KR20070007894A - 항비만약 - Google Patents

Abstract

안지오포이에틴 관련 증식 인자(AGF) 또는 그것을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 유효 성분으로서 함유하는 항비만약, 당뇨병 치료약 및/또는 고지혈증 치료약을 개시한다. AGF를 유효 성분으로 하는 비만, 당뇨병 및/또는 고지혈증의 개선 기능을 부여한 기능성 식품 또는 건강 식품을 개시한다. 또한, AGF 또는 그것을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 투여하는 것을 포함하는 비만, 당뇨병 및/또는 고지혈증을 치료 또는 예방하는 방법을 개시한다. 또한, AGF 또는 그것을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 항비만약, 당뇨병 치료약 및/또는 고지혈증 치료약을 제조하기 위한 용도를 개시한다.

안지오포이에틴 관련 증식 인자, AGF, 비만, 당뇨병, 고지혈증

Description

항비만약 {ANTIOBESITY DRUG}

본 발명은 안지오포이에틴 관련 증식 인자(Angiopoietin-Related Growth Factor; 이하, AGF라 함) 또는 그의 유도체 또는 그것을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 유효 성분으로 하는 항비만약에 관한 것이다. 본 발명의 항비만약은 의약품으로서 투여할 수 있을 뿐만 아니라 다양한 형태, 예를 들면 건강 식품(바람직하게는 기능성 식품) 또는 사료로서 음식물의 형태로 제공하는 것도 가능하다.

비만의 유해성은 널리 알려져 있음에도 불구하고 최근에 비만이 현저히 증가하고 있다. 비만, 즉 지방 조직의 과잉 축적이 다채로운 질환의 원인이 되고 있는 것은 주지된 사실이고, 질환으로서의 비만증을 치료 대상으로 하는 것이 제창되었다. 비만을 원인의 하나로서 발증하는 질환으로서, 예를 들면 요통, 무릎관절통 및 변형성 관절증이 있다. 이들 정형외과학적 질환은 비만에 의한 체중 증가가 직접적인 원인이 될 수 있다. 비만에 따른 지방의 과잉 축적은 당뇨병, 고지혈증, 고혈압 또는 동맥 경화성 질환의 원인이 되고 있다. 특히 내장 지방의 축적이 이들 질환 발증에 관여하는 것이 밝혀졌다(비특허 문헌 1).

기본적인 비만 개선 방법으로서는 운동 요법과 식사 요법이 있지만, 어느 것도 계속적인 실시가 곤란하다. 또한, 운동 또는 식사 요법 이외의 개선 방법으로 서는 의약품의 사용이 있고, 현시점에서는 세계적으로 보면 시부트라민과 올리스타트가 주로 사용되고 있다. 그러나, 이들의 효과는 약하며 모두 부작용의 문제가 있다. 일본에서는 마진돌만이 인가되어 있지만, 적용이 고도 비만자에게 한정되어 있으며 투여 기간도 한정되어 있다(비특허 문헌 2).

사회의 근대화에 따라서 일본뿐 아니라 세계적으로 당뇨병 환자는 급증하고 있다. 특히 환자수가 많은 II형 당뇨병은 비만이나 지방의 과잉 축적이 발증에 관여하고 있는 것으로 알려져 있다. II형 당뇨병의 치료로서는 비만증과 동일하게 운동 요법과 식사 요법이 있지만, 계속적인 실시가 곤란하여 의약품이 사용되고 있다. 심한 당뇨병 환자에게는 인슐린 요법이 행해지고 있다. 그러나, 인슐린 요법에는 저혈당의 부작용 위험성이 항상 있다. 경구 혈당 강하약으로서 티아졸리딘계 약제 또는 술포닐우레아(SU)약 등이 많이 사용되고 있다. 그러나, 티아졸리딘계 약제에는 간 장해ㆍ부종ㆍ심부전이라는 부작용이 있고, SU약에는 비만을 조장하는 부작용이 우려되어 안전하고 체중 증가를 수반하지 않는 인슐린 저항성개선약이 강하게 요구되었다(비특허 문헌 3).

비만 당뇨병 환자의 내장 지방에서는 지방 세포의 비대화가 관찰된다. 이 비대화된 지방 세포로부터는 인슐린 저항성을 야기하는 아디포사이토카인류가 생산 및 분비되어 근방의 지방 세포, 근세포 및/또는 간세포에 작용하여 인슐린 저항성을 야기하였다고 생각된다. 이와 같이, 지방 조직은 당뇨병 병태에 있어서 인슐린 저항성을 증강시키는 방향에 관한 조직으로 변화한다(비특허 문헌 4 및 5).

비만이나 당뇨병의 원인이 되는 지방 조직의 축적에 관여하는 인자로서는 레 프틴이 잘 알려져 있다. 레프틴은 체중 증가 억제 호르몬이고, 레프틴을 결실시킴으로써 식욕이 항진되고, 에너지 소비가 감소하여 비만이 되는 것으로 알려져 있다. 이러한 지방 조직의 축적 및 지방 세포의 비대화에 관여하는 인자의 발견은 비만증, 당뇨병 또는 고지혈증 등의 질환의 치료약 개발에 매우 유용하다(비특허 문헌 6).

안지오포이에틴 관련 증식 인자(AGF)는 N 말단측에 코일드-코일(Coiled-coil) 도메인을, C 말단측에 피브리노겐-유사(Fibrinogen-like) 도메인을 갖는 분비 단백질이다. AGF는 특허 문헌 1에서 보고된 NL8과 동일하고, NL8을 CHO 세포에 안정 발현시켜 누드 마우스에게 피하 이식하면, CHO가 종양 형성능을 갖게 되는 것이 보고되었다. 또한, AGF를 K14 프로모터를 이용하여 표피 세포에 강제 발현시킨 트랜스제닉 마우스 등을 이용하여 AGF에 혈관 신생 활성, 표피 세포 증식 활성, 연골 세포 증식 활성, 창상 치유 촉진 활성 및 조직 재생 활성이 있는 것이 개시되었다(특허 문헌 1, 비특허 문헌 7). 그러나, 상기 이외의 AGF의 생리 기능에 대해서는 전혀 발견하지 못하였다.

비특허 문헌 1: 「신진 대사(Metabolism)」, (미국), 1987년, 36권, p.54-59

비특허 문헌 2: 「일본 임상」, 2003년, 61권, 증간호 6, 비만증, p.649-654

비특허 문헌 3: 「일본 임상」, 2002년, 60권, 증간호 9, 신시대의 당뇨병학 3, p.310-331

비특허 문헌 4: 「의학의 행보」, 2000년, 192권, p.513-518

비특허 문헌 5: 「의학의 행보」, 2000년, 192권, p.541-545

비특허 문헌 6: 「트랜즈ㆍ인ㆍ몰레큘러ㆍ메디슨(Trends in Molecular Medicine)」, (네덜란드), 2002년, 8권, 9호, p.442-447

비특허 문헌 7: 「프로시딩ㆍ오브ㆍ더ㆍ내셔널ㆍ아카데미ㆍ오브ㆍ사이언스ㆍ오브ㆍ더ㆍ유나이티드ㆍ스테이트ㆍ오브ㆍ아메리카(Proceedings of the national academy of sciences of the United States of America)」, (미국), 2003년, 100권, p.9494-9499

특허 문헌 1: 국제 공개 WO99/15653호 공보

특허 문헌 2: 국제 공개 WO03/083114호 공보

<발명의 개시>

<발명이 해결하고자 하는 과제>

본 발명의 과제는 신규 항비만약를 제공하는 것에 있다.

<과제를 해결하기 위한 수단>

본 발명자들은 예의 검토한 결과, AGF 녹아웃(KO) 마우스 및 AGF 트랜스제닉(Tg) 마우스의 제조 및 해석에 의해, AGF가 항비만, 항당뇨 및 항고지혈증의 작용을 갖는 것이 밝혀졌다. 즉, AGF 녹아웃 마우스가 현저한 비만을 나타내는 것을 발견하였다(실시예 3). 또한, AGF 녹아웃 마우스는 비만에 따른 지방 조직의 중량이 증가하였고(실시예 4), 지방 세포가 비대화(실시예 5), 비만에서 증가하는 것으로 알려져 있는 골격근 및 간장 조직 중의 트리글리세라이드량이 증가하는 것을 발견하였다(실시예 6). 한편, AGF 트랜스제닉 마우스(CAG-AGF Tg 마우스; 전신에 AGF를 강제 발현한 마우스)는 체중 증가가 억제되었고(실시예 3), 지방 조직의 중량 증가가 억제되며(실시예 4), 지방 세포의 비대화는 억제되고(실시예 5), 골격근 및 간장 조직 중 트리글리세라이드량은 감소(실시예 6)되는 것, 또한 인슐린 감수성의 향상, 및 지질 대사 및 내당능이 개선되는 것(실시예 16 및 실시예 17)을 발견하였다. 또한, AGF 녹아웃 마우스는 고인슐린혈증이 되며 내당능이 악화되는 것이 나타났다(참고예 2). 또한, AGF 발현 아데노바이러스 투여 마우스에 있어서 체중 증가가 억제되고, 또한 내당능이 개선된 것(실시예 15 및 실시예 20), 다른 AGF 트랜스제닉 마우스(K14-AGF Tg 마우스; 표피에 AGF를 강제 발현한 마우스)에 있어서 항비만 작용, 지방 조직 감소 작용, 인슐린 감수성 항진 작용을 갖는 것(실시예 18 및 실시예 19)을 발견하였다.

이들 발견으로부터 AGF는 항비만, 당뇨 및/또는 고지혈증 치료약의 유효 성분이 되는 것을 밝혀 본 발명을 완성시켰다.

즉, 본 발명은

[1] (a) 서열 3으로 표시되는 아미노산 서열에서의 1번 내지 450번의 아미노산으로 이루어지는 서열, 또는 서열 5로 표시되는 아미노산 서열에서의 1번 내지 433번의 아미노산으로 이루어지는 서열을 포함하며, 체중 증가 억제 활성을 갖는 폴리펩티드,

(b) 서열 3으로 표시되는 아미노산 서열에서의 1번 내지 450번의 아미노산으로 이루어지는 서열, 또는 서열 5로 표시되는 아미노산 서열에서의 1번 내지 433번의 아미노산으로 이루어지는 서열에 있어서 1 내지 10개의 아미노산 잔기가 치환, 결실 및/또는 삽입된 아미노산 서열을 포함하며, 체중 증가 억제 활성을 갖는 폴리펩티드,

(c) 서열 3으로 표시되는 아미노산 서열에서의 1번 내지 450번의 아미노산으로 이루어지는 서열, 또는 서열 5로 표시되는 아미노산 서열에서의 1번 내지 433번의 아미노산으로 이루어지는 서열을 코딩하는 DNA와 엄격한 조건하에서 혼성화되는 DNA에 의해 코딩되며, 체중 증가 억제 활성을 갖는 폴리펩티드, 및

(d) 서열 3으로 표시되는 아미노산 서열에서의 1번 내지 450번의 아미노산으로 이루어지는 서열, 또는 서열 5로 표시되는 아미노산 서열에서의 1번 내지 433번의 아미노산으로 이루어지는 서열과의 동일성이 95％ 이상인 아미노산 서열을 포함하며, 체중 증가 억제 활성을 갖는 폴리펩티드

로 이루어지는 군에서 선택되는 폴리펩티드 또는 상기 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 유효 성분으로 하는 항비만약, 당뇨병 치료약 및/또는 고지혈증 치료약.

[2] 상기 폴리펩티드를 유효 성분으로 하는 비만, 당뇨병 및/또는 고지혈증의 개선 기능을 부여한 기능성 식품 또는 건강 식품.

[3] 상기 폴리펩티드 또는 상기 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 비만, 당뇨병 및/또는 고지혈증의 치료 또는 예방이 필요한 대상에게 유효량으로 투여하는 것을 포함하는, 비만, 당뇨병 및/또는 고지혈증을 치료 또는 예방하는 방법.

[4] 상기 폴리펩티드 또는 상기 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 항비만약, 당뇨병 치료약 및/또는 고지혈증 치료약을 제조하기 위한 용도

에 관한 것이다.

본 명세서에서 용어 「트랜스제닉 동물」은 프로모터 및 유전자를 염색체에 도입하여 유전자를 원하는 부분에서 강제 발현시킨 동물을 의미하고, 용어 「녹아웃 동물」은 염색체에 유전자 조작함으로써 특정 유전자의 발현을 결실시킨 동물을 의미하는 것으로서 사용한다.

<발명의 효과>

AGF는 항비만약, 당뇨병 치료약 및/또는 고지혈증 치료약의 유효 성분으로서 유용하다.

도 1은 플라스미드 pBS-loxP-lox71-mAGF-βgeo의 구조를 모식적으로 나타내는 도면이다. 기호 「pro.」 및 「pri.」는 각각 프로모터 및 프라이머를 의미한다.

도 2는 AGF KO 마우스의 체중 변화를 나타내는 그래프이다. 횡축은 주령(주)을, 종축은 체중(g)을 나타낸다. 또한, 기호 「WT」, 「HTR」 및 「HM」은 각각 WT 마우스, 헤테로 KO 마우스 및 호모 KO 마우스를 의미한다.

도 3은 CAG-AGF Tg 마우스(표준식)의 생식기 지방(백색 지방 조직) 중량 변화를 나타내는 그래프이다. 종축은 백색 지방 조직 중량(g)/체중(g)을 나타낸다. 또한, 기호 「WT」 및 「Tg」는 각각 WT 마우스 및 Tg 마우스를 의미한다.

도 4는 CAG-AGF Tg 마우스(고지방식 부하)의 생식기 지방(백색 지방 조직) 중량 변화를 나타내는 그래프이다. 종축은 백색 지방 조직 중량(g)/체중(g)을 나타낸다. 또한, 기호 「WT」 및 「Tg」는 각각 WT 마우스 및 Tg 마우스를 의미한다.

도 5는 AGF KO 마우스의 생식기 지방(백색 지방 조직) 중량 변화(백색 지방 조직 중량)을 나타내는 그래프이다. 종축은 백색 지방 조직 중량(g)을 나타낸다. 또한, 기호 「WT」, 「HTR」 및 「HM」은 각각 WT 마우스, AGF 헤테로 KO 마우스 및 AGF 호모 KO 마우스를 의미한다.

도 6은 AGF KO 마우스의 생식기 지방(백색 지방 조직) 중량 변화(백색 지방 조직 중량/체중)을 나타내는 그래프이다. 종축은 백색 지방 조직 중량(g)/체중(g)을 나타낸다. 또한, 기호 「WT」, 「HTR」 및 「HM」은 각각 WT 마우스, AGF 헤테로 KO 마우스 및 AGF 호모 KO 마우스를 의미한다.

도 7은 CAG-AGF Tg 마우스의 지방 세포의 형태를 나타내는 도면이다. 또한, 기호 「TG」 및 「NTG」는 각각 Tg 마우스 및 WT 마우스를 의미한다.

도 8은 AGF 호모 KO 마우스의 지방 세포의 형태를 나타내는 도면이다.

도 9는 한배새끼 WT 마우스의 지방 세포의 형태를 나타내는 도면이다.

도 10은 CAG-AGF Tg 마우스의 조직(간장) 중 TG 함량을 나타내는 그래프이다. 횡축은 고지방식 부하(개월간)를, 종축은 TG 함량(mg/g 조직)을 나타낸다. 또한, 기호 「WT」 및 「Tg」는 각각 WT 마우스 및 Tg 마우스를 의미한다.

도 11은 CAG-AGF Tg 마우스의 조직(골격근) 중 TG 함량을 나타내는 그래프이다. 횡축은 고지방식 부하(개월간)를, 종축은 TG 함량(mg/g 조직)을 나타낸다. 또한, 기호 「WT」 및 「Tg」는 각각 WT 마우스 및 Tg 마우스를 의미한다.

도 12는 AGF KO 마우스의 조직 중 TG 함량을 나타내는 그래프이다. 종축은 TG 함량(mg/g 조직)을 나타낸다. 또한, 횡축의 기호 「L」및 「SM」은 각각 간장 및 골격근을 의미하고, 기호 「WT」, 「HTR」 및 「HM」은 각각 WT 마우스, 헤테로 KO 마우스 및 호모 KO 마우스를 의미한다.

도 13은 AGF KO 마우스의 당부하 시험의 결과(혈당치)를 나타내는 그래프이다. 횡축은 시간(분)을, 종축은 혈당치(mg/dL)를 나타낸다. 또한, 기호 「WT」 및 「HM」은 각각 WT 마우스 및 호모 KO 마우스를 의미한다.

도 14는 AGF KO 마우스의 당부하 시험의 결과(혈장 인슐린)을 나타내는 그래프이다. 횡축은 시간(분)을, 종축은 혈장 인슐린(ng/mL)을 나타낸다. 또한, 기호 「WT」 및 「HM」은 각각 WT 마우스 및 호모 KO 마우스를 의미한다.

도 15는 CAG-AGF Tg 마우스의 산소 소비량을 나타내는 그래프이다. 횡축에 있어서 레인 1은 「명기(明期)」, 레인 2는 「암기(暗期)」, 레인 3은 「24 시간」이고, 종축은 VO₂(mL/kg/분)를 나타낸다. 또한, 기호 「WT」 및 「Tg」는 각각 WT 마우스 및 Tg 마우스를 의미한다.

도 16은 마우스 AGF 발현 아데노바이러스 투여 마우스의 당대사 시험의 결과를 나타내는 그래프이다. 검은 원은 mAGF-Adeno 투여 마우스의 결과이고, 흰 원은 Cont-Adeno 투여 마우스의 결과이다. 또한, 횡축은 경과 시간(분)이고, 종축은 혈당치(mg/dL)이다.

도 17은 고지방식으로 사육한 CAG-AGF Tg 마우스 및 한배새끼 WT 마우스의 혈장 중 인슐린 농도(종축; ng/mL)를 나타내는 그래프이다. 기호 「TG」 및 「NTG」는 각각 CAG-AGF Tg 마우스 및 한배새끼 WT 마우스를 의미한다.

