効な構築物である。ＩＧ Ｆ−１を組織培養液のラジオイムノアッセイおよび細胞のイムノペルオキシダー ゼ染色の両方によりアッセイした。本発明者らは、本発明者らの筋肉培養液の幾 つかの融合の間に増加レベルのＩＧＦ−Ｉを認めた。異なるＭＶＳからのレベル の比較を表１に示す。コントロールの培養液においてはＴＧＦ−Ｉのレベルは０ ．２〜Ｑ、５ｎｇ／ｍｌの範囲であった。これに比べて、ベクター５Ｋ７３３　 ｒＧＦ−１−８Ｋ２は少なくとも１００倍大きなＩＧＦ−１のレベルを有する。

ｍＲＮＡの安定性に対する骨格アルファアクチン３°ＵＴＲの役割をトランスフ ェクションしたＣ２Ｃｌ２筋原細胞の安定な集団において調べた。転写阻害剤で あるアクチノマイシンＤ（８μｇ／ｍｌ）を分化した筋原培養液に節管期にて加 え、ＲＮＡブロッティング分析のため一定時間の試料を取り、ＩＧＦ−１ｍＲＮ Ａの相対量を決定した。天然のヒトＩＧＦ−１３°ＵＴＲを含有する転写物は、 １時間未満の半減期で迅速に代謝回転することがわかった。これら結果は、成長 因子の短い半減期と一致している。ＳＶ４０３’ＵＴＲおよびポリＡ付加シグナ ルを含有するＩＧＦ−Ｉ転写物は、約４時間の半減期を示した。対照的に、骨格 アルファアクチン３’ＵＴＲを含有するＩＧＦ−Ｉ転写物は、１８時間以上の半 減期を有し、高レベルの安定性を示した。これら結果は、５Ｋ７３３１ＧＦ−Ｉ −８Ｋ２でトランスフェクションしたＣ２Ｃｌ２筋芽細胞中に蓄積する高レベル のＩＧＦ−１ｍＲＮＡが、一部、隣接する骨格アルファアクチン３°ＵＴＲを含 有するｍＲＮＡの分化安定化によるものであるとの主張を支持している。

表■ 安定にトランスフェクションしたＣ２Ｃ，□胚芽細胞中のＩＧＦ−Ｉレベルａｓ ｓ　ＩＧＦ−１（ｎｇ／ｍｌ培地／４日）ＳＫ２０２ＩＧＦ−Ｉ−３’ＳＶａ　 ４．４ＳＫ７３３１ＧＦ−Ｉ　３．８ ＳＫ７３３１０Ｆ−１−３Ｋ２　７９．０コントロールＣ２Ｃｌ２　０．５ 同様に、筋原培養液のイムノペルオキシダーセ染色により、安定にトランスフェ クションした胚芽細胞では免疫反応性ＩＧＦ−１の産生が増加したが、コントロ ールのＥＭＳＶ−ハイグロマイシントランスフエクションした胚芽細胞または潅 流ｃｚｃｕ細胞では増加しなかった。ＡおよびＤ領域に対する抗体を１　：　１ ０００の希釈で用いた。５Ｋ２０２１ＧＦ−Ｉを含むすべてのトランスフェクシ ョン株がイムノペルオキシダーゼで陽性に染色された。それゆえ、促進されたレ ベルのＩＣＦ−Ｉが合成され、安定な胚芽細胞から運び出されたことが明らかで ある。

実施例５ トランスジェニックマウス中へのＭＶＳの挿入５Ｋ２０２１ＧＦ−Ｉ−３’ＳＶ ａまたは５Ｋ２０２１ＧＦ−Ｉ−８Ｋを有するトランスジェニックマウスを標準 卵母細胞注入法（プリンスター（Ｂ　ｒｉｎｓｔｅｒ）、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、ＵＳＡ　Ｖｏ　Ｉ　８２　：　４４３８〜４４４２　（１ ９５８）　）により作製し、飼育して導入遺伝子の次世代への安定な伝達を示し た。トランスジェニックマウスの同定は、尾切断ＤＮＡから複製連鎖反応または サザーンゲノムＤＮＡプロッティングにより行った。図６および７に示すように 、幾つかの組織から単離した全ＲＮＡのＲＮＡブロッティングにより、移したＩ ＧＦ−１ベクターの筋肉特異的発現についてトランスジェニックマウスを試験し た。

ＳＶ４０３°イントロンおよびポリＡ付加配列を含有する５Ｋ２０２１ＧＦ−１ −３’ＳＶａを用い、独立したトランスジェニックマウス株５４８４．５４９６ ．５８３２．５８３４を作製した。これら株からのマウスは、主として心臓組織 において弱い発現を有することがわかったが、骨格筋および腎臓や脳などの非筋 原組織中では非常に低レベルであることが認められた（図６）。５Ｋ７３３ＩＧ Ｆ−■−３°ＳＫ２を用いて独立したトランスジェニックマウス株３３５７．３ ３５９を作製した。これら株からのマウスは、ＩＧＦ−１の発現レベルが上昇し ていることがわかった（図７）。これらレベルは、内因性のマウスアルファアク チン遺伝子活性に匹敵する。５Ｋ７３３　ＩＧＦ−１−３’ＳＫ２からのこれら レベルは、５Ｋ２０２１ＧＦ−１−３’ＳＶａベクターにより産生されるレベル と比較してＩＧＦ−１ｍＲＮＡの蓄積が少なくとも１００〜１０００倍大きいこ とを示している。骨格アルファアクチン３°ＵＴＲおよび隣接非コード領域の付 加により、ＩＧＦ−Ｉ　ＲＮＡが心臓よりも骨格筋で優先的に増加した。それゆ え、骨格アクチンの３°ＵＴＲおよびＮＣＲは、筋肉特異的な遺伝子発現を促進 する重要な役割を有する。

