JPH0440988B2

JPH0440988B2 -

Info

Publication number: JPH0440988B2
Application number: JP58165820A
Authority: JP
Inventors: Taiji Minoda; Toshio Oomori
Original assignee: Kao Corp
Current assignee: Kao Corp
Priority date: 1983-09-08
Filing date: 1983-09-08
Publication date: 1992-07-06
Also published as: JPS6058068A

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は新規な酵素であるアミンデヒドロゲナ
ーゼＭに関する。一般に、アミン類は生物に対して毒性を持つて
おり、その生分解性とか自然に対する影響に問題
があつた。そこでアミン類の無毒性や自然界に残
存するアミンの分析等が望まれていた。しかしな
がら、アミン類は微生物にとつても毒であり、ア
ミン類を資化する菌はこれまで例が少ない。アミン類を資化する菌に含まれる酵素はアミン
オキシダーゼとアミンデヒドロゲナーゼが知られ
ているが、こられはアミン類を酸化してアルデヒ
ドを生成する。その中で酵素反応で酸素の関与し
ないアミンデヒドロゲナーゼの報告例は少ない。従来、アミンデヒドロゲナーゼとしてはシユー
ドモナスAMIから産生される酵素等が報告され
ており（R.R.Eady et al，Biochem.J.，106，
245（1968）；同123，757（1971）、これらは低分子
のアミン類しか酸化せず、基質特異性は狭いもの
であつた。更に、長鎖アルキルアミンの如き分子
量の大きいアミン類を酸化するアミンデヒドロゲ
ナーゼはこれまで見当らなかつた。本発明者らは、斯かる現状に鑑み、長鎖アルキ
ルアミン等の分子量の大きいアミン類をも酸化
し、基質特異性の広いアミンデヒドロゲナーゼを
探索していたが、特定のシユードモナス属に属す
るアミンデヒドロゲナーゼ生産菌に含まれるアミ
ンデヒドロゲナーゼＭが該条件を満たすことを見
出し、本発明を完成した。すなわち、本発明の目的は新規なアミンデヒド
ロゲナーゼを提供することにある。以下、本発明について詳細に説明する。本発明に用いられるアミンデヒドロゲナーゼＭ
はシユードモナス・エスピー・K95
（Pseudomonas sp.K95）により生産される酵素
である。該菌株は本発明者らが土壌より分離した
ものであつて、微工研菌寄第7041号として工業技
術院微生物工業技術研究所に寄託されており、以
下の菌学的性質を有している。 (a) 形態１細胞の形および大きさ：桿菌、0.4〜0.6×1.5
×2.0μ ２多形性：なし３運動性：運動性があり、極鞭毛を有する４胞子：形成しない５グラム染色性：陰性６抗酸性：陰性 (b) 各培地における生育状態１肉汁寒天平板培養：生育は豊富であり、コロ
ニーの色は緑褐色で、にぶい光沢がある。２肉汁寒天斜面培養：生育は豊富であり、緑褐
色の色素を生じる。３肉汁液体培養：薄膜を形成し、全体的に混濁
を生じる。４肉汁ゼラチン穿刺培養：表層より液化。５リトマスミルク：凝固、ペプトン化。共に陽
性。 (c) 生理学的性質１硝酸塩の還元：還元しない２脱窒反応：陰性３ MRテスト：陰性４ VPテスト：陰性５インドールの生成：陰性６硫化水素の生成（TSI寒天）：陰性７デンプンの加水分解：陰性８クエン酸の利用 Koserの培地：利用する Christensenの培地：利用する９無機窒素源の利用硝酸塩：利用するアンモニウム塩：利用する 10 色素の生成：蛍光性色素を生成する。 11 ウレアーゼ：陽性 12 オキシダーゼ：陽性 13 カタラーゼ：陽性 14 生育の範囲： 22〜41℃（最適28〜39℃） PH5.0〜8.5（最適5.0〜7.0） 15 酸素に対する態度：好気性 16 OFテスト：Ｏ型（酸化型） 17 糖類からの酸、ガスの生成^**：

