JPH07500005A - コカイン検出用微生物エステラーゼ - Google Patents
コカイン検出用微生物エステラーゼInfo
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
コカイン検出用微生物エステラーゼ
発明の背景
本発明は、微生物から分離された新規な酵素、本酵素を生産する微生物、本酵素
のコカイン分解反応の触媒への使用、および本酵素を用いたコカイン検出方法ま
たは装置に関する。
従来の技術
粒子状および体液中のコカインを検出する、より優れた方法の必要が迫られてい
る。粒子状のコカインに関しては、様々な異なる分析システムが提案されている
が、そのほとんどがマススペクトル法のように大きな装置に基づいており、また
特別に研究者を養成する必要がある。薄層クロマトグラフィー、ガスクロマトグ
ラフィーおよび高速液体クロマトグラフィー(HPLC)もこのようなシステム
に含まれる。体液に関しては、妨害物質を除去するためにサンプルを蒸留する必
要かある。標識物を用いた検定法も用いられているが、これらもまた専門的な技
術を必要とする。上記またはその他の従来の技術、例えばマススペクトル法はま
た、場所をとりかつ高価な装置を必要とする。
コカインの簡便な検出装置が今日開発されている。例えば、アインスマン(Ei
nceman)ら(アナリティカル ケミストリー(Anal、 Chem、)
(1990) 601374−1379)は、簡便なイオン移動度針を開発し
たが、これは薬剤の揮発性に頼るところが大きい。同様な欠点は、ネゲエ一ネグ
ワインビ(Ngeh−Ngvainbi)ら(バイオセンサーズアンドバイオメ
カニクス(Biosensors & Biomechanics)(1984
) [feinコ璽139−148)により開発されたが、これは、多くの不法
薬物に存在する第3級アミンと複合体を形成するため、かなり非特異的である。
本発明の概要
我々は、コカインの検出に利用出来る酵素を発見した。本酵素は、コカインの脱
ベンゾイル化、すなわち加水分解してエクゴニンメチルエステルおよび安息香酸
を生成する反応に触媒作用を及ぼす、コカインエステラーゼ(以下CEと略)で
ある。本酵素は、従って、酵素をコカインと反応させ、酵素反応の発生を検出す
ることにより、コカインの検出に利用することができる。そのような検出方法の
一つに伝導性測定が挙げられる。これはCE反応が溶液のコンダクタンスに変化
をもたらすためである。代替方法としては、CE反応が溶液のpHに変化をもた
らすことによる、電位差測定が挙げられる。その他の方法としては、反応生成物
の光学、比色、温度、または電流の検出があり、いずれも技術としては、よ(知
られたものである。よって、本発明は、コカインエステラーゼのセンサー、特に
伝導性測定および電位差測定タイプのものを包含する。これらの、また同様のセ
ンサーは、密輸入者、不正取引商人やコカイン使用者らの体液、荷物や衣服など
にあるコカインを検出するための簡易で持ち運び自由なセンサーの基礎としての
利用が可能である。
明細書中で使用されている”コカイン“という言葉は、特別の意味を必要とする
場合を除き、遊離塩基および塩類を含む。
まず第一に、本発明はコカインエステラーゼ酵素を提供する。このコカインエス
テラーゼ酵素はコカインを脱ベンゾイル化し、エクゴニンメチルエステルおよび
安息香酸を生成する反応に触媒作用を及ぼす。つまり、コカインの安息香酸エス
テル結合に作用する。メチルエステル結合に対しては、殆どまたは全く作用しな
い。従って、コカインの安、ρ香酸エステル結合に特異的に作用を及ぼす能力が
、本発明のコカインエステラーゼに特有の特徴であり、この特徴は、工業的に利
用可能なエステラーゼ、例えば豚肝臓エステラーゼ、馬血清プチルーコリンエス
テラーゼ、または微生物のアトロピンエステラーゼのようなその他のエステラー
ゼには存しないものである。
CEのもう一つの特有な特徴は、非凝集体で約120,000ダルトン、凝集体
では約420.000ダルトンの天然体の分子量(両者ともタンパク標識物でキ
ャリプレートしたゲル濾過カラムからの溶離液より決定した。)を有することで
ある。”約”の意味は、この方法で高い分子量を決定する際にはつきものの変量
を包含するものであり、もちろん10%までの変量は含むものである。この分子
