JPH07203983A - 酵素合成によりトレハロースを製造する方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 トレハロースホスホリラーゼを予じめ部分精
製する必要が無く、粗酵素液で用いてもトレハロースを
酵素合成することの出来る合成法を提供する。 【構成】 マルトースとトレハロースホスホリラーゼ、
マルトースホスホリラーゼ、及び２mM以上、好ましくは
３mM以上のの夾雑妨害酵素抑制剤を含む酵素液を30〜45
℃程度に加温して、酵素反応させることによりマルトー
スをトレハロースに転換させることを特徴とする酵素合
成によりトレハロースを製造する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、マルトースホスホリラ
ーゼ及びトレハロースホスホリラーゼによりマルトース
からトレハロースを酵素合成する方法に関するものであ
る。

【０００２】

【従来の技術】トレハロースは、グルコース２分子がα
（１，１）結合した非還元性の二糖類で、天然界では昆
虫、酵母、カビ、細菌、担子菌、紅藻、地衣類、植物マ
ンナン、ワムシ、無脊椎動物、顕花植物等に広く分布し
ている。このトレハロースは、水分子が重なった構造と
類似しているため、生物体内では生命に不可欠な水の代
役となり、細胞やタンパク質、核酸等を乾燥や凍結から
守る生体保護機能、及び天然保存剤としての機能を有し
ている。又、血清や肝臓中のコレステロールの蓄積を抑
える作用や、ストレプトコッカスミュータンス（Strept
ococcus mutans）等の虫菌類による不溶性グルカンや酸
の生成が無く、ショ糖による不溶性グルカンの生成も抑
える等の抗うしょく性も有しており、更に、腸内におけ
るビフィズス菌の増殖因子として生理活性機能も有して
いる。このようにトレハロースは、物質を乾燥や凍結か
ら守る機能を有しているため、医薬品、診断薬、ホルモ
ン、受精卵、***、生理活性物質、酵素、微生物等の有
用物質や食品保存剤として用いることが出来るし、化粧
品に加えることにより保水剤として用いることも出来
る。又、砂糖に比べて甘みが低く、人体に吸収され難い
うえ、抗うしょく性も有しているので、低カロリー甘味
料として有効に用いることが出来るし、コレステロール
を抑制する効果やビフィズス菌を増殖する効果があるた
め、医薬品や健康食品としても用いることが期待されて
いる。従来、トレハロースを得る方法としては、ノカル
ジヤ(Nocardia)属に属する微生物等の微生物の醗酵によ
る方法、マルトースホスホリラーゼ及びトレハロースホ
スホリラーゼによりマルトースから生成する方法、グル
タミン酸醗酵の過程で副生させる方法、酵母菌体から抽
出する方法などがあげられる。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】上記した従来のトレハ
ロースを得る方法のうちマルトースホスホリラーゼ及び
トレハロースホスホリラーゼによりマルトースから生成
する方法、即ち、マルトースとリン酸（リン酸二水素カ
リウム）にラクトバチルス ブレビス（Lactobacillus
brevis）のマルトースホスホリラーゼ（ＭＰ）を作用さ
せ、生じたグルコースとβ-D- グルコース１リン酸（G-
1-P ）にユーグレナ グラチリス（Euglena gracilis）
のトレハロースホスホリラーゼ（ＴＰ）を作用させるこ
とによりトレハロースを酵素合成する方法は、原材料の
マルトースとリン酸が工業的に安価に供給されること
ゝ、ＡＴＰやＵＴＰなどの高エネルギー化合物を使用す
ることなく、副産物も出ないため、トレハロースの工業
的製造法として実際的であると判断されている。しかし
ながらこれらの酵素が菌体内酵素であり、糖類代謝に関
わる夾雑妨害酵素の影響を受けるので、従来は、これを
避けるために酵素を予じめ部分精製して使用することが
必須の要件とされた。そのため、トレハロースの製造コ
ストが嵩んで、安価にトレハロースを得ることが出来な
い、と云う問題があった。本発明は、ＴＰを予じめ部分
精製する必要が無く、粗酵素液を用いてもトレハロース
を酵素合成することの出来る合成法を提供することを目
的としている。