도 18은 고지방식으로 사육한 CAG-AGF Tg 마우스 및 한배새끼 WT 마우스의 혈청 콜레스테롤 농도(종축; mg/dL)를 나타내는 그래프이다. 기호 「TG」 및 「NTG」는 각각 CAG-AGF Tg 마우스 및 한배새끼 WT 마우스를 의미한다.

도 19는 고지방식으로 사육한 CAG-AGF Tg 마우스 및 한배새끼 WT 마우스의 혈청 유리 지방산 농도(종축; μEq/L)를 나타내는 그래프이다. 기호 「TG」 및 「NTG」는 각각 CAG-AGF Tg 마우스 및 한배새끼 WT 마우스를 의미한다.

도 20은 CAG-AGF Tg 마우스 및 한배새끼 WT 마우스의 당대사 시험의 결과를 나타내는 그래프이다. 기호 「TG」 및 「NTG」는 각각 CAG-AGF Tg 마우스 및 한배새끼 WT 마우스를 의미한다. 또한, 횡축은 경과 시간(분)이고, 종축은 혈당치(mg/dL)이다.

도 21은 CAG-AGF Tg 마우스 및 한배새끼 WT 마우스의 인슐린 감수성 시험의 결과를 나타내는 그래프이다. 기호 「TG」 및 「NTG」는 각각 CAG-AGF Tg 마우스 및 한배새끼 WT 마우스를 의미한다. 또한, 횡축은 경과 시간(분)이고, 종축은 인슐린 투여 전의 혈당치에 대한 투여 후의 혈당치의 비율(％)이다.

도 22는 K14-AGF Tg 마우스 및 한배새끼 WT 마우스에 있어서의 내장 지방 조직 중량을 나타내는 그래프이다. 기호 「K14-AGF」 및 「NTG」는 각각 K14-AGF Tg 마우스 및 한배새끼 WT 마우스를 의미한다. 또한, 종축은 체중당 내장 지방 조직 중량의 백분율(％)이다.

도 23은 K14-AGF Tg 마우스 및 한배새끼 WT 마우스에 있어서의 피하 지방 조직 중량을 나타내는 그래프이다. 기호 「K14-AGF」 및 「NTG」는 각각 K14-AGF Tg 마우스 및 한배새끼 WT 마우스를 의미한다. 또한, 종축은 체중당 피하 지방 조직 중량의 백분율(％)이다.

도 24는 K14-AGF Tg 마우스 및 한배새끼 WT 마우스의 인슐린 감수성 시험의 결과를 나타내는 그래프이다. 기호 「K14-AGF」 및 「NTG」는 각각 K14-AGF Tg 마우스 및 한배새끼 WT 마우스를 의미한다. 또한, 횡축은 경과 시간(분)이고, 종축은 인슐린 투여 전의 혈당치에 대한 투여 후의 혈당치의 비율(％)이다.

도 25는 인간 AGF 발현 아데노바이러스 투여 마우스의 당대사 시험의 결과를 나타내는 그래프이다. 검은 원은 hAGF-Adeno 투여 마우스의 결과이고, 흰 원은 Cont-Adeno 투여 마우스의 결과이다. 또한, 횡축은 경과 시간(분)이고, 종축은 혈당치(mg/dL)이다.

<발명을 실시하기 위한 최선의 형태>

[1] 본 발명의 의약

본 발명의 항비만약, 당뇨병 치료약 및/또는 고지혈증 치료약(이하, 총칭하여 본 발명의 의약이라 함)은 하기 (a) 내지 (d)로 이루어지는 군에서 선택되는 폴리펩티드 또는 상기 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 중 1개 이상을 유효 성분으로서 함유할 수 있다:

(a) 서열 3으로 표시되는 아미노산 서열에서의 1번 내지 450번의 아미노산으 로 이루어지는 서열, 또는 서열 5로 표시되는 아미노산 서열에서의 1번 내지 433번의 아미노산으로 이루어지는 서열을 포함하며, 체중 증가 억제 활성을 갖는 폴리펩티드,

(b) 서열 3으로 표시되는 아미노산 서열에서의 1번 내지 450번의 아미노산으로 이루어지는 서열, 또는 서열 5로 표시되는 아미노산 서열에서의 1번 내지 433번의 아미노산으로 이루어지는 서열에 있어서 1 내지 10개의 아미노산 잔기가 치환, 결실 및/또는 삽입된 아미노산 서열을 포함하며, 체중 증가 억제 활성을 갖는 폴리펩티드,

(c) 서열 3으로 표시되는 아미노산 서열에서의 1번 내지 450번의 아미노산으로 이루어지는 서열, 또는 서열 5로 표시되는 아미노산 서열에서의 1번 내지 433번의 아미노산으로 이루어지는 서열을 코딩하는 DNA와 엄격한 조건하에서 혼성화되는 DNA에 의해 코딩되며, 체중 증가 억제 활성을 갖는 폴리펩티드, 및

(d) 서열 3으로 표시되는 아미노산 서열에서의 1번 내지 450번의 아미노산으로 이루어지는 서열, 또는 서열 5로 표시되는 아미노산 서열에서의 1번 내지 433번의 아미노산으로 이루어지는 서열과의 동일성이 95％ 이상인 아미노산 서열을 포함하며, 체중 증가 억제 활성을 갖는 폴리펩티드.

또한, 본 명세서에 있어서의 「항비만약」에는 비만 환자의 치료를 위해 사용하는 약제 및 비만 경향이 있는 대상에게 예방적으로 사용하는 약제가 둘다 포함된다. 또한, 본 명세서에 있어서의 「당뇨병 치료약」에는 당뇨병 환자의 치료를 위해 사용하는 약제 및 당뇨병 경향이 있는 대상에게 예방적으로 사용하는 약제가 둘다 포함된다. 또한, 본 명세서에 있어서의 「고지혈증 치료약」에는 고지혈증인 환자의 치료를 위해 사용하는 약제 및 고지혈증 경향이 있는 대상에게 예방적으로 사용하는 약제가 둘다 포함된다.

본 발명의 의약의 유효 성분인 폴리펩티드로서는, 서열 3으로 표시되는 아미노산 서열에서의 1번 내지 450번의 아미노산으로 이루어지는 서열로 이루어지는 인간 AGF, 또는 서열 5로 표시되는 아미노산 서열에서의 1번 내지 433번의 아미노산으로 이루어지는 서열로 이루어지는 마우스 AGF가 바람직하다.

서열 3으로 표시되는 아미노산 서열은 인간 AGF 전구체의 아미노산 서열이다. 인간 AGF는 N 말단에 시그널 서열(-20 내지 -1)을 가지고 세포밖에 분비 발현될 때에 시그널 서열이 절단된다. 시그널 서열이 절단된 서열 3으로 표시되는 아미노산 서열에서의 1번 내지 450번의 아미노산으로 이루어지는 서열로 이루어지는 인간 성숙 AGF가 생리 활성을 갖는다.

동일하게, 서열 5로 표시되는 아미노산 서열은 마우스 AGF 전구체의 아미노산 서열이다. 마우스 AGF는 N 말단에 시그널 서열(-24 내지 -1)을 가지고 세포밖에 분비 발현될 때에 시그널 서열이 절단된다. 시그널 서열이 절단된 서열 5로 표시되는 아미노산 서열에서의 1번 내지 433번의 아미노산으로 이루어지는 서열로 이루어지는 마우스 성숙 AGF가 생리 활성을 갖는다.

본 발명의 의약의 유효 성분으로서 이용할 수 있는 상기 폴리펩티드(b), 즉 서열 3으로 표시되는 아미노산 서열에서의 1번 내지 450번의 아미노산으로 이루어지는 서열, 또는 서열 5로 표시되는 아미노산 서열에서의 1번 내지 433번의 아미노 산으로 이루어지는 서열에 있어서 1 내지 10개(예를 들면, 1 내지 수개)의 아미노산 잔기가 치환, 결실 및/또는 삽입된 아미노산 서열을 포함하며, 체중 증가 억제 활성을 갖는 폴리펩티드로서는, 상기 각 서열에서 바람직하게는 1 내지 7개, 보다 바람직하게는 1 내지 5개의 아미노산 잔기가 치환, 결실 및/또는 삽입된 아미노산 서열을 포함하며, 체중 증가 억제 활성을 갖는 폴리펩티드를 들 수 있다.

폴리펩티드의 기능을 유지하기 위해서, 치환되는 아미노산은 치환 전의 아미노산과 유사한 성질을 갖는 아미노산인 것이 바람직하다. 예를 들면, 이하에 나타낸 바와 같은 각 그룹에 속하는 아미노산은 그 그룹내에서 서로 유사한 성질을 갖는 아미노산이다. 이들 아미노산을 그룹내의 다른 아미노산에 치환하더라도 단백질의 본질적인 기능은 손상되지 않는 경우가 많다. 이러한 아미노산의 치환은 보존적 치환이라고 불리고, 폴리펩티드의 기능을 유지하면서 아미노산 서열을 변환하기 위한 수법으로서 공지되어 있다.

비극성 아미노산: Ala, Val, Leu, Ile, Pro, Met, Phe 및 Trp

비하전성 아미노산: Gly, Ser, Thr, Cys, Tyr, Asn 및 Gln

산성 아미노산: Asp 및 Glu

염기성 아미노산: Lys, Arg 및 His

어떤 폴리펩티드가 체중 증가 억제 활성을 갖는가 아닌가에 대한 판정 방법은 특별히 한정되는 것은 아니지만, 예를 들면 실시예 3에 기재된 방법에 의해서 확인할 수 있다. 즉, 상기 폴리펩티드를 코딩하는 유전자를 이용하여 제조한 트랜스제닉 동물을 표준식 또는 고지방식으로 사육하고, 그의 체중 변동을 야생형 동물 과 비교함으로써 확인할 수 있다. 또한, 실시예 15 또는 실시예 20에 기재된 방법에 의해서 확인할 수 있다. 즉, 상기 폴리펩티드를 발현하는 아데노바이러스를 표준식 또는 고지방식으로 사육한 마우스에게 투여하고, 그의 체중 변동을 대조군 아데노바이러스를 투여한 경우와 비교함으로써 확인할 수 있다.

본 발명의 의약의 유효 성분으로서 이용할 수 있는 상기 폴리펩티드(c)에 있어서의 「엄격한 조건」으로서는, 혼성화를 위한 조건으로서 「5 x SSPE, 5 x 덴하트(Denhard's)액, 0.5％ 도데실황산나트륨(SDS), 40％ 포름아미드, 200 ㎍/mL 연어 정자 DNA, 37 ℃ 밤새」 정도의 조건이고, 보다 엄격한 조건으로서는 「5 x SSPE, 5 x 덴하트액, 0.5％ SDS, 50％ 포름아미드, 200 ㎍/mL 연어 정자 DNA, 42 ℃ 밤새」 정도의 조건이다. 또한, 세정을 위한 조건으로서 온화한 조건으로서는 「5 x SSC, 1％ SDS, 42 ℃」이고, 통상적인 조건으로서 「0.5 x SSC, 0.1％ SDS, 42 ℃」 정도의 조건이고, 보다 엄격한 조건으로서는 「0.2 x SSC, 0.1％ SDS, 65 ℃」 정도의 조건이다. 또한, 5 x SSPE의 조성은 50 mmol/L 인산나트륨(pH 7.4), 0.75 mol/L NaCl 및 5 mmol/L EDTA이고, 5 x SSC의 조성은 0.75 mol/L NaCl 및 75 mmol/L 시트르산나트륨(pH 7.0)이다.

본 발명의 의약의 유효 성분으로서 이용할 수 있는 상기 폴리펩티드(d)에 있어서의 상기 동일성은 적어도 95％ 이상이지만, 97％ 이상의 동일성을 나타내는 것이 바람직하다. 또한, 아미노산 서열의 동일성은 BLAST 검색 알고리즘을 이용하여 결정할 수 있다. 구체적으로는 BLAST 패키지(sgi32bit판, 버젼 2.0.12; NCBI로부터 입수)의 b12seq 프로그램[Tatiana A. Tatusova, Thomas L. Madden, FEMS Microbiol Lett. 174: 247-250(1999)]를 이용하여 디폴트 파라미터에 따라서 산출할 수 있다. 페어와이즈 얼라인먼트 파라미터로서 프로그램명 blastp, Gap 삽입 Cost값을 0, Gap 신장 Cost값을 0, Query 서열의 필터로서 SEG, Matrix로서 BLOSUM62를 사용할 수 있다.

본 발명의 의약의 유효 성분으로서 이용할 수 있는 폴리펩티드로서는 상기 폴리펩티드(a) 내지 (d)의 N 말단측에 시그널 서열을 포함하는 것이 바람직하다. 시그널 서열로서는 폴리펩티드의 막 통과를 선도하는 서열이라면 한정되지 않고, 예를 들면 문헌[Biochemistry, 28(3), 923-930, 1989]에 기재된 시그널 서열을 사용할 수 있다. 보다 바람직하게는 상기 폴리펩티드(a) 내지 (d)의 N 말단측에 서열 3으로 표시되는 아미노산 서열에서의 시그널 서열(-20 내지 -1) 또는 서열 5로 표시되는 아미노산 서열에서의 시그널 서열(-24 내지 -1)을 포함하는 것이 바람직하고, 서열 3으로 표시되는 아미노산 서열 또는 서열 5로 표시되는 아미노산 서열이 가장 바람직하다.

본 발명의 의약의 유효 성분으로서 이용할 수 있는 폴리펩티드의 기원은 인간 또는 마우스로 한정되지 않는다. 상기 폴리펩티드(a) 내지 (d) 중 어느 것에 해당하는 한, 예를 들면 인간 또는 마우스 이외의 생물 유래의 폴리펩티드도 또한 서열 3으로 표시되는 아미노산 서열에서의 1번 내지 450번의 아미노산으로 이루어지는 서열, 또는 서열 5로 표시되는 아미노산 서열에서의 1번 내지 433번의 아미노산으로 이루어지는 서열을 기초로 하여 유전자 공학적으로 인위적으로 개변한 폴리펩티드도 본 발명의 의약의 유효 성분으로서 사용할 수 있다.

또한, 상기 폴리펩티드는 재조합체인 것이 바람직하다.

상기 폴리펩티드(a) 내지 (d)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 즉 본 발명의 의약의 유효 성분으로서 이용할 수 있는 폴리뉴클레오티드에는 DNA 및 RNA가 포함되고, DNA인 것이 바람직하다. 상기 폴리뉴클레오티드로서는 예를 들면 서열 2로 표시되는 염기 서열에서의 61번 내지 1410번의 염기로 이루어지는 서열, 또는 서열 4로 표시되는 염기 서열에서의 73번 내지 1371번의 염기로 이루어지는 서열을 포함하며, 체중 증가 억제 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 들 수 있다. 바람직하게는 서열 2로 표시되는 염기 서열 또는 서열 4로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드, 또는 서열 2로 표시되는 염기 서열에서의 61번 내지 1410번의 염기로 이루어지는 서열, 또는 서열 4로 표시되는 염기 서열에서의 73번 내지 1371번의 염기로 이루어지는 서열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드이다.

본 발명에는 상기 폴리펩티드(a) 내지 (d) 또는 상기 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 1개 이상을, 비만, 당뇨병 및/또는 고지혈증의 치료 또는 예방이 필요한 대상에게 유효량으로 투여하는 것을 포함하는 비만, 당뇨병 및/또는 고지혈증을 치료 또는 예방하는 방법이 포함된다. 또한, 본 발명에는 상기 폴리펩티드(a) 내지 (d) 또는 상기 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 항비만약, 당뇨병 치료약 및/또는 고지혈증 치료약을 제조하기 위한 용도가 포함된다.

본 발명의 의약인 폴리펩티드의 투여 방법으로서는 예를 들면 정제, 환제, 캡슐제, 과립제, 세립제, 산제 또는 경구 용액제 등에 의한 경구 투여, 또는 정맥 주사 또는 근육 주사 등의 주사제, 좌제, 경피 투여제, 또는 경점막 투여제 등에 의한 비경구 투여를 들 수 있다. 특히 효소의 영향을 받는 폴리펩티드에 있어서는 경피 투여나 정맥 주사 등의 비경구 투여로 하거나, 또는 소화 효소의 영향이 적은 소화관의 하부(예를 들면, 공장, 회장, 결장 또는 대장)에 상기 폴리펩티드가 분해되지 않고 송달되는 제제(製劑) 기술을 이용하는 것이 바람직하다.

상기 폴리펩티드(a) 내지 (d)를 유효 성분으로 하는 제제는 폴리펩티드의 제제화에 통상적으로 이용되는 약리학상 허용되는 담체나 부형제, 그 밖의 첨가제를 이용하여 의약 조성물로서 제조될 수 있다.

비경구 투여를 위한 주사제로서는 무균의 수성 또는 비수성의 용액제, 현탁제 또는 유탁제를 포함한다. 수용성 용액제나 현탁제에는 희석제로서 예를 들면 주사용 증류수 또는 생리용 식염수 등이 포함된다. 비수용성 용액제 또는 현탁제의 희석제로서는 예를 들면 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 올리브유와 같은 식물유, 에탄올과 같은 알코올류 또는 폴리소르베이트 80 등을 포함한다. 상기 조성물은 습윤제, 유화제, 분산제, 안정화제, 용해 또는 용해 보조제, 또는 방부제 등을 더 포함할 수 있다. 조성물은, 예를 들면 박테리아 보류 필터를 통과시키는 여과, 살균제의 배합 또는 조사에 의해서 무균화된다. 또한, 무균의 고체 조성물을 제조하여 사용시에 무균수 그 밖의 무균용 주사용 매체에 용해시켜 사용할 수도 있다.