量は、変性状態で30.000ダルトン、および自然体では60.000ダルト
ン(ロルシュ ら(Rorsch et al、 )、ブロク ケー ネット
ア力デ ウェット(Proc、 K、 Ned、^kad、Wet、) (19
71) セル シー(Ser、 C) 74132−152)の分子量を有する
微生物のアトロピンエステラーゼとはかなり異なるものである。
後述の実施例3ではCEのその他の特徴を述べるが、酵素を生産する微生物の生
育状態を変化させるか、あるいは酵素の精製度を高めることにより、それらの特
徴の一部を変化させることが可能であろう。従って、多くの一般的な酵素の定義
でのCEの酵素活性や温度安定性のような性質に頼るのは好ましくない。そのよ
うな性質のひとつ、またはその多くは、酵素を定義する代替方法として(事情が
許す限り)認められるが、それらは、ひとつまたは多くの好ましい特徴、つまり
これまでに定義したひとつまたは多くの特徴への付加的特徴として最も好ましい
と判断されたものである。
CEは、自然界から同定された微生物の菌株より得られるものである。その細菌
の菌株は、シュードモナス マルトフィリアで、ここではMB11L”と表す。
ブタペスト特許条約のこの微生物の寄託は、ナショナルコレクション オブイン
ダストリアル アンド マリン バクテリア(National Co11ec
tions ofIndustrial and Marine Bacter
ia) (NCI MB) 、23 セント マーチヤードライブ、アバーディ
ーン、ニービー217−ルワイ、スコツトランド(St。
Machar Drive、^berdeen、^B21RY、 5cotla
nd)で、1991年6月14日に、寄託番号 NCIMB 40427でなさ
れている。シュードモナス マルトフィリアの一部の厳密な分類学上の分類では
、これらがキサントモナスマルトフィリア(Xanthomonas malt
ophilia)と同真に分類されるという、無視できない問題点が見いだされ
る。この場合シュードモナス属が好ましいが、この生物体はまた、キサントモナ
ス属に分類されることもあろう。本発明において、この微生物には、本発明のC
Eを生産する突然変異株および変異体も含まれるものである。
CEは、このような微生物を炭素および窒素源で培養することにより生産される
。
図面の簡単な説明
図1から4は、CEのクロマト精製における重要な段階を表したものである(実
施例2参照)。
好ましい具体的内容の説明
コカインエステラーゼは、ンユードモナス マルトフィリアを炭素および窒素源
上で培養することにより生産される。望ましくは、コカインそのものであるとよ
い。グルコースおよび安息香酸塩上で生育した場合、CEの活性はコカインで生
育した場合に比べて低くなる。さらに、好ましくはり、L−メチオニンを生育培
地へ加えたならば、生産されたコカインエステラーゼの特異的活性は向上する。
代わりにコカインとグルコースの等モル混合物でも高い活性の酵素を生み出す。
培養は、常温で好気的に、例えば20から40℃の範囲、好ましくは25から3
5℃の範囲で行うのがよい。酵素を得るためには、慣例法に従い細胞を破壊する
。
好ましくは、無細胞抽出液を得る。酵素を細胞または抽出液から回収する。
寄託したのと全(同じ出発微生物に代えて、それらの変異株、例えばガンマ−線
照射または化学的変異を利用して引き起こしたり、池の培地などで培養して導い
たもの、または他の微生物とのトランス・コンジニガントや人工的に生産した変
異株も利用できる。
技術上よく知られた方法を利用して組換DNA技術により、本酵素またはその改
良物を生み出すことも可能である。これには、他の宿主有機体で酵素を生産して
もよい。
本発明は、荷物、貨物または人の周辺の粉末状コカイン(遊離塩基またはその塩
類)の粒の検出、および生物体液、特に尿および血液中のコカインまたはその代
謝産物の検出に特に適用できる。
本発明の酵素は、主としてコカインの検出に有用である。この目的は、コカイン
エステラーゼ酵素単独、およびコカインの検出を更に改善するであろう1または
それ以上の酵素と組み合わせて使用することにより達成できるであろう。
試験反応における伝導性、電流、および電位差の変化に依存するバイオセンサー
を作製する方法は、よく知られた技術である。イギリス特許出願公開番号2゜2
31.332A (NRDC)では、このような方法やバイオセンサーの使用法