【０００４】

【課題を解決するための手段】本発明は、マルトースホ
スホリラーゼ（ＭＰ）及びトレハロースホスホリラーゼ
（ＴＰ）でマルトースを処理してトレハロースを酵素合
成する方法に係るものであり、殊に、これをＥＤＴＡ(E
thylenediaminetetraacetic acid) 、Ca⁺⁺、その他の夾
雑妨害酵素抑制剤の存在下で行うことを特徴とするもの
である。本発明に於いて、マルトースやトレハロースホ
スホリラーゼ、及びマルトースホスホリラーゼ等の原材
料、ＥＤＴＡその他の夾雑妨害酵素抑制剤を製造する方
法や、酵素液を調整するに当たってこれらを混合する方
法、或いはその濃度等については、特に限定はしない。
例えば、トレハロースホスホリラーゼは、ユーグレナ
グラチリス（Euglena gracilis Z）を材料とする。夾雑
妨害酵素抑制剤としては、ＥＤＴＡが好ましく、殊にこ
れを２mM以上、好ましくは３mM以上加えると、糖類代謝
を阻害する夾雑妨害酵素の影響が抑えられるため、予じ
め部分精製をしないトレハロースホスホリラーゼを用い
ても、部分精製をして夾雑妨害酵素を除去したものを用
いた場合と同じようにマルトースがトレハロースに転換
される。

【０００５】

【作用】本発明は、マルトース、トレハロースホスホリ
ラーゼ、及びマルトースホスホリラーゼとを含む酵素液
にＥＤＴＡその他の夾雑妨害酵素抑制剤を添加すること
により、粗酵素に含まれる夾雑妨害酵素の影響がこれに
よって抑えられて、粗酵素も精製酵素と同じようにマル
トースをトレハロースに転換する。

