JPH07151758A - 光化学反応による抗生物質の担体への固定化方法とその担体を用いたｌｐｓおよび微生物の捕捉方法および定量方法。 - Google Patents
光化学反応による抗生物質の担体への固定化方法とその担体を用いたｌｐｓおよび微生物の捕捉方法および定量方法。Info
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- JPH07151758A JPH07151758A JP16726493A JP16726493A JPH07151758A JP H07151758 A JPH07151758 A JP H07151758A JP 16726493 A JP16726493 A JP 16726493A JP 16726493 A JP16726493 A JP 16726493A JP H07151758 A JPH07151758 A JP H07151758A
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Abstract
(57)【要約】
【目的】１）光化学反応による担体への抗生物質の固定
化方法と、当該担体を用いた ＬＰＳおよび微生物の定
量方法を提供する。 ２）当該担体を用いたＬＰＳの吸着除去方法を提供す
る。 ３）生理活性物質に対する標識方法を提供する。 【構成】光反応により抗生物質を固定化させた水不溶性
担体、および定量試薬からなる。
化方法と、当該担体を用いた ＬＰＳおよび微生物の定
量方法を提供する。 ２）当該担体を用いたＬＰＳの吸着除去方法を提供す
る。 ３）生理活性物質に対する標識方法を提供する。 【構成】光反応により抗生物質を固定化させた水不溶性
担体、および定量試薬からなる。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、 １）光化学反応による担体への抗生物質の固定化方法
と、当該担体を用いたＬＰＳおよび微生物の定量方法。 ２） 当該担体を用いたＬＰＳの吸着除去方法。 ３）生理活性物質に対する標識方法。 に関する。
と、当該担体を用いたＬＰＳおよび微生物の定量方法。 ２） 当該担体を用いたＬＰＳの吸着除去方法。 ３）生理活性物質に対する標識方法。 に関する。
【０００２】
【従来の技術】従来、血液や蛋白溶液中のＬＰＳ（リポ
ポリサッカライド）の定量は、過塩素酸処理後、発色合
成基質を用いる方法が一般的だった。同方法では、一般
に測定値が低くなる傾向があると考えられている。本発
明の発明者らは既に、グルタルアルデヒドやペプチド結
合を介して、抗生物質を共有結合させた担体を用いてＬ
ＰＳを定量する方法を発明、出願に及んだ（特願平３−
１６９４７９）。同発明の出願の後、ポリミキシンＢを
結合させたアフィニティー担体や、ヘキサメチレンジア
ミンをスペーサーとしてヒスチジンを結合させたアフィ
ニティー担体を定量に用いる方法が考案された。
ポリサッカライド）の定量は、過塩素酸処理後、発色合
成基質を用いる方法が一般的だった。同方法では、一般
に測定値が低くなる傾向があると考えられている。本発
明の発明者らは既に、グルタルアルデヒドやペプチド結
合を介して、抗生物質を共有結合させた担体を用いてＬ
ＰＳを定量する方法を発明、出願に及んだ（特願平３−
１６９４７９）。同発明の出願の後、ポリミキシンＢを
結合させたアフィニティー担体や、ヘキサメチレンジア
ミンをスペーサーとしてヒスチジンを結合させたアフィ
ニティー担体を定量に用いる方法が考案された。
【０００３】
【発明が解決しようとする問題点】これらの定量方法に
は、 １）ポリミキシンＢを結合させたアフィニティー担体
や、ヘキサメチレンジアミンをスペーサーとしてヒスチ
ジンを結合させた、アフィニティー担体を定量に用いる
方法は操作が煩雑である。 ２）グルタルアルデヒドやペプチド結合を介して、抗生
物質を共有結合させた担体を用いる方法は、測定操作は
簡単で測定値も極めて正確であるが、担体の調製操作が
煩雑（リガンドの担体への結合条件決定が難しい）であ
る。 等の欠点がある。
は、 １）ポリミキシンＢを結合させたアフィニティー担体
や、ヘキサメチレンジアミンをスペーサーとしてヒスチ
ジンを結合させた、アフィニティー担体を定量に用いる
方法は操作が煩雑である。 ２）グルタルアルデヒドやペプチド結合を介して、抗生
物質を共有結合させた担体を用いる方法は、測定操作は
簡単で測定値も極めて正確であるが、担体の調製操作が
煩雑（リガンドの担体への結合条件決定が難しい）であ
る。 等の欠点がある。
【０００４】
【課題を解決するための手段】前記の様に、本発明の発
明者らは既に、グルタルアルデヒドやペプチド結合を介
して、抗生物質を共有結合させた担体を用いてＬＰＳ
を定量する方法を発明、出願に及んだ（特願平３−１６
９４７９）。一方、フェニルアジド基は、紫外線照射に
より高反応性の中間体であるナイトレンを経由し、近傍
の炭素等と共有結合することが知られている。また、０
−ニトロベンジルエステルは、紫外光照射によって分解
して、カルボキシル基を生成することが知られている
