JPH07313140A - 凍結又は凍結乾燥乳酸菌類菌体の製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 凍結又は凍結乾燥工程において菌体の損傷又
は死滅が少なく、かつ生残率の高い凍結又は凍結乾燥乳
酸菌類菌体の製造法を提供する。 【構成】 乳酸菌類の菌体分散液に、少なくとも０．５
％（重量）の濃度でコンニャク粉に含まれる多糖類の部
分加水分解物を添加して均一に混合し、凍結又は凍結乾
燥することを特徴とする凍結又は凍結乾燥乳酸菌類菌体
の製造法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、コンニャク粉に含まれ
る多糖類の部分加水分解物を保護剤として使用すること
により、凍結融解時及び凍結乾燥時の乳酸菌類菌体の損
傷及び死滅が少なく、かつ高い生残率を有する凍結又は
凍結乾燥乳酸菌類菌体の製造法に関するものである。

【０００２】本明細書において百分率は、乳酸菌類の生
残率を除き、特に断りのない限り重量による値であり、
ビフィドバクテリウム( Bifidobacterium)に属する微生
物をビフィズス菌、ビフィズス菌以外の乳酸菌を乳酸菌
等、ビフィズス菌及び乳酸菌等をまとめて乳酸菌類と記
載することがある。

【０００３】

【従来の技術】乳酸菌類は有用な腸内細菌の一つとして
広く知られており、特にビフィズス菌の生理学的意義に
ついては多数の報告があり、腸内において乳酸、酢酸等
の有機酸を産生し、かつ有害菌の増殖を抑制する作用、
ビタミンの産生、免疫力の賦活化等が明らかにされてい
る。

【０００４】そのため、ビフィズス菌を摂取することに
より健康を維持することを目的として、ヨ−グルト、菓
子類、飲料類等のビフィズス菌を含む種々の食品が開発
されている。これらの食品にビフィズス菌を添加する場
合、予め培養したビフィズス菌を加工して添加するが、
その加工には多大な労力及び時間を要し、また加工にお
いて高い生残率を維持するためには、技術的に極めて困
難な点があった。

【０００５】一方、乳酸菌等は古くからヨ−グルト、チ
−ズ等極めて多数の乳製品に、スタ−タ−として利用さ
れており、また近年、ビフィズス菌と同様に、その整腸
作用を期待して種々の食品に添加されている。従来、こ
れらの乳酸菌等は、牛乳等で培養することによりその菌
体を取得しているが、そのために多くの労力と時間を要
し、また菌株の品質管理等について十分に注意をしなけ
ればならないという問題があった。

【０００６】従って、予め凍結又は凍結乾燥したビフィ
ズス菌又は乳酸菌等の生菌体を用いることにより、ビフ
ィズス菌又は乳酸菌等を含有する食品、例えばヨ−グル
ト、チ−ズ等の乳製品が簡単に製造することができる。
しかしながら、これらの製品の製造に必要な菌濃度を有
する凍結又は凍結乾燥乳酸菌類を調製することは、融解
時又は凍結乾燥時において、菌体が被る損傷及び／又は
死滅を防止しなければならないので、極めて困難であっ
た。

【０００７】従来、これらの問題を解決するために多く
の凍結保護物質及び凍結乾燥保護物質が開発された。こ
れらの物質には脱脂乳、グルタミン酸ナトリウム、ゼラ
チン及びしょ糖（特公昭５３−８７９２号公報）、フェ
ニルアラニン、ヒスチジン、クエン酸、コハク酸、酒石
酸及び炭酸アルカリ（特開昭６１−２６５０８５号公
報）等が知られており、その他に、グルコ−ス、トレハ
ロ−ス、脱脂粉乳、アスコルビン酸ソ−ダ−等も知られ
ている［クライオバイオロジー(CRYOBIOLOGY) ，第２６
巻，第１４９〜１５３ページ，１９８９年］。

【０００８】しかしながら、これらの従来技術によって
も凍結時及び凍結乾燥時の菌体の損傷又は死滅は甚大で
あり、高濃度、かつ安定した凍結菌体又は凍結乾燥菌体
を調製するのは困難であった。特に、菌体調製時に菌体
分散液と菌が資化する保護物資とを混合した状態におい
ては、可及的低温で、かつ迅速に凍結作業を実施しなけ
れば、菌の活発な代謝により生産される酸により凍結す
べき菌体分散液のｐＨが低下し、生残率が顕著に低下す
る。更に凍結時の菌体分散液のｐＨは、融解時又は凍結
乾燥時の菌体の損傷又は死滅に著しい影響を与えるた
め、凍結前の菌体分散液のｐＨには十分な注意を払い、
場合によってはアルカリ等で中和する必要があった。

