CN105663052B - 神经生长因子缓释微球制剂及其制备方法 - Google Patents

神经生长因子缓释微球制剂及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及神经生长因子缓释微球制剂及其制备方法，属于药物制剂领域。神经生长因子缓释微球制剂，由以下重量百分比含量的成份组成：神经生长因子0.01～2％，两嵌段两亲性聚合物40～99.88％，稳定剂0～40％，冻干保护剂0.1～50％；本发明的优点是：采用冻干保护剂单独或与稳定剂协同作用，保持冻干、储存和释放过程中神经生长因子的二聚体形式，并进一步增强神经生长因子在冻干、储存和释放过程中的稳定性。本发明显著降低了稳定剂的含量，避免稳定剂过多对药物释放产生的不利影响，降低了突释，使释放更稳定，特别在释放后期极大提高了药物的活性。

Description

神经生长因子缓释微球制剂及其制备方法
技术领域
本发明涉及神经生长因子缓释微球制剂及其制备方法，属于药物制剂领域。
背景技术
神经生长因子(Nerve Growth Factor，NGF)是一种具有神经元营养和促进突起生长双重生物学功能的小分子多肽类神经营养因子，具有较强的促细胞***功能，对中枢及周围神经元的发育、分化、生长、再生和功能特性的表达均具有重要的调控作用。
目前，神经生长因子可用于视神经损伤、脑、脊髓损伤、脊髓移植、骨科四肢神经损伤、坐骨神经损伤、多发性神经炎、椎间盘痛、神经断裂及退行性病变。但在实际应用中，由于神经生长因子的半衰期较短，在水溶液中易失活，且易受湿度、酸碱度等多种因素的影响，在神经再生及治疗疾病的漫长过程中，神经生长因子不能长时间持续发挥促再生作用，需要频繁给药才能实现良好的治疗效果，制备神经生长因子的长效缓释微球制剂是改善上述问题的有效途径。现有常用的制备微球方法是复乳法(W/O/W)，虽然操作简单，但针对制备神经生长因子的缓释微球制剂还存在如下的问题：
一、研究报道，神经生长因子主要是以二聚体的形式发挥药效，而单体的形式虽然活性没有完全丧失，但药效显著降低。现有制备微球的方法中，采用了添加药物稳定剂的方法保护药物的活性，但微球在冻干、储存和释放时，特别是冻干与存储过程中，由于蛋白药物受到强烈的外界应力作用(包括低温应力，pH的改变，离子强度增加等)，蛋白药物的结构和活性遭到破坏。蛋白二聚体容易发生解聚，影响蛋白活性。
二、药物稳定剂的含量不仅影响药物活性也会影响药物释放，而现有方法常常为了保护药物活性加入浓度过大、含量较高的药物稳定剂(大部分在内水相的浓度超过0.1g/ml)。虽然药物的活性得到一定的保护，但较高的内水相渗透压，会进一步影响药物释放行为，可能引起高突释(突释率大于15％)、释放过快或过慢、释放不完全(在理论释放期内积累释放率低于80％)等，降低药物的治疗效果。
发明内容
本发明要解决的第一个技术问题是提供一种突释率低、缓释性好、蛋白活性持久的神经生长因子长效缓释微球制剂。
本发明要解决的第二个技术问题是提供上述神经生长因子长效缓释微球制剂的制备方法。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
神经生长因子缓释微球制剂，由以下重量百分比含量的成份组成：神经生长因子0.01～2.00％，两嵌段两亲性聚合物40.00～99.88％，稳定剂0～40.00％，冻干保护剂0.10～50.00％；稳定剂选自人血清白蛋白、牛血清白蛋白、羧甲基葡聚糖、环糊精或聚乙二醇中的一种或多种；冻干保护剂选自蔗糖、甘露醇、海藻糖、泊洛沙姆或乳糖中的一种或多种。
所述两嵌段两亲性聚合物选自聚乳酸、聚乳酸-羟基乙酸共聚物、聚乳酸-聚乙二醇共聚物中的一种或多种，分子量为5,000～80,000道尔顿；
神经生长因子是以二聚体形式起药效，因此二聚体的解聚降低了药物的活性。本发明研究发现冻干保护剂能够单独或与稳定剂协同保护NGF二聚体，抵抗其在冻干过程中受到的应力作用(包括低温应力，pH的改变，离子强度增加等)，保护神经生长因子在冻干和储存过程中的结构和活性。而且协同作用使得稳定剂在极低含量条件下，提高了神经生长因子在释放过程中的稳定性。本发明中神经生长因子在冻干、储存和释放过程中二聚体形式得到很好的保护，极大的提高药物的活性。