（吉本薫：フォトポリマーハソドブック：工業調査会１
９８９）。また、人工臓器に生体適合性を付与する方法
として、材料表面の改質方法（特願、平 ２−２０６５
７３）が知られている。同方法は、デバイスの表面にア
ジド基を介して、アルブミン等の蛋白質を共有結合させ
ることにより、生体適合性を付与する方法である。
明者らは既に、グルタルアルデヒドやペプチド結合を介
して、抗生物質を共有結合させた担体を用いてＬＰＳ
を定量する方法を発明、出願に及んだ（特願平３−１６
９４７９）。一方、フェニルアジド基は、紫外線照射に
より高反応性の中間体であるナイトレンを経由し、近傍
の炭素等と共有結合することが知られている。また、０
−ニトロベンジルエステルは、紫外光照射によって分解
して、カルボキシル基を生成することが知られている
（吉本薫：フォトポリマーハソドブック：工業調査会１
９８９）。また、人工臓器に生体適合性を付与する方法
として、材料表面の改質方法（特願、平 ２−２０６５
７３）が知られている。同方法は、デバイスの表面にア
ジド基を介して、アルブミン等の蛋白質を共有結合させ
ることにより、生体適合性を付与する方法である。
【０００５】本発明の発明者は、このフェニルアジド基
の紫外線照射法を、前記のアフィニティー担体を用い
て、被検検体を捕捉した後、標識抗体や発色基質を用い
て定量する方法に応用することを考案した。即ち、本発
明の発明者は、ＬＰＳのリガンドである抗生物質の固定
化について鋭意検討した結果、 ａ）不溶性担体の表面にアジド基を有するポリマー等を
塗布した後被固定化抗生物質を塗布し、更に、光を照射
することことからなる抗生物質の固定化方法。 ｂ）０−ニトロベンジルエステルを不溶性担体の表面に
塗布、光照射した後、当該担体を水溶性カルボジイミド
を溶解した緩衝液に浸漬し、更に、抗生物質を溶解した
緩衝液に浸漬することを特徴とする抗生物質の固定化方
法 ｃ）リン酸緩衝液中でｐ−ａｚｉｄｏｂｅｎｚｏｙｌｏ
ｘｙ ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅと反応させることによ
り、フェニルアジド基を導入した抗生物質を被固定化担
体に塗布した後、更に、光を照射することことからなる
抗生物質の固定化方法。を用いて調製した担体を用いて
ＬＰＳを定量する方法がきわめて有効であることを発見
し、発明に及んだ。本発明は、ＬＰＳの定量の為に考案
されたが、当該担体は細菌を捕捉することも可能であ
り、従って、細菌の検出にも適用することができる。本
発明を用いた細菌の検出方法は、ＤＮＡプローブ法と比
較して操作が簡単で、検出迄の時間も極めて短時間であ
るという長所がある。また、本発明により、特異抗体等
の生理活性物質に、パーオキシダーゼや蛍光物質を標識
することが可能である。
の紫外線照射法を、前記のアフィニティー担体を用い
て、被検検体を捕捉した後、標識抗体や発色基質を用い
て定量する方法に応用することを考案した。即ち、本発
明の発明者は、ＬＰＳのリガンドである抗生物質の固定
化について鋭意検討した結果、 ａ）不溶性担体の表面にアジド基を有するポリマー等を
塗布した後被固定化抗生物質を塗布し、更に、光を照射
することことからなる抗生物質の固定化方法。 ｂ）０−ニトロベンジルエステルを不溶性担体の表面に
塗布、光照射した後、当該担体を水溶性カルボジイミド
を溶解した緩衝液に浸漬し、更に、抗生物質を溶解した
緩衝液に浸漬することを特徴とする抗生物質の固定化方
法 ｃ）リン酸緩衝液中でｐ−ａｚｉｄｏｂｅｎｚｏｙｌｏ
ｘｙ ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅと反応させることによ
り、フェニルアジド基を導入した抗生物質を被固定化担
体に塗布した後、更に、光を照射することことからなる
抗生物質の固定化方法。を用いて調製した担体を用いて
ＬＰＳを定量する方法がきわめて有効であることを発見
し、発明に及んだ。本発明は、ＬＰＳの定量の為に考案
されたが、当該担体は細菌を捕捉することも可能であ
り、従って、細菌の検出にも適用することができる。本
発明を用いた細菌の検出方法は、ＤＮＡプローブ法と比
較して操作が簡単で、検出迄の時間も極めて短時間であ
るという長所がある。また、本発明により、特異抗体等
の生理活性物質に、パーオキシダーゼや蛍光物質を標識
することが可能である。
【０００６】本発明に関わる抗生物質としては、ＬＰＳ
の検出の為には、ポリミキシンＢ、コリスチン等のペプ
チド系抗生物質や、アミノグリコシド系抗生物質が考え
られる。細菌の検出の為には、グラム陽性菌に有効な抗
生物質およびグラム陰性菌に有効な抗生物質を、別個に
共有結合した担体を用いる必要がある。従って、本発明
に於ける抗生物質とは、抗生物質全体を指し、特にある
種類のものに限定されるものではない。すなわち、ウイ
ルスの検出の為には、抗ウイルス剤を固定化した担体を
使用すればよい。本発明に関わる不溶性担体とは、アフ
ィニティーゲル、ビーズ、マイクロプレート、ストリッ
プ、フィルム等の実験器具。多孔性ビーズ、多孔性中空
糸、繊維、織布、不織布等の担体、更にカテーテル、人