筋肉組織ホモジネートをラジオイムノアッセイにより分析してＩＧＦ−１産生の 相対レベルを決定した。ＩＧＦ−１を含有する酸性クロマトグラフィー画分をプ ールし、凍結乾燥し、再構成し、リュウ（Ｌｉｕ、　Ｆ、）　、パラエル（Ｐｏ ｗｅｌｌ、　Ｄ。

Ｒ６）、スタイン（Ｓ　ｔｙｎｅ、　Ｄ、　Ｍ、　）およびヒンツ（Ｈｉｎｔｚ 、　Ｒ，Ｌ、）のプロトコール（（１９１）　Ｊ、Ｃ１１ｎ、Ｅｎｄｏｃｒｉｎ 、Ｍｅｔａｂ、７２　：　９０５〜９１１）に従ってアッセイした後、ホモジネ ートを酸性クロマトグラフィーにかけてＩＧＦ結合タンパク質からＩＧＦ−１を 分離した。ＩＧＦ−１抗血清は、ナショナル・ホルモン・アンド・ピチュイタリ ー・プログラム（Ｎａｔｉｏｎａｌ　ＨｏｒＩＩｌｏｎｅ　ａｎｄ　Ｐｉｔｕｉ ｔａｒｙＰ　ｒｏｇｒａｍ）によって提供された。表Ｈにおいて、本発明者らは 、コントロールと比較してトランスジェニック５Ｋ７３３３ＩＧＦ−ＩＳＫ筋肉 においてＩＧＦ−■含量が１０倍増加することを検出した。それゆえ、増加した Ｉ　ＧＦ−１ｍＲＮＡ含量と、トランスジェニックマウス筋肉組織で発現された ＩＧＦ−１の１オーダーを越える大きさの増加との間に良好な相関が存在する。

表■ ＩＧＦ−１トランスジエニツクマウスにおけるＩＧＦ−Ｉの筋肉含量（１００ｎ ｇ／１００μｇ筋肉タンパク質）コントロール　１１・５ ＳＫ７３３ＩＧＦ−１−３’ＳＫ２　１０５．５マウス株３３５７ 実施例６ 完全筋肉中へのＭＶＳの発現 滅菌２０％ンヨ糖溶液（ｗｔ／ｖｏ　ｌ）中の完全プラスミドＤＮＡを成熟鳥類 または哺乳動物筋肉中に注入することができる。１回の注入後、ベクターＤＮＡ は、組み込まれない染色体外環状ＤＮＡとして筋肉核中に少なくとも３０日間安 定であり、転写的に活性である。ウォルフ（Ｗｏｌｆ）ら、Ｓ　ｃｉｅｎｃｅ、 ２４７二１４６５〜１４６８　（１９９０）、しかしながら、ウオルフ（Ｗｏｌ ｆｆ）プロトコール（ウオルフら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　Ｖｏｌ、　１ １　：　４３７４〜４８５．１９９１）下では、注入したＤＮＡの９９％以上が 筋肉中で分解される。このプロトコールは、筋肉中へのプラスミドＤＮＡの取り 込みを増加させ、ベクターの分解を減少させることによって改良することができ る。本発明の手順では、開運転写制御因子、ヒト血清応答因子および他のヒト関 連核タンパク質（ヒストンなど）および転写開始因子でコーティングしたＭＶＳ 　ＤＮＡを用いて取り込みおよび安定性を促進させる。これら制御タンパク質は 、筋肉ヌクレアーゼに対してＤＮＡを保護し、筋原核中への該タンパク質でコー ティングしたＤＮＡの取り込みを容易にする。

ＭＶＳは、血清応答要素の内部コアＣＣ（Ａ／Ｔ）６ＧＧとの血清応答因子の配 列特異的な結合により、およびヒストンの付加によりタンパク質／ＤＮＡ複合体 を形成する。プロモーターの内部コアとの相互作用により、骨格アルファアクチ ン遺伝子の筋原細胞型に制限された発現が容易になる。血清応答因子、転写開始 因子、トランス制御因子およびヒストンをインビトロ結合反応によりＭＶＳに加 えて再構成タンパク質／ＤＮＡ複合体を形成させる。

生後の遺伝子療法の一つの方法には、特定のポリペプチドの発現の目的のために 成体筋肉中に筋原ベクターを注入することが含まれる。筋原ベクター５Ｋ７３３ １ＧＦ−１−５Ｋ２を約１００μｇ／１００μＩにて下垂体切除したＢＡＬＢ／ Ｃマウスの腓腹筋中に注入した。注入後１〜４週間の間に全筋肉を除去し、未注 入の対側肢と比較してＩＧＦ−Ｉ　ｍＲＮＡ含量をアッセイした。コントロール と比較して、チューブを注入した肢はＭＶＳの発現のためにＩＧＦ−１ｍＲＮＡ のレベルが増加しているはずである。

小さなマウスの外側広筋中への５Ｋ７３１０Ｆ−１−３Ｋ２プラスミドＤＮＡ（ ２０μｇ）の注入は、ＩＧＦ−１ランオイムノアツセイによってアッセイされる ように、プラスミドベクターｐＳＫ−３°ＳＫのみを注入したコントロールに比 べてＩＧＦ−Ｉレベルが平均６０％増加した。５Ｋ７３３１１０Ｆ−ｊ−８Ｋ２ を注入した２匹のマウスは、表■に示すようにＩＧＦ−ルベルが２倍になった。

