JPH07151758A - 光化学反応による抗生物質の担体への固定化方法とその担体を用いたlpsおよび微生物の捕捉方法および定量方法。 - Google Patents
光化学反応による抗生物質の担体への固定化方法とその担体を用いたlpsおよび微生物の捕捉方法および定量方法。Info
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- JPH07151758A JPH07151758A JP16726493A JP16726493A JPH07151758A JP H07151758 A JPH07151758 A JP H07151758A JP 16726493 A JP16726493 A JP 16726493A JP 16726493 A JP16726493 A JP 16726493A JP H07151758 A JPH07151758 A JP H07151758A
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Abstract
(57)【要約】
【目的】1)光化学反応による担体への抗生物質の固定
化方法と、当該担体を用いた LPSおよび微生物の定
量方法を提供する。 2)当該担体を用いたLPSの吸着除去方法を提供す
る。 3)生理活性物質に対する標識方法を提供する。 【構成】光反応により抗生物質を固定化させた水不溶性
担体、および定量試薬からなる。
化方法と、当該担体を用いた LPSおよび微生物の定
量方法を提供する。 2)当該担体を用いたLPSの吸着除去方法を提供す
る。 3)生理活性物質に対する標識方法を提供する。 【構成】光反応により抗生物質を固定化させた水不溶性
担体、および定量試薬からなる。
Description
【0001】
【産業上の利用分野】本発明は、 1)光化学反応による担体への抗生物質の固定化方法
と、当該担体を用いたLPSおよび微生物の定量方法。 2) 当該担体を用いたLPSの吸着除去方法。 3)生理活性物質に対する標識方法。 に関する。
と、当該担体を用いたLPSおよび微生物の定量方法。 2) 当該担体を用いたLPSの吸着除去方法。 3)生理活性物質に対する標識方法。 に関する。
【0002】
【従来の技術】従来、血液や蛋白溶液中のLPS(リポ
ポリサッカライド)の定量は、過塩素酸処理後、発色合
成基質を用いる方法が一般的だった。同方法では、一般
に測定値が低くなる傾向があると考えられている。本発
明の発明者らは既に、グルタルアルデヒドやペプチド結
合を介して、抗生物質を共有結合させた担体を用いてL
PSを定量する方法を発明、出願に及んだ(特願平3−
169479)。同発明の出願の後、ポリミキシンBを
結合させたアフィニティー担体や、ヘキサメチレンジア
ミンをスペーサーとしてヒスチジンを結合させたアフィ
ニティー担体を定量に用いる方法が考案された。
ポリサッカライド)の定量は、過塩素酸処理後、発色合
成基質を用いる方法が一般的だった。同方法では、一般
に測定値が低くなる傾向があると考えられている。本発
明の発明者らは既に、グルタルアルデヒドやペプチド結
合を介して、抗生物質を共有結合させた担体を用いてL
PSを定量する方法を発明、出願に及んだ(特願平3−
169479)。同発明の出願の後、ポリミキシンBを
結合させたアフィニティー担体や、ヘキサメチレンジア
ミンをスペーサーとしてヒスチジンを結合させたアフィ
ニティー担体を定量に用いる方法が考案された。
【0003】
【発明が解決しようとする問題点】これらの定量方法に
は、 1)ポリミキシンBを結合させたアフィニティー担体
や、ヘキサメチレンジアミンをスペーサーとしてヒスチ
ジンを結合させた、アフィニティー担体を定量に用いる
方法は操作が煩雑である。 2)グルタルアルデヒドやペプチド結合を介して、抗生
物質を共有結合させた担体を用いる方法は、測定操作は
簡単で測定値も極めて正確であるが、担体の調製操作が
煩雑(リガンドの担体への結合条件決定が難しい)であ
る。 等の欠点がある。
は、 1)ポリミキシンBを結合させたアフィニティー担体
や、ヘキサメチレンジアミンをスペーサーとしてヒスチ
ジンを結合させた、アフィニティー担体を定量に用いる
方法は操作が煩雑である。 2)グルタルアルデヒドやペプチド結合を介して、抗生
物質を共有結合させた担体を用いる方法は、測定操作は
簡単で測定値も極めて正確であるが、担体の調製操作が
煩雑(リガンドの担体への結合条件決定が難しい)であ
る。 等の欠点がある。
【0004】
【課題を解決するための手段】前記の様に、本発明の発
明者らは既に、グルタルアルデヒドやペプチド結合を介
して、抗生物質を共有結合させた担体を用いてLPS
を定量する方法を発明、出願に及んだ(特願平3−16
9479)。一方、フェニルアジド基は、紫外線照射に
より高反応性の中間体であるナイトレンを経由し、近傍
の炭素等と共有結合することが知られている。また、0
−ニトロベンジルエステルは、紫外光照射によって分解