工血管等の医療用具が考えられるが、これらには、何
等、限定されるものではない。特に多孔性ビーズ、多孔
性中空糸等の担体を用いることにより、医薬品、蛋白製
剤、血液等からＬＰＳを吸着除去することが可能にな
る。また、グリコペプチド系抗生物質を固定化したカテ
ーテルを用いることにより、ＭＲＳＡ等の細菌感染を防
止することが可能になる。更にまた、本発明によれば、
酵素を標識した特異抗体や蛍光標識した生理活性物質等
の調製が容易になる。
の検出の為には、ポリミキシンＢ、コリスチン等のペプ
チド系抗生物質や、アミノグリコシド系抗生物質が考え
られる。細菌の検出の為には、グラム陽性菌に有効な抗
生物質およびグラム陰性菌に有効な抗生物質を、別個に
共有結合した担体を用いる必要がある。従って、本発明
に於ける抗生物質とは、抗生物質全体を指し、特にある
種類のものに限定されるものではない。すなわち、ウイ
ルスの検出の為には、抗ウイルス剤を固定化した担体を
使用すればよい。本発明に関わる不溶性担体とは、アフ
ィニティーゲル、ビーズ、マイクロプレート、ストリッ
プ、フィルム等の実験器具。多孔性ビーズ、多孔性中空
糸、繊維、織布、不織布等の担体、更にカテーテル、人
工血管等の医療用具が考えられるが、これらには、何
等、限定されるものではない。特に多孔性ビーズ、多孔
性中空糸等の担体を用いることにより、医薬品、蛋白製
剤、血液等からＬＰＳを吸着除去することが可能にな
る。また、グリコペプチド系抗生物質を固定化したカテ
ーテルを用いることにより、ＭＲＳＡ等の細菌感染を防
止することが可能になる。更にまた、本発明によれば、
酵素を標識した特異抗体や蛍光標識した生理活性物質等
の調製が容易になる。
【０００７】
【発明の効果】本発明は、 ａ）不溶性担体の表面にアジド基を有するポリマー等を
塗布した後被固定化抗生物質を塗布し、更に、光を照射
することことからなる抗生物質の固定化方法。 ｂ）０−ニトロベンジルエステルを不溶性担体の表面に
塗布、光照射した後、当該担体を水溶性カルボジイミド
を溶解した緩衝液に浸漬し、更に、抗生物質を溶解した
緩衝液に浸漬することを特徴とする抗生物質の固定化方
法。 ｃ）リン酸緩衝液中でｐ−ａｚｉｄｏｂｅｎｚｏｙｌｏ
ｘｙ ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅと反応させることによ
り、フェニルアジド基を導入した抗生物質を被固定化担
体に塗布した後、更に、光を照射することことからなる
抗生物質の固定化方法。を用しいて調製した担体を用い
てＬＰＳを定量する方法、ＬＰＳを吸着除去する方法、
微生物を検出する方法、生理活性物質に標識する方法に
関する。本発明に関わる固定化方法により、抗生物質の
活性を失うことなく、抗生物質を容易に、堅固に固定化
することが可能になる。また、本発明により、ＬＰＳの
定量および細菌の検出が容易になる。更に本発明によ
り、医療用具、中空糸膜酵素（蛍光）標識抗体の新規調
製方法が実現される。
塗布した後被固定化抗生物質を塗布し、更に、光を照射
することことからなる抗生物質の固定化方法。 ｂ）０−ニトロベンジルエステルを不溶性担体の表面に
塗布、光照射した後、当該担体を水溶性カルボジイミド
を溶解した緩衝液に浸漬し、更に、抗生物質を溶解した
緩衝液に浸漬することを特徴とする抗生物質の固定化方
法。 ｃ）リン酸緩衝液中でｐ−ａｚｉｄｏｂｅｎｚｏｙｌｏ
ｘｙ ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅと反応させることによ
り、フェニルアジド基を導入した抗生物質を被固定化担
体に塗布した後、更に、光を照射することことからなる
抗生物質の固定化方法。を用しいて調製した担体を用い
てＬＰＳを定量する方法、ＬＰＳを吸着除去する方法、
微生物を検出する方法、生理活性物質に標識する方法に
関する。本発明に関わる固定化方法により、抗生物質の
活性を失うことなく、抗生物質を容易に、堅固に固定化
することが可能になる。また、本発明により、ＬＰＳの
定量および細菌の検出が容易になる。更に本発明によ
り、医療用具、中空糸膜酵素（蛍光）標識抗体の新規調
製方法が実現される。
【０００８】
【実施例】本発明を実施例により更に詳細に説明する。
本発明は実施例により、何ら限定されるものではない。
本発明は実施例により、何ら限定されるものではない。
【０００９】《実施例１．》 ｉ）アジドスチレンの合成 エタノール−濃塩酸混液２０ｍｌに、３−ニトロスチレ
ン５ｇを懸濁させ、更に、エタノールに溶解したＳｎＣ
ｌ３２Ｈ２Ｏ溶液を激しく攪拌しながら添加し、室温で
一夜、反応させた。ＮａＯＨにより中和し、固体成分を
濾別し、濾液より生成物をエーテル抽出した。エーテル
層をＭｇＳＯ４で乾燥した後、濃硫酸を加え、中間体を
得た。同中間体を１０％硫酸溶液１０ｍｌに溶解氷冷
し、１ＮのＮａＮＯ２水溶液を添加した。２時間後に、
ＮａＮ３水溶液を添加し、室温に戻した後、３時間攪拌
した。酢酸エチルにより抽出し、抽出液を０．１Ｎ Ｎ
ａＨＣＯ３水溶液と精製水で洗浄し、ＭｇＳＯ４を添加
