JPH07179363A - 生物学的に活性な成分を含有するミクロスフェアの製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】 生物学的に活性な分子とヒアルロン酸エステ
ルまたは該エステルの混合物からなり、該生物学的に活
性な分子が該ヒアルロン酸エステルまたはその混合物に
よって囲まれているかまたはそれに吸着しており、そし
て１〜１００μmの直径を有する、生物学的に活性な分
子を制御して放出させるためのミクロスフェアが提供さ
れる。 【効果】 本発明のミクロスフェアは、薬物の生物学的
および薬理学的な性質を無傷のままに、薬物の種類、所
望の作用部位、および所望の放出時間に応じて製造する
ことができ、生物学的および／または薬理学的な作用を
発揮することができる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明の目的は、ミクロスフェア
組成物およびその製造方法を提供することである。この
製造は、生物分解性かつ生物吸収性の半合成ポリマーと
薬理学的活性を有する単一の分子またはその混合物から
始め、使用する半合成ポリマーの化学的性質と該分子の
生物学的もしくは薬理学的活性を変化させないように
し、半合成ポリマー上に存在する化学的置換基の親水性
の性質に依存して制御された放出が確保されるように行
なう。

【０００２】

【従来の技術】タンパク質およびペプチド類は、現在で
は治療用薬剤の重要な基本物質であると考えられてい
る。組換えＤＮＡの技術は、重要かつ有用な生物学的お
よび薬理学的性質を有する多数のこのような巨大分子薬
物の製造を可能にした。化学合成における大きな技術的
進歩により、高い薬理学的活性を有する多数のポリペプ
チドを得ることが可能になった。しかし、これらの薬物
に対しても、その安定性およびヒトへの投与の点でなお
問題が残っている。活性成分をヒトに投与したときに
は、望ましくない副作用を避けるためにその薬理学的活
性が変化しないままであること、およびその放出が確保
されていることを保証するのが必須である。これらの巨
大分子薬物は胃腸経路に存在するタンパク質加水分解酵
素によって急速に分解および不活性化されるので、通
常、経口投与後には有効ではないことがわかっている。

【０００３】これらの巨大分子が酵素消化に耐えるとき
であっても、これら分子が大きいために極めてわずかし
か吸収されないことが多い。他の投与経路(例えば、
鼻、口腔、膣、直腸および経皮など)がタンパク質およ
びペプチドの吸収に用いられているが、生物利用性は活
性成分の固有の性質の故に変化しやすく、かつ低いこと
がわかっている。従って、これらの分子は非経口経路で
投与されるのが普通であるが、この経路も主として血流
から急速に排除されることに関係した不都合を有してい
る。過去１０年間に、一方でタンパク質の固有の活性を
保存することを可能にし、他方でその制御された放出を
可能にする製剤の製造に向けられた医薬技術に顕著な進
歩が為された[Langer R., Science 1527, 1990]。

【０００４】合成または部分的に天然のポリマー・マト
リックスを使用することは、薬物の放出が再現性あるも
のであり、血流中の一定濃度を確保するものであり、そ
れによって繰返し投与(後の副作用の危険を伴う)を避け
ることを意味する。しかし、これらポリマー・マトリッ
クスの使用は、使用するポリマーの実際の性質に本質的
に関係した一連の新しい問題、例えば、それらの毒性、
それらの分解産物の毒性、生物適合性、非分解性残骸の
蓄積の除去の問題を生じた。

【０００５】最近の研究は、生物学的および薬理学的に
活性な分子の制御された放出が可能であり、この延長さ
れた放出を可能にしつつこれら分子を分解から保護する
ことができ、この放出特性を変化させることもある線維
性の生物組織に対する親和性を持たず、薬理学的に活性
な分子に対して望ましくない反応性を示さず、またそれ
自体もその分解産物も免疫原性ではない、部分的または
全体的に天然物質から製造される生物吸収性および生物
分解性ポリマーを同定することおよび開発することに向
けられている。

【０００６】薬理学的に活性な分子の放出系として広く
用いられている天然ポリマーの例としては、例えばヒア
ルロン酸が米国特許番号４,８５１,５２１および４,９
６５,３５３に、アルギン酸がＥＰ公開番号０２５１９
０５に、キトサンがＥＰ公開番号０３４１７４５に、そ
して酸性多糖類のゲランが記載されている。

【０００７】ヒアルロン酸は動物体に広く分布している
多糖であり、交互のＤ-グルクロン酸およびＮ-アセチル
-Ｄ-グルコサミン単位で構成されている。その平均分子
量は用いた精製法によって２ｘ１０４〜７ｘ１０６に変
化する。ヒアルロン酸は、例えば米国特許番号４,７７
２,４１９に記載されているように、接着および組織拡
大を防止するために使用されている。さらに、米国特許
番号４,６３６,５２４は、ヒアルロン酸ゲルの網目によ
って形成される分子"かご"中に分散される生物学的に活
性な物質のための放出系を開示している。また、ヒアル
ロン酸は、生物分解性のコラーゲンに基づくマトリック
ス中に捕捉された薬物のための担体として文献に記載さ
れている。米国特許番号４,８５１,５２１および４,９
６５,３５３には、ヒアルロン酸のカルボキシ基を治療
学的に活性または不活性なアルコールでエステル化する
ための化学的方法が記載されている(ＨＹＡＦＦ)。この
化学的修飾を用いると、このポリマーの物理化学的性質
(例えば、このポリマーの疎水性および親水性の性質)は
大きく変化するが、多糖の化学的構造は以下に示すよう
に変化しないままである：

【化１】

【０００８】さらに、生物学的に活性な物質の制御され
た放出のための系を調製するための種々の方法が文献に
記載されている。例えば、生物学的および／または薬理
学的に活性な分子を含有するミクロスフェア(微小球)が
ＰＣＴ特許ＷＯ８９／０３２０７に記載されている。こ
れらの放出系は、薬理学的および／または生物学的に活
性な分子(ポリペプチドのように変性しうる)と天然ポリ
マー(デンプン、ゼラチンまたはアルブミン)の会合を含
んでいる。膣または鼻粘膜などの粘膜から活性物質を放
出させるために使用する製剤(ミクロスフェア)を製造す
るためのポリマー担体としてヒアルロン酸および／また
はその誘導体を使用することについては記載されていな
い。ヒアルロン酸エステルを用いて製造したミクロスフ
ェアからの、タンパク質またはグリコスフィンゴ脂質の
性質を持たない薬理学的に活性な物質の放出のインビト
ロでの特徴は論文に記載されている[Benedettiら，"ヒ
アルロン酸エステルのミクロスフェアの製造方法および
インビボでのヒドロコルチゾンの放出"，Journal of Co
ntrolled Release 13, 33-41 (1990)]。

【０００９】ミクロスフェア製造のために開発された種
々の方法の中で最も成功したのは、"蒸発"および"抽出"
法である。これらの両過程は２種類の混合できない液体
の乳濁液を調製することを必要とする。不連続相として
知られる乳濁相は、修飾ヒアルロン酸と物質、即ち生物
学的および／または薬理学的に活性な物質の適当な混合
物を含有する溶媒の微小滴によって構成されている。連
続相として知られる他の乳濁相は、微小滴が均質に分散
している第２の溶媒によって表される。この乳濁液が安
定であるときには、不連続相は使用される方法の種類に
応じて蒸発または抽出のいずれかによって除去される。
生物学的に活性な物質または物質の混合物をどのように
してミクロスフェア中に導入するかに応じて、異なる性
質を備えた放出系を得ることができる。例えば、活性成
分がミクロスフェアを構成しているポリマー・マトリッ
クス中に物理的に分散しているときには、その放出を、
ポリマー網目からの生物学的および／または薬理学的に
活性な物質の拡散の速度によって制御することができ
る。

【００１０】Benedettiら(1990)の論文は、特に蒸発に
よってミクロスフェアを製造しうることについて言及し
ているが、これは、抽出法が多孔性の高い表面を有する
ミクロスフェアを与え、その結果としてミクロスフェア
を構成しているポリマー・マトリックスが活性成分(コ
ルチコステロイド)の放出に対する制御を持たないため
である。

【００１１】

【発明が解決しようとする課題】本発明は驚くべきこと
に、平滑な表面を有するミクロスフェアであって、従っ
てその中に導入された物質の放出に対して一層高い制御
能を有するミクロスフェアを抽出によって製造しうるこ
とを示すものである。本発明の抽出法の別の利点は、Be
nedettiらが記載しているミクロスフェアよりも顕著に
小さい直径を有するミクロスフェアを製造しうることあ
る。即ち、このミクロスフェアの使用は、比較的大きな
直径のミクロスフェアとは異なり、比較的大きな全表面
積を保証し、従って治療しようとする組織との一層の接
触を保証することになる。

【００１２】本発明は、タンパク質の性質を有する分子
(例えば、カルシトニン、インシュリン、免疫グロブリ
ン、hＣＮＴＦ／hＮＧＦなどのトロフィック因子)およ
び／またはグリコスフィンゴ脂質の性質を有する分子
(例えば、天然のガングリオシドまたはその化学的誘導
体)を含有するミクロスフェアの製造、即ち、Benedetti
らの論文に記載されている化合物(コルチコステロイド)
とは構造、物理化学的性質および安定性が全く異なって
いる化合物のミクロスフェアの製造を記載するものであ
る。驚くべきことに、本放出系の使用によって、ポリマ
ーに結合しているタンパク質が分解を受けず、その生物
学的活性を維持することがわかった。

【００１３】また、本発明は高分子量の分子の導入を示
すものである：即ち、導入される分子の分子量はコルチ
コステロイドの分子量に比べて相当に高い。使用される
生物学的に活性な分子の物理化学的な性質に応じて選択
される異なる物理化学的性質(親水性／疎水性)を備えた
ＨＹＡＦＦ誘導体からミクロスフェアを製造しうるこ
と、ならびに、生物学的に活性な分子が適用されるとこ
ろでは薬理学的に活性な分子の放出時間およびその後の
作用が本発明に従って説明される。本発明の結果とし
て、投与形式、活性物質の種類および所望の作用時間に
応じて具体的に設計された薬理学的および生物学的に活
性な物質とＨＹＡＦＦポリマーの適当な混合物からミク
ロスフェアを製造することができる。また、薬理学的お
よび／または生物学的に活性な物質または物質の混合物
が表面吸着されたミクロスフェアを製造することもでき
る。この場合には、ミクロスフェアに対して上記した原
理および作用部位に対する薬理学的な相互作用の可能性
は極めて効果的である。

【００１４】

【課題を解決するための手段】本発明は、異なる分子量
を有する化学的に修飾されたヒアルロン酸と、単一の薬
物およびその適当な混合物の溶液から出発してミクロス
フェア組成物を製造するための方法に関する。即ち、本
発明は、薬物の生物学的および薬理学的な性質を無傷の
ままに、所望の部位、所望の放出時間、放出させようと
する生物学的および／または薬理学的に活性な薬物の種
類に応じて製造することができ、生物学的および／また
は薬理学的な作用を発揮するミクロスフェア組成物の製
造方法を提供するものである。

【００１５】図１は、溶液中のカルシトニンを膣投与し
た後の、血漿中のカルシウム量(％)を示すものである。
図２は、ＨＹＡＦＦ-１１およびＨＹＡＦＦ-１１ p７５
のミクロスフェアと会合したカルシトニンを膣投与した
後の、血漿中のカルシウム量(％)を示すものである。図
３は、インシュリンを含有するＨＹＡＦＦ-１１ミクロ
スフェアを異なる用量でヒツジに鼻投与した後の、血漿
グルコースの減少に及ぼす作用を示すものである。図４
は、ＨＹＡＦＦ-１１ミクロスフェアを異なる用量でヒ
ツジに鼻投与した後の、血漿中のインシュリン量を示す
ものである。図５は、ＧＭ₁を単独で、および直径の異
なるミクロスフェアと一緒にしてウサギに筋肉内投与し
た後の、血漿中のＧＭ₁量を示すものである。図６は、
ＨＹＡＦＦ-１１ p７５のミクロスフェアから放出され
るＮＧＦを示すものである。図７は、ＨＹＡＦＦ-１１
のミクロスフェアから放出されるＮＧＦを示すものであ
る。図８は、ＨＹＡＦＦ-７のミクロスフェアから放出
されるＮＧＦを示すものである。

【００１６】

【実施例】本発明のミクロスフェアは１〜１００μm、
好ましくは１〜１５μmの粒子径を有していなければな
らず、また、滑らかな表面を有していなければならな
い。以下に実施例を挙げて本発明のミクロスフェアの製
造方法およびその使用を説明するが、これらは例示のた
めだけのものであり、本発明の範囲を限定するものでは
ない。本発明のミクロスフェアを構成するヒアルロン酸
エステル誘導体(ＨＹＡＦＦ)の分子量は、例えば約１０
０,０００〜２,０００,０００ダルトンの範囲内であっ
てよいが、好ましい範囲は約１００,０００〜２００,０
００ダルトンまたは約５００,０００〜７００,０００ダ
ルトンである。

【００１７】実施例１ ヒアルロン酸の全カルボキシ基がベンジルアルコールで
エステル化されているヒアルロン酸エステル(ＨＹＡＦ
Ｆ−１１、米国特許番号４,９６５,３５３に記載)を、
５〜１０％重量/容量の間で変化する濃度(通常は７％w/
v)でジメチルスルホキシドなどの非プロトン性溶媒に溶
解する。このポリマーが溶解したら、ヒトインシュリン
などのポリペプチドを、予め決定した濃度(例えば、ポ
リマー１mgあたり５Ｉ.Ｕ.)で溶液に加える。得られた
混合物を以降は不連続相と称する。同時に、非イオン系
界面活性剤であるＡrlacel^Rを１％w/vの濃度で含む高粘
度の鉱油の混合物を適当な反応容器中で製造する。この
混合物を以降は連続相と称する。連続相を１０００rpm
の固定速度で撹拌しながら２５℃に維持し、次いで上記
のように製造した不連続相をこれに加える。これらの条
件下で二相の乳化が即時に起こる。二相(不連続相と連
続相)の間の比は約１〜１６である。撹拌の１５分後
に、アセチルアセテートを加える。この溶媒は乳濁液の
二相と完全に混合するが、ポリマーおよびヒトインシュ
リンポリペプチドに対しては非溶媒である。完全な抽出
を得るのに必要な抽出溶媒の容量は乳濁液の全容量の
２.５倍であることが判明した。抽出を容易にするため
に、撹拌速度を１０分間、１４００〜１５００rpmに設
定し、次いで５００rpmに下げる。このようにして得ら
れた懸濁液の撹拌を、１気圧に設定したフィルター・プ
レスを通してスクリュー・ポンプでポンピングしながら
続ける。この濾過が完了したなら、n−ヘキサンのフィ
ルターを通してポンピングする。この溶媒は、製造物
の"乾燥"およびミクロスフェアの表面に存在することも
あるいずれかの残留界面活性剤の溶解という二重の作用
を有する溶媒である。次いで、生成物を適当な容器に入
れ、４℃で保存する。これらの処理条件において、得ら
れた平均粒子サイズは１０μmである。導入されたイン
シュリンの量はミクロスフェア１mgあたり４ＩＵであ
る。