して、カルボキシル基を生成することが知られている
(吉本薫:フォトポリマーハソドブック:工業調査会1
989)。また、人工臓器に生体適合性を付与する方法
として、材料表面の改質方法(特願、平 2−2065
73)が知られている。同方法は、デバイスの表面にア
ジド基を介して、アルブミン等の蛋白質を共有結合させ
ることにより、生体適合性を付与する方法である。
明者らは既に、グルタルアルデヒドやペプチド結合を介
して、抗生物質を共有結合させた担体を用いてLPS
を定量する方法を発明、出願に及んだ(特願平3−16
9479)。一方、フェニルアジド基は、紫外線照射に
より高反応性の中間体であるナイトレンを経由し、近傍
の炭素等と共有結合することが知られている。また、0
−ニトロベンジルエステルは、紫外光照射によって分解
して、カルボキシル基を生成することが知られている
(吉本薫:フォトポリマーハソドブック:工業調査会1
989)。また、人工臓器に生体適合性を付与する方法
として、材料表面の改質方法(特願、平 2−2065
73)が知られている。同方法は、デバイスの表面にア
ジド基を介して、アルブミン等の蛋白質を共有結合させ
ることにより、生体適合性を付与する方法である。
【0005】本発明の発明者は、このフェニルアジド基
の紫外線照射法を、前記のアフィニティー担体を用い
て、被検検体を捕捉した後、標識抗体や発色基質を用い
て定量する方法に応用することを考案した。即ち、本発
明の発明者は、LPSのリガンドである抗生物質の固定
化について鋭意検討した結果、 a)不溶性担体の表面にアジド基を有するポリマー等を
塗布した後被固定化抗生物質を塗布し、更に、光を照射
することことからなる抗生物質の固定化方法。 b)0−ニトロベンジルエステルを不溶性担体の表面に
塗布、光照射した後、当該担体を水溶性カルボジイミド
を溶解した緩衝液に浸漬し、更に、抗生物質を溶解した
緩衝液に浸漬することを特徴とする抗生物質の固定化方
法 c)リン酸緩衝液中でp−azidobenzoylo
xy succinimideと反応させることによ
り、フェニルアジド基を導入した抗生物質を被固定化担
体に塗布した後、更に、光を照射することことからなる
抗生物質の固定化方法。を用いて調製した担体を用いて
LPSを定量する方法がきわめて有効であることを発見
し、発明に及んだ。本発明は、LPSの定量の為に考案
されたが、当該担体は細菌を捕捉することも可能であ
り、従って、細菌の検出にも適用することができる。本
発明を用いた細菌の検出方法は、DNAプローブ法と比
較して操作が簡単で、検出迄の時間も極めて短時間であ
るという長所がある。また、本発明により、特異抗体等
の生理活性物質に、パーオキシダーゼや蛍光物質を標識
することが可能である。
の紫外線照射法を、前記のアフィニティー担体を用い
て、被検検体を捕捉した後、標識抗体や発色基質を用い
て定量する方法に応用することを考案した。即ち、本発
明の発明者は、LPSのリガンドである抗生物質の固定
化について鋭意検討した結果、 a)不溶性担体の表面にアジド基を有するポリマー等を
塗布した後被固定化抗生物質を塗布し、更に、光を照射
することことからなる抗生物質の固定化方法。 b)0−ニトロベンジルエステルを不溶性担体の表面に
塗布、光照射した後、当該担体を水溶性カルボジイミド
を溶解した緩衝液に浸漬し、更に、抗生物質を溶解した
緩衝液に浸漬することを特徴とする抗生物質の固定化方
法 c)リン酸緩衝液中でp−azidobenzoylo
xy succinimideと反応させることによ
り、フェニルアジド基を導入した抗生物質を被固定化担
体に塗布した後、更に、光を照射することことからなる
抗生物質の固定化方法。を用いて調製した担体を用いて
LPSを定量する方法がきわめて有効であることを発見
し、発明に及んだ。本発明は、LPSの定量の為に考案
されたが、当該担体は細菌を捕捉することも可能であ
り、従って、細菌の検出にも適用することができる。本
発明を用いた細菌の検出方法は、DNAプローブ法と比
較して操作が簡単で、検出迄の時間も極めて短時間であ
るという長所がある。また、本発明により、特異抗体等
の生理活性物質に、パーオキシダーゼや蛍光物質を標識
することが可能である。
【0006】本発明に関わる抗生物質としては、LPS
の検出の為には、ポリミキシンB、コリスチン等のペプ
チド系抗生物質や、アミノグリコシド系抗生物質が考え
られる。細菌の検出の為には、グラム陽性菌に有効な抗
生物質およびグラム陰性菌に有効な抗生物質を、別個に
共有結合した担体を用いる必要がある。従って、本発明
に於ける抗生物質とは、抗生物質全体を指し、特にある
種類のものに限定されるものではない。すなわち、ウイ
ルスの検出の為には、抗ウイルス剤を固定化した担体を
使用すればよい。本発明に関わる不溶性担体とは、アフ
ィニティーゲル、ビーズ、マイクロプレート、ストリッ
プ、フィルム等の実験器具。多孔性ビーズ、多孔性中空
糸、繊維、織布、不織布等の担体、更にカテーテル、人