本发明所用的两嵌段两亲性聚合物的种类及分子量的选择，综合考虑了聚合物的降解率、物理性质、神经生长因子的释放周期等多种因素。
优选的神经生长因子缓释微球制剂，由以下重量百分比含量的成份组成：
神经生长因子0.01～1.26％，两嵌段两亲性聚合物70.00～99.00％，稳定剂0.005～3.14％，冻干保护剂0.23～42.73％；两嵌段两亲性聚合物的分子量为10,000～40,000道尔顿。
所述聚乳酸-羟基乙酸共聚物中聚乳酸和羟基乙酸的比例为50∶50～85∶15，聚乳酸-聚乙二醇共聚物中，聚乳酸和聚乙二醇的比例为5∶1～20∶1。
所述稳定剂聚乙二醇为聚乙二醇400、聚乙二醇600、聚乙二醇800、聚乙二醇1000、聚乙二醇2000或聚乙二醇4000。
更优选的神经生长因子缓释微球制剂，由以下重量百分比含量的成份组成：
神经生长因子0.02～1.26％，两嵌段两亲性聚合物90.00～98.00％，稳定剂0.015～3.14％，冻干保护剂1.21～9.05％。
本发明所述神经生长因子包括但不限于鼠源性神经生长因子(mNGF)、人源性神经生长因子(hNGF)或重组人神经生长因子(rhNGF)。
所述神经生长因子缓释微球制剂的平均粒径为1～100微米，优选20～80微米。
神经生长因子缓释微球制剂的制备方法，包括以下步骤：
1)将含神经生长因子和稳定剂的水相作为内水相W1，将两嵌段两亲性聚合物材料溶于有机溶剂中，形成油相O；将这两相混合均质乳化制备W1/O初乳液；
2)将步骤1)所得W1/O初乳液加入到含有表面活性剂的外水相W2中，再用一定的转速均质体系形成W1/O/W2复乳液；
3)将步骤2)所得W1/O/W2复乳液通过室温搅拌挥发或将其倒入含有NaCl的萃取液去除有机溶剂，再将微球离心、洗涤；
4)将步骤3)所得的微球悬浮于含有冻干保护剂的水溶液中，经过冷冻干燥后，得到神经生长因子缓释微球制剂。
所述步骤1)中的内水相选自去离子水、柠檬酸缓冲液、醋酸缓冲液、磷酸缓冲液中的一种，有机溶剂选自二氯甲烷、三氯甲烷、二甲苯、甲苯、乙酸乙酯、丙酮中的任意一种或至少2种的混合物，有机溶剂中含有的两嵌段两亲性聚合物的浓度为0.010～0.500g/ml，两嵌段两亲性聚合物与神经生长因子的重量含量比为4500∶1～50∶1，稳定剂浓度为0～0.200g/ml，内水相W1与油相O的体积比为1∶1～1∶15；步骤2)中的表面活性剂选自聚乙烯醇(PVA)、聚山梨酯(Tween 80)、聚山梨酯(Tween 20)、或十二烷基磺酸钠(SDS)，表面活性剂浓度为0.001～0.100g/ml，油相O与外水相W2的体积比1∶2～1∶25；步骤4)中冻干保护剂浓度为0.001～0.150g/ml。
优选的，所述步骤1)中有机溶剂中含有的两嵌段两亲性聚合物的浓度0.050～0.300g/ml，聚合物与NGF重量含量比为4500∶1～50∶1，稳定剂浓度为0.0005～0.050g/ml，所述内水相W1和油相O的体积比为1∶2～1∶10；步骤2)中表面活性剂的浓度为0.002～0.050g/ml，油相O与外水相W2的体积比1∶5～1∶20；步骤4)中冻干保护剂浓度为0.005～0.030g/ml。
对本发明产品进行包埋率、载药量、二聚体含量、NGF活性测定的方法如下：
1、包埋率，按照以下方式计算：
包埋率(％)＝微球中药物的测得载药量/微球中药物的理论载药量(μg/mg)×100％；
2、载药量＝[微球中药物量/(微球中药物量+聚合物量)]×100％。
3、二聚体含量，采用SEC-HPLC方法检测，色谱柱选用TSK G3000SWxL，流动相为含有15％乙腈的磷酸盐缓冲液，流速为0.6ml/min，并按以下公式计算：
二聚体含量(％)＝二聚体峰面积/所有峰面积总和。
4、NGF活性，采用细胞法测定，测定方法如下：(具体见CN103376248A中所述方法)
选择表达NGF高亲和力受体TrkA的TF-1细胞，利用NGF能够剂量依赖性地促进TF-1细胞增殖的特点，在一定范围内，用一系列浓度的NGF溶液作用TF-1细胞，一段时间后用MTT法测定TF-1细胞增殖情况。对NGF浓度和其对应的细胞增殖情况测定值进行四参数拟合，确定NGF对TF-1细胞增殖作用为最大值一半时的稀释倍数。然后根据供试品和标准品的稀释倍数以及标准品的活性值计算得到供试品的活性值。
