JPH07117535B2 - ヒトプロテインｓに免疫学的測定方法、それに用いる測定試薬及びキット - Google Patents
ヒトプロテインｓに免疫学的測定方法、それに用いる測定試薬及びキットInfo
- Publication number
- JPH07117535B2 JPH07117535B2 JP63279479A JP27947988A JPH07117535B2 JP H07117535 B2 JPH07117535 B2 JP H07117535B2 JP 63279479 A JP63279479 A JP 63279479A JP 27947988 A JP27947988 A JP 27947988A JP H07117535 B2 JPH07117535 B2 JP H07117535B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- antibody
- human protein
- protein
- human
- c4bp
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】 （イ）産業上の利用分野 本発明は溶液状態にあるヒトプロティンＳを免疫学的に
測定する方法、それに用いる測定試薬及びキットに関す
る。
測定する方法、それに用いる測定試薬及びキットに関す
る。
更に詳しくは、ヒト補体系制御因子のC4bpとプロティン
Ｓとの複合体を測定することなく、フリーのプロティン
Ｓのみを特異的且つ高感度に測定することのできるヒト
プロティンＳの免疫学的測定方法、それに用いる測定試
薬及びキットに関する。
Ｓとの複合体を測定することなく、フリーのプロティン
Ｓのみを特異的且つ高感度に測定することのできるヒト
プロティンＳの免疫学的測定方法、それに用いる測定試
薬及びキットに関する。
（ロ）従来技術 プロティンＳはプロティンＣと同様にビタミンＫ依存性
タンパクで、1977年DiScipioらによりウシとヒトから分
離された［DiScipio,R.G,Hermodson,M.A,Yates,S.G.and
Davie,E.W;Biochemistry,16,698〜706（1977）参
照］。ヒトプロティンＳは血漿中に約10mg/含まれ、
分子量69,000の一本鎖の糖タンパクである。またその構
造は、他のビタミンＫ依存性因子の構造とよく似てお
り、NH2末端に約10個のγ−カルボキシグルタミン酸（G
la）を有している。ヒトプロティンＳは血中では２つの
形で存在し、１つはフリーのプロティンＳであり、この
フリーのものが、活性化プロティンＣの補助因子として
働く。もう１つは、補体系の制御因子である高分子C4b
結合タンパク（C4bp）と非共有結合して存在する。この
“フリーのプロティンS"と“結合しているプロティンS"
の比率はほぼ1:1とされている。
タンパクで、1977年DiScipioらによりウシとヒトから分
離された［DiScipio,R.G,Hermodson,M.A,Yates,S.G.and
Davie,E.W;Biochemistry,16,698〜706（1977）参
照］。ヒトプロティンＳは血漿中に約10mg/含まれ、
分子量69,000の一本鎖の糖タンパクである。またその構
造は、他のビタミンＫ依存性因子の構造とよく似てお
り、NH2末端に約10個のγ−カルボキシグルタミン酸（G
la）を有している。ヒトプロティンＳは血中では２つの
形で存在し、１つはフリーのプロティンＳであり、この
フリーのものが、活性化プロティンＣの補助因子として
働く。もう１つは、補体系の制御因子である高分子C4b
結合タンパク（C4bp）と非共有結合して存在する。この
“フリーのプロティンS"と“結合しているプロティンS"
の比率はほぼ1:1とされている。
C4bp−プロティンＳ複合体におけるプロティンＳの機能
の重要性は、リン脂質の陰性荷電表面と非常に親和力が
強いことにある［Nelsestuen,G.L.,Kisiel,W. and DiSc