본 발명의 의약에는 비만, 당뇨병 및/또는 고지혈증의 치료 또는 예방에 있어서 의도되는 효과를 발휘하는데 충분한, 즉 치료적 유효량 또는 약리학적 유효량 의 상기 폴리펩티드(a) 내지 (d)가 포함된다. 실제 투여에 있어서의 유효량의 확인은 예를 들면 표적 질환의 회복 정도를 측정함으로써 행할 수 있다. 실제로 투여되어야 되는 양은 처치되는 개체의 증상, 연령, 체중 등의 다양한 요인에 의존하고, 바람직하게는 원하는 효과가 현저한 부작용을 수반하지 않고 발휘되는 양이 결정되어 투여된다. 이러한 유효량 또한 독성 등에 대하여는 당업자라면 공지된 모델 동물을 이용하여 용이하게 결정할 수 있다. 예를 들면, 통상적으로 성인에 있어서 유효 성분의 양이 1 일 1 ㎍ 내지 2 g이 바람직하다. 더욱 바람직하게는 1 일 1 ㎍ 내지 200 mg이다.

또한, 상기 폴리펩티드 대신에 그것을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 유전자치료에 있어서 항비만약, 당뇨병 치료약 및/또는 고지혈증 치료약으로서 투여할 수도 있다. 일반적으로 유전자 치료에 있어서의 투여 형태는 크게 비-바이러스 벡터를 이용하는 방법과 바이러스 벡터를 이용하는 방법으로 분류된다[『별책 실험 의학 유전자 치료의 기초 기술』 요도사(1996); 『별책 실험 의학 유전자 도입 & 발현 해석 실험법』 요도사(1997); 일본 유전자 치료학회편 『유전자 치료 개발 연구 핸드북』 NTS(1999)].

비-바이러스 벡터에 의한 방법으로서는 예를 들면 내포형 리포솜에 의한 방법, 정전기형 리포솜에 의한 방법, HVJ-리포솜[J. Clin. Invest. 93: 1458-1464(1994) 등]을 이용하는 방법, 수용체 개재성 도입법, 파티클 건으로 금속 입자등의 담체와 함께 세포에 도입하는 방법, 플라스미드의 직접 도입법 또는 정전하 중합체에 의한 도입법 등을 조직으로의 유전자 도입법으로서 들 수 있다. 세포로 의 유전자 도입법으로서는 예를 들면 리포펙션, 인산-칼슘 공침법, DEAE-덱스트란법 또는 미소 유리관을 이용한 DNA의 직접 주입법 등이 공지되어 있다.

바이러스 벡터로서는 레트로바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터 또는 아데노 수반 바이러스 벡터가 알려져 있다. 구체적으로는, 예를 들면 무독화한 레트로바이러스, 아데노바이러스 , 아데노 수반 바이러스, 헤르페스 바이러스, 백시니아 바이러스, 폭스 바이러스, 폴리오 바이러스, 신비스 바이러스, SV40, HIV 또는 센다이 바이러스 등의 DNA 또는 RNA 바이러스에 상기 폴리펩티드(a) 내지 (d)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 도입하여 세포를 바이러스 감염시킴으로써 세포내에 유전자를 도입할 수 있다.

상기 폴리펩티드(a) 내지 (d)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 항비만약, 당뇨병 치료약 또는 고지혈증 치료약은 직접 체내로의 유전자의 도입을 행하는 생체내(in vivo)법 및 체외로 취출된 세포에 유전자 도입하여 유전자가 도입된 세포를 체내로 복귀시키는 생체외(ex vivo)법 중 어느 방법에 의해서 투여할 수 있다.

생체내 투여를 위한 제제 형태로서는 주사나 점적에 사용할 수 있는 액제를 들 수 있다. 액제의 제조는 구체적으로는, 예를 들면 인산 완충 생리 식염수(PBS) 등의 완충액, 생리 식염수 또는 멸균수 등의 용제에 용해시킨 후, 필요에 따라서 필터 여과 등에 의해 멸균하여 무균적인 용기에 충전한다. 필요에 따라서 현탁제, 동결제 또는 원심 분리 농축 동결제 등의 형태로 할 수도 있다. 또한, 상기 폴리뉴클레오티드는 예를 들면 지방, 지방유, 라놀린, 바셀린, 왁스, 유동 파라핀, 경 고제, 플라스틱, 글루콜류, 고급 알코올, 수지, 글리세린, 유화제 또는 현탁제를 포함하는 반고형의 연고로서 환부에 국소 투여할 수 있다. 이러한 연고는 필요에 따라서 친수성 중합체와 혼합하여 시트상으로 성형하여 환부에 대하여 접착시켜 이용할 수도 있다.

상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 항비만약, 당뇨병 치료약 또는 고지혈증 치료약의 투여는 질환의 종류, 증상에 따른 적당한 방법ㆍ부위를 선택하여 행해진다. 투여 방법으로서는 비경구 투여가 바람직하다. 구체적으로는, 예를 들면 피하, 피내, 혈관내, 근육내 및 연고 등에 의한 표층으로의 투여가 가능하다. 피하, 피내, 혈관, 근육 등으로의 투여는 주사나 카테터 등에 의해 행할 수 있다.

본 발명의 의약에는 비만, 당뇨병 및/또는 고지혈증의 치료 또는 예방에 있어서 의도되는 효과를 발휘하는 데 충분한, 즉 치료적 유효량 또는 약리학적 유효량의 상기 폴리펩티드(a) 내지 (d)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 포함된다. 실제 투여에 있어서의 유효량의 확인은 예를 들면 표적 질환의 회복 정도를 측정함으로써 행할 수 있다. 실제로 투여되어야 하는 양은 처치되는 개체의 증상, 연령, 체중 등의 다양한 요인에 의존하고, 바람직하게는 원하는 효과가 현저한 부작용을 수반하지 않고 발휘되는 양이 결정되어 투여된다. 이러한 유효량 또한 독성 등에 대해서는 당업자라면 공지된 모델 동물을 이용하여 용이하게 결정할 수 있다. 예를 들면 통상적으로 성인에 있어서 유효 성분의 양이 1 일 0.1 ㎍ 내지 200 mg이 바람직하다. 더욱 바람직하게는 1 일 0.1 ㎍ 내지 20 mg이다.

[2] 본 발명의 건강 식품

본 발명에 있어서의 유효 성분인 상기 폴리펩티드(a) 내지 (d)는 의약품으로서 투여할 수 있을 뿐 아니라 다양한 형태, 예를 들면 건강 식품(바람직하게는 기능성 식품) 또는 사료로서 음식물의 형태로 제공하는 것도 가능하다. 또한, 상기 식품에는 음료가 포함된다.

본 명세서에 있어서 「건강 식품」이란, 건강하게 어떠한 효과를 제공하거나 또는 효과를 기대할 수 있는 식품을 의미하고, 「기능성 식품」이란, 상기 「건강 식품」 중에서도 다양한 생체 조절 기능(예를 들면, 소화기계, 순환기계, 내분비계, 면역계 또는 신경계 등의 생리 계통의 조절 기능)을 충분히 발현할 수 있도록 설계 및 가공된 식품을 의미한다.

본 발명의 건강 식품으로서는 비만, 당뇨병 및/또는 고지혈증의 치료 기능을 갖는 것이 바람직하다.

「비만, 당뇨병 및/또는 고지혈증의 개선 효과를 갖는 것을 특징으로 하는 상기 폴리펩티드(a) 내지 (d)의 폴리펩티드 함유 식품용 조성물」 및 「비만, 당뇨병 및/또는 고지혈증의 개선 효과를 갖는 것을 특징으로 하는 상기 폴리펩티드(a) 내지 (d)의 폴리펩티드 함유 기능성 식품 소재」도 본 발명에 포함된다. 상기 폴리펩티드(a) 내지 (d)의 폴리펩티드 함유 식품용 조성물은 식품에 사용 가능한 담체, 그 밖의 첨가제를 포함할 수 있다.

본 발명의 건강 식품은 유효 성분으로서 상기 폴리펩티드(a) 내지 (d)를 함유하는 것 이외에는 일반적인 건강 식품과 동일하게 제조할 수 있다. 예를 들면, 식품으로서 섭취 가능한 물질에 유효량의 상기 유효 성분을 함유시킴으로써 본 발 명의 건강 식품을 제조할 수 있다. 상기 유효량은 식품의 형상 또는 종류, 또는 그것을 섭취하는 개체의 증상, 연령, 체중 등의 다양한 요인에 따라서 적절하게 결정할 수 있다. 예를 들면, 통상적으로 성인에 있어서 유효 성분의 양이 1 일 1 ㎍ 내지 2 g이 바람직하다. 더욱 바람직하게는 1 일 1 ㎍ 내지 200 mg이다.

이하, 실시예에 의해 본 발명을 구체적으로 설명하지만, 이들은 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다. 또한, 특별히 언급이 없는 경우에는 공지된 방법(「Molecular Cloning」, Sambrook, J. 등, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989년 등)에 따라서 실시 가능하다. 또한, 시판용 시약이나 키트를 이용하는 경우에는 시판품의 지시서에 따라서 실시 가능하다.

녹아웃 동물 및 트랜스제닉 동물의 제조에 대해서는 특별히 언급이 없는 경우에는 [Manipulating the Mouse Embryo. A Laboratory Manual. 2nd Edition, B. Hogan, R. Beddington, F. Costantini, E. Lacy, Cold Spring Harbor, New York, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1994]에 따라서 ES 세포를 이용한 키메라 마우스 제조에 대해서는 [AL Joyner: Gene Targeting, A Practical Approach, OXFORD UNIVERSITY PRESS, 1993] 또는 [바이오매뉴얼 시리즈 8, 진 타게팅 ES 세포를 이용한 변이 마우스의 제조, 아이자와 신이치 저서, 요도사, 1994]에 따라서 실시 가능하다.

<<참고예 1: AGF KO 마우스의 제조>>

(1) 타게팅 벡터의 제조

마우스 AGF 유전자의 5'측의 게놈 서열(5' 롱 아암(long arm)), pgk 프로모터, 네오마이신 내성 유전자, 마우스 AGF 유전자의 엑손(exon) 2의 일부와 엑손 3을 포함하는 게놈 서열(3' 쇼트 아암(short arm)) 및 HSV-tk 유전자를 순서대로 갖는 타게팅 벡터를 이하의 방법으로 제조하였다.

즉, WO03/083114호 공보의 실시예 1과 동일하게 제조한 마우스 AGF의 단백질코드 영역 전장에 대응하는 cDNA를 프로브로 하여, 첨부 매뉴얼에 따라서 마우스 게노믹 라이브러리(Mouse Genomic, 129 SVJ Library; 스트라타진사)의 스크리닝을 행하고, 약 17.9 kbp의 서열(AGF 유전자를 포함하는, mouse-pub-genome 서열 ACO73775.2의 90644 내지 108544)을 갖는 파지 클론을 단리하여 플라스미드 pBluescript(스트라타진사)에 서브클로닝하였다. 이 플라스미드 클론(pBN2)을 제한 효소 SalI 및 MfeI로 절단함으로써 약 6.2 kbp의 5' 롱 아암(mouse-pub-genome 서열 ACO73775.2의 90664 내지 96900을 포함함)을 잘라내었다. 또한, 상기 플라스미드 pBN2를 주형으로 하여 서열 6(CTAGACTAGTTGCAAAGGCGTGCGGCGG 인공 서열) 및 서열 7(CTAGACTAGTGGATCCGCAGGCTTGCTTTGACTTAC 인공 서열)로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 프라이머 셋트를 이용하여 PCR을 행하여 약 2.0 kbp의 3' 쇼트 아암(mouse-pub-genome 서열 ACO73775.2의 105903 내지 107914를 포함함)을 얻었다. 5' 롱 아암 및 3' 쇼트 아암을 각각 플라스미드 pPNT(Cell, 1991, 65(7), 1153-1163)의 XhoI 사이트 및 XbaI 사이트에 삽입하여 타게팅 벡터를 완성하였다.

(2) 상동 재조합 ES 세포의 취득

얻어진 타게팅 벡터를 제한 효소 NotI로 절단하여 ES 세포주 R1(Proceedings of the National Academy of Sciences, Vol 90, 8424-8428, 1993)에 전기 천공법으로 도입하였다. G418을 포함한 배지에서 ES 세포를 배양하여 내성주를 얻었다. ES 세포로부터 DNA를 추출하여 상동 재조합이 일어난 클론을 서던 블롯 해석에 의해서 동정하였다. 구체적으로는 AGF의 엑손 4와 엑손 5를 포함하는, 서열 8

마우스)로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 DNA를 프로브로 하고, 제한 효소 HindIII으로 절단한 DNA를 이용하여 서던 블롯 해석을 행하였다. 그 결과, 야생형의 4.6 Kb에 대하여 상동 재조합에서는 6.5 Kb의 DNA 단편을 검출할 수 있었다.

(3) AGF KO 마우스의 제조

얻어진 ES 세포주를 C57BL/6 마우스와 DBA/2 마우스 교잡 제2대인 BDF2 마우스로부터 얻은 배반포에 마이크로인젝션하여 조작된 배를 자궁에 이식하였다. 조작된 배를 이식하여 임신한 마우스로부터 키메라 마우스를 출산시켰다. 키메라 마우스를 C57BL/6 마우스와 교배함으로써 AGF의 개시 코돈을 결실한 변이 대립유전자 를 갖는 헤테로접합체 마우스(이하, AGF 헤테로 KO 마우스라 함)를 얻었다. AGF 헤테로 KO 마우스끼리의 교배에 의해 호모접합체 마우스(이하, AGF 호모 KO 마우스라 함)를 얻었다. 새끼 마우스의 꼬리로부터 단리한 게놈 DNA를 주형으로 하여 PCR을 행하고, 마우스의 유전자형을 PCR에 의해 생기는 DNA 단편의 크기에 의해서 확인하였다. 즉, 꼬리를 프로테이나제 K로 처리하여 DNA를 페놀ㆍ클로로포름 추출하였다. 추출한 DNA는 이소프로판올 침전 및 에탄올 침전에 의해서 회수하여 트리스-EDTA 완충액(이하, TE 용액이라 함)에 용해시켰다. 네오마이신 내성 유전자 서열 및 타게팅에 의해 결실하는 게놈 서열에 기초하여 다음 염기 서열로 이루어지는 프라이머를 디자인하였다.

(네오마이신 내성 유전자)

포워드 프라이머: 서열 9(5'-agaggctattcggctatgac-3' 인공 서열)

리버스 프라이머: 서열 1O(5'-caccatgatattcggcaagc-3' 인공 서열)

(게놈 DNA)

포워드 프라이머: 서열 11(5'-tggcctctgttatcatgctc-3' 마우스)

리버스 프라이머: 서열 12(5'-ctacctacatccactcctac-3' 마우스)

얻어진 새끼 마우스 유래 게놈 DNA에 대하여 상기 프라이머를 이용하여 PCR을 행하였다. PCR은 DNA 폴리머라제(ExTaq; Takara사)를 이용하여 95 ℃(5 분간)의 열 변성을 행한 후, 95 ℃(1 분간), 60 ℃(1 분간) 및 72 ℃(1 분간)로 이루어지는 사이클을 30 사이클 실시하고, 또한 72 ℃(7 분간)의 신장 반응을 행하여 증폭되는 단편의 크기를 조사하였다. 변이 대립유전자가 있는 경우에는 네오마이신 내성 유전자를 검출하는 PCR에서 545 bp의 밴드가 검출되고, 야생형 대립유전자가 있는 경우에는 마우스 AGF 엑손 1을 포함하는 게놈 DNA를 검출하는 PCR에서 322 bp의 밴드가 검출된다. 이들 결과로부터 마우스의 유전자형을 판정하였다. 그 결과, AGF 호모 KO 마우스에서는 변이 대립유전자의 밴드가 검출되고 야생형 대립유전자의 밴드가 검출되지 않으며, AGF 헤테로 KO 마우스에서는 변이 대립유전자의 밴드와 야생형 대립유전자의 밴드가 함께 검출되며, 야생형 마우스[이하, 한배새끼(Littermate) WT 마우스라 함]에서는 변이 대립유전자의 밴드가 검출되지 않고 야생형 대립유전자의 밴드가 검출되었다.

또한, 상기 참고예 1(2)의 서던 블롯 해석을 행하는 것으로도 마우스의 유전자형을 조사하였다. 그 결과, AGF 호모 KO 마우스에서는 변이 대립유전자의 6.5 kbp의 밴드가 검출되고, AGF 헤테로 KO 마우스에서는 변이 대립유전자의 6.5 kbp의 밴드와 야생형 대립유전자의 46 kbp의 밴드가 함께 검출되며, 한배새끼 WT 마우스에서는 야생형 대립유전자의 4.6 kbp의 밴드가 검출되었다.

또한, AGF KO 마우스로부터 채혈한 혈액을 37 ℃에서 30 분간 정치 후, 원심분리하고, 그의 상청으로부터 혈청을 얻었다. 혈청을 라이시스(lysis) 버퍼[0.5 mol/L HEPES(pH 7.2), 1％ Triton X-100, 10％ 글리세롤, 10 mmol/L Na₄P₂O₇, 0.1 mol/L NaF, 0.1 mmol/L Na₃VO₄, 4 mmol/L EDTA(pH 8), 0.05 mg/mL 아프로티닌, 1 mmol/L PMSF, 0.1 mmol/L 류펩틴, 0.025 mmol/L 펩스타인 A]로 20배 희석한 것을 2×SDS 샘플 버퍼로 배량 희석하였다. 1 레인당 20 μL를 10％ 아크릴아미드 겔로 써 전기 영동을 행하여 웨스턴 블롯팅을 행하였다. 웨스턴 블롯팅은 블로킹제로서 5％ 소혈청 알부민(BSA) 함유 TBS-T[20 mmol/L Tris-HCl(pH 7.5), 150 mmol/L NaCl, 0.05％(w/v) Tween 20]를 1차 항체로서 항 마우스 AGF 항체(WO03/083114호 공보)를, 2차 항체로서 항 토끼 항체(ALI3404; BIO SourCE사)를 3％ BSA 함유 TBS-T로 5000배로 희석한 것을 각각 사용하였다. AGF 호모 KO 마우스에서는 AGF의 밴드가 결실된 것으로부터 AGF의 결손을 확인하였다.

