KR19990044317A - 아밀포스파타제2Ｃ - ＰＰ 2Ｃα-발현의 조작 및 검출 - Google Patents

아밀포스파타제2Ｃ - ＰＰ 2Ｃα-발현의 조작 및 검출 Download PDF

Info

Publication number
KR19990044317A
KR19990044317A KR1019980701557A KR19980701557A KR19990044317A KR 19990044317 A KR19990044317 A KR 19990044317A KR 1019980701557 A KR1019980701557 A KR 1019980701557A KR 19980701557 A KR19980701557 A KR 19980701557A KR 19990044317 A KR19990044317 A KR 19990044317A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
pp2cα
antibody
cells
gene
vector
Prior art date
Application number
KR1019980701557A
Other languages
English (en)
Inventor
사라 래비
Original Assignee
라미 핀클러 ; 하나넬 크바탄스키
래모트-유니버시티 어소러티 포 어플라이드 리서치 앤드 인더스트리얼 디벨럽먼트 리미티드
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 라미 핀클러 ; 하나넬 크바탄스키, 래모트-유니버시티 어소러티 포 어플라이드 리서치 앤드 인더스트리얼 디벨럽먼트 리미티드 filed Critical 라미 핀클러 ; 하나넬 크바탄스키
Publication of KR19990044317A publication Critical patent/KR19990044317A/ko

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/40—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against enzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
    • C12N2750/00011—Details
    • C12N2750/14011—Parvoviridae
    • C12N2750/14111—Dependovirus, e.g. adenoassociated viruses
    • C12N2750/14122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/106—Pharmacogenomics, i.e. genetic variability in individual responses to drugs and drug metabolism

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

본 발명은 환자로 부터 분리한 시료내 인체형 단백질 포스파타제 2C(PP2Cα 및 PP2Cβ) 및 그 유전적 다형태성을 암호하는 유전자의 활성도 변화를 검출함으로써 환자의 암을 검출하는 방법을 기술한 것이다. 또한 본 발명은 암의 유형과 그 암을 발현하는 세포를 결정하는 단계, 및 PP2Cα 의 발현가능성을 조절하는 조절요소를 함유할 수 있으며 상기 암 세포를 특이적으로 표적화할 벡터를 제조하는 단계를 포함하는 암 치료방법을 제공한다. 그런 다음 이 벡터를 환자에게 투여한다. 택일적으로 안티센스 벡터를 제조할 수도 있다.