【００１８】実施例２ ヒアルロン酸の全カルボキシ基がベンジルアルコールで
エステル化されているヒアルロン酸エステル(ＨＹＡＦ
Ｆ−１１、米国特許番号４,９６５,３５３に記載)を、
５〜１０％重量/容量の間で変化する濃度(通常は７％w/
v)でジメチルスルホキシドなどの非プロトン性溶媒に溶
解する。この得られた溶液を以降は不連続相と称する。
同時に、非イオン系界面活性剤であるＡrlacel^Rを１％w
/vの濃度で含む高粘度の鉱油の混合物を適当な反応容器
中で製造する。この混合物を以降は連続相と称する。連
続相を１０００rpmの固定速度で撹拌しながら２５℃に
維持し、上記のように製造した不連続相をこれに加え
る。これらの条件下で二相の乳化が即時に起こる。二相
(不連続相と連続相)の間の比は約１〜１６である。撹拌
の１５分後に、酢酸エチルを加える。この溶媒は２つの
乳濁相と完全に混合するが、ポリマーに対する溶媒では
ない。完全な抽出を得るのに必要な抽出溶媒の容量は乳
濁液の全容量の２.５倍であることが判明した。抽出を
容易にするために、撹拌速度を１０分間、１４００〜１
５００rpmに設定し、次いで５００rpmに下げる。このよ
うにして得られた懸濁液の撹拌を、１気圧に設定したフ
ィルター・プレスを通してスクリュー・ポンプでポンピ
ングしながら続ける。この濾過が完了したなら、n−ヘ
キサンのフィルターを通してポンピングする。この溶媒
は、製造物の"乾燥"およびミクロスフェアの表面に存在
することもあるいずれかの残留界面活性剤の溶解という
二重の作用を有する溶媒である。次いで、生成物を適当
な容器に入れ、４℃で保存する。このようにして製造さ
れたミクロスフェアを、懸濁されたミクロスフェア１mg
あたり２Ｕ.Ｉ.のタンパク質力価が達成される濃度のイ
ンシュリンを含むリン酸緩衝溶液(０.０１Ｍ)(イオン強
度＝０.１５Ｍ)中に懸濁する。半自動システムによる撹
拌の１５分後に、完全に凍結するまで懸濁物を液体窒素
に浸す。凍結したら、懸濁物を２４時間、凍結乾燥し、
生成物を４℃で保存する。平均粒子サイズは１５μmで
ある。導入されたインシュリンの量はミクロスフェア１
mgあたり２ＩＵである。

【００１９】実施例３ ヒアルロン酸の７５％のカルボキシ基がベンジルアルコ
ールでエステル化されており、残りの部分がナトリウム
で塩化されているヒアルロン酸エステル(ＨＹＡＦＦ−
１１ p７５、米国特許番号４,９６５,３５３に記載)
を、５〜１０％重量/容量の間で変化する濃度(通常は７
％w/v)でジメチルスルホキシドなどの非プロトン性溶媒
に溶解する。このポリマーが溶解したら、ヒトインシュ
リンなどのポリペプチドを、予め決定した濃度(例え
ば、ポリマー１mgあたり５Ｉ.Ｕ.)で溶液に加える。こ
のようにして得られた溶液を以降は不連続相と称する。
同時に、非イオン系界面活性剤であるＡrlacel^Rを１％w
/vの濃度で含む高粘度の鉱油の混合物を適当な反応容器
中で製造する。この混合物を以降は連続相と称する。連
続相を２５℃に維持し、１０００rpmの固定速度で撹拌
し、上記のように製造した不連続相をこれに加える。こ
れらの条件下で二相の乳化が即時に起こる。二相(不連
続相と連続相)の間の比は約１〜１６である。撹拌の１
５分後に、酢酸エチルを加える。この溶媒は乳濁液の二
相と完全に混合するが、ポリマーおよびヒトインシュリ
ンポリペプチドに対する溶媒ではない。完全な抽出を得
るのに必要な抽出溶媒の容量は乳濁液の全容量の２.５
倍であることが判明した。抽出を容易にするために、撹
拌速度を１０分間、１４００〜１５００rpmに設定し、
次いで５００rpmに下げる。このようにして得られた懸
濁液の撹拌を、１気圧に設定したフィルター・プレスを
通してスクリュー・ポンプでポンピングしながら続け
る。この濾過が完了したなら、n−ヘキサンのフィルタ
ーを通してポンピングする。この溶媒は、製造物の"乾
燥"およびミクロスフェアの表面に存在することもある
いずれかの残留界面活性剤の溶解という二重の作用を有
する溶媒である。次いで、生成物を適当な容器に入れ、
４℃で保存する。平均粒子サイズは２０μmである。導入
されたインシュリンの量はミクロスフェア１mgあたり４
ＩＵである。

【００２０】実施例４ ヒアルロン酸の全カルボキシ基がエチルアルコールでエ
ステル化されているヒアルロン酸エステル(ＨＹＡＦＦ
−７、米国特許番号４,９６５,３５３に記載)を、５〜
１０％重量/容量の間で変化する濃度(通常は７％w/v)で
ジメチルスルホキシドなどの非プロトン性溶媒に溶解す
る。このポリマーが溶解したら、ヒトインシュリンなど
のポリペプチドを、予め決定した濃度(例えば、ポリマ
ー１mgあたり５Ｉ.Ｕ.)で溶液に加える。このようにし
て得られた溶液を以降は不連続相と称する。同時に、非
イオン系界面活性剤であるＡrlacel^Rを１％w/vの濃度で
含む高粘度の鉱油の混合物を適当な反応容器中で製造す
る。この混合物を以降は連続相と称する。連続相を２５
℃に維持し、１０００rpmの固定速度で撹拌し、上記の
ように製造した不連続相をこれに加える。これらの条件
下で二相の乳化が即時に起こる。二相(不連続相と連続
相)の間の比は約１〜１６である。撹拌の１５分後に酢
酸エチルを加える。この溶媒は２つの乳濁相と完全に混
合するが、ポリマーおよびヒトインシュリンポリペプチ
ドに対する溶媒ではない。完全な抽出を得るのに必要な
抽出溶媒の容量は乳濁液の全容量の２.５倍であること
が判明した。抽出を容易にするために、撹拌速度を１０
分間、１４００〜１５００rpmに設定し、次いで５００r
pmに下げる。このようにして得られた懸濁液の撹拌を、
１気圧に設定したフィルター・プレスを通してスクリュ
ー・ポンプでポンピングしながら続ける。この濾過が完
了したなら、n−ヘキサンのフィルターを通してポンピ
ングする。この溶媒は、製造物の"乾燥"およびミクロス
フェアの表面に存在することもあるいずれかの残留界面
活性剤の溶解という二重の作用を有する溶媒である。次
いで、生成物を適当な容器に入れ、４℃で保存する。ミ
クロスフェアの大きさおよび平均粒子サイズは３０μm
である。導入されたインシュリンの量はミクロスフェア
１mgあたり４ＩＵである。

【００２１】実施例５ ヒアルロン酸の全カルボキシ基がエチルアルコールでエ
ステル化されているヒアルロン酸エステル(ＨＹＡＦＦ
−７、米国特許番号４,９６５,３５３に記載)を、５〜
１０％重量/容量の間で変化する濃度(通常は７％w/v)で
ジメチルスルホキシドなどの非プロトン性溶媒に溶解す
る。得られた溶液を以降は不連続相と称する。同時に、
非イオン系界面活性剤であるＡrlacel^Rを１％w/vの濃度
で含む高粘度の鉱油の混合物を適当な反応容器中で製造
する。この混合物を以降は連続相と称する。連続相を２
５℃に維持し、１０００rpmの固定速度で撹拌し、上記
のように製造した不連続相をこれに加える。これらの条
件下で二相の乳化が即時に起こる。二相(不連続相と連
続相)の間の比は約１〜１６である。撹拌の１５分後
に、酢酸エチルを加える。この溶媒は２つの乳濁液相と
完全に混合するが、ポリマーに対する溶媒ではない。完
全な抽出を得るのに必要な抽出溶媒の容量は乳濁液の全
容量の２.５倍であることが判明した。抽出を容易にす
るために、撹拌速度を１０分間、１４００〜１５００rp
mに設定し、次いで５００rpmに下げる。このようにして
得られた懸濁液の撹拌を、１気圧に設定したフィルター
・プレスを通してスクリュー・ポンプでポンピングしな
がら続ける。この濾過が完了したなら、n−ヘキサンの
フィルターを通してポンピングする。この溶媒は、製造
物の"乾燥"およびミクロスフェアの表面に存在すること
もあるいずれかの残留界面活性剤の溶解という二重の作
用を有する溶媒である。次いで、生成物を適当な容器に
入れ、４℃で保存する。このようにして製造されたミク
ロスフェアを、懸濁されたミクロスフェア１ｍｇあたり
２Ｕ．Ｉ.のタンパク質力価が達成される濃度のインシ
ュリンを含むリン酸緩衝溶液(０.０１Ｍ)(イオン強度＝
０.１５Ｍ)中に懸濁する。半自動システムによる撹拌の
１５分後に、懸濁物が完全に凍結するまで容器を液体窒
素に浸す。凍結したら、懸濁物を２４時間、凍結乾燥
し、生成物を４℃で保存する。平均粒子サイズは３０μ
mである。導入されたインシュリンの量はミクロスフェ
ア１mgあたり２ＩＵである。

【００２２】実施例６ ヒアルロン酸の全カルボキシ基がベンジルアルコールで
エステル化されているヒアルロン酸エステル(ＨＹＡＦ
Ｆ−１１、米国特許番号４,９６５,３５３に記載)を、
５〜１０％重量/容量の間で変化する濃度(通常は７％w/
v)でジメチルスルホキシドなどの非プロトン性溶媒に溶
解する。このポリマーが溶解したら、例えば神経成長因
子(ＮＧＦ)などのポリペプチドを、予め決定した濃度
(例えば、ポリマー重量の０.０１％)で溶液に加える。
このようにして得られた溶液を以降は不連続相と称す
る。同時に、非イオン系界面活性剤であるＡrlacel^Rを
１％w/vの濃度で含む高粘度の鉱油の混合物を適当な反
応容器中で製造する。この混合物を以降は連続相と称す
る。連続相を２５℃に維持し、１０００rpmの固定速度
で撹拌し、上記のように製造した不連続相をこれに加え
る。これらの条件下で二相の乳化が即時に起こる。二相
(不連続相と連続相)の間の比は約１〜１６である。撹拌
の１５分後に、酢酸エチルを加える。この溶媒は２つの
乳濁液相と完全に混合するが、ポリペプチドＮＧＦおよ
びポリマーに対する溶媒ではない。完全な抽出を得るの
に必要な抽出溶媒の容量は乳濁液の全容量の２.５倍で
あることが判明した。抽出を容易にするために、撹拌速
度を１０分間、１４００〜１５００rpmに設定し、次い
で５００rpmに下げる。このようにして得られた懸濁液
の撹拌を、１気圧に設定したフィルター・プレスを通し
てスクリュー・ポンプでポンピングしながら続ける。こ
の濾過が完了したなら、n−ヘキサンのフィルターを通
してポンピングする。この溶媒は、製造物の"乾燥"およ
びミクロスフェアの表面に存在することもあるいずれか
の残留界面活性剤の溶解という二重の作用を有する溶媒
である。次いで、生成物を適当な容器に入れ、４℃で保
存する。このような処理条件下で得られた平均粒子サイ
ズは１０μmである。導入されたＮＧＦの量はミクロス
フェア１mgあたり１０ngである。

【００２３】実施例７ ヒアルロン酸の全カルボキシ基がベンジルアルコールで
エステル化されているヒアルロン酸エステル(ＨＹＡＦ
Ｆ−１１、米国特許番号４,９６５,３５３に記載)を、
５〜１０％重量/容量の間で変化する濃度(通常は７％w/
v)でジメチルスルホキシドなどの非プロトン性溶媒に溶
解する。このポリマーが溶解したら、例えば神経成長因
子(ＮＧＦ)などのポリペプチドを、予め決定した濃度
(例えば、ポリマー重量の０.０１％)で溶液に加える。
この得られた溶液を以降は不連続相と称する。同時に、
非イオン系界面活性剤であるＡrlacel^Rを１％w/vの濃度
で含む高粘度の鉱油の混合物を適当な反応容器中で製造
する。この混合物を以降は連続相と称する。連続相を１
０００rpmの速度で撹拌しながら２５℃に維持し、上記
のように製造した不連続相をこれに加える。これらの条
件下で二相の乳化が即時に起こる。二相(不連続相と連
続相)の間の比は約１〜１６である。撹拌の１５分後
に、酢酸エチルを加える。この溶媒は乳濁液の二相と完
全に混合するが、ポリマーに対する溶媒ではない。完全
な抽出を得るのに必要な抽出溶媒の容量は乳濁液の全容
量の２.５倍であることが判明した。抽出を容易にする
ために、撹拌速度を１０分間、１４００〜１５００rpm
に設定し、次いで５００rpmに下げる。このようにして
得られた懸濁液の撹拌を、１気圧に設定したフィルター
・プレスを通してスクリュー・ポンプでポンピングしな
がら続ける。この濾過が完了したなら、n−ヘキサンの
フィルターを通してポンピングする。この溶媒は、製造
物の"乾燥"およびミクロスフェアの表面に存在すること
もあるいずれかの残留界面活性剤の溶解という二重の作
用を有する溶媒である。次いで、生成物を適当な容器に
入れ、４℃で保存する。このようにして製造されたミク
ロスフェアを、懸濁されたミクロスフェア重量の０.０
１％に等しいタンパク質力価が達成される濃度のＮＧＦ
を含むリン酸緩衝溶液(０.０１Ｍ)(イオン強度＝０.１
５Ｍ)中に懸濁する。半自動システムによる撹拌の１５
分後に、懸濁液が完全に凍結するまで容器を液体窒素に
浸す。凍結したら、懸濁物を２４時間凍結乾燥し、生成
物を４℃で保存する。平均粒子サイズは１０μmであ
る。導入されたＮＧＦの量はミクロスフェア１mgあたり
１０ngである。

【００２４】実施例８ ヒアルロン酸の７５％のカルボキシ基がベンジルアルコ
ールでエステル化されており、残りの部分がナトリウム
で塩化されているヒアルロン酸エステル(ＨＹＡＦＦ−
１１ p７５、米国特許番号４,９６５,３５３に記載)
を、５〜１０％重量/容量の間で変化する濃度(通常は７
％w/v)でジメチルスルホキシドなどの非プロトン性溶媒
に溶解する。このポリマーが溶解したら、例えばＮＧＦ
などのポリペプチドを、予め決定した濃度(例えば、ポ
リマー重量の０.０１％)で溶液に加える。このようにし
て得られた溶液を以降は不連続相と称する。同時に、非
イオン系界面活性剤であるＡrlacel^Rを１％w/vの濃度で
含む高粘度の鉱油の混合物を適当な反応容器中で製造す
る。この混合物を以降は連続相と称する。連続相を２５
℃に維持し、１０００rpmの速度で撹拌し、上記のよう
に製造した不連続相をこれに加える。これらの条件下で
二相の乳化が即時に起こる。二相(不連続相と連続相)の
間の比は約１〜１６である。撹拌の１５分後に、酢酸エ
チルを加える。この溶媒は乳濁液の二相と完全に混合す
るが、ポリマーまたはＮＧＦポリペプチドに対する溶媒
ではない。完全な抽出を得るのに必要な抽出溶媒の容量
は乳濁液の全容量の２.５倍であることが判明した。抽
出を容易にするために、撹拌速度を１０分間、１４００
〜１５００rpmに設定し、次いで５００rpmに下げる。こ
のようにして得られた懸濁液の撹拌を、１気圧に設定し
たフィルター・プレスを通してスクリュー・ポンプでポ
ンピングしながら続ける。この濾過が完了したなら、n
−ヘキサンのフィルターを通してポンピングする。この
溶媒は、製造物の"乾燥"およびミクロスフェアの表面に
存在することもあるいずれかの残留界面活性剤の溶解と
いう二重の作用を有する溶媒である。次いで、生成物を
適当な容器に入れ、４℃で保存する。平均粒子サイズは
１５μｍである。導入されたＮＧＦの量はミクロスフェ
ア１mgあたり１０ngである。