が述べられており、それらに関連する内容は本明細書の1部とした。
このような方法はコカインエステラーゼ反応の検出、更にはコカインの検出に利
用できるであろう。
本発明のコカインエステラーゼは、いくつかのその他の使い方をすることができ
る。コカイン過剰摂取後の過剰コカインを”掃除”するために使用できる。同様
にMBIILをコカインの産業庚棄物の”掃除”に利用することも可能である。
”掃除”の言葉は、コカインを除去し、麻薬常用癖をもたらす代謝産物をより少
なくすると言う意味で用いている。従って、本発明のコカインエステラーゼは治
療に利用できる。本酵素はまた、コカイン異性体の識別、並びに適正な状態での
脱ベンゾイル化反応の逆反応によるコカイン類似化合物の生成(生体内変換)に
も利用できる。
以下の実施例で、本発明を説明した。′ トリトン(TORITON)”、”セ
ファセル(SEPHACEL)”、”セファクリル(SEPHACRYL)”は
、登録商標である。
実施例1
イン強化天然資源より集めたサンプルより分離した。
MBIILは、リットル当たりリン酸水素2ナトリウム(4,33g)、リン酸
2水素カリウム(2,65g)、塩化アンモニウム(2,0g) 、N (CH
2C02H)! (0,1g)からなり、ローゼンベルガー(Rosenber
ger)とエルスデン(Elsden) (ジャーナル オブ ジェネラル ミ
クロバイオロジー(J、 Gen。
Microbiol、) (1960) 22726−739)らによる無機塩
溶液を4 ml/1含む培地750m1中で培養した。コカイン(純度90%1
/W)を単独炭素源(10mM)として、無菌的に2リツトルのエルレンマイヤ
ーフラスコに入れて滅菌した上記培地750m1に加え、250 rev/mi
nで振盪培養器にて振盪培養した。微生物の大量調製のために、750m1の培
養器を、9.5リツトルの滅菌培地が入った10リツトルの培養器に無菌的に加
えた。大量培養は30℃で、滅菌通気装置を181/winで作動下500 r
ev/minで撹拌しながら行った。大量培養における培養液は、10mMの上
記コカインにり、L−メチオニンを401g/l、およびシリコンポリマーの3
0%水性エマルジョンであるアンチフオーム A エマルジョン(シグマ製)を
700μl加えたものを用いた。
上記の方法で生育した細胞より無細胞抽出液を調製した。細胞を10リツトルの
大量培養液より採収する場合は、まず始めに細胞液を、孔サイズ0.45μmの
200平方cmの膜を付けたロータリー濃縮器で、2から3リツトルにまで濃縮
した。その後細胞を1リツトルの培養液で洗浄した。これらの細胞、またはもう
少し少ない容量の培養で直接得た細胞は、G5−30−ターを付けたツルパル(
Sorvall) RC−5C遠心機を10.000g、15分、4℃で遠心分
離してベレット状にした。これらのペレット状細胞を、湿潤細胞1グラム当たり
2mlの割合で、50mMM0PS緩衝液(pH7)に再度懸濁させた。細胞は
、エムニスイー ソニプレップ(MSE 5oniprep) (フィソンズ
インストルメンツ エフニスエイ リミテッド(Fisons Instrum
ents、 FSA Ltd、))にて、15秒間18×12μmバーストの超
音波処理と、氷水中で30秒間の冷却を代わる代わる行い、細胞を破壊した。細
胞の残骸および破壊されなかった細胞は、S S−340−ターを付けたツルベ
ルRC−5C遠心機で48,000g、20分、4℃にて遠心分離して取り除き
、浄化した無細胞抽出液を得た。
2、薬品
コカインの遊離塩基は、塩酸塩(5g 15 mmoles)を最低量の蒸留水
で溶解し、続けて10M水酸化ナトリウム溶液1.5mlを滴下して加えること
により得た。生成した遊離塩基は、10m1のジエチルエーテルで抽出し、蒸発
させて回収した。典型的生成量は80%で、融点は、96.4から98℃であっ
た。
コカインとその分解物および安息香酸の分離および同定は、ウォーターズ 60
0 システムを用い、218nmまたは275nmでHPLC分析で行った。
0.46x25cmのカラムは、5μmのスフエリソーブ(Spherisor
b) (C−18)を含む。移動層は、フッグル アンド クラーク(Nogg
le & C1ark) (ジャーナルオブ アソシエイション オブ オフィ
シャル アナリテイカル ケミスフ(J、 As5oc、 Off、^na1.