【０００９】また、融解と凍結乾燥とでは菌体が被る損
傷又は死滅の機構が異なり、そのため凍結乾燥に対する
有効な保護剤が、必ずしも融解に対する有効な保護剤と
はなり得ない。また逆に融解に対する有効な保護剤が、
必ずしも凍結乾燥に対する有効な保護剤とはなり得ず、
凍結菌体又は凍結乾燥菌体調製のためには、それぞれ別
個の保護剤を検討しなければならないという不都合があ
った。

【００１０】更に、凍結又は凍結乾燥菌体の製造工程に
おいては、菌体分散液を凍結する速度が菌体の損傷又は
死滅に対して甚大な影響を与える。即ち、可及的速やか
に液温を低下させることが望ましいが、工業的規模で製
造する場合には、急速凍結を実施するうえで克服しなけ
ればならない問題が多数存在していた。

【００１１】以上のように従来、乳酸菌類の凍結又は凍
結乾燥工程において菌体の損傷又は死滅を防止し得る汎
用保護剤は存在せず、その開発が待望されていた。

【００１２】一方、本発明者らは、コンニャク粉に含ま
れる多糖類の部分加水分解物であって、平均分子量が
２，０００〜１５，０００ダルトンである水溶性食物繊
維を発明し、既に特許出願し（特開平２−２２２６５９
号公報。以下先願と記載する）、更にこの水溶性食物繊
維の用途について腹膜透析液（特開平４−１５４７２５
号公報）及び大腸ガン予防剤（特開平５−２４６８６０
号公報）の発明を完成し、既に特許出願した。

【００１３】

【発明が解決しようとする課題】本発明者らは、前記従
来技術に鑑みて、乳酸菌類の凍結及び凍結乾燥工程にお
いて菌体の損傷又は死滅を防止し得る汎用保護剤につい
て鋭意研究を行う一方、前記水溶性食物繊維の用途につ
いて探索も行った結果、コンニャク粉に含まれる多糖類
の部分加水分解物であって、平均分子量が２，０００〜
１５，０００ダルトンの分画が、乳酸菌類の凍結又は凍
結乾燥工程において菌体の損傷又は死滅を防止し得るこ
とを見い出し、本発明を完成した。

【００１４】本発明は、凍結又は凍結乾燥工程において
菌体の損傷又は死滅が少なく、かつ生残率の高い凍結又
は凍結乾燥乳酸菌類菌体の製造法を提供することを目的
としている。

【００１５】

【課題を解決するための手段】前記課題を解決する本発
明は、乳酸菌類の菌体分散液に、少なくとも０．５％
（重量）の濃度でコンニャク粉に含まれる多糖類の部分
加水分解物を添加して均一に混合し、凍結又は凍結乾燥
することを特徴とする凍結又は凍結乾燥乳酸菌類菌体の
製造法であり、コンニャク粉に含まれる多糖類の部分加
水分解物が、２，０００〜１５，０００ダルトンの平均
分子量を有すること、コンニャク粉に含まれる多糖類の
部分加水分解物が、２〜１０％（重量）の濃度で添加さ
れること、並びに乳酸菌類が、ビフィドバクテリウム(B
ifidobacterium) に属する微生物、ラクトバシラス(Lac
tobacillus) に属する微生物、ストレプトコッカス(Str
eptococcus) に属する微生物及びエンテロコッカス(Ent
erococcus)に属する微生物からなる群より選択される微
生物又はこれらの任意の混合微生物であることを望まし
い態様としてもいる。

【００１６】次に本発明について詳述する。

【００１７】本発明に使用するコンニャク粉に含まれる
多糖類の部分加水分解物であって、平均分子量が２，０
００〜１５，０００ダルトンの分画（以下当該加水分解
物と記載することがある）は、前記先願の方法により、
次のとおり製造することができる。

【００１８】市販のコンニャク粉（精粉、中粉又は荒
粉）、コンニャク粉から分離したグルコマンナン又はア
ルコールで脱色、脱臭したコンニャク粉等を出発原料と
して使用することができる。

【００１９】加水分解に使用する酵素は、グルコマンナ
ンを加水分解するものであり、例えば、アスペルギルス
・ニガー(Aspergillus nigar) 若しくはトリコデルマ・
ビリデ(Trichoderma viride)、ペニシリウム・ノターツ
ム(Penicillium notatum) のセルラーゼ、ストレプトマ
イセス(Streptomyces)属に属する微生物、リゾプス・ニ
ベウス(Rhizopus niveus) 、又はバシラス・サーキュラ
ンス(Bacillus circulans)若しくはコンニャクの塊茎の
マンナナーゼ等があるが、グルコマンナンの分子内β−
グルコシド結合を加水分解（エンド型）する酵素の中
で、特にアスペルギルス属に属する微生物由来のセルラ
ーゼを用いるのが望ましい。