【００２５】実施例９ ヒアルロン酸の全カルボキシ基がエチルアルコールでエ
ステル化されているヒアルロン酸エステル(ＨＹＡＦＦ
−７、米国特許番号４,９６５,３５３に記載)を、５〜
１０％重量/容量の間で変化する濃度(通常は７％w/v)で
ジメチルスルホキシドなどの非プロトン性溶媒に溶解す
る。このポリマーが溶解したら、例えばＮＧＦなどのポ
リペプチドを、予め決定した濃度(例えば、ポリマー重
量の０.０１％)で溶液に加える。このようにして得られ
た溶液を以降は不連続相と称する。同時に、非イオン系
界面活性剤であるＡrlacel^Rを１％w/vの濃度で含む高粘
度の鉱油の混合物を適当な反応容器中で製造する。この
混合物を以降は連続相と称する。連続相を２５℃に維持
し、１０００rpmの速度で撹拌し、上記のように製造し
た不連続相をこれに加える。これらの条件下で二相の乳
化が即時に起こる。二相(不連続相と連続相)の間の比は
約１〜１６である。撹拌の１５分後に、酢酸エチルを加
える。この溶媒は乳濁液の二相と完全に混合するが、ポ
リマーまたはＮＧＦポリペプチドに対する溶媒ではな
い。完全な抽出を得るのに必要な抽出溶媒の容量は乳濁
液の全容量の２.５倍であることが判明した。抽出を容
易にするために、撹拌速度を１０分間、１４００〜１５
００rpmに設定し、次いで５００rpmに下げる。このよう
にして得られた懸濁液の撹拌を、１気圧に設定したフィ
ルター・プレスを通してスクリュー・ポンプでポンピン
グしながら続ける。この濾過が完了したなら、n−ヘキ
サンのフィルターを通してポンピングする。この溶媒
は、製造物の"乾燥"およびミクロスフェアの表面に存在
することもあるいずれかの残留界面活性剤の溶解という
二重の作用を有する溶媒である。次いで、生成物を適当
な容器に入れ、４℃で保存する。平均粒子サイズは３０
μmである。導入されたＮＧＦの量はミクロスフェア１m
gあたり１０ngである。

【００２６】実施例１０ ヒアルロン酸の全カルボキシ基がエチルアルコールでエ
ステル化されているヒアルロン酸エステル(ＨＹＡＦＦ
−７、米国特許番号４,９６５,３５３に記載)を、５〜
１０％重量/容量の間で変化する濃度(通常は７％w/v)で
ジメチルスルホキシドなどの非プロトン性溶媒に溶解す
る。得られた溶液を以降は不連続相と称する。同時に、
非イオン系界面活性剤であるＡrlacel^Rを１％w/vの濃度
で含む高粘度の鉱油の混合物を適当な反応容器中で製造
する。この混合物を以降は連続相と称する。連続相を２
５℃に維持し、１０００rpmの速度で撹拌し、上記のよ
うに製造した不連続相をこれに加える。これらの条件下
で二相の乳化が即時に起こる。二相(不連続相と連続相)
の間の比は約１〜１６である。撹拌の１５分後に、酢酸
エチルを加える。この溶媒は乳濁液の二相と完全に混合
するが、ポリマーに対する溶媒ではない。完全な抽出を
得るのに必要な抽出溶媒の容量は乳濁液の全容量の２.
５倍であることが判明した。抽出を容易にするために、
撹拌速度を１０分間、１４００〜１５００rpmに設定
し、次いで５００rpmに下げる。このようにして得られ
た懸濁液の撹拌を、１気圧に設定したフィルター・プレ
スを通してスクリュー・ポンプでポンピングしながら続
ける。この濾過が完了したなら、n−ヘキサンのフィル
ターを通してポンピングする。この溶媒は、製造物の"
乾燥"およびミクロスフェアの表面に存在することもあ
るいずれかの残留界面活性剤の溶解という二重の作用を
有する溶媒である。次いで、生成物を適当な容器に入
れ、４℃で保存する。このようにして製造されたミクロ
スフェアを、懸濁されたミクロスフェア重量の０.０１
％に等しいタンパク質力価が達成される濃度のＮＧＦを
含むリン酸緩衝溶液(０.０１Ｍ)(イオン強度＝０.１５
Ｍ)中に懸濁する。半自動システムによる撹拌の１５分
後に、懸濁液が完全に凍結するまで容器を液体窒素に浸
す。凍結したら、懸濁物を２４時間、凍結乾燥し、生成
物を４℃で保存する。ミクロスフェアの平均粒子サイズ
は３０μmである。導入されたＮＧＦの量はミクロスフ
ェア１mgあたり１０ngである。

【００２７】実施例１１ ヒアルロン酸の全カルボキシ基がベンジルアルコールで
エステル化されているヒアルロン酸エステル(ＨＹＡＦ
Ｆ−１１、米国特許番号４,９６５,３５３に記載)を、
５〜１０％重量/容量の間で変化する濃度(通常は７％w/
v)でジメチルスルホキシドなどの非プロトン性溶媒に溶
解する。このポリマーが溶解したら、例えばＣＮＴＦ
(線毛の神経栄養因子)などのポリペプチドを、予め決定
した濃度(例えば、ポリマー重量の０.０１％)で溶液に
加える。このようにして得られた混合物を以降は不連続
相と称する。同時に、非イオン系界面活性剤であるＡrl
acel^Rを１％w/vの濃度で含む高粘度の鉱油の混合物を適
当な反応容器中で製造する。この混合物を以降は連続相
と称する。連続相を２５℃に維持し、１０００rpmの速
度で撹拌し、上記のように製造した不連続相をこれに加
える。これらの条件下で二相の乳化が即時に起こる。二
相(不連続相と連続相)の間の比は約１〜１６である。撹
拌の１５分後に、酢酸エチルを加える。この溶媒は乳濁
液の二相と完全に混合するが、ポリマーまたはポリペプ
チドＣＮＴＦに対する溶媒ではない。完全な抽出を得る
のに必要な抽出溶媒の容量は乳濁液の全容量の２.５倍
であることが判明した。抽出を容易にするために、撹拌
速度を１０分間、１４００〜１５００rpmに設定し、次
いで５００rpmに下げる。このようにして得られた懸濁
液の撹拌を、１気圧に設定したフィルター・プレスを通
してスクリュー・ポンプでポンピングしながら続ける。
この濾過が完了したなら、n−ヘキサンのフィルターを
通してポンピングする。この溶媒は、製造物の"乾燥"お
よびミクロスフェアの表面に存在することもあるいずれ
かの残留界面活性剤の溶解という二重の作用を有する溶
媒である。次いで、生成物を適当な容器に入れ、４℃で
保存する。このような処理条件下で得られた平均粒子サ
イズは１０μmである。導入されたＣＮＴＦの量はミク
ロスフェア１mgあたり１０ngである。

【００２８】実施例１２ ヒアルロン酸の全カルボキシ基がベンジルアルコールで
エステル化されているヒアルロン酸エステル(ＨＹＡＦ
Ｆ−１１、米国特許番号４,９６５,３５３に記載)を、
５〜１０％重量/容量の間で変化する濃度(通常は７％w/
v)でジメチルスルホキシドなどの非プロトン性溶媒に溶
解する。得られた溶液を以降は不連続相と称する。同時
に、非イオン系界面活性剤であるＡrlacel^Rを１％w/vの
濃度で含む高粘度の鉱油の混合物を適当な反応容器中で
製造する。この混合物を以降は連続相と称する。連続相
を１０００rpmの速度で撹拌しながら２５℃に維持し、
上記のように製造した不連続相をこれに加える。これら
の条件下で二相の乳化が即時に起こる。二相(不連続相
と連続相)の間の比は約１〜１６である。撹拌の１５分
後に、酢酸エチルを加える。この溶媒は乳濁液の二相と
完全に混合するが、ポリマーに対する溶媒ではない。完
全な抽出を得るのに必要な抽出溶媒の容量は乳濁液の全
容量の２.５倍であることが判明した。抽出を容易にす
るために、撹拌速度を１０分間、１４００〜１５００rp
mに設定し、次いで５００rpmに下げる。このようにして
得られた懸濁液の撹拌を、１気圧に設定したフィルター
・プレスを通してスクリュー・ポンプでポンピングしな
がら続ける。この濾過が完了したなら、n−ヘキサンの
フィルターを通してポンピングする。この溶媒は、製造
物の"乾燥"およびミクロスフェアの表面に存在すること
もあるいずれかの残留界面活性剤の溶解という二重の作
用を有する溶媒である。次いで、生成物を適当な容器に
入れ、４℃で保存する。このようにして製造されたミク
ロスフェアを、懸濁されたミクロスフェア重量の０.０
１％に等しいタンパク質力価が達成される濃度のＣＮＴ
Ｆ(線毛神経栄養因子)を含むリン酸緩衝溶液(０.０１
Ｍ)(イオン強度＝０.１５Ｍ)中に懸濁する。半自動シス
テムによる撹拌の１５分後に、懸濁液が完全に凍結する
まで容器を液体窒素に浸す。凍結したら、懸濁物を２４
時間凍結乾燥し、生成物を４℃で保存する。平均粒子サ
イズは１０μmである。導入されたＣＮＴＦの量はミク
ロスフェア１mgあたり１０ngである。

【００２９】実施例１３ ヒアルロン酸の全カルボキシ基がエチルアルコールでエ
ステル化されているヒアルロン酸エステル(ＨＹＡＦＦ
−７、米国特許番号４,９６５,３５３に記載)を、５〜
１０％重量/容量の間で変化する濃度(通常は７％w/v)で
ジメチルスルホキシドなどの非プロトン性溶媒に溶解す
る。このポリマーが溶解したら、例えばＣＮＴＦ(線毛
神経栄養因子)などのポリペプチドを、予め決定した濃
度(例えば、ポリマー重量の０.０１％)で溶液に加え
る。このようにして得られた溶液を以降は不連続相と称
する。同時に、非イオン系界面活性剤であるＡrlacel^R
を１％w/vの濃度で含む高粘度の鉱油の混合物を適当な
反応容器中で製造する。この混合物を以降は連続相と称
する。連続相を２５℃に維持し、１０００rpmの速度で
撹拌し、上記のように製造した不連続相をこれに加え
る。これらの条件下で二相の乳化が即時に起こる。二相
(不連続相と連続相)の間の比は約１〜１６である。撹拌
の１５分後に、酢酸エチルを加える。この溶媒は乳濁液
の二相と完全に混合するが、ポリマーまたはポリペプチ
ドＣＮＴＦに対する溶媒ではない。完全な抽出を得るの
に必要な抽出溶媒の容量は乳濁液の全容量の２.５倍で
あることが判明した。抽出を容易にするために、撹拌速
度を１０分間、１４００〜１５００rpmに設定し、次い
で５００rpmに下げる。このようにして得られた懸濁液
の撹拌を、１気圧に設定したフィルター・プレスを通し
てスクリュー・ポンプでポンピングしながら続ける。こ
の濾過が完了したなら、n−ヘキサンのフィルターを通
してポンピングする。この溶媒は、製造物の"乾燥"およ
びミクロスフェアの表面に存在することもあるいずれか
の残留界面活性剤の溶解という二重の作用を有する溶媒
である。次いで、生成物を適当な容器に入れ、４℃で保
存する。ミクロスフェアの平均粒子サイズは３０μmで
ある。導入されたＣＮＴＦの量はミクロスフェア１mgあ
たり１０ngである。

【００３０】実施例１４ ヒアルロン酸の全カルボキシ基がエチルアルコールでエ
ステル化されているヒアルロン酸エステル(ＨＹＡＦＦ
−７、米国特許番号４,９６５,３５３に記載)を、５〜
１０％重量/容量の間で変化する濃度(通常は７％w/v)で
ジメチルスルホキシドなどの非プロトン性溶媒に溶解す
る。得られた溶液を以降は不連続相と称する。同時に、
非イオン系界面活性剤であるＡrlacel^Rを１％w/vの濃度
で含む高粘度の鉱油の混合物を適当な反応容器中で製造
する。この混合物を以降は連続相と称する。連続相を２
５℃に維持し、１０００rpmの速度で撹拌し、上記のよ
うに製造した不連続相をこれに加える。これらの条件下
で二相の乳化が即時に起こる。二相(不連続相と連続相)
の間の比は約１〜１６である。撹拌の１５分後に、酢酸
エチルを加える。この溶媒は乳濁液の二相と完全に混合
するが、ポリマーに対する溶媒ではない。完全な抽出を
得るのに必要な抽出溶媒の容量は乳濁液の全容量の２.
５倍であることが判明した。抽出を容易にするために、
撹拌速度を１０分間、１４００〜１５００rpmに設定
し、次いで５００rpmに下げる。このようにして得られ
た懸濁液の撹拌を、１気圧に設定したフィルター・プレ
スを通してスクリュー・ポンプでポンピングしながら続
ける。この濾過が完了したなら、n−ヘキサンのフィル
ターを通してポンピングする。この溶媒は、製造物の"
乾燥"およびミクロスフェアの表面に存在することもあ
るいずれかの残留界面活性剤の溶解という二重の作用を
有する溶媒である。次いで、生成物を適当な容器に入
れ、４℃で保存する。このようにして製造されたミクロ
スフェアを、懸濁されたミクロスフェアの重量の０.０
１％に等しいタンパク質力価が達成される濃度のＣＮＴ
Ｆ(線毛神経栄養因子)を含むリン酸緩衝溶液(０.０１
Ｍ)(イオン強度＝０.１５Ｍ)中に懸濁する。半自動シス
テムによる撹拌の１５分後に、懸濁液が完全に凍結する
まで容器を液体窒素に浸す。凍結したら、懸濁物を２４
時間、凍結乾燥し、生成物を４℃で保存する。平均粒子
サイズは３０μmである。導入されたＣＮＴＦの量はミ
クロスフェア１mgあたり１０ngである。