Chem、) (1982) 65756−761) 、およびマサウド ア
ンド クラブスキ(Masoud and Krupski) (ジャーナル
オブ アナリテイカル ト様にした。移動層には分析中宮にヘリウムを3重0m
l/winで流した。
緩衝液A: 50mM MOPS、2%グリセロール(v/v) 、1mMβ−
メルカプトエタノール、pH7、0
緩衝液B:50m1 MOPS、0.5%(v/V)コール酸塩、領 1M塩化
ナトリウム、2%グリセロール(v/v) 、1mMβ−メルカプトエタノール
、pH7,0
緩衝液C:50mMホウ酸ナトリウム、0.5%(v/v) :l−ル酸塩、領
6M塩化ナトリウム、2にグリセロール(w/v) 、1mMβ−メルカプト
エタノール、pH9,0
緩衝液D:10mMリン酸水素2カリウム、0.5%(W/V)コール酸塩、1
1M塩化ナトリウム、2%グリセロール(v/v) 、l mMβ−メルカプト
エタノール、pH6、8
抽出液、カラム画分および特性試験(例えばミカエリス定数決定による至適pH
)のコカインエステラーゼを2mMコカイン塩酸(1mlの50mMM0PS緩
衝液で調製 pH7,0)を量の分かつているサンプル(10〜200μ10−
0.0IU)と一定の時間(10〜30分)振盪インキュベーション(25Qr
pm、30℃)することにより、ルーチンに検定した。反応は、10μlの濃縮
リン酸を加えて止め、タンパクをミニフユージ中で13.OOOrpmでペレッ
トにした。生成した安息香酸の定量は、上清の50μmをHPLC分析し、同様
に分析した標準サンプル(0〜1mM)と比較して行った。安息香酸濃度↓二対
するピーク高さの標準曲線は、0から1mMの範囲で直線であった。酵素を含ま
ないコントロール実験を、基礎的な加水分解を考慮するために実施した。検定の
最後にコカインが全く残っていない場合(HPLCで確認)には、検定(よ無効
と見なした。エステラーゼ活性1ユニ・ノドは、30℃で1分間に1重モルの安
、慝香酸を生成するのに必要な酵素の量と定義した。
サンプル中のエステラーゼの存在は、同様な手段としてガスクロマトグラフィー
を用いた生成安息香酸の検出でも可能であったが、定量的な試験はしなかった。
ガスクロマトグラフィーは、これらの実施例で用いたが、事前に述べたように、
コカインおよびコカインエステラーゼのルーチンで筒便な測定には非実用的な道
具である。
全ての分光光度法での検定は、パーキン エルマー ラムダ(Perkin E
lmer Lambda) 3.5または7の2重光線分光光度計に記録計と保
温セルジャケットを付けて行った。一定のブランクに対する値を読み取った。
タンパク質
ブラッドフォード(Bradford) (アナリテイカル バイオケミストリ
ー(^na1. Biochem、 ) (1976) 72248−254)
のコーマッシー ダイ−パインディング(Coomassie dye−bin
ding)法により、工業的に利用可能な試薬および牛血清アルブミン標準試薬
(ピアース リミテッド(Pierce Ltd、 )製−ルートン(Luto
n)のライフサイエンス ラボ リミテッド(Life 5cience La
bs Ltd、 )より購入)を用いて、タンパク質をルーチンに検定した。1
ml当たり0.2〜1mgのタンパク質を含むサンプルの1アリコート(20μ
l)を試薬1mlに加え、緩衝液(20μm)を試薬(1ml)に加えたブラン
クに対する595nmにおける吸光度を読み取る前に室温にて5分間反応させた
。標準値(0〜1mg/m+)の標準曲線と比較して、サンプル中のタンパク質
濃度を算出した。
ゲル濾過標準物
次の酵素を分子量標準物としてゲル濾過試験に用いた。:牛肝臓カタラーゼ、酵
母アルコールデヒドロゲナーゼ、酵母C300ヘキソキナーゼ(分子量は、それ
ぞれ240.000.150.000.100,000ダルトン)。これらの活
性の検定は、ベルシマイヤー(Bergmeyer) ((1986)メソッズ
オブ エンシマティック アナリシス(ilethods of Enzym
atic Analysis、 ) 第3版、ブイ。シー、エイチ 出版(V、
C,H,PublisherS)、ウエインハイム(feinheim)、ドイ
ツ)が述べているのと同様の方法で実施した。チトクロムC(分子量13.00
0ダルトン)を505nmの吸光度で検出した。
すべての工程は、特に記載しない限り4℃で実施した。
シュードモナス マルトダイリア MBllLの無細胞抽出液は、コール酸塩非
含有緩衝液A中で超音波処理および浄化処理を行って調製した。続けてコール酸
塩を0.5%(V/V)加えた。DEAE−陰イオン交換クロマトグラフィーの
前にpHを測定し、13m5/cmの伝導度に達するまで塩化ナトリウムを加え
た。
最終塩濃度は、普通0.1M付近であったが、DEAEセファセルと結合を促す
ために、注意深(調整した。
1、DEAEセファセル リロマトグラフィー無細胞抽出液は、普通900mg
の可溶化タンパク質を含んでいるが、これを緩衝液Bで、平衡化した27X2.