【００２０】酵素反応のｐＨ及び反応時間は、反応生成
物の収量及び分子量に大きな影響を及ぼす。即ち市販酵
素製剤はエンド型及び末端のβ−グルコシド結合を加水
分解するエキソ型酵素のエキソ−１，４−β−Ｄ−グル
カナーゼ、β−グルコシダーゼ等の混合物であるため酵
素中に含まれるエキソ型の酵素の活性を低下させる条件
下で酵素反応を行なわせ、単糖及びオリゴ糖の遊離を最
小にする反応液のｐＨ及び反応時間、例えば、４０℃で
４〜１６時間又は５５℃で４時間保持する。

【００２１】次いで加熱して酵素を失活させ、上澄液を
集め、そのまま又はイオン交換樹脂若しくは活性炭によ
り、脱塩、脱色、脱臭を行ない、濃縮し、更に乾燥し、
粉末化することができる。

【００２２】以上のようにして製造された当該加水分解
物は、平均分子量が２，０００〜１５，０００ダルトン
である。

【００２３】本発明において使用するビフィズス菌は、
ビフィドバクテリウム(Bifidobacterium) 属に属する微
生物であり、例えば、ビフィドバクテリウム・ロンガム
(Bifidobacterium longum)、ビフィドバクテリウム・イ
ンファンティス(Bifidobacterium infantis)、ビフィド
バクテリウム・アドレッセンティス(Bifidobacteriumad
olescentis)、ビフィドバクテリウム・ブレーベ(Bifido
bacterium breve) 等であり、いずれも市販されている
か、又は寄託機関から容易に入手できる菌株である。

【００２４】また本発明において使用する乳酸菌等は、
一般に乳酸菌に分類されている微生物であり、例えばラ
ルトバシラス(Lactobacillus) 属に属する微生物［例え
ば、ラルトバシラス・アシドフィルス(Lactobacillus a
cidophilus) 、ラルトバシラス・カゼイ(Lactobacillus
casei) 、ラルトバシラス・ブルガリカス(Lactobacill
us bulgaricus)等］、ストレプトコッカス(Streptococc
us) 属に属する微生物［例えば、ストレプトコッカス・
サーモフィルス(Streptococcus thermophilus)、ストレ
プトコッカス・ラクティス(Streptococcus lactis)
等］、ラクトコッカス(Lactococcus) 属に属する微生物
［例えば、ラクトコッカス・ラクティス(Lactococcus l
actis)、ラクトコッカス・プランタルム(Lactococcus p
lantarum) 等］、エンテロコッカス(Enterococcus)属に
属する微生物［例えば、エンテロコッカス・フェシウム
(Enterococcus faecium)、エンテロコッカス・フェカー
リス(Enterococcus faecalis) 等］等であり、いずれも
市販されているか、又は寄託機関から容易に入手できる
菌株である。

【００２５】乳酸菌類の菌体は常法により製造すること
ができる。例えば、グルコ−ス、酵母エキス、ペプトン
等を含む液体培地で前記乳酸菌類の１種又は２種以上を
通常２５〜４５℃で４〜２４時間培養し、培養液から菌
体を集菌し、洗浄し、湿菌体を得る。

【００２６】得られた湿菌体を通常０．５〜１０％の濃
度（菌体の保存、菌体の大量生産等の目的により湿菌体
の分散濃度は異なる〃）で水に分散し、当該加水分解物
を０．５〜２５％、望ましくは２〜１０％、の濃度で菌
体分散液に添加し、均一に混合する。前記菌体の分散濃
度範囲では、当該加水分解物の添加濃度は、菌体の分散
濃度には無関係であり、菌体分散液中の濃度によって保
護効果が奏せられる。

【００２７】この混合液のｐＨが酸性である場合には、
水酸化ナトリウム、炭酸ナトリウム、水酸化カリウム等
のｐＨ調整剤によりほぼ中性、望ましくは６〜８、にｐ
Ｈを調整する。

【００２８】この混合液の凍結又は凍結乾燥は常法によ
り行うことができ、凍結する場合は、例えば−２０℃〜
−１６０℃以下（液体窒素等を使用）、凍結乾燥する場
合は、棚温度３５℃以下、５０〜４００ｈＰａ程度の真
空下で行うことができる。

