JP5258012B2 - 新規なrankl−グリコサミノグリカン結合体、及び該活性調節剤。 - Google Patents
新規なrankl−グリコサミノグリカン結合体、及び該活性調節剤。 Download PDFInfo
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Description
CH:コンドロイチン
CS:コンドロイチン硫酸
CS−A:コンドロイチン硫酸A
DS:デルマタン硫酸(CS−B:コンドロイチン硫酸ともいう)
CS−C:コンドロイチン硫酸C
CS−D:コンドロイチン硫酸D
CS−E:コンドロイチン硫酸E
GAG:グリコサミノグリカン
GAGは、細胞外マトリクスの構成成分の一つとして生体内に存在しており、その中のCSは、関節領域において、サプリメント、関節内治療薬として既に臨床応用されている。最近の研究においては、その動的な生体活性が注目されおり、DS、CS−E及びヘパラン硫酸は、L−セレクチン、P−セレクチン及びCD44に特異的に結合し生体活性を発現すること(非特許文献1)や硫酸化多糖類がBMPと結合して、その生理活性を増強すること(非特許文献2)等の報告がある。また、骨質を溶かす酵素の破骨細胞による放出や骨表面の硫酸化を阻害することに基づく骨吸収の抑制作用を有する物質についての報告や、硫酸化GAGのカルシウム塩を含有する口腔用組成物が歯周病原性細菌の内毒素刺激による骨のカルシウム遊離量に抑制効果を示すこと(特許文献1)や硫酸化GAGナトリウムとカルシウム化合物を併用する骨代謝改善剤が内毒素やヒト副甲状腺ホルモン等による骨のカルシウム遊離量に抑制効果を示すこと(特許文献2)及びインシュリン、プロタミン及びGAGから選択される少なくとも1種を含む石灰化促進剤と骨補填剤からなる骨疾患治療剤(特許文献3)等の報告がある。
また本発明は、本発明結合体を含有する医療用材料(以下、「本発明医療用材料2」という。)を提供する。
<1>本発明結合体
本発明結合体は、DS及び/又はCS−EとRANKL分子とから構成される結合体である。
<2>本発明担体1
本発明担体1は、RANKL分子を固定化した担体である。
i;Suvi Passila, J. Clin. Path., 29:116−120(1976);B. R. Brodeur, F. E. Ashton及び B.B. Diena, The Journal of Medical Microbiology, Vol. 15, No. 1:1−9(1981);J. Clin. Path., 29:150−153(1976);石川栄治、他編「酵素免疫測定法」株式会社医学書院、1978年〕などを挙げることができる。
<3>本発明担体2
本発明担体2は、本発明結合体又はRANKLを、分離、精製及び/又は検出するための、DS又はCS−Eを固定化した担体である。
<4> 本発明方法1
本発明方法1は、本発明担体1を用いることを特徴とする、本発明結合体、DS又はCS−Eを分離、精製及び/又は検出する方法である。
<5>本発明方法2
本発明方法2は、本発明担体2を用いることを特徴とする、本発明結合体又はRANKL分子を分離、精製及び/又は検出する方法である。
<6>本発明キット1
本発明キット1は、本発明担体1を含むキットであり、本発明方法1によりDS又はCS−Eを分離、精製及び/又は検出することができる。
<7>本発明キット2
本発明キット2は、本発明担体2を含むキットであり、本発明方法2によりRANKL分子を分離、精製及び/又は検出することができる。
<8>本発明方法3
本発明方法3は、DS又はCS−Eにより、RANKL分子の生物学的活性を促進又は阻害する方法である。
<9>本発明方法4
本発明方法4は、RANKL分子により、DS又はCS−Eの生物学的活性を抑制又は阻害する方法である。
<10>本発明組成物1
本発明組成物1は、DS又はCS−Eを含有する、RANKL分子の生物学的活性を促進又は阻害する組成物である。
<11>本発明組成物2
本発明組成物2は、RANKL分子を含有する、DS又はCS−Eの生物学的活性を促進又は阻害する組成物である。
<12>本発明医療用材料1
本発明医療用材料1は、本発明組成物1又は本発明組成物2を含有する医療用材料である。当該組成物は、各種疾病の予防及び/又は治療の為の種々の医療用材料として用いることが可能である。
<13>本発明医療用材料2
本発明医療材料2は、本発明結合体を含有する医療材料である。本発明に係るRANKL−DS結合体及びRANKL−CS−E結合体は、各種疾病の予防及び/又は治療のための種々の医療用材料として用いることが可能である。
実施例1