6cmのDEAEセファセル(ファルマシア(Pharmacia)/エルケー
ビー バイオテクノロジー リミテッド(LKB Biotechnology
Ltd、 ))カラムにロードした。ローディング、洗浄およびカラムからの
溶離は、15 a+1/sq、 cm/hで実施した。280nmにおいてタン
パク質の溶離物が検出されなくなるまで緩衝液Bで洗浄した後、コカインエステ
ラーゼを結合塩、および各々125m1ずつの緩衝液Bから緩衝液CへのpHの
勾配を利用して溶離し、続いて緩衝液C100m1で洗浄した。溶離したタンパ
ク質は、10mIずつのフラクションとして集められ、コカインエステラーゼ活
性およびタンノ々り質の検定をなした。(図1に示したように、酵素は、およそ
0.4M塩化ナトリウム、pH8,3で溶離する。図1および以下の図において
、エステラーゼ酵素活性は黒丸で、タンパク質は点線で表されている。図1およ
び2における破線は、溶離勾配を表す。)。活性フラクションを溜めて、2リツ
トルの緩衝液りで透析した。
(DEAEカラムは、0.02%(W/V)アジ化合物中で保存する前に、IM
塩化ナトリウム/1%トリトンX−100(v/v) 、および0.1M水酸化
ナトリラムでルーチンに洗浄した。)
2.ヒドロキシアパタイト クロマトグラフィー透析したタンパク質(20〜2
00mg)は、ルーチンに14X1.6cmバイオゲル(Bio−gel) H
T (バイオラッド(Bio−Rad)ラボラトリーズリミテッド)ヒドロキシ
アパタイトカラムにロードした。カラムは、緩衝液りで平衡状態にした後、ロー
ディングの前にタンパク質試料が等価のpH(6,8)および伝導性(13is
/cI!+)であることをチェックした。15 ml/sq、 cm/hの流量
は、ローディング、洗浄および溶離時を通じて維持した。ローディング後に、2
80nmにおいてタンパク溶離物が検出されなくなるまで、カラムを緩衝液りで
洗浄した。コカインエステラーゼの溶離は、各々3Qmlずつの緩衝液りから緩
衝液E(300mMリン酸カリウムが使用されている他は、緩衝液りと同じ)へ
のpH勾配を利用して行い、続いて緩衝液E30mlで洗浄した。フラクション
(3ml)を集め、コカインエステラーゼ活性の検定を行った。典型的な溶離物
の概略を図2に示す。フラクションを集め、PEG4000 (20%V/V)
でおよそ4mlになるまで濃縮した。(カラムは、1M塩化ナトリウム10.5
%(W/V)コール酸塩でルーチンに洗浄し、0,02%(w/v)アジ化合物
中で保存した。)3、AcA 44 ゲル濾過クロマトグラフィー前述の工程を
経て得たコカインエステラーゼをおよそ4mlに濃縮し、緩衝液Bで既に平衡状
態にしたAcA 44 ウルトロゲル(Ultrogel) (ライフサイエン
スラボラトリーズリミテッド(Life 5cience Laborator
ies Ltd、 ))の60X1゜6cmのカラムにロードした。コール酸塩
の存在下で、コカインエステラーゼは、分子量110.000ダルトンのタンパ
クとして溶離すると期待された。緩衝液Bでの溶離は、流量4 ml/sq、
cm/hで行い、溶離液は、2mlのフラクションとして集めた。コカインエス
テラーゼ活性の検定を行った。典型的な溶離液の概略を図3に示した。コール酸
塩除去のため活性フラクションを溜めた。
4、コール酸塩除去
溜めた酵素を緩衝液Aと1:10の割合で希釈し、(コール酸塩濃度を臨界ミセ
ル濃度以下にするため)2×10容量の緩衝液Aで透析し、塩類およびコール酸
を除去した。コール酸除去は、単にサンプル20μlを、主成分としてリン酸を
含むコーマッシー ダイ−バインディング タンパク検定試薬1mlへ加えるこ
とで確認した。酸性下では、コール酸塩含有サンプルは、コール酸の沈澱のため
に鮮やかな青の沈澱物を形成する。上記のようにAcA 44で処理したサンプ
ルは、沈澱を作らなかった。濃縮後も更にコール酸の除去が効果的に行われたこ
とを示した。
5、セファクリルS−300ゲル濾過クロマトグラフィー濃縮したコール酸塩非
含有エステラーゼを、緩衝液Aで平衡状態にしたセファクリルS−300(ファ
ルマシア エルケービー バイオテクノロジー リミテッド)の75X1.6c
mのカラムにロードした。続いて、緩衝液Aでの溶離を流量4 ml/sq、
cm/hで行った。このコール酸塩非含有状態では、エステラーゼは、分子量4
10,000ダルトンのタンパクとして溶離すると期待された。2mlのフラク
ションを集め、検定した結果の典型的な概略を図4に示した。
結果
コカインを炭素源として生育したシュードモナス マルトフィリア MBIIL
の可溶化抽出液中では、コカインエステラーゼは、0.16ユニツト/(mgタ
ンパク質)の特異的活性を示す。それを以下の表1に示すように22倍に精製し
た。
実施例3
精製したコカインエステラーゼ(10μm、5μg タンパク質)をある範囲の
緩衝液中で2mMのコカインと共に30℃で20分間インキュベートした。緩衝
液には、5QmMビストリスプロパン(p H6、0,7、0,8,0,9,0
,および10.0)、50mM MOPS (pH6,5,7,0,および7.