【００２９】本発明においては、以上のように当該加水
分解物を添加、混合することにより凍結又は凍結乾燥時
の乳酸菌類の損傷又は死滅を軽減し、かつ高い生残率で
高濃度の乳酸菌類の凍結菌体又は凍結乾燥菌体を得るこ
とができる。尚、本発明の方法は、乳酸菌類以外の細
菌、酵母等にも、乳酸菌類と同様に適用できる。

【００３０】次に試験例を示して本発明を詳述する。

【００３１】試験例１ この試験は、乳酸菌類の分散液のｐＨ、凍結速度及び静
置の有無に与える当該加水分解物の効果を調べるために
行った。

【００３２】１）試料の調製 ペプトン（ディフコ社製）１％、酵母エキス（ディフコ
社製）１％、グルコ−ス（ディフコ社製）１％、アミノ
酸混合物（関東化学社製。必須アミノ酸２０種を各１％
含む）０．５％を含む液体培地（ｐＨ６．５）にビフィ
ドバクテリウム・ロンガム(Bifidobacterium longum)Ａ
ＴＣＣ１５７０７（ＡＴＣＣから入手）を接種し、３７
℃で１２時間培養した。培養終了後、培養液を集菌、水
で洗浄し、再び集菌し、ビフィズス菌の湿菌体を得た。

【００３３】この湿菌体を、参考例１と同一の方法によ
り製造した当該加水分解物（平均分子量３，０００ダル
トン）の１０％溶液に菌体固形分１２％の割合で分散し
た試料（試料１）、湿菌体を、前記と同一の当該加水分
解物１０％、市販脱脂粉乳５％及びグルタミン酸ソ−ダ
−（関東化学社製）２％を含む溶液に同様に分散した試
料（試料２）及び同一の湿菌体を脱脂粉乳及びグルタミ
ン酸ソ−ダ−を各５％を含む溶液に同様に分散した試料
（対照）を調製した。

【００３４】２）試験方法 ｐＨについて 各試料を表１に示すｐＨ４〜１０に調整し、液体窒素を
用いて急速凍結し、のち室温で融解し、後記する方法に
より生残率を試験した。

【００３５】凍結速度について ｐＨ７．０に調製した各試料を、液体窒素を用いて急速
凍結した試料、及び−３０℃の冷凍庫で緩慢凍結させた
試料を、室温で融解し、後記する方法により生残率を試
験した。

【００３６】静置の有無について ｐＨ７．０に調製した各試料を、２０℃で３時間静置し
た試料及び静置しない試料を調製し、液体窒素を用いて
急速凍結し、のち室温で融解し、後記する方法により生
残率を試験した。尚、静置した試料については凍結前に
ｐＨメーターを用いて常法によりｐＨを測定した。

【００３７】生残率 各試料の凍結前後の生菌数を常法により測定し、次式か
ら生残率を算出した。 生残率（％）＝（凍結融解後１ｇ当たりの生菌数／凍結
前１ｇ当たりの生菌数）×１００

【００３８】３）試験結果 この試験の結果は、表１、表２及び表３に示すとおりで
ある。表１の凍結前のｐＨによる生残率から明らかなよ
うに、当該加水分解物単独及び当該加水分解物と公知の
保護剤とを併用した試料１及び２は、公知の保護剤のみ
を使用した対照に比していずれのｐＨにおいても生残率
が高く、特に当該加水分解物と公知の保護剤とを併用し
た試料２の生残率が高いことが認められた。

【００３９】表２の凍結速度による生残率から明らかな
ように、ビフィズス菌が損傷を被りやすい緩慢凍結の条
件下においても、当該加水分解物単独及び当該加水分解
物と公知の保護剤とを併用した試料１及び試料２は、高
い生残性が認められた。

【００４０】表３の静置の有無による生残率から明らか
なように、凍結までにある程度の時間を要しても、当該
加水分解物単独及び当該加水分解物と公知の保護剤とを
併用した試料１及び試料２は、生残率の低下が認められ
なかった。特に、凍結前の試料２は、凍結前の対照とほ
ぼ同一のｐＨであるにもかかわらず、対照に比して顕著
に高い生残率を示した。

【００４１】以上の結果から本発明の方法は、乳酸菌類
の凍結融解に極めて有効であることが立証された。尚、
乳酸菌類及び当該加水分解物の種類を変更して試験した
が、ほぼ同様の結果が得られた。