Description

암 검출 및 치료를 위한 종양세포내 단백질 포스파타제 2Ｃ - ＰＰ2Ｃα - 발현의 조작 및 검출
발명의 배경
형질전환된 세포나 악성세포는 심각한 건강상 위협을 야기한다. 형질전환된 표현형을 반전시킬 수 있다면 치료를 제공하도록 암 세포를 조절할 수 있다. 역으로 그 세포는 그의 신생 표현형을 잃게 되어 정상적인 세포성장 및/또는 분화를 회복할 수 있거나, 성장이 정지되거나 프로그램 세포 사멸 - 세포소멸 경로 - 이 활성화될 수 있다. 치료학적 조치에 의한 이 임의의 반전 수단이 마련됨으로써 형질전환된 표현형을 반전시킬 수 있는 치료학적 조치를 제공하는데 유용할 것이다. 또한, 초기에 형질전환 사건을 확인하는 것 역시 유용하다고 입증되었으므로 곧 치료법이 착수될 수 있을 것이다.
현재 확인되어 있는 다음과 같은 유전자가 형질전환과 관계가 있다: Ras, Fos PDGF, erb - B, erb - B2, RET, c - myc, Bci - 2, APC, NF - 1, RB, p53 등. 이들 유전자는 원종양 유전자와 종양억제 유전자의 광범위한 두 종류로 나뉜다. 원종양 유전자는 세포 분할을 자극하는 단백질을 암호하는데, 돌연변이되면(종양형성 유전자) 과활성화될 수 있는 자극 단백질이 유발되어 그 결과 세포가 과도한 증식을 하게 된다. 종양억제 유전자는 세포 분할을 억제하는 단백질을 암호한다. 돌연변이 및/또는 이상 조절로, 이들 단백질을 비활성화시켜 세포가 증식 억제되지 않도록 할 수 있다. 부가적으로, E2F 와 p53 등이 부적절하게 발현되면 종양형성 유전자와 종약억제 유전자 둘 다로서 작용할 수 있다. 종양형성 유전자와 종양억제 유전자 사이는 전사인자 및 단백질 키나제로서 작용하는 모티프이다. 이들 특이 유전자의 확인으로 세포 생활환 진행 방법의 일부가 밝혀졌다.
악성세포 및 형질전환 세포주와 관련된, 뚜렷한 이상 중의 하나는 유전자 증폭이다["Gene Amplification in Mammali an Cells, A comprehensive Guide. edited by R.E. Hellems, Marcel Dekker, Inc. for a review of amplification" 참조]. 이 현상은 신생 세포를 특정화하는 유전적 불안정의 일부로서 정상 세포에서 드물게 나타난다. 어떤 종양형성 유전자 및 종양억제 유전자는 Ras, Erb, p53 등과 같이 증폭될 수 있다고 밝혀졌다.
종양형성 유전자와 종양억제 유전자를 포함하는 구조 및 조절 단백질의 인산화가 진핵생물의 주요 세포내 조절 기작이다[Wera 및 Hemmings 의 1995 ; Cohen 의 1989 문헌 참조]. 단백질의 인산화 및 탈인산화는 시그널 도입을 위한 조절주기, 세포주기 진행 및 전사 조절의 일부이다. 단백질 키나제와 단백질 포스파타제 둘 다 각각 인산화 주기 - 탈인산화 주기에서 역할을 갖고 있다. 이들 단백질을 암호하는 유전자를 돌연변이시켜 단백질이 인산화되지 못하게 할 수 있다. 예를들어, 효모에서 2C 형 단백질 포스파타제를 돌연변이시키면 삼투압조절의 결여가 야기된다[Shiozaki 및 Russell, 1995 문헌 참조].
pp2c 는 단백질 세린/트레오닌 포스파타제이다[Cohen 1989 문헌 참조]. pp2c 과(family)는 포유동물 조직에서는 2 개의 세포질 동위효소로 구성되어 있으며[McGowan 및 Cohen 의 1987 문헌 참조] 효모에서는 동일한 효소 특성과 생물학적 특성을 나타내는 최소한 3 개의 pp2c - 유사 효소로 되어 있다. 이 두 포유동물 동위효소는 단량체이지만 분자량이 조금 다르며(44 KDa 및 42 KDa) 이를 pp2cα 와 pp2cβ 로 명명한다. 형질전환 세포와 이들 단백질 포스파타제와의 관련 및 그 기능에 대해 상반되는 문헌이 있다[Saadat 등의 1994 ; Nishikawa 등의 1995 ; Lau 및 Baylink, 1993 ; Shiozaki 등의 1994 ; Eden 및 Cedar, 1994 ; McGowan 및 Cohen, 1987 ; Wenk 및 Mieskes, 1995 참조].
정상적인 세포 기능이 요구될 경우 단백질 인산화를 치료학적으로 조절할 수 있음이 유용할 것이다. 부가적으로, mRNA 번역에 따른 글리코실레이션이 많은 유전자 산물의 기능화에 필요하다. 단백질의 글리코실레이션 이상이 단백질 기능을 간섭할 수 있는데 이것은 변경된 조절 경로로 부터 야기될 수 있다. 유전자 발현의 중요한 조절 양식은 DNA 메틸화이다[Eden 및 Cedar, 1994 참조]. DNA 의 이상 메틸화로 세포 주기를 조절하는 조절 단백질의 부적절한 발현이 야기될 수 있다.
바이러스는, 많은 경우에 있어 숙주 방어 기작을 회피하도록 진화된 매우 특별한 감염인자이다. 아데노 관련 바이러스는 종양억제 특성에 대해 1960 년도에 이미 밝혀진 파르보바이러스과 부류이다[Rommelaere 및 Tattersal, 1990 평론지 참조]. 그것은 약 5000 누클레오티드의 ssDNA 게놈을 가지며, 154 개 염기로 된 동일한 팔린드롬 말단(palindromic termini)을 특징으로 하는 작은 바이러스의 일 군이다. AAVDA3 게놈의 좌측 부분은 P5 와 P19 프로모터에 의해 작동되어, 다르게 접합된 mRNA 로 부터 번역되는 4 개의 다작용기성의, 중복의, 비 - 구조 단백질(Rep78, Rep68, Rep52 및 Rep40)을 암호한다(수탁번호 제 JO1901 호, 제 M12405 호, 제 M12468 호, 제 M12469 호). 이 게놈의 우측 부분에서는 3 개의 중복 캡시드 폴리펩티드(VP1 - VP3)가 P40 프로모터로 부터 암호된다[Berns, 1990 ; Leonard 및 Berns, 1994 문헌 참조]. 이들 극도로 작은 DNA 바이러스의 두 종류가 척추동물에서 나타나는데, 자율 복제성 파르보바이러스와 헬퍼 의존성 파르보바이러스이다[Siegl 등의 1985 문헌 참조].
헬퍼 - 의존성 아데노 - 관련 바이러스(AAV)는 그들의 복제에 대하여 헬퍼 바이러스와의 공동감염에 의존하거나[Young 및 Mayor, 1979 a, b 문헌 참조], 유전자독성 스트레스의 조건에 의존하며[Yakobson 등의 1987 문헌 참조] 뚜렷한 질병없이 인체를 감염시키는 인자를 포함한다[Cukor 등의 1984 문헌 참조]. 헬퍼 바이러스는 아데노바이러스[Atchison 등의 1965 문헌 참조], 허피스군 바이러스[Salo 및 Mayor, 1979 문헌 참조] 및 백신 바이러스[Schlehofer 등의 1986 문헌 참조] 이다. 헬퍼 바이러스는 그것의 감염 주기에 있어 초기에 염색체 손상을 유도하는 능력을 공유한다[Schlehofer 및 zur Hausen, 1982 문헌 참조].
AAV 에 대해 종양 억제 특성이 발견되었다[Schlehofer, 1994 평론지 참조]. 아데노바이러스, 허피스 바이러스에 의해서, 또는 이들 바이러스로 형질전환된 세포의 이식에 의해서 설치동물에 유도된 종양의 발육은 AAV 로 이 동물 세포를 감염시킴으로써 억제시킬 수 있다는 것이 밝혀졌다[Kirschtein 등의 1968 ; Mayor 등의 1973 ; de la Maza 및 Carter 의 1981 ; Ostrove 등의 1981 문헌 참조]. 종양 억제의 생체내 발견은 시험관내 세포 형질전환의 억제를 나타내는 결과와 유사하다. 이것은 바이러스에 의해 또는 활성화된 종양형성 유전자에 의해 형질전환된 다른 기원(햄스터 및 마우스)의 세포에 대해서도 나타날 수 있다. 대조와 비교하면, AAV 로 감염시킨 세포나 특이 AAV DNA 서열로 형질감염시킨 세포는 병소 형성이 감소하였으며 형질전환 - 관련 특성의 억제를 의미하는 포화 밀도를 나타냈다[Casto 및 Goodheart, 1972 ; Katz 및 Carter, 1986 ; Hermonat, 1989 ; Hermonat, 1994 ; Schlehofer 등의, 1983 ; Schlehofer, 1994 ; Yang 등의 1995 ; Kleinschmidt 등의 1995 문헌 참조].
또한, 사람 집단에 대한 혈청역학적 연구 결과, 암 환자에게서 AAV 에 대한 항체가 짝을 이룬 대조 개인 보다 덜 빈번히 나타난다는 것이 밝혀졌다. 미국[Mayor 등의 1976 문헌 참조], 벨기에[Sprecher - Goldberger 등의 1971 문헌 참조] 및 독일[Georg - Fries 등의 1984 문헌 참조]에서 다른 혈청학적 기술을 이용하여 수행한 개별적인 세 연구 결과, 암 환자의 혈청반응양성이 비교적 낮은 빈도인 것과 대조적으로 정상 집단에서는 AAV(2, 3 및 5 형)에 대한 항체가 아주 우세하다는 것이 발견되었다.
세포 형질전환을 조절하는 치료학적 방법을 개발하는 것이 유용할 것이다. 상기 정보가 암시하는 바와 같이, 세포 형질전환을 반전시키거나 형질전환된 세포를 특이하게 사멸시키는 것은 가능하다. 이용가능한, 주어진 안티 - 센스 기술, 벡터 운반 기술등은 이들 방법이나 공지된 다른 방법들로 세포 형질전환을 반전시키도록 조절할 수 있는 인체 세포 기작을 발견하는데 유용할 것이다.
발명의 요약
본 발명에 따라, 환자에게서 분리한 시료내 인체형 단백질 포스파타제 2C(pp2cα) 및 그것의 유전적 다형태성을 암호하는 유전자(PP2Cα 또는 PP2Cβ)의 활성도 변화를 검출함으로써 환자의 암을 검출하는 방법 및 키트를 제공한다.
또한 본 발명은 다음 단계를 포함하는 암 치료방법을 제공한다 : 암의 유형과 그 암을 발현하는 세포의 유형을 결정하는 단계 및 상기 암 세포를 특이적으로 표적화하며 PP2Cα 의 발현가능성을 조절하는 조절요소를 포함할 수 있는 벡터를 제조하는 단계. 그런 다음 이 벡터를 환자에게 투여한다. 택일적으로 안티센스 벡터를 제조할 수 있다.
또한 본 발명은 PP2Cα 발현을 조절함으로써 PP2Cα 발현의 변화로 인한 이상 인산화에 기인하는 질병을 치료하는 방법을 제공한다.
본 발명은 유전자 인체형 단백질 포스파타제 2C (PP2Cα 및 PP2Cβ)와 그 유전자 산물을 이용하는 암 검출 및 암 치료방법과 이 발명을 실행하기 위한 키트에 관한 것으로, 이는 인체 PP2Cα 유전자에 의해 암호되는 유전자 산물 또는 다른 종에서의 그 동족체를 생산하거나 천연 PP2Cα 유전자의 발현을 변형시키거나 녹아웃시킨 천연 및 형질전환 유기체를 제조함으로써 이루어 진다.
다음 상세한 설명을 참조하면 본 발명이 더 잘 이해되는 바와 같이 본 발명의 다른 잇점은 본원에 첨부한 도면과 관련하여 고려하면 쉽게 인식될 것이다.
도 1A - B 는 CO60 과, 세포 주기 분석용으로 제조한 2 개의 AAV/neo 세포주 913 및 916 과의 FACS 분석 그래프이다. 세포 접종 24 시간 후에 트립신으로 처리한 다음 PBS 로 세척하였다. 0.1 % 시트르산 나트륨, 0.1 % 트리톤 X - 100 및 50 ㎍ 의 요오드화 프로피디움을 함유하는 1 ml 완충액에 세포를 재현탁한 다음 FACS 로 처리하였다.
도 2 는 CHINT 가 다른 AAV/neo 세포주내 AAV 통합과 관련되어 있음을 보여주는 서던 블롯 분석 사진이다. 다른 AAV/neo 세포주의 서던 블롯 분석은, CO60 DNA 를 Bgl Ⅱ 로 절단하여 AAV/neo 세포주에 대해 "CHINT" 프로브, 9 - 1, 2, 3, 4 및 5 와 혼성화시켰다. 93R 은 AAV 를 포함하는 전체 염색체가 결여되어 있는 복귀변이체이다. A6 은 마우스 세포주이다.
도 3 은 9 - 3 세포의 측면 세포 서열과 통합된 AAV 의 구성의 개략도이다. EMBL - 4 람다 파아지(미국 매릴랜드 베데스다 소재의 ATCC 에서 구입)를 사용하여 C9 - 3 세포로 부터 게놈 라이브러리를 제조하고 AAV 양성 클론을 기록하였다. 13 kb - λSL9 - 1 클론을 분리한 후 블루 - 스크립트 벡터{미국 위스콘신 매디슨 소재의 노바겐(Novagen)에서 구입}에 서브클로닝시켰다. 이 도에 나타나 있는 바와 같이 플라스미드 pSL9 - 11(13 kb), pSL9 - 8(10 kb) 및 pSL9 - 6(3 kb)을 수득하였다.
도 4A - B 에서, (A) 는 AAV 가 9 - 3 세포에서 PP2Cα 를 암호하는 유전자에 근접하고 있음을 보여주는 서던 블롯 분석 사진이다. 게놈 DNA 의 서던 블롯 분석에 있어, CO60 과 9 - 3 세포를 EcoRI, 또는 XbaI 으로 절단하여 이어서 다음 프로브와 혼성화시켰다 : 1) AAV ; 2) CHINT ; 및 3) 랫 PP2Cα 프로브. CHINT 와 PP2Cα 서열은 인접해 있다(4 kb EcoRI 단편). AAV, CHINT 및 PP2Cα 는 9 - 3 세포에서 아주 근접해 있다(5.6 kb XbaI 단편). (B) pSL9 - 6 은 야생형 중국 햄스터 세포의 PP2Cα와 근접하고 있다. 중국 햄스터 neo 세포의 BamHI 절단 DNA 를 pSL9 - 6 및 PP2Cα 프로브와 혼성화시켰다. CO60 을 포함하는 모든 세포주에서 ~ 8.5 kb 의 공통 단편이 나타났다. 이 동일한 단편 역시 CHINT 프로브와 혼성화시켰다(데이터는 나타나 있지 않음).
도 5A - C 는 DA3(8 레인) 및 DA3J1 - DA3J7 세포주(1 - 7 레인)의 서던 블롯 분석 사진이다. 게놈 DNA 를 Bgl Ⅱ 로 절단하였다. 이어서 블롯을 AAV/neo JDT277, pSL9 - 6 및 PP2Cα PCR 프로브와 혼성화시켰다. J3(3 레인), J4(4 레인) 및 J6(6 레인)에서 4 kb 단편이 AAV 프로브 및 pSL9 - 6 프로브와 혼성화하였다. 4 kb 보다 더 작은 단편은 J1(1 레인), J2(2 레인), J5(5 레인) 및 J6(6 레인)에서 AAV 와 PP2Cα 프로브 둘 다와 혼성화하였다.
도 6 은 발암물질 처리에 반응하여 PP2Cα mRNA 가 변형되었음을 나타내는 사진이다. MNNG 처리(각각 7.5 μg/ml 와 2.5 μg/ml) 48 시간 후에 CO60 및 C9 - 3 세포로 부터, 및 비처리 세포로 부터 40 μg 의 총 RNA 를 분리하고 변성겔(1.2 % 아가로스/6.6 % 포름알데히드 겔) 상에서 분획화하였다. 이 겔을 블로팅시키고 연속하여32P - 표지 랫 PP2Cα cDNA (A) pSL9 - 1DNA(B) 및 rRNA cDNA (C) 와 혼성화시켰다.
도 7 은 25, 30 및 35 PCR 순환 후의 겔 전기영동 분석을 나타내는 사진이다. 결장직장 종양 번호 6(T6), 또는 그것과 인접해 있는 비종양성 점막(N6)으로 부터 수득한 올리고 dT - 프라임 cDNA 를 특이 PP2Cα 와 β - 액틴 센스 및 안티 - 센스 프라이머를 사용하여 PCR 반응시켰다. 정상 조직 및 종양 조직에서 PP2Cα cDNA 에 대한 25 순환 PCR 은 나타나 있지 않은데, 그 이유는 눈에 보이는 산물이 발견되지 않았기 때문이다.
도 8 은 CHE 세포주, 또는 그것과 인접해 있는 형질전환 세포주(CO60)로 부터 수득한 올리고 dT - 프라임 cDNA 분취량을 특이 PP2Cα 와 β - 액틴 센스 및 안티 - 센스 프라이머를 사용하여 PCR 반응시킨 25, 30, 30 및 35 PCR 순환 후의 겔 전기영동 분석을 나타내는 사진이다.
도 9A - B 는 PP2Cα cDNA 를 (A) 센스 배향으로(pYM001) (B) 안티센스 배향으로(pYM002) 포함하는 플라스미드의 개략도이다.
도 10 은 PP2Cα에 대항하는 모노클로날 항체 패널과 함께 간 추출물의 면역침강을 겔 전기영동 분석한 사진이다 ; 1D5, 2A3, 9F4, 9F1 은 간 추출물에서의 pp2cα를 침강시키는데 사용하는 모노클로날 항체이고, 801 과 351 은 면역블로팅 후 검출용으로 사용하는 토끼의 폴리클로날 항체이다.
도 11 은 번역된 PP2Cα 의 첫 번째 엑손을 함유하는 게놈 λ100 클론의 개략도이다. 파아지는 CHO 라이브러리로 부터 클로닝하였다. 서열결정된 부분은 사교(cross hatching)로써 표시되어 있다(서열 15 및 16).
도 12 는 겔 전기영동을 나타내는 사진이다. 1 레인은 pSK1 과 pAV2 를 공동형질감염시킨 것이고, 2 레인은 SV40 플라스미드 pSK1 SV40 복제물로 형질감염시킨 것이고, 3 레인은 AAV 게놈 누클레오티드 125 - 263 의 140 bp 를 함유하는 플라스미드와 pSVK1 을 공동형질감염시킨 것이며, 4 레인은 pSVK1 과 pSL9 - 6 을 공동형질감염시킨 것이다.
도 13 은 노던 블롯 사진으로서 여러 가지 마우스 조직으로 부터의 RNA 를 PP2Cα cDNA 와 혼성화시킨 결과 2 kb 미만 부터 5.0 kb 초과까지의 범위로 다른 크기를 갖는 몇몇 mRNA 가 존재한다는 것을 증명한다. RNA 는 난소(O), 고환(T), 신장(K), 간(L), 근육(M), 심장(H), 폐(Lu) 및 뇌(B)로 부터 추출하였다.
본 발명은 환자로 부터 분리한 시료내 인체형 단백질 포스파타제 2C (pp2cα) 및 그것의 유전적 다형태성을 암호하는 유전자(PP2Cα)의 유전자 활성도 변화를 검출함으로써 환자의 암을 검출하는 방법을 기술한 것이다. 환자의 유전자 활성도는 정상 대조의 유전자 활성도와 비교한다. 활성도 변화로 유전자 활성도가 하향 조절될 수 있거나 역으로 상향 조절되어 결과적으로 인산화가 변할 수 있다. 또한, 변화는 이상 기능이나 유전자 산물의 부재를 초래할 수 있으며 세포 자체내 유전자 산물의 분포를 변화시킬 수 있다.
다형태성은 유전자 서열의 변이이다. 이것은, 비록 다른 서열을 가질지라도 기능적으로 동등한 유전자 산물, 즉 동형(isoform)을 생산하는 다른 인종 및 다른 지리적 위치 간에 발견되는 서열 전위(sequence shift)일 수 있다. 또한 다형태성은 대립형질로서 분류될 수 있는 변종(Variation) 및/또는 변화된 기능을 가질 수도 있는 유전자 산물을 생산할 수 있는 돌연변이(mutation)를 포함한다. 다형태성은 또한 대립형질로서 분류될 수 있는 변종 및/또는 유전자 산물, 비활성 유전자 산물 또는 증가된 수준의 유전자 산물을 생산하지 않는 돌연변이를 포함한다. 본원에 사용한 다형태성은 조절 및 암호화 부위에서의 DNA 메틸화의 차이에 기인하는 변종도 포함할 수 있다. 또한, 이 용어는 적당할 때 대립형질과 교대로 사용한다.
암은 형질전환된 세포 또는 악성 세포, 즉 성장 및 확대가 조절되지 않는 세포라고 정의된다(Scientific Awerican September, 1996 평론지 참조).
대개, 세포내 유전자 산물의 양이 감소함으로써 결정하는 바와 같이 PP2Cα 의 활성도/발현이 정상 대조의 활성도/발현과 비교하여 감소하였음을 나타내는 하기 실시예(실시예 4, 5)에서 알 수 있듯이 암은 세포 형질전환에서 발견된다. 그러나, 본 발명에서 의도하는 바는 세포 기능이 변화되도록, 증가된 활성도가 단배질 활성도의 변화를 초래하는 것이다.
또한, PP2Cα 의 유전자 산물의 형태보다 많은 형태가 존재하는데, 그것들이, 비록 PP2Cα 의 다른 특이 형태가 정상 대조와 비교하여 상승되거나 더 우세할 것일지라도 세포내에서 감소되거나 변화될 수 있다는 것을 본 발명은 인정한다. 이 세포가 질병 상태의 PP2Cα 활성도의 변화를 나타내는 어떠한 세포 유형일 수 있다. 또한, 제 2 유전자는, 그 산물이 증가되거나 감소되도록 PP2Cα 의 활성도를 변화시킴으로써 조절시킬 수 있으며 본 발명의 방법에 의해 기록될 수 있다. 새로운 전사, 즉 이 전사에 의해 암호되는 단백질의 전사 또는 변화의 부재가 기록된다.
또한, 본 발명은, pp2cα 는 티로신, 세린 및 티로닌을 포함하는 몇몇 인산화 부위를 가지고 있으므로 자체적으로 인산화되는데 인산화에 실패하면 pp2cα 단백질의 기능부전을 야기시킬 것이라는 것을 인정한다. 또한, pp2cα 는 스스로 탈인산화한다. 그것의 자율인산화가 실패하면 세포 주기 조절에 영향을 미칠 것이다.
시료는 본원에 기술된 바와 같이 PP2Cα 활성도 또는 유전자 산물을 검정할 수 있는 요주의 전암성 병소나 임의의 조직 또는 체액의 생검 물질일 수 있다. 혈액, 요, 뇌척수액 및 타액과 같은 체액이 적당하므로 이것들을 조사할 수 있다.
PP2Cα 활성도를 검출하는 실시형태는, 정상소재의 혼성화, 노던 블롯팅 및 역전사효소 - 중합효소 사슬 반응으로 구성된 군 중에서 선택한 검정법으로 다형태성을 포함하는 PP2Cα DNA 에 상보적인 mRNA 에 대해 시료를 검정함으로써 이루어 진다.
택일적인 방법은, PP2Cα 유전자 산물의 다형태성 및 그 펩티드 단편을 포함하는 PP2Cα 유전자 산물에 대해 시료를 검정함으로써 PP2Cα 활성도 및 세포 분포를 검정하는 것으로, 상기 검정은 면역조직화학 및 면역세포화학 염색법, ELISA, RIA, 면역블롯, 면역침강, 웨스턴 블로팅, 유전자 산물의 활성도에 대한 기능적 검정, 인산화 유형에 대한 검정 및 단백질 절단 시험으로 구성된 군 중에서 선택한다. pp2cα 에 의해 탈인산화되는 표적 단백질은 PAGE 및 차별 등전점 전기이동에서 다른 크기의 특성을 지닐 뿐만 아니라 다른 단백질, RNA, DNA 및 다른 세포 성분과 상호작용하는 능력과 같은 기능을 변화시킬 수 있다.
또한, 염색체 이상이 변화된 PP2Cα 와 관련이 있다면 본 분야에 공지된 표준방법을 이용하여 이를 선별한다.
하기 실시예에서 나타낸 바와 같이 본 발명의 방법은 세포 자체내 유전자 산물의 위치와 양의 변화 이외에, 채액내 유전자 산물을 선별한다. 글리코실레이션 또는 시그널 서열이 영향을 받는다면 세포로 부터 더 많은 양이 방출되는 것 처럼 유전자 기능이 변화하면서 체액 내 유전자 산물의 수준에 영향을 미친다. 번역이 방해되면 불완전한 단백질 단편이 생성되어 세포로 부터 방출되고 기록된다.
또한, 본 발명은 다른 조직에서 다른 크기 및/또는 기능에 대한 상승을 제공하는, pp2cα 에 대해 mRNA 가 택일적으로 접합된 형태를 인정하며 검정법은 적합한 조직내 택일적으로 접합된 형태를 인식하도록 고안한 것이다.
특별한 채액내에서 유전자 산물의 변화가 확인된다는 것은 종양의 기원/위치를 암시할 것이다. 예를들어, 중추 신경계의 종양에 있어, 이 유전자 산물은 뇌척수액에서 발견될 것이다. 유사하게 다른 종양이나 다른 질병의 위치는 체액을 선별함으로써 결정될 것이며 본 기술 분야의 숙련된 기술자들에게 공지되어 있을 것이다.
본 발명은 또한 PP2Cα 활성도 및/또는 mRNA 수준이나 아니면 유전자 산물의 수준의 변화를 검출하는 키트를 제공한다. 이 키트는 PP2Cα mRNA 에 대한 mRNA 용 분자 프로브와 이 분자 프로브 및 이에 의한 mRNA 를 검출하는 검출수단을 포함한다. 택일적으로, 또는 부가하여, 이 키트는 PP2Cα 유전자 산물을 검출하는 프로브를 포함할 수 있다. 검출수단은 일반적인 것으로, 유전자 산물에 대해 고특이성을 갖는 항체 또는 PP2Cα 유전자 산물과 결합하는 천연 단백질을 모조한 인자 및 사용가능한, 본 기술 분야에 공지되어 있는 다른 인자이다. 하기 실시예 3 에 기술되어 있는 바와 같이 다형태성을 포함하는 PP2Cα 나 PP2Cβ 유전자 산물(세포 표면상의 산물도 포함)을 특이적으로 인식하는 항체, 및 이 항체의 결합을 검출함으로써 유전자 산물의 존재를 나타내며 또한 다른 산물과 구별하는 검출 수단을 제조하였다.