各GAG(CH、CS、CS−A,DS、CS−C、CS−D、CS−E)を10μg/mL、300μg/mLとなるように調製し、それぞれ24穴細胞培養用プレートに添加した。10−6MプロスタグランジンE2(以下、PEG2という。SIGMA社製)をさらに添加し、CO2(5%)、37℃で3時間静置した。その後、ddYマウス(6週齢雌)の腓骨、大腿骨を摘出し、両骨の遠心端より骨髄細胞を採取した。骨髄細胞は24穴細胞培養用プレートに5×106細胞/穴となる様に播種し、10%牛胎児血清(ベーリンガー社製、以下FCSという。)含有Minimum Essential Medium Alpha Medium(GIBCO社製、以下αMEMという。)培地にて8日間37℃、CO2インキュベーター内で培養した。8日間の培養の後、破骨細胞のマーカーである酒石酸抵抗性酸性フォスファターゼ(以下、TRAPという。)をナフトールAS−BIフォスフェート及びfast garnet GBC saltを含有するアゾ色素法を用いた染色測定キット「Acid Phosphatase Leukocyte」(SIGMA社製)を用いて染色し、形成された破骨細胞の数を顕微鏡下で計測した。
実施例2
破骨細胞の骨破壊・吸収活性はピットアッセイにて測定した。ddYマウス(六週齢雌)の腓骨、大腿骨を摘出し、両骨の遠心端より骨髄細胞を採取した。骨髄細胞はOsteologicTMプレートに4×106細胞/穴となるように播種した。10−6M PEG2刺激下において300μg/mLのDS及びCS−Eを各プレートへ添加した。10日間の培養の後、プレート上の細胞を除去し顕微鏡にてピットを計測した。
図4及び5からわかるように、PEG2刺激下においてDS及びCS−Eは骨吸収を顕著に減少させることがわかる。
実施例3
破骨細胞の前駆細胞であるRANKL誘導性の単核細胞RAW−264.7(以下「RAW細胞」という)及び破骨細胞支持細胞であるST−2細胞を96ウェルプレートに2×104個となるように播種した。その後DS及びCS−Eを0〜300μg/mL(0、0.29、1.17、4.68、18.8、75、300μg/mL)をそれぞれ各プレートへ添加した。GAGを添加した後、1,3,6日目に540〜620nmにおける吸光度をマイクロプレートリーダーで測定し、それぞれの細胞の生細胞の指標とした。
実施例4
DS及びCS−E300μg/mLをそれぞれ24穴細胞培養用プレートに添加した。RANKL(40μg/mL)及びM−CSF(50μg/mL)をさらに添加し、CO2(5%)、37℃で3三時間静置した。その後、ddYマウス(6週齢雌)の腓骨、大腿骨を摘出し、両骨の遠心端より骨髄細胞を採取した。骨髄細胞は24穴細胞培養用プレートに5×106細胞/穴となる様に播種し、10%FCS含有αMEM培地にて8日間37℃、CO2インキュベーター内で培養した。コントロールとしては骨髄細胞のみを培養したもの及びRANKL(40μg/mL)及びM−CSF(50μg/mL)のみを骨髄細胞に添加したものを用いた。8日間の培養の後、TRAPをAcid Phosphatase Leukocyteを用いて染色し、形成された破骨細胞の数を顕微鏡下で計測した。
実施例5
次にウエスタンブロッティングによりDS及びCS−EのRANKの抑制効果を調べた。
実施例6
AffinixQ(イニシャム社製)のセンサーセルを用いて相互作用実験を行った。まず、センサーチップ上にRANKL(10μg/mL)を2μg乗せ、4時間乾燥させ固着した。チャンバーにブロッキング剤として0.1%BSAを添加し、1%PBSを10mL注入後、センサーチップをPBS中に浸漬し、水晶の振動数が安定するまで静置した。水晶の振動数の安定後、PBS中にDSを100μg/mL又は300μg/mLとなるように添加し、振動数を測定した。PBS及びRANK(モル比でRANKL:RANK=2:1)をコントロールとして用いた。
Claims (11)
- デルマタン硫酸を固定化した担体を用いることを特徴とする、RANKL分子を分離、精製、及び/又は検出する方法。
- 固定化の方法が担体結合法によるものである、請求項1に記載の方法。
- 担体結合法が物理的な吸着を利用したものである、請求項2に記載の方法。
- 担体が無機物質である、請求項1−3の何れか1項に記載の方法。
- 無機物質が活性炭、酸性白土、漂白土、カオリナイト、アルミナ、シリカゲル、ベンナイト、金属酸化物、ヒドロキシアパタイト又はリン酸カルシウムである、請求項4に記載の方法。
- 固定した担体をカラムに詰めて試料を該カラムに通す工程を含むことを特徴とする、請求項1−5の何れか1項に記載の方法。
- RANKL分子の検出を、RANKL分子に対する抗体を用いて行うことを特徴とする、請求項1−6の何れか1項に記載の方法。
- 抗体がポリクローナル抗体である、請求項7に記載の方法。
- 抗体を標識物質により標識することを特徴とする、請求項7又は8に記載の方法。
- 標識物質が、FITC、フィコエリトン、ユーロピウム、フィコシアニン、ローダミン、テキサスレッド、ウンベリフェロン、トリカラー、シアニン又は7−アミノ−4−メチルクマリン−3−酢酸である、請求項9に記載の方法。
- デルマタン硫酸がウシ腎由来である、請求項1−10の何れか1項に記載の方法。
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