し、乾燥した。溶媒を留去し、クロロホルム／ヘキサン
（１／４）混合溶媒に溶解し、シリカゲルカラムで精製
した。溶媒を留去し、３−アジドスチレンを得た。 ｉｉ） アジドスチレン−スチレン共重合体の合成 アジドスチレン１モルとスチレン４モルとをベンゼンで
５倍に希釈し、０．０１当量のＮ，Ｎ−アゾビスイソブ
チロニトリル（ＡＩＢＮ）を添加、脱気、封管し、６０
℃で４時間重合した。放冷後、メタノール中に注ぎ、沈
殿したアジドスチレン−スチレン共重合体を回収した。
得られた共重合体の数平均分子量は、１０万であった。 ｉｉｉ）コリスチン固定化ＰＥＴフィルムの調製 前記方法により合成したアジドスチレン−スチレン共重
合体をアセトンに溶解し、１％溶液を調製した。この溶
液２０ｕｌを１ｃｍ２のポリエチレンテレフタレート
（ＰＥＴ）フィルムの両面に塗布、乾燥し、アジドスチ
レン−スチレン共重合体の皮膜を形成した。リン酸緩衝
液に１％の割合で溶解したコリスチン溶液に、前記処理
をしたＰＥＴフィルムを１時間浸漬し、コリスチンを吸
着させ、高圧水銀灯を用いて、紫外線を１分間照射し
た。次に、当該ＰＥＴフィルムを精製水で水洗、乾燥し
た。
ン５ｇを懸濁させ、更に、エタノールに溶解したＳｎＣ
ｌ３２Ｈ２Ｏ溶液を激しく攪拌しながら添加し、室温で
一夜、反応させた。ＮａＯＨにより中和し、固体成分を
濾別し、濾液より生成物をエーテル抽出した。エーテル
層をＭｇＳＯ４で乾燥した後、濃硫酸を加え、中間体を
得た。同中間体を１０％硫酸溶液１０ｍｌに溶解氷冷
し、１ＮのＮａＮＯ２水溶液を添加した。２時間後に、
ＮａＮ３水溶液を添加し、室温に戻した後、３時間攪拌
した。酢酸エチルにより抽出し、抽出液を０．１Ｎ Ｎ
ａＨＣＯ３水溶液と精製水で洗浄し、ＭｇＳＯ４を添加
し、乾燥した。溶媒を留去し、クロロホルム／ヘキサン
（１／４）混合溶媒に溶解し、シリカゲルカラムで精製
した。溶媒を留去し、３−アジドスチレンを得た。 ｉｉ） アジドスチレン−スチレン共重合体の合成 アジドスチレン１モルとスチレン４モルとをベンゼンで
５倍に希釈し、０．０１当量のＮ，Ｎ−アゾビスイソブ
チロニトリル（ＡＩＢＮ）を添加、脱気、封管し、６０
℃で４時間重合した。放冷後、メタノール中に注ぎ、沈
殿したアジドスチレン−スチレン共重合体を回収した。
得られた共重合体の数平均分子量は、１０万であった。 ｉｉｉ）コリスチン固定化ＰＥＴフィルムの調製 前記方法により合成したアジドスチレン−スチレン共重
合体をアセトンに溶解し、１％溶液を調製した。この溶
液２０ｕｌを１ｃｍ２のポリエチレンテレフタレート
（ＰＥＴ）フィルムの両面に塗布、乾燥し、アジドスチ
レン−スチレン共重合体の皮膜を形成した。リン酸緩衝
液に１％の割合で溶解したコリスチン溶液に、前記処理
をしたＰＥＴフィルムを１時間浸漬し、コリスチンを吸
着させ、高圧水銀灯を用いて、紫外線を１分間照射し
た。次に、当該ＰＥＴフィルムを精製水で水洗、乾燥し
た。
【００１０】《実施例２，》 コリスチン固定化ＰＥＴフィルムを用いた ＬＰＳの定
量 実施例１．で調整したコリスチン固定化ＰＥＴフィルム
１枚を１Ｎ ＮａＯＨで洗浄し、更に、パイロジェンフ
リーの精製水で充分に洗浄、乾燥し、パイロジェンフリ
ーの試験管に入れた。次に、ＬＰＳ含有ＩｇＧ溶液１ｍ
ｌを当該試験管に取り、３７℃で３０分間反応、吸着さ
せた。次に、試験管に添加したＩｇＧ溶液を無菌的に吸
引除去した。次に、当該試験管にパイロジェンフリーの
精製水を添加、攪拌、吸引除去する操作を３回行ない、
コリスチン固定化ＰＥＴフィルムを充分に洗浄した。Ｌ
ＰＳ定量用ＬＡＬ試薬（生化学工業製）０．５ｍｌを分
注したパイロジェンフリーの試験管に、前記操作を行な
ったＰＥＴフィルムを入れ，３７℃で３０分間反応させ
た。３０分後、反応停止液２ｍｌを添加し反応を停正さ
せた。引き続いて、同溶液について４０５ｎｍの吸光度
を測定した。標準ＬＰＳを用いて同一操作を行ない、描
いた検量線からＬＰＳ値を求めた。
量 実施例１．で調整したコリスチン固定化ＰＥＴフィルム
１枚を１Ｎ ＮａＯＨで洗浄し、更に、パイロジェンフ
リーの精製水で充分に洗浄、乾燥し、パイロジェンフリ
ーの試験管に入れた。次に、ＬＰＳ含有ＩｇＧ溶液１ｍ
ｌを当該試験管に取り、３７℃で３０分間反応、吸着さ
せた。次に、試験管に添加したＩｇＧ溶液を無菌的に吸
引除去した。次に、当該試験管にパイロジェンフリーの
精製水を添加、攪拌、吸引除去する操作を３回行ない、
コリスチン固定化ＰＥＴフィルムを充分に洗浄した。Ｌ
ＰＳ定量用ＬＡＬ試薬（生化学工業製）０．５ｍｌを分
注したパイロジェンフリーの試験管に、前記操作を行な
ったＰＥＴフィルムを入れ，３７℃で３０分間反応させ
た。３０分後、反応停止液２ｍｌを添加し反応を停正さ
せた。引き続いて、同溶液について４０５ｎｍの吸光度
を測定した。標準ＬＰＳを用いて同一操作を行ない、描
いた検量線からＬＰＳ値を求めた。
【００１１】《実施例３》 ｉ）アジドベンゾイルオキシエチルメタクリレートの合
成 Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）１００ｍｌ