적당한 경우에, 이 키트는 PP2Cα 유전자의 기능이 변화됨으로써 영향받는 2 차 유전자 산물에 대항하는 항체를 포함할 수도 있다.
본 발명은 환자로 부터 분리한 시료내 정상 환자와 비교하여 변화된 PP2Cβ 유전자 활성도 수준을 검출함으로써 환자의 암을 검출하는 방법을 기술한 것이다.
또한 본 발명은 PP2Cβ 활성도를 검출하는 키트를 제공한다. 이 키트는 PP2Cα 다형태성에 대한 mRNA 용 분자 프로와 이 분자 프로브 및 이에 의한 mRNA 를 검출하는 검출 수단이나 항체 또는 본원에 기술한 바와 같이 정상 대조에 대하여 유전자 산물 수준의 변화를 확인하는 다른 수단을 포함한다.
본 발명은 항체, 즉 폴리클로날이나 아니면 모노클로날을 제공하는데, 이들은 하기 실시예 3 에 기술된 바와 같이 PP2Cα 유전자에 의해 암호되는 폴리펩티드/단백질과 특이적으로 결합한다. 본 발명의 항체는 PP2Cα 및 PP2Cβ 의 유전자 산물을 확인하는데 사용된다. 본 발명은 재조합적으로 생산한 PP2Cα, NDDTDSASTD(서열 1), YKNDDTDSTSTDDMW(서열 2), 재조합적으로 생산한 pp2cβ 및 PNKDNDGGA(서열 3)에 대항하는 모노클로날 및 폴리클로날 항체를 제공한다.
본 발명은 또한 분리 정제한 펩티드 NDDTDSASTD(서열 1), YKNDDTDSTSTDDMW(서열 2) 및 PNKDNDGGA(서열 3)을 제공한다. 이 펩티드는 재조합적으로 생산할 수 있다.
또한 본 발명은 5' UTR 의 특별한 구조 또는 조절된 PP2Cα 발현을 초래하는 RNA - 단백질 복합체를 인식할 항체를 제공한다. 특별한 RNA 구조를 특이하게 인식하는 항체 역시 제공한다.
일반적으로 항체 제조에 있어서, 전체 pp2cα 단백질이나 아니면 그것의 펩티드 서열을 면역원으로서 뿐만 아니라 그것의 다형태성으로서 사용할 수 있다. 또한, 이들 항체에 대항하는 항 - 인자형 항체를 제조할 수도 있다. 이 항체는 모노클로날이나 아니면 폴리클로날일 수 있다. 편리하게, 이 항체는 서열을 기초로 한 합성 펩티드에 대항하여 제조할 수도 있거나, 클로닝 기술에 의해 재조합적으로 제조할 수 있거나 천연 유전자 산물 및/또는 그것의 부분을 분리하여 면역원으로서 사용할 수도 있다. Harlow 및 Lane, Antibodies : A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1988 문헌에 일반적으로 기술되어 있는 바와 같이 본 분야 기술자들에게 공지되어 있는 표준 항체 생성 기술에 의해 항체를 생산하는데 있어 상기 단백질 및 펩티드를 사용할 수 있다.
폴리클로날 항체를 생산하기 위해, 토끼나 염소 같은 숙주를 상기 단백질이나 펩티드로 면역화시키되, 대개는 보조제와 함께, 필요하다면 담체와 함께 면역화시켜, 단백질에 대한 항체를 혈청으로 부터 수집한다.
모노클로날 항체를 제조하기 위한 기술은 적합한 공여체, 대개 마우스를 단배질이나 펩티드 단편으로 초면역화시켜 비성(splenic)항체 생성 세포를 분리하는 것을 포함한다. 이들 세포를 골수종 세포 처럼 영속성을 갖는 세포와 융합시켜 영속성을 가지며 필요한 항체를 분비하는 융합 세포 혼성체를 제공한다. 그런 다음 이 세포를 대량으로 배양하여 사용하고자 하는 배지로 부터 모노클로날 항체를 수확한다.
항체는 고체 지지용 기질에 결합시킬 수 있거나 검출가능한 성분과 콘쥬게이션시킬 수 있으며, 또는 본 기술 분야에 공지된 바와 같이 결합시키거나 콘쥬게이션시킬 수 있다(형광 또는 효소적 성분의 콘쥬게이션에 관한 일반 논의로서, Johnstone 및 Thorpe 의 Immunochemistry in Practice, Blackwell Scientific Publications, Oxford, 1982 문헌 참조). 고체 지지용 기질에 대한 항체의 결합 역시 본 기술 분야에 공지되어 있다(Harlow 및 Lane, Antibodies : A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Publications, New York, 1988 참조). 본 발명에서 뜻하는 검출가능한 성분은 다음을 포함하지만, 이에 국한되는 것은 아니다 : 바이오틴, 금, 페리틴, 알칼린, 포스파타제, β - 갈락토시다제, 과산화효소, 요소분해효소, 플루오레세인, 로다민, 트리티움,14C 및 요오드화 같은 형광, 금속, 효소 및 방사성 표식자. 부가적으로, 표적화된 운반을 위해 독소를 항체에 결합시킬 수 있다.
또한 본 발명은 형질전환 인체 PP2Cα 유전자와 다형태성 PP2Cα 유전자, 동물 및 세포(세포주) 모델을 제공할 뿐만 아니라 녹아웃(knockout) PP2Cα 모델도 제공한다. 이들 모델은 본 기술 분야에 공지되어 있는 표준방법 및 다음 문헌에 기술되어 있는 바와 같은 방법을 이용하여 구성한다 : 미국 특허 번호 제 5,387,742 호, 제 5,360,735 호, 제 5,347,075 호, 제 5,298,422 호, 제 5,288,846 호, 제 5,221,778 호, 제 5,175,385 호, 제 5,175,384 호, 제 5,175,383 호, 제 4,736,866 호 뿐만 아니라 Burke 및 Olson, [1991], Capecchi, [1989], Davies 등의 [1992], Dickinson 등의 [1993], Huxley 등의 [1991], Jakobovits 등의 [1993], Lamb 등의 [1993], Rothstein 등의 [1991], Schedl 등의 [1993], Strauss 등의 [1993] 문헌. 또한, 특허 출원 제 WO 94/23049 호, 제 WO 93/14200 호, 제 WO 94/06908 호, 제 WO 94/28123 호도 정보를 제공한다.
본 발명은 PP2Cα 유전자의 핵산 서열 및 그것의 일부 뿐만 아니라 그것의 다형태성 서열과 효과적으로 연결된 발현 조절 서열을 포함하는 벡터를 제공한다(하기 실시예 참조). 또한 본 발명은 적합한 진핵 및 원핵 세포에서 선택한, 이들 벡터로 형질전환시킨 숙주를 제공한다.
본 기술 범위 내에서 공지되어 있는 다양한 방법들 중 임의의 한 방법으로써 세포나 조직내에 벡터를 도입시킬 수 있다. 그러한 방법은 다음 문헌에 일반적으로 기술되어 있으며, 예를들어, 재조합 바이러스 벡터를 수반하는 안정한 또는 일시적 형질감염, 리포감염, 일렉트로포레이션 및 감염이 포함된다 : Sambrook 등의 Molecular Cloning : A Laboratory Manual, Cold Springs Harbor Laboratory, New York (1992), in Ausubel 등의 Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley 및 Sons, Baltimore, Maryland (1989), Chang 등의 Somatic Gene Therapy, CRC Press, Ann Arbor, MI (1995), Vega 등의 Gene Targeting, CRC Press, Ann Arbor, MI (1995) 및 Gilboa 등의 (1986). 감염에 의한 핵산 도입은 상기 기재한 다른 방법에 비해 몇가지 잇점을 제공한다. 이들의 감염 특성으로 인해 보다 높은 효능이 수득될 수 있다. 더욱이, 바이러스는 매우 분화되어 있으며 특별한 세포유형을 전형적으로 감염시키고 번식시킨다. 따라서, 생체내 또는 조직이나 혼합된 세포 배양물내의 특이 세포 유형에 벡터를 표적화시키는 데에는 바이러스 본래의 특이성을 이용할 수 있다. 수용체 매개 사건을 통하는 표적 특이성을 변경시키기 위해 특이 수용체나 리간드[Solderling, 1993 문헌 참조]로 바이러스 벡터를 변형시킬 수도 있다.
특히, 그와 같은 바이러스는 공지되어 있거나 본 분야의 기술자들에 의해 구성될 수 있는데 원하는 서열의 전사를 획득하기 위해 필요한 모든 발현 요소를 포함해야 한다. 핵산을 다른 형태로 회수하는 기작과 같은 다른 유익한 특성을 벡터내에 포함시킬 수도 있다. 그와 같은 유익한 벡터는 플라스미드나 아니면 박테리오파아지 벡터로 사용될 수 있기 때문에 파지미드(phagemid)가 상기 벡터의 특별한 예이다. 다른 벡터의 예(하기 실시예 참조)에는 박테리오파지, 바쿨로바이러스 및 레트로바이러스 같은 바이러스, DNA 바이러스, 코스미드, 플라스미드, 리포좀 및 다른 재조합 벡터가 포함된다. 이 벡터에 원핵 또는 진핵 숙주계 사용을 위한 요소를 포함시킬 수도 있다. 본 분야의 통상의 지식을 가진 자들은 특정 벡터와 양립하는 숙주계를 알 것이다.
본 기술분야에 공지되어 있는 재조합 방법은 표적 핵산의 센스, 안티센스 또는 트리플렉스 억제를 획득하는데 사용될 수도 있다. 예를들어, 안티센스 핵산을 함유하는 벡터는, 단백질 또는 안티센스 메세지를 발현시켜 표적 핵산의 발현을 감소시키고 이로 인해 그 활성도를 감소시키는데 사용할 수 있다. 부가적으로, 리보자임을 생성시켜 유전자의 mRNA 발현을 "녹아웃" 시키는데 사용할 수 있다[Cech, 1986 ; Cech, 1990 ; Hampel 등의 1993 ; Sullivan, 1994 문헌 참조].
재조합 서열을 도입하여 발현시키는 DNA 바이러스 벡터의 특별한 예는 아데노바이러스 유래 벡터인 Adenop53TK 이다. 이 벡터는 양성이나 아니면 음성 선택을 위한 허피스 바이러스 티미딘 키나제(TK) 및 원하는 재조합 서열을 위한 발현 카세트를 발현한다. 대부분 세포성 기원 암 뿐만 아니라 다른 기원 암도 포함하는, 아데노바이러스 수용체를 갖는 감염세포에 이 벡터를 사용할 수 있다. 이 벡터 뿐만아니라 원하는 유사 기능을 나타내는 다른 벡터도 혼합 집단의 세포- 예를들어, 시험관내 또는 생체외 세포 배양물, 조직 또는 인체 피검자를 포함 - 를 치료하는데 사용할 수 있는데, 벡터의 안정성을 확실히하고/하거나 그것의 치료학적 효능을 증진시키는 부가 특징을 벡터에 부가할 수 있다. 예를들어, 그와 같은 특징은 재조합 바이러스로 감염된 세포를 음성적으로 선택하는데 사용할 수 있는 표식자이다. 그와 같은 음성 선택 표식자의 예는 항생물질 간시클로비어에 민감성을 부여하는, 상기 기술한 TK 유전자이다. 따라서 음성 선택은 감염을 조절할 수 있는 수단인데 왜냐하면 이 수단이 항생물질 부가를 통한 유도자살을 제공하기 때문이다. 그와 같은 보호는 만일 돌연변이가 바이러스 벡터나 재조합 서열의 변형된 형태로 인해 발생된다면, 세포 형질전환은 일어나지 않을 것이라는 것을 확실히 한다. 특정 세포 유형에 대한 발현을 제한시키는 특징을 포함시킬 수도 있다. 예를들어, 그와 같은 특징은 원하는 세포 유형에 특이적인 프로모터 및 조절요소를 포함한다.
또한, 재조합 바이러스 벡터는 측면 감염 및 표적 특이성과 같은 잇점을 제공하므로 원하는 핵산의 생체내 발현에 유용하다. 측면 감염은 생활환, 예를들어 레트로바이러스의 생활환에 고유한 것으로, 이 과정에 의해 새로 만들어진 많은 자손 바이러스 및 감염 인접세포가 단일 감염세포에서 생성된다. 이 결과 넓은 지역이 급속히 감염되는데, 이 지역 중 대부분은 본래 바이러스성 입자에 의해 초기에 감염되지 않았던 곳이다. 이것은 감염성 인자가 딸 자손을 통해서만 퍼지는 수직형 감염과 대조적이다. 방계적으로 퍼질 수 없는 바이러스 벡터를 생산할 수도 있다. 원하는 목적이 국한된 수의 표적세포내에만 특이 유전자를 도입시키는 것이라면 이 특징이 유용할 수 있다.
상기한 바와 같이, 바이러스는 많은 경우에 숙주 방어 기작을 회피하도록 진화된 매우 분화된 감염 인자이다. 전형적으로, 바이러스는 특별한 세포 유형을 감염시키고 번식시킨다. 바이러스 벡터의 표적 특이성은, 미리 결정된 세포 유형을 특이하게 표적화하여 이에 의해 감염세포내로 재조합 유전자를 도입시키는 그 본래의 특이성을 이용한다. 본 발명의 방법에 사용할 벡터는 표적화될 원하는 세포 유형에 좌우될 것인데, 이는 본 기술분야의 숙련자들이 알 것이다. 예를들어, 만일 유방암을 치료하고자 한다면 그와 같은 상피세포에 특이한 벡터를 사용할 것이다. 마찬가지로, 조혈계의 질병이나 병리학적 증상을 치료하고자 한다면 혈구 및 그 전구체, 바람직하게 조혈세포의 특이 형태에 특이한 바이러스 벡터를 사용할 것이다.
레트로바이러스 벡터를, 감염 입자로서 작용하도록, 또는 단지 초기 일순환으로 감염시키도록 구성할 수 있다. 전자의 경우에 있어, 바이러스의 게놈을 필수 유전자, 조절서열 및 패키지 시그널 모두를 유지하도록 변형시켜 새로운 바이러스 단백질 및 RNA 를 합성시킨다. 이들 분자가 합성되면, 숙주세포는 감염을 더 순환시킬 수 있는 새로운 바이러스 입자내로 RNA 를 포함시킨다. 원하는 재조합 유전자를 암호하여 발현시키도록 이 벡터의 게놈을 조작한다. 비감염 바이러스 벡터의 경우에 있어, 바이러스 입자내에 RNA 를 캡슐로 싸는데 필요한 바이러스 패키지 시그널이 파괴되도록 보통 벡터 게놈을 돌연변이 시킨다. 그와 같은 시그널이 없으면, 형성되는 임의의 입자는 게놈을 포함하지 않을 것이므로 잇달은 감염 순환이 진행될 수 없을 것이다. 특정 유형의 벡터는 의도하는 적용에 좌우될 것이다. 실제 벡터는 공지되어 있어 본 기술분야 내에서 쉽게 사용할 수 있거나 공지된 방법론을 이용하여 본 분야의 숙련자들이 구성할 수 있다.
재조합 벡터는 몇몇 수단에 의해 투여될 수 있으며 적합한 제약학적 담체와 함께 투여할 수 있다. 만일 바이러스 벡터를 사용할 경우, 예를들어 이 과정은 그 표적 특이성을 이용할 수 있으므로, 질병 부위에 국소적으로 투여하지 않는다. 그러나, 국소 투여는 신속하고 더 효과적인 치료를 제공할 수 있는데, 예를들어 피검자내로 정맥내 또는 피하주사함으로써 투여를 수행할 수 있다. 척수액내로 바이러스 벡터를 주사하는 것은 특히 신경변성 질병의 경우에 투여 방식으로서 사용할 수도 있다. 주사후, 바이러스 벡터는 감염에 대한 고유 표적 특이성을 갖는 숙주세포를 인식할 때까지 순환할 것이다.
PP2Cα 벡터의 선택적인 투여 방식은 질병 또는 병리학적 증상 부위에 국소적으로 직접 접종하거나 영양소를 갖는 종양을 공급하는 혈관계내로 접종할 수 있다. 국소 투여는 효과를 박약화시키지 않으므로 유리하며, 따라서 대다수 표적 세포내 발현을 획득하는데 더 적은 투여량이 필요하다. 부가적으로, 국소 접종은, 벡터가 접종된 부위내 모든 세포를 감염시킬 수 있으므로 다른 투여 형태에 요구되는 표적요구를 감소시킬 수 있다. 만일 접종 부위내 세포의 아부분(subset)에서만의 발현을 원한다면, 이 목적을 수행하기 위해 원하는 아부분에 특이한 프로모터와 조절요소를 사용할 수 있다. 그와 같은 비표적 벡터는 예를들어, 바이러스 벡터, 바이러스 게놈, 플라스미드, 파지미드등일 수 있다. 상기한 비바이러스성 벡터를 접종부위내 수용자 세포내로 도입시키기 위해 리포좀 같은 형질감염 매개체를 사용할 수도 있다. 그와 같은 형질감염 매개체는 본 기술 분야의 숙련된 기술자들에게 공지되어 있다.
바람직한 실시형태에 있어, 변형된 AAV 를 기초로 하는 바이러스 벡터를 사용한다. AAV 가 염색체 19q13.3 의 인체 게놈내로 통합된다고 나타나 있다. 특정 부위 수단으로 PP2Cα 조절 부위 내에 AAV 게놈을 통합시킬 수 있는 방식으로 이를 변형시킨다.(실시예 7 참조).
또한 본 발명은 암의 유형과 이 암을 발현하는 세포를 결정하는 단계 및 상기 암 세포를 특이적으로 표적화하며 PP2Cα 의 발현가능성을 조절하는 조절요소를 함유하는, 상기한 바와 같은 벡터를 제조하는 단계를 포함하는 암 치료방법을 제공한다. 그런 다음 이 벡터를 환자에게 투여하는데, 벡터의 생물활성도에 영향을 미치지 않을 적합한 제약학적 담체를 포함시킬 수 있다. 택일적으로 안티센스 벡터를 제조하여 PP2Cα 의 발현을 조절하는데 사용할 수 있다.
pp2c 는 단백질 세린/트레오닌 포스파타제이다[Cohen, 1989 문헌 참조]. 이것은 마그네슘을 필요로 하고 오카다익 에시드(okadaic acid)와 같은 특정 포스파타제 저해제에 민감하지 않으므로, 포스파타제 중에서도 독특한 것이다[Cohen, 1991 문헌 참조]. pp2c 과는 포유동물 조직에서 두 개의 세포질 동위효소[McGowan 및 Cohen, 1987 문헌 참조]와 효모에서 적어도 세 개의 pp2c - 유사 효소로 구성되어 있으며 이것은 동일한 효소적 특성 및 생화학적 특성을 나타낸다. 두 개의 포유동물 동위효소는 단량체이지만 분자량이 약간 다르므로(44 kDa 및 42 kDa) pp2cα 및 pp2cβ 라 명명한다. α 와 β 동형 사이에는 70 % 상동성이 존재한다. pp2cα 의 카르복시 말단에는 pp2cβ 와 다른 15 개 아미노산 서열이 있다. 인체에 있어 이 서열은 YKNDDTDSTSTDDMW(서열 2) 이다.
pp2cα 와 부가 단백질 FosB 및 ERCCI 를 암호하는 106 Kb 코스미드는 서열결정되어 있다[Martin - Gallardo 등의, 1992 문헌 참조](진뱅크(GENBANK) 수탁번호 : 제 M89651 호). 또한, 인체 PP2Cα 의 cDNA 서열은 공지되어 있다[Mann 등의 1992 문헌 참조]. 그러나, 이 게놈 서열과 cDNA 의 5'UTR 을 배열시키고자 하는 시도는 성공적이지 않았다.
상기 관찰에 대한 가설을 세울 수는 있지만, 본 발명을 이 하나의 방식에만 제한시켜서 가설을 구성해서는 안된다. 출원인은 UTR 을 몇몇 작은 엑손과 큰 인트론으로 구성시키고자 하며 PP2Cα 와 FosB 가 공통 조절부위를 가지도록 하고자 한다(ERCCI 가 조절부위를 공유할 수도 있음). 택일적으로, PP2Cα 는 매우 큰 유전자이므로 그 5' 말단과 조절 부위가 106 kb 코스미드의 5' 에 위치한 부위로 106 kb 코스미드내에 존재하지 않는다는 것이 가능하다. 또한 택일적으로, 코스미드로 부터의 9 kb 부위는 높은 G/C 함량으로 인해 서열결정되지 않았는데 그것이 5'UTR 부위와 프로모터를 포함할 수도 있다.
바람직한 실시형태에 있어, AAV 바이러스 및/또는 CHINT 또는 PP2Cα 유전자와 관련된 다른 조절 서열을 벡터, 특히 환자 치료용 벡터에 사용한다. CHINT 는 9 - 3 세포내에서 AAV 내로 재조합시킨 세포 서열이다 ; 이 서열은 표 5 에 나타나 있다(int. li ; 서열 19). 이 벡터를 PP2Cα 의 조절요소내로 통합시켜, 종양억제 바이러스로서 AAV 가 세포내에 통합되어 이 세포를 변형시키는 것과 같은 방식으로, PP2Cα 의 발현을 변형시킬 수 있다. 이로 인해 정상적인 세포성장을 회복시키거나, 성장을 정지시키거나, 세포유형, 암 유형, 분화 단계 및 본 분야의 기술 자들에게 공지되어 있는 다른 인자에 좌우되는 프로그램 세포사멸 - 세포소멸 - 을 활성화 시킬 수 있다[Schlehofer, 1994 문헌 참조].
다음 관찰을 이용하여 PR2Cα 발현을 조절하는데 사용할 수 있는, AAV 및/또는 CHINT 또는 PR2Cα 조절요소의 몇몇 요소가 존재한다.
1. PR2Cα 는 매우 긴 5' 및 3' UTR 을 갖는다 (그것은 암호화 능력 보다 더 많다). RNA 의 특이적 접힘 (folding) 과 단백질의 특정 세트와의 상호작용이 그 발현을 극적으로 달성시킬 수 있다. 특정 단계에서는 다른 접힘 방식이 존재할 수 있으며 다른 단백질이 RNA 와 상호작용하여 그 발현을 변경시킬 수도 있다.
2. CHINT 서열은 특정 부위 통합을 위해 사용할 수도 있는 매우 흥미있는 모티브를 갖는 통합과 관련이 있다. 더욱이, 출원인은 AAV 통합 부위에 인접한 특이 AAV 서열이 DNA 증폭 억제를 초래한다는 것을 입증하는 데이터를 가지고 있다. 이 서열은 치료학적으로 벡터에 사용될 수 있으며 사일런서 (silencer) (서열 13) 와 미니 - 사일런서 (mini - silencer) (서열 14) 로서 하기에 기술되어 있다.
또한 본 발명은 AAV 기저 벡터, 또는 PR2Cα 를 부적절하게 활성화시키는 세포에서 단지 특이적으로 작용하는 다른 암 치료용 벡터를 사용하여 암을 치료하는 방법을 제공한다. 본 기술 분야의 기술자들에게 공지되어 있는 바와 같이 종양을 수반하고 있다고 진단된 환자에게 이 벡터를 투여한다. 한 실시형태에 있어, AAV 벡터 (또는 본원에 기술된 다른 조절인자) 는 형질전환된 세포에서 발현되는 프로모터, rep 의 조절하에 둔다. 통합된 벡터는 실시예에 나타낸 바와 같이 형질전환을 반전시켜 세포내 PR2Cα 발현을 조절할 것이다. 또한, 이 벡터는 형질전환된 세포유형을 표적화할 것이다.
또한, PP2Cα 의 유전자 산물은 세포 표면상에 발현되므로, 이 유전자 산물에 대항하는 항체가 단일 형질도입 경로를 통해 유전자 발현을 활성화/비활성화시킬 수 있다. 따라서, PP2Cα 유전자를 재조절할 필요가 있는 환자를 치료하기 위해 항체를 치료학적으로 사용할 수 있다. 환자에게 투여할 때 이 항체가 원하지 않는 이차 효과를 나타내지 않도록 확실히 하기 위해 Fab 단편 및 본 기술분야에 공지되어 있는 다른 수단을 이용할 수 있다. 택일적으로, PP2Cα 유전자 산물과 특이적으로 결합할 수 있는 리간드나 다른 분자를 사용할 수 있다. 따라서 본 발명은 시그널 형질도입을 유도하기 위해 세포 표면에 발현하는 PP2Cα 유전자 산물을 항체와 결합시켜 형질전환된 표현형을 억제시키는 방법을 제공한다.
또한 본 발명은 PP2Cα 발현을 조절함으로써 PP2Cα 발현의 변화로 인한 이상 인산화에 기인하는 질병을 치료하는 방법을 제공한다.
그러한 질병은 신경학적일 수 있다. 예를들어, 행동상의 변화는 이상 인산화와 관련될 수 있다. Brown 등의 1996 문헌에 나타난 바와 같이 fosB 의 돌연변이가 행동상의 변화를 초래할 수 있다. 상기에 기술한 바와 같이, fosB 와 PP2Cα 는 106 KD 코스미드 상에 있다. 그것들이 공동 조절될 수도 있다는 어떤 암시가 존재한다. 따라서 PP2Cα 의 이상 발현이 행동상 변화로 나타날 수 있다. 또한, PP2Cα 활성도 수준은 다른 조직에 비해 심장 및 신장 조직에서 극도로 높다. 그러므로 PP2Cα 활성도의 변화가 이들 조직에 반영될 것이다.
본 발명은 실시예 9 에 기술된 관찰을 기초로 하는 바와 같이, PP2Cα 유전자 산물에 대한 DNA 폴리머라제 α 프리마제 (DNA polymerase α primase) 와 RNA 폴리머라제 Ⅱ 의 결합부위를 특이적으로 표적화할 안티센스 벡터를 제조하여 세포에 이 벡터를 운반시킴으로써 이 PP2Cα 의 유전자 산물과 DNA 폴리머라제 α 프리마제 및 RNA 폴리머라제 Ⅱ 와의 결합이나 활성을 방해하여 유전자 증폭을 억제하는 방법을 제공한다. 출원인은 종양세포에서 pp2cα 가 RNA 폴리머라제 Ⅱ 의 CTD 도메인과 결합한다는 것을 관찰하였다. 따라서 택일적으로, 유전자 증폭을 초래하는 결합을 조절시키기 위해 경쟁적 결합 전략에 의하여, CTD 도메인을 수반하는 펩티드의 운반을 이용할 수 있다.