<<실시예 1: CAG-AGF Tg 마우스의 제조)

본 실시예에서는 CAG(modified chicken beta-actin promoter with CMV-IE enhancer) 프로모터[GENE, 108(1991)193-200] 제어하에서 전신에 마우스 AGF를 강제 발현시킨 AGF 트랜스제닉 마우스(이하, CAG-AGF Tg 마우스라 함)를 제조하였다. 플라스미드 pBluescriptII KS(+)(스트라타진사)의 멀티클로닝 사이트에 CAG 프로모터(1.7 kb), lox71 서열, 블라스토사이진 유전자(bsr), 폴리 A 시그널 서열(0.5 kb), loxP 서열, 마우스 AGF cDNA 서열 및 IRES(internal ribosomal entry site)-β-geo-폴리 A 서열(4.5 kb)을 순서대로 삽입한 플라스미드를 이하의 방법으로 제조하였다.

마우스 AGF 전장 cDNA(WO03/083114호 공보)를 주형으로, 서열 13(AGAAGCTTCACCATGGGGACCGCCAGGCTAC 인공 서열) 및 서열 14(CCGTCGACATTAGATCTTCACAAGCGCAAGCCGGGTC 인공 서열)로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 DNA를 프라이머 셋트로 하여 PCR(95 ℃에서 10 분간의 반응 후, 94 ℃에서 15 초간, 60 ℃에서 30 초간 및 72 ℃에서 2 분간으로 이루어지는 반응을 45 사 이클 실시)을 행하고, 얻어진 PCR 산물을 pZErO-2 클로닝 벡터(인비트로젠사)에 서브클로닝하였다. 얻어진 플라스미드를 제한 효소 HindIII과 SalI로 절단하고, 플라스미드 pBluescriptII SK(스트라타진사)의 HindIII과 SalI 사이트에 삽입하여 마우스 AGF 전장 유전자를 갖는 플라스미드 pBS-mAGF를 제조하였다. 다음에, 플라스미드 pBS-mAGF에 IRES-β-geo-폴리 A 유전자를 도입하기 위해서, 이 유전자를 갖는 플라스미드 pU-San(Hum Mol Genet 8:387-396, 1999)을 제한 효소 SalI과 BglII로 절단하여 IRES-β-geo-폴리 A 유전자를 잘라내고, pBS-mAGF의 BglII와 SalI 사이트에 삽입하여 마우스 AGF cDNA 서열 및 IRES-β-geo-폴리 A 서열을 갖는 플라스미드 pBS-mAGF-βgeo를 제조하였다.

CAG 프로모터, lox71 서열, bsr 및 폴리 A 시그널 서열을 갖는 플라스미드 pCAGlox71bsr(Nucleic Acids Res. 1997; 25(4): 868-872)의 폴리 A 시그널의 3'측에 loxP 서열을 삽입하여 bsr과 polyA 시그널을 lox71 서열과 loxP 서열 사이에 끼운 구조를 갖는 플라스미드를 제조하였다. 즉, loxP를 포함하는 인산화(kination) 처리한 81 bp의 단편(서열 15:

GATCCGGAACCCTTAATATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTATTAGGTCCCTCGACCTGCAGCCCGGGGGATC: 인공 서열)을 제한 효소 SmaI에 의해 절단 후 BAP(bacterial alkaline phosphatase) 처리한 플라스미드 pCAGlox71bsr에 삽입하여 플라스미드 loxP-lox71을 제조하였다. 플라스미드 loxP-lox71에 삽입된 loxP 서열을 확인하기 위해서, T3 프라이머(서열 16: AATTAACCCTCACTAAAGGG)를 이용하여 시퀸싱을 행하고, 삽입된 loxP 서열을 포함하는 영역의 염기 서열을 조사하였다. 그 결과, T3 프라이머로 읽은 염기 서열이 상기 서열 15로 표시되는 염기 서열과 일치하여 loxP와 lox71이 동일한 방향인 것을 확인하였다. 플라스미드 loxP-lox71을 제한 효소 SpeI로 절단하고, 얻어진 CAG 프로모터, lox71 서열, bsr, 폴리 A 시그널 서열 및 loxP 서열을 포함하는 단편을 플라스미드 pBS-mAGF-βgeo의 SpeI 사이트에 삽입하여 목적하는 플라스미드 pBS-loxP-lox71-mAGF-βgeo를 제조하였다. 얻어진 플라스미드 pBS-loxP-lox71-mAGF-βgeo의 구조를 도 1에 나타낸다. 이 플라스미드를 제한 효소 NotI로 절단하여 직쇄 DNA 단편[CAG 프로모터(promoter), lox71 서열, bsr, 폴리 A 시그널 서열(pA), loxP 서열, 마우스 AGF cDNA 서열 및 IRES-β-geo-폴리 A 서열(pA)을 포함함]을 얻었다.

Tr2 ES 세포[Anal. Biochem., 1993, 214(1): 70 내지 76]에 전기 천공법으로 상기 직쇄 DNA 단편을 도입하였다(0.8 V, 3 μF). 4 ㎍/mL 블라스토사이진 존재하에서 ES 세포를 배양하고, 유전자가 도입된 세포를 선택하여 20개의 클론을 수립하였다. 이들 세포에 CAG-Cre 벡터(Blood, 1326-1333, Vol100, 2002)를 서클 그대로 전기 천공법으로 도입하였다(0.8 V, 3 μF).

CAG 프로모터에 의해 발현한 Cre 리콤비나제가 lox71-loxP 사이의 유전자를 제거하면, AGF 및 β-geo가 CAG 프로모터 활성에 의해 발현한다. 따라서, β-geo 발현 클론을 선택하기 위해서, G418(200 ㎍/mL) 존재하에서 ES 세포를 배양하여 lox71-loxP 사이가 제거된 유전자 구조를 갖는 세포를 선택하였다. 이 단계에서 선택된 15개의 클론의 세포는 CAG 프로모터(1.7 kb), lox71 서열, 마우스 AGF cDNA 서열 및 IRES-β-geo-폴리 A 서열(4.5 kb)을 가지고, CAG 프로모터의 제어하에 AGF 가 항상적으로 발현되는 ES 세포가 된다. CAG-Cre 벡터를 도입하기 전의 lox71-loxP 사이가 제거되지 않은 각 클론의 ES 세포를 네거티브 대조군으로 하여, 선택된 15개의 클론의 ES 세포에서 AGF가 발현된 것을 참고예 1(3)과 동일한 항 AGF 항체를 이용한 웨스턴 블롯팅으로 확인하였다. 즉, ES 세포를 라이시스 버퍼 및 2×SDS 샘플 버퍼로 2배 희석한 것을 샘플로 하여 웨스턴 블롯팅을 행하고, AGF가 발현된 것을 확인하였다. AGF의 발현을 확인한 ES 세포 중에서 8-1, 8-2 및 9-1의 3 라인을 선택하고, 이것을 각 배반포에 마이크로인젝션하여 조작된 배를 자궁에 이식하였다. 조작된 배를 이식하여 임신한 마우스로부터 키메라 마우스를 출산시켰다. 키메라 마우스를 C57BL/6 마우스와 교배함으로써 CAG 프로모터의 제어하에서 AGF가 항상적으로 발현되는 트랜스제닉 마우스를 얻었다. 트랜스제닉 마우스를 동정하기 위해서, 새끼 마우스의 꼬리로부터 단리한 게놈 DNA를 주형으로 하여 PCR을 행하였다. 꼬리를 프로테이나제 K로 처리하고, DNA를 페놀ㆍ클로로포름 추출하였다. 추출한 DNA는 이소프로판올 침전 및 에탄올 침전에 의해서 회수하여 TE 용액에 용해시켰다.

마우스 AGF cDNA 서열 및 LacZ 서열에 기초하여 다음 염기 서열로 이루어지는 프라이머를 디자인하였다.

(AGF)

포워드 프라이머: 서열 17(5'-cccactacgacagcttctcc-3' 마우스)

리버스 프라이머: 서열 18(5'-agccgggtcaacataacagc-3' 마우스)

(LacZ)

포워드 프라이머: 서열 19(5'-gcgttacccaacttaatcg-3' 인공 서열)

리버스 프라이머: 서열 20(5'-tgtgagcgagtaacaacc-3' 인공 서열)

이 프라이머를 이용하여 PCR을 행하면, 도입 유전자에서는 AGF cDNA를 검출하는 PCR에서 325 bp 단편이 증폭되고, LacZ를 검출하는 PCR에서는 320 bp 단편이 증폭되며, 마우스 게놈 DNA에서는 이들 크기의 단편은 증폭되지 않을 것이다. 상기 프라이머를 이용하여 얻어진 새끼 마우스 유래 게놈 DNA에 대하여 PCR을 행하였다. PCR은 DNA 폴리머라제(ExTaq; Takara사)를 이용하여 94 ℃(5 분간) 열 변성을 행한 후, 94 ℃(1 분간), 62 ℃(1 분 30 초간) 및 72 ℃(1 분 30 초간)로 이루어지는 사이클을 28 사이클 실시하고, 또한 72 ℃(7 분간)의 신장 반응을 행하여 증폭되는 단편의 크기를 조사하였다. 그 결과, 3 라인 모두 AGF cDNA를 검출하는 PCR 및 LacZ를 검출하는 PCR 모두 밴드가 확인되었다. 즉, 3 라인 모두 배선(germline) 전달을 확인하고, 각각 CAG 프로모터의 제어하에서 AGF가 항상적으로 발현되는 트랜스제닉 마우스인 것이 확인되었다.

<<실시예 2: CAG-AGF Tg 마우스의 AGF 유전자 발현>>

실시예 1에서 제조한 CAG-AGF Tg 마우스에서 AGF 유전자가 어느 정도 발현하고 있는 가를 조사하였다. CAG-AGF Tg 마우스 및 동배의 야생형 마우스(한배새끼 WT 마우스)의 백색 지방(WAT), 갈색 지방(BAT), 대뇌, 소뇌, 시상 하부, 심장, 간장, 신장, 비장, 골격근 및 췌장의 각 조직으로부터 트리졸 시약(Invitrogen사)을 이용하여 총 RNA를 제조하였다. 시판용 RNA 정제 시약(RNeasy; 키아겐사) 및 DNase(키아겐사)를 이용하여 총 RNA를 DNase 처리 및 클린업하였다. DNase 처리한 총 RNA 0.5 ㎍을 수퍼스크립트ㆍ퍼스트 스트랜드 시스템(RT-PCR용)(LIFE TECHNOLOGIES사)을 이용하여 cDNA로 변환하였다.

AGF 및 내부 표준의 18S 리보좀 RNA(18SrRNA)의 발현량은 정량 PCR법으로 행하였다. 정량 PCR은 시켄스 디텍션 시스템(ABI PRISM 7900HT Sequence Detection System; Applied Biosystems사)을 이용하여 리얼 타임의 형광량을 계측함으로써 측정하였다. 주형으로서 cDNA를, 프라이머로서 각 유전자마다 디자인한 프라이머 및 택맨 프로브(TaqMan probe)를 사용하였다. AGF 유전자의 발현량 측정에는 프라이머로서 서열 21(TCGTGTAGTAGCCGTGTGGTGT 마우스)과 서열 22(CACCTGATGCACAGGTTCCA 마우스)를 이용하고, PCR 시약으로서 시판용 시약(SYBR 그린 PCR 마스터 믹스(SYBR Green PCR Master Mix); 어플라이드 바이오시스템즈사)을 이용하여 PCR을 행하였다. 18SrRNA의 발현량 측정에는 프라이머로서 서열 23(TGGTTGATCCTGCCAGTAG 마우스)과 서열 24(CGACCAAAGGAACCATAACT 마우스)를, 택맨 프로브로서 서열 25(CCGGTACAGTGAAACTGCGAATG 마우스)를 이용하고, PCR 시약으로서 시판용 시약(택맨 유니버셜 PCT 마스터 믹스(TaqMan Universal PCR Master Mix); 어플라이드 바이오시스템즈사)을 사용하여 PCR을 행하였다.

PCR의 반응은 95 ℃(10 분간)의 초기 변성 반응을 실시한 후, 94 ℃(15 초간)과 60 ℃(60 초간)로 이루어지는 사이클 반응을 45회 반복함으로써 실시하였다. 유전자 발현량 산출의 표준 곡선은 상기 cDNA 또는 마우스 게놈 DNA를 주형으로서 이용하여 동일한 반응을 행하고, 유전자의 발현량은 샘플간의 상대치로 산출하였다.

그 결과, CAG-AGF Tg 마우스의 조직에서는 WT 마우스의 조직에 비해 AGF 유전자의 발현량이 상승된 것을 알았다. 특히 골격근, BAT, 심장에서의 발현 상승이 현저하였다.

<<실시예 3: 유전자 개변 마우스의 체중 변화>>

(1) CAG-AGF Tg 마우스의 체중 변화

CAG-AGF Tg 마우스를 C57BL/6에 2세대 재교배하여 F2의 CAG-AGF Tg 마우스를 얻었다. CAG-AGF Tg 마우스 및 한배새끼 WT 마우스를 표준식(CE-2; 구레아사)으로 통상적으로 사육하였다. 6 주령의 암컷 마우스의 체중을 비교한 결과, CAG-AGF Tg 마우스는 15.7 g±0.8 g(SD), WT 마우스는 17.8 g±0.5 g(SD)이고, 12 주령의 암컷 마우스의 체중을 비교한 결과, CAG-AGF Tg 마우스는 19.5 g±0.7 g(SD), WT 마우스는 23.5 g±2.5 g(SD)이고, CAG-AGF Tg 마우스의 경우가 체중이 적은 것을 알았다.

다음에, 동일 마우스를 계속해서 고지방식 부하하여 체중의 변동을 조사하였다. 고지방식(high fat diet 32; 구레아사)으로 통상적으로 12 주간 사육하여 체중의 변동을 조사하였다. 그 결과, 12 주간의 체중 증가량이 CAG-AGF Tg 마우스는 7.1 g±1 g(SD)인 것에 대하여 WT 마우스는 21.8 g±4 g(SD)이었다. 이로부터, CAG-AGF Tg 마우스에서는 표준식에 의한 체중 증가 억제, 고지방식에 의한 현저한 체중 증가 억제가 있는 것이 알았고, AGF에 체중 증가 억제 작용이 있는 것을 알았다.

(2) AGF KO 마우스의 체중 변화

AGF 호모 KO 마우스, AGF 헤테로 KO 마우스 및 한배새끼 WT 마우스를 표준식 으로 통상적으로 사육하였다. 1 주간마다 24 주령까지 각 마우스의 체중을 측정하였다. 결과를 도 2에 나타낸다. 도 2에 나타낸 바와 같이, AGF 호모 KO 마우스에서는 약 12 주령부터 WT 마우스에 비해 체중이 무거워지기 시작하고, 그 후에도 체중 증가가 계속되어 현저한 비만이 되는 것을 알았다. AGF 헤테로 KO 마우스에서는 AGF 호모 KO 마우스와 한배새끼 WT 마우스의 중간적인 표현형이 되었다.

<<실시예 4: 유전자 개변 마우스의 장기 중량 변화>>

(1) CAG-AGF Tg 마우스의 장기 중량 변화

CAG-AGF Tg 마우스에서는 체중 증가가 억제된 것을 알았지만, 그 원인을 밝히기 위해서 장기의 중량을 측정하였다. CAG-AGF Tg 마우스 및 한배새끼 WT 마우스의 생식기 지방(WAT), 갈색 지방(BAT), 간장, 심장, 신장 및 비장의 각 조직을 채취하여 체중당 조직 중량을 계측하였다. 표준식으로 사육한 12 주령의 마우스와 고지방식으로 12 주령 내지 24 주령의 12 주간 사육한 마우스에서 조사하였다. 그 결과, 갈색 지방, 간장, 심장, 신장 및 비장에서는 표준식 사용 및 고지방식 사육 모두 CAG-AGF Tg 마우스와 WT 마우스에서 조직 중량의 변화는 없었다. 한편, 생식기 지방(백색 지방 조직)은 표준식 사육 및 고지방식 사육 모두 CAG-AGF Tg 마우스의 경우가 WT 마우스보다 체중당 조직 중량이 감소되었다. 즉, CAG-AGF Tg 마우스에서 체중 증가가 억제되었던 것은 백색 지방 조직의 중량 증가가 억제되었기 때문인 것으로 나타났다. 즉, AGF는 다른 장기 중량에는 전혀 영향을 주지 않고, 비만 등에 따른 지방 조직 중량의 증가를 억제하는 작용이 있는 것을 알았다. 백색 지방 조직에 관한 결과를 도 3(표준식) 및 도 4(고지방식 부하)에 나타낸다.

(2) AGF KO 마우스의 장기 중량 변화

AGF KO 마우스에서는 체중이 증가한 것을 알았지만, 그 원인을 밝히기 위해서 장기의 중량을 측정하였다. 표준식으로 사육한 20 주령 암컷의 AGF 호모 KO 마우스, AGF 헤테로 KO 마우스 및 한배새끼 WT 마우스의 생식기 지방(WAT), 갈색 지방(BAT), 간장, 심장, 신장 및 비장의 각 조직을 채취하고, 체중당 조직 중량을 계측하였다. 그 결과, 갈색 지방, 간장, 심장, 신장 및 비장은 AGF 호모 KO 마우스, AGF 헤테로 KO 마우스 및 WT 마우스에서 조직 중량의 변화는 없었다. 한편, 생식기 지방은 AGF 호모 KO 마우스의 경우가 WT 마우스보다 마우스 개체당 및 체중당 조직 중량이 증가하였다. AGF 헤테로 KO 마우스는 AGF 호모 KO 마우스와 WT 마우스의 중간적인 조직 중량이 되었다. 즉, AGF KO 마우스에서 체중이 증가한 것은 생식기 지방 조직 등의 백색 지방 조직의 중량이 증가하였기 때문인 것으로 나타났다. 이로부터, AGF KO 마우스는 CAG-AGF Tg 마우스와 반대의 표현형이 되는 것이 밝혀졌고, AGF의 생리 활성으로서 다른 장기 중량에는 영향을 주지 않고 지방 조직의 중량 증가 억제 작용이 있는 것이 명확해졌다. 생식기 지방 조직(백색 지방 조직)에 관한 결과를 도 5(백색 지방 조직 중량) 및 도 6(백색 지방 조직 중량/체중)에 나타낸다.

