KR20210059497A

KR20210059497A - 유산균 생육 촉진용 조성물 및 유산균 배양배지

Info

Publication number: KR20210059497A
Application number: KR1020190147009A
Authority: KR
Inventors: 김여진; 배수진; 신동주; 김형철; 박홍욱
Original assignee: 씨제이제일제당 (주)
Priority date: 2019-11-15
Filing date: 2019-11-15
Publication date: 2021-05-25
Also published as: KR102275530B1

Abstract

본 출원은 유산균 생육 촉진용 조성물, 이를 포함하는 유산균 배양배지 및 유산균의 배양방법에 관한 것으로, 본 출원의 조성물, 배양배지 및 배양방법은, 곤충의 효소분해물이 나타내는 유산균의 생장 촉진 효과를 이용하여, 더 많은 수의 유산균을 배양하여 수득할 수 있는 장점이 있다.

Description

유산균 생육 촉진용 조성물 및 유산균 배양배지{Composition for promoting growth of Lactic acid bacteria and a culture medium for Lactic acid bacteria}

본 출원은 유산균 생육 촉진용 조성물, 유산균의 배양배지 및 이를 이용한 유산균의 배양방법에 관한 것이다.

유산균은 발효를 통해 여러 가지 유용 물질을 만들어낼 수 있는 미생물로, 동서양의 역사 속에서 다양한 식품에 유산균을 이용하여 왔다. 예를 들어, 치즈, 요거트, 김치 등의 식품들은 유산균의 발효 과정을 이용하여 만들어지는 식품들이며, 유산균과 유산균에 의해 만들어지는 성분들을 함유하고 있다는 점에서 이를 취식하는 사람의 건강에 도움이 되고 질병의 예방이나 치료에 효과가 있는 것으로 널리 알려져 있다.

상기와 같이 유산균을 함유하는 식품이나 제품을 제조하기 위해서는, 유산균을 배양하는 과정이 수반되어야 하는 경우가 있다. 이 때, 유산균을 배양시키기 위한 배양배지로 흔히 락토바실러스 속 유산균의 배양을 위한 용도로 제작된 MRS 배지를 이용하는 경우가 많으나, MRS 배지는 유산균 배양 후 일정 시간이 경과한 뒤에는 pH 저하로 인한 유산균 생장 저해의 문제점과 이를 극복하기 위한 염기성 물질의 첨가에 따른 문제점이 발생할 수 밖에 없는 단점이 있다. 이에, 유산균 배양배지의 pH를 조절하기 위한 성분을 첨가하거나, 다양한 종류의 아미노산을 배지에 첨가함으로써 유산균의 생장률을 개선하려는 시도가 있었다.

한편, 다양한 종류의 곤충이 식용으로 이용될 수 있음이 밝혀져 있으며, 이에 따라 식용 곤충은 미래 식량 중 하나로 제안되고 있다. 식용 곤충 중 귀뚜라미는 양질의 영양 성분을 함유하는 것으로 알려져 있어, 귀뚜라미를 섭취의 용도나 식품 소재로 이용하고자 하는 시도가 있었으며, 귀뚜라미를 섭취함에 따라 장내 미생물 중 유산균의 성장이 저해되는 효과가 있다는 연구 결과가 있었다. 그러나, 유산균의 배양 과정에서 이의 생장을 촉진시키기 위한 용도로 곤충을 이용하고자 하는 연구는 없었으며, 곤충을 특정한 방법으로 가공하여 유산균 생장 향상을 위해 이용하고자 하는 시도도 없었다. 이에, 본 출원의 발명자는 곤충의 효소분해물을 유산균 생육 촉진에 이용할 수 있음을 새롭게 밝혀내 본 출원의 발명을 완성하였다.

본 출원은 다양한 식품에 유용하게 이용될 수 있는 유산균을 배양하는 과정에서 이의 생육을 촉진할 수 있는 효과가 있는 조성물 및 유산균의 배양배지를 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 출원의 일 측면은, 상기의 목적을 달성하기 위하여, 곤충의 효소분해물을 포함하는, 유산균 생육 촉진용 조성물을 제공한다.

본 출원의 다른 측면은, 상기의 목적을 달성하기 위하여, 유산균 생육 촉진용 조성물을 포함하는, 유산균 배양배지를 제공한다.

본 출원의 또 다른 측면은, 상기의 목적을 달성하기 위하여, 유산균 배양배지에 곤충의 효소분해물을 첨가하는 단계를 포함하는, 유산균의 배양방법을 제공한다.

본 출원의 유산균 생육 촉진용 조성물은 유산균의 생육을 촉진하는 효과가 있는바, 이를 유산균의 배양배지에 첨가할 경우 유산균의 배양 시 통상적으로 이용되는 배지와 비교할 때 유산균의 생장을 획기적으로 향상시킬 수 있는 효과가 있다. 또한, 상기와 같은 본 출원 조성물의 효과는 곤충의 효소 분해에 따라 생성되는 생리활성 물질에 의해 발생하는 것임을 새롭게 확인하였다.

다만, 본 출원의 효과는 상기에서 언급한 효과로 제한되지 아니하며, 언급되지 않은 또 다른 효과들은 하기의 기재로부터 당업자에게 명확히 이해될 수 있을 것이다.

도 1은 MRS 배지에 각각 귀뚜라미 건조분말, 귀뚜라미 에탄올추출물, 귀뚜라미 효소분해물을 첨가한 각각의 배지, 및 MRS 배지에서 유산균을 4시간 동안 배양하며 이의 생균 수 변화를 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 2는 MRS 배지에 귀뚜라미 효소분해물을 각각 0.1%, 0.5%의 농도가 되도록 첨가한 배지, 및 MRS 배지에서 유산균을 10시간 동안 배양하며 이의 생균 수 변화를 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 3은 귀뚜라미의 에탄올추출물을 10 Brix로 희석하여, 이에 함유된 여러 종류의 유리 아미노산의 함량을 HPLC로 분석한 결과이다. 그래프의 각 피크에 해당하는 아미노산은, 표 4에 기재된 것과 동일하게, 1번 내지 21번까지 순서대로 아스파르트산, 글루탐산, 아스파라긴, 세린, 글루타민, 히스티딘, 글리신, 트레오닌, 아르기닌, 알라닌, 타우린, GABA, 티로신, 발린, 메티오닌, 트립토판, 페닐알라닌, 이소류신, 류신, 리신, 프롤린을 의미한다.
도 4는 귀뚜라미의 효소분해물을 10 Brix로 희석하여, 이에 함유된 여러 종류의 유리 아미노산의 함량을 HPLC로 분석한 결과이다. 그래프의 각 피크에 해당하는 아미노산은, 표 4에 기재된 것과 동일하게, 1번 내지 21번까지 순서대로 아스파르트산, 글루탐산, 아스파라긴, 세린, 글루타민, 히스티딘, 글리신, 트레오닌, 아르기닌, 알라닌, 타우린, GABA, 티로신, 발린, 메티오닌, 트립토판, 페닐알라닌, 이소류신, 류신, 리신, 프롤린을 의미한다.