종양 억제시 AAV 의 역할을 조사하기 위해 AAV/neo 바이러스 JDT277 을 SV40 형질전환 중국 햄스터 (CO60 및 OD4 세포) 와 마우스 유방 종양세포 (DA3) 내로 도입하였다. CO60 은 SV40 형질전환 중국 햄스터 태아 세포주의 한 세포주이다 [Lavi, 1981 문헌 참조]. 기원 삭제된 SV40 DNA 를 갖는 중국 햄스터 태아 세포를 형질감염시킴으로써 OD 세포주를 확립하였다 [Lavi, 1985 문헌 참조]. 마우스 DA3 세포주는 BALB/c 마우스와 유전적 동계인 유방 종양으로부터 유도하였다 [Sotomayor 등의 1991 문헌 참조]. JDT277 바이러스는 바이러스 Rep 단백질을 암호하는 AAV2 게놈의 부분, AAV 말단 역위 반복체 (TIRs) 및 원핵 네오마이신 포스포트란스퍼라제 유전자(neo) 를 함유하며, G418 에 대한 내성을 부여한다. 누클레오티드 1882 에 neo 유전자를 삽입시켜 카르복시 말단이 절단된 Rep 단백질을 생성하였다. rep 단백질의 절단형은 아데노바이러스와 공동감염된 인체 세포를 복제시키는 AAV/neo 바이러스의 능력에 영향을 미치지 않는다.
G418 의 존재하에서 연속 계대배양함으로써 단일 콜로니를 분리하여 증폭시켰다. 내성 세포를, CO60 세포로 부터 유래된 세포에 대하여 9 - 1 내지 9 - 5 라 명명하고 OD4 세포로부터 유래된 세포에 대하여는 A20 - A29 라 명명하였다. 마우스 세포 DA3 로 부터 유래된 세포주는 JI - J15 라 명명하였다.
형질전환된 표현형의 변화 :
AAV 삽입후 세포는 몇몇 형질전환된 특성이 결여된다.
1. SV40 DNA 증폭 억제(실시예 7)
종양세포의 특징적인 특성은 DNA 를 증폭시키는 능력이다. 유전자 증폭을 연구하기 위한 모델 시스템으로서 CO60 세포를 사용하여 발암물질로 처리한 결과 이 세포에 SV40 증폭을 유도시킬 수 있다[Lavi, 1981 ; Aladjem 및 Lavi, 1992 문헌 참조]. AAV/neo 바이러스 삽입후 이 세포는 SV40 을 증폭시킬 수 없었다. CO60 세포로부터 유래된 대부분 AAV/neo 세포주는 모 CO60 세포와 대조적으로 발암물질로 처리시 SV40 을 증폭시키는 능력을 잃었다[Tal Burstyn, 1993 참조]. OD4 와 CO60 세포 둘 다로 부터 유래된 AAV/neo 세포로부터의 추출물은 시험관내 SV40 을 증폭시키는 능력이 결여되었다 [Winocour 등의 1992 ; Tal Burstyn, 1993 문헌 참조].
2. 통합된 SV40 을 포함하는 세포는 UV 나 MNNG 처리에 아주 민감하였다[Winocour 등의 1992 문헌 참조].
3. 형질전환된 세포는 이 세포의 전형적인 특징인, 연한천(soft agar) 에서 성장하는 능력이 결여되었다.
4. 세포는 다음에 의해 측정한 바와 같이 세포소멸 표현형을 나타냈다 :
a) 세포주기 유형은 변화되었고 세포소멸 세포가 AAV/neo 세포에서 자발적으로 나타났으며 그 수준은 DNA 손상 약물 처리에 따라 증가되었다(도1A, 표 3A 및 도 1B, 표 3B),
b) 염색질과 세포질의 응축 및 분열. 염색질의 응축 및 분열은 등색 아크리딘으로 염색함으로써 관찰되었다. 에티듐 브로마이드는 이 세포를 염색하지 않는다.
등색 아크리딘은 살아있는 세포와 죽은 세포 둘 다에서 얻어지며 형광 - 녹색 신호를 나타내는 반면, 에티듐 브로마이드는 무생육성 세포에서만 얻어지며 밝은 적색 형광을 제공한다. 이 이중 염색계는 죽은 세포와 살아있는 세포간을 구별하는 수단을 제공하는데, 세포는 막 보전이 결여되기 전에 세포소멸된다. 살아있는 세포의 정상 또는 세포소멸 핵은 밝은 녹색의 형광을 낸다. 대조적으로, 죽은 세포의 정상 및 세포소멸 핵은 밝은 적색 형광을 낸다.
세포의 실체화된 분획은 등색 아크리딘으로 염색시 응축된 염색질을 보여주는 세포소멸 핵을 나타냈다. 또한, 세포는 염색질의 강한 수축을 나타냈다. 종종 핵은 다수의 미량핵으로 분해되었다. 이 세포는 막 보전이 결여되지 않고서 세포소멸되었다. EtBr 은 이들 세포내로 침투하지 않으므로 세포는 여전히 생존하였다. 처리된 (7.5 μg/ml MNNG) 세포에서의 상당히 낮은 백분율, 및 대조 CO60 세포에 비해 처리된 AAV 양성 세포에서의 다량의 생존 세포소멸 핵이 발견되었다. 모든 AAV/neo 세포주에 대해 동일 유형의 염색을 반복하였다. 결과, 이 세포소멸 표현형은 모든 AAV/neo 세포에 공통된 특징이었다.
c) 염색체 DNA 의 붕괴에 의함 :
프로그램 세포 사멸이 DNA 분열과 관련되어 있다고 나타났다. 세포소멸을 검출하기 위한 이 접근법은 DNA 의 3' - OH 말단에 대한 말단 데옥시누클레오티딜 트란스퍼라제 (TdT) 의 특이 결합 - 뒤이어 폴리데옥시누클레오티드 중합체가 합성됨 - 을 기초로 하였다 [Gavrieli 등의 1992 문헌 참조]. 고정된 세포에 바이오티닐레이티드 데옥시우리딘을 가함으로써 DNA 붕괴 부위에 이 누클레오티드를 삽입시키기 위해 TDT 를 사용하였다. 형광 현미경에 의해 확인할 수 있는 FITC - Avidin 결합에 의해 시그널을 증폭시켰다. 모든 AAV/neo 세포주에 있어, 출원인은 세포소멸 세포의 염색질의 전형적인 붕괴와 직접 상호관계가 있는, 독특한 유형의 핵 염색을 검출할 수 있었다. 이 반응은 특이하므로, 세포소멸 핵만이 염색된다. 이 기술의 효율에 대한 양성대조로서 출원인은 DNase 로 처리한 CO60 핵을 사용하였다.
C9 - 2 및 C9 - 3, 이 AVV 양성 클론이 2.5 μg/ml MNNG 처리 48 시간 후에 밝은 핵 형광을 나타낸 반면 어떠한 처리도 하지 않은 대조는 낮은 바탕 형광만을 나타냈다. 출원인은 핵이 다수의 작은 고형광 미량핵으로 특징적으로 붕괴한다는 것을 알 수 있었다. 관찰된 형광은 양성 대조와 유사하였다.
비처리된 AAV/neo 세포와 대조 및 처리된 CO60 (7.5 μg/ml MNNG) 는 어떠한 형광 표시도 나타내지 않았다. 이 유형의 핵 붕괴는 시험된 모든 AAV/neo 세포주에서 나타났으나 (약 20), 분열 정도는 다른 세포주에 따라 변하였다.
뜻밖에, G418 에 대한 내성이 결여되어 있는 C9 - 3 - 2 및 C9 - 3 - 12 라 명명한 복귀변이체 세포가 선택되었는데, 이것은 통합 AAV 서열이 결여되어 있으며 [Burstyn, 1993 문헌 참조], 2.5 μg/ml 나 5 μg/ml MNNG 로 처리한 후에도 여전히 세포소멸 표현형을 유지하였다.
또한 FACS, 김사 염색법 및 고분자량의 세포성 DNA 로 부터 누클레오좀 DNA 단편의 전기영동 분리에 의한 분석으로 이 결과는 지지되었다.
AAV/neo 세포내에 조립된 AAV(실시예 6 및 7)
rep 단백질을 발현하는 차이니즈 햄스터 A20-A29 , 9 - 1 내지 9 - 5 및 마우스 DA3 유도체에서 유래한 세포 추출물을, 항 - Rep 항체를 이용한 임뮤노블로팅법에 의해 분석하여 모든 세포주내에 진정한 Rep 단백질이 존재하지 않는지를 결정하였다. 일부 세포주에서는 짧은 단백질, 아마도 절단된 단백질이 항 - Rep 항체와 반응하였다 [ Winocour 등의 1992 참조].
손상되지 않은 rep 프로모터 영역의 존재에 대해 대부분의 세포주를 RCR 분석하여, 대부분의 세포주에서 Rep 단백질의 프로모터 영역이 AAV 서열의 결실, 삽입 및 재배열 결과 재조직되어 진정한 Rep 단백질의 발현이 감소되었는지를 결정하였다.
본 출원은 CO60 세포로부터 유래한 차이니즈 햄스터 세포주, 9 - 3 분석에 초점을 맞추었다(도 3 참조). 조립된 AAV 는 이 세포주에서 복제되고 조립된 AAV 를 갖는 염색체는 두 영역을 포함한다. 이러한 AAV 의 복제는 아마도 AAV 조립 후 차이니즈 햄스터 게놈에서 일어나는 대규모의 재배열에서 기인할 것이다. 정상소재 혼성화에 의해 이제까지 연구한 모든 차이니즈 햄스터 세포주 (6 개의 독립적인 세포주) 에 있어서, 조립된 AAV 를 갖는 염색체는 변형되어 모든 전형적인 차이니즈 햄스터 염색체와 여러모로 다르므로 염색체가 동일함을 입증할 수 없었다.
9 - 3 에 대한 측면 세포 서열 (flanking cellular sequences) 및 조립된 AAV 를 파아지내로 클로닝하였다 (도 3 참조). 도 3 에 도시한 바와 같이 바이러스성 게놈을 수 회 변화시켰다. AAV p5 프로모터 서열 하류를 결실시키고 세포성 단편인 "CHINT" 로 치환하였다. 또한, AAV/neo 게놈의 5' 부분에서 결실과 재배열이 관찰되었다. 그와는 대조적으로 바이러스성 게놈의 3' 말단과 Neo 유전자의 코딩 영역은 원형 그대로 남아있었다(실험한 모든 AAV/neo 차이니즈 햄스터 및 마우스 세포주에서 유사한 변화가 관찰되었다).
다른 AAV/neo 차이니즈 햄스터 클론내 AAV 조립 부위를 분석하기 위한 프로브로 "CHINT" 서열을 이용하였다 (도 2 참조). 몇몇 AAV/neo 클론에서, 이 단편의 크기가 AAV 조립으로 변화되었음을 시사하는 이 단편의 전위가 존재하였다. 또한 AAV 프로브에 혼성된 전위 밴드의 일부는 AAV 가 실제로 이 영역내로 조립되었음을 입증하였다. 측면 세포 서열로부터 유도한 플라스미드 pSL9 - 6 을 서브클로닝하여 얻은 프로브를 마우스 DA3 AAV/neo 세포에 혼성화시키면 언제나 AAV 조립물과 결합하였다. 이러한 결과는 차이니즈 햄스터내 AAV 조립 부위가 마우스 세포의 그것과 유사함을 시사하는 것이다.
제네틱 컴퓨터 그룹 인코포레이티드 (Genetic Computer Group Inc.) 소프트웨어를 이용한 서열 비교로, CHINT 서열이 인간의 염색체 19 q 13.3 의 서열과 58.3 % 동일함을 입증하였다. 이 인체 서열은 자동적으로 서열결정 및 분석되는 106 Kb 단편의 일부이다[Martin - Gallardo 등의 1992 참조] (GENBANK 기탁 번호 : M89651). CHINT 서열과 상동성을 보이는 영역은 인체 단백질 포스파타제 2C(pp2cα) 의 코딩 유전자의 일부였다. 이 유전자의 cDNA 서열에 따른, CHINT 와 정확히 동일한 영역은 PP2Cα 의 5' UTR 상류에 위치한다 (표 5 참조) (GENBANK 기탁 번호 : 인체 PP2Cα S87759, 토끼의 PP2Cα S87757).
PP2Cα 에 대한 두 프라이머 (프라이머 1 및 4) 를 사용하여 유도한 PCR 단편을 이용하여 (하기한 본원의 방법), 9 - 3 으로부터의 cDNA DNA 를 탐침하여 AAV, CHINT 및 PP2Cα 에 혼성되는 XbaI 단편을 찾아내고 CO60 DNA 내 PP2Cα 와 CHINT 에 혼성되는 EcoRI 단편을 찾아내었다. 이와 같이, PP2Cα 는 실제로 CO60 세포내 CHINT 와 매우 근접한 곳에 위치하며 9 - 3 세포내 조립 부위에 존재한다. 정상소재 혼성화로 이러한 결과를 확인하였다 (도 4A 참조).
차이니즈 햄스터(CO60 및 OD4) 및 마우스 세포(DA3) 둘다에 있어서, PP2Cα 서열 부분은 AAV 조립 부위의 람다 클론에서 유도한 pSL 9 - 6 (도 3 참조) 에 존재하는 CHINT 햄스터 서열과 인접해 있었다. 따라서 정상적인 차이니즈 햄스터와 마우스 염색체 둘다의 PP2Cα 는 실제로 조립된 AAV 주변 서열과 4 Kb 미만의 매우 근접한 곳에 위치한다 (도 4B 참조).
게다가, 조립된 AAV 게놈을 갖는 마우스 DA3 세포내 AAV 서열은 PP2Cα 또는 단편 6 또는 그 둘다와 결합하였다 (도 5 참조). 조립된 AAV 를 DA3J7 로부터 클로닝하고 (λDA37A) 파아지의 일부를 도면에 나타난 바와 같이 서열결정하였다. 도 3 에 나타나 있는 바와 같이 35 - 3. seg 및 35 - T7 뿐만 아니라 MMDBC (GenBank 기탁번호 M89657) 내 위치 59770 의 첫 번째 PP2Cα 코딩 엑손을함유하고 자동적으로 서열결정되는 코스미드 MMDA (기탁번호 M63796) 내 위치 23467 - 23715 의 인체 염색체 19 q 13.3 및 λSL9 - 1 (도 3 참조) 플라스미드내 조립된 AAV 내부 영역의 상동성을 발견하였다. MMDA 와 MMDBC 는 동종의 다른 코스미드이다(서열에 대한 보다 자세한 설명은 본원의 하기 실시예 10 에 나타나 있다).
PP2Cα 에 대한 특이 저해제의 결핍으로 인해 세포내 PP2Cα 의 기능이나 그것의 천연 기질에 대하여 알려진 것은 거의 없다. 스키조사카로마이시스 폼베 (Schizosaccharomyces pombe) 의 경우, pp2cα - 유사 효소는 열 쇽 반응 및 삼투조절에 중요한 것으로 나타났다[Shiozaki, 1995 ; Shiozaki, 1994 참조]. 사카로마이시스 세레비지에 (Saccharomyces cerevisiae) 의 경우 pp2c - 유사 활성도는 tRNA 스플라이싱 조절 및 세포 분리와 관련이 있었다 [Robinson 등의 1994 참조]. 신경 세포에서 pp2cα 는 Ca++/칼모듀린 의존성 단백질 키나아제 Ⅱ 의 Ca++- 비의존 활성도 조절 기능을 가졌다[Fukugana, 1993 참조]. 그러나 pp2cα 에 관한 정보는 불충분하다.
pp2cα 는 그 자체가 세포 마커였다. 선행 기술은 종양 세포에서의 pp2cα 발현에 관한 정보를 제공하지 못한다. pp2cα 가 근원성 (myogenic) 분화 중에 역할을 수행할 것임을 시사하는 문헌도 있다[Ohishi, 1992 참조]. 다른 전사 인자에도 나타나는 10 개 아미노산 변형에 근거하여, pp2cα 는 전사 인자와 같은 기능을 할 것이며 특이 성장 조건하의 세포와 조직내에서 전사를 조절할 것이다. 따라서 그것은 주요 전사 인자인 E2F 처럼 작용할 수 있으며 종양유전자나 종양 억제 인자 중 하나로 부적절하게 발현될 경우 작용할 수 있다[ Weinberg, 1996 참조].
AAV/neo 세포내 PP2Cα mRNA 분석에 의해 놀랍게도, PP2Cα 를 처리후 유도하는 선조 SV40 형질전환 세포와는 대조적으로 DNA 손상제로 처리시에 유전자의 전사량이 감소하였음이 증명되었다(도 6 참조).
다음은 혼성화 시그날의 밀도측정 분석이다.
CO60 C CO60 T CO60 T───CO60 C C9 - 3C C9 - 3T C9 - 3T────C9 - 3C
PP2Cα───rRNA 0.15 0.31 2.06 0.26 0.15 0.57
PP2Cα 를 처리 후 유도하는 선조 SV40 형질전환 세포와는 대조 적으로 MNNG 로 처리시에 C9 - 3 내 PP2Cα 의 전사량은 감소하 였다.
pp2cα 를 코드하는 원래의 cDNA 를 cDNA 라이브러리 [레호보트 소재 바이츠만 인스티튜트 오브 사이언스(Weizmann Institute of Science) 에서 제공받음( 담당자 : 엠. 오렌)] 로부터 클로닝하고, AAV - 조립 후 형질전환 표현형을 상실한 AAV/neo 세포내로 PP2Cα 클론을 안정하게 도입하였다. PP2Cα neo 세포에서 PP2Cα 클론이 발현된 후 형질전환 특성을 되찾았고, 세포는 형질전환 세포의 특성을 회복하고 연한천에서 성장하여 그들의 세포사멸 표현형을 상실하였으나 세포가 증식되지는 않았다. 관련이 없는 유전자의 절단된 cDNA 를 함유하는 대조 플라스미드와 같은 효율로 형질감염시킨 유사 세포는 연한천에서 성장하는 능력을 회복하지 못했다.
이러한 연구로 PP2Cα 가 형질전환 세포의 개시 및/또는 보존에 결정적인 역할을 함이 분명해졌다. 연한천에서 세포를 성장시켰지만 본 출원인은 살아있는 세포를 분리할 수 없었으며, 이것은 세포의 불균형적인 발현이 비정상적인 성장과 세포 사멸을 유도함을 시사하는 것임에 주목해야 한다.
PP2Cα 는 발육에 중요할 것이다. 진화를 통해 잘 보존된 유전자와 단백질인 5'UTR 의 IRES (내부 리보솜 결합 부위)를 포함한 특이 조절 시그날이 이를 뒷받침한다. AAV 감염으로 특이하게 종양 세포가 된다는 다른 실험실의 발견은 두가지 의미가 있다 : 1) 바이러스는 정상 세포에 감염되거나 특이한 방식으로 세포의 게놈내로 조립될 수 없다. 2) AAV 가 정상 세포의 PP2Cα 내로 조립된다면 이 유전자의 파괴는 택일적으로 정상 세포에 영향을 미치지 않거나 이러한 세포를 죽게 할 것이다. 형질전환 표현형의 변화로 PP2Cα의 한 대립형질만이 불활성화되고 기능적인 PP2Cα cDNA 클론의 도입으로 형질전환 표현형을 회복한다는 사실은 PP2Cα 의 중요성을 입증하는 것이다. 또한 출원인은 PP2Cα 를 운반하는 전체 염색체가 9 - 3 으로부터 유도한 고도의 종양형성 차이니즈 햄스터 세포에서 3,4 회 및 심지어는 5 회 복제되는 것에 주목하였다.
사람의 경우 동일 염색체 상에서 PP2Cα 와 근접하여 암발생항원 (CEA) 이라 불리는 중요한 종양 특이 마커가 존재하는데, 이것은 대부분의 종양 세포에서 나타난다. 두 유전자는 염색체 19q 13. 3 에 위치한다. CEA 같은 마커를 수반하는 세포 치료를 목표로 삼는 것도 도움이 될 것이다(CEA 단독으로 암에 관련된 것은 아니지만 PP2Cα 의 발현 촉진에 관계하거나 이 염색체 영역의 복제물이 두 유전자를 함유하는 것이 가능하다).
상기 논의로 암의 검출 및 치료에 PP2C 를 사용하는 것에 대한 사실상의 원리가 제공된다. 본 발명에 이용한 방법 및 그 이용은 하기 실시예와 첨부한 도면에 의해 나타낼 수 있으며, 하기 실시예로 제한되지는 않는다.
방법
분자생물학의 일반적인 방법: 본 분야에 공지된 표준적인 분자생물학 기술과, 특별하게 기술하지 않은 것은 일반적으로 Sambrook 등의 Molecular Cloning : A Laboratory Manual, Cold springs Harbor Laboratory, New York (1992) 및 Ausubel 등의 Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Baltimore, Maryland (1994) 문헌에 나타나 있는 바와 같이 실시하였다. 폴리메라제 연쇄반응법(PCR) 은 일반적으로 PCR Protocols : A Guide To Methods And Applications, Academic Press, San Diego, CA (1990) 문헌에 나타나 있는 바와 같이 실시하였다. 그외의 핵산 기술을 포함한 반응 및 조작은 달리 언급하지 않는 한 Sambrook 등의 1989, Molecular Cloning : A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press 및 본원에서 참고문헌으로 인용한 미국 특허 번호 제 4,666,828 호 ; 제 4,683,202 호 ; 제 4,801,531 호 ; 제 5,192, 659 호 및 제 5,272,057 호에 언급되어 있는 방법학에 일반적으로 기술되어 있는 바와 같이 실시하였다.
항체 포착 검정: 이 방법의 단계는 다음과 같다 :(1) 고체상에 대한 항원의 결합 ; (2) 항원에 대한 항체의 결합 ; 및 (3) 복합체에 대한 표식 2 차 항체의 결합. 일정량의 rpp2cα 를 고체상에 결합시킴으로써, 출원인은 클로닝 기간 중에 모노클로날 항체를 검출하고 정량하여 다른 토끼를 출혈시켜 얻은 폴리클로날 항체와 비교하는 데에 이 기술을 이용하였다. 또한 조직과 세포 배양액의 조추출물(crude extracts) 에서 pp2cαα 를 검출하는 데에도 이 검정을 이용하였다.
임뮤노블로팅법: 이 방법의 단계는 다음과 같다: (1) 항원 시료, 조직 추출물, 세포 배양액 추출물 또는 rpp2cα 제제의 제조 ; (2) SDS - PAGE 로 시료를 분리 ; (3) 분리된 단백질을 니트로셀룰로스막으로 전이 ; (4) 막의 비특이 부위 차단 ; (5) 폴리 - 또는 모노클로날 항체와 함께 항온 ; 및 (6) 표식 2 차 항체로 검출. 출원인은 상기 언급한 항체의 특정화 및 세포와 조직 추출물내 pp2cαα 검출을 위해 임뮤노블로팅법을 이용하였다[Harlow 및 Lane].
면역침강법: 이 방법의 단계는 다음과 같다 : (1) 고체 매트릭스 (항 - 마우스 IgG 가 결합된 아가로스) 에 모노클로날 항체 고정 ; (2) 고정된 항체에 대한 항원의 결합 ; (3) SDS - PAGE 상에서 결합 단백질 분리 ; 및 (4) 정제된 토끼의 폴리클로날 항체와의 친화성에 의해 항원 검출. 이 방법은 발견한 서로 다른 크기의 pp2cα 및 β 폴리펩티드량 및 분자 질량을 측정하는 데 사용되어 왔다.
pp2cα 활성도 검정: PP2Cα 유전자 산물은 마우스 세포로부터 일반적인 방법에 의해 정제하고 그 활성도는 [32 p] 카제인을 탈인산화시키는 능력으로 분석한다[McGowan 및 Cohen,1988 참조].
역 PCR 에 대한 올리고누클레오티드 프라이머: 역전사 및 PCR 에 랫의 PP2C - α cDNA 특이 프라이머를 이용하였다. 이들 프라이머는 레호보트 소재 제너럴 바이오테크놀로지에서 수득하여 별다른 정제 없이 이용하였다. 프라이머의 위치는 Tamura 등의 [1989] 에 의해 Genbank (기탁번호 : Gb-ro : 랫 pp2c, J04503) 에 보고된 PP2Cα cDNA 의 랫 신장 누클레오티드 서열에 따른다. 랫 PP2Cα cDNA 상에서 각 프라이머의 대략적인 위치 :
프라이머 #1 : 5' - AGGATCAAGTCATAATGGGA - 3' (74 - 93nt - 센스) (서열 4)
프라이머 # 4: 5' - GCTGGAGTCTGATTTACAAC - 3' (1454 - 1473nt - 안티센스) (서열 5)
안티센스 RNA: PP2Cα 유전자에 상보적인 인공 안티센스 RNA 를 합성하고 Inouye [1988] 의 방법에 의해 마우스 세포로 형질감염시켰다.
차등 디스플레이 (differential display) 에 의한 유전자 발현의 단일 변화 확인: AAV 조립에 의해 조절되는 세포성 유전자 발현의 변화를 검출하기 위해 차등 디스플레이 방법을 이용한다 [Liang 및 pardee, 1992 ; McClelliand 등의 1995 참조]. 이 방법은 감염 및 비감염 세포와 같은 한쌍의 포유동물 세포 집단내의 약 15,000 개의 개별적인 mRNA 종 중에서 차등적으로 발현되는 유전자를 확인하여 그것의 cDNA 및 게놈 클론을 회수하는 것에 관한 것이다. 이 방법은 다음 단계로 구성된다 :(1) 일련의 앵커 프라이머 (anchored primer)를 이용하여 분별적으로 역전사, (2) 한 세트의 임의의 프라이머와 앵커 프라이머를 이용하여 표식 PCR 에 의해 각 분획의 cDNA 종 증폭, (3) 결과적으로 생성된 단편을 서열결정 겔에서 전기영동 분리, (4) 두 위치의 다른 단편을 재증폭, 클로닝 및 서열결정, 및 (5) 개별적인 RNA 분석 기술에 의해 차등적인 발현 확인.
특히, 총 RNA 는 Sambrook 등에 의해 기술된 세포에서 분리한다. RNA 는 폴리 A 말단의 5' 경계부에 결합하도록 고안된 올리고 dT 프라이머로 역전사시킨다. cDNA 는 올리고 dT 프라이머와 다른 10 - 량체를 임의의 순서대로 이용한 PCR 반응으로 증폭시킨다. [35 S] - dATP 의 존재하에 다음과 같이 40 주기의 PCR 을 실시한다 : 94 ℃ 에서 30 초, 42 ℃ 에서 60 초 및 72 ℃ 에서 30 초. 증폭된 cDNA 는 6 % 서열결정 겔 상에서 분리하여 X - 레이 필름에 노출시킨다.
