JP2009525110A - 薬物溶出血管内プロテーゼおよび使用方法 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、化学、生化学、細胞生物学、遺伝子工学、医用デバイスおよび医学の分野に関する。詳細には、本発明は、プロテーゼの性能を改善し、内腔の狭小化を防止する因子を発現するように遺伝子操作された細胞でコーティングされた血管内プロテーゼに関する。
世界中の極めて多くの人々が血管疾患に罹患している。それにより血管の罹患部分を回避するため、または閉塞もしくは損傷した血管の周囲の血流を回復させるために、人工もしくは自家いずれかの導管が既存血管内に移植されるバイパス手術は、そのような疾患のための最も一般的な治療法の1つである。毎年100万例を越えるそのような手技が実施されていると推定されている。
そこで、1つの態様では、本発明は、外面および内腔を説明する内面を有する合成チューブ状素子を含む人工血管グラフトに関する。このチューブは、その内面に播種および培養された複数の細胞を有する。細胞は、全部が内皮細胞または内皮細胞と平滑筋細胞の混合物のいずれかである。内皮細胞だけが使用される場合は、少なくともそれらの一部分は、1つ以上の細胞接着因子を発現または過剰発現するように遺伝子操作される。内皮細胞および平滑筋細胞の両方が使用される場合は、内皮細胞の少なくとも一部分、平滑筋細胞の少なくとも一部分またはそれらの両方の少なくとも一部分が1つ以上の細胞接着因子を発現または過剰発現するように遺伝子操作される。
毎年、夥しい数の人々が様々な器官および四肢へ十分な量の血液を送達する能力を失っている。これらの疾病の中で最もよく知られているのは、心臓に通じる1枝以上の動脈の閉塞である冠動脈閉塞症である。しかし、数十万人の人々はさらに四肢への血流の喪失にも苦しんでいる。血流の喪失が重大である場合は、先端の組織は虚血性になり、最終的には死亡する。そのような末梢血流の喪失は、傷害の結果として生じることがあるが、最も頻回には進行性アテローム硬化症を合併するアテローム硬化症または糖尿病などの疾患の結果である。これらの状態を救済するために、外科医はしばしば、血管の傷害もしくは罹患した部分を回避し、血流を回復させるために血管グラフトを使用しようとする。
細菌β−ガラクトシダーゼ遺伝子LacZを含有する3,700bpのHindIII−BamHIフラグメント(Clontech社、米国カリフォルニア州)をCMV前初期プロモーターの制御下での構成的発現のためにプラスミドpCA3内に挿入した。生じたプラスミドは、プラスミドpJM17によって、アデノウイルスE1遺伝子を構成的に発現する「293」細胞内へ共形質移入した。プラスミドpJM17は、E3領域を排除して、ウイルスのE1領域内のインサート(pBRX)を含んでいるアデノウイルスゲノムを含有している。形質移入後のβ−ガラクトシダーゼをコードするpCA3とpJM17との間の同種組換えは、pJM17のE1領域をpCA3からのCMV−β−ガラクトシダーゼ発現カセットと置換した。プラーク形成は、共形質移入の2〜4週間後に発生し、その後に個別プラークを単離し、それらから「293」細胞の感染によってウイルス抽出物を増幅させた。各ウイルスストックの力価は、「293」細胞におけるプラークアッセイによって決定した。約1010pfu/mLのウイルス力価が得られた。感染細胞によるβ−ガラクトシダーゼの発現は、X−gal染色によって確証された。
分泌のシグナル配列(カリフォルニア州マウンテンビューに所在するScios Nova社のJ.Abraham博士よりの寄贈)を含むヒトVEGF165 cDNA(Genbankアクセッション番号AB021221)を含有する600bpのBamHIフラグメントをシャトルベクターpQBI−CMV5−GFP(QBI社、カナダ国)のBglII部位内に挿入すると、それによりシャトルベクターCMV5−VEGF165−IRES−EGFPが産生した(図3a)。発現プラスミドpQBI−CMV5−GFPは、hCMV5インサートを含有するE1領域内に欠失を備えるAd5ゲノムの左腕(16%)を含有している。シャトルベクターCMV5−VEGF165−IRES−EGFPは、プラスミドpJM17によってE1遺伝子を構成的に発現する「293」細胞内へ共形質移入した。pJM17プラスミドは、E3領域を排除して、ウイルスのE1領域内のインサート(pBRX)を含んでいるアデノウイルスゲノムを含有している。形質移入後のCMV5−IRES−VEGF165−GFPとpJM17との間の同種組換えは、E1領域およびpBRXインサートをCMV5−VEGF165−IRES−GFP由来の発現カセットと置換した。プラーク形成は、共形質移入の2〜4週間後に発生し、その後に個別プラークを単離し、「293」細胞の感染によってウイルス抽出物を増幅させた。各ウイルスストックの力価は、「293」細胞におけるプラークアッセイによって決定した。約1010pfu/mLの力価が得られた。導入遺伝子の発現は、感染細胞馴化培地のウェスタンブロット分析によって確証した。
GFPおよびヒトVEGF165遺伝子をコードする組換えレトロウイルスベクターは、2工程でプラスミドpLXSN(#K1060−B、Clontech社、米国)内にクローニングする工程によって構築した。第1に、VEGF165(Genbankアクセッション番号AB021221)をコードする600bpのBamHIフラグメントは、プラスミドpIRES2−EGFP(#6029−1、Clontech社)のBamHI部位内に挿入した。次に、VEGF165、IRESおよびEGFPコーディング配列を含有する2.0kBのEcoRI−MunIフラグメントは、ベクターLXSN−VEGF165−IRES−EGFP(図3b)を生じさせるpLXSN内のEcoRI制限部位内にクローニングした。レトロウイルスベクター産生のために、293E3環境栄養性パッケージング細胞は、LXSN−VEGF165−EGFPを用いて一過性で形質移入した。48時間後、G418耐性プロデューサー細胞のコンフルエントな培養からの上清を採取し、濾過し(0.45μm)、PA317両種性パッケージング細胞を形質導入するために使用した。形質導入PA317細胞はG418(Gibco BRL社、米国)選択(300mg/mL)下で増殖させ、48時間後に上清を採取し、高効率でECおよびSMCを形質導入することのできる偽型ウイルスを生成するためにGALVエンベロープ糖タンパク質を発現するTEFLYGAパッケージング細胞を形質導入するために使用した。形質導入TEFLYGA細胞のG418選択(400μg/mL)後に、個々のコロニーを採取し、EGFPおよびVEGF165発現についてスクリーニングした。各コロニーのウイルス力価はTE671細胞形質導入によって決定し、105〜106pfu/mLの範囲内にあることが見いだされた。最高力価産生コロニーを選択し、新しく採取した上清を形質導入のために使用した。