이하, 본 출원을 구체적으로 설명한다.

본 출원의 일 측면은 곤충의 효소분해물을 포함하는, 유산균 생육 촉진용 조성물을 제공한다.

본 출원의 "곤충의 효소분해물"은 곤충에 효소를 처리하여 얻어지는 것을 의미한다. 상기 효소분해물은, 곤충 내 물질이 상기 효소에 의해 분해되어 생성되는 물질을 포함하는 것이며, 곤충 내 물질들 중 상기 효소에 의해 분해되지 않은 물질을 더 포함할 수 있다. 또한, 상기 효소에 의해 분해되어 생성되는 물질만을 분리, 정제시킨 것일 수 있다. 상기 효소는 구체적으로 프로테아제일 수 있다.

상기 프로테아제는 단백질의 펩티드 결합을 가수분해할 수 있는 효소로, 단백질의 내부를 절단하여 분해하는 효소이거나, 단백질의 말단의 아미노산을 절단하여 분해하는 효소일 수 있다. 상기 프로테아제는 효소 분류 코드(E.C. number)가 EC 3.4.21.14일 수 있다. 또한, 상기 프로테아제는 단백질 내 특정 아미노산 서열을 인식하여 그 부위를 절단하는 것이거나, 특정 서열과 무관하게 단백질을 무작위적으로 절단하여 분해하는 효소일 수 있으며, 예컨대 바실러스 속(Bacillus sp.) 유래의 프로테아제, 상표명으로 프로타멕스(Protamex, Novozyme사)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 프로테아제는 1종, 또는 1종 이상의 프로테아제를 혼합하여 이용할 수 있다.

본 출원의 "곤충"은 이를 효소로 분해하였을 때, 그 효소분해물이 유산균의 생육을 촉진할 수 있는 곤충이라면 제한 없이 이용 가능하다. 일례로 메뚜기, 누에번데기, 백강잠, 갈색거저리 유충, 흰점박이 꽃무지유충, 장수풍뎅이 유충, 귀뚜라미 등일 수 있으며, 상기 곤충은 식용으로 섭취될 수 있는 곤충일 수 있다. 상기 귀뚜라미는 쌍별귀뚜라미(쌍별이, Gryllus bimaculatus)일 수 있다. 쌍별귀뚜라미는 양질의 영양 성분을 함유하고, 국내에 식품 원료로 등록되어 있는바, 생육을 촉진하고자 하는 유산균의 사용 목적에 따라 본 출원의 조성물에 포함되는 곤충의 효소분해물로 쌍별귀뚜라미의 효소분해물을 이용할 수 있다.

상기 곤충의 효소분해물은 효소를 곤충에 처리하여 분해시킨 후 가열한 것을 포함한다. 가열된 상기 효소분해물의 경우, 처리된 상기 효소가 열에 의해 불활성화될 수 있다.

또한, 상기 효소분해물은 효소에 의한 분해 후 여과, 농축 및/또는 건조되어 제조된 것일 수 있다. 상기 여과는 효소분해물로부터 부유하는 고체 입자를 제거하여 침전물을 제외한 수용성의 상등액만을 얻는 것으로, 면, 나일론 등의 필터, 예컨대 0.2 ㎛ 내지 5 ㎛의 필터를 이용하여 입자를 걸러내거나 냉동여과법, 원심분리법 등을 사용할 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 상기 농축은 효소분해물의 고형분 농도를 높이는 것으로 이를 통해 얻어진 효소분해물의 농축물은 유산균의 배양 시 첨가하여 이용하기에 더 용이한 특징이 있다. 상기 농축은 진공농축, 판형농축, 박막농축 등에 의해 농축된 것일 수 있으나 이에 제한되지 않으며, 예컨대 공지의 농축기를 이용하여 40 ℃ 내지 60 ℃의 온도에서 수행할 수 있다.

상기와 같은 여과 및/또는 농축 과정을 거쳐 제조된 효소분해물의 농도는 5 Brix 내지 15 Brix일 수 있으며, 구체적으로 5 Brix, 6 Brix, 7 Brix, 8 Brix, 9 Brix, 및 10 Brix로부터 선택된 하나의 하한 및/또는 15 Brix, 14 Brix, 13 Brix, 12 Brix, 11 Brix, 및 10 Brix로부터 선택된 하나의 상한으로 구성된 범위일 수 있다. 예컨대, 5 Brix 내지 15 Brix, 6 Brix 내지 14 Brix, 7 Brix 내지 13 Brix, 8 Brix 내지 12 Brix, 9 Brix 내지 11 Brix, 10 Brix 내지 11 Brix, 또는 9 Brix 내지 10 Brix일 수 있다. 상기 농축물의 농도 범위 내에서는 곤충의 효소분해물에 함유된 유효성분이 충분하게 포함되면서도 농축 공정의 경제성이 감소하지 않는 장점이 있다. 본 출원의 "Brix"는 용액(물) 100g에 들어있는 고형분의 양을 당류(설탕) 기준의 g수로 표현한 것으로, Brix%, bx 등과 혼용되어 사용될 수 있다. 상기 Brix는 공지된 방법으로 측정된 것일 수 있으며, 15℃내지 35℃등의 상온에서 측정된 것일 수 있다.

상기 건조는 동결건조, 진공건조, 열풍건조, 분무건조, 감압건조, 분무건조, 포말건조, 고주파건조, 적외선건조 등을 포함하나 이에 제한되지 않는다.