해당 밴드 (차등적으로 나타난 밴드)를 겔에서 절단하여 원래의 PCR 산물을 생성시키는 데 사용한 것과 동일한 프라이머로 재증폭시킨다. 각각의 후보 밴드의 차등적인 조절을 확인하기 위해 노던 블롯 혼성화를 실시한다. 해당 단편은 TA 클로닝 키트를 이용하여 클로닝하고 서열을 결정한다. 이 방법에 의해 검출한 유전자는 적당한 세포로 노던 블롯하기 위해 혼성화한다.
잠복기 감염 세포내 염색질 구조: 밀집된 염색질 구조는 세포성 유전자의 전사에 영향을 미칠 수 있다. DNAse I 이나 구균성 누클레아제 절단에 대한 민감성의 증가 정도를 판단하면, 전사적으로 활성인 염색질 영역이 전사적으로 불활성인 유전자를 함유하는 염색질 보다 덜 밀집되어 있다. 구균성 염색질을 부분적으로 정제하여 구균성 누클레아제로 절단한다[Roth 등의 1990 참조]. 구균성 누클레아제에 의해 한정한 한쪽 말단과 제한 효소에 의해 한정한 다른 쪽 말단을 갖는 일련의 단편을 만들기 위해 정제된 DNA 단편을 유일한 제한 효소로 절단한다. 아가로스 겔 전기영동에 의해 단편을 분리하고 니트로셀룰로스 필터에 전이시켜 표식 DNA 단편으로 탐침한다. 나(裸) DNA 를 정제하여 유사하게 처리한다. 누클레오솜 위치와 누클레아제에 민감한 영역은 나 DNA 염색질 단편을 비교하여 추론한다.
메틸화된 상태의 유전자는 염색질 변화를 암시할 수 있다. 유전자 특이 DNA 메틸화반응은 메틸화반응 분석에 의해 측정한다[Kafri 등의 1992 참조]. 이 방법에서 총 세포성 DNA 를 Hpa Ⅱ 또는 Hha Ⅰ 과 같은 메틸 - 민감 효소로 절단하고, 이들 부위를 함유하는 DNA 의 특이 단편을 측면 올리고누클레오티드 프라이머로 증폭시킨다. 특이 부위가 메틸화되면 증폭은 정상적으로 진행될 것이다. 한편, 메틸화되지 않은 부위가 존재할 경우에는 단편이 절단되어 증폭 산물을 가시화하는 것에 실패할 것이다. 제대로 측정되었을 경우에 이 검정은 광범위한 DNA 농도에 걸쳐 직선이며, 특이 부위의 DNA 메틸화 정도를 정확히 측정하는 데에 이용할 수 있다.
실시예 1
AAV 연구에 대한 예
A.AAV 로 마우스 세포 감염:
A1.안정하게 조립 AAV 를 수반하는 마우스 세포 생산:
Winocour 등의 [1992] 문헌의 방법을 약간 변형하여 JDT277 AAV/neo 혼성 바이러스로 DA3 세포를 감염시켰다. 단일 콜로니를 분리하여 항생물질 G418 의 존재하에 연속계대에 의해 증폭한다. 그 결과 생성된 세포주를 DA3J 라 명명하였다.
DA3 세포주는 BALB/c 마우스와 동계 (syngeneic) 인 생체내 D1 - DMBA - 3 유방 종양에서 유도하였다. DA3 세포주는 동일한 성장 반응속도를 갖는 BALB/c 마우스에서 종양을 유발하며 선조 종양과 마찬가지로 그 표면에 동일한 종양 관련 항원 (Ag) 을 발현시킨다. 세포는 종양 세포에 대한 특이 마커를 발현하며, 정상적인 유방 세포에 대해 전형적인 특이 Ag 발현을 중지시킨다[Sotomayor 등의 1991 참조].
AAV 가 마우스 세포에 미치는 영향을 평가하기 위해, DA3 세포를 JDT277 AAV/neo 혼성 바이러스로 감염시켰다[Tratschin, 1985 참조]. JDT277 은 Rep 단백질을 코드하는 AAV 게놈의 일부, AAV 말단 역위 반복물(TIR) 및 G418 에 내성을 부여하는 원핵 네오마이신 포스포트란스페라제 유전자 (neo) 를 함유한다. neo 유전자는 누클레오티드 1882 에 삽입되어 카르복시 말단이 절단된 Rep 단백질이 되게 한다. Rep 단백질의 절단은 아데노바이러스가 공동감염된 인체 세포에서 AAV/neo 바이러스가 증식하는 능력에는 영향을 미치지 못한다.
단일 콜로니를 분리하여 G418 의 존재하에 연속계대로 증폭시켰다. 그 결과 생성된 세포를 DA35 라 명명하였다.
A2.DA3J 세포내 AAV 게놈의 특정화
a. 서던 분석 (Southern analysis)
DA3J1 - DA3J7 클론에서 분리한 게놈 DNA 를 상이한 제한 효소 (BglⅡ 또는 EcoRⅠ) 으로 절단하여 전기영동하고 방사성표지된 AAV DNA 에 혼성화시켰다. 혼성화 방식은 아마도 AAV 게놈의 재배열 탓에 각 클론마다 다르다. 실제로 AAV DNA 조립이 종종 바이러스 서열 내부 변화를 수반하는 것으로 알려져 있다[Walz 및 Schlehofer, 1992 참조].
b. PCR 분석
rep 프로모터와 ORF 가 DA3J 세포주에 존재하는 지를 알아내기 위해, AAV 와 neo 서열에 상보적인 상이한 올리고누클레오티드 프라이머를 이용하여 13 개의 클론 (DA3J1 - DA3J13) 대해 PCR 반응을 실시하였다. 결과적으로 각 클론내 바이러스 서열의 일부가 다소 절단되었다. 실험한 모든 세포주에서, AAV rep ORF 가 손상되었음으므로 AAV 특이 단백질의 발현이 감소하였다.
DA3J3 및 DA3J4 두 클론에서, 두 AAV 분자는 완전한 형태 (head - to - tail pattern) 로 숙주 게놈내로 조립되었다. 이러한 발견은 AAV DNA 가 하나 이상의 바이러스 게놈의 완전한 쇄상체처럼 적어도 경우에 따라서는 바이러스 분자의 말단 서열을 거쳐 차이니즈 햄스터 숙주 DNA 내로 재조합됨을 보여주는 초기 연구와 일치한다[Cheung 등의 1980 ; Walz 및 Schlehofer, 1992 참조]. DA3J7 의 조립 AAV 는 본원의 하기 실시예 7 에 기술한 유사 검정에서 293 세포 (ATCC 제 CRL 1573 호) 내 SV40 복제에 대한 사일런서 (Silencer) 로서 작용하였다.
A3.감염시킨 DA3J 세포내 AAV 유전자의 발현
감염시킨 DA3의 세포 추출물을 Winocour 등의 [1992] 문헌에 의해 제조하였다. 추출물 시료를 12 % PAGE 상에서 전기영동시키고 항 - Rep 항체로 임뮤노블로팅하였다. 그 결과 두 개의 주요 Rep 단백질인 Rep 78 및 Rep 68 은 모든 감염 세포에서 발현되지 못하지만 소량의 Rep 단백질 중 하나인 Rep 40 은 두 클론 DA3J11 및 DA3J13 에서 발현되는 것으로 나타났다. 모든 실험 세포주에서 rep ORF 가 손상되었음을 보여주는 PCR 분석으로 이러한 결과를 추측하였다.
B.부위 특이 조립
B1.마우스 세포내 AAV 조립 부위와 차이니즈 햄스터 세포내 AAV 조립 부위 비교:
선조 DA3 및 DA3J 클론 (DA3J1 - DA3J7) 의 게놈 DNA 를 BglⅡ 나 EcoRⅠ 으로 절단하였다. 블롯을 전기영동한 후부터 분리한
(psL 9 - 6) C9 - 3 으로 바이러스 세포 결합의 세포 서열로 1 회 혼성시키고 방사성표지된 AAV DNA 로 1 회 혼성시켰다. 세 개의 세포주(DA3J3, DA3J4 및 DA3J6) 에서 세포성 프로브와 AAV 프로브가 공통 밴드로 혼성되었다. PP2Cα 프로브를 이용하여 본 출원인은 AAV 와 PP2Cα 가 동일한 밴드에 혼성된 Bgl Ⅱ 절단 DNA 임을 확인하였다. 따라서 차이니즈 햄스터와 마우스 둘다에서 AAV 는 언제나 PP2Cα 부근의 동일한 부위내로 조립되었다. 선조 DA3 세포를 포함한 모든 세포주에서 PP2Cα 및 세포성 클론 6 개의 프로브가 조립예정 부위인 동일 밴드에 혼성되었음에 주의하라.
C.세포 표현형에 대한 AAV 의 영향:
감염시킨 DA3 및 선조 세포 간의 다음 세포학적 특성을 비교하였다 :
a.평판 효율
표 1 에 나타나 있는 바와 같이, DA3J 세포의 평판 효율은 선조 DA3 세포의 평판 효율에 비해 11 % (DA3J2) 내지 54 % (DA3J3) 감소하였다.
b.UV 조사 (irradiation) 에 대한 민감성
표 2 에 나타나 있는 바와 같이, DA3J 세포는 선조 DA3 세포에 비하여 UV 조사에 대해 증가된 민감성을 보인다. DA3 세포에 비해 DA3J 세포의 생존율은 5 % ~ 55 % 감소된다.
이러한 결과는 AAV 감염 세포 (Hela, CO60 ) 가 비감염 세포에 비해 평판 효율의 감소, UV 조사에 대한 민감성의 증가를 나타내는 것으로 확인된 다른 연구 [Walz 및 Schlehofer, 1992 ; Winocour 등의 1992 참조] 결과와 일치한다.
DA3J3 이 가장 낮은 평판 효율 및 UV 조사에 대해 가장 높은 민감성을 보이는 것은 흥미롭다. 이것은 DA3J3 이 두 개의 조립된 AAV 분자를 함유하는 반면에 DA3J1 과 DA3J2 는 하나만을 갖는다는 사실에 기인할 것이다.
c.FACS 분석
Vindelov 등의 1983 문헌에 기술된 바와 같이 DA3, DA3J1, DA3J2 및 DA3J3 에 대하여 FACS 분석을 실시하였다. 이 과정에서 선조 DA3 세포와 DA3J 세포 간에 별다른 변화는 관찰되지 않았다.
실시예 2
PP2Cα 의 클로닝 및 발현
전체 길이의 PP2Cα cDNA 코딩 영역을 랫의 cDNA 라이브러리로부터 분리하였다. KpnⅠ 과 NotⅠ 제한 부위 사이의 발현 벡터 pET - 176 (pET 시스템, 노바겐에서 구입) 내로 cDNA 를 클로닝하였다. SDS - PAGE 상에서 ~ 45 kDa 밴드로 현저하게 관찰되는 바와 같이, 발현 플라스미드로 형질전환시킨 E.coli 세포 (BL21 - DE3) (ATCC 와 같은 기탁기관으로부터 입수 가능) 는 고수준의 재조합 pp2cα (rpp2cα) 를 생산하였다.
pp2cα 활성도 분석: McGowan 및 Cohen 의 방법에 의해 측정한 바와 같이, 재조합 플라스미드를 함유하는 배양액의 조추출물에서 단백질 포스파타제 활성도를 확인하였다[Methods Enzymol. 159 : 416 - 429, 1988 참조].
rpp2cα 의 정제: 암피실린을 함유하는 LB 배지에서 30 ℃ 로 배양액을 밤새 성장시켰다. 세포를 수확하여 음파처리로 파괴하였다. 원심분리기로 제거한 후 황산암모늄 침전 및 DEAE - 세파덱스 상의 음이온 교환 크로마토그래피로 더 정제하였다.
실시예 3
항체의 생산 및 분석
토끼에서 폴리클로날 항체 제조: ~ 250 - 500 μg 의 rpp2cα 를 함유하는 조세포 추출물을 12 % SDS - PAGE (200 X 150 X 1.5 mm) 상에서 분리하였다. 사이드 - 스트립 염색 (side - strip staining) 에 의해 나타난 rpp2cα 밴드를 잘라내어 - 20℃ 에 보관하였다. 토끼에 주입할 경우 18 게이지의 주사 바늘에 반복적으로 통과시킴으로써 밴드를 부수고 동부피의 프로인트 보조액과 혼합하였다. SDS - PAGE 밴드에서 생긴 4 ml 의 에멀션을 두 마리의 토끼 주입에 이용하였다. 미리 채혈한 토끼에게 4 주 간격으로 피하주입하였다. 1 차 면역화에 프로인트 완전 보조액을 이용하였고 그외의 모든 주사액은 프로인트 불완전 보조액을 포함하였다. 2 주에 1 번씩 동물의 혈액을 채취하여 원심분리기로 혈청을 제거하였다. 항체는 351 및 343 으로 명명하였다. 달리 언급하지 않는 한 본원의 실험은 351 을 이용하였다.
모노클로날 항체 제조: 상기한 바와 같이 마우스 하이브리도마 생산에 의한 모노클로날 항체 제조에 정제된 rpp2cα 를 이용하였다. 항체 포착 검정 (하기 참조) 및 면역형광 세포 염색에 의해 하이브리도마 콜로니를 선별하였다. 동일한 방법으로 양성 콜로니를 클로닝 및 선별하였다. 최종적으로, 앞으로의 연구를 위해 여덟 개의 양성 클론을 선택하였다. 이들 클론으로부터 항체를 조직 배양 상청액 및 복수액으로 모았다.
pp2cα 및 pp2cβ 에 대하여 생성되는 항체
(1) 801 이라 명명한 토끼의 폴리클로날은 카르복시 말단 펩티드 (10 개 아미노산) 에 대하여 생성되었다. 이 항체는 pp2cβ 가 아닌 pp2cα 를 인식한다.
항체는 토끼에서 생성되었으며 pp2cα 에 대하여 친화정제하였다. 이 항체는 대부분의 조직화학적 분석에 이용하였다.
토끼의 폴리클로날 항체는 pp2cβ의 카르복시 말단인 PNKDNDGGA (서열 3) 에 대하여 생성되었다.
(2) α 와 β 둘다의 에피토프를 인식하는, 351 이라 명명한 토끼의 폴리클로날은 rpp2cα 에 대하여 생성되었다.
(3) 간암 세포의 면역형광 염색법, 웨스턴 블로팅 및 면역침강을 이용하여 rpp2cα 와의 ELISA 반응 및 pp2c (α 및 β 또는 α) 를 인식하는 그들의 능력에 따라 rpp2cα 에 대하여 생성된 여덟 개의 개별적인 모노클로날 항체를 선별하고 선택하였다.
표 4 는 항체 포착 검정, 임뮤노블로팅법 및 면역침강을 이용하여 얻은 여덟 개의 모노클로날 항체의 특징을 제공한다. 이들 검정을 연합하여 본 발명에 알맞은 특이성을 갖는 모노클로날 항체를 분리할 수 있다.
실시예 4
정상적인 유방 조직과 유방 종양에서의 pp2cα 발현: 정상적인 유방 및 유방 종양에서 수득한 파라핀 블록을 pp2cα 에 대해 특이한 801 항체로 염색한 다음 과산화효소에 결합한 2 차 항체로 염색하였다. 기질은 DAB 였다. 시료를 메틸렌블루로 대비염색하였다. 일부 실험에서 사용한 항체는 pp2cα 에 특이한 모노클로날 2A3 이었다. 400 X 확대하였다. 정상적인 간과 간암 조직 및 정상적인 결장과 결장 종양 조직 또한 실험하였다.
정상적인 유방 시료와 과형성 유방시료의 핵은 항체로 매우 눈에 띄게 염색하였다. 유방 종양의 경우 세포질이 현저하게 염색되었다. 침입성 종양의 경우 항 - pp2cα 로 염색되지 않았다. 간 조직 배양 세포를 801 또는 2A3 항체로 염색하였을 때 흥미롭게도, 세포 표면이 염색되는데 이것은 PP2Cα 유전자 산물이 세포막에서 발현되었음을 나타낸다. 정상적인 간세포일 경우 핵 영역은 강하게 염색되지 않고 세포질은 매우 뚜렷하게 염색되었다. 간암일 경우 세포질은 희미하게 염색되고 핵은 거의 염색이 관찰되지 않는다.
대비염색시에, 세포가 악성으로 진전되므로 pp2cα 가 단계적으로 소실됨에 주의해야 한다.
실시예 5
정상적인 결장직장 조직 및 결장직장 종양에서의 pp2cα 발현:
역전사 효소 폴리메라제 연쇄반응법(RT - PCR) 에 의해 정상적인 결장 조직과 결장직장 종양 조직을 비교하고 비허용 SV40 형질전환 차이니즈 햄스터 세포(CO60) 를 차이니즈 햄스터 배(CHE) 세포주 (ATCC 와 같은 기탁기관으로부터 입수함) 와 비교하여 단백질 포스파타제 2Cα (pp2cα) 의 발현 수준을 측정하였다.
안티 - 센스 프라이머로서 0.5 M 올리고 dT (15 량체) 의 존재하에 65 ℃ 에서 10 분간 1 μg 의 총 RNA 시료를 변성시키고, 장래에 대비하여 즉시 냉각시켰다. 0.25 mM dNTP (프로메가에서 구입), 10 mM DTT, 20 μ RNasin, 50 u MMLV 역전사효소 및 5 μl 의 10 X 반응 완충액 (스트라타진에서 구입) 을 함유하는 50 μl 의 반응 혼합물에서 37 ℃ 로 60 분 후에 첫 번째 cDNA 가닥을 수득하였다. 95 ℃ 에서 10 분간 불활성화시킨 다음, 0.025 mM dNTP (프로메가에서 구입), 10 mM DTT, 20 U RNasin, 50 U MMLV 역전사효소 및 5 μl 의 10 X 반응 완충액 (스트라타진에서 구입) 을 함유하는 100 μl 의 PCR 반응물에 3 μl 의 결과적 cDNA 를 이용하였다. 95 ℃ 에서 10 분간 불활성화시킨 후, 0.025 mM dNTP (프로메가에서 구입), 0.5 μM 의 PP2Cα 센스 프라이머 5' - GAAGTAGTCGACACCTGT - 3' (서열 6), 0.5 μM 의 PP2Cα 안티 - 센스 프라이머 5' - GCTGGAGTCTGATTTACAAC - 3' (서열 5) , 10 X 반응 완충액, 2.5 mM MgCl2및 2.5 μ 의 ABTaq 폴리메라제 (어드밴스트 바이오테크놀로지에서 구입) 를 함유하는 100 μl PCR 반응물에 3 μl 의 결과적 cDNA 를 이용하였다. 다음 조건하에서 35 주기의 PCR 을 실시하였다 : 94 ℃ 에서 1 분, 60 ℃ 에서 1 분, 72 ℃ 에서 1 분 후에 72 ℃ 에서 10 분. β - 액틴 프라이머인 5' - GTTTGAGACCTTCAACACCCC - 3' (서열 7) 및 5' - GTGGCCATCTCTTGCTCGAAGTC - 3' (서열 8) 의 존재시에 동일한 PCR 반응 혼합물에서 실시한 평형 PCR 반응의 주형으로 동일한 cDNA 를 이용하였다. 20, 25, 30 및 35 주기 후에 분취량을 취하여 겔 전기영동으로 분석하였다.
결 과
PP2Cα 특이 올리고누클레오티드 프라이머를 이용하여 480 bp 의 추정 크기를 갖는 RT - PCR 산물을 생산하였다. 여덟 개의 시료 중 일곱 개의 RT - PCR 반응물에서 정상적인 결장 조직의 PP2Cα mRNA 수준이 종양 결장 인접 조직에서 수득한 수준보다 현저하게 높은 것으로 나타났다(도 7 참조). CHE 세포주에서의 PP2Cα 발현 수준이 CO60 세포주에서 보다 더 높았다 (도 8 참조).
실시예 6
벡터와 그 벡터를 수반하는 형질전환 세포의 생산
유도가능한 tet 프로모터하에서 PP2Cα mRNA 발현: 포유동물 세포내 센스 및 안티센스 PP2Cα mRNA 의 발현은 Gossen 및 Bujard [1992] 문헌에 기술된 바와 같이 테트라사이클린 - 조절 유도가능 유전자 발현 시스템에 기초한다.
이 시스템은 허피스 심플렉스 VP16 의 활성 도메인을 갖는 테트라사이클린 억제인자와 결합하는 테트라사이클린 - 조절 트란스활성화인자(tTA) 융합 단백질의 구성적 발현에 의존한다. tTA 는 랫의 선유아세포 및 HeLa 세포(ATCC 제 CCL 2 호)에서 일정하게 발현되었다. 이들 두 세포주에서 tTA 는 인체 사이토메갈로바이러스 프로모터와 테트라사이클린 작동유전자에서 유래한 미소량의 프로모터로부터 전사를 자극한다. 테트라사이클린을 가하면 tTA 에 의한 전사 자극이 저해된다.
tTA - 의존성 프로모터의 조절하에, 센스 및 안티센스 방향으로 PP2Cα mRNA 를 함유하는 발현 벡터를 갖는 두 세포주를 안정하게 형질감염시킴으로써 클론을 제조하였다.
발현 벡터의 구성: 발현 벡터로 사용한 플라스미드의 구성 단계는 다음을 포함한다.
1. 랫의 PP2Cα mRNA 를 코드하는 DNA 단편 제조.
2. tTA 함유 플라스미드 내로 랫의 PP2Cα cDNA 클로닝.
3. 제한 지도 분석으로 플라스미드 확인.
4. PP2Cα cDNA 삽입 DNA 서열 분석.
랫의 PP2Cα mRNA 를 코드하는 DNA 단편 제조:
랫의 PP2Cα mRNA 를 코드하는 DNA 단편을 열 순환 증폭에 의해 제조하였
하였다. 증폭 반응에 대한 주형은 플라스미드 skPP2C (sk BLUESCRIPT 플라스미드내로 클로닝한 PP2Cα cDNA) 의 삽입물이었다.
증폭 반응에 사용한 상부 프라이머는 랫의 PP2Cα 의 초기 여섯 개 아미노산을 코드하는 서열을 포함한다 (Met Gly Ala Phe Leu Asp ; 서열 : 9). 상부 프라이머 염기서열은 다음과 같다 :
5' CGGGATCCGC ATGGGAGCAT TTTTAGAC 3' (서열 : 10).
증폭 반응에 사용한 하부 프라이머는 랫의 PP2Cα 종결 코돈 및 마지막 다섯 개 아미노산을 코드하는 서열을 포함한다
(Thr Asp Asp Met Trp★★★; 서열 : 11). 하부 프라이머의 염기서열은 다음과 같다 : 5' CGCGGATCCT TACCACATAT CATCAGT 3' (서열 : 12).
DNA 단편의 말단은 양 말단에 BamHI 제한 부위를 도입하여 변형시켰다.
tTA 함유 플라스미드 내로 랫의 PP2Cα cDNA 클로닝:
랫의 PP2Cα cDNA 를 증폭시킨 후, DNA 단편을 제한 효소 BamHI 으로 절단하여 플라스미드 pUHD10 - 3 [Gossen 및 Bujard, 1992 참조] 의 테트라사이클린에 민감한 프로모터 하류에 클로닝시켰다.
제한 지도 분석에 의한 플라스미드 확인: 프로모터에 대한 cDNA
삽입물의 방향은 제한 지도 분석으로 결정하였다. 센스 방향 및 안티센스 방향으로 cDNA 를 함유하는 플라스미드 (순서대로 pYM00l, pYM002) 를 선택하였다(도 9 참조).
PP2Cα cDNA 삽입물의 DNA 서열 분석: 플라스미드 pYM001 DNA 삽입
물의 서열은 자동적인 DNA 서열 분석으로 결정하였다. 서열결정 분석에 이용한 프라이머는 클로닝에 사용한 것과 같은 것이었다. 이러한 분석 결과는 클로닝된 단편의 서열이 랫의 pp2cα 의 서열과 동일하며 증폭 반응 중에 돌연변이되지 않았음을 보여준다.
형질감염: 플라스미드 pBSpac (미국 위스콘신주 메디슨 소재 노바겐에서 구입) 을 CaPO4와 공침강시킴으로써 tTA 를 일정하게 발현하는 랫의 선유아세포와 HeLa 세포주내로 플라스미드 pYM001 및 pYM002 를 도입하였다. 플라스미드 pBSpac 은 푸로마이신 내성을 부여하는 유전자 선별 마커를 함유한다.
형질감염시킨 지 24 ∼ 48 시간 후에, 세포를 1 : 10 계대배양하여 선택 배지에서 성장시켰다. HeLa 및 랫의 선유아세포주에 대한 선택 배지는 각각 0.3 ㎍/ml 및 1 ㎍/ml 의 뉴로마이신을 함유하였다. 2 ∼ 3 주 후에 클론을 분리하여 24 웰 배양 평판에 전면성장시키고, 10 cm 접시로 옮겨 70 - 90 % 전면성장시킨 다음 90 % 우태아혈청 10 % DMSO 에 녹여 동결시켰다. Tet 를 제거한 후의 이들 클론에서, pYM001 을 수반하는 클론내 PP2Cα mRNA 의 유도 및 안티센스 플라스미드 pYM002 를 수반하는 클론내 PP2Cα 의 내인성 mRNA 의 환원이 관찰되었다.
실시예 7
PP2Cα 발현 조절에 대한 조립 AAV 의 역할
이 연구로 유전자내 정확한 AAV 조립 부위를 확인하지는 못한다. 또한, 106 kb 코스미드 내부가 아닌 동일한 염색체 영역 19 q 13.3 상에 위치한 인체 조립 부위에 대한 정확한 위치를 데이터가 제공하지 못한다. 출원인은 RNA 와 특이 단백질에 대한 결과를 토대로 AAV 조립 부위가 pp2cα 를 코드하는 유전자내에 존재하거나 그 조절 영역이 어떤 점에서는 PP2Cα 와 관계가 있는 것으로 가정한다. 예를들어, rep 는 pp2cα 단백질 및 rep 에 결합된 AAV 게놈과 상호작용하며, PP2Cα 는 PP2Cα 의 조절 영역에 관계할 것이다.
안정한 세포주에 있어서, SV40 증폭은 재조합 AAV/neo 바이러스에 의한 감염으로 억압되었으며 출원인은 rep 를 코드하는 서열이나 rep 발현을 검출할 수 없었고, 따라서 출원인은 억압 활성을 갖는 서열을 연구하였다. 이 서열은 그것이 차이니즈 햄스터 기원이건 마우스 기원이건 간에 모든 AAV 함유 세포에 존재하였다.
AAV 게놈을 수반하는 세포내 PP2Cα 활성도와 조립 AAV 서열간의 기능상 상호관계는 아직 결정되지 않았지만, AAV 조립 결과 본원에 기술한 바와 같은 형질전환 특성에 변화가 있었음은 분명하다.
하기한 연구를 토대로, PP2Cα 부근에서 발생하는 부위 특이 조립 이외에 AAV 서열은 형질전환 표현형의 변화에 어느 정도 중요할 수 있을 것이다.