にｐ−アジド安息香酸１０ｇを溶解、氷冷し、トリエチ
ルアミン８．５ｍｌを添加し、更に、クロロ蟻酸イソブ
チル８．３ｍｌを添加した。次に、ＤＭＦ３００ｍｌに
ヒドロキシエチルメタクリレート５．２ｍｌを溶解し、
前記溶液に添加し、６０℃で５時間攪拌した。溶媒を留
去し、酢酸エチルを添加、抽出し、１０％クエン酸水溶
液、精製水、４％ＮａＨＣＯ３水溶液で順次洗浄し、無
水ＮａＳＯ４を添加、乾燥した。溶媒を留去した後、ク
ロロホルムに溶解し、シリカゲルカラムで精製した。溶
媒を留去し、アジドベンソゾイルオキシエチルメタクリ
レートを得た。 ｉｉ）アジドベンゾイルオキシエチルメタクリレート−
メチルメタクリレート共重合体の合成 前記方法により合成したアジドベンゾイルオキシエチル
メタクリレート １ｍｏｌとメチルメタクリレート４
ｍｏｌとをＤＭＦ で２倍に希釈し、０．０１等量のＡ
ＩＢＮを添加、脱気、封管し、６０℃で３時間重合し
た。冷却後、大量のエチルエーテルに注ぎ、沈殿したア
ジドベンゾイルオキシエチルメタクリレート−メチルメ
タクリレート重合体を得た。得られた共重合体の数平均
分子量は１５万であった。 ｉｉｉ）ポリミキシンＢ固定化マイクロプレートの調製 前記方法により合成したアジドベンゾイルオキシエチル
メタクリレート−メチルメタクリレート共重合体をアセ
トンに溶解し、１％溶液を調製した。この溶液各３０ｕ
ｌをマイクロプレートの１穴に塗布、乾燥し、アジドベ
ンゾイルオキシエチルメタクリレート−メチルメタクリ
レート共重合体の皮膜を形成した。前記処理をしたマイ
クロプレートの各穴に、リン酸緩衝液に１％の割合で溶
解したポリミキシンＢ溶液２００ｕｌを添加し、ポリミ
キシンＢを吸着させ、高圧水銀灯を用いて、紫外線を１
分間照射した。次に、当該ＰＥＴフィルムを精製水で水
洗、乾燥した。
成 Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）１００ｍｌ
にｐ−アジド安息香酸１０ｇを溶解、氷冷し、トリエチ
ルアミン８．５ｍｌを添加し、更に、クロロ蟻酸イソブ
チル８．３ｍｌを添加した。次に、ＤＭＦ３００ｍｌに
ヒドロキシエチルメタクリレート５．２ｍｌを溶解し、
前記溶液に添加し、６０℃で５時間攪拌した。溶媒を留
去し、酢酸エチルを添加、抽出し、１０％クエン酸水溶
液、精製水、４％ＮａＨＣＯ３水溶液で順次洗浄し、無
水ＮａＳＯ４を添加、乾燥した。溶媒を留去した後、ク
ロロホルムに溶解し、シリカゲルカラムで精製した。溶
媒を留去し、アジドベンソゾイルオキシエチルメタクリ
レートを得た。 ｉｉ）アジドベンゾイルオキシエチルメタクリレート−
メチルメタクリレート共重合体の合成 前記方法により合成したアジドベンゾイルオキシエチル
メタクリレート １ｍｏｌとメチルメタクリレート４
ｍｏｌとをＤＭＦ で２倍に希釈し、０．０１等量のＡ
ＩＢＮを添加、脱気、封管し、６０℃で３時間重合し
た。冷却後、大量のエチルエーテルに注ぎ、沈殿したア
ジドベンゾイルオキシエチルメタクリレート−メチルメ
タクリレート重合体を得た。得られた共重合体の数平均
分子量は１５万であった。 ｉｉｉ）ポリミキシンＢ固定化マイクロプレートの調製 前記方法により合成したアジドベンゾイルオキシエチル
メタクリレート−メチルメタクリレート共重合体をアセ
トンに溶解し、１％溶液を調製した。この溶液各３０ｕ
ｌをマイクロプレートの１穴に塗布、乾燥し、アジドベ
ンゾイルオキシエチルメタクリレート−メチルメタクリ
レート共重合体の皮膜を形成した。前記処理をしたマイ
クロプレートの各穴に、リン酸緩衝液に１％の割合で溶
解したポリミキシンＢ溶液２００ｕｌを添加し、ポリミ
キシンＢを吸着させ、高圧水銀灯を用いて、紫外線を１
分間照射した。次に、当該ＰＥＴフィルムを精製水で水
洗、乾燥した。
【００１２】《実施例４，》 ＬＰＳの定量 実施例３．で調製したポリミキシンＢ固定化マイクロプ
レートを用いて、ＬＰＳの定量を行なった。すなわち、
ポリミキシンＢ固定化マイクロプレートの各穴に、被検
検体２００ｕｌを分取し、３７℃で３０分間反応させ
た。次に、マイクロプレートの各穴をリソ酸緩衝液２０
０ｕｌで３回洗浄した。次に、マイクロプレートの各穴
にＬＡＬ試液２００ｕｌを分注し、３７℃で３０分間反
応させた。３０分後、マイクロプレートの各穴に反応停
止液１００ｕｌを分注し、反応を停止した。プレートリ
ーダーにより、各穴の吸光度を測定した。標準ＬＰＳを
用いて同様の操作を行ない、検量線を描きＬＰＳ値を求
めた。
レートを用いて、ＬＰＳの定量を行なった。すなわち、
ポリミキシンＢ固定化マイクロプレートの各穴に、被検
検体２００ｕｌを分取し、３７℃で３０分間反応させ
た。次に、マイクロプレートの各穴をリソ酸緩衝液２０
０ｕｌで３回洗浄した。次に、マイクロプレートの各穴
にＬＡＬ試液２００ｕｌを分注し、３７℃で３０分間反
応させた。３０分後、マイクロプレートの各穴に反応停
止液１００ｕｌを分注し、反応を停止した。プレートリ
ーダーにより、各穴の吸光度を測定した。標準ＬＰＳを
用いて同様の操作を行ない、検量線を描きＬＰＳ値を求
めた。