工血管等の医療用具が考えられるが、これらには、何
等、限定されるものではない。特に多孔性ビーズ、多孔
性中空糸等の担体を用いることにより、医薬品、蛋白製
剤、血液等からLPSを吸着除去することが可能にな
る。また、グリコペプチド系抗生物質を固定化したカテ
ーテルを用いることにより、MRSA等の細菌感染を防
止することが可能になる。更にまた、本発明によれば、
酵素を標識した特異抗体や蛍光標識した生理活性物質等
の調製が容易になる。
の検出の為には、ポリミキシンB、コリスチン等のペプ
チド系抗生物質や、アミノグリコシド系抗生物質が考え
られる。細菌の検出の為には、グラム陽性菌に有効な抗
生物質およびグラム陰性菌に有効な抗生物質を、別個に
共有結合した担体を用いる必要がある。従って、本発明
に於ける抗生物質とは、抗生物質全体を指し、特にある
種類のものに限定されるものではない。すなわち、ウイ
ルスの検出の為には、抗ウイルス剤を固定化した担体を
使用すればよい。本発明に関わる不溶性担体とは、アフ
ィニティーゲル、ビーズ、マイクロプレート、ストリッ
プ、フィルム等の実験器具。多孔性ビーズ、多孔性中空
糸、繊維、織布、不織布等の担体、更にカテーテル、人
工血管等の医療用具が考えられるが、これらには、何
等、限定されるものではない。特に多孔性ビーズ、多孔
性中空糸等の担体を用いることにより、医薬品、蛋白製
剤、血液等からLPSを吸着除去することが可能にな
る。また、グリコペプチド系抗生物質を固定化したカテ
ーテルを用いることにより、MRSA等の細菌感染を防
止することが可能になる。更にまた、本発明によれば、
酵素を標識した特異抗体や蛍光標識した生理活性物質等
の調製が容易になる。
【0007】
【発明の効果】本発明は、 a)不溶性担体の表面にアジド基を有するポリマー等を
塗布した後被固定化抗生物質を塗布し、更に、光を照射
することことからなる抗生物質の固定化方法。 b)0−ニトロベンジルエステルを不溶性担体の表面に
塗布、光照射した後、当該担体を水溶性カルボジイミド
を溶解した緩衝液に浸漬し、更に、抗生物質を溶解した
緩衝液に浸漬することを特徴とする抗生物質の固定化方
法。 c)リン酸緩衝液中でp−azidobenzoylo
xy succinimideと反応させることによ
り、フェニルアジド基を導入した抗生物質を被固定化担
体に塗布した後、更に、光を照射することことからなる
抗生物質の固定化方法。を用しいて調製した担体を用い
てLPSを定量する方法、LPSを吸着除去する方法、
微生物を検出する方法、生理活性物質に標識する方法に
関する。本発明に関わる固定化方法により、抗生物質の
活性を失うことなく、抗生物質を容易に、堅固に固定化
することが可能になる。また、本発明により、LPSの
定量および細菌の検出が容易になる。更に本発明によ
り、医療用具、中空糸膜酵素(蛍光)標識抗体の新規調
製方法が実現される。
塗布した後被固定化抗生物質を塗布し、更に、光を照射
することことからなる抗生物質の固定化方法。 b)0−ニトロベンジルエステルを不溶性担体の表面に
塗布、光照射した後、当該担体を水溶性カルボジイミド
を溶解した緩衝液に浸漬し、更に、抗生物質を溶解した
緩衝液に浸漬することを特徴とする抗生物質の固定化方
法。 c)リン酸緩衝液中でp−azidobenzoylo
xy succinimideと反応させることによ
り、フェニルアジド基を導入した抗生物質を被固定化担
体に塗布した後、更に、光を照射することことからなる
抗生物質の固定化方法。を用しいて調製した担体を用い
てLPSを定量する方法、LPSを吸着除去する方法、
微生物を検出する方法、生理活性物質に標識する方法に
関する。本発明に関わる固定化方法により、抗生物質の
活性を失うことなく、抗生物質を容易に、堅固に固定化
することが可能になる。また、本発明により、LPSの
定量および細菌の検出が容易になる。更に本発明によ
り、医療用具、中空糸膜酵素(蛍光)標識抗体の新規調
製方法が実現される。
【0008】
【実施例】本発明を実施例により更に詳細に説明する。
本発明は実施例により、何ら限定されるものではない。
本発明は実施例により、何ら限定されるものではない。
【0009】《実施例1.》 i)アジドスチレンの合成 エタノール−濃塩酸混液20mlに、3−ニトロスチレ
ン5gを懸濁させ、更に、エタノールに溶解したSnC
l32H2O溶液を激しく攪拌しながら添加し、室温で
一夜、反応させた。NaOHにより中和し、固体成分を
濾別し、濾液より生成物をエーテル抽出した。エーテル
層をMgSO4で乾燥した後、濃硫酸を加え、中間体を
得た。同中間体を10%硫酸溶液10mlに溶解氷冷
し、1NのNaNO2水溶液を添加した。2時間後に、
NaN3水溶液を添加し、室温に戻した後、3時間攪拌
した。酢酸エチルにより抽出し、抽出液を0.1N N
aHCO3水溶液と精製水で洗浄し、MgSO4を添加
し、乾燥した。溶媒を留去し、クロロホルム/ヘキサン
(1/4)混合溶媒に溶解し、シリカゲルカラムで精製