本发明具有如下有益效果：
1、本发明针对神经生长因子缓释微球中蛋白药物活性易受影响的缺陷，采用冻干保护剂单独或与稳定剂协同作用，保持冻干、储存和释放过程中神经生长因子的二聚体形式，并进一步增强神经生长因子在冻干、储存和释放过程中的稳定性。本发明使蛋白二聚体含量在冻干、储存12个月后一直维持在99％以上；释放完全后，二聚体含量维持在90％以上，活性保持在80％以上。
2、本发明显著降低了稳定剂的含量，避免稳定剂过多对药物释放产生的不利影响，降低了突释，使释放更稳定，特别在释放后期极大提高了药物的活性：微球包埋率高于85％；24小时突释率低于13％，在相应释放周期内，释放稳定。同时在冻干和释放过程中，药物的二聚体形式得以维持，极大保持了药物的活性。
下面结合实施例对本发明做进一步描述，但本发明不限制于实施例中，凡依照本发明公开内容所做的本领域等同替换，均属于本发明的保护范围。
附图说明
图1为实施例1制备的神经生长因子缓释微球的电镜图
图2为实施例1制备的神经生长因子缓释微球体外释放曲线
图3为SEC-HPLC检测实施例1制备的缓释微球中神经生长因子聚集体含量
具体实施方式
以下实施例中使用的试剂和仪器：
神经生长因子：购于舒泰神(北京)生物制药股份有限公司
两嵌段两亲性聚合物：购于济南岱罡生物工程有限公司
激光粒度仪：购于英国马尔文公司
均质乳化剂：购于IKA(T18)
其余试剂：市售分析纯试剂
实施例1
一、处方
1、神经生长因子0.25mg；
2、两嵌段两亲性聚合物：分子量为10kDa的聚乳酸-羟基乙酸共聚物1g，聚乳酸和羟基乙酸的比例为50∶50；
3、稳定剂：无；
4、冻干保护剂：甘露醇0.1g；
二、制法
将2ml含有0.25mg神经生长因子的去离子水溶液作为内水相(W1)，将1g的分子量为10kDa的聚乳酸-羟基乙酸共聚物溶于10ml的二氯甲烷中，作为油相(O)。将内水相和油相混合，均质乳化得到W1/O型初乳液。将该初乳液倒入100ml的0.02g/ml聚乙烯醇水溶液中(W2)，10000rpm均质乳化形成W1/O/W2复乳液，再将该乳液室温搅拌挥发，经离心洗涤得到载药微球，再将所得的微球悬浮于5ml的0.02g/ml甘露醇溶液中，经冷冻干燥得到微球成品。
三、产品检测
1、产品外观测定：微球的平均粒径为25μm，跨度为1.011，包埋率为85.3％。
2、体外释放度测试：该微球的突释为10.3％，30天之内持续释放累积达到88.2％。
3、NGF蛋白二聚体的测定：用SEC-HPLC测量蛋白的含量，冻干后和4℃储存12个月后的二聚体含量分别为98.5％和96.7％。将释放30天的释放介质中的蛋白进行SEC-HPLC检测，二聚体含量为76.4％，活性为原蛋白药物的67.6％。
实施例2
一、处方
1、神经生长因子0.25mg；
2、两嵌段两亲性聚合物：分子量为10kDa的聚乳酸-羟基乙酸共聚物1g，聚乳酸和羟基乙酸的比例为50∶50；
3、稳定剂：人血清白蛋白5.0mg；
4、冻干保护剂：甘露醇0.1g；
二、制法
将2ml含有0.25mg神经生长因子和5.0mg人血清白蛋白的去离子水溶液作为内水相(W1)，将1g的分子量为10kDa的聚乳酸-羟基乙酸共聚物溶于10ml的二氯甲烷中，作为油相(O)。将内水相和油相混合，均质乳化得到W1/O型初乳液。将该初乳液倒入100ml的0.02g/ml聚乙烯醇水溶液中(W2)，10000rpm均质乳化形成W1/O/W2复乳液，再将该乳液室温搅拌挥发，经离心洗涤得到载药微球，再将所得的微球悬浮于5ml的0.02g/ml甘露醇溶液中，经冷冻干燥得到微球成品。
三、产品检测
1、产品外观测定
微球的体积平均粒径及分布用激光粒度仪测定。经检测，微球的平均粒径为25μm(图1)，跨度为0.978，包埋率为97.6％。
2、体外释放度测试：
准确称量50mg冻干微球，加入10ml pH 7.4的PBS缓冲液(10mM)。样品管置于37℃水浴恒温振荡器(100rpm)。定期离心分离，取出全部上清液，同时再补入10.0ml新鲜PBS缓冲液。上清蛋白含量用ELISA试剂盒测定。