【００１３】《実施例５．》 アミカシン固定化マイクロプレートの調製 ラジカル重合により、２−（４−アジドベンゾイルオキ
シ）エチルメタクリレート：スチレン：ｏ−ニロベンジ
ルアクリレートの三元共重合体（仕込モル比３：６：１
（以下 ＰＡＳＮ）を合成した。マイクロプレートの各
穴に、前記ＰＡＳＮを塗布、薄膜を形成した後、紫外線
を照射した。次にマイクロプレートの各穴に、水溶性カ
ルボジイミドを含有するリン酸緩衝液１００ｕｌを添加
し、３７℃で３０分間反応させた。続いて２％のアミカ
シソを含有するリン酸緩衝液１００ｕｌを添加し、３７
℃で８時間反応させた。次にマイクロプレートの各穴を
１ＭのＮａＣｌ水溶液およびリン酸緩衝液で洗浄した。
シ）エチルメタクリレート：スチレン：ｏ−ニロベンジ
ルアクリレートの三元共重合体（仕込モル比３：６：１
（以下 ＰＡＳＮ）を合成した。マイクロプレートの各
穴に、前記ＰＡＳＮを塗布、薄膜を形成した後、紫外線
を照射した。次にマイクロプレートの各穴に、水溶性カ
ルボジイミドを含有するリン酸緩衝液１００ｕｌを添加
し、３７℃で３０分間反応させた。続いて２％のアミカ
シソを含有するリン酸緩衝液１００ｕｌを添加し、３７
℃で８時間反応させた。次にマイクロプレートの各穴を
１ＭのＮａＣｌ水溶液およびリン酸緩衝液で洗浄した。
【００１４】《実施例６．》 ） ＬＰＳの定量 実施例６で調製したマイクロプレートの各穴を１ＮのＮ
ａＯＨ溶液で処理した後、パイロジェンフリーの精製水
で充分に洗浄し、無菌的に乾燥した。当該マイクロプレ
ートの各穴にパイロジェン測定用ヒト血清（無菌的に調
製）２００ｕｌを無菌的に分取し、３７℃で３０分間反
応させた。３０分後にヒト血清を吸引除去し、マイクロ
プレートの各穴をリン酸緩衝液２００ｕｌで３回無菌的
に洗浄した。次に、マイクロプレートの各穴にＬＡＬ試
薬（生化学工業製）２００ｕｌを添加し、３７℃で３０
分間反応させた。３０分後に反応停止液を添加し、プレ
ートリーダーで４０５ｎｍの吸光度を測定した。標準Ｌ
ＰＳを用いて同様の操作を行ない、描いた検量線からＬ
ＰＳ濃度を求た。
ａＯＨ溶液で処理した後、パイロジェンフリーの精製水
で充分に洗浄し、無菌的に乾燥した。当該マイクロプレ
ートの各穴にパイロジェン測定用ヒト血清（無菌的に調
製）２００ｕｌを無菌的に分取し、３７℃で３０分間反
応させた。３０分後にヒト血清を吸引除去し、マイクロ
プレートの各穴をリン酸緩衝液２００ｕｌで３回無菌的
に洗浄した。次に、マイクロプレートの各穴にＬＡＬ試
薬（生化学工業製）２００ｕｌを添加し、３７℃で３０
分間反応させた。３０分後に反応停止液を添加し、プレ
ートリーダーで４０５ｎｍの吸光度を測定した。標準Ｌ
ＰＳを用いて同様の操作を行ない、描いた検量線からＬ
ＰＳ濃度を求た。
【００１５】《実施例７．》 ｉ）重合体の合成 アジドスチレンのホモポリマー、２−（４−アジドベン
ゾイルオキシ）エチルメタクリレート／スチレン／０−
ニトロベンジルアクリレートの三重合体（仕込モル比
３＝６：１）（以下ＰＡＳＮ）およびＮ，Ｎ’−ジメチ
ルアクリルアミド／０−ニトロベンジルアクリレート
（以下ＮＩＤＭ）の共重合体を、各々ラジカル重合で合
成した。 ｉｉ）コリスチン固定化不織布の調製 ポリエチレンテレフタレート製不織布の両面に、前記Ｐ
ＡＳＮを塗布乾燥した後、紫外線を照射し、リン酸緩衝
液中で水溶性カルボジイミドと反応させた後、同緩衝液
に１％の割合でコリスチンを添加し、４℃で８時間反応
させた。同操作を行った不織布を１Ｍ ＮａＣｌ溶液、
リン酸緩衝液で洗浄した。乾燥後、１０ｃｍの正方形に
切断し、３０枚を重ねモジュールに充填した。同モジュ
ールを１ＮＮａＯＨで充分に洗浄した後、パイロジェン
フリーの精製水で、流出液が中性になる迄充分に洗浄し
た。 ｉｉｉ）ＬＰＳの吸着除去 ＬＰＳ含有ＩｇＧ溶液（ＬＰＳ濃度 １０ｎｇ／ｍｌ）
１００ｍｌをｉｉ）に記載の方法で調製したモジュール
中を１０ｍｌ／ｈの速度で通過させ、パイロジェンフリ
ーの容器で無菌的に受けた。同ＩｇＧ溶液について、生
化学工業性ＬＰＳ定量試薬パイロディックを用いてＬＰ
Ｓの定量をおこなった。その結果、ＬＰＳ濃度は検出限
界以下であった。
ゾイルオキシ）エチルメタクリレート／スチレン／０−
ニトロベンジルアクリレートの三重合体（仕込モル比
３＝６：１）（以下ＰＡＳＮ）およびＮ，Ｎ’−ジメチ
ルアクリルアミド／０−ニトロベンジルアクリレート
（以下ＮＩＤＭ）の共重合体を、各々ラジカル重合で合
成した。 ｉｉ）コリスチン固定化不織布の調製 ポリエチレンテレフタレート製不織布の両面に、前記Ｐ
ＡＳＮを塗布乾燥した後、紫外線を照射し、リン酸緩衝
液中で水溶性カルボジイミドと反応させた後、同緩衝液
に１％の割合でコリスチンを添加し、４℃で８時間反応
させた。同操作を行った不織布を１Ｍ ＮａＣｌ溶液、
リン酸緩衝液で洗浄した。乾燥後、１０ｃｍの正方形に
切断し、３０枚を重ねモジュールに充填した。同モジュ
ールを１ＮＮａＯＨで充分に洗浄した後、パイロジェン
フリーの精製水で、流出液が中性になる迄充分に洗浄し
た。 ｉｉｉ）ＬＰＳの吸着除去 ＬＰＳ含有ＩｇＧ溶液（ＬＰＳ濃度 １０ｎｇ／ｍｌ）