【表】＊＊10％ペプトン水、30℃、14日間培養指示薬：BCP（ブロムクレゾールパープル）以上の菌学的性質を有する菌について、バージ
エイのマニユアル（Bergey ｓ Maunal of
Determinative Bacteriology）第８版（1975年）
にもとづいて検索した結果、本菌株はシユードモ
ナス属に属することが判明した。本発明において、アミンデヒドロゲナーゼ生産
菌の培養に用いる培地の栄養源としては、微生物
の培養に通常用いられるものが広く使用され得
る。すなわち、炭素源としては炭水化物（たとえば
グルコース、グリセロール、フラクトース等）、
有機酸（たとえばクエン酸、コハク酸等）、アミ
ノ酸（たとえばグルタミン酸、アスパラギン等）、
炭化水素（たとえばｎ−ドデカン等）、あるいは
脂肪族アミン及び／又は脂肪族ジアミン（たとえ
ばヘキシルアミン、ドデシルアミン、ドデカメチ
レンジアミン等）などが使用できる。窒素源とし
てはアンモニア、無機および有機アンモニウム塩
（たとえば塩化アンモニウム、燐酸アンモニウム、
硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、コハク酸
アンモニウム等）、含窒素有機物（たとえば尿素、
ペプトン、NZアミン、肉エキス、酵母エキス、
コーンスチープリカー、カゼイン加水分解物等）、
あるいはアミノ酸（たとえばグルタミン酸、アス
パラギン、チロシン等）などが使用できる。無機
塩としては各種燐酸塩、硫酸マグネシウムなどが
使用できる。さらに微量の重金属塩類が使用され
るが、天然物を含む培地では必ずしも添加を必要
としない。また、栄養要求を示す変異株を用いる
場合には、当然その栄養要求を満足させる物質を
培地に加えなければならない。培養は通常、振盪または通気撹拌培養などの好
気的条件下に行なうのがよい。水に難溶性の炭素
源等を使用する場合には、ポリオキシエチレンソ
ルビタン等の各種界面活性剤、あるいはアセト
ン、エタノール等の有機溶媒を培地に添加するこ
とも可能である。培地のPHは6.0〜10.0、培養温
度は20〜40℃、培養期間は通常18〜96時間であつ
て、酵素の生産蓄積量が最高に達する時期を見計
らつて培養を終了すればよい。培養菌体からのアミンデヒドロゲナーゼの抽出
法については、一般的な菌体からの酵素の抽出法
が適用できる。例えば、得られた培養液から遠心
分離などの方法により生菌体を採取し、生菌又は
その凍結乾燥菌体を磨砕、自己消化、音波処理に
より菌体を破壊し、該酵素を遊離させる。更に、
この菌体処理物を遠心分離等により粗酵素を含む
上清を菌体破片より分離する。上記粗酵素は、更にイオン交換樹脂法、DEAE
セルロース、CMセルロース、DEAEセフアデツ
クスＡ−50、QAEセフアデツクスＡ−50又はSE
セフアデツクスなどのイオン交換セフアデツクス
やセフアデツクスＧ−100、セフアデツクスＧ−
200などのセフアデツクスやトヨパールHW−
55SFなどを用いるゲルろ過法、等電点分画法、
アセテート膜澱粉、アクリルアミドゲルを用いる
電気泳動法、その他等電点沈殿法などの個々の手
段又はこれらの適当な組み合わせを適宜利用する
ことによつて精製酵素とすることができる。本発明に使用するアミンデヒドロゲナーゼＭは
必ずしも純粋である必要はない。すなわち菌体を
破壊した菌体処理物や菌体処理物より菌体破片を
除去した粗酵素も使用可能である。もちろん、こ
れらの固定化酵素であつても良い。本酵素の活性は本酵素反応において生成した
PMSH₂（PMS；Ｎ−メチルフエナゾニウムメソ
サルフエード）と反応する2.6−ジクロロフエノ
ールインドフエノール（DCPIP）の量を600mμ
の吸光度にて測定した。測定に際しては、40mM
のトリス−塩酸緩衝液（PH7.3）、1mMのKCN、
5mMのPMS、0.05mMのDCPIPの溶液を用い、
1mMの基質及び酵素溶液を加え、30℃で30〜120
分間反応を行つた。反応時間１分間当たり1μM
のアルデヒドを生成させる酵素量を１単位とす
る。次に、本発明において使用されるシユードモナ
ス・エスピー・K95の生産する新規酵素、アミン
デヒドロゲナーゼＭの理化学的性質について述べ
る。作用及び基質特異性広い基質特異性を示し、モノアミン、ジアミン
のほかに２級アミン、３級アミンにも作用する。
アミン類のアミノ基に作用してアンモニアを放出
し、対応するアルデヒドを生産する。安定PH及び至適PH PH６〜９に安定PHを有し、PH７〜7.5に至適PH
を有する。作用温度及び至適温度 20〜45℃に作用温度を有し、30〜40℃付近に至
適温度を有する。 PH、温度等による失活条件 70℃、５分間の熱処理で完全に失活する。PH
は、5.5以下又は9.5以上で失活する。阻害、活性化及び安定化 1mMのカルボニル試薬（イソニアジド、セミ
カルバジド）で阻害され、活性化剤、安定化剤は
特にない。分子量約42000の分子量を有する。（SDS−ポリアクリルアミド電気泳動法）等電点 PH8.4に等電点を有する。本発明においてアミンデヒドロゲナーゼＭをを
アミン類に作用させてアミン類を酸化し、相当す
るアルデヒドを生成させる。生成したアルデヒド
はガスクロマトグラフイーで確認できる。本発明の酵素は基質特異性が広く、種々のアミ
ン類に適用できる。基質として用いるアミン類と
しては、例えば１級モノアミンとして、メチルア
ミン、エチルアミン、ｎ−プロピルアミン、ｎ−
ブチルアミン、ｉ−ブチルアミン、ｎ−ペンチル
アミン、ｉ−ペンチルアミン、ｎ−ヘキシルアミ
ン、ｎ−ヘプチルアミン、ｎ−オクチルアミン、
ｎ−ノニルアミン、ｎ−デシルアミン、ｎ−ウン
デシルアミン、ｎ−ドデシルアミン、ｎ−テトラ
デシルアミンが挙げられる。１級ジアミンとして、エチレンジアミン、プロ
ピレンジアミン、ブチレンジアミン、ペンタメチ
レンジアミン、ヘキサメチレンジアミン、ヘプタ
メチレンジアミン、オクタメチレンジアミン、ノ
ナメチレンジアミン、デカメチレンジアミン、ド
デカメチレンジアミンなどが挙げられる。 ω−アミノ酸としては、６−アミノヘキサン
酸、８−アミノオクタン酸、11−アミノウンデカ
ン酸酸、12−アミノドデカン酸などが挙げられ
る。置換１級アミンとしては、ベンジルアミン、フ
エネチルアミン、チラミン、１−ノルアドレナリ
ン、ヒスタミンなどが挙げられる。２級アミンとしては、ジ−ｎ−ブチルアミン、
ジ−ｎ−ヘキシルアミンなどが挙げられる。３級アミンとしては、トリエチルアミン、トリ
−ｎ−ブチルアミン、トリ−ｎ−ヘキシルアミン
などが挙げられる。ポリアミンとしては、スペルミン、スペルミジ
ンなどが挙げられる。反応系における基質としてのアミン類の量は特
に制限はないが、通常液中濃度として0.01〜10重
量％の範囲で使用される。而して反応に際しては、基質の他に補酵素であ
るPMS等の電子受容体を微量添加することが必
要である。反応系における酵素の量は、前記の酵素の分離
精製あるいは処理方法によつて異なるが、特に制
限はなく、それぞれの基質の量比、酵素の活性、
その他の条件によつて適宜変更し得る。この反応
における反応温度は通常20〜45℃の範囲であり、
また反応時のPHは６〜９の範囲である。而して反応液中に生成したアルデヒドを単離す
るには、シリカゲル、イオン交換樹脂のカラムク
ロマトグラフイーなど通常用いられる分離手段を
用いて容易に行なうことができる。本発明の酵素は、有害なアミン類の分解や臨床
分析等への応用、更に有用なアルデヒドの製造法
へのの応用など広い分野に応用できるものであ
る。次に、実施例をもつて本発明を具体的に説明す
るが、本発明はこれらによつて限定されるもので
はない。実施例１シユードモナス・エスピー・Ｋ−95株を下記組
成の液体培地20を仕込んだジヤーフアーメンタ
ーにて30℃、600rpm、1VVM（通気量）で60時
間培養を行なつた。