<<실시예 5: 유전자 개변 마우스의 지방 세포 형태 변화>>

(1) CAG-AGF Tg 마우스의 지방 세포 형태 변화

고지방식을 부하함으로써 백색 지방 조직의 중량이 증대하고, 또한 지방 세포가 비대화되는 것이 알려져 있다. 지방 세포의 비대화는 당뇨병의 악성화와 관 련이 있는 것이 알려져 있기 때문에(의학의 행보, 192, 513-518, 2000; 의학의 행보, 192, 541-545, 2000), CAG-AGF Tg 마우스의 지방 세포의 형태를 조사하였다. 고지방식으로 12 주령 내지 24 주령의 12 주간 사육한 CAG-AGF Tg 마우스 및 한배새끼 WT 마우스의 생식기 지방 조직을 채취하여 10％ 중성 완충 포르말린액(Wako)으로 고정하고, 파라핀 포매(包埋) 후, 박절 절편의 제조 및 헤마톡실린 에오진(H&E) 염색을 행하였다. 결과를 도 7에 나타낸다. 한배새끼 WT 마우스(NTG)에서는 지방 세포가 비대화되었지만, CAG-AGF Tg 마우스(TG)에서는 지방 세포의 비대화가 억제되어 거의 정상의 크기로 유지되었다.

(2) AGF KO 마우스의 지방 세포 형태 변화

당뇨병 모델 마우스나 비만 모델 마우스에서는 지방 조직의 중량 증대에 따라서 지방 세포가 비대화되는 것이 알려져 있다[Diabetologia, 14(3), 141-148, 1978]. 지방 세포의 비대화는 당뇨병의 악성화와 관련이 있는 것이 알려져 있기 때문에 AGF KO 마우스의 지방 세포의 형태를 조사하였다. AGF 호모 KO 마우스 및 한배새끼 WT 마우스의 생식기 지방 조직(WAT) 및 갈색 지방 조직(BAT)을 채취하여 10％ 중성 완충 포르말린액으로 고정하고, 파라핀 포매 후, 박절 절편의 제조 및 헤마톡실린 에오진(H&E) 염색을 행하였다. 결과를 도 8(AGF 호모 KO 마우스) 및 도 9(한배새끼 WT 마우스)에 나타낸다. 한배새끼 WT 마우스의 WAT는 지방 세포가 정상 크기였지만, AGF 호모 KO 마우스의 WAT는 지방 세포가 비대화된 것을 알았다. 또한, AGF 호모 KO 마우스에서는 한배새끼 WT 마우스에 비해 BAT에서의 지방 축적이 관찰되었다.

<<실시예 6: 유전자 개변 마우스의 조직 중 트리글리세라이드 함량 변화>>

(1) CAG-AGF Tg 마우스의 조직 중 트리글리세라이드 함량 변화

비만에서는 지방 조직의 증대에 부가적으로 골격근이나 간장 중에서의 트리글리세라이드(TG) 함량의 증가가 일어나는 것이 알려져 있다(일본 임상, 1995년, 53권, 1995년 특별호, 비만증, p354-p358). 따라서, CAG-AGF Tg 마우스의 골격근(배복근) 및 간장 조직 중의 TG 함량을 조사하였다. CAG-AGF Tg 마우스(Tg) 및 한배새끼 WT 마우스(WT)를 고지방식(high fat diet 32; 구레아사)로 1개월간 및 3개월간 사육하고, 각 마우스의 골격근 및 간장 조직으로부터 클로로포름-메탄올 용액을 이용하여 조직 중의 TG를 추출하였다(생화학 실험 강좌 3, 지질의 화학, 도꾜 가가꾸 동인). 추출한 TG의 농도를 키트(트리글리세라이드 E 테스트 와꼬; 와코 쥰야쿠 고교사)를 이용하여 측정하고, 조직 중의 TG 함량을 구하였다. 결과를 도 10(간장) 및 도 11(골격근)에 나타낸다. 골격근와 간장 모두 CAG-AGF Tg 마우스는 WT 마우스에 비해 조직 중의 TG 함량이 감소된 것을 알았다. 이로부터, 비만에 의해서 증가하는 것이 알려져 있는 골격근이나 간장 중의 TG 함량을, AGF가 감소시키는 활성이 있는 것이 밝혀졌다.

(2) AGF KO 마우스의 조직 중 TG 함량

AGF KO 마우스의 골격근(배복근) 및 간장 조직 중의 TG 함량을 조사하였다. AGF KO 마우스 및 한배새끼 WT 마우스의 골격근 및 간장 조직으로부터 상기 (1)의 방법으로 조직 중의 TG를 추출하였다. 추출한 TG의 농도를 키트(트리글리세라이드 E 테스트 와꼬; 와코 쥰야쿠 고교사)를 이용하여 측정하고, 조직 중의 TG 함량을 구하였다. 결과를 도 12에 나타낸다. AGF KO 마우스는 WT 마우스에 비해 골격근 및 간장 조직 중의 TG 함량이 현저히 증가한 것을 알았다. AGF KO 마우스는 CAG-AGF Tg 마우스와 반대의 표현형이 되는 것을 알았고, AGF의 생리 활성으로서 골격근이나 간장 중의 TG 함량을 감소시키는 활성이 있는 것이 밝혀졌다.

<<참고예 2: AGF KO 마우스의 혈당치 및 혈중 인슐린 농도 변화>>

AGF 호모 KO 마우스 및 한배새끼 WT 마우스의 당부하 시험을 행하여 혈당치 및 혈중 인슐린 농도를 조사하였다. 마우스를 16 시간 절식 후, 1 g/kg의 D-글루코스를 복강내 주사(ip)에 의해 투여하고, 투여 전 및 투여 후 15, 30, 60 및 120 분 후에 안정맥으로부터 채혈하였다. 글루테스트 에이스(산와 가가꾸 겡뀨쇼)를 이용하여 혈당치를, RIA2 항체법(SRL사)을 이용하여 혈중 인슐린 농도를 측정하였다. 결과를 도 13(혈당치) 및 도 14(혈장 인슐린)에 나타낸다.

WT 마우스는 당부하에 의해 상승한 혈당치가 투여 후 30 분 후에 감소하기 시작하는 것에 대하여, AGF 호모 KO 마우스는 당부하에 의해 혈당치가 보다 크게 상승하고, 투여 후 60 분 후에도 혈당치는 감소하기 시작하지 않았다. 이로부터, AGF 호모 KO 마우스에서는 내당능 이상이 일어난 것을 알았다. 혈중 인슐린 농도는 WT 마우스에서는 당부하에 의해 인슐린 농도가 상승하였지만, AGF 호모 KO 마우스에서는 당부하 전부터 혈중 인슐린 농도가 현저히 높은 값이고, 고인슐린혈증 상태에 있는 것을 알았다. 이로부터, AGF 유전자를 결실한 AGF 호모 KO 마우스에서는 당뇨병이 야기되는 것을 알았고, AGF에 항당뇨병 작용이 있는 것이 밝혀졌다.

<<실시예 7: CAG-AGF Tg 마우스의 산소 소비량>>

CAG-AGF Tg 마우스 및 한배새끼 WT 마우스의 산소 소비량을 측정하였다. 산소 소비량 측정 장치(OXYMAX; Columbus Instruments사)를 이용하여 절식하에서 마우스의 산소 소비량을 24 시간에 걸쳐 계측하였다. 계측 방법은 산소 소비량 측정 장치에 첨부된 취급 설명서에 따랐다. CAG-AGF Tg 마우스 및 한배새끼 WT 마우스 각 14 마리의 산소 소비량을 계측하고, 명기의 12 시간(7:00 내지 19:00), 암기의 12 시간(19:00 내지 7:00) 및 24 시간의 산소 소비량을 구하여 CAG-AGF Tg 마우스와 WT 마우스 사이에서 비교하였다. 결과를 도 15에 나타낸다. 어느 시간대에서도 CAG-AGF Tg 마우스의 산소 소비량(VO₂)이 WT 마우스에 비해 많은 것을 알았다. 이 결과, AGF에는 산소 소비량을 항진하는 활성이 있는 것을 알았다. 산소 소비량과 에너지 소비량은 상관이 있기 때문에, 산소 소비량이 항진됨으로써 항비만 작용이 있다[FEBS Letters, 491(1-2): 154-158, 2001]. AGF에는 산소 소비량을 항진하는 활성이 있는 것을 알았기 때문에, AGF에는 항비만 작용이 있는 것이 뒷받침되었다.

<<실시예 8: CAG-AGF Tg 마우스의 조직 중의 유전자 발현 변동>>

CAG-AGF Tg 마우스의 갈색 지방 조직(BAT) 및 골격근에서의 UCP(Uncoupling Protein) 유전자 및 PPAR(Peroxisome Proliferator-Activated Receptor) 유전자의 발현 변동을 조사하였다. CAG-AGF Tg 마우스 및 한배새끼 WT 마우스의 BAT 및 골격근 조직으로부터 실시예 2와 동일한 방법으로 총 RNA를 제조하고, DNase 처리 후 cDNA 합성하였다. UCP1, UCP3, PPAR-α, PPAR-δ 및 β-액틴의 발현량은 정량 PCR 법으로 행하였다. 정량 PCR은 실시예 2에 기재된 방법과 동일한 방법으로 실시하였다. 각 유전자의 정량 PCR에서 이용한 프라이머로서는 표 1에 기재된 프라이머를 이용하였다. 또한, 시판용 PCR 시약으로서 β-액틴에 대해서는 SYBR 그린 PCR 마스터 믹스(어플라이드 바이오시스템즈)를 UCP1, UCP3, PPAR-α 및 PPAR-δ에 대해서는 택맨 유니버셜 PCT 마스터 믹스(어플라이드 바이오시스템즈)를 사용하였다.

유전자	포워드 프라이머	리버스 프라이머	택맨 프라이머
UCP1	서열 26	서열 27	서열 28
UCP2	서열 29	서열 30	서열 31
PPAR-α	서열 32	서열 33	서열 34
PPAR-δ	서열 35	서열 36	서열 37
β-액틴	서열 38	서열 39	사용하지 않음

그 결과, CAG-AGF Tg 마우스의 BAT에서는 UCP1이 발현 유도된 것, CAG-AGF Tg 마우스의 골격근에서는 UCP3, PPAR-α 및 PPAR-δ가 발현 유도된 것을 알았다. 즉, AGF는 BAT에서는 UCP1을 발현 유도시키고, 골격근에서는 UCP3, PPAR-α 및 PPAR-δ를 발현 유도시키는 것을 알았다. 이로부터, AGF에 의한 열 소비를 항진시키는 UCP의 발현 항진, 열 소비나 지질 대사를 항진시키는 PPAR의 발현 항진이 AGF에 의한 산소 소비량의 항진, 체중 증가 억제 및 지방 조직 중량 증가 억제 등의 작용 메카니즘 중 하나인 것이 밝혀졌다.

<<실시예 9: 마우스 AGF와 인간 AGF의 발현 및 정제>>

인간 AGF 및 마우스 AGF를 WO03/083114호 공보(실시예 19)에 기재된 방법에 따라서 발현하여 정제하였다. 즉, PCR에 의해 얻어진 약 1.4 kbp(인간) 또는 약1.3 kbp(마우스)의 DNA 단편을 플라스미드 pcDNA-Signal-FLAG에 삽입하여 얻어진 발현 플라스미드를 HEK293 세포에 도입하였다. 인간 AGF 및 마우스 AGF의 발현 세포주의 배양 상청을 항 FLAG-M2 모노클로날 항체 아가로스 어피니티 겔(ANTI-FLAG M2 Monoclonal Antibody Agarose Affinity Gel; Sigma사)을 이용하여 어피니티 정제하여 인간 및 마우스의 리콤비넌트 AGF 단백질을 얻었다.

<<실시예 10: 마우스 AGF 발현 아데노바이러스의 제조>>

마우스 AGF의 전장 cDNA를 함유하는 플라스미드 pCR2.1-mNew(WO03/083114호 공보의 실시예 1에서 제조)를 주형으로 하고, 포워드 프라이머(AATCTAGACACCATGGGGACCGCCAGGCTACG; 서열 40)와 리버스 프라이머(AAGCGGCCGCCAAGCGCACAAGCCGGGTCAA: 서열 41)를 사용하여 PCR(pfuDNA 폴리머라제를 이용하여 95 ℃ 10 분간 후, 94 ℃ 15 초, 60 ℃ 30 초, 72 ℃ 2 분의 사이클을 45회)을 실시하였다. 얻어진 PCR 산물을 pCR4Blunt-TOPO(인비트로젠사 제조)에 서브클로닝 후, 제한 효소 XbaI과 NotI로 절단하여 XbaI과 NotI로 절단한 C 말단 FLAG 부가형 발현 벡터 pCEP4dE2-FLAG(WO02/42448호 공보의 실시예 2와 동일하게 제조)에 삽입하여 pCEPdE2-mAGF-FLAG를 얻었다. PCEPdE2-mAGF-FLAG를 주형으로 하고, 포워드 프라이머(GAAGATCTACCATGGGGACCGCCAGGCTACGC; 서열 42)와 리버스 프라이머(CCGCTCGAGTGATGGGACAGTCACAAGCGC: 서열 43)를 사용하여 PCR(PyroBest DNA 폴리머라제를 이용하여 95 ℃ 2 분간 후, 98 ℃ 20 초, 60 ℃ 30 초, 72 ℃ 1 분 30 초의 사이클을 20회, 계속해서 72 ℃ 7 분)을 실시하였다. 얻어진 PCR 산물을 pCR4Blunt-TOPO(인비트로젠사 제조)에 서브클로닝 후, 제한 효소 BglII와 XhoI로 절단하여 생긴 약 1.4 kbp의 DNA 단편을 아데노바이러스 제조용 서틀 벡터 pAdTrack-CMV(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 2509-2514, 1998)의 BglII, XhoI 부위에 삽입하여 pAdTracK-CMV-mAGF를 완성시켰다. 이 플라스미드 또는 대조군으로서 pAdTrack-CMV(빈 벡터)를 이용하여 바이러스 입자를 제조하였다. 구체적으로는 이하의 방법에 의해 제조하였다.

대장균 BJ5183(stratagene사 제조)를 플라스미드 pAdEasy-1(HeT. -C. 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95, 2509-2514, 1998)로 형질변형시켜 플라스미드 pAdEasy-1을 포함하는 대장균 BJ5183[이하, 대장균 BJ5183(pAdEasy-1)이라 함]을 제조하였다. 앞서 제조한 플라스미드 pAdTracK-CMV-mAGF 또는 pAdTrack-CMV를 제한 효소 PmeI로 절단하고, 이것을 이용하여 대장균 BJ5183(pAdEasy-1)을 형질변형시켰다. 플라스미드 pAdEasy-1과 플라스미드 pAdTracK-CMV-mAGF 또는 pAdTrack-CMV가 리콤비네이션한 클론을 선택하기 위해서, 얻어진 형질변형의 클론으로부터 플라스미드를 제조하여 제한 효소 PacI에 의한 절단 패턴을 조사하였다. 3 kb 또는 4.5 kb의 엑스트라 밴드(extra band)가 출현하는 클론을 선택함으로써, 플라스미드의 아암 부위에서 디자인 그대로 리콤비네이션를 일으킨 클론을 얻었다.

얻어진 바이러스 입자 농도는 WO02/42448호 공보의 실시예 15와 동일한 방법으로 구하였다.

<<실시예 11: 아데노바이러스를 이용한 마우스 AGF 단백질의 발현>>

실시예 10에서 제조한 마우스 AGF 단백질 발현 아데노바이러스 및 pAdTrack-CMV 대조군 아데노바이러스를 인간 태아 신장 세포주 293(ATCC 번호: CRL-1573)에 세포 1개당 약 100개의 바이러스 입자가 되도록 감염시켰다. 구체적으로는 I형 콜라겐으로 코팅한 6웰 플레이트(아사히테크노글래스)에 3×10⁵로 293개 세포를 시딩하고, 2 mL의 10％ FBS/페니실린 100 IU/mL, 스트렙토마이신 100 ㎍/mL/DMEM 배지에서 하룻밤 배양한 후, 아데노바이러스 6×10⁷ 입자를 첨가하여 하룻밤 배양하며, 2 mL의 페니실린 100 IU/mL, 스트렙토마이신 100 ㎍/mL/DMEM 배지로 치환하였다. 감염 후 2 일째에 배양 상청을 회수하여 3,000 회전/분으로 5 분간의 원심 분리를 행하고, 상청을 겔 농도 4 내지 20％의 농도 구배 겔(다이이찌 가가꾸 야꾸힝)에서 SDS 폴리아크릴아미드 겔 전기 영동(SDS-PAGE)을 실시하였다. 1차 항체로서 항 마우스 AGF 항체(WO03/083114호 공보의 실시예 5에서 제조), 2차 항체로서 서양 고추냉이 퍼옥시다아제 표지 염소 항 토끼 IgG 폴리클로날 항체(Biosource사 제조)를 이용한 웨스턴 블롯팅을 행하였다. 대조군 아데노바이러스에 의해 감염시킨 상청을 샘플로 한 경우에는 검출되지 않고, 마우스 AGF 단백질 발현 아데노바이러스에 의해 감염시킨 상청을 샘플로 한 경우에만, 예상되는 마우스 AGF 분자량에 밴드가 검출되어, 실시예 10에서 제조한 마우스 AGF 단백질 발현 아데노바이러스에 의해 실시예 11의 방법으로 마우스 AGF 단백질이 발현되는 것을 알았다.