【００３１】実施例１５ ヒアルロン酸の全カルボキシ基がベンジルアルコールで
エステル化されているヒアルロン酸エステル(ＨＹＡＦ
Ｆ−７、米国特許番号４,９６５,３５３に記載)を、５
〜１０％重量/容量の間で変化する濃度(通常は７％w/v)
でジメチルスルホキシドなどの非プロトン性溶媒に溶解
する。このポリマーが溶解したら、予め決定した濃度
(例えば、ポリマー重量の０.０１％)のポリペプチド(例
えばＮＧＦなど)、さらに主要成分としてＧＭ１ ２１
％、ＧＤ１２ ４０％、ＧＤ１b １６％およびＧＴ１b
１９％を有するガングリオシド混合物(Ｃronassial^R)を
重量比１：１０００で溶液に加える。このようにして得
られた溶液を以降は不連続相と称する。同時に、非イオ
ン系界面活性剤であるＡrlacel^Rを１％w/vの濃度で含む
高粘度の鉱油の混合物を適当な反応容器中で製造する。
この混合物を以降は連続相と称する。連続相を２５℃に
維持し、１０００rpmの速度で撹拌し、上記のように製
造した不連続相をこれに加える。これらの条件下で二相
の乳化が即時に起こる。二相(不連続相と連続相)の間の
比は約１〜１６である。撹拌の１５分後に、酢酸エチル
を加える。この溶媒は乳濁液の二相と完全に混合する
が、ポリマーもしくはポリペプチドＮＧＦもしくはＧＡ
混合物(Ｃronassial)に対する溶媒ではない。完全な抽
出を得るのに必要な抽出溶媒の容量は乳濁液の全容量の
２.５倍であることが判明した。抽出を容易にするため
に、撹拌速度を１０分間、１４００〜１５００rpmに設
定し、次いで５００rpmに下げる。このようにして得ら
れた懸濁液の撹拌を、１気圧に設定したフィルター・プ
レスを通してスクリュー・ポンプでポンピングしながら
続ける。この濾過が完了したなら、n−ヘキサンのフィ
ルターを通してポンピングする。この溶媒は、製造物
の"乾燥"およびミクロスフェアの表面に存在することも
あるいずれかの残留界面活性剤の溶解という二重の作用
を有する溶媒である。次いで、生成物を適当な容器に入
れ、４℃で保存する。このような処理条件下で得られた
平均粒子サイズは１０μmである。導入されたＮＧＦお
よびＧＡの量はミクロスフェア１mgあたりそれぞれ１０
ngおよび１０μgである。

【００３２】実施例１６ ヒアルロン酸の全カルボキシ基がベンジルアルコールで
エステル化されているヒアルロン酸エステル(ＨＹＡＦ
Ｆ−１１、米国特許番号４,９６５,３５３に記載)を、
５〜１０％重量/容量の間で変化する濃度(通常は７％w/
v)でジメチルスルホキシドなどの非プロトン性溶媒に溶
解する。このポリマーが溶解したら、ガングリオシド混
合物(Ｃronassil^R)を、予め決定した濃度(例えば、ポリ
マー重量の２０％)で溶液に加える。この得られた溶液
を以降は不連続相と称する。同時に、非イオン系界面活
性剤であるＡrlacel^Rを１％w/vの濃度で含む高粘度の鉱
油の混合物を適当な反応容器中で製造する。この混合物
を以降は連続相と称する。連続相を１０００rpmの速度
で撹拌しながら２５℃に維持し、上記のように製造した
不連続相をこれに加える。これらの条件下で二相の乳化
が即時に起こる。二相(不連続相と連続相)の間の比は約
１〜１６である。撹拌の１５分後に、酢酸エチルを加え
る。この溶媒は乳濁液の二相と完全に混合するが、ポリ
マーまたはガングリオシド混合物に対する溶媒ではな
い。完全な抽出を得るのに必要な抽出溶媒の容量は乳濁
液の全容量の２.５倍であることが判明した。抽出を容
易にするために、撹拌速度を１０分間、１４００〜１５
００rpmに設定し、次いで５００rpmに下げる。このよう
にして得られた懸濁液の撹拌を、１気圧に設定したフィ
ルター・プレスを通してスクリュー・ポンプでポンピン
グしながら続ける。この濾過が完了したなら、n−ヘキ
サンのフィルターを通してポンピングする。この溶媒
は、製造物の"乾燥"およびミクロスフェアの表面に存在
することもあるいずれかの残留界面活性剤の溶解という
二重の作用を有する溶媒である。次いで、生成物を適当
な容器に入れ、４℃で保存する。このようにして製造さ
れたミクロスフェアを、懸濁されたミクロスフェア重量
の０.０２％に等しいタンパク質力価が達成され、１：
１０００の重量比(ＮＧＦ：ガングリオシド)が維持され
る濃度のＮＧＦを含むリン酸緩衝溶液(０.０１Ｍ)(イオ
ン強度＝０.１５Ｍ)中に懸濁する。半自動システムによ
る撹拌の１５分後に、懸濁液が完全に凍結するまで容器
を液体窒素に浸す。凍結したら、懸濁物を２４時間凍結
乾燥し、生成物を４℃で保存する。平均粒子サイズは１
０μmである。導入されたＮＧＦおよびＧＡの量はミク
ロスフェア１mgあたりそれぞれ２０ngおよび２０μgで
ある。

【００３３】実施例１７ ヒアルロン酸の全カルボキシ基がエチルアルコールでエ
ステル化されているヒアルロン酸エステル(ＨＹＡＦＦ
−７、米国特許番号４,９６５,３５３に記載)を、５〜
１０％重量/容量の間で変化する濃度(通常は７％w/v)で
ジメチルスルホキシドなどの非プロトン性溶媒に溶解す
る。このポリマーが溶解したら、予め決定した濃度(例
えば、ポリマー重量の０.０１％)のポリペプチド(例え
ばＮＧＦなど)、さらにガングリオシド混合物(Ｃronass
ial^R)を重量比１：１０００で溶液に加える。このよう
にして得られた溶液を以降は不連続相と称する。同時
に、非イオン系界面活性剤であるＡrlacel^Rを１％w/vの
濃度で含む高粘度の鉱油の混合物を適当な反応容器中で
製造する。この混合物を以降は連続相と称する。連続相
を２５℃に維持し、１０００rpmの速度で撹拌し、上記
のように製造した不連続相をこれに加える。これらの条
件下で二相の乳化が即時に起こる。二相(不連続相と連
続相)の間の比は約１〜１６である。撹拌の１５分後
に、酢酸エチルを加える。この溶媒は乳濁液の二相と完
全に混合するが、ポリマー、ポリペプチド(ＮＧＦ)もし
くはＧＡ混合物に対する溶媒ではない。完全な抽出を得
るのに必要な抽出溶媒の容量は乳濁液の全容量の２.５
倍であることが判明した。抽出を容易にするために、撹
拌速度を１０分間、１４００〜１５００rpmに設定し、
次いで５００rpmに下げる。このようにして得られた懸
濁液の撹拌を、１気圧に設定したフィルター・プレスを
通してスクリュー・ポンプでポンピングしながら続け
る。この濾過が完了したなら、n−ヘキサンのフィルタ
ーを通してポンピングする。この溶媒は、製造物の"乾
燥"およびミクロスフェアの表面に存在することもある
いずれかの残留界面活性剤の溶解という二重の作用を有
する溶媒である。次いで、生成物を適当な容器に入れ、
４℃で保存する。ミクロスフェアの大きさおよび平均粒
子サイズは３０μmである。導入されたＮＧＦおよびＧ
Ａの量はミクロスフェア１mgあたりそれぞれ１０ngおよ
び１０μgである。

【００３４】実施例１８ ヒアルロン酸の全カルボキシ基がエチルアルコールでエ
ステル化されているヒアルロン酸エステル(ＨＹＡＦＦ
−７、米国特許番号４,９６５,３５３に記載)を、５〜
１０％重量/容量の間で変化する濃度(通常は７％w/v)で
ジメチルスルホキシドなどの非プロトン性溶媒に溶解す
る。このポリマーが溶解したら、ガングリオシド混合物
(Ｃronassial^R)を、予め決定した濃度(例えば、ポリマ
ー重量の２０％)で溶液に加える。このようにして得ら
れた溶液を以降は不連続相と称する。同時に、非イオン
系界面活性剤であるＡrlacel^Rを１％w/vの濃度で含む高
粘度の鉱油の混合物を適当な反応容器中で製造する。こ
の混合物を以降は連続相と称する。連続相を２５℃に維
持し、１０００rpmの速度で撹拌し、上記のように製造
した不連続相をこれに加える。これらの条件下で二相の
乳化が即時に起こる。二相(不連続相と連続相)の間の比
は約１〜１６である。撹拌の１５分後に、酢酸エチルを
加える。この溶媒は乳濁液の二相と完全に混合するが、
ポリマーまたはガングリオシド混合物に対する溶媒では
ない。完全な抽出を得るのに必要な抽出溶媒の容量は乳
濁液の全容量の２.５倍であることが判明した。抽出を
容易にするために、撹拌速度を１０分間、１４００〜１
５００rpmに設定し、次いで５００rpmに下げる。このよ
うにして得られた懸濁液の撹拌を、１気圧に設定したフ
ィルター・プレスを通してスクリュー・ポンプでポンピ
ングしながら続ける。この濾過が完了したなら、n−ヘ
キサンのフィルターを通してポンピングする。この溶媒
は、製造物の"乾燥"およびミクロスフェアの表面に存在
することもあるいずれかの残留界面活性剤の溶解という
二重の作用を有する溶媒である。次いで、生成物を適当
な容器に入れ、４℃で保存する。このようにして製造さ
れたミクロスフェアを、懸濁されたミクロスフェア重量
の０.０２％に等しいタンパク質力価が達成され、１：
１０００の重量比(ＮＧＦ：ガングリオシド)が維持され
る濃度のＮＧＦを含むリン酸緩衝溶液(０.０１Ｍ)(イオ
ン強度＝０.１５Ｍ)中に懸濁する。半自動システムによ
る撹拌の１５分後に、懸濁液が完全に凍結するまで容器
を液体窒素に浸す。凍結したら、懸濁物を２４時間凍結
乾燥し、生成物を４℃で保存する。平均粒子サイズは３
０μmである。導入されたＮＧＦおよびＧＡの量はミク
ロスフェア１mgあたりそれぞれ２０ngおよび２０μgで
ある。

【００３５】実施例１９ ヒアルロン酸の全カルボキシ基がドデシルアルコールで
エステル化されているヒアルロン酸エステル(ＨＹＡＦ
Ｆ−７３、米国特許番号４,９６５,３５３に記載)を、
５〜１０％重量/容量の間で変化する濃度(通常は７％w/
v)でジメチルスルホキシドなどの非プロトン性溶媒に溶
解する。このポリマーが溶解したら、予め決定した濃度
(例えば、ポリマー重量の０.０１％)のポリペプチド(例
えばＮＧＦなど)、さらにガングリオシド混合物(Ｃrona
ssial^R)を重量比１：１０００(ＮＧＦ：Ｃronassial^R)
で溶液に加える。このようにして得られた溶液を以降は
不連続相と称する。同時に、非イオン系界面活性剤であ
るＡrlacel^Rを１％w/vの濃度で含む高粘度の鉱油の混合
物を適当な反応容器中で製造する。この混合物を以降は
連続相と称する。連続相を２５℃に維持し、１０００rp
mの速度で撹拌し、上記のように製造した不連続相をこ
れに加える。これらの条件下で二相の乳化が即時に起こ
る。二相(不連続相と連続相)の間の比は約１〜１６であ
る。撹拌の１５分後に、酢酸エチルを加える。この溶媒
は乳濁液の二相と完全に混合するが、ポリマーもしくは
ポリペプチド(ＮＧＦ)もしくはＧＡ混合物に対する溶媒
ではない。完全な抽出を得るのに必要な抽出溶媒の容量
は乳濁液の全容量の２.５倍であることが判明した。抽
出を容易にするために、撹拌速度を１０分間、１４００
〜１５００rpmに設定し、次いで５００rpmに下げる。こ
のようにして得られた懸濁液の撹拌を、１気圧に設定し
たフィルター・プレスを通してスクリュー・ポンプでポ
ンピングしながら続ける。この濾過が完了したなら、n
−ヘキサンのフィルターを通してポンピングする。この
溶媒は、製造物の"乾燥"およびミクロスフェアの表面に
存在することもあるいずれかの残留界面活性剤の溶解と
いう二重の作用を有する溶媒である。次いで、生成物を
適当な容器に入れ、４℃で保存する。このような条件下
で得られる平均粒子サイズは２０μmである。導入され
たＮＧＦおよびＧＡの量はミクロスフェア１mgあたりそ
れぞれ１０ngおよび１０μgである。

【００３６】実施例２０ ヒアルロン酸の全カルボキシ基がベンジルアルコールで
エステル化されているヒアルロン酸エステル(ＨＹＡＦ
Ｆ−１１、米国特許番号４,９６５,３５３に記載)を、
５〜１０％重量/容量の間で変化する濃度(通常は７％w/
v)でジメチルスルホキシドなどの非プロトン性溶媒に溶
解する。このポリマーが溶解したら、予め決定した濃度
(例えば、ポリマー重量の０.０１％)のポリペプチド(例
えばＮＧＦなど)、さらにモノシアロガングリオシドＧ
Ｍ１を重量比１：１０００(ＮＧＦ：ＧＭ１)で溶液に加
える。このようにして得られた溶液を以降は不連続相と
称する。同時に、非イオン系界面活性剤であるＡrlacel
^Rを１％w/vの濃度で含む高粘度の鉱油の混合物を適当な
反応容器中で製造する。この混合物を以降は連続相と称
する。連続相を２５℃に維持し、１０００rpmの速度で
撹拌し、上記のように製造した不連続相をこれに加え
る。これらの条件下で二相の乳化が即時に起こる。二相
(不連続相と連続相)の間の比は約１〜１６である。撹拌
の１５分後に、酢酸エチルを加える。この溶媒は乳濁液
の二相と完全に混合するが、ポリマーもしくはポリペプ
チド(ＮＧＦ)もしくはモノシアロガングリオシドＧＭ１
に対する溶媒ではない。完全な抽出を得るのに必要な抽
出溶媒の容量は乳濁液の全容量の２.５倍であることが
判明した。抽出を容易にするために、撹拌速度を１０分
間、１４００〜１５００rpmに設定し、次いで５００rpm
に下げる。このようにして得られた懸濁液の撹拌を、１
気圧に設定したフィルター・プレスを通してスクリュー
・ポンプでポンピングしながら続ける。この濾過が完了
したなら、n−ヘキサンのフィルターを通してポンピン
グする。この溶媒は、製造物の"乾燥"およびミクロスフ
ェアの表面に存在することもあるいずれかの残留界面活
性剤の溶解という二重の作用を有する溶媒である。次い
で、生成物を適当な容器に入れ、４℃で保存する。この
ような処理条件下で得られた平均粒子サイズは１０μm
である。導入されたＮＧＦおよびモノシアロガングリオ
シドＧＭ１の量はミクロスフェア１mgあたりそれぞれ１
０ngおよび１０μgである。