根据体外释放的测定，该微球的突释为9.4％，30天持续释放累积达到92.2％(图2)。
3、NGF蛋白二聚体的测定：
将冻干后和4℃储存1个月，3个月，6个月和12个月的微球中的神经生长因子提取出，用SEC-HPLC测量蛋白的含量，二聚体含量一直保持99.5％(图3)。将释放30天的释放介质中的蛋白进行SEC-HPLC检测，二聚体含量为98.1％，经过细胞检测，其活性为原蛋白药物的95.2％。
实施例3
一、处方
1、神经生长因子0.25mg；
2、两嵌段两亲性聚合物：分子量为10kDa的聚乳酸-羟基乙酸共聚物1g，聚乳酸和羟基乙酸的比例为50∶50；
3、稳定剂：人血清白蛋白200.0mg；
4、冻干保护剂：甘露醇0.1g；
二、制法
将2ml含有0.25mg神经生长因子和200.0mg人血清白蛋白的去离子水溶液作为内水相(W1)，将1g的分子量为10kDa的聚乳酸-羟基乙酸共聚物溶于10ml的二氯甲烷中，作为油相(O)。将内水相和油相混合，均质乳化得到W1/O型初乳液。将该初乳液倒入100ml的0.02g/ml聚乙烯醇水溶液中(W2)，10000rpm均质乳化形成W1/O/W2复乳液，再将该乳液室温搅拌挥发，经离心洗涤得到载药微球，再将所得的微球悬浮于5ml的0.02g/ml甘露醇溶液中，经冷冻干燥得到微球成品。
三、产品检测
1、产品外观测定：微球的平均粒径为27μm，跨度为1.225，包埋率为75.2％。
2、体外释放度测试：该微球的突释为20.3％，30天之内持续释放累积达到75.2％。
3、NGF蛋白二聚体的测定：用SEC-HPLC测量蛋白的含量，冻干后和4℃储存12个月后，二聚体含量保持99.5％。将释放30天的释放介质中的蛋白进行SEC-HPLC检测，二聚体含量为95.1％，活性为原蛋白药物的91.1％。
实施例4
一、处方
1、神经生长因子0.25mg；
2、两嵌段两亲性聚合物：分子量为10kDa的聚乳酸-羟基乙酸共聚物1g，聚乳酸和羟基乙酸的比例为50∶50；
3、稳定剂：人血清白蛋白160.00mg
4、冻干保护剂：无；
二、制法
将2ml含有0.25mg神经生长因子和160.00mg人血清白蛋白的去离子水溶液作为内水相(W1)，将1g的分子量为10kDa的聚乳酸-羟基乙酸共聚物溶于10ml的二氯甲烷中，作为油相(O)。将内水相和油相混合，均质乳化得到W1/O型初乳液。将该初乳液倒入100ml的0.02g/ml聚乙烯醇水溶液中(W2)，10000rpm均质乳化形成W1/O/W2复乳液，再将该乳液室温搅拌挥发，经离心洗涤得到载药微球，再将所得的微球悬浮于去离子水溶液中，经冷冻干燥得到微球成品。
三、产品检测
1、产品外观测定：微球的平均粒径为25μm，跨度为1.425，包埋率为90.9％。
2、体外释放度测试：该微球的突释为17.3％，30天之内持续释放累积达到85.5％。
3、NGF蛋白二聚体的测定：用SEC-HPLC测量蛋白的含量，冻干后和4℃储存12个月后，二聚体含量保持89.4％和68.5％。将释放30天的释放介质中的蛋白进行SEC-HPLC检测，二聚体含量为82.5％，活性为原蛋白药物的75.1％。
实施例5
一、处方
1、神经生长因子0.25mg；
2、两嵌段两亲性聚合物：分子量为10kDa的聚乳酸-羟基乙酸共聚物1g，聚乳酸和羟基乙酸的比例为50∶50；
3、稳定剂：人血清白蛋白5.0mg；
4、冻干保护剂：无；
二、制法
将2ml含有0.25mg神经生长因子和5.0mg人血清白蛋白的去离子水溶液作为内水相(W1)，将1g的分子量为10kDa的聚乳酸-羟基乙酸共聚物溶于10ml的二氯甲烷中，作为油相(O)。将内水相和油相混合，均质乳化得到W1/O型初乳液。将该初乳液倒入100ml的0.02g/ml聚乙烯醇水溶液中(W2)，10000rpm均质乳化形成W1/O/W2复乳液，再将该乳液室温搅拌挥发，经离心洗涤得到载药微球，再将所得的微球悬浮于5ml去离子水中，经冷冻干燥得到微球成品。
三、产品检测
1、产品外观测定：微球的平均粒径为24μm，跨度为1.096，包埋率为94.6％。