した。溶媒を留去し、3−アジドスチレンを得た。 ii) アジドスチレン−スチレン共重合体の合成 アジドスチレン1モルとスチレン4モルとをベンゼンで
5倍に希釈し、0.01当量のN,N−アゾビスイソブ
チロニトリル(AIBN)を添加、脱気、封管し、60
℃で4時間重合した。放冷後、メタノール中に注ぎ、沈
殿したアジドスチレン−スチレン共重合体を回収した。
得られた共重合体の数平均分子量は、10万であった。 iii)コリスチン固定化PETフィルムの調製 前記方法により合成したアジドスチレン−スチレン共重
合体をアセトンに溶解し、1%溶液を調製した。この溶
液20ulを1cm2のポリエチレンテレフタレート
(PET)フィルムの両面に塗布、乾燥し、アジドスチ
レン−スチレン共重合体の皮膜を形成した。リン酸緩衝
液に1%の割合で溶解したコリスチン溶液に、前記処理
をしたPETフィルムを1時間浸漬し、コリスチンを吸
着させ、高圧水銀灯を用いて、紫外線を1分間照射し
た。次に、当該PETフィルムを精製水で水洗、乾燥し
た。
ン5gを懸濁させ、更に、エタノールに溶解したSnC
l32H2O溶液を激しく攪拌しながら添加し、室温で
一夜、反応させた。NaOHにより中和し、固体成分を
濾別し、濾液より生成物をエーテル抽出した。エーテル
層をMgSO4で乾燥した後、濃硫酸を加え、中間体を
得た。同中間体を10%硫酸溶液10mlに溶解氷冷
し、1NのNaNO2水溶液を添加した。2時間後に、
NaN3水溶液を添加し、室温に戻した後、3時間攪拌
した。酢酸エチルにより抽出し、抽出液を0.1N N
aHCO3水溶液と精製水で洗浄し、MgSO4を添加
し、乾燥した。溶媒を留去し、クロロホルム/ヘキサン
(1/4)混合溶媒に溶解し、シリカゲルカラムで精製
した。溶媒を留去し、3−アジドスチレンを得た。 ii) アジドスチレン−スチレン共重合体の合成 アジドスチレン1モルとスチレン4モルとをベンゼンで
5倍に希釈し、0.01当量のN,N−アゾビスイソブ
チロニトリル(AIBN)を添加、脱気、封管し、60
℃で4時間重合した。放冷後、メタノール中に注ぎ、沈
殿したアジドスチレン−スチレン共重合体を回収した。
得られた共重合体の数平均分子量は、10万であった。 iii)コリスチン固定化PETフィルムの調製 前記方法により合成したアジドスチレン−スチレン共重
合体をアセトンに溶解し、1%溶液を調製した。この溶
液20ulを1cm2のポリエチレンテレフタレート
(PET)フィルムの両面に塗布、乾燥し、アジドスチ
レン−スチレン共重合体の皮膜を形成した。リン酸緩衝
液に1%の割合で溶解したコリスチン溶液に、前記処理
をしたPETフィルムを1時間浸漬し、コリスチンを吸
着させ、高圧水銀灯を用いて、紫外線を1分間照射し
た。次に、当該PETフィルムを精製水で水洗、乾燥し
た。
【0010】《実施例2,》 コリスチン固定化PETフィルムを用いた LPSの定
量 実施例1.で調整したコリスチン固定化PETフィルム
1枚を1N NaOHで洗浄し、更に、パイロジェンフ
リーの精製水で充分に洗浄、乾燥し、パイロジェンフリ
ーの試験管に入れた。次に、LPS含有IgG溶液1m
lを当該試験管に取り、37℃で30分間反応、吸着さ
せた。次に、試験管に添加したIgG溶液を無菌的に吸
引除去した。次に、当該試験管にパイロジェンフリーの
精製水を添加、攪拌、吸引除去する操作を3回行ない、
コリスチン固定化PETフィルムを充分に洗浄した。L
PS定量用LAL試薬(生化学工業製)0.5mlを分
注したパイロジェンフリーの試験管に、前記操作を行な
ったPETフィルムを入れ,37℃で30分間反応させ
た。30分後、反応停止液2mlを添加し反応を停正さ
せた。引き続いて、同溶液について405nmの吸光度
を測定した。標準LPSを用いて同一操作を行ない、描
いた検量線からLPS値を求めた。
量 実施例1.で調整したコリスチン固定化PETフィルム
1枚を1N NaOHで洗浄し、更に、パイロジェンフ
リーの精製水で充分に洗浄、乾燥し、パイロジェンフリ
ーの試験管に入れた。次に、LPS含有IgG溶液1m
lを当該試験管に取り、37℃で30分間反応、吸着さ
せた。次に、試験管に添加したIgG溶液を無菌的に吸
引除去した。次に、当該試験管にパイロジェンフリーの
精製水を添加、攪拌、吸引除去する操作を3回行ない、
コリスチン固定化PETフィルムを充分に洗浄した。L
PS定量用LAL試薬(生化学工業製)0.5mlを分
注したパイロジェンフリーの試験管に、前記操作を行な
ったPETフィルムを入れ,37℃で30分間反応させ
た。30分後、反応停止液2mlを添加し反応を停正さ
せた。引き続いて、同溶液について405nmの吸光度
を測定した。標準LPSを用いて同一操作を行ない、描
いた検量線からLPS値を求めた。
【0011】《実施例3》 i)アジドベンゾイルオキシエチルメタクリレートの合
成 N,N−ジメチルホルムアミド(DMF)100ml
にp−アジド安息香酸10gを溶解、氷冷し、トリエチ
ルアミン8.5mlを添加し、更に、クロロ蟻酸イソブ