ヒトUP50遺伝子を発現する組換えアデノウイルスベクター(Weizmann InstituteのY. Shaulから入手した)は、上述したように構築した。ヒトUP50 cDNAを含有する1,361bpのBglIIフラグメント(配列番号1)をプラスミドpCA3内に挿入した。導入遺伝子含有プラスミドのpCA3は、「293」細胞内にプラスミドpJM17によって共形質移入した。形質移入後の発現プラスミドとpJM17との間の同種組換えは、E1領域をpCA3プラスミド由来の発現カセットと置換し、それによりシャトルベクターCMV5−UP50を生成した(図4a)。プラーク形成は、共形質移入の2〜4週間後に発生した。個々のプラークを単離し、ウイルス抽出物は293細胞の感染によって増幅させた。約1011pfu/mLのウイルスストックの力価が得られた。導入遺伝子の発現は、感染細胞馴化培地のウェスタンブロット分析によって確証した。
ヒトUP50およびGFP遺伝子を共発現する組換えアデノウイルスベクターは、修正AdEasyプロトコール(28)によって構築した。UP50 cDNAの1,361bpのBglIIフラグメントは、CMVプロモーターの制御下でpAdTrack−CMVシャトルベクター内のBglII部位内へ挿入した。このシャトルベクターは、導入遺伝子の下流で追加のCMVプロモーターの制御下でGFPをコードする。インサート含有シャトルベクターは、PmeI消化によって線形化し、Qiaquickゲル抽出キット(Qiagen社、ドイツ国)を用いて精製した。コンピテントBJ5183細胞は、エレクトロポレーションによってインサートを含有するシャトルベクターおよびpAdEasy−1によって共形質移入され、UP50−GFPをコードする組換えアデノウイルスベクターを含有する陽性クローン(図4b)は、PCRおよび制限マップ分析によって選択した。組換えアデノウイルスプラスミドは、PacI消化によって線形化し、精製し、Lipofectamine 2000(Gibco BRL社、米国)を用いて「293」細胞内に形質移入した。形質移入の7日後、細胞変性効果が発生し、100%の細胞がGFPを発現することが見いだされた。細胞を収穫し、ウイルス抽出物は、「293」細胞内でさらに増幅させた。各ウイルスストックの力価は「293」細胞内での連続希釈アッセイによって決定し、約1011pfu/mLの力価が得られた。導入遺伝子の発現は、感染細胞馴化培地のウェスタンブロット分析によって確証した。
ヒトUP50遺伝子をコードする組換えレトロウイルスベクターLXSN−UP50(図4c)は、ヒトUP50 cDNAの1,361bpのBglIIフラグメントをプラスミドpLXSN(#K1060−B、Clontech社、米国)のBamHI部位内へMo−MULV 5’長い末端反復(LTR)の制御下で挿入する工程によって構築した。
レトロウイルスベクター産生のためには、ベクターpLXSN−UP50−EGFPもしくはpLXSN−UP50は、Lipofectamine(Gibco BRL社、米国)を用いて293FLYAパッケージング細胞内へ形質移入した。48時間後、ウイルスプロデューサー細胞のコンフルエントな培養からの上清を採取し、濾過し(0.45μm)、293FLY10Aもしくは293FLYGALVパッケージング細胞へ添加した。形質導入細胞はG418選択(400μg/mL)下で増殖させ、個々のコロニーを採取し、倒立蛍光顕微鏡を用いてEGFP発現についてスクリーニングした。それらは、形質導入細胞馴化培地のウェスタンブロット分析によってUP50の発現についてもまたスクリーニングした。各コロニーのウイルス力価は、TE671細胞の形質導入によって決定し、約106ffu/mLの力価が得られた。最高力価を備えるコロニーからの上清は、ECおよびSMCの形質導入のために新しく採取した。
ヒト伏在静脈EC(HSVEC)、ヒト橈骨動脈EC(HRAEC)およびヒト左内胸動脈EC(HLAEC)は、以前に記載されたように(29)、コラゲナーゼ消化によって長さ5cmの血管区間から採取した。単離したECは、20%ウシ胎児血清(hyClone社、米国)、2mMのL−グルタミン(Biological Industries社、イスラエル国)、100単位/mLのペニシリン(Biological Industries社、イスラエル国)、および0.1mg/mLのストレプトマイシン(Biological Industries社、イスラエル国)、100μg/mLのヘパリン(Sigma社、米国)および2ng/mLのbFGF(Neufeld教授から入手)が補給されたM199培地(Gibco BRL社、米国)を含有するゼラチン被覆培養皿上で培養した。細胞形態ならびにvon Willebrand因子およびCD31についての免疫組織化学的染色に基づいて監視した表現型安定性を保証するために、第3〜9継代からの細胞を採取した(図39)。ヒトSMCは、ヒト伏在静脈、ヒト橈骨動脈(HRASMC)および左内胸動脈(HLSMC)由来の移植片外植によって培養した。細胞は、10%のプールヒト血清、2mMのL−グルタミン、100単位/mLのペニシリン、0.1mg/mLのストレプトマイシンおよび2ng/mLのbFGFを補給したDulbeccoの改質イーグル培地(DMEM)(Gibco BRL社、米国)中で培養した。SMCは、平滑筋α−アクチンについての免疫組織化学的染色によって同定した(Dako社、米国、図40)。細胞は、ルーチン的に無菌性、エンドトキシンおよびマイコプラズマ感染について試験した。動物の静脈は、ヒト血管区間の場合と同一手技を用いて、ミニブタおよびヒツジから切除した。ブタおよびヒツジ両方由来のECおよびSMCは、ヒトECおよびSMCと同一方法で同様に採取した。
パッケージング細胞系293−FLYA、293−FLY10A、293−FLYGALVおよびTEFLYGA(フランス国のDr.FL.Cosset−Lionから入手した)は、10%のFCS(Biological Industries社、イスラエル国)、2mMのL−グルタミン、100単位/mLのペニシリン、0.1mg/mLのストレプトマイシン、6μg/mLのブラストサイジン(Sigma社、米国)および6μg/mLのフレオミシン(phleomicin)(Sigma社、米国)を補給したDMEM中で増殖させた。
細胞は、感染させる20時間前にフィブロネクチン(Sigma社、米国)をプレコートしたプレート(4.5μg/mL)上で70%コンフルエンスに播種し、完全培地(M20)中で増殖させた。感染当日、培養培地は新鮮血清無含有M199培地と交換し、組換えウイルスを3,000の感染多重度(MOI)(すなわち、ウイルス粒子3,000個/細胞)で加えた。細胞は20分毎に穏やかに上下に動かしながら90分間にわたりインキュベートし、その後にウイルス含有培地を完全培地(M20)と交換した。感染率は、蛍光GFPフィルター(GFP−LP、Nikon社)を装備した倒立蛍光顕微鏡(TE200、Nikon社、日本国)を用いてGFP発現の視認によって監視した。
