JPH07289272A

JPH07289272A - ドコサヘキサエン酸高含有油脂の製造方法

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Publication number: JPH07289272A
Application number: JP6081654A
Authority: JP
Inventors: Giichi Tsujiwaki; 義一辻脇; Hiroshi Yamamoto; 浩志山本; Kenji Minami; 憲二南
Original assignee: UEDA SEIYU KK
Current assignee: UEDA SEIYU KK
Priority date: 1994-04-20
Filing date: 1994-04-20
Publication date: 1995-11-07
Anticipated expiration: 2011-12-25
Also published as: JP2566377B2

Abstract

(57)【要約】【目的】ＤＨＡをグリセリンエステルの形で高濃度に
含有する油脂を、簡便な手法で効率よく製造できるよう
にする。【構成】キャンディダ・ファマタＵＳ−２３８（Ｆ
ＥＲＭＰ−１３９７４）をドコサヘキサエン酸含有油
脂を炭素源とする培地で培養し、この培地中のドコサヘ
キサエン酸グリセリンエステルの濃度を高めて油脂分を
回収する。培養前の培地は、ドコサヘキサエン酸を５重
量％以上含有する油脂を用いた培地であることが好まし
く、培地に炭酸カルシウム、水酸化カルシウム、炭酸カ
リウムおよび炭酸マグネシウムからなる群から選ばれる
一種以上の添加剤を０．１〜１容量（ｗ／Ｖ）％添加し
て培養することが好ましい。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】この発明は、食品または医薬品等
として有用なドコサヘキサエン酸高含有油脂の製造方法
に関し、さらに詳しくは微生物によるドコサヘキサエン
酸グリセリンエステルの含有量を高めたドコサヘキサエ
ン酸高含有油脂の製造方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】ドコサヘキサエン酸（以下、ＤＨＡと略
記する）は、長鎖高度不飽和脂肪酸（以下ＰＵＦＡと略
記する）の一種であり、多くの生理活性機能を持つこと
が知られたものであって、近年、濃縮や高度精製技術に
関する研究が活発に進められている。

【０００３】従来のＰＵＦＡまたはＰＵＦＡ含有油脂の
濃縮方法としては、魚から抽出した油脂を低温分別結晶
法、尿素付加法、クロマト法、リパーゼ処理法等により
分離濃縮する方法が知られている。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】しかし、上記した従来
のＰＵＦＡまたはＰＵＦＡ含有油脂の濃縮方法では、煩
雑な操作を必要としたり、操作の煩雑性に伴う高コスト
の問題点があり、さらには、ＰＵＦＡをグリセリンエス
テルの形で得る場合に、濃縮後、さらに別工程を加えな
ければならないという問題点もある。

【０００５】また、微生物を用いたＰＵＦＡ含有油脂の
製造方法としては、トルロプシス属に属する酵母を用い
たＰＵＦＡグリセリドの製造方法（特開平２−１６９８
８）が知られているが、この酵母はＤＨＡのみ特異的に
資化能を欠如しているとはいい難いので、ＤＨＡの濃縮
効率の点で充分に改良された方法とはいえない。

【０００６】なお、魚から抽出、精製される以外の方法
として、微生物により生産されるＤＨＡを含む油脂を抽
出する方法もあるが、培養単位容量当りのＤＨＡの収率
はまだまだ低く、実用化にはコスト面での問題がある。

【０００７】そこで、この発明の課題は、上記した問題
点を解決して、ＤＨＡをグリセリンエステルの形で高濃
度に含有する油脂を、簡便な手法で効率よく製造できる
ようにすることである。

【０００８】

【課題を解決するための手段】本願の発明者は、濃縮さ
れたＤＨＡ含有油脂を効率よく得る方法について検討を
重ねた結果、ＤＨＡを含有する油脂を炭素源とする培地
において、特定の微生物、即ちキャンディダ・ファマタ
ＵＳ−２３８を培養することにより、油脂中のＤＨＡ
含有量を飛躍的に効率よく高められることを見いだし、
この発明を完成するに至った。

【０００９】すなわち、前記の課題を解決するため、こ
の発明においては、キャンディダ・ファマタＵＳ−２
３８（ＦＥＲＭＰ−１３９７４）をドコサヘキサエン
酸含有油脂を炭素源とする培地に培養し、この培地中の
ドコサヘキサエン酸グリセリンエステルの濃度を高めて
油脂分を回収したのである。