【００４２】

【表１】

【００４３】

【表２】

【００４４】

【表３】 試験例２ この試験は、試験例１とは異なる当該加水分解物につい
て凍結乾燥における効果を調べるために行った。

【００４５】１）試料の調製 参考例２と同一の方法で得た当該加水分解物（平均分子
量７，０００ダルトン）を使用したこと及びグルタミン
酸ナトリウム及びアスパラギン酸ナトリウムを各２％含
む溶液を使用したことを除き、試験例１と同一の方法に
より試料３及び４を調製した。

【００４６】尚、ショ糖８％、グルタミン酸ナトリウム
及びアスパラギン酸ナトリウム各２％含む保護溶液を使
用したことを除き、試験例１と同一の方法により対照試
料を調製した。

【００４７】２）試験方法 １００〜２００ｈＰａの真空度、３０℃以下の温度で各
試料を凍結乾燥したことを除き、試験例１と同一の方法
によった。ただし、凍結乾燥試料の乳酸菌類の生残率
は、次式から算出した。 生残率（％）＝［凍結乾燥後１ｇ当たりの生菌数×凍結
前溶液固形分（％）／凍結前１ｇ当たりの生菌数×１０
０］×１００

【００４８】３）試験結果 この試験の結果は、表４、表５及び表６に示すとおりで
ある。表４の凍結前のｐＨによる生残率から明らかなよ
うに、当該加水分解物単独及び当該加水分解物と公知の
保護剤とを併用した試料３及び試料４は、公知の保護剤
のみを使用した対照に比していずれのｐＨにおいても生
残率が高く、特に当該加水分解物と公知の保護剤とを併
用した試料４の生残率が高いことが認められた。

【００４９】表５の凍結速度による生残率から明らかな
ように、ビフィズス菌が損傷を被りやすい緩慢凍結の条
件下においても、当該加水分解物単独及び当該加水分解
物と公知の保護剤とを併用した試料３及び試料４は、高
い生残性が認められた。

【００５０】表６の静置の有無による生残率から明らか
なように、凍結するまでにある程度の時間を要した場合
であっても、当該加水分解物単独及び当該加水分解物と
公知の保護剤とを併用した試料３及び試料４は、顕著な
生残率の低下が認められなかった。これに対して対照で
は、静置により生残率が激減し、ほとんど生菌が存在し
ない状態であった。

【００５１】以上の結果から本発明の方法は、乳酸菌類
の凍結乾燥においても極めて有効であることが立証され
た。尚、乳酸菌類及び当該加水分解物の種類を変更して
試験したが、ほぼ同様の結果が得られた。

【００５２】

【表４】

【００５３】

【表５】

【００５４】

【表６】 試験例３ この試験は、各種乳酸菌類の凍結融解に対する当該加水
分解物の効果を調べるために行った。

【００５５】１）試料の調製 ペプトン（ディフコ社製）１％、酵母エキス（ディフコ
社製）１％、グルコ−ス（ディフコ社製）１％、アミノ
酸混合物（関東化学社製。必須アミノ酸２０種を各１％
含む）０．５％、リン酸一カリウム（ナカライテスク社
製）及びリン酸二カリウム（ナカライテスク社製）を各
０．２％含む液体培地（ｐＨ６．５）に、ストレプトコ
ッカス・サーモフィルス(Streptococcus thermophilus)
ＡＴＣＣ１９２５８（ＡＴＣＣから入手）、ラクトバシ
ラス・ブルガリカス(Lactobacillus bulgaricus)ＡＴＣ
Ｃ１１８４２（ＡＴＣＣから入手）、ラクトバシラス・
アシドフィルス(Lactobacillus acidophilus) ＡＴＣＣ
４３５６（ＡＴＣＣから入手）及びエンテロコッカス・
フェシウム(Enterococcus faecium)ＩＦＯ３１２８（Ｉ
ＦＯから入手）をそれぞれ別個に接種し、３７℃で１２
時間培養した。培養終了後、培養液を集菌し、水で洗浄
し、再び集菌し、各乳酸菌類の湿菌体を得た。

【００５６】この湿菌体を、参考例１と同一の方法によ
り製造した当該加水分解物（平均分子量３，０００ダル
トン）の１０％溶液に、菌体固形分１２％の割合で分散
した試料（試料５）同一の湿菌体を、脱脂粉乳及びグル
タミン酸ソ−ダ−各５％を含む溶液に同様に分散した試
料（対照）を調製し、以下試験例１と同一の方法により
緩慢凍結及び急速凍結した。又試験例１と同様に凍結前
に静置した試料も調製した。

【００５７】２）試験方法 試験例１と同一の方法によった。

【００５８】３）試験結果 この試験の結果は、表７及び表８に示すとおりである。
表７の凍結速度による生残率から明らかなように、乳酸
菌類が損傷を被りやすい緩慢凍結の条件下においても、
本発明の方法で製造した試料５は、いずれの菌種につい
ても対照に比して高い生残性が認められた。

