JP4081794B2 - 新規なラビリンチュラ科微生物及びそれを用いた4,7,10,13,16‐ドコサペンタエン酸の製造方法 - Google Patents
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Description
【発明の属する技術分野】
本発明は、ラビリンチュラ科ラビリンチュラ属に属する新規な微生物及びそれを用いた4,7,10,13,16‐ドコサペンタエン酸の製造方法に関するものである。
【0002】
【従来の技術】
4,7,10,13,16‐ドコサペンタエン酸(通称n‐6DPA)は、高度不飽和脂肪酸の1種であって、近年、血液脳関門通過能が高いことから、血液脳関門通過性医薬組成物の成分として注目されている(特開昭61−204136号公報)。また、4,7,10,13,16‐ドコサペンタエン酸は、n‐3系必須脂肪酸欠乏時に、代替物質として増加することも報告されており、4,7,10,13,16‐ドコサペンタエン酸を大量に生産することは、工業的に非常に大きな意義を有する。
【0003】
その4,7,10,13,16‐ドコサペンタエン酸は、イワシ油などの魚油にはほとんど含まれていないので、それを製造するには微生物の利用が考えられる。そして、これまで、ラビリンチュラ属に属する微生物が、アラキドン酸、ドコサテトラエン酸、ドコサヘキサエン酸などの高度不飽和脂肪酸とともに、4,7,10,13,16‐ドコサペンタエン酸を構成脂肪酸とするトリグリセリドやリン脂質として生産することが知られている。
【0004】
したがって、この微生物を培養し、その菌体から常法に従い、非水溶性有機溶媒で抽出処理し、抽出液から有機溶剤を蒸発除去することにより、高度不飽和脂肪酸を含む脂質成分を回収し、次いでこの高度不飽和脂肪酸を含む脂質成分を加水分解したのち、その分解生成物から4,7,10,13,16‐ドコサペンタエン酸を分離すれば、4,7,10,13,16‐ドコサペンタエン酸を製造することができる。
【0005】
しかしながら、上記の多数の高度不飽和脂肪酸を含む脂質の加水分解生成物中の4,7,10,13,16‐ドコサペンタエン酸の含有割合が低く、さらにそれを分離するには、クロマトグラフィー処理を含む分離操作を必要とするため、4,7,10,13,16‐ドコサペンタエン酸を大量に製造する方法としては不適当であった。
【0006】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、このような事情のもとで、4,7,10,13,16‐ドコサペンタエン酸を優勢的に生産する微生物を用いて、その培養物に含まれる他の高度不飽和脂肪酸からの分離、精製を必要としない程度に純粋な4,7,10,13,16‐ドコサペンタエン酸及びそれを含むトリグリセリドやリン脂質を大量に製造する方法を提供することを目的としてなされたものである。
【0007】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、高度不飽和脂肪酸を生産する微生物について鋭意研究を重ねた結果、ラビリンチュラ科ラビリンチュラ属に属する微生物中に、4,7,10,13,16‐ドコサペンタエン酸を優勢的に生産する菌株が存在すること、そして、この菌株を用いれば、脂質の構成成分である高度不飽和脂肪酸の90質量%以上が4,7,10,13,16‐ドコサペンタエン酸となるトリグリセリドやリン脂質を製造しうること、及び4,7,10,13,16‐ドコサペンタエン酸を90質量%以上の割合で含む高度不飽和脂肪酸混合物を選択的に製造しうることを見出し、この知見に基づいて本発明をなすに至った。
【0008】
すなわち、本発明は、ラビリンチュラ科ラビリンチュラ属に属する4,7,10,13,16‐ドコサペンタエン酸生産菌L59株(FERM P−18987)、及びこの微生物を培養し、菌体中に構成脂肪酸として4,7,10,13,16‐ドコサペンタエン酸を含む脂質を蓄積させたのち、菌体を分離し、分離した菌体から溶媒により前記脂質を抽出したのち、その抽出物を加水分解することを特徴とする4,7,10,13,16‐ドコサペンタエン酸の製造方法を提供するものである。
本発明でいう高度不飽和脂肪酸とは、炭素数20以上で3個以上の不飽和結合を有する脂肪酸を意味する。
【0009】
【発明の実施の形態】