表■ ７７６　ｐＳＫ−３’ＳＫ　４．２ ７７７　ｐＳＫ−３’ＳＫ　４．２ ７７８　ｐＳＫ−３’ＳＫ　４．５ ７７９　ｐＳＫ−３’ＳＫ　３．９ ７８０　ｐＳＫ−３’ＳＫ　３．９ ７８１　ｐＳＫ−３°ＳＫ　４．２ ７８２　ｐｓＫ７３３１ＧＦｓＫ２　４．５７８３　ｐＳＫ７３３ＩＧＦＳＫ２ 　６．３７８４　ｐｓＫ７３３１ＧＦｓＫ２　８．２７８５　ｐＳＫ７３３ＩＧ ＦＳＫ２　６．９７８６　ｐｓＫ７３３１ＧＦｓＫ２　８．４７８７　ｐｓＫ７ ３３１ＧＦｓＫ２　７．０実施例７ 成長ホルモンを用いた治療 成長ホルモンは下垂体前葉で産生および分泌され、思春前期の子供の直線的成長 を促進する。成長ホルモンの分泌は、視床下部ホルモンの刺激（成長ホルモン放 出ホルモン）および抑制（ソマトスタチン）により制御される。成長ホルモンは 肝臓および他の組織に作用してインシュリン様増殖因子Ｉの産生を刺激する。

この因子が成長ホルモンの成長促進作用の原因である。さらに、この因子は、全 体的な成長ホルモン分泌の指標としても働く。血清のＩＧＦ−Ｉ濃度は、内因的 または外因的に投与された成長ホルモンに応答して増加する。これら濃度は、成 長ホルモンが欠乏していると低い。ＩＧＦ−１の配列を含有するＭＶＳ　（たと えば、５Ｋ７３３１ＧＦ−４３に２）の注射は成長障害を治療するのに用いるこ とができる。ＭＶＳの注射は、成長ホルモンの欠乏した患者においてＩＧＦ−Ｉ の全身的血液濃度を増加させるための長期の安価な方法である。

実施例８ 加齢による筋萎縮症の治療 成長ホルモンレベルは、年齢とともに減少する。年齢が５５以上の健康な男女の レベルは、１８〜３３の男女のレベルに比べて約１／３低い。成長ホルモンおよ びＩＧＩ−Ｉ産生の減少は筋肉容量の減少と相関関係があり（老年性筋萎縮症と 呼ばれる）、健康なヒトで生じる肥満の増加と相関関係がある。健康な若い男性 よりも低い血清レベルを有する健康な６１〜８１歳の老人に週３回成長ホルモン を投与すると、血清ＩＧＦ−ルベルが若い健康な成人に認められる程度にまで増 加する。この増加レベルによって、筋肉容量および強度が増大し、体脂肪が減少 した。

筋原ベクター系中の都合のよいクローニング部位を用い、ヒト成長ホルモンｃＤ ＮＡ配列および／またはヒト成長ホルモン放出（分泌）ホルモンを含有するＭＶ Ｓベクターを構築する。筋肉内注射後のＭＶＳによる成長ホルモン遺伝子の発現 は、ＩＧＦｉ血清レベルを増加させる他の方法である。成長因子放出ホルモン（ ＧＨＲＨ）のＭＶＳ発現は、ＩＧＦ−Ｉまたは成長ホルモンベクター転写物のい ずれの発現に比べても一層有利である。ＧＨＲＨは年配の人で減少するので、下 垂体前葉が成長ホルモンを合成する能力よりもむしろＧＨ分泌の欠如に原因があ ると思われ、それゆえ、筋肉からのＧＨＲＨ発現の増加は全身血液系でのＧＨＲ Ｈレベルを増加させ、下垂体前葉からのＧＨの自然な日中分泌パターンが可能と なるであろう。このようにして、ＧＨＲＨは自然な分泌促進として働き、年配の 人の視床下部からのＧＨの分泌または放出を高めることができる。

それゆえ、筋原ベクター系を適用して５Ｋ７３３１ＧＦ−ＩＳｋ２ベクターを成 人筋肉中に注射することによりインシュリン様増殖因子を発現させることは、年 配の人のＩＧＦ−１の全身的な血液濃度を増加させるための長期の安価な方法で ある。

実施例９ を髄損傷、神経除去および神経筋疾患によって誘発されたヒト筋萎縮症インシュ リン様増殖因子は、筋肉の発達および筋肉の増殖を強化する重要な因子の一つで ある。胚芽細胞は、生来、融合の開始の間にＩＧＦ−Ｉ／ＩＧＦ−ｎ並びに同族 の結合タンパク質を分泌する。この過程は、筋肉特異的な遺伝子産物の出現と同 時に起こる。受動的な引っ張りにより誘発された（ｐａｓｓｉｖｅ　５ｔｒｅｔ ｃｈｉｎｄｕｃｅｄ）肥大から伝播したシグナルはＩＧＦ遺伝子の発現を誘発す る。筋肉に対するＩＧＦの作用の多くはＩＧＦ−Ｉレセプターとの相互作用の結 果である。