2、体外释放度测试：该微球的突释为15.3％，30天之内持续释放累积达到77.6％。
3、NGF蛋白二聚体的测定：用SEC-HPLC测量蛋白的含量，冻干后和4℃储存12个月后的二聚体含量分别为89.3％和66.7％。将释放30天的释放介质中的蛋白进行SEC-HPLC检测，二聚体含量为52.0％，活性为原蛋白药物的42.4％。
以上实施例1～5的主要性能参数对比如表1所示：
表1：主要性能参数对比
由上表可知，添加冻干保护剂，可以降低突释率，稳定保持蛋白药物的二聚体含量；再结合添加低剂量的稳定剂，既可以降低突释率，稳定保持药物的而二聚体含量，还可以持久保持蛋白药物活性。
实施例1中，添加冻干保护剂，可以降低突释率，稳定保持4℃储存12个月后的二聚体含量，但释放30天后，蛋白的活性损失较大。
实施例2中，添加冻干保护剂，结合少量稳定剂的添加，可以稳定保持4℃储存12个月后的二聚体含量，释放30天后，蛋白活性保持为原蛋白药物活性的95.2％。
在实施例3中，较高剂量稳定剂的添加，虽然可以保持储存和释放阶段的二聚体含量及活性的稳定，但突释率极大升高，且积累释放率降低，表明微球的释放速率较慢，因此不利于体内药效学效果。
在实施例4中，没有冻干保护剂，虽然提高稳定剂的含量至正常剂量，但对冻干和储存条件下的活性保护不明显，仅仅稍微增强了释放后的活性。
在实施例5中，由于没有冻干保护剂，尽管有较低量稳定剂的存在，蛋白的活性在存储12个月后的二聚体含量急剧下降，效果较差，在释放30天后，活性也急剧降低。
实施例6
一、处方
1、神经生长因子0.47mg；
2、两嵌段两亲性聚合物：分子量为5kDa的聚乳酸1.5g；
3、稳定剂：PEG400，0.6g；
4、冻干保护剂：蔗糖5mg；
二、制法
将3ml含有0.47mg神经生长因子和0.6g PEG400的柠檬酸缓冲液作为内水相(W1)，将1.5g的分子量为5kDa的聚乳酸溶于3ml的二氯甲烷中，作为油相(O)。将内水相和油相混合，均质乳化得到W1/O型初乳液。将该初乳液倒入15ml的0.01g/ml聚乙烯醇水溶液中(W2)，10000rpm均质乳化形成W1/O/W2复乳液，再将该乳液室温搅拌挥发，经离心洗涤得到载药微球，再将所得的微球悬浮于5ml的0.001g/ml蔗糖溶液中，经冷冻干燥得到成品。
三、产品检测
1、产品外观测定：微球的平均粒径为30μm，跨度为1.668，包埋率为74.5％。
2、体外释放度测试：该微球的突释为25.2％，30天之内持续释放累积达到70.2％。
3、NGF蛋白二聚体的测定：用SEC-HPLC测量蛋白的含量，冻干后和4℃储存12个月后的二聚体含量分别为97.1％和91.5％。将释放30天的释放介质中的蛋白进行SEC-HPLC检测，二聚体含量为84.9％，活性为原蛋白药物的77.4％。
实施例7
一、处方
1、神经生长因子2mg；
2、两嵌段两亲性聚合物分子量为5kDa的聚乳酸1.5g；
3、稳定剂：牛血清白蛋白0.2mg；
4、冻干保护剂：乳糖0.150g
二、制法
将2ml含有2mg神经生长因子和0.2mg牛血清白蛋白的磷酸缓冲液作为内水相(W1)，将4g的分子量为40kDa的聚乳酸-聚乙二醇共聚物溶于20ml的乙酸乙酯中，作为油相(O)。将内水相和油相混合，均质乳化得到W1/O型初乳液。将该初乳液倒入100ml的0.05g/mlTween20(W2)，6000rpm均质乳化形成W1/O/W2乳液，再将该乳液倒入1L含有NaCl的萃取液中固化，经离心洗涤得到载药微球，再将所得的微球悬浮于5ml的0.03g/ml乳糖溶液中，经冷冻干燥得到成品。
三、产品检测
1、产品外观测定：微球的平均粒径为42μm，跨度为1.152，包埋率为93.6％。
2、体外释放度测试：该微球的突释为11.1％，60天之内持续释放累积达到90.2％。用SEC-HPLC测量蛋白的含量，冻干后和4℃储存12个月后的二聚体含量保持99.5％。3、NGF蛋白二聚体的测定：将释放60天的释放介质中的蛋白进行SEC-HPLC检测，二聚体含量为90.5％，活性为原蛋白药物的84.3％。
实施例8
一、处方
1、神经生长因子2mg；