【００５９】表８の静置の有無による生残率から明らか
なように、凍結するまでにある程度の時間を要した場合
であっても、本発明の方法で製造した試料５は、いずれ
の菌種についても対照に比して顕著な生残率の低下が認
められなかった。

【００６０】以上の結果から本発明の方法は、各種乳酸
菌類の凍結融解においても極めて有効であることが立証
された。尚、乳酸菌類及び当該加水分解物の種類を変更
して試験したが、ほぼ同様の結果が得られた。

【００６１】

【表７】

【００６２】

【表８】 試験例４ この試験は、コンニャク粉に含まれる多糖類の部分加水
分解物の平均分子量による凍結融解に対する効果を調べ
るために行った。

【００６３】１）試料の調製 参考例２〜４と同一の方法により製造した各種平均分子
量のコンニャク粉に含まれる多糖類の部分加水分解物を
用いたことを除き、試験例３と同一の方法により各種乳
酸菌類の凍結菌体を調製した。

【００６４】２）試験方法 試験例１と同一の方法によった。

【００６５】３）試験結果 この試験の結果は、表９に示すとおりである。表９から
明らかなように、当該加水分解物（平均分子量２，００
０〜１５，０００ダルトン）が、いずれの乳酸菌類に対
しても顕著に高い生残率を示し、乳酸菌類の凍結融解保
護効果を有することが認められた。尚、他の方法により
製造した当該加水分解物及び他の乳酸菌類についても試
験したが、ほぼ同様の結果が得られた。

【００６６】

【表９】 試験例５ この試験は、コンニャク粉に含まれる多糖類の部分加水
分解物の平均分子量による凍結乾燥に対する効果を調べ
るために行った。

【００６７】１）試料の調製 参考例２〜４と同一の方法により製造した各種平均分子
量のコンニャク粉に含まれる多糖類の部分加水分解物を
用いたことを除き、試験例２と同一の方法により各種乳
酸菌類の凍結乾燥菌体を調製した。

【００６８】２）試験方法 試験例２と同一の方法によった。

【００６９】３）試験結果 この試験の結果は、表１０に示すとおりである。表１０
から明らかなように、当該加水分解物（平均分子量２，
０００〜１５，０００ダルトン）が、いずれの乳酸菌類
に対しても顕著に高い生残率を示し、乳酸菌類の凍結乾
燥保護効果を有することが認められた。尚、他の方法に
より製造した当該加水分解物及び他の乳酸菌類について
も試験したが、ほぼ同様の結果が得られた。

【００７０】

【表１０】 試験例６ この試験は、当該加水分解物の有効量を調べるために行
った。

【００７１】１）試料の調製 参考例１と同一の方法により製造した当該加水分解物
を、菌体分散液に対して表１１に示す各種の割合で用い
たことを除き、試験例１と同一の方法により各種乳酸菌
類の凍結菌体を調製した。

【００７２】２）試験方法 試験例１と同一の方法によった。

【００７３】３）試験結果 この試験の結果は、表１１に示すとおりである。表１１
から明らかなように、菌体分散液に対する当該加水分解
物の添加割合が０．５％未満の場合は、乳酸菌類の凍結
融解に対する生残率の増加が認められず、添加割合が２
５％を超える場合は、添加割合の増加にともなう生残率
の増加が認められなかった。

【００７４】これに対して菌体分散液に対する当該加水
分解物の添加割合が０．５％〜２５％では、添加割合の
増加による生残率の増加が認められ、特に２〜１０％の
範囲において高い生残率が認められた。従って、菌体分
散液に対する当該加水分解物の添加割合は０．５〜２５
％、望ましくは２〜１０％、である。

【００７５】尚、他の方法により製造した当該加水分解
物及び他の乳酸菌類についても試験したが、ほぼ同様の
結果が得られた。

【００７６】

【表１１】 参考例１ リン酸緩衝液（ｐＨ６．５）８０ｌにアスペルギルス属
に属する微生物に由来するセルラーゼ（商品名：セルラ
ーゼＡ「アマノ」、天野製薬社製品、繊維素糖化力：１
５，０００Ｕ／ｇ）６７ｇを加え、４０℃に加温し、こ
れに市販のコンニャク粉４．０ｋｇを加え、攪拌して溶
解した。この混合液を４０℃に１２時間保持して、酵素
反応を行った後、その反応混合液を１００℃に加熱し、
１０分間か１００℃に保持して、酵素反応を停止した。
その反応混合液を、６，０００Ｇにおいて遠心分離し、
その上澄液を陽イオン交換樹脂(Dowex 50w×8 。Ｈ＋
型）１，０００ｍｌのカラムおよび陰イオン交換樹脂(D
owex 1×8 。ＯＨ−型）４，０００ｍｌのカラムに、順
次通液して脱塩し、濃縮し、噴霧乾燥し、当該加水分解
物約１，２５０ｇを得た。得られた当該加水分解物の平
均分子量は３，０００ダルトンであった。