【００１０】また、前記手段において、キャンディダ・
ファマタＵＳ−２３８（ＦＥＲＭＰ−１３９７４）を
培養する培地が、ドコサヘキサエン酸を５重量％以上含
有する油脂を炭素源とする培地を採用することができ
る。

【００１１】または、上記したドコサヘキサエン酸高含
有油脂の製造方法において、培地に炭酸カルシウム、水
酸化カルシウム、炭酸カリウムおよび炭酸マグネシウム
からなる群から選ばれる一種以上の添加剤を０．１〜１
容量（ｗ／Ｖ）％添加する手段を採用することもでき
る。

【００１２】以下に、その詳細を述べる。なお、この発
明で用いる％は、特にことわりのない限り、容量（ｖ／
Ｗ）％で示した。この発明に用いるキャンディダ・ファ
マタＵＳ−２３８（ＣａｎｄｉｄａｆａｍａｔａＵ
Ｓ−２３８）は、本願の発明者が日本各地で採取された
土壌から微生物を分離して、その油脂に対する資化能を
調べた結果、本願発明の目的を最も効率よく達成できる
ものとして採用された菌株であり、これは広島県因島の
土壌から分離し、次のスクリーニング方法により単離し
たものである。

【００１３】［キャンディダ・ファマタＵＳ−２３８
のスクリーニング方法］土壌の分離サンプルを下記組成
の培地Ａに添加し、３０℃で２〜３日培養した後、微生
物の増殖が見られるものについて、同じ培地で集積培養
を行ない、油脂資化能の強い菌を集積させた。そして、
培養液を遠心分離処理することによって上層にある油脂
の減少量を確認し、最も油脂資化能の強い菌を含む培養
液を同様な組成で構成した平板培地上に塗布し、培養
後、コロニーを単離し分取して目的とする菌株を得た。

【００１４】培地Ａの組成：（ｐＨ８．０）魚油１ｍｌグルコース３．５ｍｇ硝酸アンモニウム３５ｍｇリン酸水素二カリウム１４ｍｇ硫酸マグネシウム７ｍｇ酵母エキス７ｍｇ水道水７ｍｌ前記得られた菌株の菌学的性状は以下の如くである。

【００１５】(1) 形態的性質形態卵型又は球形細胞は１個又は数個連な
っている大きさ（１〜６）×（２〜６）μ 出芽多極出芽偽菌糸コーンミール培地で未発達な偽菌糸の形
成を認める子嚢胞子形成を認めず (2) 培養的性質（ＹＭ液体培地）沈澱及び皮膜の形成を認める (3) 巨大コロニーの観察（ＹＭ寒天培地）成育良好 ***状態台状表面の状態平滑色調乳白色 (4) 生理学的性質生育ｐＨ３〜９最適ｐＨ５〜７生育温度約４２℃まで最適温度２０〜３５硝酸塩の資化性 − ビタミン欠培地での生育 − ジアゾニウムブルーＢの呈色反応 − ［発酵性］グルコース − ガラクトース − シュークロース − マルトース − ラクトース − ラフィノース − イノシトール − ［資化性］グルコース＋ガラクトース＋シュークロース＋マルトース＋セロビオース＋トレハロース＋ラクトース − ラフィノース＋メリチトース＋スターチ＋Ｄ−キシロース＋Ｌ−アラビノース − Ｄ−リボース＋Ｌ−ラムノース＋エリスリトール − リビトール＋Ｄ−マンニトール＋コハク酸塩＋クエン酸塩＋イノシトール − 以上の結果から、分離された菌株は、キャンディダ・フ
ァマタ（Ｃａｎｄｉｄａｆａｍａｔａ）であると同定
され、この株をキャンディダ・ファマタＵＳ−２３８
（ＣａｎｄｉｄａｆａｍａｔａＵＳ−２３８）と命
名した。

【００１６】この菌株は、工業技術院生命工学工業技術
研究所に「微生物受託番号生命研菌寄第１３９７４号
（ＦＥＲＭＰ−１３９７４）」として寄託されてい
る。

【００１７】この発明におけるＤＨＡは、炭素数２２で
６個の二重結合を持っており、メチル基側から数えて３
番目の炭素原子から二重結合が始まる脂肪酸である。こ
のようなＤＨＡを含有する油脂としては、カツオ、マグ
ロ、イワシ等の魚類の油（魚油）や、甲殻類、海産動物
類、藻類等の油脂を挙げることができる。