【表】培養後遠心分離機にて集菌し、更に菌体をフレ
ンチプレス（20000PSI）にて破砕し、超遠心処
理して細胞破片などを除去し、上清を粗酵素画分
とした。アミンデヒドロゲナーゼＭを含有する祖酵素液
に40mMトリス−塩酸緩衝液（PH7.2）に解かし
た硫酸ストレプトマイシンを氷冷下滴下し、30分
静置後遠心分離し、上清を得る。得られた上清に精製硫安を加え、PH7.2にて40
％飽和として30分静置後遠心分離し、上清を得
る。更に、精製硫安を加えて70％飽和にし、2N
アンモニア水にてPH7.6に調製する。30分静置後
遠心分離して沈殿を得、40mMトリス−塩酸緩衝
液（PH7.2）−70％硫安飽和溶液にて沈殿を集め、
これを10mMトリス−塩酸緩衝液（PH8.3）に溶
かし、一夜透析する。 10mMトリス−塩酸緩衝液（PH8.3）で平均化
したDEAE−セルロース（ワツトマン社製DE−
52）に上記粗酵素を吸着させ、同緩衝液で洗浄
し、０〜150mMの食塩水により直線的濃度勾配
で溶出し、アミンデヒドロゲナーゼＭの活性画分
を10mMリン酸ナトリウム緩衝液（PH6.8）で平
均化したCM−セルロース（ワツトマン社製CM
−52）のカラムに通液し、同緩衝液で洗浄し、０
〜70mMの食塩水により直線的濃度勾配で溶出
し、アミンデヒドロゲナーゼＭの活性画分を集め
た。更に、この活性画分をトヨパールHW−55SF
（東洋曹達社製）のカラムに通液してゲルろ過を
行い、40mMトリス−塩酸緩衝液（PH7.2）にて
溶出してアミンデヒドロゲナーゼＭの酵素的単一
標品を得る。本酵素はデイスク電気泳動及びSDS
電気泳動的に均一であつた。結果を表１、図１，２，３に示した。以上の操
作によりデイスク電気泳動、SDS電気泳動的に均
一となつた。実施例２基質としてｎ−ヘキシルアミンを用いた。
5mMのPMSを含む51mMのリン酸バツフアー溶
液（PH7.0）100ml中に10mgのｎ−ヘキシルアミン
及びアミンデヒドロゲナーゼM20単位を含む溶液
を300ml容三角フラスコに入れ、30℃にて120分反
応を行なつた。反応終了後、ジエチルエーテルにて抽出し、ガ
スクロマトグラフイーにてｎ−ヘキシルアルデヒ
ドの定量を行なつたところ5.7mg得られた。本品はガスクロマトグラフイーにより標品と一
致し、ｎ−ヘキシルアルデヒドであると同定され
た。実施例３基質として表２に示すような各種アミン類を
1mM用い、40mMのトリス・塩酸（PH7.3）、
1mMのKCN、5mMのPMS、0.05mMのDCPIP
及びアミンデヒドロゲナーゼM1単位を含む10ml
を大型試験管に取り、30℃にて120分反応を行な
つた。酵素活性は反応するDCPIP量を600mμの吸光
度によつて測定した。表２にドデカメチレンジア
ミンを基質とした場合の活性を100としてその比
活性を結果として示した。