<<실시예 12: 인간 AGF 발현 아데노바이러스의 제조>>

인간 AGF의 전장 cDNA를 함유하는 플라스미드(WO03/083114호 공보의 실시예 18에서 제조; 이하, pCR2.1-hNew)를 주형으로 하고, 포워드 프라이머(CCAAGCTTACCATGGGGAAGCCCTGGCTGCGTGCGCTACAG; 서열 44)와 리버스 프라이머(AACTCGAGCAGCTTCAGGGGCCGAATGAGCATGGC; 서열 1)를 사용하여 PCR(PyroBest^TM DNA 폴리머라제(다까라슈조)를 이용하여 5％ 포름아미드 존재하에서 98 ℃ 20 초, 64 ℃ 30 초, 74 ℃ 3 분의 사이클을 35회 반복)을 실시하였다. 얻어진 PCR 산물을 pCR4Blunt-TOPO(인비트로젠사 제조)에 서브클로닝 후, 제한 효소 HindIII과 XhoI로 절단하여 HindIII과 XhoI로 절단한 pCEP4(Invitrogen)에 삽입하여 pCEP-hAGF를 얻었다. PCEP-hAGF를 제한 효소 KpnI 및 MluI로 절단하여 생긴 약 0.43 kbp의 DNA 단편, 전장 인간 AGF cDNA를 포함하는 발현 플라스미드(WO03/083114호 공보의 실시예 19에서 제조; 이하, pcDNA-SF-hAGF)를 제한 효소 MluI 및 XhoI로 절단하여 생긴 약 0.98 kbp의 DNA 단편을 아데노바이러스 제조용 서틀 벡터 pAdTrack-CMV(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 2509-2514, 1998)의 KpnI, XhoI 부위에 삽입하여 pAdTracK-CMV-hAGF를 완성시켰다. 이 플라스미드 또는 대조군으로서 pAdTrack-CMV를 이용하고, WO02/42448호 공보의 실시예 14 및 실시예 15와 동일한 방법으로 pAdEasy 시스템(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 2509-2514, 1998)을 이용하여 바이러스 입자를 제조하였다. 얻어진 바이러스 입자 농도는 WO02/42448호 공보의 실시예 15와 동일한 방법으로 구하였다.

<<실시예 13: 항인간 AGF 항체의 제조>>

전장 인간 AGF 정제 단백질(WO03/083114호 공보의 실시예 19)을 토끼에게 면역시켜 항체를 얻었다. 첫회 면역에 500 ㎍, 2회째 내지 4회째의 면역에 250 ㎍을 사용하여 2 주간마다 면역시켰다. 최종 면역 후 2 주간째에 전채혈에 의해 항혈청을 얻었다. 항혈청을 프로테인 A 칼럼(아마샴 바이오사이언스사 제조)를 이용하여 정제하여 IgG 항체(이하, 항 SF-YP-030 IgG)를 얻었다.

<<실시예 14: 아데노바이러스를 이용한 인간 AGF 단백질의 발현>>

실시예 10 및 실시예 12에서 제조한 인간 AGF 단백질 발현 아데노바이러스 및 pAdTrack-CMV 대조군 아데노바이러스를 인간 태아 신장 세포주 293에 실시예 11과 동일한 방법으로 감염시켜 배양 상청을 얻었다. 1차 항체로서 실시예 13에서 제조한 항 SF-YP-030 IgG를 사용하는 것 이외에는 실시예 11과 동일한 방법을 이용하여 배양 상청 중의 인간 AGF 단백질 발현을 검출하였다. 그 결과, 대조군 아데노바이러스에 의해 감염시킨 상청을 샘플로 한 경우에는 검출되지 않고, 인간 AGF 단백질 발현 아데노바이러스에 의해 감염시킨 상청을 샘플로 한 경우에만, 예상되는 인간 AGF 분자량에 밴드가 검출되어, 실시예 12에서 제조한 인간 AGF 단백질 발현 아데노바이러스에 의해 실시예 14의 방법으로 인간 AGF 단백질이 발현되는 것을 알았다.

<<실시예 15: 고지방식 부하 마우스로의 마우스 AGF 발현 아데노바이러스 투여>>

암컷의 C57BL/6 마우스(구레아사)에 8 주령부터 고지방식(high fat diet 32; 구레아사)을 제공하였다. 고지방식 부하 마우스는 체중이 증가하여 본 시험의 바이러스 투여시인 38 주령시에 약 54 g으로 비만이 되었다. 이들 마우스 각 4 마리에, 실시예 10에서 제조한 마우스 AGF 발현 아데노바이러스 (mAGF-Adeno) 또는 대조군 아데노바이러스(Cont-Adeno)를 5×10⁹ PFU/마우스/주령씩 꼬리 정맥 주사로써 투여하였다. 최초에 아데노바이러스를 투여하고나서 12 일 후의 체중이 mAGF-Adeno 투여 마우스에서 평균 7.3 g 감소하고, Cont-Adeno 투여 마우스에서 1.4 g 감소하였다. mAGF-Adeno 투여 마우스에서는 AGF 유전자를 갖는 바이러스를 투여함으로써 생체내에서 AGF 단백질이 발현되어, 이 AGF 단백질이 체중 감소를 야기한 것을 알았다.

또한, 이들 마우스를 이용하여 당대사 시험을 실시하였다. 이들 마우스를 16 시간 절식 후, 0.4 g/kg의 D-글루코스를 복강내 주사(ip)에 의해 투여하고, 투여 전 및 투여 후 15, 30, 60 및 120 분 후에 안정맥으로부터 채혈하였다. 글루테스트 에이스(산와 가가꾸 겡뀨쇼)를 이용하여 혈당치를 측정하였다. 결과를 도 16에 나타낸다.

mAGF-Adeno 투여 마우스는 글루코스 투여 후의 모든 시간에 있어서 Cont-Adeno 투여 마우스보다 혈당치가 낮아 내당능이 개선된 것이 밝혀졌다. 즉, mAGF-Adeno 투여 마우스에서 고발현된 AGF 단백질의 작용에 의해 내당능이 개선된 것이 명확해졌다.

<<실시예 16: 고지방식 부하에 의한 CAG-AGF Tg 마우스의 혈중 인슐린 및 지질 농도>>

6 주령의 CAG-AGF Tg 마우스(실시예 1) 및 한배새끼 WT 마우스(암컷)를 고지방식으로 12 주간 사육하였다. 안정맥으로부터 채혈하고, 인슐린 면역분석법(에이껜 가가꾸)을 이용하여 혈장 중 인슐린 농도를, L 타입 와꼬 콜레스테롤(와코 쥰야꾸)를 이용하여 혈청 콜레스테롤 농도를, 및 NEFA C-테스트 와꼬(와코 쥰야꾸)를 이용하여 혈청 유리 지방산 농도를 각 키트에 첨부된 프로토콜에 따라서 측정하였다. 결과를 도 17(혈장 중 인슐린 농도, ng/mL), 도 18(혈청 콜레스테롤 농도, mg/dL), 도 19(혈청 유리 지방산 농도, μEq/L)에 나타낸다.

그 결과, 인슐린 농도, 콜레스테롤 농도, 유리 지방산 농도 중 어느 것도 CAG-AGF Tg 마우스(TG)의 경우가 한배새끼 WT 마우스(NTG)보다 낮은 것을 알았다. 이로부터, CAG-AGF Tg 마우스에서 고발현된 AGF 단백질의 작용에 의해 인슐린 감수성이 항진된 것, 지질 대사가 개선된 것이 명확해졌다.

<<실시예 17: CAG-AGF Tg 마우스의 당대사 시험>>

CAG-AGF Tg 마우스(실시예 1)의 당부하 시험을 행하여 AGF에 의한 내당능 개선 효과를 조사하였다. 4개월령의 암컷 CAG-AGF Tg 마우스 및 한배새끼 WT 마우스를 16 시간 절식 후, 1 g/kg의 D-글루코스를 복강내 주사(ip)에 의해 투여하고, 투여 전 및 투여 후 15, 30, 60 및 120 분 후에 안정맥으로부터 채혈하였다. 글루테스트 에이스(산와 가가꾸 겡뀨쇼)를 이용하여 혈당치를 측정하였다. 결과를 도 20에 나타낸다.

CAG-AGF Tg 마우스는 글루코스 투여 후의 모든 시간에 있어서 한배새끼 WT 마우스보다 혈당치가 낮아 내당능이 개선된 것이 명확해졌다. 즉, CAG-AGF Tg 마우스에서 고발현된 AGF 단백질의 작용에 의해 내당능이 개선된 것이 명확해졌다.

다음에, 4개월령의 암컷 CAG-AGF Tg 마우스 및 한배새끼 WT 마우스에게 0.75 단위/kg의 인슐린을 복강내 투여하였다. 인슐린 투여 후, 20, 40 및 60 분 후에 안정맥으로부터 채혈하고, 글루테스트 에이스(산와 가가꾸 겡뀨쇼)를 이용하여 혈당치를 측정하였다. 인슐린 투여 전의 혈당치에 대한 투여 후의 혈당치의 비율을 도 21에 나타낸다.

CAG-AGF Tg 마우스는 인슐린 투여 후 모든 시간에 있어서 한배새끼 WT 마우스보다 혈당치의 저하가 크고, 인슐린 감수성이 항진된 것을 알았다. 즉, CAG-AGF Tg 마우스에서 고발현된 AGF 단백질의 작용에 의해 인슐린 감수성이 항진된 것이 명확해졌다.

<<실시예 18: K14-AGF Tg 마우스의 체중 및 지방 중량 변화>>

K14 프로모터 제어하에서 AGF를 강제 발현시킨 트랜스제닉 마우스(WO03/083114호 공보의 실시예 8)를 제조하였다.

이 마우스는 표피 세포로부터 AGF 단백질을 고발현하고, 발현된 AGF의 작용에 의해 혈관 신생, 조직 재생이 야기되는 것이 알았다. 전신에 AGF를 고발현한 마우스를 이용하여 실시예 3, 실시예 4 및 실시예 17에서 나타낸 것과 같이 표피 세포에서 고발현된 AGF가 항비만 및 항당뇨병의 작용을 나타내는 것을 확인하였다.

8개월령의 암컷 K14-AGF Tg 마우스 및 한배새끼 WT 마우스 각 5 마리의 체중을 측정한 결과, K14-AGF Tg 마우스는 평균 약 21 g이고, 한배새끼 WT 마우스의 평균 약 31 g과 비교하여 체중이 감소된 것이 명확해졌다. 다음에, K14-AGF Tg 마우스 및 한배새끼 WT 마우스의 횡격막으로부터 복강의 최하부까지의 영역을 2 mm 간격으로, 실험 동물용 X선 CT(아로카사 제조)로 촬영하여 내장 지방 조직 중량 및 피하 지방 조직 중량을 계측하였다. 결과를 도 22(내장 지방 조직 중량) 및 도 23(피하 지방 조직 중량)에 나타낸다.

내장 지방 및 피하 지방 모두 K14-AGF Tg 마우스의 경우가 한배새끼 WT 마우스에 비해 현저히 지방 조직 중량이 감소된 것이 명확해졌다. 즉, CAG-AGF Tg 마우스의 경우와 동일하게, 발현된 AGF에 항비만 작용 및 지방 조직을 감소시키는 작용이 있는 것을 알았다.

<<실시예 19: K14-AGF Tg 마우스의 인슐린 감수성 시험>>

K14-AGF Tg 마우스의 인슐린 감수성을 조사하였다. 8개월령의 암컷 K14-AGF Tg 마우스 및 한배새끼 WT 마우스에게 0.75 단위/kg의 인슐린을 복강내 투여하였다. 인슐린 투여 후, 20, 40, 60, 80 및 100 분 후에 안정맥으로부터 채혈하고, 글루테스트 에이스(산와 가가꾸 겡뀨쇼)를 이용하여 혈당치를 측정하였다. 인슐린 투여 전의 혈당치에 대한 투여 후의 혈당치의 비율을 도 24에 나타낸다.

K14-AGF Tg 마우스는 인슐린 투여 후 모든 시간에 있어서 한배새끼 WT 마우스보다 혈당치의 저하가 크고, 인슐린 감수성이 항진된 것을 알았다. 즉, CAG-AGF Tg 마우스에서 고발현된 AGF 단백질의 작용에 의해 인슐린 감수성이 항진된 것이 명확해졌다.

<<실시예 20: 고지방식 부하 마우스로의 인간 AGF 발현 아데노바이러스 투여>>

실시예 15에서는 마우스 AGF의 체중 감소 억제 작용 및 내당능 개선 작용을 나타내었다. 또한, 인간 AGF에 동일한 작용이 있는 것을 이하의 시험을 실시함으로써 확인하였다. 실시예 12에서 제조한 인간 AGF 발현 아데노바이러스(hAGF-Adeno) 및 대조군 아데노바이러스(Cont-Adeno)를 각 3 마리의 마우스에게 실시예 15와 동일하게 투여한 결과, 13 일 후의 체중이 hAGF-Adeno 투여 마우스에서 평균 4.6 g 감소하고, Cont-Adeno 투여 마우스에서 평균 0.1 g 증가하였다. 또한, 복강내 주사한 D-글루코스가 0.5 g/kg, 투여 후의 채혈을 30, 60, 90 및 120 분 후에 행한 것 이외에는, 실시예 15와 동일하게 당대사 시험을 실시한 결과, 도 25에 나타낸 바와 같이 hAGF-Adeno 투여 마우스는 글루코스 투여 후의 모든 시간에 있어서 Cont-Adeno 투여 마우스보다 혈당치가 낮아 내당능이 개선된 것이 명확해졌다. 즉, hAGF-Adeno 투여 마우스에서 고발현된 hAGF 단백질의 작용에 의해 체중 감소가 야기된 것 및 내당능이 개선된 것이 명확해졌다.

<<실시예 21: CAG-AGF Tg 마우스의 혈중 AGF 단백질량>>

CAG-AGF Tg 마우스(실시예 1)에 있어서 AGF 단백질이 혈중에 어느 정도 발현되는가를 조사하였다. 4개월령의 암컷 CAG-AGF Tg 마우스 및 한배새끼 WT 마우스로부터 안저 채혈하여 통상법에 따라서 혈청을 얻었다. 얻어진 혈청을 참고예 1(3)과 동일한 방법으로 웨스턴 블롯팅을 행하여 AGF 단백질을 검출하였다. 스캐너에서 웨스턴 블롯팅의 결과를 얻고, 화상 해석 소프트(NIH image 1.62f)를 이용하여 AGF 단백질 밴드의 농도를 수치화하였다. 그 결과, 한배새끼 WT 마우스와 비교하여 CAG-AGF Tg 마우스에서 혈청 중의 AGF 단백질 농도가 2.4배로 항진된 것을 알았다.

<<실시예 22: 마우스 AGF 발현 아데노바이러스 투여한 마우스의 혈중 AGF 단백질량>>

실시예 15에서 마우스 AGF 발현 아데노바이러스를 마우스에게 투여하였을 때의 혈중의 AGF 단백질량을 조사하였다. 마우스 AGF 발현 아데노바이러스 및 대조군 아데노바이러스 투여 전(0 일째) 및 투여 후 1 내지 7 일째의 마우스로부터 안저 채혈하여 통상법에 따라서 혈청을 얻었다. 참고예 1(3)과 동일한 방법으로 웨스턴 블롯팅을 행하여 AGF 단백질을 검출하였다. 그 결과, 대조군 아데노바이러스 투여에서는 AGF 단백질 농도는 변화되지 않지만, 마우스 AGF 발현 아데노바이러스 투여에서는 4 일째를 피크로 하여 경시적으로 AGF 단백질 농도가 상승되는 것을 알았다. 실시예 21과 동일한 방법으로 마우스 AGF 발현 아데노바이러스를 투여한 마우스의 0 일째와 4 일째의 AGF 단백질 밴드의 농도를 수치화하였다. 그 결과, 마우스 AGF 아데노바이러스를 투여함으로써 AGF 단백질 농도가 2.5배로 항진된 것을 알았다.

<<실시예 23: K14-AGF Tg 마우스의 혈중 AGF 단백질량>>

실시예 18 및 실시예 19에서 사용한 K14-AGF Tg 마우스에서 AGF 단백질이 혈중에 어느 정도 발현되는가를 조사하였다. 8개월령의 암컷 K14-AGF Tg 마우스 및 한배새끼 WT 마우스로부터 안저 채혈하여 통상법에 따라서 혈청을 얻었다. 참고예 1(3)과 동일한 방법으로 웨스턴 블로팅을 행하여 AGF 단백질을 검출, 수치화하였다. 그 결과, 한배새끼 WT 마우스와 비교하여 CAG-AGF Tg 마우스에서 혈청 중의 AGF 단백질 농도가 1.8배로 항진된 것을 알았다.

<<실시예 24: 항인간 AGF 항체 제조>>

인간 AGF의 부분 서열인 펩티드(SRMLDPAPEPQRDQTQR; 서열 45)의 N 말단에 Cys 잔기를 부가한 펩티드(CSRMLDPAPEPQRDQTQR; 서열 46)(이하, 펩티드 A)를 합성 및 정제하였다. 펩티드 A를 캐리어 단백질의 소 사일로글로불린(SIGMA)에 결합시켜 항원을 제조하고, 100 ㎍의 펩티드를 2 주간마다 합계 8회 토끼에게 면역시켰다. 최종 면역 후 1 주간째에 전채혈을 행하여 혈청을 얻었다. 펩티드 A로 어피니티 칼럼을 제조하였다. 어피니티 칼럼을 이용하여 혈청을 어피니티 정제하여 펩티드 A에 결합하는 IgG 항체(이하, 항 YP-030-A IgG)를 얻었다. 항체의 농도는 280 nm의 흡광도를 측정하고, 분자 흡광 계수를 1.38로 하여 구하였다.