또한, 상기 곤충의 효소분해물은 효소 처리에 의한 분해 전, 곤충을 절식, 건조 및/또는 분쇄한 것일 수 있다.

상기 곤충의 절식은 곤충의 내장에 잔존하는 잔여 사료 및/또는 배설물을 배출시키기 위한 것으로, 절식 기간은 1시간, 2시간, 5시간, 7시간, 10시간, 12시간, 15시간, 17시간, 20시간, 22시간, 23시간, 24시간, 25시간, 27시간 및 30시간으로부터 선택된 하나의 하한 및/또는 72시간, 70시간, 68시간, 65시간, 63시간, 60시간, 58시간, 55시간, 50시간, 45시간, 40시간, 36시간, 35시간 및 30시간으로부터 선택된 하나의 상한으로 구성된 범위일 수 있다. 예컨대, 1 내지 72시간, 2 내지 65시간, 5 내지 55시간, 7 내지 45시간, 10 내지 40시간, 12 내지 36시간, 15 내지 36시간, 20 내지 36시간, 22 내지 36시간, 23 내지 35시간 또는 24 내지 30시간일 수 있다. 곤충을 상기와 같은 기간 동안 절식시킨 이후에 효소분해물을 수득하는 경우, 곤충 내 잔여 사료 및 배설물에 의한 유산균에 대한 독성 발생 가능성을 감소시켜, 이로 인한 유산균의 생육 억제 효과를 배제시킬 수 있는 장점이 있다.

상기 건조는 곤충을 60 ℃ 내지 90 ℃의 온도 조건에서 건조하는 것일 수 있다. 상기 건조는 귀뚜라미 내 수분 함량을 곤충 100중량% 기준 70중량% 이하가 될 때까지 수행하거나, 24시간 이상 건조하는 것일 수 있다. 상기와 같이 건조된 곤충을 대상으로 효소를 처리하여 분해하는 경우, 분해 효율이 증가되는 장점이 있다. 상기 건조 온도 범위에서 건조를 수행하는 경우, 곤충의 수분이 충분히 제거되어 건조될 수 있으면서도 부패의 가능성은 적으며, 고온에 의해 발생할 수 있는 마이얄 반응이나 탄화물의 발생 가능성을 감소시킬 수 있다. 분쇄된 곤충을 대상으로 효소 분해를 수행하는 경우, 상기 분쇄된 곤충은, 곤충을 부위 별로 절단하여 분해하거나 별도의 절단 없이 곤충의 모든 부위를 분쇄한 것일 수 있으며, 분쇄된 곤충을 이용하여 효소 분해를 수행하는 경우 분해 효율이 높아져 효소분해물에 함유된 유효성분의 함량이 증가될 수 있다.

상기 효소분해물은 상기 유산균 생육 촉진용 조성물에 대하여, 0.05%(w/v) 내지 10%(w/v)의 함량으로 포함될 수 있다. 구체적으로, 상기 효소분해물은 0.05%(w/v), 0.1%(w/v), 0.2%(w/v), 0.3%(w/v), 0.4%(w/v), 0.5%(w/v), 0.6%(w/v), 0.7%(w/v), 0.8%(w/v), 0.9%(w/v), 및 1%(w/v)로부터 선택된 하나의 하한 및/또는 10%(w/v), 8%(w/v), 5%(w/v), 4%(w/v), 3%(w/v), 2.5%(w/v), 2%(w/v), 1.8%(w/v), 1.5%(w/v), 1.4%(w/v), 및 1.3%(w/v)로부터 선택된 하나의 상한으로 구성된 범위일 수 있다. 예컨대, 0.05%(w/v) 내지 10%(w/v), 0.1%(w/v) 내지 8%(w/v), 0.2%(w/v) 내지 5%(w/v), 0.3%(w/v) 내지 4%(w/v), 0.4%(w/v) 내지 3(w/v), 0.5%(w/v) 내지 2.5%(w/v), 0.6%(w/v) 내지 2%(w/v), 0.7%(w/v) 내지 1.8%(w/v), 0.8%(w/v) 내지 1.5%(w/v), 0.9%(w/v) 내지 1.4%(w/v), 또는 1%(w/v) 내지 1.3%(w/v)의 함량일 수 있다. 곤충의 효소분해물이 상기와 같은 범위의 함량으로 본 출원의 조성물에 포함될 경우, 상기 효소분해물에 의한 유산균의 생육 촉진 효과 및 생장 수율이 가장 높게 나타나면서도, 곤충의 효소분해물이 지나치게 다량으로 함유되지 않아 제조 공정의 효율 측면에서도 유리한 장점이 있다.

상기 효소분해물은 아미노산의 함량이 20,000 ㎎/ℓ 이하일 수 있다. 구체적으로, 상기 효소분해물 내 아미노산은 3,000 ㎎/ℓ, 4,000 ㎎/ℓ, 5,000 ㎎/ℓ, 6,000 ㎎/ℓ, 7,000 ㎎/ℓ, 8,000 ㎎/ℓ, 8,500 ㎎/ℓ, 9,000 ㎎/ℓ, 및 9,500 ㎎/ℓ로부터 선택된 하나의 하한 및/또는 20,000 ㎎/ℓ, 18,000 ㎎/ℓ, 15,000 ㎎/ℓ, 14,000 ㎎/ℓ, 13,000 ㎎/ℓ, 12,000 ㎎/ℓ, 11,000 ㎎/ℓ, 10,500 ㎎/ℓ, 및 10,000 ㎎/ℓ로부터 선택된 하나의 상한으로 구성된 범위의 함량일 수 있다. 예컨대, 20,000 ㎎/ℓ 이하, 18,000 ㎎/ℓ 이하, 15,000 ㎎/ℓ 이하, 13,000 ㎎/ℓ 이하, 10,000 ㎎/ℓ 이하, 3,000 ㎎/ℓ 내지 20,000 ㎎/ℓ, 4,000 ㎎/ℓ 내지 18,000 ㎎/ℓ, 5,000 ㎎/ℓ 내지 15,000 ㎎/ℓ, 6,000 ㎎/ℓ 내지 14,000 ㎎/ℓ, 7,000 ㎎/ℓ 내지 13,000 ㎎/ℓ, 8,000 ㎎/ℓ 내지 12,000 ㎎/ℓ, 8,500 ㎎/ℓ 내지 11,000 ㎎/ℓ, 9,000 ㎎/ℓ 내지 10,500 ㎎/ℓ, 또는 9,500 ㎎/ℓ 내지 10,000 ㎎/ℓ일 수 있다. 본 출원의 조성물에 포함된 효소분해물은, 이에 함유된 아미노산의 함량이 상기 범위인 경우에도, 유산균의 생육을 촉진하는 효과가 현저하게 높은 특징이 있다.