１００ｍｌをｉｉ）に記載の方法で調製したモジュール
中を１０ｍｌ／ｈの速度で通過させ、パイロジェンフリ
ーの容器で無菌的に受けた。同ＩｇＧ溶液について、生
化学工業性ＬＰＳ定量試薬パイロディックを用いてＬＰ
Ｓの定量をおこなった。その結果、ＬＰＳ濃度は検出限
界以下であった。
【００１６】《実施例８．》 標識抗体の調製 Ｐ−ａｚｉｄｏｂｅｎｚｏｙｌｏｘｙ ｓｕｃｃｉｎｉ
ｍｉｄｅと反応させることにより、フェニルアジド基を
導入した特異抗体（ＩｇＧ）とラクトパーオキシダーゼ
（各々１％）をリン緩衝液１００ｍｌに添加溶解した
後、同溶液をバットに移し、溶液層を厚さ１ｍｍにした
後、震盪しながら、４００−Ｗ高圧水銀灯を用いて紫外
光を３分間照射した。同処理をした溶液をカラムクロマ
トグラフィーにより非標識画分と分画し、ラクトパーオ
キシダーゼ標識抗体を得た。
ｍｉｄｅと反応させることにより、フェニルアジド基を
導入した特異抗体（ＩｇＧ）とラクトパーオキシダーゼ
（各々１％）をリン緩衝液１００ｍｌに添加溶解した
後、同溶液をバットに移し、溶液層を厚さ１ｍｍにした
後、震盪しながら、４００−Ｗ高圧水銀灯を用いて紫外
光を３分間照射した。同処理をした溶液をカラムクロマ
トグラフィーにより非標識画分と分画し、ラクトパーオ
キシダーゼ標識抗体を得た。
【００１７】《実施例９．》テイコプラニン固定化エチ
レン酢酸ビニル共重合体（ＥＶＡ） カテーテルの調整
テイコプラニン１％水溶液とデンプン糊とを混合し、Ｅ
ＶＡカテーテルの内部に塗布乾燥させた。次に光ファイ
バーを用いて、当該カテーテルの内部に均一に紫外線を
照射し、ＥＶＡカテーテルの内部にテイコプラニンを共
有結合させた。次に、同カテーテルを精製水に浸漬し、
カテーテル内部のデンプン糊を溶解させた。更に、同カ
テーテルの内部を１Ｎ ＮａＯＨで充分に洗浄浄した
後、パイロジェンフリーの精製水で、流出液が中性にな
る迄充分に洗浄した。更に、同カテーテルをポリスチレ
ン製の袋に詰め、γ線滅菌した。
レン酢酸ビニル共重合体（ＥＶＡ） カテーテルの調整
テイコプラニン１％水溶液とデンプン糊とを混合し、Ｅ
ＶＡカテーテルの内部に塗布乾燥させた。次に光ファイ
バーを用いて、当該カテーテルの内部に均一に紫外線を
照射し、ＥＶＡカテーテルの内部にテイコプラニンを共
有結合させた。次に、同カテーテルを精製水に浸漬し、
カテーテル内部のデンプン糊を溶解させた。更に、同カ
テーテルの内部を１Ｎ ＮａＯＨで充分に洗浄浄した
後、パイロジェンフリーの精製水で、流出液が中性にな
る迄充分に洗浄した。更に、同カテーテルをポリスチレ
ン製の袋に詰め、γ線滅菌した。
【００１８】《実施例１０．》 細菌の検出 実施例５に示した方法に準じて、カナマイシンを共有結
合させたマイクロプレートの各穴を１ＮのＮａＯＨ溶液
で処理した後、パイロジェンフリーの精製水で充分に洗
浄し、無菌的に乾燥した。当該マイクロプレートの各穴
に、被検ヒト血清（無菌的調整）２００ｕｌを添加、３
７℃で１時間反応させた。次に、当該マイクロプレート
の各穴をリン酸緩衝液２００ｕｌで洗浄した。次に、当
該マイクロプレートの各穴に、酵素標識特異抗体（赤痢
菌、大腸菌、緑膿菌、サルモネラ菌等に対する特異抗
体）２００ｕｌを１種類づつ、別々に添加し、３７℃で
１時間反応させた。１時間後、プレートリーダーで４９
２ｎｍの波長を測定し、吸光度を求めた。標準菌を用い
て同様の操作を行ない、被検ヒト血清中に存在する細菌
を同定した。
合させたマイクロプレートの各穴を１ＮのＮａＯＨ溶液
で処理した後、パイロジェンフリーの精製水で充分に洗
浄し、無菌的に乾燥した。当該マイクロプレートの各穴
に、被検ヒト血清（無菌的調整）２００ｕｌを添加、３
７℃で１時間反応させた。次に、当該マイクロプレート
の各穴をリン酸緩衝液２００ｕｌで洗浄した。次に、当
該マイクロプレートの各穴に、酵素標識特異抗体（赤痢
菌、大腸菌、緑膿菌、サルモネラ菌等に対する特異抗
体）２００ｕｌを１種類づつ、別々に添加し、３７℃で
１時間反応させた。１時間後、プレートリーダーで４９
２ｎｍの波長を測定し、吸光度を求めた。標準菌を用い
て同様の操作を行ない、被検ヒト血清中に存在する細菌
を同定した。
Claims (7)
- 【請求項１】 不溶性担体の表面にアジド基を有するポ
リマー等を塗布した後、被固定化抗生物質を塗布し、更
に光を照射することを特徴とする抗生物質の固定化方
法。 - 【請求項２】 Ｏ−ニトロベンジルエステルを不溶性担
体の表面に塗布、光照射した後、当該担体を水溶性カル
ボジイミドを溶解した緩衝液に浸漬し、更に抗生物質を
溶解した緩衝液に浸漬することを特徴とする抗生物質の
固定化方法。 - 【請求項３】 リン酸緩衝液中 でｐ−ａｚｉｄｏｂｅ
ｎｚｏｙｌｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅと反応させる
ことにより、フェニルアジド基を導入した抗生物質を被
固定化担体に塗布した後、更に光を照射することを特徴
とする抗生物質の固定化方法。 - 【請求項４】 請求項１、または請求項２、または請求