0)、および5QmMビシン(pH7、5,8,5,および9,0)を用いた。
。10μmの濃縮リン酸で沈澱させ、ミクロフユーシ中で13.000rpmで
遠心分離してタンパク質を除去した後、インキュベートしたそれぞれの試液中の
安息香酸濃度をHPLC分析により測定し、コカインエステラーゼ活性を測った
。それぞれのケースにおいては、コントロール検定は酵素を加えずに行い、検定
は1mMの安息香酸塩標準液を用いて換算した。
全ての検定は、ダフルて行った。
コカインエステラーゼは、7〜9の範囲の至適pHを示した。第3級アミン緩衝
液は、エステラーゼ活性に阻害効果をもたらすものと見られた。
温度の効果
無細胞抽出液を、遠心分離を施す前に、少なくとも30分間様々な温度に保った
。コカインエステラーゼ活性およびタンパク質の検定を標準レベルと比較した。
酵素は、30℃までは安定であったが、それ以上の温度では酵素活性は、急速に
低下した。
精製したタンパク質製剤(領 015mg タンパク)中でのCEおよびアセチ
ルエステラーゼ活性の温度安定性の比較を、コール酸塩存在下および非存在下で
行った。アセチルエステラーゼのt172は、 コール酸塩存在下で4.5分、
非存在下では10分であった。CEのt172は、 コール酸塩存在下で2.5
分、非存在下ではほとんど安定性を示さなかった。
コカインエステラーゼの動的特性および基質特異性精製したコカインエステラー
ゼぐタンパク質の1.25μg)のインキュベーションをpH8,0の50mM
ビス−トリス−プロパン1ml中で、0〜2mM(コカインでは0〜1mM)の
濃度範囲の基質と共に、30℃で10分間行った。濃縮リン酸(10μm)を用
いてタンパク質を沈澱させることにより反応を止め、沈澱したタンパク質は、ミ
クロフユージを用いて13.OOOrpmで遠心分離して除去した。基質の加水
分解率は、インキュベーション後のHPLC分析より算出した。非酵素加水分解
率は、酵素を加えないコントロールサンプより算出した。関連のあるフリーの酸
の標準サンプルをそれぞれの検定の換算に用いた。結果から、それぞれの基質に
対するコカインエステラーゼの見かけのに1およびv、。
1、値を計算することが可能であった。ラインウエーバー−ブルク(Linew
eaver−Burke)とエアディー−ホフスティ−(Eadie−Hofs
tee)の図式をこれらの値を得るために用いた。(方法は、フェルシュド(F
ersht)、1985、酵素の構造としくみ(Enzy+se 5truct
ure and Mechanism)、第2版、出版者:ダブリュー エイチ
フリーマン アンド カンパニー(J、 H,Freeeman & Co、
)、オックスフォード(Oxford) 参照)平均値を表2に示した。
基質 見かけのKa+ 見かけの■IIlax(mM) (U/mg)
コカイン 0.36 29.5
安息香酸エチル 1.89 65.0
2−ヒドロキシ安息香酸エチル 1.75 測定せず3−ヒドロキシ安息香酸エ
チル 不活性 不活性4−ヒドロキシ安息香酸エチル 不活性 不活性従って、
精製した酵素を使って得たミカエリス定数は、コカインエステラーゼが安息香酸
エチルよりもコカインに対して優れた親和性をもつが、コカインの加水分解は安
息香酸エチルよりもゆつ(すした割合で起こることを示している。
分子量測定
天然物/可溶化酵素の分子量は、アントリユース(^ndrevs)の方法(ノ
クイオケミカルジャーナル(BIochem、 J、) (1964) 912
22−233)により測定した。
可溶化酵素については、測定は、セファクリルS−200(1,6X75cm)
のカラムで行った。精製したコカインエステラーゼ(2mg タン<す)可溶化
してタンパク標識物と混合し、混合物(全量2m1)をカラムに加える。緩衝液
Bを用い、4ml/c+o2/hの流量でカラムを溶離し、1.3mlずつのフ