【００１８】この発明における培養は、ＤＨＡを含有す
る油脂を炭素源として含む培地に前記の酵母を接種し、
好気的に培養することにより行なわれるが、その場合に
用いる炭素源としては、ＤＨＡ含有油脂のほか、グルコ
ース、デンプン、廃糖蜜等の糖類を併用することができ
る。

【００１９】また、窒素源としてはアンモニウム塩、そ
の他の窒素含有物質を用いることができ、無機塩類とし
ては、マグネシウム塩、リン酸塩、カリウム塩、カルシ
ウム塩、鉄塩、銅塩等を用いることができる。また、ビ
タミン源としては、酵母エキスが用いられる他、成長促
進物質を添加することも好ましい。

【００２０】この発明に用いる培地の炭素源は、ＤＨＡ
を５重量％以上含有する油脂を用いることが好ましい。
この発明では、ＤＨＡ以外の成分を特定の酵母で資化す
ることによって油脂中のＤＨＡを濃縮するのであるか
ら、ＤＨＡ含有量が５重量％未満の油脂では、製造効率
が悪くなるからである。

【００２１】培地における初発のＤＨＡ含有油脂濃度
は、５００ｇ／１以下で行なうが、より好ましい濃度範
囲は１０〜３００ｇ／１である。初発量に応じて培養時
間が長くなり、３００ｇ／１を越えると実用性が低くな
る。

【００２２】培養温度は２０〜４０℃、好ましくは２５
〜３５℃で、ｐＨは３〜９、好ましくは５〜７にて通常
３〜１０日行えばよい。

【００２３】また無機塩類は、微生物の微量栄養素とし
て、通常は０．０１〜０．５％の範囲で用いられること
が多いが、この発明においては、培養途中例えば培養２
〜５日後に炭酸カルシウム、水酸化カルシウム、炭酸カ
リウム、炭酸マグネシウムの中から選ばれる１種、また
はそれらの混合物を０．１〜１％添加することによりさ
らにＤＨＡ含量を高めることが可能である。すなわち、
この発明に用いる微生物は、通常の培養時において特に
オレイン酸、リノール酸等不飽和脂肪酸の資化能に優れ
ている。

【００２４】しかし、上記無機塩を添加することにより
パルミチン酸、ステアリン酸等の飽和脂肪酸の資化能が
増し、結果的にＤＨＡ含量がさらに高まることになる。
上記無機塩添加による微生物の資化能の変化の理由につ
いては明らかではないが、脂質代謝機構に何らかの変化
を与えているものと考えられる。但し、添加量が１．０
％をこえると濃縮を阻害する傾向が現れる。

【００２５】ＤＨＡ含有油脂の回収方法としては、培養
終了後、菌体を遠心分離等によって除き、得られた培養
上清からヘキサン等の油脂抽出溶剤を用いて、ＤＨＡ含
有油脂を抽出回収すればよく、濃縮されたＤＨＡ含有油
脂を得ることができる。

【００２６】なお、得られたＤＨＡ高含有性油脂中のＤ
ＨＡは、各種グリセリン脂肪酸エステルの混合物、特に
トリグリセリドとジグリセリドの混合物として得られ
る。必要ならばこのグリセリド混合物を適当な触媒、例
えばリパーゼによりエステル合成反応を行えばＤＨＡ高
含有性のトリグリセリドが得られる。

【００２７】

【実施例】次に実施例および比較例によりこの発明をさ
らに詳しく説明する。〔実施例１〕硫酸アンモニウム０．５％、硫酸マグネシ
ウム０．１％、酵母エキス０．１％を含み、０．２５Ｍ
リン酸緩衝液でｐＨ６に調製された液体培地１００ｍｌ
を坂口フラスコに入れ、さらにＤＨＡ含有油脂として魚
油を５．０ｇ添加し、キャンディダ・ファマタＵＳ−
２３８を接種し、３０℃で３日間振とう培養した後、培
養液を遠心分離して菌体を除いた上清をヘキサンで抽出
し油分を回収した。得られた油脂の脂肪酸組成を表１に
示した。

【００２８】なお、脂肪酸組成分析は、油脂をメチルエ
ステル化し、ＧＣにて測定し、全組成から要部を抜粋し
た。

【００２９】

【表１】

【００３０】表１の結果からも明らかなように、原料油
脂のＤＨＡ含有量は１９．５％であったのに対し、キャ
ンディダ・ファマタＵＳ−２３８を培養処理後のＤＨ
Ａ含有量は３５．２％であった。したがってＤＨＡは約
１．８倍に濃縮されたことになる。なお油脂の回収率は
４５％であった。