【００７７】参考例２ セルラーゼによる酵素反応の時間を８時間としたこと以
外は、参考例１と同一の方法により、当該加水分解物約
２，２５０ｇを得た。得られた当該加水分解物の平均分
子量は７，０００ダルトンであった。

【００７８】参考例３ セルラーゼによる酵素反応の時間を２０時間としたこと
以外は、参考例１と同一の方法により、当該加水分解物
約２，９００ｇを得た。得られた当該加水分解物の平均
分子量は１，８００ダルトンであった。

【００７９】参考例４ セルラーゼによる酵素反応の時間を２時間としたこと以
外は、参考例１と同一の方法により、当該加水分解物約
１，０５０ｇを得た。得られた当該加水分解物の平均分
子量は１６，０００ダルトンであった。

【００８０】次に実施例を示して本発明を更に詳述する
が、本発明は、以下の実施例に限定されるものではな
い。

【００８１】

【実施例】

実施例１ ペプトン（ディフコ社製）１％、酵母エキス（ディフコ
社製）１％、グルコ−ス（ディフコ社製）１％、アミノ
酸混合物（関東化学社製。必須アミノ酸２０種を各１％
含む）０．５％を含む液体培地（ｐＨ６．５）３００ｍ
ｌに、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Bifidobacter
ium longum) ＡＴＣＣ１５７０７（ＡＴＣＣから入手）
の前培養液を３％接種し、３７℃で１２時間培養し、
１．４３×１０⁹ ＣＦＵ／ｍｌのビフィズス菌液３００
ｍｌを得た。この菌液を、冷蔵庫で冷却し、３００ｍｌ
の遠心管に入れ、遠心機（トミ−精工社製）により６，
０００×ｇで２０分間の遠心分離を行い、デカンテ−シ
ョンにより上清液を除去した。沈殿した湿菌体に３００
ｍｌの滅菌水（４℃）を添加し、湿菌体を分散し、再び
同様の遠心分離を行い、上清液を同様に除去することに
より湿菌体約０．５ｇを得た。

【００８２】この湿菌体に、参考例１と同一の方法によ
り製造した当該加水分解物（平均分子量３，０００）の
１０％溶液３０ｍｌを添加し、菌体を分散させ、のち１
０％水酸化ナトリウム（ナカライテスク社製）溶液でｐ
Ｈを７．０に調整し、菌体分散液を調製した。

【００８３】この分散液を３ｍｌづつ１０ｍｌのバイア
ル瓶（日電理科化学社製）に充填し、内３本を液体窒素
に２分間浸し、急速凍結を行い、ビフィズス菌急速凍結
菌体を得た。また別のバイアル瓶３本を−３０℃の冷凍
庫（サンヨ−社製）中に１時間放置し、緩慢凍結を行
い、ビフィズス菌緩慢凍結菌体を得た。

【００８４】得られた各凍結菌体を室温で３０分間放置
して融解し、試験例１と同一の方法により生残率を測定
した結果、急速凍結したバイアル瓶中では９５．３％、
緩慢凍結したバイアル瓶中では８５．２％であり、高い
生残率を維持していた。

【００８５】実施例２ 実施例１と同一の方法で得たビフィズス菌の湿菌体０．
５ｇに、参考例２と同一の方法により製造した加水分解
物（平均分子量７，０００）の５％溶液を２０ｍｌ添加
し、湿菌体を分散し、１０％水酸化ナトリウム（ナカラ
イテスク社製）溶液によりｐＨを７．０に調整し、菌体
分散液を調製した。

【００８６】この分散液をトレ−に流し込み、凍結乾燥
機（エドワ−ズ社製）を用いて−４０℃まで冷却して凍
結し、のち３０℃、真空度１０Ｐａの条件下で凍結乾燥
し、約１．５ｇの凍結乾燥菌体を得た。