このレセプターは、リガンド活性化チロシン特異的プロティンキナーゼである。

インシュリン様増殖因子はまた、ニューロンの筋肉シナプス、ニューロンの完全 性、および神経変性条件下でのニューロンの細胞寿命を維持する神経栄養因子と しても知られている。ＩＧＦ−１配列を含有するＭＶＳを注入することにより、 筋原培養液およびトランスジェニックマウスにおいて他は厳格な増殖条件下、筋 肉の増殖を増加させることができた。成人筋肉中に直接注射することによって成 長促進遺伝子構築物を直接移送することができ、それゆえ生後の遺伝子療法が可 能である。ＭＶＳによる遺伝子は筋肉の神経除去状態に対して比較的無感覚であ るので、これら遺伝子は、を髄損傷および神経筋疾患によって引き起こされたヒ トのある種の筋萎縮症を治療するための直接的でかなり広い応用を提供する。こ れら疾患には、を好性筋萎縮症および筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）が含まれる 。

この治療において、ＭＶＳの産物は、注入した筋肉から分泌される神経栄養因子 として、および筋肉の完全性を維持する肥大因子（ｈｙｐｅｒｔｒｏｐｈｉｃ　 ａｇｅｎｔ）として働く。

実施例１０ アテローム性動脈硬化性心血管疾患 アテローム性動脈硬化性心血管疾患は、米国および世界の主要な死因である。

アテローム性動脈硬化症斑、アテローム性動脈硬化症の基本的な病変には、循環 している脂質に由来するコレステロールエステルが含まれている。これら循環脂 質は、アテローム性動脈硬化症の発症に本質的なものである。高密度リポタンパ ク質（ＨＤＬ）の血漿濃度は、アテローム性動脈硬化症を発症する傾向と逆の相 関を有する。新生期においては、ＨＤＬは円盤状の粒子の形態で分泌される。こ れら粒子は、リン脂質上にアポリポタンパク質（ａｐｏＡ−１、Ａｐｏｌｌおよ びＥ）が重層した二重層からなる。ＨＤＬは、酵素のレシチンーコレステロール アンルトランスフェラーゼの作用によりコレステロールエステルを捕捉する。Ｈ ＤＬは、肝臓、小腸、およびおそらく他の組織から分泌される。

ＡＰＯＡ−１ｃＤＮＡは８７８ｂｐであり、２４アミノ酸のプロプロペプチド（ ｐｒｏｐｒｏｐｅｐｔｉｄｅｓ）を含む２６７アミノ酸をコードしている。ＨＤ Ｌの循環レベルを増加させることによりコレステロールの移動に影響を及ぼしま たは逆転させることができ、それゆえ、アテローム性動脈硬化症斑を形成する傾 向を減少させることができる。ＭＶＳ中へのヒトＡＰＯＡ−Ｉコード配列の挿入 は、プラスミドＤＮＡの骨格筋中への注入後にＡＰＯＡ−１発現を高めるための 発現ベクターとして働く。ＭＶＳ　ＡＰＯＡ−１ハイブリツド遺伝子は、真贋的 部位でのＨＤＬの長期発現、生合成および分泌に有効であり、それゆえ、血漿中 の全分泌ＨＤＬの含量を増加させる。

実施例１１ ビタミンＤで制御可能な筋原ベクター系骨格アクチンプロモーターおよび３゛非 翻訳領域を用いて設計した筋原ベクターの第一系列は、高レベルの非制御転写活 性を与える。ある種の環境下においては、簡単なインデューサーまたはリガンド を全身的に導入することにより、ベクターの転写活性をコントロールし、遺伝子 の転写をオンおよびオフに切り替えることが望ましい。また、ヒトに対して毒性 でもなく免疫原性でもない天然のインデューサー産物により筋原ベクターの制御 をコントロールすることも重要である。

２つの異なるビタミンＤ制御系を図８および９に示す。

アクチンプロモーターおよび３’ＵＴＲ安定化配列の制御下にあるハイブリッド 骨格アクチンビタミンＤレセプター（ＶＤＲ）遺伝子を注入することにより、Ｍ ＶＳ系を用いて筋肉中でのＶＤＲの細胞濃度を増加させることができる。目的の 配列番号（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ）：　２を、ビタミンＤ制陣要素（ＶＤＲＥ）　 の合成多量体（ｍｕｌｔｉｍｅｒｓ）を含有するように構築する。この目的物を 最小の単純ヘルペスウィルス（ＨＳ　Ｖ）チミジンキナーゼプロモーターに連結 させる。ＴＫプロモーターに由来する転写活性は、ＶＤＨの存在によって制御さ れ、リガンドのビタミンＤによって同時活性化される。Ｈ８Ｖプロモーターに対 して直列にｃＤＮＡとしてクローニングしたポリペプチド配列は、ビタミンＤが 筋肉細胞中に導入されたときに該標的ベクターから駆動される。ハイブリッドア クチンＶＤＲ遺伝子および該標的ベクターを同じプラスミド上に連結させるかま たは別々のプラスミドで一緒に注入する。グラス一杯のミルクを飲むかまたはビ タミンＤ丸薬を摂取することにより、前辺て測定したレベルのビタミンＤを投与 する。これらレベルは、該標的ベクターの転写を活性化するのに用いる。隔日に 該リガンドを摂取すれば、プロモーター活性が振動するであろう。リガンドであ るビタミンＤを食事から外すことにより、該標的ベクターからの転写が下方に制 御すなわち抑制される。