<<실시예 25: 항 SF-YP-030 IgG의 HRP 표지>>

0.1 mol/L 시트르산 완충액에 투석한 항 SF-YP-030IgG(실시예 13에서 제조)에 교반하면서 펩신(시그마)를 첨가하고, 37 ℃에서 1 시간 반응시켜 항체를 부분 절단하였다. 반응액을 0.1 mol/L 인산 완충액(pH 6.0)으로 평형화한 Superdex 200 16/60HR 칼럼(아마샴 바이오사이언스)을 이용한 겔 여과에 의해 F(ab')₂를 채취하였다. 얻어진 F(ab')₂에 2-머캅토에틸아민 염산염(나카라이 테스크)을 첨가 후 37 ℃에서 90 분간 반응시켜 환원하고, ULTROGEL ACA54 칼럼(BIOSEPRA사)을 이용한 겔 여과에 의해 Fab'를 채취하였다. 가교제 EMCS[N-(6-말레이미도카프로일옥시)숙신이미드; DOJINDO사]와 서양 고추냉이 퍼옥시다아제(HRP; 도요보)를 혼합하여 37 ℃에서 60 분간 반응시키고, 0.1 mol/L 인산 완충액(pH 6.0)으로 평형화한 P6-DG 칼럼(BIORAD사)을 이용한 겔 여과에 의해 EMCS와 HRP의 컨쥬게이트 분획(이하, EMCS-HRP)을 채취하였다. 계속해서, Fab'와 EMCS-HRP를 혼합하여 4 ℃에서 16 시간 반응시킨 후, Superdex 200 16/60HR 칼럼을 이용한 겔 여과로써 Fab'와 HRP와의 결합 분획을 채취하여 HRP 표지 항 인간 AGF 항체 Fab' 분획(HRP-항 SF-YP-030 Fab')을 얻었다. 항체의 농도는 280 nm의 흡광도를 측정하고, 분자 흡광 계수를 1.38로 하여 구하였다.

<<실시예 26: 인간 AGF 검출 ELISA계 구축>>

실시예 24에서 제조한 항 YP-030-A IgG를 20 ㎍/mL로 ELISA용 마이크로플레이트(NUNC사)에 100 μL/웰 넣어 4 ℃에서 밤새 정치하였다. 웰내의 용액을 흡인 제거하고, PBS(인산 완충화 생리 식염수)로 2회 세정 후, 블로킹액(1％ BSA, 0.05％ NaN₃, PBS)을 300 μL/웰 첨가하여 4 ℃에서 밤새 정치하여 블로킹하였다. 세정액(0.05％ Tween 20 첨가 10 mmol/L 인산 완충액)으로 2회 세정 후, 표준 인간 AGF 정제 단백질을 희석액(1％ BSA, 0.05％ Tween 20 함유 PBS)으로 100 내지 0.39 ng/mL까지 2배 연속 희석하고, 100 μL/웰씩 첨가하여 37 ℃에서 1 시간 반응시켰다. 세정액으로 7회 세정 후, 실시예 25에서 제조한 HRP 표지 항체(HRP-항 SF-YP-030 Fab')를 희석액으로 1 ㎍/mL로 제조하고, 100 μL/웰씩 첨가 후, 37 ℃에서 0.5 시간 반응하였다. 세정액으로 9회 세정 후, TMBZ 기질액(IBL사 제조)을 100 μL/웰씩 첨가 후, 실온에서 30 분간 반응하였다. 반응 정지액(1N H₂SO₄)을 100 μL/웰 첨가하여 발색 반응을 정지하였다. 흡광 광도계(스펙트라맥스)를 이용하여 A450 nm에서의 흡광도를 측정하였다. 스펙트라맥스에 첨부된 프로그램을 이용하여 해석한 결과, 직선성이 얻어지는 농도 영역이 있으며 검량선을 제조할 수 있었다. 이상과 같이 하여 인간 AGF를 검출하는 ELISA계를 구축할 수 있었다.

<<실시예 27: 인간 AGF 발현 아데노바이러스 투여한 마우스의 혈중 인간 AGF 단백질량>>

인간 AGF 발현 아데노바이러스를 마우스에게 투여하였을 때의 혈중의 AGF 단백질량을 조사하였다. 각 6 마리의 고지방식 부하 마우스에게 실시예 12에서 제조한 인간 AGF 발현 아데노바이러스(hAGF-Adeno) 및 대조군 아데노바이러스(Cont-Adeno)를 실시예 20과 동일하게 투여하였다. 그 결과, 실시예 20에 기재한 경우와 동일하게, hAGF-Adeno 투여 마우스에서 체중 감소, 내당능 개선이 동일하게 관찰되었다. 아데노바이러스 투여 4 일째에 안저 채혈을 행하여 통상법에 따라서 혈청을 얻었다. 혈청 중의 인간 AGF 단백질량을 실시예 26에서 구축한 ELISA계를 이용하여 측정하였다. 그 결과, Cont-Adeno를 투여한 마우스의 혈청에서는 인간 AGF 단백질은 검출되지 않고, hAGF-Adeno를 투여한 마우스의 혈청에서는 0.7 내지 1.2 ㎍/mL의 농도로 인간 AGF 단백질이 검출되었다. 이 결과, 혈중의 AGF 단백질 농도가 0.7 내지 1.2 ㎍/mL이면, 기대되는 체중 감소 및 내당능 개선의 작용이 얻어지는 것이 밝혀졌다.

본 발명의 의약은 비만, 당뇨병 및/또는 고지혈증의 치료 및/또는 예방의 용도에 적용할 수 있다.

이상, 본 발명을 특정 양태에 따라서 설명하였지만, 당업자에게 자명한 변형 이나 개량은 본 발명의 범위에 포함된다.

<서열 목록 프리텍스트>

이하의 서열 목록의 숫자 색인 <223>에는 「Artificial Sequence」의 설명을 기재한다. 서열 1, 6, 7, 9, 10, 13, 14, 16, 19, 20 및 40 내지 44의 서열로 표시되는 각 염기 서열은 인공적으로 합성한 프라이머 서열이고, 서열 15의 서열로 표시되는 염기 서열은 loxP를 포함하는 서열이다. 서열 46의 서열로 표시되는 아미노산 서열은 펩티드 A의 서열이다.