【００３７】実施例２１ ヒアルロン酸の全カルボキシ基がエチルアルコールでエ
ステル化されているヒアルロン酸エステル(ＨＹＡＦＦ
−７、米国特許番号４,９６５,３５３に記載)を、５〜
１０％重量/容量の間で変化する濃度(通常は７％w/v)で
ジメチルスルホキシドなどの非プロトン性溶媒に溶解す
る。このポリマーが溶解したら、予め決定した濃度(例
えば、ポリマー重量の０.０１％)のポリペプチド(例え
ばＮＧＦなど)、さらにモノシアロガングリオシドＧＭ
１を重量比１：１０００(ＮＧＦ：ＧＭ１)で溶液に加え
る。このようにして得られた溶液を以降は不連続相と称
する。同時に、非イオン系界面活性剤であるＡrlacel^R
を１％w/vの濃度で含む高粘度の鉱油の混合物を適当な
反応容器中で製造する。この混合物を以降は連続相と称
する。連続相を２５℃に維持し、１０００rpmの速度で
撹拌し、上記のように製造した不連続相をこれに加え
る。これらの条件下で二相の乳化が即時に起こる。二相
(不連続相と連続相)の間の比は約１〜１６である。撹拌
の１５分後に、酢酸エチルを加える。この溶媒は乳濁液
の二相と完全に混合するが、ポリマー、ポリペプチド
(ＮＧＦ)もしくはモノシアロガングリオシドＧＭ１に対
する溶媒ではない。完全な抽出を得るのに必要な抽出溶
媒の容量は乳濁液の全容量の２.５倍であることが判明
した。抽出を容易にするために、撹拌速度を１０分間、
１４００〜１５００rpmに設定し、次いで５００rpmに下
げる。このようにして得られた懸濁液の撹拌を、１気圧
に設定したフィルター・プレスを通してスクリュー・ポ
ンプでポンピングしながら続ける。この濾過が完了した
なら、n−ヘキサンのフィルターを通してポンピングす
る。この溶媒は、製造物の"乾燥"およびミクロスフェア
の表面に存在することもあるいずれかの残留界面活性剤
の溶解という二重の作用を有する溶媒である。次いで、
生成物を適当な容器に入れ、４℃で保存する。平均粒子
サイズは３０μmである。導入されたＮＧＦおよびモノ
シアロガングリオシドＧＭ１の量はミクロスフェア１mg
あたりそれぞれ１０ngおよび１０μgである。

【００３８】実施例２２ ヒアルロン酸の全カルボキシ基がベンジルアルコールで
エステル化されているヒアルロン酸エステル(ＨＹＡＦ
Ｆ−１１、米国特許番号４,９６５,３５３に記載)を、
５〜１０％重量/容量の間で変化する濃度(通常は７％w/
v)でジメチルスルホキシドなどの非プロトン性溶媒に溶
解する。このポリマーが溶解したら、予め決定した濃度
(例えば、ポリマー重量の０.０１％)のポリペプチド(例
えばＣＮＴＦなど)、さらにガングリオシド混合物(Ｃro
nassial^R)を１：１０００(ＣＮＴＦ：ガングリオシド)
の比で溶液に加える。このようにして得られた溶液を以
降は不連続相と称する。同時に、非イオン系界面活性剤
であるＡrlacel^Rを１％w/vの濃度で含む高粘度の鉱油の
混合物を適当な反応容器中で製造する。この混合物を以
降は連続相と称する。連続相を２５℃に維持し、１００
０rpmの速度で撹拌し、上記のように製造した不連続相
をこれに加える。これらの条件下で二相の乳化が即時に
起こる。二相(不連続相と連続相)の間の比は約１〜１６
である。撹拌の１５分後に、酢酸エチルを加える。この
溶媒は乳濁液の二相と完全に混合するが、ポリマーもし
くはポリペプチドＣＮＴＦに対する溶媒ではない。完全
な抽出を得るのに必要な抽出溶媒の容量は乳濁液の全容
量の２.５倍であることが判明した。抽出を容易にする
ために、撹拌速度を１０分間、１４００〜１５００rpm
に設定し、次いで５００rpmに下げる。このようにして
得られた懸濁液の撹拌を、１気圧に設定したフィルター
・プレスを通してスクリュー・ポンプでポンピングしな
がら続ける。この濾過が完了したなら、n−ヘキサンの
フィルターを通してポンピングする。この溶媒は、製造
物の"乾燥"およびミクロスフェアの表面に存在すること
もあるいずれかの残留界面活性剤の溶解という二重の作
用を有する溶媒である。次いで、生成物を適当な容器に
入れ、４℃で保存する。このような処理条件下で得られ
た平均粒子サイズは１０μmである。導入されたＣＮＴ
ＦおよびＧＡの量はミクロスフェア１mgあたりそれぞれ
１０ngおよび１０μgである。

【００３９】実施例２３ ヒアルロン酸の全カルボキシ基がベンジルアルコールで
エステル化されているヒアルロン酸エステル(ＨＹＡＦ
Ｆ−１１、米国特許番号４,９６５,３５３に記載)を、
５〜１０％重量/容量の間で変化する濃度(通常は７％w/
v)でジメチルスルホキシドなどの非プロトン性溶媒に溶
解する。このポリマーが溶解したら、ガングリオシド混
合物を予め決定した濃度(例えば、ポリマー重量の２０
％)で溶液に加える。このようにして得られた溶液を以
降は不連続相と称する。同時に、非イオン系界面活性剤
であるＡrlacel^Rを１％w/vの濃度で含む高粘度の鉱油の
混合物を適当な反応容器中で製造する。この混合物を以
降は連続相と称する。連続相を２５℃に維持し、１００
０rpmの速度で撹拌し、上記のように製造した不連続相
をこれに加える。これらの条件下で二相の乳化が即時に
起こる。二相(不連続相と連続相)の間の比は約１〜１６
である。撹拌の１５分後に、酢酸エチルを加える。この
溶媒は乳濁液の二相と完全に混合するが、ポリマーもし
くはガングリオシド混合物に対する溶媒ではない。完全
な抽出を得るのに必要な抽出溶媒の容量は乳濁液の全容
量の２.５倍であることが判明した。抽出を容易にする
ために、撹拌速度を１０分間、１４００〜１５００rpm
に設定し、次いで５００rpmに下げる。このようにして
得られた懸濁液の撹拌を、１気圧に設定したフィルター
・プレスを通してスクリュー・ポンプでポンピングしな
がら続ける。この濾過が完了したなら、n−ヘキサンの
フィルターを通してポンピングする。この溶媒は、製造
物の"乾燥"およびミクロスフェアの表面に存在すること
もあるいずれかの残留界面活性剤の溶解という二重の作
用を有する溶媒である。次いで、生成物を適当な容器に
入れ、４℃で保存する。このようにして製造されたミク
ロスフェアを、懸濁されたミクロスフェア重量の０.０
２％に等しいタンパク質力価が達成され、１：１０００
(ＣＮＴＦ：ガングリオシド)の重量比が維持される濃度
のＣＮＴＦを含むリン酸緩衝溶液(０.０１Ｍ)(イオン強
度＝０.１５Ｍ)中に懸濁する。半自動システムによる撹
拌の１５分後に、懸濁液が完全に凍結するまで容器を液
体窒素に浸す。凍結したら、懸濁物を２４時間、凍結乾
燥し、生成物を４℃で保存する。平均粒子サイズは１０
μmである。導入されたＣＮＴＦおよびＧＡの量はミク
ロスフェア１mgあたりそれぞれ２０ngおよび２０μgで
ある。

【００４０】実施例２４ ヒアルロン酸の全カルボキシ基がエチルアルコールでエ
ステル化されているヒアルロン酸エステル(ＨＹＡＦＦ
−７、米国特許番号４,９６５,３５３に記載)を、５〜
１０％重量/容量の間で変化する濃度(通常は７％w/v)で
ジメチルスルホキシドなどの非プロトン性溶媒に溶解す
る。このポリマーが溶解したら、予め決定した濃度(例
えば、ポリマー重量の０.０１％)のポリペプチド(例え
ばＣＮＴＦなど)、さらにガングリオシド混合物を重量
比１：１０００(ＣＮＴＦ：Ｃronassial^R)で溶液に加え
る。このようにして得られた溶液を以降は不連続相と称
する。同時に、非イオン系界面活性剤であるＡrlacel^R
を１％w/vの濃度で含む高粘度の鉱油の混合物を適当な
反応容器中で製造する。この混合物を以降は連続相と称
する。連続相を２５℃に維持し、１０００rpmの速度で
撹拌し、上記のように製造した不連続相をこれに加え
る。これらの条件下で二相の乳化が即時に起こる。二相
(不連続相と連続相)の間の比は約１〜１６である。撹拌
の１５分後に、酢酸エチルを加える。この溶媒は乳濁液
の二相と完全に混合するが、ポリマー、ポリペプチド
(ＣＮＴＦ)もしくはＧＡ混合物(Ｃronassial^R)に対する
溶媒ではない。完全な抽出を得るのに必要な抽出溶媒の
容量は乳濁液の全容量の２.５倍であることが判明し
た。抽出を容易にするために、撹拌速度を１０分間、１
４００〜１５００rpmに設定し、次いで５００rpmに下げ
る。このようにして得られた懸濁液の撹拌を、１気圧に
設定したフィルター・プレスを通してスクリュー・ポン
プでポンピングしながら続ける。この濾過が完了したな
ら、n−ヘキサンのフィルターを通してポンピングす
る。この溶媒は、製造物の"乾燥"およびミクロスフェア
の表面に存在することもあるいずれかの残留界面活性剤
の溶解という二重の作用を有する溶媒である。次いで、
生成物を適当な容器に入れ、４℃で保存する。平均粒子
サイズは３０μmである。導入されたＣＮＴＦおよびＧ
Ａの量はミクロスフェア１mgあたりそれぞれ１０ngおよ
び１０μgである。

【００４１】実施例２５ ヒアルロン酸の全カルボキシ基がエチルアルコールでエ
ステル化されているヒアルロン酸エステル(ＨＹＡＦＦ
−７、米国特許番号４,９６５,３５３に記載)を、５〜
１０％重量/容量の間で変化する濃度(通常は７％w/v)で
ジメチルスルホキシドなどの非プロトン性溶媒に溶解す
る。このポリマーが溶解したら、ガングリオシド混合物
(Ｃronassial^R)を予め決定した濃度(例えば、ポリマー
重量の１０％)で溶液に加える。得られた溶液を以降は
不連続相と称する。同時に、非イオン系界面活性剤であ
るＡrlacel^Rを１％w/vの濃度で含む高粘度の鉱油の混合
物を適当な反応容器中で製造する。この混合物を以降は
連続相と称する。連続相を２５℃に維持し、１０００rp
mの速度で撹拌し、上記のように製造した不連続相をこ
れに加える。これらの条件下で二相の乳化が即時に起こ
る。二相(不連続相と連続相)の間の比は約１〜１６であ
る。撹拌の１５分後に、酢酸エチルを加える。この溶媒
は乳濁液の二相と完全に混合するが、ポリマーもしくは
ガングリオシド混合物に対する溶媒ではない。完全な抽
出を得るのに必要な抽出溶媒の容量は乳濁液の全容量の
２.５倍であることが判明した。抽出を容易にするため
に、撹拌速度を１０分間、１４００〜１５００rpmに設
定し、次いで５００rpmに下げる。このようにして得ら
れた懸濁液の撹拌を、１気圧に設定したフィルター・プ
レスを通してスクリュー・ポンプでポンピングしながら
続ける。この濾過が完了したなら、n−ヘキサンのフィ
ルターに通す。この溶媒は、製造物の"乾燥"およびミク
ロスフェアの表面に存在することもあるいずれかの残留
界面活性剤の溶解という二重の作用を有する溶媒であ
る。次いで、生成物を適当な容器に入れ、４℃で保存す
る。このようにして製造されたミクロスフェアを、懸濁
されたミクロスフェア重量の０.０１％に等しいタンパ
ク質力価が達成され、１：１０００(ＣＮＴＦ：ガング
リオシド)の重量比が維持される濃度のＣＮＴＦを含む
リン酸緩衝溶液(０.０１Ｍ)(イオン強度＝０.１５Ｍ)中
に懸濁する。半自動システムによる撹拌の１５分後に、
懸濁液が完全に凍結するまで容器を液体窒素に浸す。凍
結したら、懸濁物を２４時間、凍結乾燥し、生成物を４
℃で保存する。平均粒子サイズは３０μmである。導入
されたＣＮＴＦおよびＧＡの量はミクロスフェア１mgあ
たりそれぞれ１０ngおよび１０μgである。

【００４２】実施例２６ ヒアルロン酸の全カルボキシ基がベンジルアルコールで
エステル化されているヒアルロン酸エステル(ＨＹＡＦ
Ｆ−１１、米国特許番号４,９６５,３５３に記載)を、
５〜１０％重量/容量の間で変化する濃度(通常は７％w/
v)でジメチルスルホキシドなどの非プロトン性溶媒に溶
解する。このポリマーが溶解したら、予め決定した濃度
(例えば、ポリマー重量の０.０１％)のポリペプチド(例
えばＣＮＴＦなど)、およびモノシアロガングリオシド
ＧＭ１(Ｓygen)を重量比１：１０００(ＣＮＴＦ：Ｓyge
n)で溶液に加える。得られた溶液を以降は不連続相と称
する。同時に、非イオン系界面活性剤であるＡrlacel^R
を１％w/vの濃度で含む高粘度の鉱油の混合物を適当な
反応容器中で製造する。この混合物を以降は連続相と称
する。連続相を２５℃に維持し、１０００rpmの速度で
撹拌し、上記のように製造した不連続相をこれに加え
る。これらの条件下で二相の乳化が即時に起こる。二相
(不連続相と連続相)の間の比は約１〜１６である。撹拌
の１５分後に、酢酸エチルを加える。この溶媒は乳濁液
の二相と完全に混合するが、ポリマー、ポリペプチドＣ
ＮＴＦもしくはモノシアロガングリオシドＧＭ１(Ｓyge
n)に対する溶媒ではない。完全な抽出を得るのに必要な
抽出溶媒の容量は乳濁液の全容量の２.５倍であること
が判明した。抽出を容易にするために、撹拌速度を１０
分間、１４００〜１５００rpmに設定し、次いで５００r
pmに下げる。このようにして得られた懸濁液の撹拌を、
１気圧に設定したフィルター・プレスを通してスクリュ
ー・ポンプでポンピングしながら続ける。この濾過が完
了したなら、n−ヘキサンのフィルターを通してポンピ
ングする。この溶媒は、製造物の"乾燥"およびミクロス
フェアの表面に存在することもあるいずれかの残留界面
活性剤の溶解という二重の作用を有する溶媒である。次
いで、生成物を適当な容器に入れ、４℃で保存する。こ
れらの処理条件下で得られた平均粒子サイズは１０μm
である。導入されたＣＮＴＦおよびＧＭ１の量はミクロ
スフェア１mgあたりそれぞれ１０ngおよび１０μgであ
る。