実施例１２ ワクチン製造 ＭＶＳ系は、筋肉中で外来タンパク質エピトープの発現を指令するのに、それゆ え、ヒトおよび動物においてワクチンを製造するのに充分に適している。保護的 免疫を媒介するためのタンパク質エピトープを発現させるため、ＭｖＳのカセッ ト中に標的配列を挿入する。たとえば、ＡＩＤＳウィルスタンパク質ＧＰ１２０ 、ＧＰ１６０およびＧＰ４１および細胞媒体免疫のためのＧＰ２４の定常領域、 Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎およびＣ型肝炎ウィルス、インフルエンザを含む 呼吸器系ウィルス、および胃腸レトロウィルスの表面タンパク質を用いる。つい で、ＭＶＳをヒトまたは動物に注射する。

配列表 配列番号＝１ 配列の長さ：２７５塩基対 配列の型：核酸 鎖の数ニー水銀 トポロジー：直線状 配列の種類：ｃＤＮＡ ハイポセティカル配列二ＮＯ アンチセンス・Ｎ。

配列 τ入ｋＡｃＡＴｃ、ＴＴ　ＴＡｅＡ丁Ｇ＾τＣＡ　ＣＴＴＴａｃｃ入＾ＣＣＡＣ ＡＣＴＣ＾ＧＧ　ＡＴＧＡａ＾７ｃ丁　丁ＧＴＡＧＧ丁丁Ｃb６０ ＾ＧＧＣＴＧｅＴＧｋ　ＧＧＡＣＣτｃｃｈｃ　ｃ入ｃｃｃｘ’ｒｃｃ＾ＡＣ？ τ丁ＣτＡＴＴＴτＧτＡＡＣ＾＾丁ｍｅ丁ＧＧＴτ＾Ｃ１Q０ 丁Ｇ？ＴＯ（：？ＧＣＡ　ＡＡｃｃｅｃＡ？ＧＴ　ＧｋＣＡＣＭ；ＴＧ丁λＴＧ ＴＡＭＧＴＧτＡＣＡ？Ａ＾Ａ丁丁ＡＡＴＴ丁ＡτＴｉτ　w５Ｏ ＡＣＣ？ｅＧＴＴＴ丁ＧＴＴ丁ａｍτ丁入＾ＡＡＣＣ入＾τＧ　ｅＣＣ？（ｉ？ Ｇ６Ａ＾ＧＧＡＡＡＣＡＴＡＡ　ＡＡＣ？丁Ｃ入ＡＧＡ　２S０ ＡＧＣＡ丁τＡＪＩＡＴ　ＣｋＴＣＪｋＧＴＣＡτ　τｅｒａ↑Ｃ＾Ｃ＾ｃ　ｃ ｃｃ丁Ａ　２７５配列番号：２ 配列の長さ＝２７塩基対 配列の型：核酸 鎖の数・二本鎖 トボロンー：直線状 配列の種類：　Ｇｅｎｏｍｉｃ　ＤＮＡハイポセティカル、ＮＯ アンチセンス＝Ｎ。

配列 ＣＣ丁Ｇ＾Ｃ？Ｃ＾ＣＣＧＧ６ＴＧｋｋＣＧ　ＧＧＧＣＪｋＴＴ骨オ存ｒ７ケ／ 　ｌ　インシ・す／／ｉｔ瑚タ八因ｙへイグ′ノヅＲｒ云イヒＦＩＧＵＲＥ４ ＤＧ　ＤＧ　ＤＧ　ＤＧ　ＤＧ　ＤＧ 螺氾 Ｆｉｇｕｒｅ　５ ｉｌ 卵釆 −）寥 ６゛ム １８Ｅｉ−−− Ｆｉｇｕｒｅ　７ ＤＮＡ耗伶ドｔイン　トラン　ソｂ１匹イ６＋ンインし“′Ｚミンレレ払７゛Ｚ − −ｒＬン・Ｖ杉イ￥［ンイン昏７ｉｉ八刹簀ンド゛〉　Ｆランメ３シ１ナイムＦ ９に１′ンドメインλダ「船ｊ会こしく更とすへ／う宋叫囚チ２オ九１）ビ７ミ ンＩ７和・伊ド／イン：翳〉ＥＥＥ〉［句−ンｈ蜂トララス↓各）１圧イＬト＼ イ／骨不存了７千ン７゛ロモー７−甲っ賞、ニ一体巳乞ｔ７ミン」“ｕ９ｒ’Ｒ ヒ五千史υ ↓ ＦＩＧＵＩ（ト）８ ５ｋ２０２１ＧＦ−１３’ＳＶａ　、　、　、、、　、　。

５ｋ７３３１ＧＦ−１ Ｆｉｇｕｒｅ　１０ フロントページの続き （５１）　Ｉｎｔ、　Ｃ１，’　識別記号　庁内整理番号Ａ６１Ｋ　３８１０４ ＣＯ７Ｈ２１１００８３１４−４Ｃ ８３１４−４Ｃ ８３１４−４Ｃ Ｉ Ａ６１Ｋ　３７１０２

Claims (66)