ECもしくはSMC(第4〜9継代)は、4.5μg/mLのフィブロネクチンでコーティングされたプレート中において105個(細胞)/ウエル(35mm)で播種し、24時間にわたり完全培地中で増殖させた。細胞は、形質導入の1時間前に0.1mg/mLのDEAE−デキストラン(Sigma社、米国)を含有する血清無含有M199培地で培養培地を交換することによって予備馴化した。予備馴化後に、細胞はリン酸緩衝食塩水(PBS)を用いて3回洗浄した。形質導入は、新しく採取した上清を用いた細胞の4時間にわたるインキュベーションによって実施し、ウイルス産生パッケージング細胞から濾過した(0.45μL)。インキュベーションの終了時に、ウイルス含有培地をM20培地と交換した。
PTFEグラフト(Gore社、米国)を必要な長さへ無菌的に切断し、PBS中で3回洗浄し(室温で30分間)、フィブロネクチン中でインキュベートした(PBS中で20μg/mL、一晩、37℃)。2つのコネクター(Teflonもしくはステンレススチール)は、1本ずつをグラフトの片側に入れて挿入した。これらのコネクターは、3回の二重結びで結んだシリコン糸で固定した。各グラフトの端部は、ゴム製キャップを用いて栓をした(図31A)。
インキュベーション期間の終了時に、グラフトは1時間にわたり4%のパラホルムアルデヒド中で固定した。固定後、グラフトを長手方向で切片作製し、蛍光顕微鏡下で試験し、写真撮影し、さらに画像は画像分析システム(Image pro Plus、Media cybernetics社、米国)によって加工処理した。内皮細胞播種グラフトの形態計測評価は、内皮細胞によるグラフトの表面被覆を評価するためのコンピュータ援用画像分析によって実施した。画像分析システムは、倒立蛍光顕微鏡(TE200、Nikon社、日本国)上に据え付けられたデジタルビデオカメラ(DXM 1200、Nikon社、日本国)から構成される。データはデジタル化し、画像分析システム(Image Pro Plus 4画像分析用ソフトウエア)へ移した。分析したグラフト表面の顕微鏡検査(×100の倍率)下でグラフトの無作為の運動によって、少なくとも10の区域を選択した。本分析は、画像分析ソフトウエアを使用して、内皮細胞被覆面積対全区域面積(Per−area)の比率の決定を含んでいた。各区域は12の等四分円に分割され、各四分円について同一比率が決定された。さらに、主観的評価は、被覆について観察された均質性(1〜3の尺度)および密度(1〜5の尺度)をスコア付けすることによって実施した。
全RNAは、PURESCRIPT RNA単離キット(Gentra systems社、米国)を用いてUP50をコードするアデノウイルスベクターおよびレトロウイルスベクターによる形質変換の48時間後にECおよびSMCから単離した。RNA濃度は、260nmの吸光度から計算した。
240mmolのdNTP、1UのEx−Taq DNAポリメラーゼ(Takara社、日本国)および反応バッファー(Takara社)を含む50μLの容量中で実施した。PCRサイクリングプロトコルは:94℃で2分間、その後に10サイクルの94℃/30秒間−>50℃/30秒間−>72℃/60秒間であった。この後に94℃/30秒間−>60℃/30秒間−>72℃/60秒間+5秒間/サイクル−>72℃/10分間の21サイクルが続いた。RT−PCR産物は、1%アガロースゲル上での電気泳動法によって分析した。
アデノウイルスまたはレトロウイルスによって遺伝子操作されたECおよびSMCによるUP50もしくはVEGFタンパク質の発現を、遺伝子操作された細胞馴化培地のウェスタンブロット分析によって検出した。培養培地は遺伝子操作24時間後に血清無含有培地と交換し、細胞をさらに24時間にわたり培養した。遺伝子操作された細胞−馴化培地(CM)(30μL)のサンプルは、還元条件下で10% SDSポリアクリルアミドゲル中での電気泳動法によって分離した。分離したタンパク質は、ニトロセルロース膜(Schleicher & Schuell社)上に電気ブロッティングした。これらのブロットは、室温で1時間にわたり緩徐に攪拌しながらインキュベーションブロック溶液(0.1%スキムミルクおよび0.3%のTween−20を含有するTBS(TBST))を用いてブロックした。その後、ブロットは、室温で2時間にわたりブロック溶液中に希釈した一次抗体と一緒にインキュベートした。UP50検出のためには親和性精製ウサギポリクローナル抗UP50抗体(#9855、特注、Sigma社、イスラエル国)(1:5000)を使用し、VEGF検出のためにはウサギポリクローナル抗VEGF165抗体(#SC152、Santa−Cruz社、米国)(1:700)を使用した。
アデノウイルスによって感染させたECおよびSMCは、フィブロネクチン(4.5μg/mL)がプレコーティングされたチャンバースライド(Lab−Tek社、米国)上に播種し、24時間にわたり培養した。細胞は、室温の4%パラホルムアルデヒド中での20分間にわたるインキュベーションおよびその後のPBSを用いた2回の洗浄によるアデノウイルス感染の48時間後に固定した。細胞は、5分間にわたり電子レンジ中で1mM EDTA(pH8.0)とともにスライドを加熱することによって変性させた。サンプルは、製造業者の取扱説明書にしたがって、Histostain−Plusキット(Zymed社、米国)とともに供給されたブロック溶液を用いてブロックした。ブロッキング後、細胞は室温で1時間にわたり親和性精製抗UP50(1:50)と一緒にインキュベートした。サンプルはPBS−T(0.3%のTween−20を含有するPBS)を用いて3回洗浄し、1時間にわたりPBS−T中で1:400に希釈したローダミン抱合ヤギ抗ウサギIgG抗体(#SC2091、Santa Cruz社、米国)と一緒にインキュベートした。細胞はPBS−Tを用いて3回洗浄し、封入剤(H−1000、Vector laboratories社、米国)で被覆した。サンプルは次に、走査型蛍光共焦点(MRC−1024、BioRad社)顕微鏡を用いて細胞中のGFPおよびローダミンの検出によって視認した。
アデノウイルスによって感染させたECもしくはアデノウイルスによって感染させたECおよびSMCの混合物は、血清を補給した培地中での感染後に24時間培養し、さらに24時間にわたり血清無含有培地中で培養した。上清タンパク質は10%のSDSポリアクリルアミドゲル上で電気泳動法により分離し、分離したタンパク質はニトロセルロース膜上で電気ブロッティングした。ブロットは、抗VEGFもしくは抗UP50抗体と一緒にインキュベートした。ペルオキシダーゼ抱合二次抗体へ曝露させた後、ECL試薬を用いてブロットを展開させ、X線フィルムに曝露させた。
様々なレトロウイルスで感染させたECまたは感染させたECおよびSMCの混合物は、感染後に24時間にわたり血清補給培地中で培養し、その後に細胞はさらに24時間にわたり血清無含有培地中で培養した。増殖培地のサンプル(30μL)は、10%のSDSポリアクリルアミドゲル上で分離し、ニトロセルロース膜上に電気ブロッティングした。ブロットは、抗VEGFもしくは抗UP50抗体のいずれかと一緒にインキュベートした。ペルオキシダーゼ抱合二次抗体へ曝露させた後、ECL試薬を用いてブロットを展開させ、X線フィルムに曝露させた。