【００４３】実施例２７ ヒアルロン酸の全カルボキシ基がベンジルアルコールで
エステル化されているヒアルロン酸エステル(ＨＹＡＦ
Ｆ−１１、米国特許番号４,９６５,３５３に記載)を、
５〜１０％重量/容量の間で変化する濃度(通常は７％w/
v)でジメチルスルホキシドなどの非プロトン性溶媒に溶
解する。このポリマーが溶解したら、予め決定した濃度
(例えば、ポリマー重量の０.０１％)のポリペプチド(例
えばＣＮＴＦなど)、およびガングリオシド混合物の内
部エステル(ＡＧＦ１)を１：１０００(ＣＮＴＦ：ＡＧ
Ｆ１)で溶液に加える。得られた溶液を以降は不連続相
と称する。同時に、非イオン系界面活性剤であるＡrlac
el^Rを１％w/vの濃度で含む高粘度の鉱油の混合物を適当
な反応容器中で製造する。この混合物を以降は連続相と
称する。連続相を２５℃に維持し、１０００rpmの速度
で撹拌し、上記のように製造した不連続相をこれに加え
る。これらの条件下で二相の乳化が即時に起こる。二相
(不連続相と連続相)の間の比は約１〜１６である。撹拌
の１５分後に、酢酸エチルを加える。この溶媒は乳濁液
の二相と完全に混合するが、ポリマー、ポリペプチドＣ
ＮＴＦもしくはガングリオシド混合物の内部エステル
(ＡＧＦ１)に対する溶媒ではない。完全な抽出を得るの
に必要な抽出溶媒の容量は乳濁液の全容量の２.５倍で
あることが判明した。抽出を容易にするために、撹拌速
度を１０分間、１４００〜１５００rpmに設定し、次い
で５００rpmに下げる。このようにして得られた懸濁液
の撹拌を、１気圧に設定したフィルター・プレスを通し
てスクリュー・ポンプでポンピングしながら続ける。こ
の濾過が完了したなら、n−ヘキサンのフィルターを通
してポンピングする。この溶媒は、製造物の"乾燥"およ
びミクロスフェアの表面に存在することもあるいずれか
の残留界面活性剤の溶解という二重の作用を有する溶媒
である。次いで、生成物を適当な容器に入れ、４℃で保
存する。これらの処理条件下で得られた平均粒子サイズ
は１０μmである。導入されたＣＮＴＦおよびＡＧＦ１
の量はミクロスフェア１mgあたりそれぞれ１０ngおよび
１０μgである。

【００４４】実施例２８ ヒアルロン酸の全カルボキシ基がベンジルアルコールで
エステル化されているヒアルロン酸エステル(ＨＹＡＦ
Ｆ−１１、米国特許番号４,９６５,３５３に記載)を、
５〜１０％重量/容量の間で変化する濃度(通常は７％w/
v)でジメチルスルホキシドなどの非プロトン性溶媒に溶
解する。このポリマーが溶解したら、予め決定した濃度
(例えば、ポリマー重量の０.０１％)のポリペプチド(例
えばＣＮＴＦなど)、およびモノシアロガングリオシド
ＧＭ１の内部エステル(ＡＧＦ２)を１：１０００(ＣＮ
ＴＦ：ＡＧＦ２)で溶液に加える。得られた溶液を以降
は不連続相と称する。同時に、非イオン系界面活性剤で
あるＡrlacel^Rを１％w/vの濃度で含む高粘度の鉱油の混
合物を適当な反応容器中で製造する。この混合物を以降
は連続相と称する。連続相を２５℃に維持し、１０００
rpmの速度で撹拌し、上記のように製造した不連続相を
これに加える。これらの条件下で二相の乳化が即時に起
こる。二相(不連続相と連続相)の間の比は約１〜１６で
ある。撹拌の１５分後に、酢酸エチルを加える。この溶
媒は乳濁液の二相と完全に混合するが、ポリマー、ポリ
ペプチドＣＮＴＦもしくはモノシアロガングリオシドＧ
Ｍ１の内部エステル(ＡＧＦ２)に対する溶媒ではない。
完全な抽出を得るのに必要な抽出溶媒の容量は乳濁液の
全容量の２.５倍であることが判明した。抽出を容易に
するために、撹拌速度を１０分間、１４００〜１５００
rpmに設定し、次いで５００rpmに下げる。このようにし
て得られた懸濁液の撹拌を、１気圧に設定したフィルタ
ー・プレスを通してスクリュー・ポンプでポンピングし
ながら続ける。この濾過が完了したなら、n−ヘキサン
のフィルターを通してポンピングする。この溶媒は、製
造物の"乾燥"およびミクロスフェアの表面に存在するこ
ともあるいずれかの残留界面活性剤の溶解という二重の
作用を有する溶媒である。次いで、生成物を適当な容器
に入れ、４℃で保存する。これらの処理条件下で得られ
た平均粒子サイズは１０μmである。導入されたＣＮＴ
ＦおよびＡＧＦ２の量はミクロスフェア１mgあたりそれ
ぞれ１０ngおよび１０μgである。

【００４５】実施例２９ ヒアルロン酸の全カルボキシ基がベンジルアルコールで
エステル化されているヒアルロン酸エステル(ＨＹＡＦ
Ｆ−１１、米国特許番号４,９６５,３５３に記載)を、
５〜１０％重量/容量の間で変化する濃度(通常は８％w/
v)でジメチルスルホキシドなどの非プロトン性溶媒に溶
解する。このポリマーが溶解したら、ＧＭ１の溶液を、
予め決定した濃度(例えば、ポリマー重量の２０％)で溶
液に加える。得られた溶液を以降は不連続相と称する。
同時に、非イオン系界面活性剤であるＡrlacel^Rを１％w
/vの濃度で含む高粘度の鉱油の混合物を適当な反応容器
中で製造する。この混合物を以降は連続相と称する。連
続相を２５℃に維持し、７００rpmの速度で撹拌し、上
記のように製造した不連続相をこれに加える。これらの
条件下で二相の乳化が即時に起こる。二相(不連続相と
連続相)の間の比は約１〜１６である。撹拌の１５分後
に、酢酸エチルを加える。この溶媒は乳濁液の二相と完
全に混合するが、ポリマーに対する溶媒ではない。完全
な抽出を得るのに必要な抽出溶媒の容量は乳濁液の全容
量の２.５倍であることが判明した。抽出を容易にする
ために、撹拌速度を１０分間、１４００〜１５００rpm
に設定し、次いで５００rpmに下げる。このようにして
得られた懸濁液の撹拌を、１気圧に設定したフィルター
・プレスを通してスクリュー・ポンプでポンピングしな
がら続ける。この濾過が完了したなら、n−ヘキサンの
フィルターを通してポンピングする。この溶媒は、製造
物の"乾燥"およびミクロスフェアの表面に存在すること
もあるいずれかの残留界面活性剤の溶解という二重の作
用を有する溶媒である。次いで、生成物を適当な容器に
入れ、４℃で保存する。これらの処理条件下で得られた
平均粒子サイズは４０μmである。導入されたＧＭ₁の量
はミクロスフェア１mgあたり１８０μgである。

【００４６】実施例３０ ヒアルロン酸の全カルボキシ基がベンジルアルコールで
エステル化されているヒアルロン酸エステル(ＨＹＡＦ
Ｆ−１１、米国特許番号４,９６５,３５３に記載)を、
５〜１０％重量/容量の間で変化する濃度(通常は８％w/
v)でジメチルスルホキシドなどの非プロトン性溶媒に溶
解する。このポリマーが溶解したら、ＧＭ１の溶液を、
予め決定した濃度(例えば、ポリマー重量の２０％)で溶
液に加える。得られた溶液を以降は不連続相と称する。
同時に、非イオン系界面活性剤であるＡrlacel^Rを１％w
/vの濃度で含む高粘度の鉱油の混合物を適当な反応容器
中で製造する。この混合物を以降は連続相と称する。連
続相を２５℃に維持し、１０００rpmの速度で撹拌し、
上記のように製造した不連続相をこれに加える。これら
の条件下で二相の乳化が即時に起こる。二相(不連続相
と連続相)の間の比は約１〜１６である。撹拌の１５分
後に、酢酸エチルを加える。この溶媒は乳濁液の二相と
完全に混合するが、ポリマーに対する溶媒ではない。完
全な抽出を得るのに必要な抽出溶媒の容量は乳濁液の全
容量の２.５倍であることが判明した。抽出を容易にす
るために、撹拌速度を１０分間、１４００〜１５００rp
mに設定し、次いで５００rpmに下げる。このようにして
得られた懸濁液の撹拌を、１気圧に設定したフィルター
・プレスを通してスクリュー・ポンプでポンピングしな
がら続ける。この濾過が完了したなら、n−ヘキサンの
フィルターを通してポンピングする。この溶媒は、製造
物の"乾燥"およびミクロスフェアの表面に存在すること
もあるいずれかの残留界面活性剤の溶解という二重の作
用を有する溶媒である。次いで、生成物を適当な容器に
入れ、４℃で保存する。これらの処理条件下で得られた
平均粒子サイズは１０μmである。導入されたＧＭ₁の量
はミクロスフェア１mgあたり１８０μgである。

【００４７】実施例３１ ヒアルロン酸の全カルボキシ基がベンジルアルコールで
エステル化されているヒアルロン酸エステル(ＨＹＡＦ
Ｆ−１１、米国特許番号４,９６５,３５３に記載)を、
５〜１０％重量/容量の間で変化する濃度(通常は７％w/
v)でジメチルスルホキシドなどの非プロトン性溶媒に溶
解する。得られた溶液を以降は不連続相と称する。同時
に、非イオン系界面活性剤であるＡrlacel^Rを１％w/vの
濃度で含む高粘度の鉱油の混合物を適当な反応容器中で
製造する。この混合物を以降は連続相と称する。連続相
を２５℃に維持し、１０００rpmの速度で撹拌し、上記
のように製造した不連続相をこれに加える。これらの条
件下で二相の乳化が即時に起こる。二相(不連続相と連
続相)の間の比は約１〜１６である。撹拌の１５分後
に、酢酸エチルを加える。この溶媒は乳濁液の二相と完
全に混合するが、ポリマーに対する溶媒ではない。完全
な抽出を得るのに必要な抽出溶媒の容量は乳濁液の全容
量の２.５倍であることが判明した。抽出を容易にする
ために、撹拌速度を１０分間、１４００〜１５００rpm
に設定し、次いで５００rpmに下げる。このようにして
得られた懸濁液の撹拌を、１気圧に設定したフィルター
・プレスを通してスクリュー・ポンプでポンピングしな
がら続ける。この濾過が完了したなら、n−ヘキサンの
フィルターを通してポンピングする。この溶媒は、製造
物の"乾燥"およびミクロスフェアの表面に存在すること
もあるいずれかの残留界面活性剤の溶解という二重の作
用を有する溶媒である。次いで、生成物を適当な容器に
入れ、４℃で保存する。このようにして製造されたミク
ロスフェアを、懸濁されたミクロスフェア１mgに対して
３μgのタンパク質力価が達成される濃度の免疫グロブ
リンを含むリン酸緩衝溶液(０.０１Ｍ)中に懸濁する。
半自動システムによる撹拌の１５分後に、懸濁液が完全
に凍結するまで容器を液体窒素に浸す。凍結したら、懸
濁物を２４時間、凍結乾燥し、生成物を４℃で保存す
る。平均粒子サイズは１０μmである。導入された免疫
グロブリンの量はミクロスフェア１mgあたり２.５μgで
ある。

【００４８】実施例３２ ヒアルロン酸の全カルボキシ基がベンジルアルコールで
エステル化されているヒアルロン酸エステル(ＨＹＡＦ
Ｆ−１１、米国特許番号４,９６５,３５３に記載)を、
５〜１０％重量/容量の間で変化する濃度(通常は７％w/
v)でジメチルスルホキシドなどの非プロトン性溶媒に溶
解する。このポリマーが溶解したら、塩酸(pＨ３)に溶
解したカルシトニンなどのポリペプチドを、予め決定し
た濃度(例えば、ポリマー１mgあたり１５ Ｉ.Ｕ.)で溶
液に加える。こうして得た溶液を以降は不連続相と称す
る。同時に、非イオン系界面活性剤であるＡrlacel^Rを
１％w/vの濃度で含む高粘度の鉱油の混合物を適当な反
応容器中で製造する。この混合物を以降は連続相と称す
る。連続相を２５℃に維持し、１０００rpmの速度で撹
拌し、上記のように製造した不連続相をこれに加える。
これらの条件下で二相の乳化が即時に起こる。二相(不
連続相と連続相)の間の比は約１〜１６である。撹拌の
１５分後に、酢酸エチルを加える。この溶媒は乳濁液の
二相と完全に混合するが、ポリマーもしくはポリペプチ
ドカルシトニンに対する溶媒ではない。完全な抽出を得
るのに必要な抽出溶媒の容量は乳濁液の全容量の２.５
倍であることが判明した。抽出を容易にするために、撹
拌速度を１０分間、１４００〜１５００rpmに設定し、
次いで５００rpmに下げる。このようにして得られた懸
濁液の撹拌を、１気圧に設定したフィルター・プレスを
通してスクリュー・ポンプでポンピングしながら続け
る。この濾過が完了したなら、n−ヘキサンのフィルタ
ーを通してポンピングする。この溶媒は、製造物の"乾
燥"およびミクロスフェアの表面に存在することもある
いずれかの残留界面活性剤の溶解という二重の作用を有
する溶媒である。次いで、生成物を適当な容器に入れ、
４℃で保存する。これらの処理条件下で得られた平均粒
子サイズは１０μmである。導入されたカルシトニンの
量はミクロスフェア１mgあたり１３Ｉ.Ｕ.である。

【００４９】実施例３３ ヒアルロン酸の全カルボキシ基がベンジルアルコールで
エステル化されているヒアルロン酸エステル(ＨＹＡＦ
Ｆ−１１、米国特許番号４,９６５,３５３に記載)を、
５〜１０％重量/容量の間で変化する濃度(通常は７％w/
v)でジメチルスルホキシドなどの非プロトン性溶媒に溶
解する。得られた溶液を以降は不連続相と称する。同時
に、非イオン系界面活性剤であるＡrlacel^Rを１％w/vの
濃度で含む高粘度の鉱油の混合物を適当な反応容器中で
製造する。この混合物を以降は連続相と称する。連続相
を２５℃に維持し、１０００rpmの速度で撹拌し、上記
のように製造した不連続相をこれに加える。これらの条
件下で二相の乳化が即時に起こる。二相(不連続相と連
続相)の間の比は約１〜１６である。撹拌の１５分後
に、酢酸エチルを加える。この溶媒は乳濁液の二相と完
全に混合するが、ポリマーに対する溶媒ではない。完全
な抽出を得るのに必要な抽出溶媒の容量は乳濁液の全容
量の２.５倍であることが判明した。抽出を容易にする
ために、撹拌速度を１０分間、１４００〜１５００rpm
に設定し、次いで５００rpmに下げる。このようにして
得られた懸濁液の撹拌を、１気圧に設定したフィルター
・プレスを通してスクリュー・ポンプでポンピングしな
がら続ける。この濾過が完了したなら、n−ヘキサンの
フィルターを通してポンピングする。この溶媒は、製造
物の"乾燥"およびミクロスフェアの表面に存在すること
もあるいずれかの残留界面活性剤の溶解という二重の作
用を有する溶媒である。次いで、生成物を適当な容器に
入れ、４℃で保存する。このようにして製造されたミク
ロスフェアを、懸濁されたミクロスフェア１mgに対して
１５ Ｉ.Ｕ.のタンパク質力価が達成される濃度のカル
シトニンを含むリン酸緩衝溶液(０.０１Ｍ)(イオン強度
＝０.１Ｍ)(pＨ７)中に懸濁する。半自動システムによ
る撹拌の１５分後に、懸濁液が完全に凍結するまで容器
を液体窒素に浸す。凍結後、懸濁物を２４時間凍結乾燥
し、生成物を４℃で保存する。これらの処理条件下で得
られた平均粒子サイズは１０μmである。導入されたカ
ルシトニンの量はミクロスフェア１mgあたり１３Ｉ.Ｕ.
である。