【特許請求の範囲】
1. １．プロモーター；５′末端が該プロモーターの３′末端に結合し発現すべき核 酸配列を含有するカセット；筋原特異的な３′非翻訳領域（３′ＵＴＲ）および 該３′ＵＴＲの３′末端に隣接した非コード隣接（ＮＣＲ）（該ＮＣＲは転写終 結シグナルを含有する）からなり、該３′ＵＴＲの５′末端が該カセットの３′ 末端に結合していることを特徴とする、筋原組織中で核酸配列を発現するための 筋原ベクター系（ＭＶＳ）。
2. ２．プロモーターとカセットとの間に５′ｍＲＮＡリーダー配列をさらに含み、 該リーダー配列の５′末端が該プロモーターに結合しており、３′末端が該カセ ットに結合している、請求項１に記載のＭＶＳ。
3. ３．核酸配列を発現する機能単位からなる筋肉組織中で該核酸配列を発現するた めのＭＶＳであって、該機能単位が５′から３′へすべて連続的に連結した要素 からなり、該要素がプロモーター；５′ｍＲＮＡリーダー配列；第一イントロン ；開始ＡＴＧおよびＮｃｏＩクローニング部位；３′末端にＥｃｏＲＩ部位を有 し、発現すべき核酸配列を含有するカセット；筋原特異的な３′非翻訳領域（３ ′ＵＴＲ）；および該３′ＵＴＲの３′末端に隣接した非コード領域（ＮＣＲ） であり、該ＮＣＲが転写終結シグナルを含有することを特徴とするＭＶＳ。
4. ４．該プロモーターが筋原特異的である請求項１または３に記載のＭＶＳ。
5. ５．該リーダー配列が筋原特異的である請求項２または３に記載のＭＶＳ。
6. ６．プロモーターが、骨格アルファアクチン遺伝子プロモーター、第一ミオシン Ｌ鎖１プロモーター、ミオシンＨ鎖プロモーター、トロピニンＴプロモーター、 筋肉クレアチニンキナーゼプロモーター／エンハンサー、アセチルコリンレセプ ターサブユニット、サイトメガロウイルスプロモーター、ＲＳＶプロモーターお よびラウスサルコーマウイルスＬＴＲよりなる群から選ばれたものである請求項 １または３に記載のＭＶＳ。
7. ７．プロモーターが骨格アルファアクチン遺伝子プロモーターである請求項１ま たは３に記載のＭＶＳ。
8. ８．３′ＵＴＲおよびＮＣＲが骨格アルファアクチン遺伝子、第一ミオシンＬ鎖 １遺伝子、ミオシンＨ鎖遺伝子、トロビニンＴ遺伝子および筋肉クレアチニンキ ナーゼ遺伝子よりなる群から選ばれたものである請求項１、３または５９に記載 のＭＶＳ。
9. ９．３′ＵＴＲおよびＮＣＲが骨格アルファアクチン遺伝子からのものである請 求項１、３または５９に記載のＭＶＳ。
10. １０．核酸配列の発現を制御するための制御系をさらに含む請求項１、３または ５９に記載のＭＶＳ。
11. １１．プロモーター領域中の血清応答因子の少なくとも一つが、ＤＮＡ結合ドメ インがレセプターＤＮＡ結合配列で置換されたキメラである、請求項１０に記載 のＭＶＳ。
12. １２．レセプター結合部位が、ビタミン、ステロイド、甲状腺薬、稀用薬、ホル モン、レチノイン酸およびチロキシンよりなるレセプターの群から選ばれたもの である請求項１１に記載のＭＶＳ。
13. １３．レセプター結合部位がビタミンＤレセプターである請求項１１に記載のＭ ＶＳ。
14. １４．発現された核酸配列がポリペプチドをコードする請求項１、３または５９ に記載のＭＶＳ。
15. １５．発現された核酸配列が、ホルモン、成長因子、酵素、アポリボタンパク質 、凝固因子、腫瘍サプレッサー、腫瘍抗原、ウイルスタンパク質、細菌表面タン パク質、および寄生虫細胞表面タンパク質よりなる群から選ばれたポリペプチド をコードする請求項１、３または５９に記載のＭＶＳ。
16. １６．発現された核酸配列が、インシュリン様増殖因子１、インシュリン様増殖 因子ＩＩまたはインシュリン増殖因子結合タンパク質をコードする請求項１、３ または５９に記載のＭＶＳ。
17. １７．発現された核酸配列が成長ホルモン放出ホルモンをコードする請求項１、 ３または５９に記載のＭＶＳ。
18. １８．発現された核酸配列がアポリボタンパク質Ａ−Ｉをコードする請求項１、 ３または５９に記載のＭＶＳ。
19. １９．発現された核酸配列が、インシュリン様増殖因子Ｉ、インシュリン様増殖 因子ＩＩまたはインシュリン増殖因子結合タンパク質をコードする請求項１０に 記載のＭＶＳ。
20. ２０．発現された核酸配列が成長ホルモン放出ホルモンをコードする請求項１０ に記載のＭＶＳ。
21. ２１．発現された核酸配列がアポリボタンパク質Ａ−Ｉをコードする請求項１０ に記載のＭＶＳ。
22. ２２．有効量の請求項１または３に記載のＭＶＳをヒトまたは動物の骨格筋中ま たは組織培養液中に注入する工程からなることを特徴とする、ヒト、動物または 組織培養液中にポリペプチドの継続的な供給を導入する方法。
23. ２３．有効量の請求項１０に記載のＭＶＳをヒトまたは動物の骨格筋中または組 織培養液中に注入する工程からなることを特徴とする、ヒト、動物または組織培 養液中にポリペプチドの制御された供給を導入する方法。