本発明の微生物、すなわちラビリンチュラ科ラビリンチュラ属に属する4,7,10,13,16‐ドコサペンタエン酸生産菌L59株は、北海道オホーツク海沿岸で採取された落葉から分離され、それらを培養した場合、4,7,10,13,16‐ドコサペンタエン酸が全高度不飽和脂肪酸の90質量%以上を占めることで特徴づけられるものである。この菌株は受託番号FERM P−18987として独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託されている。
【0010】
本発明の微生物を得るには、例えば北海道オホーツク海沿岸で採取した落葉樹の落葉を海水中に数日間放置したのち、落葉の表面に付着した微生物を集めることによって先ず原体を採取する。
【0011】
次に採取した原体を、炭素源としてグルコースを含む合成培地中で培養する。このようにして得た菌株L59株についての光学顕微鏡写真を図1に示す。次いで、培養後、培養培地から菌体を分離し、乳鉢で破砕し、この破砕物をクロロホルムで抽出し、ガスクロマトグラフィーにより脂肪酸組成の分析をした。このようにして得た脂肪酸組成パターンを図2に示す。
【0012】
このようにして得られる本発明の微生物は、高度不飽和脂肪酸としてアラキドン酸やドコサヘキサエン酸を含まず、4,7,10,13,16‐ドコサペンタエン酸を高い割合で菌体内に保有するが、これまで知られているラビリンチュラ属に属する微生物では、このような能力を示すものは存在しない。
【0013】
本発明の微生物は、図1から分るように、ラビリンチュラ属の特徴である紡錘形状を有し、海中に広く存在する海生菌の1種である。そして、以下に示す菌学的性質から、容易に公知の微生物と区別される。
I.形態学的性質
(1)細胞の大きさは、約10μmで紡錘形である。
(2)ネットワークを形成し、その中で滑走運動している。
II.培養的性質
(1)糖質寒天培地では培地表面のみに拡がる。
(2)糖質液体培養では、ほとんど生育しない。
(3)有機又は無機の窒素源を利用して増殖する。
(4)至適pHは5〜9、至適温度は18〜25℃である。
(5)大豆レシチンの存在下で4,7,10,13,16‐ドコサペンタエン酸を多量に生産する。
【0014】
次に、本発明の微生物を培養して4,7,10,13,16‐ドコサペンタエン酸を得るには、炭素源として糖類、窒素源として有機含窒素物質及び無機塩をそれぞれ0.1〜10g/リットルの濃度で含有する海水が基本培地として用いられる。
【0015】
上記の糖類としては、例えばグルコース、ショ糖、フルクトース、水あめなどが、有機含窒素物質としては、ペプトン、酵母エキスなどが用いられる。また、無機塩としては、NaCl、KCl、NaNO3、MgSO4・7H2O、KH2PO4、K2HPO4、FeSO4・7H2O、(NH4)2SO4などが用いられるが、もともと海水中に存在する成分については特に添加する必要はない。
培養温度としては、15〜30℃、好ましくは18〜25℃、培地pHとしては5〜9、好ましくは6〜8が用いられる。
【0016】
このようにして2時間ないし20日間培養した培養物中の菌体には、4,7,10,13,16‐ドコサペンタエン酸がトリグリセリドとして多量に蓄積される。この際、4,7,10,13,16‐ドコサペンタエン酸の一部はリン脂質としても蓄積される。
【0017】
したがって、培養物から菌体を分離し、分離した菌体を有機溶剤、例えばクロロホルムで抽出すると、高度不飽和脂肪酸として4,7,10,13,16‐ドコサペンタエン酸を高い割合で含む脂質を得ることができる。そして、この脂質は、シリカカラムクロマトグラフィーにより、トリグリセリド及びリン脂質に分離することができる。次に、このようにして得られた4,7,10,13,16‐ドコサペンタエン酸のグリセリド及びリン脂質を常法により加水分解すると、所望の4,7,10,13,16‐ドコサペンタエン酸が得られる。
【0018】
本発明の微生物を培養するに際して、培地中に大豆レシチンを添加すれば、その培養効率を著しく向上させることができるので有利である。この添加濃度としては、2.0〜4.5g/リットル、好ましくは2.5〜4.0g/リットルの範囲内で選ぶのがよい。
【0019】
また、培養物を加水分解したのち、尿素付加法を用いて濃縮すれば、4,7,10,13,16‐ドコサペンタエン酸以外の脂肪酸を効率よく除去しうるので、容易に高純度の4,7,10,13,16‐ドコサペンタエン酸を得ることができる。
【0020】
この尿素付加法は以下のようにして行われる。
すなわち、菌体を有機溶剤で抽出し、加水分解後、得られた脂肪酸混合物50gをメチルアルコール1リットルに溶解し、メチルアルコール1リットル当り、尿素200gを加えて溶解したのち、低温で静置し、析出してくる尿素を濾去する。このようにして得た濾液には飽和脂肪酸は含まれておらず、90質量%以上が4,7,10,13,16‐ドコサペンタエン酸である。