<110> Yamanouchi Pharmaceutical Co., Ltd. <110> KEIO UNIVERSITY <120> Antiobesity agents <130> Y05018PCT728 <150> JP 2004-111501 <151> 2004-04-05 <150> JP 2004-351813 <151> 2004-12-03 <160> 46 <170> PatentIn version 3.1 <210> 1 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: an artificially synthesized primer sequence <220> <223> Inventor: Yasunaga, Kunio; Yamaji, Noboru; Suda, Toshio Inventor: Oike, Yuichi <400> 1 aactcgagca gcttcagggg ccgaatgagc atggc 35 <210> 2 <211> 1413 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(1413) <223> <220> <221> mat_peptide <222> (61)..(1410) <223> <400> 2 atg ggg aag ccc tgg ctg cgt gcg cta cag ctg ctg ctc ctg ctg ggc 48 Met Gly Lys Pro Trp Leu Arg Ala Leu Gln Leu Leu Leu Leu Leu Gly -20 -15 -10 -5 gcg tcg tgg gcg cgg gcg ggc gcc ccg cgc tgc acc tac acc ttc gtg 96 Ala Ser Trp Ala Arg Ala Gly Ala Pro Arg Cys Thr Tyr Thr Phe Val -1 1 5 10 ctg ccc ccg cag aag ttc acg ggc gct gtg tgc tgg agc ggc ccc gca 144 Leu Pro Pro Gln Lys Phe Thr Gly Ala Val Cys Trp Ser Gly Pro Ala 15 20 25 tcc acg cgg gcg acg ccc gag gcc gcc aac gcc agc gag ctg gcg gcg 192 Ser Thr Arg Ala Thr Pro Glu Ala Ala Asn Ala Ser Glu Leu Ala Ala 30 35 40 ctg cgc atg cgc gtc ggc cgc cac gag gag ctg tta cgc gag ctg cag 240 Leu Arg Met Arg Val Gly Arg His Glu Glu Leu Leu Arg Glu Leu Gln 45 50 55 60 agg ctg gcg gcg gcc gac ggc gcc gtg gcc ggc gag gtg cgc gcg ctg 288 Arg Leu Ala Ala Ala Asp Gly Ala Val Ala Gly Glu Val Arg Ala Leu 65 70 75 cgc aag gag agc cgc ggc ctg agc gcg cgc ctg ggc cag ttg cgc gcg 336 Arg Lys Glu Ser Arg Gly Leu Ser Ala Arg Leu Gly Gln Leu Arg Ala 80 85 90 cag ctg cag cac gag gcg ggg ccc ggg gcg ggc ccg ggg gcg gat ctg 384 Gln Leu Gln His Glu Ala Gly Pro Gly Ala Gly Pro Gly Ala Asp Leu 95 100 105 ggg gcg gag cct gcc gcg gcg ctg gcg ctg ctc ggg gag cgc gtg ctc 432 Gly Ala Glu Pro Ala Ala Ala Leu Ala Leu Leu Gly Glu Arg Val Leu 110 115 120 aac gcg tcc gcc gag gct cag cgc gca gcc gcc cgg ttc cac cag ctg 480 Asn Ala Ser Ala Glu Ala Gln Arg Ala Ala Ala Arg Phe His Gln Leu 125 130 135 140 gac gtc aag ttc cgc gag ctg gcg cag ctc gtc acc cag cag agc agt 528 Asp Val Lys Phe Arg Glu Leu Ala Gln Leu Val Thr Gln Gln Ser Ser 145 150 155 ctc atc gcc cgc ctg gag cgc ctg tgc ccg gga ggc gcg ggc ggg cag 576 Leu Ile Ala Arg Leu Glu Arg Leu Cys Pro Gly Gly Ala Gly Gly Gln 160 165 170 cag cag gtc ctg ccg cca ccc cca ctg gtg cct gtg gtt ccg gtc cgt 624 Gln Gln Val Leu Pro Pro Pro Pro Leu Val Pro Val Val Pro Val Arg 175 180 185 ctt gtg ggt agc acc agt gac acc agt agg atg ctg gac cca gcc cca 672 Leu Val Gly Ser Thr Ser Asp Thr Ser Arg Met Leu Asp Pro Ala Pro 190 195 200 gag ccc cag aga gac cag acc cag aga cag cag gag ccc atg gct tct 720 Glu Pro Gln Arg Asp Gln Thr Gln Arg Gln Gln Glu Pro Met Ala Ser 205 210 215 220 ccc atg cct gca ggt cac cct gcg gtc ccc acc aag cct gtg ggc ccg 768 Pro Met Pro Ala Gly His Pro Ala Val Pro Thr Lys Pro Val Gly Pro 225 230 235 tgg cag gat tgt gca gag gcc cgc cag gca ggc cat gaa cag agt gga 816 Trp Gln Asp Cys Ala Glu Ala Arg Gln Ala Gly His Glu Gln Ser Gly 240 245 250 gtg tat gaa ctg cga gtg ggc cgt cac gta gtg tca gta tgg tgt gag 864 Val Tyr Glu Leu Arg Val Gly Arg His Val Val Ser Val Trp Cys Glu 255 260 265 cag caa ctg gag ggt gga ggc tgg act gtg atc cag cgg agg caa gat 912 Gln Gln Leu Glu Gly Gly Gly Trp Thr Val Ile Gln Arg Arg Gln Asp 270 275 280 ggt tca gtc aac ttc ttc act acc tgg cag cac tat aag gcg ggc ttt 960 Gly Ser Val Asn Phe Phe Thr Thr Trp Gln His Tyr Lys Ala Gly Phe 285 290 295 300 ggg cgg cca gac gga gaa tac tgg ctg ggc ctt gaa ccc gtg tat cag 1008 Gly Arg Pro Asp Gly Glu Tyr Trp Leu Gly Leu Glu Pro Val Tyr Gln 305 310 315 ctg acc agc cgt ggg gac cat gag ctg ctg gtt ctc ctg gag gac tgg 1056 Leu Thr Ser Arg Gly Asp His Glu Leu Leu Val Leu Leu Glu Asp Trp 320 325 330 ggg ggc cgt gga gca cgt gcc cac tat gat ggc ttc tcc ctg gaa ccc 1104 Gly Gly Arg Gly Ala Arg Ala His Tyr Asp Gly Phe Ser Leu Glu Pro 335 340 345 gag agc gac cac tac cgc ctg cgg ctt ggc cag tac cat ggt gat gct 1152 Glu Ser Asp His Tyr Arg Leu Arg Leu Gly Gln Tyr His Gly Asp Ala 350 355 360 gga gac tct ctt tcc tgg cac aat gac aag ccc ttc agc acc gtg gat 1200 Gly Asp Ser Leu Ser Trp His Asn Asp Lys Pro Phe Ser Thr Val Asp 365 370 375 380 agg gac cga gac tcc tat tct ggt aac tgt gcc ctg tac cag cgg gga 1248 Arg Asp Arg Asp Ser Tyr Ser Gly Asn Cys Ala Leu Tyr Gln Arg Gly 385 390 395 ggc tgg tgg tac cat gcc tgt gcc cac tcc aac ctc aac ggt gtg tgg 1296 Gly Trp Trp Tyr His Ala Cys Ala His Ser Asn Leu Asn Gly Val Trp 400 405 410 cac cac ggc ggc cac tac cga agc cgc tac cag gat ggt gtc tac tgg 1344 His His Gly Gly His Tyr Arg Ser Arg Tyr Gln Asp Gly Val Tyr Trp 415 420 425 gct gag ttt cgt ggt ggg gca tat tct ctc agg aag gcc gcc atg ctc 1392 Ala Glu Phe Arg Gly Gly Ala Tyr Ser Leu Arg Lys Ala Ala Met Leu 430 435 440 att cgg ccc ctg aag ctg tga 1413 Ile Arg Pro Leu Lys Leu 445 450 <210> 3 <211> 470 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Met Gly Lys Pro Trp Leu Arg Ala Leu Gln Leu Leu Leu Leu Leu Gly -20 -15 -10 -5 Ala Ser Trp Ala Arg Ala Gly Ala Pro Arg Cys Thr Tyr Thr Phe Val -1 1 5 10 Leu Pro Pro Gln Lys Phe Thr Gly Ala Val Cys Trp Ser Gly Pro Ala 15 20 25 Ser Thr Arg Ala Thr Pro Glu Ala Ala Asn Ala Ser Glu Leu Ala Ala 30 35 40 Leu Arg Met Arg Val Gly Arg His Glu Glu Leu Leu Arg Glu Leu Gln 45 50 55 60 Arg Leu Ala Ala Ala Asp Gly Ala Val Ala Gly Glu Val Arg Ala Leu 65 70 75 Arg Lys Glu Ser Arg Gly Leu Ser Ala Arg Leu Gly Gln Leu Arg Ala 80 85 90 Gln Leu Gln His Glu Ala Gly Pro Gly Ala Gly Pro Gly Ala Asp Leu 95 100 105 Gly Ala Glu Pro Ala Ala Ala Leu Ala Leu Leu Gly Glu Arg Val Leu 110 115 120 Asn Ala Ser Ala Glu Ala Gln Arg Ala Ala Ala Arg Phe His Gln Leu 125 130 135 140 Asp Val Lys Phe Arg Glu Leu Ala Gln Leu Val Thr Gln Gln Ser Ser 145 150 155 Leu Ile Ala Arg Leu Glu Arg Leu Cys Pro Gly Gly Ala Gly Gly Gln 160 165 170 Gln Gln Val Leu Pro Pro Pro Pro Leu Val Pro Val Val Pro Val Arg 175 180 185 Leu Val Gly Ser Thr Ser Asp Thr Ser Arg Met Leu Asp Pro Ala Pro 190 195 200 Glu Pro Gln Arg Asp Gln Thr Gln Arg Gln Gln Glu Pro Met Ala Ser 205 210 215 220 Pro Met Pro Ala Gly His Pro Ala Val Pro Thr Lys Pro Val Gly Pro 225 230 235 Trp Gln Asp Cys Ala Glu Ala Arg Gln Ala Gly His Glu Gln Ser Gly 240 245 250 Val Tyr Glu Leu Arg Val Gly Arg His Val Val Ser Val Trp Cys Glu 255 260 265 Gln Gln Leu Glu Gly Gly Gly Trp Thr Val Ile Gln Arg Arg Gln Asp 270 275 280 Gly Ser Val Asn Phe Phe Thr Thr Trp Gln His Tyr Lys Ala Gly Phe 285 290 295 300 Gly Arg Pro Asp Gly Glu Tyr Trp Leu Gly Leu Glu Pro Val Tyr Gln 305 310 315 Leu Thr Ser Arg Gly Asp His Glu Leu Leu Val Leu Leu Glu Asp Trp 320 325 330 Gly Gly Arg Gly Ala Arg Ala His Tyr Asp Gly Phe Ser Leu Glu Pro 335 340 345 Glu Ser Asp His Tyr Arg Leu Arg Leu Gly Gln Tyr His Gly Asp Ala 350 355 360 Gly Asp Ser Leu Ser Trp His Asn Asp Lys Pro Phe Ser Thr Val Asp 365 370 375 380 Arg Asp Arg Asp Ser Tyr Ser Gly Asn Cys Ala Leu Tyr Gln Arg Gly 385 390 395 Gly Trp Trp Tyr His Ala Cys Ala His Ser Asn Leu Asn Gly Val Trp 400 405 410 His His Gly Gly His Tyr Arg Ser Arg Tyr Gln Asp Gly Val Tyr Trp 415 420 425 Ala Glu Phe Arg Gly Gly Ala Tyr Ser Leu Arg Lys Ala Ala Met Leu 430 435 440 Ile Arg Pro Leu Lys Leu 445 450 <210> 4 <211> 1374 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> CDS <222> (1)..(1374) <223> <220> <221> mat_peptide <222> (73)..(1371) <223> <400> 4 atg ggg acc gcc agg cta cgc aag ctg caa ctg ctg ctt ctg ctg ggc 48 Met Gly Thr Ala Arg Leu Arg Lys Leu Gln Leu Leu Leu Leu Leu Gly -20 -15 -10 gct tgg agg gcg ctc gga ggt gcc gcg cgt tgc cgc gtc acc cta gtt 96 Ala Trp Arg Ala Leu Gly Gly Ala Ala Arg Cys Arg Val Thr Leu Val -5 -1 1 5 ttg tcc ccg cag aag gca act agc gcc gtc tgc agg agc tca gag gcc 144 Leu Ser Pro Gln Lys Ala Thr Ser Ala Val Cys Arg Ser Ser Glu Ala 10 15 20 acc caa gac agc gaa ctg gcc acg ctg cgc atg cgc ctg ggt cgc cac 192 Thr Gln Asp Ser Glu Leu Ala Thr Leu Arg Met Arg Leu Gly Arg His 25 30 35 40 gag gag ctg ctg cgc gcg ctg caa agg cgt gcg gcg gag ggt ggt gcg 240 Glu Glu Leu Leu Arg Ala Leu Gln Arg Arg Ala Ala Glu Gly Gly Ala 45 50 55 ctc gcg gac gag gtg cgc gca ctg cgc gag cac agt ctc acc ctg aac 288 Leu Ala Asp Glu Val Arg Ala Leu Arg Glu His Ser Leu Thr Leu Asn 60 65 70 acg cgc ctg ggc cag ctg cgc gcg caa ttg cag cag gag gcg agg gcg 336 Thr Arg Leu Gly Gln Leu Arg Ala Gln Leu Gln Gln Glu Ala Arg Ala 75 80 85 gag cct gac ctg ggg gcg gag cct gct gct gca ctt ggt ttg cta gcc 384 Glu Pro Asp Leu Gly Ala Glu Pro Ala Ala Ala Leu Gly Leu Leu Ala 90 95 100 gag cgc gcg ctg gac gct gag gcc gaa gcg cgc cgg acg acg gca cgc 432 Glu Arg Ala Leu Asp Ala Glu Ala Glu Ala Arg Arg Thr Thr Ala Arg 105 110 115 120 ctg cag cag ctg gac gca cag ctc cgt gag cat gcg cag ctc atg agc 480 Leu Gln Gln Leu Asp Ala Gln Leu Arg Glu His Ala Gln Leu Met Ser 125 130 135 cag cat agc agc ctc ctc ggc cgc ctg caa cgc gcg tgc gcg ggc ccg 528 Gln His Ser Ser Leu Leu Gly Arg Leu Gln Arg Ala Cys Ala Gly Pro 140 145 150 gaa cgg gga cag cag cag gtc ctg cca ctg ccc ctg gcg cct ctg gtg 576 Glu Arg Gly Gln Gln Gln Val Leu Pro Leu Pro Leu Ala Pro Leu Val 155 160 165 cct ctg agc ctc gtg ggc agt gcc agc aac acc agc agg agg ctg gac 624 Pro Leu Ser Leu Val Gly Ser Ala Ser Asn Thr Ser Arg Arg Leu Asp 170 175 180 caa act cca gag cac cag aga gag cag agc ttg aga cag cag ggg cct 672 Gln Thr Pro Glu His Gln Arg Glu Gln Ser Leu Arg Gln Gln Gly Pro 185 190 195 200 cca tct tct ctg ctg ccc aca ggg cac ctt gct gtc ccc aca agg cca 720 Pro Ser Ser Leu Leu Pro Thr Gly His Leu Ala Val Pro Thr Arg Pro 205 210 215 gtg ggc cca tgg agg gat tgt gca gag gct cac ggg gca ggt cac tgg 768 Val Gly Pro Trp Arg Asp Cys Ala Glu Ala His Gly Ala Gly His Trp 220 225 230 cag agt gga gtg tat gac ctg cgg ctg ggc cgt cgt gta gta gcc gtg 816 Gln Ser Gly Val Tyr Asp Leu Arg Leu Gly Arg Arg Val Val Ala Val 235 240 245 tgg tgt gaa cag cag cag gaa ggt gga ggc tgg act gtc atc cag aga 864 Trp Cys Glu Gln Gln Gln Glu Gly Gly Gly Trp Thr Val Ile Gln Arg 250 255 260 cgg cag gac ggc tct gtc aac ttc ttc acc aac tgg cag cac tac aag 912 Arg Gln Asp Gly Ser Val Asn Phe Phe Thr Asn Trp Gln His Tyr Lys 265 270 275 280 gcg ggc ttt ggg cgt cca gaa gga gaa tac tgg ctg ggc ctg gaa cct 960 Ala Gly Phe Gly Arg Pro Glu Gly Glu Tyr Trp Leu Gly Leu Glu Pro 285 290 295 gtg cat cag gtg aca agc cgt ggg gac cac gag ctg ctg ata ctc cta 1008 Val His Gln Val Thr Ser Arg Gly Asp His Glu Leu Leu Ile Leu Leu 300 305 310 gag gac tgg ggg ggc cgt gca gca cgc gcc cac tac gac agc ttc tcc 1056 Glu Asp Trp Gly Gly Arg Ala Ala Arg Ala His Tyr Asp Ser Phe Ser 315 320 325 ttg gag cct gag agt gac cac tac cgt ctg cgg ctt ggc cag tac cac 1104 Leu Glu Pro Glu Ser Asp His Tyr Arg Leu Arg Leu Gly Gln Tyr His 330 335 340 ggc gat gcc gga gac tcc ctc tct tgg cac aat gac aaa cct ttc agc 1152 Gly Asp Ala Gly Asp Ser Leu Ser Trp His Asn Asp Lys Pro Phe Ser 345 350 355 360 act gtg gat agg gac aga gac tca tat tct ggt aac tgt gcc ctg tac 1200 Thr Val Asp Arg Asp Arg Asp Ser Tyr Ser Gly Asn Cys Ala Leu Tyr 365 370 375 cat cgt ggg ggc tgg tgg tac cat gcc tgt gcc cac tct aac ctc aat 1248 His Arg Gly Gly Trp Trp Tyr His Ala Cys Ala His Ser Asn Leu Asn 380 385 390 gga gta tgg tat cat gga ggt cat tac cgg agc cga tac cag gac ggg 1296 Gly Val Trp Tyr His Gly Gly His Tyr Arg Ser Arg Tyr Gln Asp Gly 395 400 405 gtc tac tgg gcc gag ttc cgt ggt ggg gcg tac tct ctg aag aaa gct 1344 Val Tyr Trp Ala Glu Phe Arg Gly Gly Ala Tyr Ser Leu Lys Lys Ala 410 415 420 gtt atg ttg acc cgg ctt gtg cgc ttg tga 1374 Val Met Leu Thr Arg Leu Val Arg Leu 425 430 <210> 5 <211> 457 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 5 Met Gly Thr Ala Arg Leu Arg Lys Leu Gln Leu Leu Leu Leu Leu Gly -20 -15 -10 Ala Trp Arg Ala Leu Gly Gly Ala Ala Arg Cys Arg Val Thr Leu Val -5 -1 1 5 Leu Ser Pro Gln Lys Ala Thr Ser Ala Val Cys Arg Ser Ser Glu Ala 10 15 20 Thr Gln Asp Ser Glu Leu Ala Thr Leu Arg Met Arg Leu Gly Arg His 25 30 35 40 Glu Glu Leu Leu Arg Ala Leu Gln Arg Arg Ala Ala Glu Gly Gly Ala 45 50 55 Leu Ala Asp Glu Val Arg Ala Leu Arg Glu His Ser Leu Thr Leu Asn 60 65 70 Thr Arg Leu Gly Gln Leu Arg Ala Gln Leu Gln Gln Glu Ala Arg Ala 75 80 85 Glu Pro Asp Leu Gly Ala Glu Pro Ala Ala Ala Leu Gly Leu Leu Ala 90 95 100 Glu Arg Ala Leu Asp Ala Glu Ala Glu Ala Arg Arg Thr Thr Ala Arg 105 110 115 120 Leu Gln Gln Leu Asp Ala Gln Leu Arg Glu His Ala Gln Leu Met Ser 125 130 135 Gln His Ser Ser Leu Leu Gly Arg Leu Gln Arg Ala Cys Ala Gly Pro 140 145 150 Glu Arg Gly Gln Gln Gln Val Leu Pro Leu Pro Leu Ala Pro Leu Val 155 160 165 Pro Leu Ser Leu Val Gly Ser Ala Ser Asn Thr Ser Arg Arg Leu Asp 170 175 180 Gln Thr Pro Glu His Gln Arg Glu Gln Ser Leu Arg Gln Gln Gly Pro 185 190 195 200 Pro Ser Ser Leu Leu Pro Thr Gly His Leu Ala Val Pro Thr Arg Pro 205 210 215 Val Gly Pro Trp Arg Asp Cys Ala Glu Ala His Gly Ala Gly His Trp 220 225 230 Gln Ser Gly Val Tyr Asp Leu Arg Leu Gly Arg Arg Val Val Ala Val 235 240 245 Trp Cys Glu Gln Gln Gln Glu Gly Gly Gly Trp Thr Val Ile Gln Arg 250 255 260 Arg Gln Asp Gly Ser Val Asn Phe Phe Thr Asn Trp Gln His Tyr Lys 265 270 275 280 Ala Gly Phe Gly Arg Pro Glu Gly Glu Tyr Trp Leu Gly Leu Glu Pro 285 290 295 Val His Gln Val Thr Ser Arg Gly Asp His Glu Leu Leu Ile Leu Leu 300 305 310 Glu Asp Trp Gly Gly Arg Ala Ala Arg Ala His Tyr Asp Ser Phe Ser 315 320 325 Leu Glu Pro Glu Ser Asp His Tyr Arg Leu Arg Leu Gly Gln Tyr His 330 335 340 Gly Asp Ala Gly Asp Ser Leu Ser Trp His Asn Asp Lys Pro Phe Ser 345 350 355 360 Thr Val Asp Arg Asp Arg Asp Ser Tyr Ser Gly Asn Cys Ala Leu Tyr 365 370 375 His Arg Gly Gly Trp Trp Tyr His Ala Cys Ala His Ser Asn Leu Asn 380 385 390 Gly Val Trp Tyr His Gly Gly His Tyr Arg Ser Arg Tyr Gln Asp Gly 395 400 405 Val Tyr Trp Ala Glu Phe Arg Gly Gly Ala Tyr Ser Leu Lys Lys Ala 410 415 420 Val Met Leu Thr Arg Leu Val Arg Leu 425 430 <210> 6 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: an artificially synthesized primer sequence <400> 6 ctagactagt tgcaaaggcg tgcggcgg 28 <210> 7 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: an artificially synthesized primer sequence <400> 7 ctagactagt ggatccgcag gcttgctttg acttac 36 <210> 8 <211> 536 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 8 gcccatggag ggattgtgca gaggctcacg gggcaggtca ctggcagagt ggagtgtatg 60 acctgcggct gggccgtcgt gtagtagccg tgtggtgtga acagcagcag gaagtggagg 120 ctggactgtc atccagagac ggcaggacgg ctctgtcaac ttcttcacca actggcagca 180 ctacaaggtg tgtgcttgtg gtgggggtgt cagagactgc tgggcagaga ggacgccccc 240 accctcttcc tcctaccctt ccaggcgggc tttgggcgtc cagaaggaga atactggctg 300 ggcctggaac ctgtgcatca ggtgacaagc cgtggggacc acgagctgct gatactccta 360 gaggactggg ggggccgtgc agcacgcgcc cactacgaca gcttctcctt ggagcctgag 420 agtgaccact accgtctgcg gcttggccag taccacggcg atgccggaga ctccctctct 480 tggcacaatg acaaaacctt tcagcactgt ggatagggac agagactcat attctg 536 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: an artificially synthesized primer sequence <400> 9 agaggctatt cggctatgac 20 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: an artificially synthesized primer sequence <400> 10 caccatgata ttcggcaagc 20 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 11 tggcctctgt tatcatgctc 20 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 12 ctacctacat ccactcctac 20 <210> 13 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: an artificially synthesized primer sequence <400> 13 agaagcttca ccatggggac cgccaggcta c 31 <210> 14 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: an artificially synthesized primer sequence <400> 14 ccgtcgacat tagatcttca caagcgcaag ccgggtc 37 <210> 15 <211> 81 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Sequence containing loxP <400> 15 gatccggaac ccttaatata acttcgtata atgtatgcta tacgaagtta ttaggtccct 60 cgacctgcag cccgggggat c 81 <210> 16 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: an artificially synthesized primer sequence <400> 16 aattaaccct cactaaaggg 20 <210> 17 <211> 20 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 17 cccactacga cagcttctcc 20 <210> 18 <211> 20 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 18 agccgggtca acataacagc 20 <210> 19 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: an artificially synthesized primer sequence <400> 19 gcgttaccca acttaatcg 19 <210> 20 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: an artificially synthesized primer sequence <400> 20 tgtgagcgag taacaacc 18 <210> 21 <211> 22 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 21 tcgtgtagta gccgtgtggt gt 22 <210> 22 <211> 20 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 22 cacctgatgc acaggttcca 20 <210> 23 <211> 19 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 23 tggttgatcc tgccagtag 19 <210> 24 <211> 20 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 24 cgaccaaagg aaccataact 20 <210> 25 <211> 23 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 25 ccggtacagt gaaactgcga atg 23 <210> 26 <211> 19 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 26 acagaaggat tgccgaaac 19 <210> 27 <211> 20 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 27 agctgatttg cctctgaatg 20 <210> 28 <211> 17 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 28 cagcggtctg cctgcgg 17 <210> 29 <211> 19 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 29 catggttgga cttcagccc 19 <210> 30 <211> 17 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 30 ggcccccagg aacttca 17 <210> 31 <211> 22 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 31 ccgaagtgcc tcccacaacg gt 22 <210> 32 <211> 21 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 32 acgatgctgt cctccttgat g 21 <210> 33 <211> 21 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 33 gtgtgataaa gccattgccg t 21 <210> 34 <211> 23 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 34 acaaagacgg gatgctgatc gcg 23 <210> 35 <211> 21 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 35 gaccctcctc aagtatggcg t 21 <210> 36 <211> 21 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 36 gtctttgttg acgatggagg c 21 <210> 37 <211> 23 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 37 cacgaggcca tctttgccat gct 23 <210> 38 <211> 22 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 38 tgagagggaa atcgtgcgtg ac 22 <210> 39 <211> 22 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 39 aagaaggaag gctggaaaag ag 22 <210> 40 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: an artificially synthesized primer sequence <400> 40 aatctagaca ccatggggac cgccaggcta cg 32 <210> 41 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: an artificially synthesized primer sequence <400> 41 aagcggccgc caagcgcaca agccgggtca a 31 <210> 42 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: an artificially synthesized primer sequence <400> 42 gaagatctac catggggacc gccaggctac gc 32 <210> 43 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: an artificially synthesized primer sequence <400> 43 ccgctcgagt gatgggacag tcacaagcgc 30 <210> 44 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: an artificially synthesized primer sequence <400> 44 ccaagcttac catggggaag ccctggctgc gtgcgctaca g 41 <210> 45 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 45 Ser Arg Met Leu Asp Pro Ala Pro Glu Pro Gln Arg Asp Gln Thr Gln 1 5 10 15 Arg <210> 46 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Peptide A <400> 46 Cys Ser Arg Met Leu Asp Pro Ala Pro Glu Pro Gln Arg Asp Gln Thr 1 5 10 15 Gln Arg

Claims (4)

1. (a) 서열 3으로 표시되는 아미노산 서열에서의 1번 내지 450번의 아미노산으로 이루어지는 서열, 또는 서열 5로 표시되는 아미노산 서열에서의 1번 내지 433번의 아미노산으로 이루어지는 서열을 포함하며, 체중 증가 억제 활성을 갖는 폴리펩티드,

   (b) 서열 3으로 표시되는 아미노산 서열에서의 1번 내지 450번의 아미노산으로 이루어지는 서열, 또는 서열 5로 표시되는 아미노산 서열에서의 1번 내지 433번의 아미노산으로 이루어지는 서열에 있어서 1 내지 10개의 아미노산 잔기가 치환, 결실 및/또는 삽입된 아미노산 서열을 포함하며, 체중 증가 억제 활성을 갖는 폴리펩티드,

   (c) 서열 3으로 표시되는 아미노산 서열에서의 1번 내지 450번의 아미노산으로 이루어지는 서열, 또는 서열 5로 표시되는 아미노산 서열에서의 1번 내지 433번의 아미노산으로 이루어지는 서열을 코딩하는 DNA와 엄격한 조건하에서 혼성화되는 DNA에 의해 코딩되며, 체중 증가 억제 활성을 갖는 폴리펩티드, 및

   (d) 서열 3으로 표시되는 아미노산 서열에서의 1번 내지 450번의 아미노산으로 이루어지는 서열, 또는 서열 5로 표시되는 아미노산 서열에서의 1번 내지 433번의 아미노산으로 이루어지는 서열과의 동일성이 95％ 이상인 아미노산 서열을 포함하며, 체중 증가 억제 활성을 갖는 폴리펩티드

   로 이루어지는 군에서 선택되는 폴리펩티드 또는 상기 폴리펩티드를 코딩하는 폴리 뉴클레오티드를 유효 성분으로 하는 항비만약, 당뇨병 치료약 및/또는 고지혈증 치료약.
2. 제1항에 기재된 폴리펩티드를 유효 성분으로 하는 비만, 당뇨병 및/또는 고지혈증의 개선 기능을 부여한 기능성 식품 또는 건강 식품.
3. 제1항에 기재된 폴리펩티드 또는 상기 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 비만, 당뇨병 및/또는 고지혈증의 치료 또는 예방이 필요한 대상에게 유효량으로 투여하는 것을 포함하는, 비만, 당뇨병 및/또는 고지혈증을 치료 또는 예방하는 방법.
4. 제1항에 기재된 폴리펩티드 또는 상기 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 항비만약, 당뇨병 치료약 및/또는 고지혈증 치료약을 제조하기 위한 용도.

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