24. ２４．有効量の請求項１６に記載のＭＶＳを年いったヒトの骨格筋中に注射する 工程からなることを特徴とする、年いったヒトの筋萎縮症の治療方法。
25. ２５．有効量の請求項１９に記載のＭＶＳを年いったヒトの骨格筋中に注射する 工程からなることを特徴とする、年いったヒトの筋萎縮症の治療方法。
26. ２６．有効量の請求項１７に記載のＭＶＳを年いったヒトの骨格筋中に注射する 工程からなることを特徴とする、年いったヒトの筋萎縮症の治療方法。
27. ２７．有効量の請求項２０に記載のＭＶＳを年いったヒトの骨格筋中に注射する 工程からなることを特徴とする、年いったヒトの筋萎縮症の治療方法。
28. ２８．有効量の請求項１６に記載のＭＶＳをヒトの骨格筋中に注射する工程から なることを特徴とする、骨髄損傷または神経筋疾患により引き起こされた筋萎縮 症を有するヒトの治療方法。
29. ２９．該ヒトが筋萎縮性側索硬化症を有する請求項２８に記載の方法。
30. ３０．有効量の請求項１９に記載のＭＶＳをヒトの骨格筋中に注射する工程から なることを特徴とする、骨髄損傷または神経筋疾患により引き起こされた筋萎縮 症を有するヒトの治療方法。
31. ３１．該ヒトが筋萎縮性側索硬化症を有する請求項３０に記載の方法。
32. ３２．有効量の請求項１８に記載のＭＶＳをヒトの骨格筋中に注射する工程から なることを特徴とする、ヒトにおけるアテローム性動脈硬化性心血管疾患の予防 または治療方法。
33. ３３．有効量の請求項２１に記載のＭＶＳをヒトの骨格筋中に注射する工程から なることを特徴とする、ヒトにおけるアテローム性動脈硬化性心血管疾患の予防 または治療方法。
34. ３４．有効量の請求項１または３に記載のＭＶＳを骨格筋中に注射する工程から なり、カセット中の核酸が遺伝子欠損を補正するための遺伝子を含有することを 特徴とする遺伝子置換方法。
35. ３５．該カセットが、グリコーゲンホスホリラーゼ、アルファ−１−抗トリプシ ンおよびジストロフィンよりなる群から選ばれた遺伝子をコードする配列を含有 する請求項３４に記載の方法。
36. ３６．有効量の請求項１０に記載のＭＶＳを骨格筋中に注射する工程からなり、 カセット中の核酸が遺伝子欠損を補正するための遺伝子を含有することを特徴と する遺伝子置換方法。
37. ３７．該カセットが、グリコーゲンホスホリラーゼ、アルファ−１−抗トリプシ ンおよびジストロフィンよりなる群から選ばれた遺伝子をコードする配列を含有 する請求項３６に記載の方法。
38. ３８．有効量の請求項１または３に記載のＭＶＳをヒトまたは動物の骨格筋中に 注入する工程からなり、カセット中の核酸配列が抗体応答を引き起こし得るポリ ペプチドをコードすることを特徴とする、ヒトまたは動物におけるワクチンの製 造方法。
39. ３９．該核酸配列が、細菌細胞表面タンパク質、ウイルスタンパク質および寄生 虫細胞タンパク質よりなる群から選ばれたものである、請求項３８に記載の方法 。
40. ４０．該核酸配列がＡＩＤＳウイルスタンパク質をコードする請求項３８に記載 の方法。
41. ４１．有効量の請求項１０に記載のＭＶＳをヒトまたは動物の骨格筋中に注入す る工程からなり、カセット中の核酸配列が抗体応答を引き起こし得るポリペプチ ドをコードすることを特徴とする、ヒトまたは動物におけるワクチンの製造方法 。
42. ４２．該核酸配列が、細菌細胞表面タンパク質、ウイルスタンパク質および寄生 虫細胞タンパク質よりなる群から選ばれたものである、請求項４１に記載の方法 。
43. ４３．該核酸配列がＡＩＤＳウイルスタンパク質をコードする請求項４１に記載 の方法。
44. ４４．有効量の請求項１または３に記載のＭＶＳを成長疾患を有する個体の骨格 筋中に注射する工程からなり、カセット中の核酸配列が成長ホルモン配列を含有 することを特徴とする、成長疾患の治療方法。
45. ４５．有効量の請求項１０に記載のＭＶＳを成長疾患を有する個体の骨格筋中に 注射する工程からなり、カセット中の核酸配列が成長ホルモン配列を含有するこ とを特徴とする、成長疾患の治療方法。
46. ４６．筋原特異的プロモーター；レセプターをコードする核酸配列；筋原特異的 な３′非翻訳領域（３′ＵＴＲ）および筋原特異的な非コード領域（ＮＣＲ）か らなる要素からなり、５′末端のプロモーターから始まってレセプター核酸配列 、３′ＵＴＲおよび隣接するＮＣＲまで連続的に連結してなる第一機能単位；該 レセプターに対応する応答要素；チミジンキナーゼプロモーター；目的の特定核 酸配列；筋原特異的な３′ＵＴＲおよび隣接する筋原特異的なＮＣＲからなる要 素からなり、５′末端の応答要素から始まってプロモーター、特定配列、３′Ｕ ＴＲおよびＮＣＲまで連続的に連結してなる第二機能単位；からなり、該第一単 位がレセプターを発現し、該レセプターが該応答要素、該レセプターおよび該レ セプターに結合する因子の間で相互作用を形成し、該相互作用が該目的配列の発 現を制御することを特徴とする、筋原組織中で特定核酸配列を発現するための制 御された筋原ベクター系（ＭＶＳ）。