内皮細胞(第5〜11継代)は、アデノウイルス感染ECの24時間前に4.5μg/mLフィブロネクチンでプレコーティングされた24ウエルプレート中において30%コンフルエンス(104個(細胞)/ウエル)で播種した。細胞は、Ad.UP50−GFP、Ad.GFPもしくはAd.VEGF165−GFPを用いて感染させた。37℃でのアデノウイルスベクターへの90分間の曝露後、血清含有培地を加え、16〜18時間後に培地は2%ヒト血清および2ng/mLのbFGFを含有するM199培地と置換した。アッセイは3回ずつ実施し、増殖は感染後第7日にXTT比色アッセイによって測定した。
ECは、感染前24時間にわたりフィブロネクチンでプレコーティングされた48ウエルプレート上に播種した(104個(細胞)/ウエル)。細胞は、以前に記載されたように、Ad.UP50−GFPもしくはAd.GFPを用いて感染させた。感染後、細胞は、4%デキストラン42000(Sigma社、米国)を補給したM20培地中で7日間にわたり増殖させた。この感染期間後、培地は感染した細胞から吸引し、マトリックス産生細胞は約5分間にわたり20mMのNH4OHとの接触によって露出させた。細胞溶解後、ECMでコーティングされたウエルはPBSで3回洗浄し、4℃でPBS中に保管した。
コラーゲンゲル内でのインビトロ血管形成は、アデノウイルス感染ECスフェロイドを用いて定量した。ECスフェロイドの生成は、以前に記載されたように実施した(33)。内皮細胞は、0.25%(w/v)カルボキシメチルセルロースを含有する培養培地中に懸濁させ、37℃、5%のCO2での24時間にわたる非組織培養処理丸底96ウエルプレート(Nunc社、デンマーク国)中で培養したが、その期間内に懸濁させた細胞は1ウエルに付き規定サイズおよび細胞数(約750個/スフェロイド)の単一スフェロイドを形成した。スフェロイドは、次にコラーゲンゲル中に包埋した。コラーゲンストック液は、8容量の酸性ラット尾コラーゲン抽出物(4℃で2mg/mLへ平衡化させた)、1容量の10×M199(Gibco BRL社、米国)を混合する工程によって、使用前に調製した。pHは、0.34NのNaOHの添加によって7.4へ調整した。コラーゲンゲル上での重合前のスフェロイドの沈降を予防するために、1容量のコラーゲンストック液は、40%ヒト血清および0.5%(w/v)カルボキシメチルセルロースを含有する1容量の室温のM199培地と混合した。スフェロイド含有ゲル(20〜30個のスフェロイド/ゲル)は事前に加温した24ウエルプレート中へ迅速に移し、重合させた。ゲルは37℃で5%のCO2と一緒にインキュベートし、ゲル中でのECの増殖は、デジタルビデオカメラ(DXM1200、Nikon社、日本国)を用いた顕微鏡写真によって証明した。各群から少なくとも40個のスフェロイドの催芽について分析した。
内皮細胞は、アデノウイルス感染の24時間前に、12ウエルプレート内で70〜80%のコンフルエンス(6〜7.5×104個(細胞)/ウエル)で播種した。細胞は、以前に記載されたように、Ad.UP50−GFPもしくはAd.GFPを用いて感染させた(3×103pfu/細胞)。非感染細胞は、コントロールとして機能した。感染後に、細胞は4日間にわたりM20培地中で増殖させた。細胞はPBSを用いて洗浄し、接着アッセイは、0.001%のEDTAを含有する0.0025%トリプシンを用いる細胞のトリプシン化によって実施した。室温での3分間のインキュベーション後、トリプシンは、完全培地(M20)の添加によって中和した。細胞はPBSを用いて3回洗浄し、次にM20(300μL)培地を細胞へ加えた。コントロールの非トリプシン化細胞に対するパーセントとしての、残留していた接着細胞の定量は、比色XTTアッセイによって決定した。
ECは、10mMのEDTA溶液によって剥離させ、0.1%のBSA(Sigma社、米国)、10mMのHEPES溶液を含有するM199培地で洗浄し、Ad.UP50−GFPもしくはAd.GFP感染EC由来または非感染EC由来の培養培地(CM)と15分間にわたりインキュベートした。インキュベーション後、細胞はECMでコーティングされたウエル中に播種した(2×104個(細胞)/ウエル)。Ad.UP50−GFP感染ECによって生成したECM上に播種した細胞は、Ad.UP50−GFP感染細胞由来のCM中でインキュベートした。Ad.GFP感染細胞によって生成したECM上に播種した細胞は、Ad.GFP感染細胞から収集したCMと一緒にインキュベートし、非感染細胞によって生成したECM上に播種した細胞のコントロール群は、非感染細胞馴化培地と一緒にインキュベートした。細胞は、細胞接着を許容するようにさらに30分間にわたりインキュベートし、次にPBSを用いて洗浄した。残留していた接着細胞の定量は、比色XTTアッセイによって実施した。
ヒト伏在静脈EC(第8〜11継代)を播種し(105個(細胞)/ウエル(35mm))、M20中で60〜80%のコンフルエンスまで増殖させた。細胞は、以前に記載されたように、Ad.UP50−GFPもしくはAd.GFPを用いて感染させた(MOI 3000)。非感染細胞は、コントロールとして機能した。細胞は、剪断応力へ曝露する前の導入遺伝子の発現を保証するために30時間にわたり増殖させた。実験前に、各群(Ad.UP50−GFP、Ad.GFP、コントロール)からの2つのウエルをトリプシン−EDTAを用いて採取し、細胞を計数した。揺動中に細胞を完全に被覆するために、5mLのM20培地を各ウエルに加えた。プレートはCO2インキュベーター内の揺動台上に配置し、強度に揺動させながら(約140サイクル/分)20〜24時間にわたりインキュベートした。揺動後、細胞はPBSを用いて5回洗浄した。細胞はトリプシン−EDTAを用いて採取し、血球計数器によって計数した。本アッセイは、さらに各々レトロウイルスベクターによって形質導入した細胞を用いて実施した。
グラフトは、上述したように播種した。
移植の36時間前に、GFP、UP50−GFPもしくはVEGF165−GFPを過剰発現するためにレトロウイルス形質導入により遺伝子操作されたヒツジECを径の小さなePTFEグラフト(6mm)に播種した。
ePTFEグラフトに、UP50およびVEGFを過剰発現する遺伝子操作されたECおよびGFPを過剰発現するECを播種した。播種の24時間後、グラフトをMatrigel(2mg/mL)を用いて外面上に載せ、透析に使用する14Gの針で穿刺した。グラフトを24時間にわたりインキュベートし、その後で蛍光顕微鏡を用いて視認した。UP50およびVEGFが播種されたグラフトは、増強された増殖および針の軌跡内の間隙を閉鎖する内皮細胞の穿刺傷を越える架橋を示した(図34A)。GFPを過剰発現するECで播種したグラフトは、この作用を示さなかった(図34B)。針によって生じた間隙の閉鎖は、グラフトに生体適合性表面を提供し、したがって局所的血栓症を減少させる。