【００３１】〔実施例２〕実施例１において培養開始時
に炭酸カルシウム０．５％を添加して培養を行なったこ
と以外は全く同様にして、培養後、抽出を行ない、油脂
の脂肪酸組成及びＤＨＡ含量を調べ、結果を表１中に併
記した。

【００３２】その結果、炭酸カルシウムを添加すること
により、本発明に使用する菌の資化によって残存する脂
肪酸に変化がみられた。すなわち、パルミチン酸、ステ
アリン酸等飽和脂肪酸の資化能が増し、結果的にＤＨＡ
含量が高まっていた。

【００３３】〔実施例３〜７〕硫酸アンモニウム０．５
％、硫酸マグネシウム０．１％、酵母エキス０．１％を
含み、０．２５Ｍリン酸緩衝液でｐＨ６に調製された液
体培地７ｍｌを試験管に入れ、さらにＤＨＡ含有油脂と
して魚油（ＤＨＡ１９．５％）を０．７ｇ添加し、キ
ャンディダ・ファマタＵＳ−２３８を接種し、３０℃
で２日間振とう培養した。

【００３４】その後、なにも添加せずそのまま培養を継
続したもの（実施例３）、炭酸カルシウム（ＣａＣ
Ｏ₃）０．５％添加したもの（実施例４）、水酸化カル
シウム（Ｃａ（ＯＨ）₂）０．５％添加したもの（実施
例５）、炭酸カリウム（Ｋ₂ＣＯ₃）０．５％添加した
もの（実施例６）、炭酸マグネシウム０．５％添加した
もの（実施例７）を別途調製し、再び継続して３日間培
養した。これらは培養後、実施例１と全く同様にして油
脂分を回収し、得られた油脂の脂肪酸組成を調べた。こ
の結果を表２に示した。

【００３５】

【表２】

【００３６】表２の結果からも明らかなように、炭酸カ
ルシウム、水酸化カルシウム、炭酸カリウムまたは炭酸
マグネシウムを培養途中に添加することによって、実施
例１、２に比べてさらにＤＨＡ含量が高まり、ＤＨＡ含
有成分がさらに濃縮された油脂が得られたことがわか
る。

【００３７】〔実施例８〜１１〕硫酸アンモニウム０．
５％、硫酸マグネシウム０．１％、酵母エキス０．１％
を含み、０．２５Ｍリン酸緩衝液でｐＨ６に調製された
液体培地７ｍｌを試験管に入れ、さらにＤＨＡ含有油脂
として魚油（ＤＨＡ２６．８％）を０．７ｇ添加し、
キャンディダ・ファマタＵＳ−２３８を接種し、３０
℃で３日間振とう培養した。その後、炭酸カルシウム
（ＣａＣＯ₃をそれぞれ０．１％、０・２％０．５％、
１．０％添加し（それぞれ実施例８、９、１０、１
１）、さらに継続して４日間培養した後、実施例１と全
く同様に油脂分を回収し、得られた油脂のＤＨＡ含有量
及び油脂の回収率を調べた。この結果を表３に示した。

【００３８】

【表３】

【００３９】表３の結果からも明らかなように、炭酸カ
ルシウムを０．１〜１．０％添加することによりＤＨＡ
がさらに濃縮され（実施例８〜１１）、ＤＨＡ含有量の
高い油脂が回収されたことがわかる。

【００４０】〔比較例１、２〕実施例８においてＣａＣ
Ｏ₃を添加しない（比較例１）、または培養３日後にＣ
ａＣＯ₃を２．０％添加した（比較例２）こと以外は実
施例８と全く同様に行い、回収した油脂のＤＨＡ含量及
び油脂回収率を調べ、結果を表３中に併記した。その結
果、２．０％では、無添加のものに比べ、ＤＨＡ含量が
やや低くなっていた。

【００４１】〔実施例１２〕硫酸アンモニウム０．５
％、硫酸マグネシウム０．１％、酵母エキス０．１％を
含み、０．２５Ｍリン酸カリウム緩衝液でｐＨ６に調製
された液体培地１００ｍｌを坂口フラスコに入れ、さら
にＤＨＡ含有魚油（ＤＨＡ２６．８％）を５ｇ添加し、
キャンディダ・ファマタＵＳ−２３８を接種し、３０
℃で３日間振とう培養行い、実施例１と同様に油脂の抽
出操作を行い、ＤＨＡ含量及び油脂回収率を調べ、この
結果を表４に示した。