본 출원의 "유산균(Lactic acid bacteria)"은 그람-양성균의 일종으로 젖산균으로도 불리며, 탄수화물의 발효를 통해 젖산을 주요한 산물로 생산하는 특징이 있는 미생물을 의미한다. 상기 유산균은 이를 섭취한 사람의 장내에서 병원성 미생물의 작용을 억제하고 항상성의 유지에 도움을 주는 등의 활성이 있는바, 상기 유산균은 발효유와 같은 유산균 음료, 김치 등의 발효 식품의 제조에 이용될 수 있다.

상기 유산균은 락토바실러스 속(Lactobacillus sp.), 비피도박테리움 속(Bifidobacterium sp.), 또는 스트렙토코커스 속(Streptococcus sp.)의 미생물일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 예컨대 식품 기술 분야에서 통상적으로 이용되는 속의 유산균이라면 모두 포함될 수 있다. 또한, 상기 유산균은 락토바실러스 플란타룸, 락토바실러스 애시도필러스, 락토바실러스 메젠테로이드, 락토바실러스 가세리, 락토바실러스 델브루에키, 락토바실러스 람노서스, 락토바실러스 카제이, 락토바실러스 브레비스, 락토바실러스 살리바리우스, 비피도박테리움 락티스 및 스트렙토코커스 써모필러스로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있다. 예컨대 락토바실러스 플란타룸 CJLP133 균주일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 출원의 "유산균 생육 촉진"은, 유산균의 성장 속도를 증가시키는 것을 의미하며, 이는 유산균의 배양 시작 시점으로부터 단위시간 당 유산균의 생균 수 증가율 향상을 의미한다. 상기 유산균의 생균 수는 배양 이후 나타난 유산균의 집락 수를 세어 측정할 수 있으며, ㎖ 당 생균 수(CFU/㎖)로 나타낼 수 있다. 상기 유산균 생육 촉진은 유산균의 분열에 도움을 주어 이의 세포 수 증가를 촉진하는 것이거나, 유산균의 생장 억제 작용을 저해하는 것일 수 있다.

또한, 상기 유산균 생육 촉진은, 상기 유산균을 배양배지에서 배양하고자 할 때 이의 생육을 촉진하는 것이거나, 식품 내에 함유된 유산균의 생육을 촉진하는 것일 수 있다. 배양배지에서의 유산균의 생육을 촉진시키기 위하여, 본 출원의 조성물은 유산균 배양배지에 첨가되어 이용될 수 있고, 식품 내 유산균의 생육을 촉진시키기 위하여, 본 출원의 조성물은 유산균을 함유하는 식품에 처리되어 이용될 수 있다. 상기 식품은 발효식품일 수 있으며, 예컨대, 발효유, 요거트, 김치, 치즈, 간장, 된장, 젓갈, 빵, 주류 등일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.

본 출원의 다른 측면은 상기 유산균 생육 촉진용 조성물을 포함하는, 유산균 배양배지를 제공한다.

상기 유산균 생육 촉진용 조성물에 관한 설명은 상기에서 설명한 바와 동일하며, 구체적으로 상기 곤충, 곤충의 효소분해물, 효소분해물의 제조방법, 이의 함량, 효소분해물 내 성분의 함량, 유산균, 유산균 생육 촉진 등에 관한 설명은 상기의 설명을 원용한다.

본 출원의 "유산균 배양배지"는, 유산균을 배양하기 위한 목적의 배지를 의미하며, 유산균의 생장에 도움을 줄 수 있는 것으로 본 출원의 기술분야에서 통상적으로 알려진 성분을 포함할 수 있다.

상기 유산균 배양배지는 액체 또는 고체 형태일 수 있으며, 액체 형태의 배지를 한천(agar)과 혼합하여 고체화한 것일 수 있다.

상기 유산균 배양배지는, 곤충의 효소분해물을 포함하는 본 출원의 상기 조성물을 포함함에 따라, 상기 효소분해물은 상기 유산균 배양배지에 대하여, 0.05%(w/v) 내지 5%(w/v)의 함량으로 포함될 수 있으며, 상기와 같이 유산균 배양배지에 포함되는 효소분해물의 함량을 고려하여, 상기 조성물의 농도 및 함량을 적절히 조절할 수 있다. 구체적으로, 상기 효소분해물은 유산균 배양배지 내에 0.05%(w/v), 0.1%(w/v), 0.2%(w/v), 0.3%(w/v), 0.4%(w/v), 0.5%(w/v), 0.6%(w/v), 0.7%(w/v), 0.8%(w/v), 0.9%(w/v), 및 1%(w/v)로부터 선택된 하나의 하한 및/또는 5%(w/v), 4.5%(w/v), 4%(w/v), 3.5%(w/v), 3%(w/v), 2.5%(w/v), 2%(w/v), 1.8%(w/v), 1.5%(w/v), 1.4%(w/v), 및 1.3%(w/v)로부터 선택된 하나의 상한으로 구성된 범위의 함량으로 포함될 수 있다. 예컨대, 0.05%(w/v) 내지 5%(w/v), 0.1%(w/v) 내지 4.5%(w/v), 0.2%(w/v) 내지 4%(w/v), 0.3%(w/v) 내지 3.5%(w/v), 0.4%(w/v) 내지 3(w/v), 0.5%(w/v) 내지 2.5%(w/v), 0.6%(w/v) 내지 2%(w/v), 0.7%(w/v) 내지 1.8%(w/v), 0.8%(w/v) 내지 1.5%(w/v), 0.9%(w/v) 내지 1.4%(w/v), 또는 1%(w/v) 내지 1.3%(w/v)의 함량일 수 있다. 곤충의 효소분해물이 상기와 같은 범위의 함량으로 본 출원의 유산균 배양배지에 포함될 경우, 상기 효소분해물에 의한 유산균의 생육 촉진 효과가 충분히 발휘되면서도, 유산균의 생장에 도움을 줄 수 있는 상기 배양배지 내 다른 성분들의 함량도 지나치게 감소되지 않을 수 있어 유산균의 생장 수율이 가장 높게 나타날 수 있는 장점이 있다.