チル8.3mlを添加した。次に、DMF300mlに
ヒドロキシエチルメタクリレート5.2mlを溶解し、
前記溶液に添加し、60℃で5時間攪拌した。溶媒を留
去し、酢酸エチルを添加、抽出し、10%クエン酸水溶
液、精製水、4%NaHCO3水溶液で順次洗浄し、無
水NaSO4を添加、乾燥した。溶媒を留去した後、ク
ロロホルムに溶解し、シリカゲルカラムで精製した。溶
媒を留去し、アジドベンソゾイルオキシエチルメタクリ
レートを得た。 ii)アジドベンゾイルオキシエチルメタクリレート−
メチルメタクリレート共重合体の合成 前記方法により合成したアジドベンゾイルオキシエチル
メタクリレート 1molとメチルメタクリレート4
molとをDMF で2倍に希釈し、0.01等量のA
IBNを添加、脱気、封管し、60℃で3時間重合し
た。冷却後、大量のエチルエーテルに注ぎ、沈殿したア
ジドベンゾイルオキシエチルメタクリレート−メチルメ
タクリレート重合体を得た。得られた共重合体の数平均
分子量は15万であった。 iii)ポリミキシンB固定化マイクロプレートの調製 前記方法により合成したアジドベンゾイルオキシエチル
メタクリレート−メチルメタクリレート共重合体をアセ
トンに溶解し、1%溶液を調製した。この溶液各30u
lをマイクロプレートの1穴に塗布、乾燥し、アジドベ
ンゾイルオキシエチルメタクリレート−メチルメタクリ
レート共重合体の皮膜を形成した。前記処理をしたマイ
クロプレートの各穴に、リン酸緩衝液に1%の割合で溶
解したポリミキシンB溶液200ulを添加し、ポリミ
キシンBを吸着させ、高圧水銀灯を用いて、紫外線を1
分間照射した。次に、当該PETフィルムを精製水で水
洗、乾燥した。
成 N,N−ジメチルホルムアミド(DMF)100ml
にp−アジド安息香酸10gを溶解、氷冷し、トリエチ
ルアミン8.5mlを添加し、更に、クロロ蟻酸イソブ
チル8.3mlを添加した。次に、DMF300mlに
ヒドロキシエチルメタクリレート5.2mlを溶解し、
前記溶液に添加し、60℃で5時間攪拌した。溶媒を留
去し、酢酸エチルを添加、抽出し、10%クエン酸水溶
液、精製水、4%NaHCO3水溶液で順次洗浄し、無
水NaSO4を添加、乾燥した。溶媒を留去した後、ク
ロロホルムに溶解し、シリカゲルカラムで精製した。溶
媒を留去し、アジドベンソゾイルオキシエチルメタクリ
レートを得た。 ii)アジドベンゾイルオキシエチルメタクリレート−
メチルメタクリレート共重合体の合成 前記方法により合成したアジドベンゾイルオキシエチル
メタクリレート 1molとメチルメタクリレート4
molとをDMF で2倍に希釈し、0.01等量のA
IBNを添加、脱気、封管し、60℃で3時間重合し
た。冷却後、大量のエチルエーテルに注ぎ、沈殿したア
ジドベンゾイルオキシエチルメタクリレート−メチルメ
タクリレート重合体を得た。得られた共重合体の数平均
分子量は15万であった。 iii)ポリミキシンB固定化マイクロプレートの調製 前記方法により合成したアジドベンゾイルオキシエチル
メタクリレート−メチルメタクリレート共重合体をアセ
トンに溶解し、1%溶液を調製した。この溶液各30u
lをマイクロプレートの1穴に塗布、乾燥し、アジドベ
ンゾイルオキシエチルメタクリレート−メチルメタクリ
レート共重合体の皮膜を形成した。前記処理をしたマイ
クロプレートの各穴に、リン酸緩衝液に1%の割合で溶
解したポリミキシンB溶液200ulを添加し、ポリミ
キシンBを吸着させ、高圧水銀灯を用いて、紫外線を1
分間照射した。次に、当該PETフィルムを精製水で水
洗、乾燥した。
【0012】《実施例4,》 LPSの定量 実施例3.で調製したポリミキシンB固定化マイクロプ
レートを用いて、LPSの定量を行なった。すなわち、
ポリミキシンB固定化マイクロプレートの各穴に、被検
検体200ulを分取し、37℃で30分間反応させ
た。次に、マイクロプレートの各穴をリソ酸緩衝液20
0ulで3回洗浄した。次に、マイクロプレートの各穴
にLAL試液200ulを分注し、37℃で30分間反
応させた。30分後、マイクロプレートの各穴に反応停
止液100ulを分注し、反応を停止した。プレートリ
ーダーにより、各穴の吸光度を測定した。標準LPSを
用いて同様の操作を行ない、検量線を描きLPS値を求
めた。
レートを用いて、LPSの定量を行なった。すなわち、
ポリミキシンB固定化マイクロプレートの各穴に、被検
検体200ulを分取し、37℃で30分間反応させ
た。次に、マイクロプレートの各穴をリソ酸緩衝液20
0ulで3回洗浄した。次に、マイクロプレートの各穴
にLAL試液200ulを分注し、37℃で30分間反
応させた。30分後、マイクロプレートの各穴に反応停
止液100ulを分注し、反応を停止した。プレートリ
ーダーにより、各穴の吸光度を測定した。標準LPSを
用いて同様の操作を行ない、検量線を描きLPS値を求
めた。
【0013】《実施例5.》 アミカシン固定化マイクロプレートの調製 ラジカル重合により、2−(4−アジドベンゾイルオキ