インビトロ試験は、フィブリン−5が単独で平滑筋細胞および内皮細胞増殖/移動の両方を部分的に阻害することを証明している。例えばVEGFなどの成長因子を添加すると、内皮細胞は迅速に増殖するが、他方平滑筋細胞は部分的に損害されたままとなる。そこで、成長因子の存在下では、フィブリン−5は、内皮細胞増殖/移動に対して平滑筋細胞増殖/移動とは相違する作用を及ぼす。図41AおよびBにはその結果を要約した。
一次内皮細胞はヒト伏在静脈から単離した。細胞は、LXSNをベースとするUP50をコードするウイルスベクターを用いてレトロウイルスによって形質導入した。追加の試験群は以下を含んでいた:ナイーブEC、VEGF165(内皮細胞の特異的マイトジェン)を発現するEC、GFPを発現するEC、UP50およびVEGF165を発現するEC、外因性VEGF165が補給されたUP50を発現するEC。増殖アッセイのために、ゼラチンでプレコーティングされた24ウエルプレート中に20,000個(細胞)/ウエルを播種した。細胞は、第0日、第2日、第4日、および第5日にコールター・カウンターを用いて計数した。(図41A)。
一次平滑筋細胞をヒト伏在静脈から単離した。細胞は、LXSNをベースとするUP50をコードするウイルスベクターを用いてレトロウイルスによって形質導入した。コントロールのために、GFPによって形質導入した細胞を使用した。アッセイのために、ゼラチンでプレコーティングされた24ウエルプレート中に20,000個(細胞)/ウエルを播種した。細胞は、ベースライン時、第2日、第6日、および第9日にコールター・カウンターを用いて計数した。細胞は、bFGF(平滑筋細胞の強力なマイトジェン)とともに増殖させた。(図41B)。
フィブリン−5およびVEGFがインビトロでの内皮細胞および平滑筋細胞の増殖、ならびにラット頸動脈傷害モデルにおける新生内膜形成に及ぼす作用について、これら2つの遺伝子がグラフト開存性を改善できる機序を探索するために試験した。フィブリン−5およびVEGFを過剰発現する自家ECが播種された、端側に移植した長さ15〜18cm、6mm径のePTFEグラフトの3および6カ月後の長期開存性についてもまた試験した。
ECの単離および培養
インビトロ実験のために、自家内皮細胞を、大動脈−冠動脈バイパス術のために使用されたヒト静脈の残余物からの短い区間のコラゲナーゼ消化によって単離した。静脈残余物の使用は、Carmel Medical CenterのIRBによる承認を受けた。ヒツジ内皮細胞は、類似方法を用いて後肢外側伏在静脈から単離した。実験動物使用プロトコルは、イスラエル国ハイファに所在するTechnion大学の「実験動物の飼育管理委員会」によって精査され、承認された。
これらのベクターは、インビトロ実験およびヒツジ実験のために使用した。
フィブリン−5をコードする組換えレトロウイルスベクターは、Mo−MULV 5’−長い末端反復(LTR)およびSV40 poly Aシグナルの制御下で、1361bpのフィブリン−5 cDNAフラグメント(Genebankアクセッション番号NM006329)をpLXSNプラスミド(#K1060−B、Clontech社、米国)のBamHI部位内へ挿入する工程によって構築した。レトロウイルスベクター産生のためには、10μgのpLXSN−フィブリン−5プラスミドは、Lipofectamine(Gibco BRL社、米国)を用いて293FLYAパッケージング細胞内へ形質移入した。48時間後、ウイルスプロデューサー細胞のコンフルエントな培養からの上清を採取し、濾過し(0.45μm)、293FLY10Aもしくは293FLYGALVパッケージング細胞へ添加した。形質導入細胞はG418選択(400μg/mL)下で増殖させ、個々のコロニーを採取し、馴化培地サンプルのウエスタンブロット分析によってフィブリン−5発現についてスクリーニングした。各コロニーのウイルス力価はTE671細胞形質導入によって決定したが、力価は約106pfu/mLの範囲内にあった。
600bpのVEGF165 BamHI cDNAフラグメントは、pCDNA−VEGF165(カリフォルニア州マウンテンビューに所在するScions Nova社のDr.J.Abrahamのご厚意による寄贈)から切断した。ヒトVEGF165遺伝子をコードする組換えレトロウイルスベクターは、600bpのVEGF165 BamHIフラグメントをpLXSNプラスミドのBamHI部位内に挿入する工程によって構築した。
これらのベクターは、血管傷害のラット頸動脈モデルのために使用した。
ヒトVEGF165およびGFP遺伝子を発現する組換えアデノウイルスベクターは、シャトルベクター内へのルーチンの原核生物のクローニングおよび293細胞系における同種組換え手技からなる、いくつかの工程で構築した。分泌のためのシグナル配列を含むヒトVEGF165 cDNAを含有する600bpのBamHIフラグメント(カリフォルニア州マウンテンビューに所在するScios Nova社のDr.J.Abrahamのご厚意による寄贈)をpQBI−CMV5−GFPシャトルベクター(QBI社、カナダ国)内のBglII部位へ挿入した。発現プラスミドpQBI−CMV5−GFPは、その中にhCMV5が挿入されたE1領域内に欠失を備えるAd5ゲノムの左腕(16%)もまた含有していた。シャトルベクターpQBI−VEGF−IRES−EGFPは、E1遺伝子を構成的に発現する293細胞内へpJM17プラスミドによって共形質移入した。pJM17プラスミドは、E3領域を排除して、ウイルスのE1領域内のインサート(pBRX)を含んでいるアデノウイルスゲノムを含有していた。形質移入後の発現プラスミドとpJM17との間の同種組換えは、E1領域およびpBRXインサートをpCA3プラスミド由来の発現カセットと置換した。プラーク形成は、共形質移入後の2〜4週間の間に発生した。個々のプラークを単離し、ウイルス抽出物は293細胞の感染によって増幅させた。各ウイルスストックの力価は293細胞内でのプラークアッセイによって決定し、力価は約1010〜1011pfu/mLの範囲に及んだ。導入遺伝子の発現は、感染細胞馴化培地のウェスタン分析によって確証した。GFPウイルスストック生成は、類似方法で実施した。
4×105個のECは、形質導入の24時間前にフィブロネクチンでコーティングされた60mm径のプレート(Biological Industries社、イスラエル国)上に播種した。細胞は、DEAE−デキストラン(Sigma社、米国)と一緒に1時間にわたりインキュベートし、37℃で4時間にわたりレトロウイルスベクターに曝露させた。ウイルスベクターストックは、細胞1個に付きウイルス粒子5〜8個の比率を達成するようにM199培地中に希釈させた。
ePTFEグラフト(6mm、Gore社、米国)は、播種前にフィブロネクチン(45μg/mL、Sigma社、米国)を用いてプレインキュベートした。EC播種は、同種の重力非依存性グラフト播種を許容するために回転式装置を用いて実施した。血管グラフトにはEC培地中に4.5×105個(細胞)/cm2(グラフト表面積)を含有していたEC懸濁液を充填した。グラフトの播種は、5%のCO2、37℃の環境において実施した。この方法は、コンフルエントなEC単層でコーティングされたPTFEグラフトを産生した。