ipio,R.G.:Biochemistry,17;2134〜2138,（1978）］。
細胞が傷害されたり活性化を受けると、Ca2+の存在下で
プロティンＳのGla−domainはリン脂質に結合し、更に
このプロティンＳにC4bpが複合体を形成して結合してそ
の機能を発揮するものと考えられている［Dahlback,B.:
Semin. Thromb. Haemostas.,10;139〜148（1984）］。
の重要性は、リン脂質の陰性荷電表面と非常に親和力が
強いことにある［Nelsestuen,G.L.,Kisiel,W. and DiSc
ipio,R.G.:Biochemistry,17;2134〜2138,（1978）］。
細胞が傷害されたり活性化を受けると、Ca2+の存在下で
プロティンＳのGla−domainはリン脂質に結合し、更に
このプロティンＳにC4bpが複合体を形成して結合してそ
の機能を発揮するものと考えられている［Dahlback,B.:
Semin. Thromb. Haemostas.,10;139〜148（1984）］。
プロティンS,プロティンＣの凝固，線溶系に関する機能
については、最近の研究からその制御機構に関して極め
て重要な働きをしていることが解明され、その生理的意
義についても血栓症との関わりで注目されている。プロ
ティンＳの先天性欠乏は血栓症の原因となり得ることが
報告されている［Comb,P.C.,Nixon,R.R.,Cooper,M.R.an
d Esmon,C.T.:J.Clin.Invest.,74;2082〜2088,（198
4）］。
については、最近の研究からその制御機構に関して極め
て重要な働きをしていることが解明され、その生理的意
義についても血栓症との関わりで注目されている。プロ
ティンＳの先天性欠乏は血栓症の原因となり得ることが
報告されている［Comb,P.C.,Nixon,R.R.,Cooper,M.R.an
d Esmon,C.T.:J.Clin.Invest.,74;2082〜2088,（198
4）］。
したがって、プロティンＳの作用機構を明らかにするこ
と、また、プロティンＳの血中における抗原量，活性量
を測定し、その同行を把握することができれば、それは
基礎医学，臨床医学の領域において非常に重要な意味を
持つと考えられる。
と、また、プロティンＳの血中における抗原量，活性量
を測定し、その同行を把握することができれば、それは
基礎医学，臨床医学の領域において非常に重要な意味を
持つと考えられる。
従来知られたプロティンＳの測定方法として、プロティ
ンＳに対する抗血清を用いるローレル法，ポリクローナ
ル抗体を用いるIRMA（immunoradiometricassay）及びEI
A（enzyme immunoassay）をあげることができるが、こ
れらの方法によって得られた測定値は、フリーのプロテ
ィンＳと、C4bpと複合体を形成しているプロティンＳの
両者を含めて測定していることになる。
ンＳに対する抗血清を用いるローレル法，ポリクローナ
ル抗体を用いるIRMA（immunoradiometricassay）及びEI
A（enzyme immunoassay）をあげることができるが、こ
れらの方法によって得られた測定値は、フリーのプロテ
ィンＳと、C4bpと複合体を形成しているプロティンＳの
両者を含めて測定していることになる。
そのため従来フリーのプロティンＳのみを測定する方法
においては、検体をポリエチレングリコール水溶液等で
処理しC4bpとプロティンＳとの複合体を沈澱させて除去
する必要があった。しかしながら、この測定方法は、操
作が極めて頻雑であるという欠点を有している。
においては、検体をポリエチレングリコール水溶液等で
処理しC4bpとプロティンＳとの複合体を沈澱させて除去
する必要があった。しかしながら、この測定方法は、操
作が極めて頻雑であるという欠点を有している。
また、モノクローナル抗体は単一の抗原決定基にたいし