상기 유산균 배양배지는 탄소원, 질소원, 및 무기염으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상을 더 포함할 수 있으며, 유산균의 배양에 최소로 요구되는 성분이나, 유산균의 생장에 도움을 줄 수 있는 성분이라면 제한 없이 포함할 수 있다.

상기 탄소원은 글루코오스(glucose), 말토오스(maltose), 락토오스(lactose), 셀로비오스(cellobiose), 만노오스(mannose), 트레할로오스(trehalose), 프룩토오스(fructose), 멜리비오스(melibiose), 갈락토오스(galactose), 라피노오스(raffinose), 수크로오스(sucrose), 스타키오스(stachyose), 만니톨(mannitol), 아라비노오스(arabinose), 소비톨(sorbitol), 자일로오스(xylose), 에스쿨린(esculin), 람노오스(rhamnose), 살리신(salicin), 전분 등의 당류, 및/또는 구연산, 주석산, 사과산 등의 유기산, 및/또는 저분자량의 지방산일 수 있다.

상기 질소원은 카제인, 비프 추출물(beef extract), 트립톤(tryptone), 펩톤(peptone), 소이펩톤(soypeptone), 및/또는 효모 추출물(yeast extract)일 수 있다.

상기 무기염은 P, Na, K, Mg, S, 및/또는 Mn일 수 있으며, 상기 배양배지는 그 외 미량의 무기염을 더 포함할 수 있다. 상기 무기염은, 예컨대 폴리소베이트 80, 제2인산칼륨(K₂HPO₄), Na-아세테이트, 시트르산 암모늄((NH₄)₂citrate), 황산마그네슘(MgSO₄ × 7H₂O), 황산망간(MnSO₄ × H₂O) 등의 형태로 포함될 수 있고, 상기 무기염의 종류 및 함량은 배양배지의 pH, 삼투압에 따라 적절히 선택할 수 있다. 또한, 소고기 추출물, 펩톤, 효모 추출물 등 천연의 성분을 배지에 이용할 경우에는, 상기 천연 재료 내 포함되는 무기염을 고려하여, 별도의 무기염을 더 첨가하지 않거나 그 함량을 적게 설정할 수 있다.

상기 탄소원, 질소원, 및 무기염 성분의 함량은 상기 곤충의 효소분해물에 의한 유산균 생육 촉진 효능을 억제하지 않는 범위 내에서 유산균의 배양 목적, 목표 유산균 수 등에 따라 설정될 수 있다.

상기 유산균 배양배지는 MRS 배지 성분을 더 포함할 수 있다. 상기 MRS 배지는 유산균의 배양에 이용되는 배지로, 락토바실러스 속 유산균의 생육에 도움을 줄 수 있다. 상기 MRS 배지 성분은 프로테오스 펩톤, 비프(beef) 추출물, 효모(yeast) 추출물, 덱스트로스, 폴리소베이트 80, 시트르산 암모늄, 황산마그네슘, 황산망간, 및/또는 제2인산칼륨일 수 있다. 상기 MRS 배지 성분의 함량은 상기 곤충의 효소분해물에 의한 유산균 생육 촉진 효능을 억제하지 않는 범위 내에서 유산균의 배양 목적, 목표 유산균 수 등에 따라 설정될 수 있다.

상기 유산균 배양배지는 유산균의 생육 촉진에 도움을 줄 수 있는 성분을 더 포함할 수 있으며, 상기 성분의 종류 및 함량은 상기 곤충의 효소분해물에 의한 유산균 생육 촉진 효능을 억제하지 않는 범위 내에서 유산균의 배양 목적, 목표 유산균 수 등에 따라 설정될 수 있으며, 예컨대 비타민 등을 더 포함할 수 있다.

본 출원의 또 다른 측면은 유산균 배양배지에 곤충의 효소분해물을 첨가하는 단계를 포함하는, 유산균의 배양방법을 제공한다.

상기 곤충, 곤충의 효소분해물, 효소분해물의 제조방법, 효소분해물 내 성분의 함량, 유산균 등에 관한 설명은 상기에서 설명한 바와 동일하다.

본 출원의 상기 곤충의 효소분해물은 유산균의 생육을 촉진하는 효과가 있는바, 이를 유산균 배양배지에 첨가하여 유산균을 배양 시 유산균의 생장 효율을 높여 더 많은 수의 유산균을 수득할 수 있다.

상기 유산균 배양배지에 곤충의 효소분해물을 첨가하는 단계는, 배양배지에 먼저 유산균 또는 이의 배양액을 첨가한 후 상기 효소분해물을 첨가하는 것이거나, 상기 효소분해물을 먼저 배양배지에 첨가한 후 유산균 또는 이의 배양액을 첨가하는 것일 수 있으며, 유산균 또는 이의 배양액과 상기 귀뚜라미 효소분해물을 혼합하여 배양배지에 첨가하는 것일 수도 있다.

상기 유산균 배양배지는 유산균의 배양에 통상적으로 이용되는 배양배지라면 제한 없이 적용될 수 있다. 상기 배양배지는 탄소원, 질소원, 및 무기염으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상을 포함하는 것일 수 있으며, 상기 탄소원, 질소원, 및 무기염에 관한 설명은 상기에서 설명한 바와 동일하다. 예컨대, 상기 배양배지는 MRS 배지일 수 있다.

또한, 상기 유산균 배양배지는 액체 또는 고체 형태일 수 있으며, 액체 형태의 배지를 한천(agar)과 혼합하여 고체화한 것일 수 있다.

본 출원의 유산균의 배양방법은 상기 효소분해물 첨가 단계 이전에, 곤충의 효소분해물을 가열하는 단계를 더 포함할 수 있다. 상기 귀뚜라미 효소분해물을 가열 처리함으로써 잔존하는 효소가 불활성화된다. 상기 곤충의 효소분해물 내의 잔존하는 효소를 불활성화시킨 후 상기 효소분해물을 유산균 배양배지에 첨가할 경우, 상기 효소에 의해 유산균의 단백질이 분해될 수 있는 가능성을 차단하여 유산균의 생육 억제를 방지할 수 있다.