シ)エチルメタクリレート:スチレン:o−ニロベンジ
ルアクリレートの三元共重合体(仕込モル比3:6:1
(以下 PASN)を合成した。マイクロプレートの各
穴に、前記PASNを塗布、薄膜を形成した後、紫外線
を照射した。次にマイクロプレートの各穴に、水溶性カ
ルボジイミドを含有するリン酸緩衝液100ulを添加
し、37℃で30分間反応させた。続いて2%のアミカ
シソを含有するリン酸緩衝液100ulを添加し、37
℃で8時間反応させた。次にマイクロプレートの各穴を
1MのNaCl水溶液およびリン酸緩衝液で洗浄した。
シ)エチルメタクリレート:スチレン:o−ニロベンジ
ルアクリレートの三元共重合体(仕込モル比3:6:1
(以下 PASN)を合成した。マイクロプレートの各
穴に、前記PASNを塗布、薄膜を形成した後、紫外線
を照射した。次にマイクロプレートの各穴に、水溶性カ
ルボジイミドを含有するリン酸緩衝液100ulを添加
し、37℃で30分間反応させた。続いて2%のアミカ
シソを含有するリン酸緩衝液100ulを添加し、37
℃で8時間反応させた。次にマイクロプレートの各穴を
1MのNaCl水溶液およびリン酸緩衝液で洗浄した。
【0014】《実施例6.》 ) LPSの定量 実施例6で調製したマイクロプレートの各穴を1NのN
aOH溶液で処理した後、パイロジェンフリーの精製水
で充分に洗浄し、無菌的に乾燥した。当該マイクロプレ
ートの各穴にパイロジェン測定用ヒト血清(無菌的に調
製)200ulを無菌的に分取し、37℃で30分間反
応させた。30分後にヒト血清を吸引除去し、マイクロ
プレートの各穴をリン酸緩衝液200ulで3回無菌的
に洗浄した。次に、マイクロプレートの各穴にLAL試
薬(生化学工業製)200ulを添加し、37℃で30
分間反応させた。30分後に反応停止液を添加し、プレ
ートリーダーで405nmの吸光度を測定した。標準L
PSを用いて同様の操作を行ない、描いた検量線からL
PS濃度を求た。
aOH溶液で処理した後、パイロジェンフリーの精製水
で充分に洗浄し、無菌的に乾燥した。当該マイクロプレ
ートの各穴にパイロジェン測定用ヒト血清(無菌的に調
製)200ulを無菌的に分取し、37℃で30分間反
応させた。30分後にヒト血清を吸引除去し、マイクロ
プレートの各穴をリン酸緩衝液200ulで3回無菌的
に洗浄した。次に、マイクロプレートの各穴にLAL試
薬(生化学工業製)200ulを添加し、37℃で30
分間反応させた。30分後に反応停止液を添加し、プレ
ートリーダーで405nmの吸光度を測定した。標準L
PSを用いて同様の操作を行ない、描いた検量線からL
PS濃度を求た。
【0015】《実施例7.》 i)重合体の合成 アジドスチレンのホモポリマー、2−(4−アジドベン
ゾイルオキシ)エチルメタクリレート/スチレン/0−
ニトロベンジルアクリレートの三重合体(仕込モル比
3=6:1)(以下PASN)およびN,N’−ジメチ
ルアクリルアミド/0−ニトロベンジルアクリレート
(以下NIDM)の共重合体を、各々ラジカル重合で合
成した。 ii)コリスチン固定化不織布の調製 ポリエチレンテレフタレート製不織布の両面に、前記P
ASNを塗布乾燥した後、紫外線を照射し、リン酸緩衝
液中で水溶性カルボジイミドと反応させた後、同緩衝液
に1%の割合でコリスチンを添加し、4℃で8時間反応
させた。同操作を行った不織布を1M NaCl溶液、
リン酸緩衝液で洗浄した。乾燥後、10cmの正方形に
切断し、30枚を重ねモジュールに充填した。同モジュ
ールを1NNaOHで充分に洗浄した後、パイロジェン
フリーの精製水で、流出液が中性になる迄充分に洗浄し
た。 iii)LPSの吸着除去 LPS含有IgG溶液(LPS濃度 10ng/ml)
100mlをii)に記載の方法で調製したモジュール
中を10ml/hの速度で通過させ、パイロジェンフリ
ーの容器で無菌的に受けた。同IgG溶液について、生
化学工業性LPS定量試薬パイロディックを用いてLP
Sの定量をおこなった。その結果、LPS濃度は検出限
界以下であった。
ゾイルオキシ)エチルメタクリレート/スチレン/0−
ニトロベンジルアクリレートの三重合体(仕込モル比
3=6:1)(以下PASN)およびN,N’−ジメチ
ルアクリルアミド/0−ニトロベンジルアクリレート
(以下NIDM)の共重合体を、各々ラジカル重合で合
成した。 ii)コリスチン固定化不織布の調製 ポリエチレンテレフタレート製不織布の両面に、前記P
ASNを塗布乾燥した後、紫外線を照射し、リン酸緩衝
液中で水溶性カルボジイミドと反応させた後、同緩衝液
に1%の割合でコリスチンを添加し、4℃で8時間反応
させた。同操作を行った不織布を1M NaCl溶液、
リン酸緩衝液で洗浄した。乾燥後、10cmの正方形に
切断し、30枚を重ねモジュールに充填した。同モジュ
ールを1NNaOHで充分に洗浄した後、パイロジェン
フリーの精製水で、流出液が中性になる迄充分に洗浄し
た。 iii)LPSの吸着除去 LPS含有IgG溶液(LPS濃度 10ng/ml)