て特異的であり、かつ同一の特異性を有する抗体を安定
的に産生できるという利点から抗原タンパク質の機能及
び構造の解析、あるいは免疫測定（EIA,RIA）に近年、
一般的に広く利用されるようになってきた。特に抗原タ
ンパク質の機能解析，分子解析には抗原タンパク質の機
能に関与する部位、又は特殊な構造部位を認識する抗体
を見出すことが有力な手段となり得る。
て特異的であり、かつ同一の特異性を有する抗体を安定
的に産生できるという利点から抗原タンパク質の機能及
び構造の解析、あるいは免疫測定（EIA,RIA）に近年、
一般的に広く利用されるようになってきた。特に抗原タ
ンパク質の機能解析，分子解析には抗原タンパク質の機
能に関与する部位、又は特殊な構造部位を認識する抗体
を見出すことが有力な手段となり得る。
そして、フリーのヒトプロティンＳの測定方法において
も、フリーのプロティンＳと、複合体を形成しているプ
ロティンＳとを区別して認識する２種のモノクローナル
抗体を用いて、極めて高い特異性でフリーのヒトプロテ
ィンＳの抗原量等を測定する方法が行われている（特願
昭61−298881号公報）。
も、フリーのプロティンＳと、複合体を形成しているプ
ロティンＳとを区別して認識する２種のモノクローナル
抗体を用いて、極めて高い特異性でフリーのヒトプロテ
ィンＳの抗原量等を測定する方法が行われている（特願
昭61−298881号公報）。
（ハ）発明が解決しようとする問題点 しかしながら、２種のモノクローナル抗体を用いたフリ
ーのヒトプロティンＳの測定方法においては、抗原の特
定部位以外とは反応しないというモノクローナル抗体の
特性故に、抗原との親和性が必ずしも十分に高くない場
合があり、より高い感度で、フリーのプロティンＳを測
定することのできるプロティンＳの免疫学的測定方法が
望まれていた。
ーのヒトプロティンＳの測定方法においては、抗原の特
定部位以外とは反応しないというモノクローナル抗体の
特性故に、抗原との親和性が必ずしも十分に高くない場
合があり、より高い感度で、フリーのプロティンＳを測
定することのできるプロティンＳの免疫学的測定方法が
望まれていた。
（ニ）問題点を解決するための手段 そこで本発明者らは、かかる従来技術の問題点に鑑み
て、溶液状態にあるフリーのヒトプロティンＳを容易に
且つ高感度で測定し得る測定方法，測定試薬及びキット
を開発するべく鋭意検討した結果、C4bpとプロティンＳ
との複合体は認識せず、フリーのヒトプロティンＳを特
異的に認識して結合し得るモノクローナル抗体と、ヒト
プロティンＳを特異的に認識し、抗原との親和性が高い
ポリクローナル抗体とを組合せることにより、高い特異
性及び高感度でフリーのヒトプロティンＳを容易に測定
し得ることを見出し本発明に到達した。
て、溶液状態にあるフリーのヒトプロティンＳを容易に
且つ高感度で測定し得る測定方法，測定試薬及びキット
を開発するべく鋭意検討した結果、C4bpとプロティンＳ
との複合体は認識せず、フリーのヒトプロティンＳを特
異的に認識して結合し得るモノクローナル抗体と、ヒト
プロティンＳを特異的に認識し、抗原との親和性が高い
ポリクローナル抗体とを組合せることにより、高い特異
性及び高感度でフリーのヒトプロティンＳを容易に測定
し得ることを見出し本発明に到達した。
すなわち本発明は、 1. 不溶性担体に結合した抗体と標識抗体とを用いてヒ
トプロティンＳの免疫学的測定を行うに際し、いずれか
一方の抗体としてヒトプロティンＳを特異的に認識する
ポリクローナル抗体を用い、他方の抗体としてヒト補体
系制御因子のC4bpとプロティンＳとの複合体は認識せ
ず、フリーのヒトプロティンＳを特異的に認識して結合
し得るモノクローナル抗体を用いることを特徴とするヒ
トプロティンＳの免疫学的測定方法， 2. 不溶性担体に結合した抗体と標識抗体とからなり、
いずれか一方の抗体がヒトプロティンＳを特異的に認識
するポリクローナル抗体であり、他方の抗体がヒト補体
系制御因子のC4bpとプロティンＳの複合体は認識せず、