【図面の簡単な説明】

図１は実施例１における本酵素のDEAE−セル
ロースによるカラムクロマトグラフムであり、図
２は同じ酵素のCM−セルロースによるカラムク
ロマトグラムである。更に、図３はゲルろ過よる
カラムクロマトグラムである。

【表】

Claims

【特許請求の範囲】１次の理化学的性質を有するアミンデヒドロゲ
ナーゼＭ。作用及び基質特異性広い基質特異性を示し、モノアミン、ジアミン
のほかに２級アミン、３級アミンにも作用する。
アミン類のアミノ基に作用してアンモニアを放出
し、対応するアルデヒドを生産する。安定PH及び至適PH PH６〜９に安定PHを有し、PH７〜7.5に至適PH
を有する。作用温度及び至適温度 20〜45℃に作用温度を有し、30〜40℃付近に至
適温度を有する。 PH、温度等による失活条件 70℃、５分間の熱処理で完全に失活する。 PHは、5.5以下又は9.5以上で失活する。阻害、活性化及び安定化 1mMのカルボニル試薬（イソニアジド、セミ
カルバジド）で阻害され、活性化剤、安定化剤は
特にない。分子量約42000の分子量を有する。（SDS−ポリアクリルアミド電気泳動法）等電点 PH8.4に等電点を有する。