2、两嵌段两亲性聚合物：分子量为40kDa的聚乳酸-聚乙二醇共聚物6g，聚乳酸-聚乙二醇共聚物中，聚乳酸和聚乙二醇的比例为20∶1；
3、稳定剂：牛血清白蛋白1mg；
4、冻干保护剂：乳糖0.15g；
二、制法
将2ml含有2mg神经生长因子和1mg牛血清白蛋白的磷酸缓冲液作为内水相(W1)，将6g的分子量为40kDa的聚乳酸-聚乙二醇共聚物溶于20ml的乙酸乙酯中，作为油相(O)。将内水相和油相混合，均质乳化得到W1/O型初乳液。将该初乳液倒入100ml的0.05g/mlTween20(W2)，6000rpm均质乳化形成W1/O/W2乳液，再将该乳液倒入1L含有NaCl的萃取液中固化，经离心洗涤得到载药微球，再将所得的微球悬浮于5ml的0.03g/ml乳糖溶液中，经冷冻干燥得到成品。
三、产品检测
1、产品外观测定：微球的平均粒径为45μm，跨度为1.124，包埋率为94.2％。
2、体外释放度测试：该微球的突释为9.2％，60天之内持续释放累积达到90.1％。用SEC-HPLC测量蛋白的含量，冻干后和4℃储存12个月后，二聚体含量保持99.5％。
3、NGF蛋白二聚体的测定：将释放60天的释放介质中的蛋白进行SEC-HPLC检测，二聚体含量为95.1％，活性为原蛋白药物的92.2％。
实施例9
一、处方
1、神经生长因子0.6mg；
2、两嵌段两亲性聚合物：分子量为80kDa的聚乳酸0.6g；
3、稳定剂：环糊精1mg；
4、冻干保护剂：海藻糖50mg；
二、制法
将2ml含有0.6mg神经生长因子和1mg环糊精的醋酸缓冲液作为内水相(W1)，将0.6g的分子量为80kDa的聚乳酸溶于4ml的二氯甲烷中，作为油相(O)。将内水相和油相混合，均质乳化得到W1/O型初乳液。将该初乳液倒入80ml的0.001g/ml十二烷基磺酸钠水溶液中(W2)，4000rpm均质乳化形成W1/O/W2乳液，再将该乳液室温搅拌挥发，经离心洗涤得到载药微球，再将所得的微球悬浮于5ml的0.01g/ml海藻糖溶液中，经冷冻干燥得到成品。
三、产品检测
1、产品外观测定：微球的平均粒径为61μm，跨度为1.891，包埋率为92.1％。
2、体外释放度测试：该微球的突释为5.2％，80天之内持续释放累积达到80.7％。用SEC-HPLC测量蛋白的含量，冻干后和4℃储存12个月后，二聚体含量保持99.5％。
3、NGF蛋白二聚体的测定：将释放80天的释放介质中的蛋白进行SEC-HPLC检测，二聚体含量为91.8％，活性为原蛋白药物的84.6％。
实施例10
一、处方
1、神经生长因子10mg；
2、两嵌段两亲性聚合物：分子量为80kDa的聚乳酸2g；
3、稳定剂：人血清白蛋白8mg，PEG40032mg；
4、冻干保护剂：甘露醇25mg；
二、制法
将2ml含有10mg神经生长因子和8mg人血清白蛋白和32mg PEG400的去离子水作为内水相(W1)，将2g的分子量为80kDa的聚乳酸溶于10ml的二氯甲烷中，作为油相(O)。将内水相和油相混合，均质乳化得到W1/O型初乳液。将该初乳液倒入80ml的0.005g/ml聚乙烯醇水溶液中(W2)，3000rpm均质乳化得到W1/O/W2乳液，再将该乳液室温搅拌挥发，经离心洗涤得到载药微球，再将所得的微球悬浮于5ml的0.005g/ml甘露醇溶液中，经冷冻干燥得到成品。
三、产品检测
1、产品外观测定：微球的平均粒径为80μm，跨度为1.158，包埋率为90.1％。
2、体外释放度测试：该微球的突释为2.7％，90天之内持续释放累积达到91.2％。用SEC-HPLC测量蛋白的含量，冻干后和4℃储存12个月后，二聚体含量保持99.5％。
3、NGF蛋白二聚体的测定：将释放90天的释放介质中的蛋白进行SEC-HPLC检测，二聚体含量为95.7％，活性为原蛋白药物的92.5％。
实施例11
一、处方
1、神经生长因子0.25mg；
2、两嵌段两亲性聚合物：分子量为10kDa的聚乳酸-羟基乙酸共聚物0.25g和10kDa的聚乳酸-聚乙二醇共聚物0.25g；聚乳酸-羟基乙酸共聚物中聚乳酸和羟基乙酸的比例为50∶50，聚乳酸-聚乙二醇共聚物中，聚乳酸和聚乙二醇的比例为5∶1)
3、稳定剂：人血清白蛋白5mg；
4、冻干保护剂：泊洛沙姆25mg；