본 출원의 유산균의 배양방법은, 배양된 유산균을 회수하는 단계를 더 포함할 수 있다.

이하, 본 출원을 실험예에 의하여 상세히 설명한다.

단, 하기 실험예는 본 출원을 구체적으로 예시하는 것이며, 본 출원의 내용이 하기 실시예에 의해 한정되지 아니한다.

[실시예 및 비교예]

쌍별귀뚜라미를 첨가한 유산균 배양 배지의 제조

본 출원의 곤충의 효소분해물을 포함하는 유산균 배양배지의 유산균 배양 촉진 효과를 확인하기 위한 실험을 수행하기에 앞서 이에 이용될 수 있는 배지를 제조하였다. MRS 배지를 기반으로 하여 다양한 종류의 성분을 첨가하여 하기 표 1과 같이 실시예 및 비교예의 배지를 제조하였고, 곤충으로는 쌍별귀뚜라미를 이용하였다.

성분		비교예 1	비교예 2	비교예 3	실시예 1	실시예 2
MRS 배지	Protease Peptone (g)	10	10	10	10	10
	Beef Extract (g)	10	10	10	10	10
	Yeast Extract (g)	5	5	5	5	5
	Dextrose (g)	20	20	20	20	20
	Polysorbate 80 (g)	1	1	1	1	1
	Ammonium Citrate (g)	2	2	2	2	2
	Sodium Acetate (g)	5	5	5	5	5
	Magnesium Sulfate (g)	0.1	0.1	0.1	0.1	0.1
	Manganese Sulfate (g)	0.05	0.05	0.05	0.05	0.05
	Dipotassium Phosphate (g)	2	2	2	2	2
쌍별귀뚜라미	건조분말 (g)		5
	에탄올추출분말 (g)			5
	효소분해물분말 (g)				5	1
물 (ℓ)		1	1	1	1	1

유산균 배양배지로 통상적으로 이용되는 MRS 액체 배지(Difco, USA)에 다른 성분을 첨가하지 않은 비교예 1, 그리고 상기 MRS 배지에 쌍별귀뚜라미를 다양한 방법으로 추출 또는 가공하고 분말화하여 첨가함으로써 비교예 2 및 3, 실시예 1 및 2의 배양배지를 제조하였다.

구체적으로, 비교예 2의 배양배지에는 MRS 액체 배지에 쌍별귀뚜라미의 건조분말을 5 g 첨가하고 물 1 ℓ와 혼합해 수용화하여 멸균함으로써, 상기 쌍별귀뚜라미 건조분말이 0.5%의 농도가 되도록 제조하였다. 상기 쌍별귀뚜라미의 건조분말은 24 시간 동안 절식시킨 쌍별귀뚜라미의 배설물을 배출시킨 다음, 세척 후 90 ℃에서 24 시간 건조시켜 호모게나이저를 이용해 6,000 rpm으로 10분 동안 분쇄함으로써 분말 형태로 제조하였다.

비교예 3의 배양배지에는 MRS 액체 배지에 쌍별귀뚜라미의 에탄올추출분말을 5 g 첨가하고 물 1 ℓ와 혼합해 수용화하여 멸균함으로써, 상기 쌍별귀뚜라미 에탄올추출분말이 0.5%의 농도가 되도록 제조하였다. 상기 쌍별귀뚜라미의 건조분말을 제조한 것과 동일한 과정으로 절식, 세척 후, 70 ℃에서 48 시간 건조하였다. 건조물을 분쇄함으로써 쌍별귀뚜라미의 분쇄물을 제조하고, 상기 분쇄물 100 g에 59% 에탄올(식용 주정)을 900 g 첨가하고, 30 ℃에서 24시간 동안 교반하면서 추출을 수행하였다. 상기 추출물을 60 ℃에서 10 Brix의 농도가 되도록 여과 및 농축하여 동결건조하여 분말화한 다음, 상기 MRS 액체 배지에 첨가하여 비교예 3의 배양배지를 제조하였다.

실시예 1의 배양배지에는 MRS 액체 배지에 쌍별귀뚜라미의 효소분해물분말을 5 g 첨가하고 물 1 ℓ와 혼합해 수용화하여 멸균함으로써, 상기 쌍별귀뚜라미 효소분해물이 0.5%의 농도가 되도록 제조하였다. 상기 쌍별귀뚜라미 효소 분해물은 24 시간 동안 절식시킨 쌍별귀뚜라미의 배설물을 배출시킨 다음, 세척 후 냉동보관하였다. 상기 냉동보관한 쌍별귀뚜라미 100 g에 정제수 1,900 g을 첨가하고, 100 ℃에서 30분 동안 살균 및 분쇄하여 액상으로 제조하였다. 그리고 프로테아제(Protamex, Novozymes사)를 2g (0.1%(w/w)) 만큼 첨가하여 60 ℃에서 3시간 동안 반응시킨 다음, 100 ℃에서 10분 동안 가열시킴으로써 프로테아제를 불활성화시켰다. 이를 60 ℃에서 10 Brix 의 농도가 되도록 여과 및 농축하여 동결건조하여 분말화한 다음, 상기 MRS 액체 배지에 첨가하여 실시예 1의 배양배지를 제조하였다.

실시예 2의 배양배지는, 상기 실시예 1의 배양배지와 동일하게 제조하되 쌍별귀뚜라미의 효소분해물분말의 양을 1 g으로 달리하여 첨가함으로써, 쌍별귀뚜라미 효소분해물이 0.1%의 농도가 되도록 제조하였다.

[실험예 1]

쌍별귀뚜라미의 가공 방법에 따른 유산균의 생육 촉진 효과 차이 확인

각기 다른 방법으로 쌍별귀뚜라미를 가공 후 MRS 배지에 첨가하여 제조한 상기 비교예 2, 3 및 실시예 1의 배양배지, 그리고 쌍별귀뚜라미를 첨가하지 않은 MRS 배지인 비교예 1의 배양배지를 이용하여 유산균을 배양함으로써 유산균의 성장을 확인해 각 배양배지의 유산균 생육 촉진 효과 차이를 확인하였다.