形質導入細胞における導入遺伝子の発現を検証するためにウエスタンブロットを実施した。形質導入細胞由来の馴化培地を採取し、10%のSDS−PAGEによって分離した。タンパク質をニトロセルロース紙へ電気的に移動させ、これを10%低脂肪乳でブロックし、ヒトフィブリン−5配列由来の合成ペプチドに対して立てられたウサギポリクローナル抗体とともに1:500の希釈率でインキュベートした(特注、Sigma社、イスラエル国)。ホースラディッシュペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ウサギ抗体(1:7000)を使用して、ECL検出システムを用いて結合抗体を視認した。VEGF165の検出は、1:500の希釈率でヤギ抗ヒトVEGF抗体(Santa−Cruz社、米国)を用いて実施した。ホースラディッシュペルオキシダーゼ標識ロバ抗ヤギ抗体(1:10000)を使用して、ECL検出システムを用いて結合抗体を視認した。
組織培養:免疫組織化学を使用して、形質導入細胞における導入遺伝子の発現の同定を実施した。細胞は4ウエル組織培養スライド(Nunc社)上で24時間にわたり播種し、次に4%のPFA(パラホルムアルデヒド)を用いて固定した。抗原を回収するために、スライドは1mM EDTAバッファー(pH8.0)中で15分間にわたりマイクロ波処置した。
5×105個の細胞の血清無含有馴化培地を24〜48時間後に採取し、細胞遠心分離のために2分間にわたり2,000rpmで遠心し、使用時まで−80℃で冷凍した。
一般的説明
MultiGeneGraft播種のために使用した遺伝子操作内皮細胞の生体内分布をウサギ/ヒツジ毒性モデルにおいて試験した。生体内分布試験は、それらがグラフト表面から剥離したMultiGeneGraft細胞の分布を試験するために実施した。ウサギにはMultiGeneGraftのために調製した治療用量もしくは高用量の二重形質導入内皮細胞を注射し、3もしくは24週間後に犠死させた。
DNAサンプルの調製
ウサギ/ヒツジ組織由来の2つずつのサンプルを新しく犠死させた動物から入手し、DNA単離時まで−80℃で保管した。組織サンプルから50〜70mgのアリコートを調製した。さらに、各々5mLの新鮮全血サンプルから白血球(WBC)サンプルを調製した。RBCを溶解させ、WBCは遠心分離後に採取し、食塩水中で洗浄し、DNA単離時まで−70℃で冷凍した。
SV40プロモーター(SV40)領域からのベクター特異的配列およびレトロウイルスベクター(pLXSN、Genebankアクセッション番号M28248)において見出されたネオマイシン耐性遺伝子(Neo)領域からの配列を検出するために、ネステッドPCRアッセイを実施した。選択したプライマーは、140bpの単一PCR増幅産物の増幅をもたらした。各々が約1μgの組織中DNAを含有する各組織について、3回ずつのPCRを実施した。3回のうちの1回は、50コピーのベクターDNAを用いてスパイクした。
陰性試薬コントロール(NRC)−核酸を含まないPCR反応ミックスから構成される。
組織サンプル中で抽出したDNAの完全性は、ハウスキーピング遺伝子β−アクチンに対して特異的な追加のPCRによって評価した(ウサギβ−アクチンに対して特異的なプライマーおよびヒツジβ−アクチンに対して特異的なプライマーを用いて)。106bpの単一特異的PCR増幅産物を産生するウサギサンプルDNA(0.1μg)は陽性と見なし、182bpのPCR増幅産物はヒツジサンプルDNAに対して陽性と見なした。
治療用量−24週間後犠死群の1匹のウサギについての代表的結果を図42に示した。現在までに試験した他のウサギのPCRの結果は表2に要約した。組織サンプルから抽出したDNAの完全性は、ウサギハウスキーピング遺伝子β−アクチンに対して特異的なPCR反応によって評価した。7匹のウサギを試験したが、試験した組織のいずれにおいてもベクター特異的配列は検出されなかった(表2を参照)。
生体内分布試験は、それらがグラフト表面から剥離したMultiGeneGraft細胞の分布を試験するために実施した。ベクター特異的配列の証拠は、MultiGeneGraft細胞の直接動脈内注射のウサギモデルについて試験したいずれの組織中でも検出されなかった。
これまでに試験したヒツジのPCRの結果の要約は、表3に提示した。MultiGeneGraftが移植された3匹の試験ヒツジ中1匹は、試験した全組織中でベクター特異的配列の存在について陰性であることが見いだされたことに注目することは重要である。24週間後犠死群のMultiGeneGraftが移植された1匹のヒツジについて同様に試験した。現在までに試験した他のヒツジのPCRの結果は表3に要約した。
1.移植24週間後の、剖検時の移植グラフト中で検出されたベクター配列
・ベクター特異的配列は、MultiGeneGraftにおいては検出されたが、ナイーブEC播種、またはベアePTFEグラフトにおいては検出されず、これは本発明者らのPCRに基づく生体内分布アッセイシステムの妥当性を支持している。
表3に要約したように、MultiGeneGraftが移植された3匹のヒツジにおいて、移植24週間後にベクター特異的配列の生体内分布について試験した。ベクター特異的配列は、1匹のヒツジの眼組織および他のヒツジの骨髄において検出された。他の組織もしくは器官では、ベクター含有細胞の証拠は見いだされなかった。
導入遺伝子の活性:
レトロウイルスベクターによる内皮細胞へのフィブリン−5およびVEGF165の高効率遺伝子導入は、実行可能であることが証明された。ECは導入遺伝子を発現することが証明されており、本セクションでは導入タンパク質が毒性試験のために使用されたヒトおよびウサギ細胞上で生物学的活性であるというインビトロ証拠を提供する。
フィブリン−5は、細胞の接着、増殖および運動性の調節において重要な役割を有する細胞外マトリックスタンパク質である。これらの経路におけるフィブリン−5の関係は、未だ十分には理解されていない。以前の試験では、フィブリン−5は、MAPキナーゼERKおよび上皮細胞中のp38の活性化を増強することが見いだされた。同様に数種の成長因子およびサイトカイン、特にVEGF165によってアップレギュレートされるこれらのキナーゼの活性化は、単一上流MAPキナーゼキナーゼ(MEK)によるトレオニンおよびチロシンのリン酸化を通して発生する。ここで本発明者らは、フィブリン−5およびVEGF165が単離したヒト伏在静脈由来内皮細胞(HSVEC)および平滑筋細胞(HSVSMC)中でERKおよびp38リン酸化を活性できるかどうかを試験した。手短には、ナイーブECおよびSMCは24時間にわたり6ウエルプレート内で培養した。培地は、フィブリン−5、VEGF165もしくはその両方の遺伝子を過剰発現するHSVECの馴化培地と交換した。外因性VEGF165(50ng/mL)もまた一部の実験において培養に加えた。その後、細胞は低温PBSを用いて1回洗浄し、溶解バッファーを用いて溶解させた。全細胞抽出物中のERKおよびp38活性化は、抗phospho−ERKまたは抗phospho−p38 MAPKモノクローナル抗体を用いたウエスタンブロット分析によって評価した。タンパク質負荷の相違は、抗ERKもしくは抗β−アクチン抗体のいずれかを用いた剥離膜の再プロービングによって監視した。