【００４２】

【表４】

【００４３】〔比較例３、４〕実施例１２においてキャ
ンディダ・ファマタＵＳ−２３８株以外の株として、
Ｃａｎｄｉｄａｆａｍａｔａ（ＩＦＯ０６６４）を
用い（比較例３）、または油脂資化性菌として知られて
いるＴｏｒｕｌｏｐｓｉｓ属の菌としてＴｏｒｕｌｏｐ
ｓｉｓｂｏｍｂｉｃｏｌａ（ＩＦＯ１０２４３）を
用いたこと（比較例４）以外は、全く同様に培養、油脂
の回収を行ない、結果を表４中に併記した。

【００４４】表４の結果からも明らかなように、所定の
株以外を培養しても、回収された油脂中のＤＨＡ含有量
は３１％以下であった。

【００４５】〔実施例１３〕硫酸アンモニウム０．５
％、硫酸マグネシウム０．１％、酵母エキス０．１％を
含み、０．２５Ｍリン酸緩衝液でｐＨ６に調製された液
体培地１００ｍｌを坂口フラスコに入れ、さらにＤＨＡ
含有油脂として魚油を５ｇ添加し、キャンディダ・ファ
マタＵＳ−２３８を接種し、３０℃で６日間振とう培
養した。その後、ＣａＯ３を０．５％添加し、再び、継
続して３日間培養した後、培養液を遠心分離して菌体を
除いた上清をヘキサンで抽出した油分を回収した。

【００４６】この結果、原料油脂のＤＨＡ含有量は１
９．５％であったのに対し、酵母と接触処理後のＤＨＡ
含有量は、６９．１％であった。したがってＤＨＡは約
３．５倍に濃縮されたことになる。なお、油脂の回収率
は１２．０％であった。

【００４７】〔実施例１４〕次に、ジャーファメンター
を用いて大量培養を行なった。培地の組成及び培養条件
は、下記に示した通りである。

【００４８】［培地］魚油（ＤＨＡ１９．５％）６００ｇ（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄ ３０ｇＫＨ₂ＰＯ₄ １２ｇＭｇＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ６ｇ酵母エキス６ｇ水道水６０００ｍｌ［培養条件］ｐＨ６．０（１Ｎの
ＮａＯＨで調節）温度３０℃ 通気量３１／分撹拌速度３００ｒｐｍ培養時間１１５時間ＣａＣＯ₃ ３０ｇの添加培養開始６７時間後培養後、実施例１と全く同様に油脂を回収した結果、回
収油脂量は、１１５ｇであり、ＤＨＡ含量は、３７．１
％に濃縮されていた。

【００４９】

【効果】この発明は、以上説明したように、キャンディ
ダ・ファマタの所定菌株をＤＨＡ含有油脂用いた培地に
培養するといった簡易な方法により、ＤＨＡを含有する
油脂から効率よくＤＨＡグリセリンエステルを濃縮回収
することができる利点がある。

【００５０】また、培養の際に特定の無機物質を添加す
る手段を採用した発明では、さらにＤＨＡ含量を高める
ことができる。そして、この発明で得られるＤＨＡは、
グリセリンエステルの形で存在し、遊離脂肪酸は、少量
しか存在しないため、培養後の油脂の精製が容易であ
り、非常に実用性の高い方法であるといえる。

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】キャンディダ・ファマタＵＳ−２３８
（ＦＥＲＭＰ−１３９７４）をドコサヘキサエン酸含
有油脂を炭素源とする培地で培養し、この培地中のドコ
サヘキサエン酸グリセリンエステルの濃度を高めて油脂
分を回収することからなるドコサヘキサエン酸高含有油
脂の製造方法。
【請求項２】キャンディダ・ファマタＵＳ−２３８
（ＦＥＲＭＰ−１３９７４）を培養する培地が、ドコ
サヘキサエン酸を５重量％以上含有する油脂を炭素源と
する培地である請求項１記載のドコサヘキサエン酸高含
有油脂の製造方法。
【請求項３】請求項１または２に記載のドコサヘキサ
エン酸高含有油脂の製造方法において、培地に炭酸カル
シウム、水酸化カルシウム、炭酸カリウムおよび炭酸マ
グネシウムからなる群から選ばれる一種以上の添加剤を
０．１〜１容量（ｗ／Ｖ）％添加することを特徴とする
ドコサヘキサエン酸高含有油脂の製造方法。