【０００６】

【実施例】以下、本発明に係る酵素合成によりトレハロ
ースを製造する方法を実施例に基づいて具体的に説明す
る。尚、各実施例で用いた酵素は、以下に示すものであ
る。 (1) ＭＰ生産菌 ＭＰ生産菌は、ラクトバチルス ブレビス（Lactobacil
lus brevis）を Yeast extract 1.0 ％ Glucose 1.0 ％ Pepton 1.0 ％ Sodium acetate 0.3 ％ Agar 1.7 ％ の保存培地、及び Yeast extract 0.2 ％ Maltose 1.0 ％ Pepton 1.0 ％ Sodium acetate 1.0 ％ MgSO₄・7H₂O 0.02 ％ MnSO₄・4H₂O 0.0002 ％ の保存培地で穿刺高層培養、及び斜面培養により、ま
た、10％スキムミルク液体培養により保存し、この保存
培地より１白金耳を10ml酵素生産用培地／φ18試験管に
植菌して、30℃、24時間の静置培養を行い、この前々培
養液を 100mlの同培地に２ml植菌して、30℃、24時間の
静置培養を行い、この前培養液30mlを1500mlの同培地／
２リットル三角フラスコに植菌し、30℃、24時間の静置培養
を行った。そして、この方法により得られた３リットルの培
養液を8000rpm 、15min の遠心分離により集め、５mMク
エン酸緩衝液（pH 6.6）で１回洗浄した後、培養液の１
／50量の同緩衝液（60ml）で菌を懸濁させ、この菌懸濁
液を超音波破砕処理し、10krpm、20min の遠心分離によ
り得られる上澄液（65ml）を菌体抽出液とした。次い
で、この抽出液に２％プロタミン硫酸塩14mlを加え、４
℃で30分間静かに攪拌し、6000rpm 、20min の遠心分離
により沈澱を除去し、この処理液71mlに硫安17.25gを添
加して40％飽和にし、４℃で30分間攪拌したのち放置し
て、5000rpm、20min の遠心分離により沈澱を除去し、
更に、上澄液82.5mlに対し、40％飽和になるように硫安
23.5gを加え、４℃で１晩放置したのち10krpm、10min
の遠心分離により沈澱を集め、沈澱を上記５mMクエン酸
緩衝液（10ml）に懸濁した。続いて、この酵素溶液を上
記緩衝液に対して４℃で１夜透析を行った後、同緩衝液
で平衡化したイオン交換カラム（ベット容積 60ml）に
流速１ml／min で通液して吸着させ、更にこれに 180ml
の溶出液を通液してカラムを洗浄した後、０〜１M （ 3
00ml−300ml ）のNaClグラジエントによりカラムからの
溶脱を行い、フラクションコレクタで４mlずつ分画し
て、ＭＰ活性の強い画分27.0mlを回収し、これを攪拌セ
ル型限外濾過器で脱塩、濃縮して14.5mlにした。この酵
素の比活性は、16.4 units/A₂₈₀ である。 (2) ＴＰ生産細胞 ＴＰ生産細胞は、ユーグレナ グラチリス（Euglena gr
acilis Z）を Glucose 12.0 g/l DL-malic acid 7.0 g/l L-glutamie acid 5.0 g/l KH₂SO₄ 0.4 g/l MgSO₄・7H₂O 0.5 g/l CaCO₃ 0.2 g/l ZnSO₄・7H₂O 0.025 g/l MnCl₂・4H₂O 0.025 g/l Fe₂(SO₄)₃・xH₂O 0.001 g/l NaMoO₄・2H₂O 0.001 g/l CuSO₄・7H₂O 0.001 g/l CoSO₄・7H₂O 0.001 g/l H₃BO₃ 0.001 g/l NiCl₂・6H₂O 0.0005g/l Thiamine HCl 0.0025g/l Cyanocobalamin 10. μg の、pHを3.3 に調整した Oda培地で 100ml／500ml 坂口
フラスコを用いて25℃で振盪条件下で継代培養し、或い
はpHを 6.0に調整した Oda斜面培地で保存し、この継代
培養液３mlを 100mlの Oda培地／ 500ml坂口フラスコに
植菌し、プラントルックス付往復振盪培養機にて、振盪
条件下で25℃、４日間培養を行った。そして、得られた
10リットルの培養液を3000rpm 、５min の遠心分離により集
め、冷水で２回洗浄した後、抽出用緩衝液（ 100mM K₂H
PO₄・pH 7.0、２mM ＥＤＴＡ、25％グリセロール）で細
胞を懸濁して、培養液の１／10量（１リットル）にし、この
懸濁液に超音波破砕処理を加え、8000rpm 、10min の遠
心分離により沈澱を除去して、上澄液を菌体抽出液とし
た。次いで、この抽出液に５％プロタミン硫酸塩68mlを
添加し、氷水中に20分間放置し、5000rpm 、10min の遠
心分離により沈澱を除去し、この処理液に硫安 691g を
添加して75％飽和にし、アンモニアでpHを7.0 に調整し
た後、４℃で１晩放置し、生じた沈澱をセライトを助剤
として吸引濾過して集め、沈澱を４mM K₂HPO₄-KH₂PO
₄(pH 7.0) 、２mM ＥＤＴＡ、25％グリセロール（ 400
ml）に溶解した。続いて、この酵素溶液を４mM K₂HPO₄
-KH₂PO₄(pH 7.0) 、２mM ＥＤＴＡを外液として４℃で
24時間透析を行い、生じた不溶物は、10Krpm、10min に
より除去し、同緩衝液で平衡化したイオン交換カラム
（ベット容積 200ml）に流速２ml／min で通液して吸着
させ、更にこれに 600mlの溶出液を通液してカラムを洗
浄した後、 0〜１M （1000ml−1000ml）の KCl（４mM K
₂HPO₄-KH₂PO₄・pH 7.0 、２mMＥＤＴＡ、25％グリセロー
ル）グラジエントによりカラムからの溶脱を行い、フラ
クョンコレクタで15mlずつ分画して、ＴＰ活性の強い画
分 245mlを回収し、これを攪拌セル型限外濾過器で脱
塩、濃縮して40mlにした。この酵素の比活性は、118mun
its ／mgである。酵素活性は、下記の測定により測定し
た。 (1) ＭＰ活性の測定 ＭＰ活性は、リン酸存在下でマルトースから遊離するグ
ルコース量をグルコースオキシダーゼ法により定量する
ことによって行った。即ち、酵素溶液 0.6mlと 0.2M K₂
HPO₄−クエン酸緩衝液（pH・5.2） 0.2mlを混合し、これ
を37℃の恒温槽中で、５分間放置して温度を平衡化さ
せ、これに 0.2Mのマルトース水溶液 0.2mlを加え、37
℃で10分間反応を行う。反応は、沸騰湯浴中で３分間加
熱して停止させ、次いで、この反応液より 0.1mlをと
り、 2.5mlのグルコースオキシダーゼ呈色液に加え、こ
れを37℃の恒温槽で、５分間温度を平衡化させた後、５
mg／ ml グルコースオキシダーゼ溶液 0.1mlを加え、37
℃で10分間反応させた後、１M NaN₃水溶液 0.1mlを加え
て反応を止め、 550nmの吸光度を測定する。又、酵素液
の代わりに水を用いて同様の操作を行ったものをブラン
クとして、予じめ作成した検線量によりグルコースの量
を求める。本条件下で、１分間に１μmol のグルコース
を生成させる酵素量を１unitと定義する。 (2) ＴＰ活性の測定 ＴＰ活性は、リン酸存在下でトレハロースから遊離する
グルコース量をSomogyi-Nelson法により定量することに
よって行う。即ち、 0.1M トレハロース(in 0.1M K₂HPO
₄ 緩衝液、pH・7.0）50μl に酵素溶液50μl を加え、37
℃で30分間反応を行う。次いで、これにSomogyi 液 0.5
mlを加えて反応を停止させ、沸騰湯浴中で15分間加熱し
たのち、流水で５分間直冷する。そしてこれにNelson液
0.5mlを添加して攪拌して、室温で15分間放置した後、
水４mlを加え、 500nmの吸光度を測定する。又、基質溶
液の代わりに 0.1M K₂HPO₄緩衝液(pH・7.0 ）を加えて同
様の操作を行ったものをブランクとし、グルコースを用
いて作成した検量線より生成したグルコースの量を求め
る。本条件下で、１分間に１μmol のグルコースを生成
させる酵素量を１unitと定義する。