1.フィブリン−5を発現する細胞由来の予備馴化培地へのナイーブHSVECの曝露は、ERKリン酸化の有意な増強を生じさせたが、不活性形へは作用をほとんど、もしくは全く生じさせなかった。この上昇は、フィブリン−5に加えてVEGF165を用いた細胞のナイーブHSVSMC形質導入においてさえいっそう顕著であり、これはさらにERKリン酸化のわずかな増加をもたらしたが、HSVSMCにおける活性化には影響を及ぼさなかった(図44)。
フィブリン−5およびVEGF165両方の導入遺伝子の発現は、ヒトECに生物学的作用を及ぼすことが見いだされた。フィブリン−5過剰発現はERK活性化をもたらしたが、他方VEGF165はERKおよびp38両方のリン酸化を増強した。例えば細胞の増殖、分化、移動および生存などの生物学的プロセスにおけるERKおよびp38 MAPKの機能的関与に関しては矛盾するデータが存在する。フィブリン−5がHSVECの増殖を減少させる能力は、ERK活性化の増強を通して媒介されることが考えられる。さらに、VEGFによって誘導されるHSVEC増殖についての本発明者らの観察もまた、このプロセスにおいてERKおよびp38 MAPKが役割を果たすことを意味するであろう。
ウサギ静脈に由来するECにヒトVEGF165タンパク質が及ぼす生物学的作用を増殖アッセイによって評価し、ヒト静脈由来ECと比較した。EC(1×104個(細胞)/ウエル)は、フィブロネクチンがプレコーティングされた12ウエルプレート上に播種した。ECは、20%ウシ胎児血清(FBS)を補給した増殖培地中で培養した。翌日、培地は、72時間にわたり2種の濃度の組換えヒトVEGF165(rhVEGF、R&D Systems社)を補給した2%のFBSを含有する増殖培地と交換した。細胞増殖にVEGFが及ぼす作用は、Coulter細胞計数器を用いて細胞を計数することによって評価した(図47)。
本アッセイは、ヒトVEGFがウサギ内皮細胞に及ぼす生物学的作用を有することを証明した。2例のドナー由来のウサギECへのヒトVEGF補給は、72時間後に細胞増殖における20〜30%の増加を生じさせた。
内皮細胞−ヒト伏在静脈由来内皮細胞(2×104個(細胞)/ウエル)は、フィブロネクチン(20μg/mL)でプレコーティングされた24ウエル培養皿内に播種した。ECはトリプシンを用いて採取し、播種4時間後、第2日(48時間後)、第4日(96時間後)、第5日(120時間後)に細胞計数器(Coulter社、米国)を用いて計数した。各実験は3回ずつ実施し、3例の相違する静脈ドナーにおいて繰り返した(一次細胞系)。増殖率は、非形質導入EC(ナイーブ)、GFPを過剰発現するレトロウイルス形質導入EC(緑色蛍光タンパク質)、フィブリン−5を過剰発現するレトロウイルス形質導入EC、ならびにVEGF165およびフィブリン−5を共発現するレトロウイルス形質導入EC中で試験した。本アッセイは、bFGF(2ng/mL)の補給を行って、および行わずに実施した。
それにより内皮細胞が過剰に拡張させたFogartyバルーンによって内頸動脈から露出させられるラット頸動脈傷害モデルは、再狭窄の現象を試験するための最も一般的な動物モデルである。本方法は、バルーン拡張およびステント留置後のヒト動脈内で惹起される傷害に類似する血管傷害を誘発する。傷害に反応して、平滑筋細胞は増殖して内膜層に移動し、動脈内腔に突出する新生内膜層を作り出す。
本実験方法は、以下の工程から構成した:外側伏在静脈は18匹の成体ヒツジから切除した。それらの静脈各々由来の内皮細胞(EC)を単離し、20〜24日間の期間にわたり50×106個(細胞)へ拡大させた。ECは、CD31についての免疫組織化学的染色を用いて同定し、他方では線維芽細胞および平滑筋細胞汚染を平滑筋α−アクチンについての免疫染色を用いて除外した。ECは、フィブリン−5およびVEGF165をコードする遺伝子を用いてレトロウイルスによって形質導入した。遺伝子導入および選択後のフィブリン−5およびVEGF165の発現は、免疫組織化学的染色およびELISAによって検証した。遺伝子導入および細胞拡大後に、形質導入ECは長さ25cmで6mm径のePTFEグラフト上に播種した。6本のグラフトにフィブリン−5(>90%の細胞)およびVEGF165(15〜25%の細胞)を過剰発現する自家ECを播種し、6本のグラフトには自家非形質導入EC(ナイーブ)を播種し、6本のベアグラフトはコントロールとして移植した。播種したグラフトは、ECドナーヒツジの右頸動脈内に移植した。グラフトは頸動脈の端側に移植し、吻合部間の頸動脈はグラフトを通る血流量を最大限にするために閉塞させた。手術終了時に、グラフト開存性は選択的血管造影法によって検証し、頸動脈血流量を測定した(Dopplerフロープローブ、#T−106;Transonic System社、ニューヨーク)。移植の3カ月後、ヒツジに麻酔を掛け、グラフト開存性を試験するために選択的血管造影法を実施した。6カ月後、選択的血管造影法および頸動脈を通る血流量の測定を繰り返し、ヒツジはKCl注射によって犠死させた。移植したグラフトは、100mmHgで1Lの通常の生理食塩水を用いて選択的に灌流した。次にグラフトを含む頸動脈を切り裂き、近位および遠位吻合部、ならびにグラフトの中央区間からの連続区間をさらに24時間にわたり4%ホルマリン中で固定し、次にパラフィン包埋した。スライドは、内腔内血栓症および内皮細胞被覆を評価するためにH&E染色によって選択した。開存性グラフトは、全3種の横断面、つまり、近位および遠位吻合部、ならびに中央グラフト切片の形態計測分析を用いて腔内血栓の存在について評価した。連続する厚さ6μmのスライドをヘマトキシリン−エオシンによって染色した。EC被覆、内腔内血栓領域および血栓領域対グラフト内腔面積の比率は、デジタル画像分析(Image Pro Plus 4,Media Cybernetics社、米国)を用いて計算した。
全データは、平均値±SDとして計算した。複数のノンパラメトリック群間の増殖指数の比較は、Kruskal−Wallis ANOVA、その後のDunnの事後試験を用いて実施した。2つのノンパラメトリック群は、Mann−Whithney U試験を用いて比較した。2つの群間の血流量および形態計測的変量の比較は、対応のないStudentのT検定を用いて実施した。0.05以下の両側P値は、統計的有意と見なした。
ECおよびSMCのインビトロ増殖:
実施例28に記載の考察を参照されたい。