SV40 형질전환 차이니즈 햄스터 세포주[9 - 3 (ATCC 와 같은 기탁기관으로부터 입수가능) 및 그외의 세포주] 내에 조립된 AAV 는 SV40 증폭에서 유래하는 발암물질 억압에 책임이 있다. SV40 증폭 억압에 책임이 있는 바이러스 성분은 AAV rep 단백질이 SV40 증식 억압에 책임이 있는지를 결정하는 SV40 증식의 일시적 검정 [Yang 등의 1995 참조] 으로 규정하였다. 이 검정은 T 항원에 대한 코딩 영역과 바이러스성 복제 기원을 함유하는 SV40 벡터로 인체 신장 세포주 293 을 형질감염시키고, 조립 AAV 를 함유하는 SV40 형질전환 차이니즈 햄스터 배세포 및 DA357 을 9 - 3 내 AAV 조립체 부근에서 유래한 수 개의 상이한 구성물로 공동형질감염시키는 것을 기초로 한다(조립 AAV 를 수반하는, 그것의 표현형이 형질전환되는 마우스 세포주는 AAV 조립 후 변화되었다).
출원인은 상이한 구성물을 이용하여 억압 특성을 갖는 미소량의 AAV 성분을 밝히는 데 성공하였다. 이 성분은 AAV 게놈에서 유래한 64 개의 누클레오티드(누클레오티드 125 - 189)로 이루어진다.
ACTCCATCACTAGGGGTTCCTGGAGGGGTG
GAGTCGTGACGTGAATTACGTCATAGGGTTAGGG
택일적인 구체예에서 21 개의 누클레오티드, 125 - 145 (서열 : 14) 만이 확실하지만 이 성분을 SV40 사일런서 (서열 : 13)라 명명하였다.
293 세포에서 SV40 벡터가 복제되면 메틸화되지 않은 DNA 가 생성되므로, 메틸화되지 않은 DNA 만을 절단하는 효소인 DpnⅡ 로 절단한다. DpnⅡ 로 절단된 DNA 를 겔상에서 분리하여 블롯팅하고 SV40 프로브로 혼성하였다. 결과는 도 12 에 나타나 있다. 블롯팅 결과는 다음과 같다 :
레인 1: pSK1 (미국 위스콘신주 메디슨 소재 노바겐에서 구입) 및 pAV2 (ATCC 제 37,216 호, 전체 AAV 게놈을 함유하며 rep 단백질을 발 현하는 플라스미드)로 공동형질감염. SV40 증식이 억압됨 에 주의하라.
레인 2: SV40 플라스미드 pSK1 SV40 증식체로 형질감염. SV40 주형 의 증식이 관찰된다.
레인 3: pSVK1 (미국 위스콘신주 메디슨 소재 노바겐에서 구입) 및 138 bp 의 AAV 게놈을 수반하는 플라스미드(누클레오티드 125 - 263)의 공동형질감염. 이 성분에 의해 SV40 증식이 억압되었다.
레인 4: pSL 9 - 6 (AAV DNA 서열이 아님)을 수반하는 pSVK1 의 공동형질감 염.
이와 같이 293 세포내 SV40 증식은 rep 및 사일런서 성분에 의해 억압되었다.
125 - 145 (SV40 미니 - 사일런서, 서열 14) 만을 함유하는 플라스미드로 세포를 형질감염시켰을 때에도 SV40 증식은 유사하게 억압되었다.
5' A124C125TCCCATCACTAGGGGTTCCT145
조립 AAV 에서 유래한 다른 서열 및 pSL9 - 6 과 그외의 것 (도 12 의 레인 4 참조) 과 같은 조립 AAV 를 메우는 세포 서열로 형질감염시킨 대조 실험에서는 SV40 DNA 증식 억압이 검출되지 않았다.
마우스 DA3J7 세포주에서 유래한 측면 세포 서열 및 조립 AAV 를 함유하는 λ 클론을 이용하면, 유사한 SV40 증식 억압이 관찰되었다. 이 클론은 사일런서 영역을 포함하는 64 개의 누클레오티드를 함유한다.
293 세포의 일시적 검정으로 Rep 발현물 및 64 bp 의 사일런서 성분에 의해 SV40 증식이 억압될 수 있음에 주목하라.
조립 AAV 를 상실한 복귀유전자는 SV40 을 증폭시키는 능력을 회복하였다. 한 복귀유전자인 C9 - 3 - 2 에 있어서, 복귀유전자가 조립 AAV 를 함유하는 전체 염색체를 상실한 것으로 나타났다. 출원인은 AAV 가 그 내부로 조립되는 매우 잘 특정화된 비정상 염색체가 소실되는 FISH 에 의해 이것을 보여주었다.
상기 관찰한 것에 대한 가설을 세울 수 있지만, 이러한 작용의 한 형태로 본 발명을 제한하려는 것은 아니다. 출원인은 Rep 단백질 [Heilbronn, Schlehofer 등의 1983 ; Kleinschmidt 등의 1995 ; Yang 등의 1995 참조] 및 사일런서 성분이 유사 단백질 또는 성분, 아마도 PP2Cα 와 직접 또는 간접적으로 상호작용하여 SV40 증식을 억압할 수 있음을 제안한다.
AAV 게놈의 21 bp(미니 - 사일런서) 는 조절 영역을 활성화시켜 상호작용에 의해 PP2Cα 활성도를 조절하는 것이 가능하다. 택일적으로 사일런서는 SV40 증식과 관련된 단백질과 직접 및/또는 간접적으로 상호작용하는 유력한 네거티브 성분으로 작용할 수 있다. PP2C 는 탈인산화반응에 의해 이러한 단백질의 활동을 조절할 수 있다. 이러한 상호작용에 대한 예는 DNA 폴리메라제 α 프리마제일 수 있다. rep 단백질이 이러한 상호작용에 직접적으로 관계하는 것이 가능하다.
CO60 세포내 증폭으로 인한 발암물질 유도 도중에 탈인산화 DNA 폴리메라제 α 프리마제가 SV40 DNA 복제 개시에 관여하는 것으로 생각된다. 또한 이 인산화 - 탈인산화 과정은 세포 주기에 의해 조절된다. 따라서 PP2Cα 가 rep 에 결합하여 PP2Cα 로부터 DNA 폴리메라제 α 프리마제 활성도를 감소시킬 수 있으며, 직간접적으로 DNA 폴리메라제 α 프리마제가 비정상적으로 인산화되게 하여 SV40 DNA 복제 개시를 실패하게 할 수 있었을 것이다.
실시예 8
42 kd 보다 큰 pp2cα 단백질의 존재
rpp2cα에 대항하여 생성된 상이한 모노클로날 항체(상기 실시예 3 참조) 로 간 추출물을 면역침강하였다. 침강물을 두 분취량으로 나누어 12 % PAGE 에서 분리하고 블롯팅하였다. 각 세트의 면역침강물을 다음의 폴리클로날 항체로 항원투여하였다 :
(1) 351 - α 및 β 둘다 인식
(2) 801 - pp2cα에 대해 특이적임
도 10 에 설명한 바와 같이 항체 351 과의 반응시에, 40 - 43 kd 위치에서 이동하는 수 개의 밴드가 검출되었다. 모노클로날 항체 9F11, 9F4 및 1D5 는 2 - 3 개의 뚜렷한 밴드와 1 - 2 개의 희미한 밴드로 유사한 결과를 나타내었다. 모노클로날 항체 2A3 은 희미한 밴드만 나타났다.
두 번째로 블롯팅 분취량을 α 특이 항체 801 과 반응시켰다. ∼ 40 - 43 kd 위치에서 네 개의 모노클로날 항체에 대해 두 개의 밴드를 볼 수 있었다. 이들 밴드는 아마도 모노클로날 2A3 에 의해 검출된 것일 것이다. 따라서 모노클로날 항체 2A3 은 pp2cα 에 특이적이다.
더욱이, 75 kb 및 150 kb 보다 큰 위치에서 이동하는 두 개의 부가적인 밴드가 검출되었다. 이들 단백질은 간에서 40 - 43 kd 의 단백질보다 더 많이 존재한다. 여덟 개의 모든 모노클로날 항체가 이들 단백질을 인식하고 801 폴리클로날 항체도 마찬가지로 반응하므로 이들 두 개의 큰 단백질이 pp2cα 를 수반하는 각각의 에피토프를 공유함이 분명한데, 이것은 그들이 동일 유전자의 산물이지만 선택적으로 스플라이싱된 것임을 시사한다.
폴리클로날 항체 351 과 75 kd 단백질을 면역침강에 의해 반응시켰을때는 약한 반응이 검출되었다. 그러나 간의 총 추출물과 직접 임뮤노블로팅한 때에는 75 kd 이 존재하는 것으로 보였고 보다 큰 분자량의 단백질에 대한 희미한 반응을 검출할 수 있었다.
수 개의 보다 큰 분자량의 부가적인 단백질 또한 폴리클로날 항체 351 과 함께 검출되었다. 이들 단백질은 폴리클로날 항체 801 과는 상호작용하지 않았는데, 그것은 pp2cα 에 특이적이다. 이러한 결과는 다른 형태의 α 가 존재하며 그것이 상이한 분자량을 가짐을 시사한다.
몇 개의 조직에서 유래한 mRNA 의 노던 블롯 분석 (도 13 참조) 으로, pp2cα 의 5' UTR 에서 유래한 프로브 또는 전체 PP2Cα cDNA 프로브와 혼성되는 몇 개의 RNA 밴드가 나타났다. 상이한 조직으로부터 RNA 를 추출하였으며 이들 조직의 RNA 크기는 상이한 것으로 나타났다.
실시예 9
pp2cα 는 mRNA 합성을 조절한다
표 6 은 pp2cα 카르복시 말단 펩티드의 10 개 아미노산 : NDDTDSASTD (서열 1) 에 대하여 발견한 단백질 또는 RNA 서열 상동성을 요약한 것이다. 이 펩티드는 상기한 폴리클로날 항체 801 을 생성시키는 데 사용하였다.
RNA 폴리메라제 Ⅱ 의 카르복시 세포성 도메인(CTD) 을 GST 와 융합하여 세파로스 글루타티온 주 (sepharose glutathion beads) 에 융합 단백질을 결합시키고, HeLa 세포 추출물과 혼합하였다. PAGE 및 블롯팅 후, RNA 폴리메라제의 카르복시 말단 도메인 (CTD) 에 결합한 단백질은 pp2cα 에도 결합하였다. 801 과 2A3 둘다를 블롯팅에 사용하였다. 결합된 pp2cα 의 크기는 대략 43 kD 이었다. 따라서 RNA 폴리메라제 Ⅱ 는 pp2cα 와 결합한다.
두 번째 실험에서, 종양 세포, 간암 세포 및 HeLa 추출물을 상기와 같이 분석하였다. 종양 추출물에서는 GST - CTD 에 대한 결합만이 관찰되는 반면에 정상적인 간세포 추출물에서는 관찰되지 않았다.
폴리메라제 α CTD 도메인이 PP2Cα(PP2Cα 가 아님) 에 대한 그것의 특성과 유사하게 포스파타제에 의해 탈인산화될 수 있음을 입증하는 연구를 토대로 [Chamber 및 Dahmus, 1994 참조], 출원인은 pp2cα 가 RNA 폴리메라제 Ⅱ를 탈인산화시켜며, 따라서 특이 메센저 상의 mRNA 합성 개시를 조절한다고 생각한다. 이 펩티드는 그외의 인자에 의해 촉진되는 전사를 제어하고 조절하는 데 이용할 수 있다.
실시예 10
부가적인 서열
AAV 조립 부위를 함유하는 두 λ 클론을 제조하였다.
(1) 하나는 차이니즈 햄스터 세포 CO60 에서 유도하여 λSL 9 - 1 (ATCC 와 같은 기탁기관으로부터 입수가능) 이라 명명하였다(도 3 의 개략도 ; 서열 15 및 16). 도 3 에 나타나 있는 바와 같이 일부의 서열을 결정하였다. 부가적인 서열 AN8T7 (서열 18) 은 플라스미드 pSL9 - 8 에서 유도하였다(도 3 참조).
(2) 두 번째 λ 파지는 세포주 DA3J7 로부터 클로닝하였고, 지도화하지는 않았다. 일부를 플라스미드 내로 서브클로닝하고 5h - 1 에 기술한 바와 같이 부분 서열결정하였다(서열 17). 서 열을 비교하면 5h - 1 이 AN8T7 과 상동인 것으로 나타난다. 이 비교 영역은 코스미드 MMDA 23467 - 23715 와도 상동이었다
본 출원 전체에 걸쳐, 여러 문헌의 인용구와 특허 번호를 참고로 인용하였다. 그것의 전부를 공개한 간행물은 본 발명이 본 분야에서 차지하는 위치를 보다 상세히 설명하기 위해 본원의 참고문 헌으로 인용하였다.
본 발명은 예증 형식으로 기술하였으며, 본원에 사용한 용어로 제한하기 보다는 설명하고자 하는 것임을 숙지할 수 있을 것이다.
명백하게, 상기 지침을 고려하여 본 발명의 다양한 변형 및 수정이 가능하다. 따라서 첨부한 청구의 범위의 범주 내에서 특정하여 기술한 것 이외에 본 발명을 다른 방법으로 실시할 수 있을 것으로 숙지된다.
선조 DA3세포주와 DA3J 클론의 평판 효율 비교
평판 세포의 수 성장 콜로니의 수 (평균 ± SD), 평판 효율 %
DA3 DA3J1 DA3J2 DA3J3
250 88 (6)35 % 53 (8)21 % 78 (11)31 % 43 (5)17 %
500 181(36)36% 103(10)20 % 131 (20)26 % 82 (9)17 %
DA3, DA3J1, DA3J2및 DA3J3세포 배양액에서 유도한 반전면 세포를9 - cm 플라스틱 페트리접시에 250 및 500 세포로 접종하였다.세포를고정시킨 다음 김자(Gimsa) 로 염색하였다. 두 실험의 평균성장 콜로니 수를 측정하였다. 각 실험은 3 중으로 실시하였다.
선조 DA3세포주와 DA3J 클론의 UV 민감성 비교
J/㎡ 성장 콜로니의 수 (평균 ± SD), 생존율 %
DA3 DA3J1 DA3J2 DA3J3
0 91(4) 100 % 59(20) 100 % 79 (6) 100 % 36 (7) 100 %
2.5 86(9) 95 % 54 (9) 91 % 85 (8) 100 % 36 (4) 100 %
5 62(5) 68 % 25(30) 42 % 39(13) 49 % 11(11) 30 %
10 22(6) 24 % 12 (2) 20 % 19 (4) 24 % 4 (2) 11 %
20 0(0) 0 % 0(0) 0 % 2 (2) 2 % 0 (0) 0 %
DA3, DA3J1, DA3J2및 DA3J3세포 배양액에서 반전면 성장시킨 세포를9 - ㎝ 플라스틱 페트리접시에 250 세포로 접종하였다.48 시간 후에 UV 광으로 배양액을 조사한 다음 7 일간 배양하였다.평균 성장 콜로니 수를 측정하였다. 실험은 3 중으로 실시하였다.
마커 경우 총계 % 평균 CV
합계 7000 100.00 384.11 48.19
G0/G1 3355 47.93 394.88 14.49
S 943 13.47 569.28 7.41
G2+M 668 9.54 727.76 8.06
Ap. 1485 21.21 132.36 36.21
목록 : Shu..008취득일자 : 1995년 5월 10일총 경우 : 7000× 파라미터 : FL2 - A (선형)
마커 경우 총계 % 평균 CV
합계 7000 100.00 382.46 51.58
G0/G1 3019 43.13 393.54 14.79
S 938 13.40 574.35 7.10
G2+M 798 11.40 737.43 8.24
Ap. 1684 24.06 133.69 36.68
목록 : Shu..010취득일자 : 1995년 5월 10일총 경우 : 7000× 파라미터 : FLA - 2(선형)
모노클로날 항체의 특정화
항체 번호 항체 포착(1) 임뮤노블로팅(2) 면역침강(3)
PP2C PET
1D5 + 1/8 - +++ +++
2A3 + 1/32 - +++ α- 특이
2H8 + 1/16 +1/8 실험 못함 +++
9F4 + 1/10 - +++ +++
9F11/169 - - 비특이 +++
9F11/53 + 1/10 - +++ +++
10C6 + 1/10 + 1/10 ++ +++
10F8 + 1/1 - + +++
(1) 두 항원에 대하여 항체 포착 검정을 실시하였다 : 정제된 rpp2c - 항 pp2c 항체를 확인하기 위하여, pp2c 삽입물이 없는 pET 발현 벡터를 함유하는 세포로부터의 단백질 추출물 - 비특이 항체를 확인하기 위하여. 결과는 + 또는 - 및 최상의 결과를 제공하는 항체 희석액을 나타내는 수로 표현한다.(2) rpp2c 및 간 추출물에 대하여 실험한 임뮤노블로팅은 12 % SDS - PAGE 상에서 분리하였다.(3) 면역침강. 간 추출물의 단백질을 침전시키는 데 모노클로날 항체를 이용하였다. 12 % SDS - PAGE 에서 단백질을 분리하여, 정제된 토끼의 폴리클로날 항체(α - 특이 801 및 pp2cα 와 pp2cβ 를 식별하는 351) 와의 친화성에 의해 검출하였다.
PP2C RNA 의 5' 말단을 함유하는 코스미드 DNA MMDB 로부터의 인체 DNA 서열 (서열 20) 및 CHINT(서열 19) 간의 상동성
위치 HUMMMDBC 68505 bp ds-DNA PRI 1992.4.09
정의 염색체 19q 13.3의 코스미드 DNA MMDB(f10080) 및 MMDC(f13544) 로부터의 인체 DNA (자동 서열 분석에 의해 수득).
기탁핵심어 M89651 M77823 M77824 M77825
원(Source) 호모 사피엔스(라이브러리: A.V.카라노의 Lawrist5 벡터 라이브러리)
스코어 Initl: 61 Initn: 150 Opt: 82103 bp가 부분적으로 일치하므로 58.3 % 가 동일함
NDDTDSASTD 에 대해 상동인 단백질 또는 RNA 서열
펩티드 서열
#1 1) 상이한 PP2Cα 단백질 및 mRNA
2) 라투스 노르베기안 신경원, 펜트록신 전구체 mRNA
3) 제노푸스 전사 인자 ⅢA
4) 인체 DNA/RNA 결합 단백질 mRNA
5) 인체 전사 인자 ⅢA
및 그외의 경미한 정도의 다른 단백질
RNA 수준의 상동체
#2 1)PP2Cα mRNA
2)제노푸스 전사 인자 ⅢA와 상동인 인체 mRNA
3)인체 DNA/RNA 결합 단백질 mRNA
4)인체 전사 인자 ⅢA
#3 1)PP2Cα 의 다른 형태
2)RNA 폴리메라제 시그마 사슬을 향하는 DNA를 코드하 는 씨. 엘레강스 (C.elegans) 코스미드
3)피루브산 키나아제에 대한 포테이토 mRNA
4)C. 엘레강스 코스미드
5)익타투리드 허피스 바이러스(Ictaturid herpes virus)DNA 폴리메라제 헬리케이스
6)UIsnRNA 특이 단백질 UIA 에 대한 에이. 타바나(A.thabana) mRNA
7)회충(Ascaris lumbricoides)의 소핵 RNA(snRNA UI-1 UI-2 UI-3 U-I 유전자)
참고문헌
서열 목록
(1) 일반적 정보 :
(ⅰ) 출원인 : 래비, 사라
(ⅱ) 발명의 명칭 : 암 치료, 예방 및 검출을 위한 종양세포내 단 백질 포스파타제 2C - PP2C알파 - 발현의 조작 및 검출
(ⅲ) 서열의 개수 : 20
(ⅳ) 통신 주소 :
(A) 수신인 : 콘 & 어소시에이츠
(B) 가 : 노스웨스턴 하이웨이 30500
(C) 시 : 파밍톤 힐즈
(D) 주 : 미시간
(E) 국명 : 미국
(F) 우편번호 : 48334
(ⅴ) 컴퓨터 판독 형태 :
(A) 매체타입 : 플로피 디스크
(B) 컴퓨터 : IBM PC 호환기종
(C) 운영 체계 : PC-DOS/MS-DOS
(D) 소프트웨어 : 파텐트인 릴리스 #1.0, 버전 #1.30
(ⅵ) 현출원 데이터 :
(A) 출원번호 :
(B) 출 원 일 :
(C) 분류 :
(ⅷ) 대리인/관리인 정보 :
(A) 성명 : 콘, 케네스 아이.
(B) 등록번호 : 30,955
(C) 참조/문서 번호 : 2290.00037
(ⅸ) 통신 정보:
(A) 전화번호 : (810) 539-5050
(B) 팩스: (810) 539-5055
(2) 서열 번호 : 1
(ⅰ) 서열 특징 :
(A) 서열의 길이 : 10 아미노산
(B) 서열의 타입 : 아미노산
(C) 쇄의 수 : 1 본쇄
(D) 토폴로지 : 직쇄상
(ⅱ) 서열의 종류 : 펩티드
(2) 서열 번호 : 2
(ⅰ) 서열 특징 :
(A) 서열의 길이 : 15 아미노산
(B) 서열의 타입 : 아미노산
(C) 쇄의 수 : 1 본쇄
(D) 토폴로지 : 직쇄상
(ⅱ) 서열의 종류 : 펩티드
(2) 서열 번호 : 3
(ⅰ) 서열 특징 :
(A) 서열의 길이 : 9 아미노산
(B) 서열의 타입 : 아미노산
(C) 쇄의 수 : 1 본쇄
(D) 토폴로지 : 직쇄상
(ⅱ) 서열의 종류 : 펩티드
(2) 서열 번호 : 4
(ⅰ) 서열 특징 :
(A) 서열의 길이 : 20 염기쌍
(B) 서열의 타입 : 핵산
(C) 쇄의 수 : 1 본쇄
(D) 토폴로지 : 직쇄상
(ⅱ) 서열의 종류 : 기타 핵산
(A) 기술 : /desc = "Primer"
(2) 서열 번호 : 5
(ⅰ) 서열 특징 :
(A) 서열의 길이 : 20 염기쌍
(B) 서열의 타입 : 핵산
(C) 쇄의 수 : 1 본쇄
(D) 토폴로지 : 직쇄상
(ⅱ) 서열의 종류 : 기타 핵산
(A) 기술 : /desc = "Primer"
(ⅳ) 안티 - 센스 : Yes
(2) 서열 번호 : 6
(ⅰ) 서열 특징 :
(A) 서열의 길이 : 18 염기쌍
(B) 서열의 타입 : 핵산
(C) 쇄의 수 : 1 본쇄
(D) 토폴로지 : 직쇄상
(ⅱ) 서열의 종류 : 기타 핵산
(A) 기술 : /desc = "Primer"
(2) 서열 번호 : 7
(ⅰ) 서열 특징 :
(A) 서열의 길이 : 21 염기쌍
(B) 서열의 타입 : 핵산
(C) 쇄의 수 : 1 본쇄
(D) 토폴로지 : 직쇄상
(ⅱ) 서열의 종류 : 기타 핵산
(A) 기술 : /desc = "Primer"
(2) 서열 번호 : 8
(ⅰ) 서열 특징 :
(A) 서열의 길이 : 23 염기쌍
(B) 서열의 타입 : 핵산
(C) 쇄의 수 : 1 본쇄
(D) 토폴로지 : 직쇄상
(ⅱ) 서열의 종류 : 기타 핵산
(A) 기술 : /desc = "Primer"
(2) 서열 번호 : 9
(ⅰ) 서열 특징 :
(A) 서열의 길이 : 6 아미노산
(B) 서열의 타입 : 아미노산
(C) 쇄의 수 : 1 본쇄
(D) 토폴로지 : 직쇄상
(ⅱ) 서열의 종류 : 펩티드
(2) 서열 번호 : 10
(ⅰ) 서열 특징 :
(A) 서열의 길이 : 28 염기쌍
(B) 서열의 타입 : 핵산
(C) 쇄의 수 : 1 본쇄
(D) 토폴로지 : 직쇄상
(ⅱ) 서열의 종류 : 기타 핵산
(A) 기술 : /desc = "Primer"
(2) 서열 번호 : 11
(ⅰ) 서열 특징 :
(A) 서열의 길이 : 5 아미노산
(B) 서열의 타입 : 아미노산
(C) 쇄의 수 : 1 본쇄
(D) 토폴로지 : 직쇄상
(ⅱ) 서열의 종류 : 펩티드
(2) 서열 번호 : 12
(ⅰ) 서열 특징 :
(A) 서열의 길이 : 27 염기쌍
(B) 서열의 타입 : 핵산
(C) 쇄의 수 : 1 본쇄
(D) 토폴로지 : 직쇄상
(ⅱ) 서열의 종류 : 기타 핵산
(A) 기술 : /desc = "Primer"
(2) 서열 번호 : 13
(ⅰ) 서열 특징 :
(A) 서열의 길이 : 64 염기쌍
(B) 서열의 타입 : 핵산
(C) 쇄의 수 : 1 본쇄
(D) 토폴로지 : 직쇄상
(ⅱ) 서열의 종류 : 기타 핵산
(A) 기술 : /desc = "Silencer Region"
(2) 서열 번호 : 14
(ⅰ) 서열 특징 :
(A) 서열의 길이 : 22 염기쌍
(B) 서열의 타입 : 핵산
(C) 쇄의 수 : 1 본쇄
(D) 토폴로지 : 직쇄상
(ⅱ) 서열의 종류 : 기타 핵산
(A) 기술 : /desc = "Mini - silencer region"
(2) 서열 번호 : 15
(ⅰ) 서열 특징 :
(A) 서열의 길이 : 1573 염기쌍
(B) 서열의 타입 : 핵산
(C) 쇄의 수 : 1 본쇄
(D) 토폴로지 : 직쇄상
(ⅱ) 서열의 종류 : 기타 핵산
(A) 기술 : /desc = "35-3.seg (도 3)"
(2) 서열 번호 : 16
(ⅰ) 서열 특징 :
(A) 서열의 길이 : 2580 염기쌍
(B) 서열의 타입 : 핵산
(C) 쇄의 수 : 1 본쇄
(D) 토폴로지 : 직쇄상
(ⅱ) 서열의 종류 : 기타 핵산
(A) 기술 : /desc = "35 - T7.seg (도 3)"
(2) 서열 번호 : 17
(ⅰ) 서열 특징 :
(A) 서열의 길이 : 830 염기쌍
(B) 서열의 타입 : 핵산
(C) 쇄의 수 : 1 본쇄
(D) 토폴로지 : 직쇄상
(ⅱ) 서열의 종류 : 기타 핵산
(A) 기술 : /desc = "5H - 1 (실시예 10)"
(2) 서열 번호 : 18
(ⅰ) 서열 특징 :
(A) 서열의 길이 : 838 염기쌍
(B) 서열의 타입 : 핵산
(C) 쇄의 수 : 1 본쇄
(D) 토폴로지 : 직쇄상
(ⅱ) 서열의 종류 : 기타 핵산
(A) 기술 : /desc = "AN8T7 (실시예 10)"
(2) 서열 번호 : 19
(ⅰ) 서열 특징 :
(A) 서열의 길이 : 180 염기쌍
(B) 서열의 타입 : 핵산
(C) 쇄의 수 : 1 본쇄
(D) 토폴로지 : 직쇄상
(ⅱ) 서열의 종류 : 기타 핵산
(A) 기술 : /desc = "CHINT (표 5)"
(2) 서열 번호 : 20
(ⅰ) 서열 특징 :
(A) 서열의 길이 : 175 염기쌍
(B) 서열의 타입 : 핵산
(C) 쇄의 수 : 1 본쇄
(D) 토폴로지 : 직쇄상
(ⅱ) 서열의 종류 : 기타 핵산
(A) 기술 : /desc = "HUMMDB (표 5)"