먼저, 비교예 1, 비교예 2, 비교예 3 및 실시예 1의 액체 배양배지를 1 ㎖ 채취하여 희석(희석비율: 10^-5~10^-6)한 후, 평판배지에서 배양하였다. 구체적으로 유산균의 일종인 락토바실러스 플란타룸 CJLP133 균주의 배양액을 상기 각 평판배지에 30 내지 300개 정도의 집락을 형성하도록 멸균 생리수로 희석하여 도말한 후, 37 ℃에서 4시간 동안 배양하였다. 4시간 배양 후 상기 유산균이 형성한 집락 수를 계측하고 ㎖당 생균 수로 계산하여 하기 표 2에 나타냈다.

CFU/㎖	비교예 1	비교예 2	비교예 3	실시예 1
CFU/㎖	MRS 배지	MRS 배지 + 0.5% 건조분말	MRS 배지 + 0.5% 에탄올추출분말	MRS 배지 + 0.5% 효소분해물분말
0시간	1.0 × 10⁷	1.0 × 10⁷	1.0 × 10⁷	1.0 × 10⁷
4시간	5.4 × 10⁸	6.0 × 10⁸	5.3 × 10⁸	8.7 × 10⁸

그 결과, 쌍별귀뚜라미를 에탄올추출을 통해 추출한 추출물의 분말을 첨가한 비교예 3의 경우에는 4시간 배양 후의 유산균 생균 수가 통상의 유산균 배양배지인 MRS 배지에서 배양한 것과 비교하여 오히려 더 효과가 낮았고, 쌍별귀뚜라미 건조분말을 첨가한 비교예 2의 경우에도 유산균 수가 MRS 배지에 비해 크게 증가하지 않은 것에 반해, 쌍별귀뚜라미 효소분해물의 분말을 첨가한 실시예 1의 경우 4시간 배양 후 유산균의 생균 수가 현저하게 증가하여 종래 MRS 배지에 비해 약 1.6배로 증가하였다(도 1).

상기와 같은 결과로 볼 때, 유산균의 배양을 위하여 사용되는 MRS 배지에 쌍별귀뚜라미의 가공물을 첨가할 경우, 유산균의 생장 증대 효과가 나타날 수 있으며, 다양한 방식의 가공물 중에서도 프로테아제와 같은 효소를 이용하여 분쇄한 효소분해물을 첨가할 경우 유산균의 생장이 촉진되는 효과가 가장 현저하게 나타남을 확인할 수 있었다. 또한, 이에 따라 상기 효소분해물 및 이를 포함하는 조성물을, 유산균의 생육 촉진을 위한 용도로 이용할 수 있음을 확인할 수 있었다.

[실험예 2]

쌍별귀뚜라미의 효소분해물의 농도에 따른 유산균 생육 촉진 효과 확인

상기 실험예 1의 결과에서 볼 수 있듯이, 쌍별귀뚜라미를 프로테아제와 같은 효소를 이용하여 분쇄한 효소분해물을 첨가한 배지에서 유산균의 생장이 향상되었는바, 상기와 같은 효과가 쌍별귀뚜라미의 효소분해물에 의해 발생하는 효과인지 여부를 명확하게 다시 확인하기 위하여, 상기 효소분해물의 농도를 달리한 배양배지에서 유산균을 배양해 생균 수를 확인하였다.

구체적으로, 상기 효소분해물이 0.5%로 함유되어 있는 실시예 1의 배양배지, 상기 효소분해물이 0.1%로 함유되어 있는 실시예 2의 배양배지 및 쌍별귀뚜라미를 첨가하지 않은 MRS 배지(비교예 1)를 한천평판배지 형태로 제조하였다. 그리고 유산균 락토바실러스 플란타룸 CJLP133 균주의 배양액을 상기 각 한천평판배지에 30 내지 300개 정도의 집락을 형성하도록 멸균 생리수로 희석하여 도말한 후, 37 ℃에서 10시간 동안 배양하였다. 10시간 배양 후 상기 유산균이 형성한 집락 수를 계측하고 ㎖당 생균 수로 계산하여 하기 표 3에 나타냈다.

CFU/㎖	비교예 1	실시예 1	실시예 2
CFU/㎖	MRS 배지	MRS 배지 + 0.5% 효소분해물분말	MRS 배지 + 0.1% 효소분해물분말
0시간	1.0 × 10⁷	1.0 × 10⁷	1.0 × 10⁷
4시간	4.1 × 10⁸	4.9 × 10⁸	4.4 × 10⁸
7시간	8.8 × 10⁸	1.3 × 10⁹	1.1 × 10⁹
10시간	1.2 × 10⁹	1.6 × 10⁹	1.6 × 10⁹

그 결과, 쌍별귀뚜라미의 효소분해물을 첨가한 실시예 1 및 실시예 2의 배양배지는, 이를 첨가하지 않은 비교예 1의 배양배지와 비교할 때, 배양 시간이 지남에 따라 유산균의 생장 속도가 더 빨라 생균 수가 현저하게 증가하였다. 또한, 상기 효소분해물의 농도를 달리한 실시예 1과 실시예 2의 결과를 비교하여 볼 때, 쌍별귀뚜라미의 효소분해물을 0.1%만 첨가하여도 유산균의 생균 수가 높게 유지됨을 확인하였다(도 2).

상기와 같은 결과로 볼 때, 쌍별귀뚜라미 효소분해물을 첨가한 실시예 1, 2에서 유산균 생육 촉진 효과가 나타났으며, 상기 효소분해물의 농도만을 달리한 실시예 1과 실시예 2의 배양배지 중 농도가 더 높은 실시예 1의 배양배지에서 유산균 생균 수가 더 많이 증가하였는바, 쌍별귀뚜라미의 효소분해물에 유산균의 생육을 촉진하는 효과가 있다는 것을 확인할 수 있었다.