二、制法
将2ml含有0.25mg神经生长因子和5mg人血清白蛋白的去离子水溶液作为内水相(W1)，将0.25g的分子量为10kDa的聚乳酸-羟基乙酸共聚物和0.25g的分子量为10kDa的聚乳酸-聚乙二醇共聚物溶于10ml的二氯甲烷中，作为油相(O)。将内水相和油相混合，均质乳化得到W1/O型初乳液。将该初乳液倒入50ml的0.05g/ml Tween80(W2)，10000rpm均质乳化形成W1/O/W2乳液，再将该乳液室温搅拌挥发，经离心洗涤得到载药微球，再将所得的微球悬浮于5ml的0.005g/ml泊洛沙姆溶液中，经冷冻干燥得到成品。
三、产品检测
1、产品外观测定：微球的平均粒径为20μm，跨度为1.218，包埋率为95.4％。
2、体外释放度测试：该微球的突释为12.2％，30天之内持续释放累积达到93.7％。用SEC-HPLC测量蛋白的含量，冻干后和4℃储存12个月后，二聚体含量保持99.5％。
3、NGF蛋白二聚体的测定：将释放30天的释放介质中的蛋白进行SEC-HPLC检测，二聚体含量为98.1％，活性为原蛋白药物的95.3％。
实施例12
一、处方
1、神经生长因子0.25mg；
2、两嵌段两亲性聚合物：分子量为10kDa的聚乳酸-羟基乙酸共聚物1g，聚乳酸-羟基乙酸共聚物中聚乳酸和羟基乙酸的比例为85∶15；
3、稳定剂：人血清白蛋白5mg；
4、冻干保护剂：甘露醇0.75mg；
二、制法
将2ml含有0.25mg神经生长因子和5.0mg人血清白蛋白的去离子水溶液作为内水相(W1)，将1g的分子量为10kDa的聚乳酸-羟基乙酸共聚物溶于10ml的二氯甲烷中，作为油相(O)。将内水相和油相混合，均质乳化得到W1/O型初乳液。将该初乳液倒入100ml的0.02g/ml聚乙烯醇水溶液中(W2)，10000rpm均质乳化形成W1/O/W2复乳液，再将该乳液室温搅拌挥发，经离心洗涤得到载药微球，再将所得的微球悬浮于5ml的0.15g/ml甘露醇溶液中，经冷冻干燥得到微球成品。
三、产品检测
1、产品外观测定：微球的平均粒径为22μm，跨度为1.331，包埋率为95.1％。
2、体外释放度测试：该微球的突释为5.1％，30天之内持续释放累积达到75.1％。用SEC-HPLC测量蛋白的含量，冻干后和4℃储存12个月后，二聚体含量保持99.5％。
3、NGF蛋白二聚体的测定：。将释放30天的释放介质中的蛋白进行SEC-HPLC检测，二聚体含量为96.9％，活性为原蛋白药物的91.4％。
实施例13
一、处方
1、神经生长因子40mg；
2、两嵌段两亲性聚合物：分子量为20kDa的聚乳酸3g；
3、稳定剂：人血清白蛋白100mg；
4、冻干保护剂：蔗糖50mg；
二、制法
将2ml含有40mg神经生长因子和100mg人血清白蛋白的去离子水作为内水相(W1)，将3g的分子量为20kDa的聚乳酸溶于10ml的二氯甲烷中，作为油相(O)。将内水相和油相混合，均质乳化得到W1/O型初乳液。将该初乳液倒入80ml的0.005g/ml聚乙烯醇水溶液中(W2)，3000rpm均质乳化得到W1/O/W2乳液，再将该乳液室温搅拌挥发，经离心洗涤得到载药微球，再将所得的微球悬浮于5ml的0.01g/ml蔗糖溶液中，经冷冻干燥得到成品。
三、产品检测
1、产品外观测定：微球的平均粒径为80μm，跨度为1.127，包埋率为91.5％。
2、体外释放度测试：该微球的突释为5.6％，90天之内持续释放累积达到95.6％。用SEC-HPLC测量蛋白的含量，冻干后和4℃储存12个月后，二聚体含量保持99.5％。
3、NGF蛋白二聚体的测定：将释放90天的释放介质中的蛋白进行SEC-HPLC检测，二聚体含量为95.5％，活性为原蛋白药物的91.8％。

Claims (11)

1.神经生长因子缓释微球制剂，其特征在于：由以下重量百分比含量的成份组成：神经生长因子0.02～1.26％，两嵌段两亲性聚合物90.00～98.00％，稳定剂0.015～3.14％，冻干保护剂1.21～9.05％；所述两嵌段两亲性聚合物的分子量为10,000～40,000道尔顿；稳定剂选自人血清白蛋白、牛血清白蛋白、羧甲基葡聚糖、环糊精或聚乙二醇中的一种或多种；冻干保护剂选自蔗糖、甘露醇、海藻糖、泊洛沙姆或乳糖中的一种或多种；