ラクションを集めた。コカインエステラーゼの溶離量は、分子量110.000
ダルトンに相当した。セファクリルS−300カラムを用いた同様な方法では凝
集したコカインエステラーゼの分子量が得られたが、可溶化は達成できず、溶離
は緩衝液Aで行った。コカインエステラーゼの溶離量は、分子量410.000
ダルトンに相当した。
分子量測定は5DS−PAGEを用いても行った。精製したコカインエステラー
ゼは、はっきりしたメジャーバンドで現れ、ンヤピロら(Shapiro et
at、 ) ()くイオケミカル アンド バイオフィジカル リサーチ コ
ミュニケーションズ(Biochem、 Biophys、 Res、 Com
ets、) (1967) 28815−820)の方法を用いた標準タンパク
質と比較すると、分子量は129.000ダルトンに相当した。可溶化酵素のそ
れも等価であったことから、可溶化酵素の分子量を測定するに当たっては、洗浄
液/タンパク質相互作用の影響はごく少ないことが言える。
精製したCEのネイティブ ページ(Native PAGE)分析では、Rf
o、2にメジャーバンドが現れた。ゲルをメスの刃を用いて切断し、緩衝液中で
ゲルの区分を2mMのコカインと共にインキュベーションし、コカインエステラ
ーゼ活性を分析した。HPLC分析では、Rfo、2のメジャーバンドに相当す
るゲルの部位は、サンプリングした他のゲルの部位よりも高い率で、コカインを
加水分解した。
阻害研究
精製したコカインエステラーゼ(0,0IU)のサンプルを、ある範囲の阻害の
可能性のある物質(1mM)と30℃て10分間インキュベートした後、コカイ
ンに対する活性を常法により検定した。試験に供した阻害可能性のある物質には
、フェニルメチルスルフォニル フルオライド(PMSF) 、エゼリン、パラ
ーヒドロキシメルキュリベンゾアート(pHMB)、安息香酸塩、およびエクゴ
ニンメチルエステルを用いた。コカインエステラーゼ活性を阻害剤を含まないコ
ントロールサンプルで測定した。下記の表3に示した結果から、PMSFはコカ
インエステラーゼ活性を完全に不活性化するが、一方で他の阻害活性の可能性が
あると思われた物質、エゼリンおよびpHMBは、阻害剤としては比較的効果が
なかった。
阻害剤 % コントロールとの比較活性1mM PMSF 0
1mM エゼリン 95
1mM pHMB 86
1mM 安息香酸塩 92
1mM エクゴニンメチルエステル 82活性は、阻害剤非存在下での2mMコ
カインとの反応の測定値(09U/a+1=lQQ%活性)との比較で表した。
コカインに対する市販エステラーゼの活性多くの工業的に利用可能なエステラー
ゼ酵素について、コカインの安息香酸とエクゴニンメチルエステルへの加水分解
能を、工業的に見てそれぞれの通常の活性の至適と報告されている条件下でコカ
イン2mMと共にインキュベートして、スクリーニングした。コカインの加水分
解は、HPLCを用いて確認し、結果を表4に示した。酵素を加えないコントロ
ールは、酵素活性の的確な検定をするためにそれぞれに設定した条件下で行った
。試験に供した酵素の中で、それらの通常の基質に対する活性に比較して、認め
得るほどの活性を示したものはなかったのに比べ、MB 11 Lから得たコカ
インエステラーゼは、コカインの安息香酸エステル結合を攻撃する能力において
特有の性質を有するようである。
コカインのエステラーゼ活性は、既に述べたようにHPLCによって確認した。
反応混合物は、それぞれの酵素の最大酵素活性のpHに合わせた50mMの緩衝
液中に2mMコカインを含んだ。下の表は、酵素のコカインに対する活性を、そ
れらの通常の基質に対するものと比較して示した。
特異的活性 特異的活性
酵素 (U/mg) (U/mg)
対コカイン 対通常の基質
豚バンクレアチンリバー七 0 50
オレンジピール アセチルエステラーゼ 0 6、2豚肝臓エステラーゼ 0.