【００５０】実施例３４ ヒアルロン酸の７５％のカルボキシ基がベンジルアルコ
ールでエステル化され、残りの部分がナトリウムで塩化
されているヒアルロン酸エステル(ＨＹＡＦＦ−１１ p
７５、米国特許番号４,９６５,３５３に記載)を、５〜
１０％重量/容量の間で変化する濃度(通常は７％w/v)で
ジメチルスルホキシドなどの非プロトン性溶媒に溶解す
る。このポリマーが溶解したら、塩酸(pＨ３)に溶解し
たカルシトニンなどのポリペプチドを、予め決定した濃
度(例えば、ポリマー１mgあたり１５ Ｉ.Ｕ.)で溶液に
加える。このようにして得られた溶液を以降は不連続相
と称する。同時に、非イオン系界面活性剤であるＡrlac
el^Rを１％w/vの濃度で含む高粘度の鉱油の混合物を適当
な反応容器中で製造する。この混合物を以降は連続相と
称する。連続相を２５℃に維持し、１０００rpmの速度
で撹拌し、上記のように製造した不連続相をこれに加え
る。これらの条件下で二相の乳化が即時に起こる。二相
(不連続相と連続相)の間の比は約１〜１６である。撹拌
の１５分後に、酢酸エチルを加える。この溶媒は乳濁液
の二相と完全に混合するが、ポリマーもしくはポリペプ
チドカルシトニンに対する溶媒ではない。完全な抽出を
得るのに必要な抽出溶媒の容量は乳濁液の全容量の２.
５倍であることが判明した。抽出を容易にするために、
撹拌速度を１０分間、１４００〜１５００rpmに設定
し、次いで５００rpmに下げる。このようにして得られ
た懸濁液の撹拌を、１気圧に設定したフィルター・プレ
スを通してスクリュー・ポンプでポンピングしながら続
ける。この濾過が完了したなら、n−ヘキサンのフィル
ターを通してポンピングする。この溶媒は、製造物の"
乾燥"およびミクロスフェアの表面に存在することもあ
るいずれかの残留界面活性剤の溶解という二重の作用を
有する溶媒である。次いで、生成物を適当な容器に入
れ、４℃で保存する。平均粒子サイズは１５μmであ
る。導入されたカルシトニンの量はミクロスフェア１mg
あたり１３Ｉ.Ｕ.である。

【００５１】実施例３５ ヒアルロン酸の全カルボキシ基がエチルアルコールでエ
ステル化されているヒアルロン酸エステル(ＨＹＡＦＦ
−７、米国特許番号４,９６５,３５３に記載)を、５〜
１０％重量/容量の間で変化する濃度(通常は７％w/v)で
ジメチルスルホキシドなどの非プロトン性溶媒に溶解す
る。このポリマーが溶解したら、塩酸(pＨ３)に溶解し
たカルシトニンなどのポリペプチドを、予め決定した濃
度(例えば、ポリマー１mgあたり１５Ｉ.Ｕ.)で溶液に加
える。このようにして得られた溶液を以降は不連続相と
称する。同時に、非イオン系界面活性剤であるＡrlacel
^Rを１％w/vの濃度で含む高粘度の鉱油の混合物を適当な
反応容器中で製造する。この混合物を以降は連続相と称
する。連続相を２５℃に維持し、１０００rpmの速度で
撹拌し、上記のように製造した不連続相をこれに加え
る。これらの条件下で二相の乳化が即時に起こる。二相
(不連続相と連続相)の間の比は約１〜１６である。撹拌
の１５分後に、酢酸エチルを加える。この溶媒は乳濁液
の二相と完全に混合するが、ポリマーもしくはポリペプ
チドカルシトニンに対する溶媒ではない。完全な抽出を
得るのに必要な抽出溶媒の容量は乳濁液の全容量の２.
５倍であることが判明した。抽出を容易にするために、
撹拌速度を１０分間、１４００〜１５００rpmに設定
し、次いで５００rpmに下げる。このようにして得られ
た懸濁液の撹拌を、１気圧に設定したフィルター・プレ
スを通してスクリュー・ポンプでポンピングしながら続
ける。この濾過が完了したなら、n−ヘキサンのフィル
ターを通してポンピングする。この溶媒は、製造物の"
乾燥"およびミクロスフェアの表面に存在することもあ
るいずれかの残留界面活性剤の溶解という二重の作用を
有する溶媒である。次いで、生成物を適当な容器に入
れ、４℃で保存する。平均粒子サイズは３０μmであ
る。導入されたカルシトニンの量はミクロスフェア１mg
あたり１３ Ｉ.Ｕ.である。

【００５２】実施例３６ ヒアルロン酸の全カルボキシ基がエチルアルコールでエ
ステル化されているヒアルロン酸エステル(ＨＹＡＦＦ
−７、米国特許番号４,９６５,３５３に記載)を、５〜
１０％重量/容量の間で変化する濃度(通常は７％w/v)で
ジメチルスルホキシドなどの非プロトン性溶媒に溶解す
る。このようにして得られた溶液を以降は不連続相と称
する。同時に、非イオン系界面活性剤であるＡrlacel^R
を１％w/vの濃度で含む高粘度の鉱油の混合物を適当な
反応容器中で製造する。この混合物を以降は連続相と称
する。連続相を２５℃に維持し、１０００rpmの速度で
撹拌し、上記のように製造した不連続相をこれに加え
る。これらの条件下で二相の乳化が即時に起こる。二相
(不連続相と連続相)の間の比は約１〜１６である。撹拌
の１５分後に、酢酸エチルを加える。この溶媒は乳濁液
の二相と完全に混合するが、ポリマーに対する溶媒では
ない。完全な抽出を得るのに必要な抽出溶媒の容量は乳
濁液の全容量の２.５倍であることが判明した。抽出を
容易にするために、撹拌速度を１０分間、１４００〜１
５００rpmに設定し、次いで５００rpmに下げる。このよ
うにして得られた懸濁液の撹拌を、１気圧に設定したフ
ィルター・プレスを通してスクリュー・ポンプでポンピ
ングしながら続ける。この濾過が完了したなら、n−ヘ
キサンのフィルターを通してポンピングする。この溶媒
は、製造物の"乾燥"およびミクロスフェアの表面に存在
することもあるいずれかの残留界面活性剤の溶解という
二重の作用を有する溶媒である。次いで、生成物を適当
な容器に入れ、４℃で保存する。このようにして製造さ
れたミクロスフェアを、懸濁されたミクロスフェア１mg
に対して１５ Ｉ.Ｕ.のタンパク質力価が達成される濃
度のカルシトニンを含むリン酸緩衝溶液(０.０１Ｍ)(イ
オン強度＝０.１Ｍ)(pＨ７)中に懸濁する。半自動シス
テムによる撹拌の１５分後に、懸濁液が完全に凍結する
まで容器を液体窒素に浸す。凍結後、懸濁物を２４時間
凍結乾燥し、生成物を４℃で保存する。平均粒子サイズ
は３０μmである。導入されたカルシトニンの量はミク
ロスフェア１mgあたり１３ Ｉ.Ｕ.である。

【００５３】実施例３７ 異なる濃度のカルシトニン(ミクロスフェア１mgあたり
主として５ｘ１０^-3〜１０Ｉ.Ｕ.)を含有するミクロス
フェアを、異なるヒアルロン酸誘導体を用いて調製し
た。疎水性の程度が異なるポリマーを用いた。以下にそ
の例を挙げる： ・ＨＹＡＦＦ-１１：ベンジルアルコールで全エステル
化されたＨＡ； ・ＨＹＡＦＦ-１１ p７５：ベンジルアルコールで部分
エステル化されたＨＡ； ・ＨＹＡＦＦ-７：エチルアルコールで全エステル化さ
れたＨＡ。 実施例３２〜３６の記載のようにしてミクロスフェアを
調製し、インビボの動物モデルでカルシトニンの皮下吸
収を試験した。この動物モデルにおいては、ポリマー・
マトリックスの内部に導入したか、またはミクロスフェ
アの外部表面に吸着させたタンパク質の製剤を試験し
た。これら製剤は次のようである： ・製剤１：ミクロスフェア１mgあたり５ｘ１０^-3Ｉ.Ｕ.
の濃度で物理的に導入したカルシトニンを含有するＨＹ
ＡＦＦ-１１のミクロスフェア； ・製剤２：粉末１mgあたり５ｘ１０^-3Ｉ.Ｕ.の濃度で表
面吸着させたカルシトニンを含有するＨＹＡＦＦ-１１
のミクロスフェア； ・製剤３：ミクロスフェア１mgあたり５ｘ１０^-3Ｉ.Ｕ.
の濃度で物理的に導入したカルシトニンを含有するＨＹ
ＡＦＦ-１１ p７５のミクロスフェア； ・製剤４：粉末１mgあたり５ｘ１０^-3Ｉ.Ｕ.の濃度で表
面吸着させたカルシトニンを含有するＨＹＡＦＦ-７の
ミクロスフェア； ・製剤５：５ｘ１０^-3Ｉ.Ｕ.の濃度でカルシトニンを含
有する緩衝溶液。 これらミクロスフェアを皮下経路によって雄性Ｗistar
ラット(１１５〜１２５g)に投与した。実験前の２０時
間はこのラットに餌を与えなかった。それぞれの製剤に
ついて、ミクロスフェア(３０mg)を、１Ｎ ＨＣlでpＨ
４.００にした１％酢酸ナトリウム(４２５ml)と１６％
ゼラチン(３１.２５ml)の混合物からなる希釈溶液(２０
ml)に懸濁した。次いで、それぞれの製剤(０.４ml；３m
Ｉ.Ｕ.)を皮下注射した。投与後の１、２、３、４、お
よび５時間の一定時間に、腹部大動脈から血液(３ml)を
採取し、動物を犠牲にした。次いで、血液カルシウムを
原子吸収により血清において直接測定した。表１は、試
験を行なった全製剤の時間毎の血液カルシウム値の減少
を示すものである。この表から、ポリマーが、血液中の
Ｃa⁺⁺減少の反応および時間に明らかな影響を有してい
るカルシトニンの放出に対して明確な遅延作用を有して
いることがわかる。

【表１】 表１ 血液カルシウム量の減少 製 剤 一定時間後の血液Ｃa²⁺の減少率(％) １ ２ ３ ４ ５(時間) ＨＹＡＦＦ-１１(内部) ５ １８ ３０ ２７ １３ ＨＹＡＦＦ-１１(外部) １０ ３０ ２６ ２１ １０ ＨＹＡＦＦ-１１ p７５(内部) １０ ３０ ２８ １５ ３ ＨＹＡＦＦ-７(外部) １２ ２８ ２４ １７ ２.８カルシトニン溶液 ３０ ２２ １５ １０ ２.５ また、これらの結果は、ポリマー・マトリックス中に物
理的に導入されたカルシトニンを含有するミクロスフェ
アの場合には放出が比較的遅くなるという、導入の種類
に依存する作用が存在することを示している。

【００５４】実施例３８ 種々の濃度のカルシトニン(ミクロスフェア１mgあたり
主として５ｘ１０^-3、１０Ｉ.Ｕ.)を含有するミクロス
フェアを、異なるヒアルロン酸誘導体を用いて調製し
た。疎水性の程度が異なるポリマーを用いた。以下にそ
の例を挙げる： ・ＨＹＡＦＦ-１１：ベンジルアルコールで全エステル
化されたＨＡ； ・ＨＹＡＦＦ-１１ p７５：ベンジルアルコールで部分
エステル化されたＨＡ。 膣吸収を研究するために考案した動物モデルにおいて、
ミクロスフェアに内部導入したか、またはその表面に外
部吸着させたタンパク質の製剤を試験した。これら製剤
は次のようである： ・ＨＹＡＦＦ-１１：ミクロスフェア１mgあたり５Ｉ.
Ｕ.の濃度で内部導入したカルシトニンを含有するミク
ロスフェア； ・ＨＹＡＦＦ-１１ p７５：ミクロスフェア１mgあたり
５Ｉ.Ｕ.の濃度で内部導入したカルシトニンを含有する
ミクロスフェア； ・カルシトニン：１００Ｉ.Ｕ.／mlの濃度で０.９％食
塩水(塩酸でpＨ４に調整)に溶解したカルシトニン。 上記の製剤を、体重１５０〜２００gの雌性の卵巣摘出
したＷistarラットに投与した。このラットを麻酔し、
気管切開した。頸動脈と頸静脈にカテーテル挿入して血
液の採取と決めた時間での食塩水による置換を可能にし
た。カルシトニン溶液を４００μl／kg(１００Ｉ.Ｕ.／
kgに等しい)の用量で膣に注入した。カルシトニンを含
まない同じ容量の食塩水(pＨ４)を対照ラットの群に投
与した。膣にカテーテルを挿入し、乾燥粉末形態のミク
ロスフェアを噴霧することによって１００Ｉ.Ｕ.、２０
mg／kgの用量でミクロスフェアを投与した。血液試料を
ヘパリン処理した容器に集め、遠心によって得た血漿を
分析時まで−２０℃で保存した。血漿中のカルシウム濃
度は原子吸収分光法によって測定し、血漿中の最初の濃
度に対する百分率(％)で表した。図１は、１００Ｉ.Ｕ.
のカルシトニンを膣投与した後の血中カルシウムの減少
を示すものである。減少は１５分後に血漿において観察
することができ、また、最大の低カルシウム作用は２ま
たは３時間後に到達する。標準偏差値が小さいことか
ら、動物間の変動がごくわずかであることがわかった。
図２は、ＨＹＡＦＦ-１１およびＨＹＡＦＦ-１１ p７５
ミクロスフェア中に配合したカルシトニンを膣投与した
後の、血漿中のカルシウム量を示すものである。両製剤
は血中カルシウムの吸収に有効であることが証明され、
タンパク質はミクロスフェアの製造過程で分解を受けて
いないことが示された。これら２種類の製剤を用いて得
た血漿プロフィールの相違は、ポリマー・マトリックス
の異なる物理化学的性質に帰結することができる。ミク
ロスフェアからのカルシトニンの放出およびその結果と
しての活性は、ＨＹＡＦＦ-１１(ポリマーがベンジルア
ルコールで全エステル化されている)の場合の方がＨＹ
ＡＦＦ-１１ p７５の場合よりも低い。後者の場合で
は、ポリペプチドは部分的にエステル化されたマトリッ
クス中に導入されており、これは生物学的液体の存在下
では全エステル化ポリマーよりも迅速に水和し、従って
カルシトニンがより迅速にポリマー・マトリックスから
膣粘膜に広がる。このように、ポリマーのエステル化の
程度によってカルシトニンの放出を調節することができ
る。