Claims (44)

  1. 환자로 부터 분리한 시료내 PP2Cα 유전자 활성도 변화를 검출함으로써 환자의 암 세포를 검출하는 방법.
  2. 제 1 항에 있어서, 시료는 조직 생검물 및 체액으로 구성된 군 중에서 선택한 것임을 특징으로 하는 방법.
  3. 제 1 항에 있어서, 변화는 정상 대조에 비해 PP2Cα 유전자 활성도가 감소하는 것임을 더 특징으로 하는 방법.
  4. 제 1 항에 있어서, 검출단계는 정상소재의 혼성화, 노던 블로팅 및 역전사효소 - 중합효소 사슬 반응으로 구성된 군 중에서 선택한 검정법으로 다형태성을 포함하는 PP2Cα DNA 에 상보적인 mRNA 에 대해 시료를 검정하는 것으로 더 규정함을 특징으로 하는 방법.
  5. 제 1 항에 있어서, 검출단계는 면역조직화학 및 면역세포화학 염색법, ELISA, RIA, 면역블롯, 면역침강, 웨스턴 블로팅, 기능적 검정법 및 단백질 절단 시험으로 구성된 군 중에서 선택한 검정법으로 다형태성을 포함하는 PP2Cα 유전자 산물과 그것의 펩티드 단편에 대해 시료를 검정하는 것으로 더 규정함을 특징으로 하는 방법.
  6. 제 5 항에 있어서, 시료는 요, 혈액, 뇌척수액 및 타액으로 구성된 군 중에서 선택한 체액임을 특징으로 하는 방법.
  7. 제 1 항에 있어서, 시료내 PP2Cα 유전자 활성도를 검출하는 것은 PP2Cα 유전자 산물에 의해 영향받는 단백질 인산화 유형의 변화를 측정하는 것임을 특징으로 하는 방법.
  8. 다음을 포함하는, 제 4 항에 나타낸 바와 같은 PP2Cα 활성도를 검출하기 위한 키트 :
    다형태성을 포함하는 PP2Cα 에 대한 mRNA 의 유전자 서열에 상보적 인 분자 프로브 및
    상기 분자 프로브와 mRNA 의 혼성화를 검출함으로써 PP2Cα 유전자의 활성도를 나타내는 검출 수단.
  9. 다음을 포함하는, 제 5 항에 나타낸 바와 같은 PP2Cα 유전자 활성도와 관련된 유전자 산물을 검출하기 위한 키트 :
    다형태성을 포함하는 PP2Cα 유전자 산물과 그것의 펩티드 단편으로 구성된 군 중에서 선택한 표식자를 인식하는 고특이성을 갖는 항체 및
    상기 항체의 결합을 검출함으로써 상기 유전자 산물의 존재를 나타내는 검출 수단.
  10. 다음을 포함하는, 제 5 항에 나타낸 바와 같은 PP2C 유전자 활성도와 관련된 유전자 산물을 검출하기 위한 키트 :
    다형태성을 포함하는 PP2Cα 유전자 산물과 그것의 펩티드 단편에 결합하는 천연 단백질을 모조한 인자 및
    상기 인자의 결합을 검출함으로써 상기 유전자 산물의 존재 를 나타내는 검출 수단.
  11. 다형태성을 포함하는 인체 PP2Cα 에 대한 발현가능한 핵산 서열을 함유하는 비인체 형질전환 동물이나 세포주.
  12. PP2Cα 에 대한 동등한 게놈 핵산 서열이 녹아웃(knocked - out) 되어 있는 비인체 진핵 유기체.
  13. PP2Cα 의 핵산 서열과 효과적으로 연결된 발현 조절 서열을 포함하 는 벡터.
  14. 제 13 항의 벡터로 형질전환된 숙주세포.
  15. PP2Cα 의 안티센스 서열을 포함하는 벡터.
  16. PP2Cα 의 유전자 산물과 PP2Cβ 의 유전자 산물을 구별하는, 다형태성을 포함하는 PP2Cα 의 유전자 산물의 에피토프와 특이적으로 결합하는 항체.
  17. 제 16 항에 있어서, 검출가능한 부분과 콘쥬게이션됨을 특징으로 하는 항체.
  18. 제 16 항에 있어서, 모노클로날 및 폴리클로날 항체로 구성된 군 중에서 선택함을 특징으로 하는 항체.
  19. 제 18 항에 있어서, 폴리클로날 항체는 재조합적으로 생산된 PP2Cα 에 대항함을 특징으로 하는 항체.
  20. 제 18 항에 있어서, 폴리클로날 항체는 NDDTDSASTD (서열 1) 및 YKNDDTDSTSTDDMW(서열 2) 로 구성된 군 중에서 선택한 pp2cα 의 카르복시 말단 펩티드에 대항함을 특징으로 하는 항체.
  21. 제 18 항에 있어서, 모노클로날 pp2cβ 와 교차반응하지 않으며 재조합적으로 생산된 pp2cα, NDDTDSASTD(서열 1) 및 YKNDDTDSTSTDDMW(서열 2) 로 구성된 군 중에서 선택한 펩티드에 대항함을 특징으로 하는 항체.
  22. 제 21 항에 있어서, 모노클로날 항체는 2A3 이라 명명함을 특징으로 하는 항체.
  23. NDDTDSASTD(서열 1), YKNDDTDSTSTDDMW(서열 2) 및 PNKDNDGGA(서열 3) 으로 구성된 군 중에서 선택한 분리 정제한 펩티드.
  24. 제 23 항에 있어서, 재조합적으로 생산한 것임을 특징으로 하는 펩티드.
  25. 다음 단계를 포함하는 암 치료방법 :
    a. 암의 유형과 그 암을 발현하는 세포를 결정하는 단계,
    b. PP2Cα 의 발현가능성을 조절하는 조절요소를 포함하는, 상기 암 세포를 특이적으로 표적화할 벡터를 제조하는 단계 및
    c. 환자에게 상기 벡터를 투여하는 단계.
  26. 제 25 항에 있어서, 벡터는 AAV 변형 서열이나 이 AAV 서열의 부분을 포함함을 특징으로 하는 방법.
  27. 제 25 항에 있어서, 벡터는 CHINT 서열을 포함함을 특징으로 하는 방법.
  28. 제 25 항에 있어서, 벡터는 사일런서 부위 (서열 13) 를 포함함을 특징으로 하는 방법.
  29. 제 25 항에 있어서, 벡터는 미니 - 사일런서 부위 (서열 14) 를 포함함을 특징으로 하는 방법.
  30. 다음 단계를 포함하는 암 치료방법 :
    a. 암의 유형과 그 암을 발현하는 세포를 결정하는 단계,
    b. PP2Cα 의 발현가능성을 조절하도록 상기 암 세포를 특이적으 로 표적화할 안티센스 벡터를 제조하는 단계 및
    c. 환자에게 상기 벡터를 투여하는 단계.
  31. 벡터와 제약학적으로 적합한 담체로 이루어진 제약학적 조성물로서, 벡터는 암 세포를 특이적으로 표적화할 것이며 PP2Cα 의 발현가능성을 조절하는 조절요소를 포함하는 벡터 및 PP2Cα 의 발현가능성을 조절하도록 암 세포를 특이적으로 표적화할 안티센스 벡터로 구성된 군 중에서 선택한 것인, 제약학적 조성물.
  32. 다음 단계를 포함하는, PP2Cα 발현의 변화로 인한 이상 인산화에 기인하는 질병의 치료방법 :
    a. PP2Cα 의 발현가능성을 조절하도록 이상 인산화를 나타내는 세포를 특이적으로 표적화할 안티센스 벡터를 제조하는 단 계 및
    b. 환자에게 상기 벡터를 투여하는 단계.
  33. PP2Cα 유전자 산물에 대한 DNA 폴리머라제 α 프리마제의 결합부위를 특이적으로 표적화할 안티센스 벡터를 제조하고 이 벡터를 세포에 운반하여 PP2Cα 의 유전자 산물과 DNA 폴리머라제 α 프리마제의 예정되지 않은 상호작용을 방해함으로써 유전자 증폭을 억제시키는 방법.
  34. 시그널 형질도입을 유도하기 위해 세포 표면에 발현되는 PP2Cα 의 유전자 산물을 활성화시키는 방법.
  35. 제 34 항에 있어서, PP2Cα 의 유전자 산물과 결합시키기 위해 항체를 사용함을 특징으로 하는 방법.
  36. 환자로부터 분리한 시료내 변화된 PP2Cβ 유전자 활성도를 검출함으로써 환자의 암을 검출하는 방법.
  37. 제 36 항에 있어서, PP2Cβ 활성도의 증가를 검출함을 더 특징으로 하는 방법.
  38. 제 36 항에 있어서, PP2Cβ 활성도의 검출은 정상소재의 혼성화, 노던 블로팅 및 역전사효소 - 중합효소 사슬 반응으로 구성된 군 중에서 선택한 검정법으로 다형태성을 포함하는 PP2Cβ DNA 에 상보적인 mRNA 에 대해 시료를 검정하는 것임을 특징으로 하는 방법.
  39. 제 36 항에 있어서, PP2Cβ 활성도의 검출은 면역조직화학 및 면역세포화학 염색법, ELISA, RIA, 면역블롯, 면역침강, 웨스턴 블롯, 기능적 검정법 및 단백질 절단 시험으로 구성된 군 중에서 선택한 검정법으로 다형태성을 포함하는 PP2Cβ 유전자 산물에 대해 시료를 검정하는 것임을 특징으로 하는 방법.
  40. PP2Cα 의 유전자 산물과 PP2Cβ 의 유전자 산물을 구별하는, 다형태성을 포함하는 PP2Cβ 유전자 산물의 에피토프와 특이적으로 결합하는 항체.
  41. 제 40 항에 있어서, 검출가능한 부분과 콘쥬게이션됨을 특징으로 하는 항체.
  42. 제 40 항에 있어서, 모노클로날 및 폴리클로날 항체로 구성된 군 중에서 선택함을 특징으로 하는 항체.
  43. 제 40 항에 있어서, 폴리클로날 항체가 재조합적으로 생산된 PP2Cβ 에 대항함을 특징으로 하는 항체.
  44. 제 40 항에 있어서, 폴리클로날 항체가 카르복시 말단 펩티드 PNKDNDGGA (서열 3) 에 대항함을 특징으로 하는 폴리클로날 항체.
KR1019980701557A 1995-09-01 1996-08-30 아밀포스파타제2Ｃ - ＰＰ 2Ｃα-발현의 조작 및 검출 KR19990044317A (ko)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US311495P 1995-09-01 1995-09-01
US60/003,114 1995-09-01