100mlをii)に記載の方法で調製したモジュール
中を10ml/hの速度で通過させ、パイロジェンフリ
ーの容器で無菌的に受けた。同IgG溶液について、生
化学工業性LPS定量試薬パイロディックを用いてLP
Sの定量をおこなった。その結果、LPS濃度は検出限
界以下であった。
【0016】《実施例8.》 標識抗体の調製 P−azidobenzoyloxy succini
mideと反応させることにより、フェニルアジド基を
導入した特異抗体(IgG)とラクトパーオキシダーゼ
(各々1%)をリン緩衝液100mlに添加溶解した
後、同溶液をバットに移し、溶液層を厚さ1mmにした
後、震盪しながら、400−W高圧水銀灯を用いて紫外
光を3分間照射した。同処理をした溶液をカラムクロマ
トグラフィーにより非標識画分と分画し、ラクトパーオ
キシダーゼ標識抗体を得た。
mideと反応させることにより、フェニルアジド基を
導入した特異抗体(IgG)とラクトパーオキシダーゼ
(各々1%)をリン緩衝液100mlに添加溶解した
後、同溶液をバットに移し、溶液層を厚さ1mmにした
後、震盪しながら、400−W高圧水銀灯を用いて紫外
光を3分間照射した。同処理をした溶液をカラムクロマ
トグラフィーにより非標識画分と分画し、ラクトパーオ
キシダーゼ標識抗体を得た。
【0017】《実施例9.》テイコプラニン固定化エチ
レン酢酸ビニル共重合体(EVA) カテーテルの調整
テイコプラニン1%水溶液とデンプン糊とを混合し、E
VAカテーテルの内部に塗布乾燥させた。次に光ファイ
バーを用いて、当該カテーテルの内部に均一に紫外線を
照射し、EVAカテーテルの内部にテイコプラニンを共
有結合させた。次に、同カテーテルを精製水に浸漬し、
カテーテル内部のデンプン糊を溶解させた。更に、同カ
テーテルの内部を1N NaOHで充分に洗浄浄した
後、パイロジェンフリーの精製水で、流出液が中性にな
る迄充分に洗浄した。更に、同カテーテルをポリスチレ
ン製の袋に詰め、γ線滅菌した。
レン酢酸ビニル共重合体(EVA) カテーテルの調整
テイコプラニン1%水溶液とデンプン糊とを混合し、E
VAカテーテルの内部に塗布乾燥させた。次に光ファイ
バーを用いて、当該カテーテルの内部に均一に紫外線を
照射し、EVAカテーテルの内部にテイコプラニンを共
有結合させた。次に、同カテーテルを精製水に浸漬し、
カテーテル内部のデンプン糊を溶解させた。更に、同カ
テーテルの内部を1N NaOHで充分に洗浄浄した
後、パイロジェンフリーの精製水で、流出液が中性にな
る迄充分に洗浄した。更に、同カテーテルをポリスチレ
ン製の袋に詰め、γ線滅菌した。
【0018】《実施例10.》 細菌の検出 実施例5に示した方法に準じて、カナマイシンを共有結
合させたマイクロプレートの各穴を1NのNaOH溶液
で処理した後、パイロジェンフリーの精製水で充分に洗
浄し、無菌的に乾燥した。当該マイクロプレートの各穴
に、被検ヒト血清(無菌的調整)200ulを添加、3
7℃で1時間反応させた。次に、当該マイクロプレート
の各穴をリン酸緩衝液200ulで洗浄した。次に、当
該マイクロプレートの各穴に、酵素標識特異抗体(赤痢
菌、大腸菌、緑膿菌、サルモネラ菌等に対する特異抗
体)200ulを1種類づつ、別々に添加し、37℃で
1時間反応させた。1時間後、プレートリーダーで49
2nmの波長を測定し、吸光度を求めた。標準菌を用い
て同様の操作を行ない、被検ヒト血清中に存在する細菌
を同定した。
合させたマイクロプレートの各穴を1NのNaOH溶液
で処理した後、パイロジェンフリーの精製水で充分に洗
浄し、無菌的に乾燥した。当該マイクロプレートの各穴
に、被検ヒト血清(無菌的調整)200ulを添加、3
7℃で1時間反応させた。次に、当該マイクロプレート
の各穴をリン酸緩衝液200ulで洗浄した。次に、当
該マイクロプレートの各穴に、酵素標識特異抗体(赤痢
菌、大腸菌、緑膿菌、サルモネラ菌等に対する特異抗
体)200ulを1種類づつ、別々に添加し、37℃で
1時間反応させた。1時間後、プレートリーダーで49
2nmの波長を測定し、吸光度を求めた。標準菌を用い
て同様の操作を行ない、被検ヒト血清中に存在する細菌
を同定した。
Claims (7)
- 【請求項1】 不溶性担体の表面にアジド基を有するポ
リマー等を塗布した後、被固定化抗生物質を塗布し、更
に光を照射することを特徴とする抗生物質の固定化方
法。 - 【請求項2】 O−ニトロベンジルエステルを不溶性担
体の表面に塗布、光照射した後、当該担体を水溶性カル
ボジイミドを溶解した緩衝液に浸漬し、更に抗生物質を
溶解した緩衝液に浸漬することを特徴とする抗生物質の
固定化方法。 - 【請求項3】 リン酸緩衝液中 でp−azidobe
nzoyloxysuccinimideと反応させる
ことにより、フェニルアジド基を導入した抗生物質を被
固定化担体に塗布した後、更に光を照射することを特徴
とする抗生物質の固定化方法。 - 【請求項4】 請求項1、または請求項2、または請求