[실험예 3]

쌍별귀뚜라미의 에탄올추출물 또는 효소분해물 첨가 배양배지의 유리 아미노산 함량 비교

쌍별귀뚜라미 효소분해물을 포함하는 배양배지에서 나타나는 유산균의 생육 촉진 효과가, 상기 효소분해물에 함유된 아미노산 성분에 의한 것인지 여부를 확인하기 위하여, 쌍별귀뚜라미의 에탄올추출물 및 쌍별귀뚜라미의 효소분해물을 대상으로 각각 유리 아미노산의 함량을 측정하였다. 상기 에탄올추출물은 상기 비교예 3의 배양배지 제조 과정에서 추출물을 제조하는 과정과 동일한 방법을 통해 제조하였고, 상기 효소분해물은 상기 실시예 1의 배양배지 제조 과정에서 효소분해물을 제조하는 과정과 동일한 방법을 통해 제조하였다. 상기와 같이 제조된 에탄올추출물 및 효소분해물의 분말을 10 Brix의 농도로 희석하고, HPLC를 통해 유리 아미노산의 함량을 측정하여 분석하였다(도 3 및 도 4). 구체적으로, 상기 제조예에서 제조된 쌍별 귀뚜라미 추출물을 5 mM sodium hexanesulfonate/0.1% 아세트산 용액과 혼합하였다. 30분 동안 초음파를 처리한 다음 0 ℃, 9,000 rpm으로 원심분리한 상층액을 membrane syringe filter(pore size 0.2 ㎛, 25 ㎜)로 여과하여 이용하였다. 분석 과정에서 컬럼은 Capcellpak UG120V(4.66Х250 ㎜, 5 ㎛)를 사용하였고, 주입량은 10 ㎕, 유속은 1 ㎖/min, 이동상은 A: '5 mM sodium hexanesulfonate/0.1% 아세트산', B: '5 mM sodium hexanesulfonate/0.1% 아세트산 : 메탄올(35:65)'로 하여 40 ℃ 조건으로 분석하였다.

피크(peak) No.	유리 아미노산	함량 (㎎/ℓ)
피크(peak) No.	유리 아미노산	에탄올추출물	효소분쇄물
1	아스파르트산	794.12	225.56
2	글루탐산	3078.34	812.06
3	아스파라긴	275.78	159.67
4	세린	923.98	5.71
5	글루타민	209.70	83.62
6	히스티딘	404.84	326.85
7	글리신	1385.66	667.72
8	트레오닌	1115.62	280.76
9	아르기닌	3224.19	1208.64
10	알라닌	2558.36	1468.55
11	타우린	3146.22	704.28
12	GABA	151.65	40.59
13	티로신	209.01	295.32
14	발린	1474.58	493.19
15	메티오닌	177.56	144.49
16	트립토판	288.43	111.96
17	페닐알라닌	669.82	285.18
18	이소류신	963.31	286.42
19	류신	1680.91	644.26
20	리신	1808.10	866.36
21	프롤린	2438.38	869.19
	합계	26978.55	9980.38

그 결과, 상기 표 4의 결과와 같이, 쌍별귀뚜라미의 효소분해물의 경우 에탄올추출물과 비교할 때, 티로신을 제외한 모든 종류의 유리 아미노산의 함량이 더 적게 측정되었고, 총 유리 아미노산의 함량에서도 효소분해물은 9,980.38 ㎎/ℓ로 측정된 것에 반해 에탄올추출물은 26,978.55 ㎎/ℓ로 측정되어 약 36% 정도에 불과한 것으로 측정되었다.

상기와 같은 효소분해물 내 유리 아미노산의 함량이 에탄올추출물에 비해 더 적다는 실험예 3의 결과와, 효소분해물 함유 배양배지(실시예 1)의 유산균 생장 향상 효과가 에탄올추출물 함유 배양배지(비교예 3)보다 더 현저하게 나타나는 실험예 1의 결과를 종합하여 볼 때, 쌍별귀뚜라미의 효소분해물에 의한 유산균 생육 촉진 효과는 효소분해물에 함유된 아미노산에 의해 발생하는 것이 아니라, 효소 처리에 따른 생리활성 물질의 증가로 인한 것임을 예상할 수 있다.

상기에서는 본 출원의 대표적인 실시예를 예시적으로 설명하였으나, 본 출원의 범위는 상기와 같은 특정 실시예에만 한정되지 아니하며, 해당 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 본 출원의 청구범위에 기재된 범주 내에서 적절하게 변경이 가능할 것이다.

Claims

곤충의 효소분해물을 포함하는, 유산균 생육 촉진용 조성물.
청구항 1에 있어서,
상기 효소분해물은 상기 곤충을 프로테아제로 분해한 것인, 유산균 생육 촉진용 조성물.
청구항 1에 있어서,
상기 효소분해물은 상기 유산균 생육 촉진용 조성물에 대하여, 0.05%(w/v) 내지 10%(w/v)의 함량으로 포함되는 것인, 유산균 생육 촉진용 조성물.
청구항 1에 있어서,
상기 곤충은 귀뚜라미인, 유산균 생육 촉진용 조성물.
청구항 1에 있어서,
상기 유산균은 락토바실러스 속(Lactobacillus sp.)인, 유산균 생육 촉진용 조성물.
청구항 1에 있어서,
상기 유산균은 락토바실러스 플란타룸, 락토바실러스 애시도필러스, 락토바실러스 메젠테로이드, 락토바실러스 가세리, 락토바실러스 델브루에키, 락토바실러스 람노서스, 락토바실러스 카제이, 락토바실러스 브레비스, 락토바실러스 살리바리우스, 비피도박테리움 락티스 및 스트렙토코커스 써모필러스로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상인, 유산균 생육 촉진용 조성물.
청구항 1 내지 6 중 어느 한 항의 조성물을 포함하는, 유산균 배양배지.
청구항 7에 있어서,
상기 효소분해물은 상기 유산균 배양배지에 대하여, 0.05%(w/v) 내지 5%(w/v)의 함량으로 포함되는 것인, 유산균 배양배지.
청구항 7에 있어서,
탄소원, 질소원, 및 무기염으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상을 더 포함하는, 유산균 배양배지.
유산균 배양배지에 곤충의 효소분해물을 첨가하는 단계를 포함하는, 유산균의 배양방법.
청구항 10에 있어서,
상기 효소분해물 첨가 단계 이전에, 곤충의 효소분해물을 가열하는 단계를 더 포함하는, 유산균의 배양방법.