所述的神经生长因子缓释微球制剂的制备方法，包括以下步骤：
1)将含神经生长因子和稳定剂的水相作为内水相W1，将两嵌段两亲性聚合物材料溶于有机溶剂中，形成油相O；将这两相混合均质乳化制备W1/O初乳液；
2)将步骤1)所得W1/O初乳液加入到含有表面活性剂的外水相W2中，再用一定的转速均质体系形成W1/O/W2复乳液；
3)将步骤2)所得W1/O/W2复乳液通过室温搅拌挥发或将其倒入含有NaCl的萃取液去除有机溶剂，再将微球离心、洗涤；
4)将步骤3)所得的微球悬浮于含有冻干保护剂的水溶液中，经过冷冻干燥后，得到神经生长因子缓释微球制剂。
2.根据权利要求1所述的神经生长因子缓释微球制剂，其特征在于：所述两嵌段两亲性聚合物选自聚乳酸、聚乳酸-羟基乙酸共聚物、聚乳酸-聚乙二醇共聚物中的一种或多种。
3.根据权利要求2所述的神经生长因子缓释微球制剂，其特征在于：所述聚乳酸-羟基乙酸共聚物中聚乳酸和羟基乙酸的比例为50：50～85：15；聚乳酸-聚乙二醇共聚物中，聚乳酸和聚乙二醇的比例为5:1～20:1。
4.根据权利要求1～3中任何一项所述的神经生长因子缓释微球制剂，其特征在于：所述稳定剂聚乙二醇为聚乙二醇400、聚乙二醇600、聚乙二醇800、聚乙二醇1000、聚乙二醇2000或聚乙二醇4000。
5.根据权利要求4所述的神经生长因子缓释微球制剂，其特征在于：所述神经生长因子为鼠源性神经生长因子、人源性神经生长因子或重组人神经生长因子。
6.根据权利要求5所述的神经生长因子缓释微球制剂，其特征在于：所述神经生长因子缓释微球制剂的平均粒径为1～100微米。
7.根据权利要求6所述的神经生长因子缓释微球制剂，其特征在于：所述神经生长因子缓释微球制剂的平均粒径为20～80微米。
8.根据权利要求1-3、5-7任一项所述的神经生长因子缓释微球制剂，其特征在于：所述神经生长因子缓释微球制剂的制备方法中步骤1)中的内水相选自去离子水、柠檬酸缓冲液、醋酸缓冲液、磷酸缓冲液中的一种；有机溶剂选自二氯甲烷、三氯甲烷、二甲苯、甲苯、乙酸乙酯、丙酮中的任意一种或至少两种的混合物，稳定剂浓度为0～0.20g/ml，内水相W1与油相O的体积比为1：1～1：15；步骤2)中的表面活性剂选自聚乙烯醇、聚山梨酯Tween 80、聚山梨酯Tween 20或十二烷基磺酸钠，表面活性剂浓度为0.001～0.10g/ml，油相O与外水相W2的体积比1：2～1：25；步骤4)中冻干保护剂浓度为0.001～0.15g/ml。
9.根据权利要求4所述的神经生长因子缓释微球制剂，其特征在于：所述神经生长因子缓释微球制剂的制备方法中步骤1)中的内水相选自去离子水、柠檬酸缓冲液、醋酸缓冲液、磷酸缓冲液中的一种；有机溶剂选自二氯甲烷、三氯甲烷、二甲苯、甲苯、乙酸乙酯、丙酮中的任意一种或至少两种的混合物，稳定剂浓度为0～0.20g/ml，内水相W1与油相O的体积比为1：1～1：15；步骤2)中的表面活性剂选自聚乙烯醇、聚山梨酯Tween 80、聚山梨酯Tween20或十二烷基磺酸钠，表面活性剂浓度为0.001～0.10g/ml，油相O与外水相W2的体积比1：2～1：25；步骤4)中冻干保护剂浓度为0.001～0.15g/ml。
10.根据权利要求8所述的神经生长因子缓释微球制剂，其特征在于：所述步骤1)中稳定剂浓度为0.0005～0.05g/ml，所述内水相W1和油相O的体积比为1：2～1：10；步骤2)中表面活性剂的浓度为0.002～0.05g/ml，油相O与外水相W2的体积比1：5～1：20；步骤4)中冻干保护剂浓度为0.005～0.03g/ml。
11.根据权利要求9所述的神经生长因子缓释微球制剂，其特征在于：所述步骤1)中稳定剂浓度为0.0005～0.05g/ml，所述内水相W1和油相O的体积比为1：2～1：10；步骤2)中表面活性剂的浓度为0.002～0.05g/ml，油相O与外水相W2的体积比1：5～1：20；步骤4)中冻干保护剂浓度为0.005～0.03g/ml。
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