47. ４７．第一および第二機能単位が同一ベクター上にある請求項４６に記載のＭＶ Ｓ。
48. ４８．第一および第二機能単位が別々のベクター上にある請求項４６に記載のＭ ＶＳ。
49. ４９．レセプターが、ビタミン、ステロイド、甲状腺薬、稀用薬、ホルモン、レ チノイン酸およびチロキシンよりなるレセプターの群から選ばれたものである請 求項４６に記載のＭＶＳ。
50. ５０．レセプターがビタミンＤレセプターであり、応答要素がビタミンＤ応答要 素であり、因子がビタミンである、請求項４６に記載のＭＶＳ。
51. ５１．さらにコーティングを含み、該コーティングが、ＤＮＡ開始複合体、該Ｄ ＮＡ開始複合体は、血清応答因子（ＳＲＦ）、転写開始因子（ＴＩＦ）およびト ランス制御因子（ＴＲＦ）からなり、該ＳＲＦはプロモーター内の該血清応答要 素に結合し、該ＴＩＦおよびＴＲＦは該ＳＲＦおよびプロモーター内のＴＡＴＡ ボックスと相互作用して安定な複合体を形成する；およびヒストン、該ヒストン は該ＭＶＳの残りのＤＮＡに非特異的に結合するを含む、請求項１、３または４ ６に記載のＭＶＳ。
52. ５２．有効量の請求項５１に記載のＭＶＳをヒトまたは動物の骨格筋中または組 織培養液中に注入する工程からなことを特徴とする、ヒト、動物または組織培養 液中にポリペプチドを導入する方法。
53. ５３．有効量の請求項５１に記載のＭＶＳをヒトまたは動物の骨格筋中に注射す る工程からなことを特徴とする、ヒトまたは動物疾患の治療方法。
54. ５４．有効量の請求項５１に記載のコーティングＭＶＳを骨格筋中に注入する工 程からなり、カセットが遺伝子欠損を補正するための遺伝子配列を含有すること を特徴とする遺伝子置換方法。
55. ５５．有効量の請求項５１に記載のコーティングＭＶＳをヒトまたは動物の骨格 筋中に注入する工程からなり、カセットが抗体応答を引き起こし得るポリペプチ ドをコードする配列を含有することを特徴とする、ヒトまたは動物におけるワク チンの製造方法。
56. ５６．有効量の請求項５１に記載のコーティングＭＶＳを骨格筋中に注射する工 程からなることを特徴とする、筋萎縮症の治療方法。
57. ５７．さらにコーティングを含み、該コーティングが、ＤＮＡ開始複合体、該Ｄ ＮＡ開始複合体は、血清応答因子（ＳＲＦ）、転写開始因子（ＴＩＦ）およびト ランス制御因子（ＴＲＦ）からなり、該ＳＲＦはプロモーター内の該血清応答要 素に結合し、該ＴＩＦおよびＴＲＦはＳＲＦおよびプロモーター内のＴＡＴＡボ ックスと相互作用して安定な複合体を形成する；およびヒストン、該ヒストンは 該ＭＶＳの残りのＤＮＡに非特異的に結合するを含む、請求項１０に記載のＭＶ Ｓ。
58. ５８．さらにコーティングを含み、該コーティングが、ＤＮＡ開始複合体、該Ｄ ＮＡ開始複合体は、血清応答因子（ＳＲＦ）、転写開始因子（ＴＩＦ）およびト ランス制御因子（ＴＲＦ）からなり、該ＳＲＦはプロモーター内の該血清応答要 素に結合し、該ＴＩＦおよびＴＲＦはＳＲＦおよびプロモーター内のＴＡＴＡボ ックスと相互作用して安定な複合体を形成する；およびヒストン、該ヒストンは 該ＭＶＳの残りのＤＮＡに非特異的に結合するを含む、請求項１１に記載のＭＶ Ｓ。
59. ５９．５′オリゴヌクレオチド、該オリゴヌクレオチドはプロモーターを含む； 筋原特異的な３′非翻訳領域（３′ＵＴＲ）および該３′ＵＴＲの３′末端に隣 接した非コード領域（ＮＣＲ）を含有する３′オリゴヌクレオチド、該ＮＣＲは 転写終結シグナルを含有する；および 複数の制限エンドヌクレアーゼ部位を有するリンカー、該リンカーは該５′オリ ゴヌクレオチドおよび該３′オリゴヌクレオチドを連結し、さらに該リンカーは 発現すべき核酸配列を含有するカセットを挿入するための位置を提供するからな る、筋原組織中で核酸配列を発現するための筋原ベクター系（ＭＶＳ）。
60. ６０．５′オリゴヌクレオチドがさらにリーダー配列を含む請求項５９に記載の ＭＶＳ。
61. ６１．発現すべき核酸配列がＭＶＳ中の３′ＵＴＲおよびＮＣＲに関して異種の ものである請求項１または３に記載のＭＶＳ。
62. ６２．請求項１、３、１０または５９に記載のベクターを含有する組換え細胞。
63. ６３．請求項１、３、１０または５９に記載のベクターを含有し、カセット中の 核酸が免疫グロブリン遺伝子タンパク質をコードするワクチン。
64. ６４．請求項１、３、１０または５９に記載の筋原および薬理学的送達ビヒクル からなる医薬組成物。
65. ６５．ミルクを産生する動物中に請求項１、３、１０または５９に記載の薬理学 的投与量の筋原ベクターを導入する工程からなり、該カセットの核酸が成長ホル モンをコードすることを特徴とする、ミルク産生を増加させる方法。
66. ６６．肉を産生する動物中に請求項１、３、１０または５９に記載の薬理学的投 与量の筋原ベクターを導入する工程からなり、該カセットの核酸が成長ホルモン をコードすることを特徴とする、肉の産生を増加させる方法。