フィブリン−5をコードするレトロウイルスベクターによる形質導入後に、形質導入細胞の50〜70%は導入遺伝子を発現した。導入遺伝子の発現は、G418選択下での5〜7日間の培養後には細胞の85〜100%へ改善された。VEGF165をコードするベクターによる二次形質導入後、フィブリン−5を過剰発現するECの20〜30%は、追加してVEGF165を過剰発現した。フィブリン−5およびVEGF165の過剰発現は、ウエスタンブロット分析によって検証した(図48A、B)これらの細胞の免疫組織化学的染色は、二重遺伝子発現を証明した(図47C、D)。二重遺伝子の発現は安定性であり、第16継代まで維持された。
ECによるフィブリン−5の過剰発現は、EC増殖に阻害作用を及ぼした(図41A、B)。この阻害作用は繰り返しのヒト伏在静脈EC増殖アッセイにおいて観察された。bFGFなどの外因性成長因子の存在は、この作用を阻害した。同一細胞内でのVEGF165の過剰発現はこの阻害作用を無効にし、そしてbFGFの存在下では非形質導入ECもしくはフィブリン−5形質導入ECに比した増殖の利点を有していた。
ECは、方法のセクションに記載したePTFEグラフト上に播種した。グラフトには、緑色蛍光タンパク質発現、および走査型電子顕微鏡検査によって証明されるように、ECのコンフルエントな単層でコーティングした(図50A、B)。播種されたECは、ヘマトキシリン&エオシン染色によって証明されるように、グラフト表面上に単一単層を形成した(図50C)。播種した細胞をCD−31についての免疫組織化学的染色によっても染色した(図50D)。
グラフトはヒツジ頸動脈の両側に移植し、2週間にわたり動物を観察した。両方の遺伝子を過剰発現するECを播種したグラフト(n=8)は、ベアePTFEグラフト(n=4)、ナイーブEC播種グラフト(n=2)、およびGFPを過剰発現するECを播種したグラフト(n=4)を含むコントロール群と比較した。フィブリン−5およびVEGF165の発現は、GFP発現、ウエスタンブロットおよび免疫組織化学によって関連する導入遺伝子について検証した。二重遺伝子形質導入EC播種グラフト2つにおいて、VEGF165発現レベルは、ウエスタンブロット分析において検出されなかった。
グラフトのEC被覆は、細胞に被覆されたままである全グラフト面積のパーセンテージとして評価した。全グラフト切片(近位、中央および遠位)をECコーティングについて評価した。グラフトのECコーティング試験の結果の要約は表4に示した。結果は、フィブリン−5およびVEGF165の二重発現がコントロール群のECコーティンググラフトと比較して、ePTFEグラフトへのEC接着を有意に改善することを証明した(73.4±22.4%対29.6±24.8%;p値<0.004)。
実施例29は、合成グラフト上に播種された内皮細胞によるフィブリン−5およびVEGFの共発現がヒツジモデルにおいて径の小さな合成グラフトの長期開存性を改善することを証明している。これら2種の遺伝子の共発現がラット頸動脈傷害モデルにおける血管傷害後の新生内膜形成を減少させたという証拠もまた提供されている。
本発明の特定の実施形態についての上記の詳細な説明から、様々な心血管状態を治療するための独創的なデバイスおよび方法が記載されていることは明白である。本明細書では特定の実施形態を詳細に開示してきたが、これは例示する目的でのみ例として開示されており、そして添付の特許請求項の範囲に関して限定することは企図されていない。詳細には、本明細書に記載した実施形態に関する知識を用いれば、当業者であれば様々な代用、変更、および変形は日常的作業であること、そして請求項によって規定された本発明の精神および範囲から逸脱せずに行えることは本発明者らによって企図されている。
Claims (19)
- 血管疾患もしくは障害を治療するための移植可能なデバイスであって、平滑筋細胞増殖のインヒビターおよび成長因子を含有する血管内プロテーゼを含む移植可能なデバイス。
- 前記血管内プロテーゼは、ステントである、請求項1に記載のデバイス。
- 前記平滑筋細胞増殖のインヒビターは、UP50である、請求項1に記載のデバイス。
- 前記成長因子は、VEGFである、請求項1に記載のデバイス。
- 前記血管疾患は、再狭窄である、請求項1に記載のデバイス。
- 前記デバイスは、前記平滑筋細胞増殖のインヒビターおよび前記成長因子が含浸させられている生分解性薬物溶出ポリマーでコーティングされている、請求項1に記載のデバイス。
- 前記デバイスは、代替的に、前記成長因子および平滑筋細胞増殖のインヒビターを発現もしくは過剰発現するように遺伝子操作されている内皮細胞を含む基質でコーティングされている、請求項6に記載のデバイス。
- 血管内インターベンション後に血管閉塞を阻害して、同時に血管壁の回復を増強する工程によって血管疾患もしくは障害を治療する方法であって:
a)平滑筋細胞増殖のインヒビターおよび成長因子を含有する血管内デバイスを、それを必要とする対象の血管内に挿入する工程と;および
b)前記インヒビターおよび成長因子を前記血管内に溶出させ、それにより平滑筋細胞増殖を阻害し、内皮細胞増殖を増強する工程とを含む方法。 - 前記血管内デバイスは、ステントである、請求項8に記載の方法。
- 前記平滑筋細胞増殖のインヒビターは、UP50である、請求項8に記載の方法。
- 前記成長因子は、VEGFである、請求項8に記載の方法。
- 前記血管疾患は、再狭窄である、請求項8に記載の方法。
- 血管内インターベンション後に血管閉塞を阻害して同時に血管壁の回復を増強する工程によって血管疾患もしくは障害を治療する方法であって:
a)平滑筋細胞増殖のインヒビターおよび成長因子が含浸させられている生分解性薬物溶出ポリマーでコーティングされた血管内デバイスを、それを必要とする対象の血管内に挿入する工程と;および
b)前記インヒビターおよび前記成長因子を前記ポリマーから前記対象の血管内に溶出させ、それにより平滑筋細胞増殖を阻害し、内皮細胞増殖を増強する工程とを含む方法。 - 血管内インターベンション後の平滑筋細胞の新生内膜形成を予防する方法であって、平滑筋細胞増殖のインヒビターを血管障害部位へ送達する工程を含む方法。
- 前記平滑筋細胞増殖のインヒビターは、UP50である、請求項14に記載の方法。
- 前記送達する工程は、注射によって実施される、請求項14に記載の方法。
- 1つ以上の細胞増殖成長因子を送達する工程をさらに含む、請求項14に記載の方法。
- 前記細胞増殖成長因子は、VEGFである、請求項17に記載の方法。
- 血管内インターベンション後に血管閉塞を阻害して、同時に血管壁の回復を増強する工程によって血管疾患もしくは障害を予防する方法であって:
a)それを必要とする対象の血管内に、平滑筋細胞増殖のインヒビターおよび成長因子が含浸させられている生分解性薬物溶出ポリマーでコーティングされた血管内デバイスを挿入する工程と;および
b)前記インヒビターおよび前記成長因子を前記ポリマーから対象の血管内に溶出させ、それにより平滑筋細胞増殖を阻害し、内皮細胞増殖を増強する工程とを含む方法。
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