項3記載の方法により作製した不溶性担体を用いて、L
PSを捕捉した後、標識抗体または発色合成基質により
定量する方法。 - 【請求項5】 請求項1、または請求項2、または請求
項3記載の方法により作製した不溶性担体を用いて微生
物を捕捉した後、標識抗体により検出する方法。 - 【請求項6】 請求項1、または請求項2、または請求
項3記載の方法により、抗生物質を固定化したことを特
徴とする不溶性担体。 - 【請求項7】 a)緩衝液中でp−azidobenz
oyloxy succinimideと反応させるこ
とにより、フェニルアジド基を導入した被標識物質(ま
たは酵素または蛍光物質)と b)酵素(または被標識物質または蛍光物質)とを緩衝
液中で光反応させることにより調製した標識物質。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP16726493A JPH07151758A (ja) | 1993-05-30 | 1993-05-30 | 光化学反応による抗生物質の担体への固定化方法とその担体を用いたlpsおよび微生物の捕捉方法および定量方法。 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP16726493A JPH07151758A (ja) | 1993-05-30 | 1993-05-30 | 光化学反応による抗生物質の担体への固定化方法とその担体を用いたlpsおよび微生物の捕捉方法および定量方法。 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPH07151758A true JPH07151758A (ja) | 1995-06-16 |
Family
ID=15846517
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP16726493A Pending JPH07151758A (ja) | 1993-05-30 | 1993-05-30 | 光化学反応による抗生物質の担体への固定化方法とその担体を用いたlpsおよび微生物の捕捉方法および定量方法。 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JPH07151758A (ja) |
Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2006017554A (ja) * | 2004-06-30 | 2006-01-19 | Daikin Ind Ltd | 磁気ビーズ及び微生物検出方法 |
JP2016509101A (ja) * | 2013-01-18 | 2016-03-24 | セルガード エルエルシー | 表面改質剤、改質された材料及び方法 |
KR20170001341A (ko) * | 2015-06-26 | 2017-01-04 | 고려대학교 산학협력단 | 폴리믹신 b의 표면 고정화를 통한 그람 음성균의 신속 검출 방법 |
-
1993
- 1993-05-30 JP JP16726493A patent/JPH07151758A/ja active Pending
Cited By (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2006017554A (ja) * | 2004-06-30 | 2006-01-19 | Daikin Ind Ltd | 磁気ビーズ及び微生物検出方法 |
US11725099B2 (en) | 2012-07-18 | 2023-08-15 | Celgard, Llc | Surface modifying agents, modified materials and methods |
JP2016509101A (ja) * | 2013-01-18 | 2016-03-24 | セルガード エルエルシー | 表面改質剤、改質された材料及び方法 |
US10240031B2 (en) | 2013-01-18 | 2019-03-26 | Celgard, Llc | Surface modifying agents, modified materials and methods |
JP2019070134A (ja) * | 2013-01-18 | 2019-05-09 | セルガード エルエルシー | 表面改質基板 |
CN113764824A (zh) * | 2013-01-18 | 2021-12-07 | 赛尔格有限责任公司 | 隔板设有表面改性剂的电池 |
KR20170001341A (ko) * | 2015-06-26 | 2017-01-04 | 고려대학교 산학협력단 | 폴리믹신 b의 표면 고정화를 통한 그람 음성균의 신속 검출 방법 |
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