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR19990044317A true KR19990044317A (ko) 1999-06-25

Family

ID=29418017

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1019980701557A KR19990044317A (ko) 1995-09-01 1996-08-30 아밀포스파타제2Ｃ - ＰＰ 2Ｃα-발현의 조작 및 검출

Country Status (3)

Country Link
US (1) US20040197798A1 (ko)
KR (1) KR19990044317A (ko)
CA (1) CA2227306A1 (ko)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2006138160A2 (en) * 2005-06-16 2006-12-28 The Regents Of The University Of California Amyloid beta protein channel structure and uses thereof indentifying potential drug molecules for neurodegenerative diseases
AU2020296104A1 (en) * 2019-06-21 2022-01-27 Quralis Corporation PPM1A inhibitors and methods of using same

Family Cites Families (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4736866B1 (en) * 1984-06-22 1988-04-12 Transgenic non-human mammals
US4666828A (en) * 1984-08-15 1987-05-19 The General Hospital Corporation Test for Huntington's disease
US4683202A (en) * 1985-03-28 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying nucleic acid sequences
US4801531A (en) * 1985-04-17 1989-01-31 Biotechnology Research Partners, Ltd. Apo AI/CIII genomic polymorphisms predictive of atherosclerosis
EP0289121B1 (en) * 1987-05-01 1995-12-27 Stratagene Mutagenesis testing using transgenic non-human animals carrying test DNA sequences
US5175385A (en) * 1987-09-03 1992-12-29 Ohio University/Edison Animal Biotechnolgy Center Virus-resistant transgenic mice
US5221778A (en) * 1988-08-24 1993-06-22 Yale University Multiplex gene regulation
US5272057A (en) * 1988-10-14 1993-12-21 Georgetown University Method of detecting a predisposition to cancer by the use of restriction fragment length polymorphism of the gene for human poly (ADP-ribose) polymerase
US5175384A (en) * 1988-12-05 1992-12-29 Genpharm International Transgenic mice depleted in mature t-cells and methods for making transgenic mice
US5175383A (en) * 1989-02-17 1992-12-29 President And Fellows Of Harvard College Animal model for benign prostatic disease
US5192659A (en) * 1989-08-25 1993-03-09 Genetype Ag Intron sequence analysis method for detection of adjacent and remote locus alleles as haplotypes
JPH06507782A (ja) * 1990-06-15 1994-09-08 サイオス　ノバ　インコーポレイテッド アルツハイマー病のアミロイド形成開症状を示すヒト以外の組換え哺乳動物
US5288846A (en) * 1990-10-19 1994-02-22 The General Hospital Corporation Cell specific gene regulators
US5298422A (en) * 1991-11-06 1994-03-29 Baylor College Of Medicine Myogenic vector systems
US5360735A (en) * 1992-01-08 1994-11-01 Synaptic Pharmaceutical Corporation DNA encoding a human 5-HT1F receptor, vectors, and host cells

Also Published As

Publication number Publication date
US20040197798A1 (en) 2004-10-07
CA2227306A1 (en) 1997-03-27

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Srinivasan et al. The amino-terminal transforming region of simian virus 40 large T and small t antigens functions as a J domain
Bhattacharya et al. The B subunit of the CCAAT box binding transcription factor complex (CBF/NF-Y) is essential for early mouse development and cell proliferation
Haupt et al. Induction of apoptosis in HeLa cells by trans-activation-deficient p53.
US5801236A (en) Probes for MTS1 gene and polynucleotides encoding mutant MTS1 genes
JPH10513359A (ja) サイクリン依存性キナーゼＣＤＫ４およびＣＤＫ６のインヒビター、ＩｎＫ４ｃ−ｐ１８およびＩｎＫ４ｄ−ｐ１９、ならびにそれらの使用
JP4454670B2 (ja) Ｔｓ１０ｑ２３．３と称する腫瘍抑制因子
JPH09511910A (ja) 腫瘍サプレッサ遺伝子、並びに癌の検出、腫瘍進行のモニタおよび癌処理のための方法
JP2006507807A (ja) ウイルス感染および腫瘍抑制に関与する哺乳動物遺伝子
US5464936A (en) Compositions for identification of papillomavirus replication inhibitors
AU723055B2 (en) Manipulation and detection of protein phosphatase 2C - PP2Calpha - expression in tumor cells for cancer therapy, prevention and detection
US5643727A (en) BCL-2 gene inhibitory element binding factor
KR19990044317A (ko) 아밀포스파타제2Ｃ - ＰＰ 2Ｃα-발현의 조작 및 검출
US20060199781A1 (en) Assays based on BTF3 activity
US7214374B2 (en) 12832, a novel human kinase-like molecule and uses thereof
US5843756A (en) Mouse MTSI gene
US20030157481A1 (en) Diagnosing and treating cancer cells using T-HR mutants and their targets
EP1337640A2 (en) NOVEL RETINA-SPECIFIC HUMAN PROTEINS C7orf9, C12orf7, MPP4 AND F379
KR20010102996A (ko) 메그-4 단백질
WO2001018037A2 (en) A p53-induced protein with a death domain that can promote apoptosis
US20050013803A1 (en) Diagnosing and treating cancer cells using mutant viruses
US20020147996A1 (en) Diagnosing and treating cancer cells using Sal2
US20020018765A1 (en) Diagnosing and treating cancer cells using mutant viruses
Boehm Involvement of the transcription factors ATF-1 and CREB in neoplasia: aspects of gene expression and regulation
JP2002515732A (ja) 細胞周期チェックポイントｐｉｋ関連キナーゼ物質及び方法
WO2002004596A2 (en) Diagnosing and treating cancer cells using mutant viruses

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E601 Decision to refuse application