【0021】
【実施例】
次に実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらによってなんら限定されるものではない。
【0022】
実施例1
人工海水にポリペプトン1g/リットル、酵母エキス0.5g/リットル、寒天10g/リットル、ツイーン80(Tween80)1.25g/リットルを加えたのち、100℃に加熱し滅菌することにより基本培地を調製した。この基本培地に、炭素源として大豆油、大豆レシチン、リノール酸又はリノレン酸を30g/リットル添加したのち、ラビリンチュラL59株を植菌し、25℃において14日間培養した。
次いで、培養物の一部を採取し、ガスクロマトグラフィーにより、4,7,10,13,16‐ドコサペンタエン酸の定量分析を行い、寒天1g当りの生成量(mg)すなわちmg/g−agarを求めた。その結果を表1に示す。
【0023】
【表1】
【0024】
この表から分るように、大豆油又は大豆レシチンを添加した場合、特に大豆レシチンを添加した場合にドコサペンタエン酸の収量が向上する。
【0025】
実施例2
実施例1の基本培地に、20、25、30、40又は45g/リットルの割合で大豆レシチンを添加した培地を調製し、これに、ラビリンチュラL59株を植菌し、実施例1と同様にして25℃において14日間培養し、得られた培養物について実施例1と同様にして4,7,10,13,16‐ドコサペンタエン酸のガスクロマトグラフィー分析を行った。その結果を表2に示す。
【0026】
【表2】
【0027】
この表から分るように、大豆レシチン添加量2.5〜4.0質量%において、ドコサペンタエン酸が高い収率で得られる。
【0028】
実施例3
実施例1の基本培地に大豆レシチン40g/リットルを添加し、ラビリンチュラL59株を植菌し、10〜30℃の範囲内で温度を変えて14日間培養した。得られた培養物について、実施例1と同様にしてガスクロマトグラフィー分析を行った結果を表3に示す。
【0029】
【表3】
【0030】
この表から分るように、培養温度としては18〜25℃の範囲、特に20℃付近が最適である。
【0031】
実施例4
実施例3の培養温度20℃で得た培養物を加水分解したのち、10%塩酸−メチルアルコール溶液を加えて反応させ、脂肪酸をすべてメチルエステルに変換し、それを尿素付加法を用いて精製した。このものについてガスクロマトグラフィー分析を行った結果をチャートとして図3に示す。
また、同じものについて、ガスクロマトグラフィー質量分析計で分離、分析した場合のピーク成分のチャートを図4に示す。
これらの結果は、ラビリンチュラL59株が高度不飽和脂肪酸として4,7,10,13,16‐ドコサペンタエン酸のみを含み、それは尿素付加法により容易にその他の脂肪酸から分離できることを示す。
【0032】
【発明の効果】
本発明によると、生理活性物質として期待される4,7,10,13,16‐ドコサペンタエン酸を選択的にかつ90質量%以上の高収率で得ることができ、さらに脂質の構成成分である高度不飽和脂肪酸の90質量%以上が4,7,10,13,16‐ドコサペンタエン酸であるトリグリセリド及びリン脂質が得られ、その結果、これまで実現できなかった食品、家畜飼料、医薬品の添加剤を工業的規模で製造しうるという利点がある。
【図面の簡単な説明】
【図1】 本発明微生物L59株の光学顕微鏡写真。
【図2】 本発明微生物の菌株中に蓄積された脂肪酸のガスクロマトグラフィーによる組成パターン。
【図3】 実施例4で得た生成物のガスクロマトグラフィー分析のチャート。
【図4】 実施例4で得た生成物のガスクロマトグラフィー質量分析計で測定したピーク成分の分析チャート。
Claims (3)
- ラビリンチュラ科ラビリンチュラ属に属する4,7,10,13,16‐ドコサペンタエン酸生産菌L59株(FERM P−18987)。
- 請求項1記載の微生物を培養し、菌体中に構成脂肪酸として4,7,10,13,16‐ドコサペンタエン酸を含む脂質を蓄積させたのち、菌体を分離し、分離した菌体から溶媒により前記脂質を抽出したのち、その抽出物を加水分解することを特徴とする4,7,10,13,16‐ドコサペンタエン酸の製造方法。
- 炭素源として大豆レシチンを含む培地中で培養する請求項2記載の製造方法。
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