833 20馬血清ブチリルコリンエステラーゼ 0. 098 14α−キモ
トリ1ツノ(有カルシウム) 0.04 40電fiうなぎアセチルコリンエス
テラーゼ 0 320コカインエステラーゼ’ 3. 5 −了トロピンエステ
ラーゼ” 0 1. 531 MBIILから得た精製酵素
2 単独炭素源としてアトロビンで生育したシュードモナス プチダ(Psue
domonas putida) PMB L−1から得た原油出液で、0.0
5Uのアトロビン加水分解活性をもつ(HP L Cにより分析)のサンプルを
、2mMのコカインと30℃で20分間インキュベートした。HPLC分析の結
果より、コカインの分解は見られなかった。
3 この値は、スティーブンズ(Stevens)の研究((1969)フェト
テシス(PhD Thesis)、レーデン大学(Ilniversity
of Leiden)、オランダ)による原油出液から得たものである。精製し
たアトロビンエステラーゼは、500〜600U/mgの特異的活性をもつ。(
ヘツシング(Hessing)、(1983)フェト テシス、レーデン大学、
オランダ)
コカインエステラーゼ活性における培養基質の効果培地Bを用いある範囲の炭素
源(10mM)で、750m1を1バツチとしてMBIIL細胞の培養を行った
。3回菌を植え変えた後、細胞を採集し、粗抽出物を得た。コカインエステラー
ゼとタンパク質の検定を行い、コカインで生育した細胞から得た抽出液で観察さ
れたレベル(0,02μmole/win/mgタンパク質= 100%)との
比較により結果を表し、表5に示した。
比較酵素活性
酵素 培養基質
安息香酸塩 クエン酸塩 コカイン ブドウ糖コカインエステラーヤ 20%
0% 100% 20%結果は、コカイン非存在下で生育した細胞から得たコカ
インエステラーゼのレベルの低さを明らかに表しており(安息香酸塩およびブド
ウ糖で生育した細胞の抽出液は、コカインで生育した細胞の特異的活性のたった
20%しか占めず、一方クエン酸塩で生育した細胞は、何の活性も示さない。)
、コカインエステラーゼは誘発できることを示している。40mg/lのり、L
−メチオニンを培地に含めることにより、生産されるコカインエステラーゼの特
異的活性は、20%程度上昇する。
以下の請求項は、本発明のいくつかの重要な側面を示してはいるが、その後の出
願および外国特許出願において保護をめるであろう総ての考えられ得る知見を包
含するという意味ではな(、前述の総括的な発明の概念から外れていると解釈す
べきではない。
溶離量 (ml)
図、2
図、3
溶離量 (ml)
図、4
国際調査報告 。1.T/、。。っ/IVl’1つ。
、、、、、、、−、^−,,,八+PCT/GB92101324フロントペー
ジの続き
(51) Int、 C1,’ 識別記号 庁内整理番号Cl2R1:38)
(C12N 1/20
C12R1:38)
(72)発明者 ブルース、ネイル・チャールズイギリス国ケンブリッジ、シー
ビー2・1エヌアイー、ノーウィッチ・ストリート93番
I
(72)発明者 ロウ、クリストファー・ロビンイギリス国エセックス、シービ
ー10・2ビーダブリユウ、サフラン・ウォルデン、ヘンプステッド、ザ・ライ
ムズ (番地の表示なし)
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 1.(1)コカインの脱ベンゾイル化に触媒作用を及ぼし、(2)ゲル濾過によ る測定では、非凝集体で約120.000ダルトンの分子量をもち、 (3)コカインの安息香酸エステル結合に特異的なエステラーゼ活性をもつこと を特徴とするコカインエステラーゼ酵素。 2.(4)凝集体が、PAGEで約0.2のRf値のメジャーバンドとして分離 し、 (5)非凝集体は、47℃において約21/2分の半減期で温度変性し、(6) フェニルメチルスルフォニルフルオライドにより特異的に阻害される特徴のひと つまたはそれ以上の特徴を有する請求項1記載のコカインエステラーゼ酵素。 3.コカインを分解するコカインエステラーゼ酵素の生産能を有する、“MB1 1L”で示され、NCIMB40427として寄託されているシュードモナスマ ルトフィリアの徴生物菌株、およびその突然変異株または変異体。 4.請求項3記載のシュードモナス属NCIMB40427またはその突然変異 株および変異体を、炭素および窒素源と共に20から40℃の範囲の温度で培養 し、細胞を破壊してその破壊した細胞から酵素を回収する工程を含む、請求項1 記載の酵素の製造方法。 5.エクゴニンメチルエステルおよび安息香酸が生成するまで請求項1または2 に記載のコカインエステラーゼの存在下で、試料を脱ベンゾイル化反応に付し、 反応の発生を検出することを含む、試料中のコカインの検出方法。 6.脱ベンゾイル化反応で遊離した安息香酸塩イオンを検出することを特徴とす る請求項5記載の方法。 7.安息香酸塩イオンを伝導性測定により検出することを特徴とする請求項6記 載の方法。 8.請求項1または2に記載のコカインエステラーゼを含む電解質液と接触した 一対の電極を含む伝導性測定のバイオセンサー。 9.電位差性、電流性、伝導性または圧電性の変換器との関連で作動する、請求 項1または2に記載のコカインエステラーゼを含むセンサー。 10.治療、生体内変換またはコカイン廃物処理への請求項1または2に記載の コカインエステラーゼの利用方法。
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