【００８７】得られた凍結乾燥菌体を、試験例１と同一
の方法により生残率を測定した結果、３０．７％であ
り、高い生残率を維持していた。

【００８８】実施例３ ペプトン（ディフコ社製）１％、酵母エキス（ディフコ
社製）１％、グルコ−ス（ディフコ社製）１％、アミノ
酸混合物（関東化学社製。必須アミノ酸２０種を各１％
含む）０．５％、リン酸一カリウム（ナカライテスク社
製）及びリン酸二カリウム（ナカライテスク社製）を各
０．２％を含む液体培地（ｐＨ６．５）３００ｍｌに、
ラクトバシラス・アシドフィラス（Lactobacillus acid
ophilus)ＡＴＣＣ４３５６（ＡＴＣＣから入手）の前培
養液３％を接種し、３７℃で１２時間培養し、ラクトバ
シラス菌液３００mlを得た。

【００８９】この菌液を、冷蔵庫で冷却し、３００ｍｌ
の遠心管に入れ、遠心機（トミ−精工社製）により６，
０００×ｇで２０分間の遠心分離を行い、デカンテ−シ
ョンにより上清液を除去した。沈殿した湿菌体に３００
ｍｌの滅菌水（４℃）を添加し、湿菌体を分散し、再び
同様の遠心分離を行い、上清液を同様に除去し、湿菌体
約０．６ｇを得た。

【００９０】この湿菌体に、参考例１と同一の方法によ
り製造した加水分解物（平均分子量３，０００）の１０
％溶液３０ｍｌを添加し、菌体を分散し、１０％水酸化
ナトリウム（ナカライテスク社製）溶液でｐＨを７．０
に調整し、菌体分散液を調製した。

【００９１】この分散液を３ｍｌづつ１０ｍｌのバイア
ル瓶（日電理科化学社製）に充填し、内３本のバイアル
瓶を直ちに液体窒素に２分間浸し、凍結させ、凍結菌体
を得た。一方、別の３本のバイアル瓶を、室温で３時間
放置し、のち同様に凍結させ、凍結菌体を得た。

【００９２】得られた各凍結菌体を室温で３時間放置し
て融解し、試験例１と同一の方法により生残率を測定し
た結果、急速凍結したバイアル瓶中では９３．０％、緩
慢凍結したバイアル瓶中では８３．７％であり、高い生
残率を維持していた。

【００９３】

【発明の効果】以上詳述したように、本発明は、凍結時
又は凍結乾燥時の保護剤として当該加水分解物を使用
し、高い生残率を有する凍結又は凍結乾燥乳酸菌類菌体
を製造する方法であり、本発明の方法によって奏せられ
る効果は、次のとおりである。

【００９４】１）凍結又は凍結乾燥工程において損傷又
は死滅が少なく、かつ高い生残率を有する乳酸菌類の凍
結菌体又は凍結乾燥菌体が得られる。

【００９５】２）緩慢な凍結速度においても高い生残率
を有する乳酸菌類の凍結菌体又は凍結乾燥菌体が得られ
る。

【００９６】３）乳酸菌類の湿菌体を製造後、凍結まで
に時間を要した場合であっても高い生残率を有する乳酸
菌類の凍結菌体又は凍結乾燥菌体が得られる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 宮浦 小百合 神奈川県座間市東原５−１−83 森永乳業 株式会社栄養科学研究所内 (72)発明者 財津 明美 神奈川県座間市東原５−１−83 森永乳業 株式会社栄養科学研究所内

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 乳酸菌類の菌体分散液に、少なくとも
   ０．５％（重量）の濃度でコンニャク粉に含まれる多糖
   類の部分加水分解物を添加して均一に混合し、凍結又は
   凍結乾燥することを特徴とする凍結又は凍結乾燥乳酸菌
   類菌体の製造法。
2. 【請求項２】 コンニャク粉に含まれる多糖類の部分加
   水分解物が、２，０００〜１５，０００ダルトンの平均
   分子量を有する請求項１に記載の凍結又は凍結乾燥乳酸
   菌類菌体の製造法。
3. 【請求項３】 コンニャク粉に含まれる多糖類の部分加
   水分解物が、２〜１０％（重量）の濃度で添加される請
   求項１又は請求項２に記載の凍結又は凍結乾燥乳酸菌類
   菌体の製造法。
4. 【請求項４】 乳酸菌類が、ビフィドバクテリウム(Bif
   idobacterium) に属する微生物、ラクトバシラス(Lacto
   bacillus) に属する微生物、ストレプトコッカス(Strep
   tococcus) に属する微生物及びエンテロコッカス(Enter
   ococcus)に属する微生物からなる群より選択される微生
   物又はこれらの任意の混合微生物である請求項１乃至請
   求項３に記載の凍結又は凍結乾燥乳酸菌類菌体の製造
   法。