項３記載の方法により作製した不溶性担体を用いて、Ｌ
ＰＳを捕捉した後、標識抗体または発色合成基質により
定量する方法。 - 【請求項５】 請求項１、または請求項２、または請求
項３記載の方法により作製した不溶性担体を用いて微生
物を捕捉した後、標識抗体により検出する方法。 - 【請求項６】 請求項１、または請求項２、または請求
項３記載の方法により、抗生物質を固定化したことを特
徴とする不溶性担体。 - 【請求項７】 ａ）緩衝液中でｐ−ａｚｉｄｏｂｅｎｚ
ｏｙｌｏｘｙ ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅと反応させるこ
とにより、フェニルアジド基を導入した被標識物質（ま
たは酵素または蛍光物質）と ｂ）酵素（または被標識物質または蛍光物質）とを緩衝
液中で光反応させることにより調製した標識物質。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP16726493A JPH07151758A (ja) | 1993-05-30 | 1993-05-30 | 光化学反応による抗生物質の担体への固定化方法とその担体を用いたｌｐｓおよび微生物の捕捉方法および定量方法。 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP16726493A JPH07151758A (ja) | 1993-05-30 | 1993-05-30 | 光化学反応による抗生物質の担体への固定化方法とその担体を用いたｌｐｓおよび微生物の捕捉方法および定量方法。 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH07151758A true JPH07151758A (ja) | 1995-06-16 |
Family
ID=15846517
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP16726493A Pending JPH07151758A (ja) | 1993-05-30 | 1993-05-30 | 光化学反応による抗生物質の担体への固定化方法とその担体を用いたｌｐｓおよび微生物の捕捉方法および定量方法。 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH07151758A (ja) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2006017554A (ja) * | 2004-06-30 | 2006-01-19 | Daikin Ind Ltd | 磁気ビーズ及び微生物検出方法 |
| JP2016509101A (ja) * | 2013-01-18 | 2016-03-24 | セルガード エルエルシー | 表面改質剤、改質された材料及び方法 |
| KR20170001341A (ko) * | 2015-06-26 | 2017-01-04 | 고려대학교 산학협력단 | 폴리믹신 b의 표면 고정화를 통한 그람 음성균의 신속 검출 방법 |
-
1993
- 1993-05-30 JP JP16726493A patent/JPH07151758A/ja active Pending
Cited By (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2006017554A (ja) * | 2004-06-30 | 2006-01-19 | Daikin Ind Ltd | 磁気ビーズ及び微生物検出方法 |
| US11725099B2 (en) | 2012-07-18 | 2023-08-15 | Celgard, Llc | Surface modifying agents, modified materials and methods |
| JP2016509101A (ja) * | 2013-01-18 | 2016-03-24 | セルガード エルエルシー | 表面改質剤、改質された材料及び方法 |
| US10240031B2 (en) | 2013-01-18 | 2019-03-26 | Celgard, Llc | Surface modifying agents, modified materials and methods |
| JP2019070134A (ja) * | 2013-01-18 | 2019-05-09 | セルガード エルエルシー | 表面改質基板 |
| CN113764824A (zh) * | 2013-01-18 | 2021-12-07 | 赛尔格有限责任公司 | 隔板设有表面改性剂的电池 |
| KR20170001341A (ko) * | 2015-06-26 | 2017-01-04 | 고려대학교 산학협력단 | 폴리믹신 b의 표면 고정화를 통한 그람 음성균의 신속 검출 방법 |
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