【００５５】実施例３９ インシュリンを含有するミクロスフェアを調製し、イン
ビボのモデルで試験した。Ｎa-インシュリンの調製物
を、溶液中の遊離インシュリンとして、ならびに実施例
１〜５の記載のようにして調製したミクロスフェアの形
態のヒアルロン酸誘導体と会合させてヒツジの鼻から投
与した。溶液を投与するために、３５cmの管を、鼻孔の
開口部から１０cmの設定深さのところに設置されるよう
に注意しながら鼻腔に挿入した。粉末形態の製剤を投与
するために、６.５μmの気管内用の管を決めた量のミク
ロスフェアで満たし、鼻孔に設置した。この場合には、
この装置を鼻孔の開口部から６cmの深さのところに設置
した。インシュリンは、溶液中およびミクロスフェアと
会合させて鼻内経路により２Ｉ.Ｕ.／kgで投与した。４
匹のヒツジの群をそれぞれの実験に用いた。以下の製剤
を調製した： 製剤１：ヒアルロン酸(ＨＹＡＦＦ-１１)のミクロスフ
ェアと会合したインシュリンの鼻投与のために、凍結乾
燥生成物を調製した(２.０mg／kgが２Ｉ.Ｕ.インシュリ
ンに対応)； 製剤２：ヒアルロン酸(ＨＹＡＦＦ-１１ p７５)のミク
ロスフェアと会合したインシュリンの鼻投与のために、
凍結乾燥生成物を調製した(２.０mg／kgが２Ｉ.Ｕ.イン
シュリンに対応)； 製剤３：ヒアルロン酸(ＨＹＡＦＦ-７)のミクロスフェ
アと会合したインシュリンの鼻投与のために、凍結乾燥
生成物を調製した(２.０mg／kgが２Ｉ.Ｕ.インシュリン
に対応)； 製剤４：対照の鼻投与のために、ミクロスフェア単独
(ＨＹＡＦＦ-１１)の凍結乾燥生成物を調製した(２.０m
g／kg)； 製剤５：水溶液中のインシュリンの鼻投与のために、２
Ｉ.Ｕ.／mlの濃度の溶液を調製した。 設定した時間に、血液試料(５ml)をそれぞれ予めカニュ
ーレ挿入しておいた頸静脈から採取した。それぞれの血
液試料を半分に分け、インシュリン分析用に２.５mlを
ヘパリン処理した試験管に入れ、血糖症分析用に他の
２.５mlをシュウ酸フッ化物を含む試験管に入れた。以
下の表２は、インシュリンの鼻投与の後に得られる血漿
のグルコース量の低下を示すものである。

【表２】 表２ インシュリンの鼻投与後の血漿グルコース量の低下 製剤 種々の時間(分)での血中グルコースの減少率(％) 10 20 30 40 60 80 90 120 140 190 １ 7 15 25 40 65 60 51 42 21 7 ２ 10 20 39 58 49 30 21 7 0 0 ３ 12 19 35 57 40 29 18 5 0 0 ４ 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 ５ 4 6 8 7 6 0 0 0 0 0 単なる溶液として鼻から投与したインシュリン(製剤５)
は血中グルコース量の低下に有意の作用を有していない
ことが表２から明らかである。ミクロスフェアを製造す
るために用いたヒアルロン酸エステルの種類によって血
中グルコース量の低下に異なるプロフィールを観察する
ことができる。ＨＹＡＦＦ-７(最も親水性である誘導
体)を用いて製造したミクロスフェアは鼻粘膜との"活
性"の低い相互作用を有しており、従って血中グルコー
ス量の低下に及ぼす作用が小さい(製剤３)。一方、ＨＹ
ＡＦＦ-１１ p７５(製剤２)およびＨＹＡＦＦ-１１(製
剤１)を用いて製造したミクロスフェアは、粘膜細胞と
のさらに高い相互作用を有している。この場合にも、血
糖症の低下は誘導体の種類と関係している。即ち、ＨＹ
ＡＦＦ-１１ p７５はＨＹＡＦＦ-１１よりも作用が小さ
く、誘導体の物理化学的性質がタンパク質放出の操作を
可能にすることがわかる。

【００５６】実施例４０ Ｎa-インシュリンの調製物を、溶液中の遊離インシュリ
ンとして、ならびに実施例１〜５の記載のようにして調
製したミクロスフェアの形態のヒアルロン酸誘導体と会
合させてヒツジの鼻から投与した。溶液を投与するため
に、３５cmの管を、鼻孔の開口部から１０cmの設定深さ
のところに設置されるように注意しながら鼻腔に挿入し
た。粉末形態の製剤を投与するために、６.５μmの気管
内用の管を決めた量のミクロスフェアで満たし、鼻孔に
設置した。この場合には、この装置を鼻孔の開口部から
６cmの深さのところに設置した。ＨＹＡＦＦ-１１のミ
クロスフェアと会合させたインシュリンを鼻内経路によ
り１、２、４および８Ｉ.Ｕ.／kgの用量で投与した。４
匹のヒツジ(約４０kg)の群をそれぞれの実験に用いた。
以下の製剤を調製した： 製剤１：ミクロスフェア１mgあたり１Ｉ.Ｕ.の濃度でイ
ンシュリンを含有するＨＹＡＦＦ-１１； 製剤２：ミクロスフェア１mgあたり２Ｉ.Ｕ.の濃度でイ
ンシュリンを含有するＨＹＡＦＦ-１１； 製剤３：ミクロスフェア１mgあたり４Ｉ.Ｕ.の濃度でイ
ンシュリンを含有するＨＹＡＦＦ-１１； 製剤４：ミクロスフェア１mgあたり８Ｉ.Ｕ.の濃度でイ
ンシュリンを含有するＨＹＡＦＦ-１１。 それぞれの群のそれぞれのヒツジを、２Ｉ.Ｕ.／kgの用
量の、異なる量のミクロスフェアと会合させたインシュ
リンで処理した。設定した時間に、血液試料(５ml)をそ
れぞれ予めカニューレ挿入しておいた頸静脈から採取し
た。それぞれの血液試料を半分に分け、インシュリン分
析用に２.５mlをヘパリン処理した試験管に入れ、血糖
症分析用に他の２.５mlをシュウ酸フッ化物を含む試験
管に入れた。図３は、２.０、１.０、０.５または０.２
５mg／kgのＨＹＡＦＦ-１１と会合させた２.０Ｉ.Ｕ.／
kgのインシュリンを投与した後の、血中グルコース濃度
の平均値を示すものである。これらの結果は、すべての
製剤が血糖症の顕著な低下を引き起こし、この低下のプ
ロフィールがそれぞれの鼻投与で類似していることを示
す。図４は、上記製剤を鼻投与した後に得られる血漿中
のインシュリン量を示すものである。このグラフは、す
べての製剤について投与後の最初の１５〜３０分の間に
血漿インシュリンのピークが現れることを示している。
血漿インシュリンのプロフィールはすべての製剤で類似
している。血漿インシュリン濃度の曲線の下側の面積の
分析によって、唯一の統計学的に有意な相違がＨＹＡＦ
Ｆ-１１の最高用量と最低用量の間に認められることが
わかる。さらに、ＨＹＡＦＦ-１１の用量を８倍に増加
させても曲線下の面積は２倍になるにすぎないことがわ
かる。結論として、これらの結果は、この系をヒトに適
用することができ、低用量のミクロスフェアを用いてイ
ンシュリンを投与しうることを示すものである。

【００５７】実施例４１ ＧＭ１を含有するＨＹＡＦＦ-１１の異なる寸法のミク
ロスフェア(１０−４０μm)を実施例２９および３０の
記載のようにして調製した。ガングリオシドを２mg／kg
の濃度でニュージーランド・ウサギ(体重２.５kg)の群
に筋肉内経路で投与した。設定した時間に、血液(２.５
ml)を耳の正中動脈から採取した。それぞれの血液試料
を３７℃で１時間インキュベートし、次いで４℃で一晩
冷蔵した。次に、この試料を遠心し、血清の上層を取っ
た。ＧＭ１含量の測定のために、血清(５００μl)にテ
トラヒドロフラン(ＴＨＦ)(２ml)を加えた。この試料を
撹拌および遠心し、上層を保存した。沈澱をＴＨＦ(２
μl)および５０mＭリン酸緩衝液(５００μl)で２回処理
し、遠心した。このようにして得た上層をエチルエーテ
ルで抽出し、水相を分離した後に有機相をさらに水で抽
出した。次いで、２つの水相を混合し、凍結乾燥した。
この凍結乾燥生成物を水に再溶解し、ＧＭ１含量をＥＬ
ＩＳＡ試験で測定した。図５のグラフは筋肉内投与の後
の血漿中のＧＭ１量を示すものである。薬物をミクロス
フェアと会合させると、血漿中の最大濃度に到達するの
に必要な時間がＧＭ１それ自体を投与したときに必要な
時間よりも長くなることがわかる。さらに、ＧＭ１自体
を投与したときには血漿のＧＭ１量は急激に降下する
が、ミクロスフェアと共に投与したときには、薬物の放
出がより遅くなるのでＧＭ１は血漿中により長く存続す
る。表３は、ＧＭ１を３種の異なる製剤で投与した後
の、曲線下の面積を示すものである。これからわかるよ
うに、より大きな直径(４０μm)を有するミクロスフェ
アは、より小さな直径を有するミクロスフェアに比べて
より長い循環中の薬物の存在を保証する。これは、恐ら
く、より大きなミクロスフェアからのＧＭ１の拡散時間
がより長くなるためであろう。

【表３】 表３ ２mg／kgの濃度でＧＭ１を筋肉内投与した後の 曲線下の面積(μg／時間／ml) 実験 ＧＭ１ ＨＹＡＦＦ-１１ ＨＹＡＦＦ-１１ (１０μm) (４０μm) １回目 １２７.７４ １６７.０６ ２５３.４ ２回目 １３４.４３ １５８.２５ ２２３.２９

【００５８】実施例４２ ポリマーの異なる物理化学的性質に従って選択した異な
るポリマー・マトリックス(実施例６、８、９、２０お
よび２１)を用いてＮＧＦおよびＮＧＦ＋ＧＭ１を含有
するミクロスフェアを製造した。ここには、使用したヒ
アルロン酸誘導体の３種を例として挙げる(ＨＹＡＦＦ-
１１；ＨＹＡＦＦ-１１ p７５；ＨＹＡＦＦ-７)。ミク
ロスフェアの製造に使用した誘導体の異なる物理化学的
性質の作用を明瞭にするために、導入された産物(ＮＧ
ＦおよびＧＭ１)の放出時間をインビトロで評価した。
ミクロスフェア試料を０.１Ｍリン酸緩衝液(pＨ７.４；
ｕ＝０.３Ｍ)に懸濁させ、一定の撹拌のもとに３７℃に
維持した。種々の時間に試料を取り、このようにして集
めた分画を、ＧＭ１の測定にはＨＰＬＣを用いて、ＮＧ
Ｆの測定にはＥＬＩＳＡ法を用いて分析した。ＮＧＦの
放出は、ミクロスフェアの製造に用いたポリマーの物理
化学的性質との関係で、また、製剤中のＧＭ１の存在ま
たは非存在に依存して特定のパターンを示した。ＧＭ１
を含まないときには、予想されたように、ＮＧＦは使用
したマトリックスの親水性の性質に応じて放出され、定
量された。図６は、ＧＭ１の存在下／非存在下でのＨＹ
ＡＦＦ-１１ p７５からのＮＧＦの放出を例として挙げ
るものである。このミクロスフェア種については、ＮＧ
Ｆの放出は、ＧＭ１の存在下の方がガングリオシドを含
まない試料におけるよりも多量かつ早いことがわかる。
全エステル化されたヒアルロン酸誘導体を用いて製造さ
れた製剤の場合には、ＮＧＦはポリマー・マトリックス
から少ない量で放出され、強いポリマー-ポリペプチド
相互作用が存在することが示された。しかし、ＧＭ１が
同一の製剤中に存在するときには、放出されるＮＧＦの
最大量は導入量の４０％ではあるが溶液中に有意に多い
量のＮＧＦを観察することができ(図７および図８)、こ
こでもポリマーとの強い相互作用が示された。

【００５９】以上に本発明を説明したが、これらの方法
を様々に修飾しうることは明らかである。このような修
飾は本発明の思想および目的から逸脱するものとみなす
べきではなく、当業者に明白なあらゆる修飾は本願の特
許請求の範囲内にある。

【図面の簡単な説明】

【図１】 溶液中のカルシトニンを膣投与した後の、血
漿中のカルシウム量(％)を示すグラフである。

【図２】 ＨＹＡＦＦ-１１およびＨＹＡＦＦ-１１ p７
５のミクロスフェアと会合したカルシトニンを膣投与し
た後の、血漿中のカルシウム量(％)を示すグラフであ
る。

【図３】 インシュリンを含有するＨＹＡＦＦ-１１ミ
クロスフェアを異なる用量でヒツジに鼻投与した後の、
血漿グルコースの減少に及ぼす作用を示すグラフであ
る。

【図４】 ＨＹＡＦＦ-１１ミクロスフェアを異なる用
量でヒツジに鼻投与した後の、血漿中のインシュリン量
を示すグラフである。

【図５】 ＧＭ₁を単独で、および直径の異なるミクロ
スフェアと一緒にしてウサギに筋肉内投与した後の、血
漿中のＧＭ₁量を示すグラフである。

【図６】 ＨＹＡＦＦ-１１ p７５のミクロスフェアか
ら放出されるＮＧＦを示すグラフである。

【図７】 ＨＹＡＦＦ-１１のミクロスフェアから放出
されるＮＧＦを示すグラフである。

【図８】 ＨＹＡＦＦ-７のミクロスフェアから放出さ
れるＮＧＦを示すグラフである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ａ６１Ｋ 38/22 38/28 38/23 // Ａ６１Ｋ 39/395 Ｙ Ａ６１Ｋ 37/26 37/30 (72)発明者 ルカ・ベネデェッティ イタリア36100ビチェンツァ、ビア・ドゥ ランド26番

Claims (14)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 生物学的に活性な分子とヒアルロン酸エ
   ステルまたは該エステルの混合物からなり、該生物学的
   に活性な分子が該ヒアルロン酸エステルまたはその混合
   物によって囲まれているかまたはそれに吸着しており、
   そして１〜１００μmの直径を有する、生物学的に活性
   な分子を制御して放出させるためのミクロスフェア。
2. 【請求項２】 生物学的に活性な分子がポリペプチドで
   ある請求項１に記載のミクロスフェア。
3. 【請求項３】 ポリペプチドがインシュリンである請求
   項２に記載のミクロスフェア。
4. 【請求項４】 ポリペプチドがカルシトニンである請求
   項２に記載のミクロスフェア。
5. 【請求項５】 ポリペプチドが成長因子である請求項２
   に記載のミクロスフェア。
6. 【請求項６】 成長因子が神経成長因子である請求項５
   に記載のミクロスフェア。
7. 【請求項７】 成長因子が線毛神経栄養因子である請求
   項５に記載のミクロスフェア。
8. 【請求項８】 ポリペプチドが免疫グロブリンである請
   求項２に記載のミクロスフェア。
9. 【請求項９】 ポリペプチドがガングリオシド混合物ま
   たは単一のガングリオシド分画またはそれらの誘導体に
   会合している請求項１に記載のミクロスフェア。
10. 【請求項１０】 ガングリオシド混合物または単一のガ
    ングリオシド分画またはそれらの誘導体がミクロスフェ
    アと会合している請求項１に記載のミクロスフェア。
11. 【請求項１１】 粘膜に投与する請求項１に記載のミク
    ロスフェア。
12. 【請求項１２】 粘膜が鼻粘膜である請求項１１に記載
    のミクロスフェア。
13. 【請求項１３】 粘膜が膣粘膜である請求項１１に記載
    のミクロスフェア。
14. 【請求項１４】 筋肉内に投与する請求項１に記載のミ
    クロスフェア。