【０００７】

【実施例１】 2.0 u/ml ＭＰ ・・・ 1.0 ml 0.6 u/ml ＴＰ ・・・ 4.0 ml 0.0 〜200 mM ＥＤＴＡ(K₂HPO₄-クエン酸緩衝液・pH 6.0)・・ 5.0 ml を混合して、夫々の濃度を 0.2 u/ml 、 0.2 u/ml、及び
0.0 〜100 mMにした酵素液を調整し、これにマルトース
180mgを加え、37℃で40時間攪拌した。反応は30時間で
殆んど平衡に達し、マルトースからトレハロースへの転
換率は、58％に達した。尚、この反応では、酵素液のＥ
ＤＴＡの濃度が 0.2mM以下のときは、ＴＰが菌体抽出液
のものよりもプロタミン処理液、塩析溶液の方がマルト
ースからトレハロースへの転換率が若干高く、ＥＤＴＡ
の濃度を高くするに従ってその転換率が高くなる傾向が
ある。又、ＥＤＴＡの濃度が 2.0mM程度以上のときは、
ＴＰが菌体抽出液であるか抽出液であるかに拘らずマル
トースからからトレハローmlへの転換率はほゞ60％とな
った。

【０００８】

【実施例２】 4.0〜23.5 u/ml ＭＰ(0.1M Tris-maleate-KOH・pH 6.0) ・・・ 64 ml 0.5〜 3.0 u/ml ＴＰ(0.1M Tris-maleate-KOH・pH 6.0) ・・・500 ml 200 mM ＥＤＴＡ(0.1M K₂HPO₄緩衝液・pH 6.0) ・・・ 25 ml を混合して、夫々の濃度を 0.25 〜1.5 u/ml、 0.25 〜
1.5 u/ml、 5.0mMにした酵素液を調整し、これに 500mM
のマルトース（in 0.1M K₂HPO₄緩衝液・pH 6.0)を400ml
加え、リン酸塩は終濃度で40mMになるように添加して、
30〜45℃で21時間の反応を行った。その結果、マルトー
スからトレハロースへの転換率は、酵素濃度が 0.5〜1.
3u/mlの場合が最適であり、ＴＰの濃度はＭＰの濃度以
上にする必要はなかった。酵素液の酵素の濃度を共に
0.5 u/ml にした場合は、リン酸塩濃度は80mMにしたよ
りも40mMにした方がよい結果が得られた。反応温度は、
35〜40℃の範囲が好ましく、35℃以下では転換率がやゝ
低下した。補助緩衝液（酵素希釈用緩衝液）として、
0.1mM Tris-maleate-KOH 、 0.1mMK₂HPO₄ −クエン酸、
及び 0.1mM K₂HPO₄-KH₂PO₄を用いて比較したところ、何
れも同程度の効果があった。

【０００９】

【発明の効果】以上詳述したように本発明は、ＴＰとＭ
Ｐとからなる酵素液を用いて、マルトースをトレハロー
スに転換させるもので、殊にこの反応をＥＤＴＡその他
の、夾雑妨害酵素抑制剤の存在下で行うことにより、酵
素に夾雑妨害酵素が含まれていても、その影響が強力に
阻害される。そのため、酵素を予じめ部分精製する必要
が無く、粗酵素液を用いることが可能となり、製造コス
トが低減し、安価にトレハロースを得ることが出来るよ
うになったのである。

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 マルトースとトレハロースホスホリラー
   ゼ、及びマルトースホスホリラーゼを含む酵素液を適度
   な温度に加温して、酵素反応させることによりマルトー
   スをトレハロースに転換させるものであり、殊に酵素液
   には、２mM以上、好ましくは３mM以上の夾雑妨害酵素抑
   制剤を添加することを特徴とする酵素合成によりトレハ
   ロースを製造する方法。
2. 【請求項２】 夾雑妨害酵素抑制剤はＥＤＴＡであるこ
   とを特徴とする請求項１記載の酵素合成によりトレハロ
   ースを製造する方法。
3. 【請求項３】 夾雑妨害酵素抑制剤はCa⁺⁺であることを
   特徴とする請求項１記載の酵素合成によりトレハロース
   を製造する方法。