フリーのヒトプロティンＳを特異的に認識して結合し得
るモノクローナル抗体であるヒトプロティンＳの免疫学
的測定用の測定試薬，及び 3. 不溶性担体に結合した体と標識抗体とからなり、い
ずれか一方の抗体がヒトプロティンＳを特異的に認識す
るポリクローナル抗体であり、他方の抗体がヒト補体系
制御因子のC4bpとプロティンＳの複合体は認識せず、フ
リーのヒトプロティンＳを特異的に認識して結合し得る
モノクローナル抗体であるヒトプロティンＳの免疫学的
測定用の測定試薬と、これに（ａ）溶解剤，（ｂ）洗浄
剤及び酵素で標識化した抗体を用いる場合には、（ｃ）
酵素活性を測定するための基質及びその反応停止剤を組
合せてなるヒトプロティンＳの免疫学的測定用のキット である。
トプロティンＳの免疫学的測定を行うに際し、いずれか
一方の抗体としてヒトプロティンＳを特異的に認識する
ポリクローナル抗体を用い、他方の抗体としてヒト補体
系制御因子のC4bpとプロティンＳとの複合体は認識せ
ず、フリーのヒトプロティンＳを特異的に認識して結合
し得るモノクローナル抗体を用いることを特徴とするヒ
トプロティンＳの免疫学的測定方法， 2. 不溶性担体に結合した抗体と標識抗体とからなり、
いずれか一方の抗体がヒトプロティンＳを特異的に認識
するポリクローナル抗体であり、他方の抗体がヒト補体
系制御因子のC4bpとプロティンＳの複合体は認識せず、
フリーのヒトプロティンＳを特異的に認識して結合し得
るモノクローナル抗体であるヒトプロティンＳの免疫学
的測定用の測定試薬，及び 3. 不溶性担体に結合した体と標識抗体とからなり、い
ずれか一方の抗体がヒトプロティンＳを特異的に認識す
るポリクローナル抗体であり、他方の抗体がヒト補体系
制御因子のC4bpとプロティンＳの複合体は認識せず、フ
リーのヒトプロティンＳを特異的に認識して結合し得る
モノクローナル抗体であるヒトプロティンＳの免疫学的
測定用の測定試薬と、これに（ａ）溶解剤，（ｂ）洗浄
剤及び酵素で標識化した抗体を用いる場合には、（ｃ）
酵素活性を測定するための基質及びその反応停止剤を組
合せてなるヒトプロティンＳの免疫学的測定用のキット である。
一般に抗原の２つの異なる部位に結合する抗体を用いて
抗体の有無又はその量を測定する方法は、サンドイッチ
法と呼ばれ、例えばワイド（Wide）の「放射線免疫検定
法（Radioimmunoassay Methods）」199〜206（1970）に
記載されている。
抗体の有無又はその量を測定する方法は、サンドイッチ
法と呼ばれ、例えばワイド（Wide）の「放射線免疫検定
法（Radioimmunoassay Methods）」199〜206（1970）に
記載されている。
本発明のヒトプロティンＳの免疫学的測定方法において
は、抗原の２つの異なる部位に結合する２種類の抗体と
して、ヒトプロティンＳを特異的に認識するモノクロー
ナル抗体とポリクローナル抗体を使用し、そのモノクロ
ーナル抗体としてはヒト補体系制御因子の１つであるヒ
トC4b結合タンパク（C4bp）とヒトプロティンＳの複合
体を認識せず、フリーのヒトプロティンＳを特異的に認
識して結合し得るモノクローナル抗体を使用し、ポリク
ローナル抗体としてはヒトプロティンＳを特異的に認識
して結合する抗ヒトプロティンＳ抗血清の抗体成分を使
用する。
は、抗原の２つの異なる部位に結合する２種類の抗体と
して、ヒトプロティンＳを特異的に認識するモノクロー
ナル抗体とポリクローナル抗体を使用し、そのモノクロ
ーナル抗体としてはヒト補体系制御因子の１つであるヒ
トC4b結合タンパク（C4bp）とヒトプロティンＳの複合
体を認識せず、フリーのヒトプロティンＳを特異的に認
識して結合し得るモノクローナル抗体を使用し、ポリク
ローナル抗体としてはヒトプロティンＳを特異的に認識
して結合する抗ヒトプロティンＳ抗血清の抗体成分を使
用する。
次に本発明によるヒトプロティンＳの免疫学的測定方
法、それに用いる測定試薬及びキットを具体的に説明す
る。
法、それに用いる測定試薬及びキットを具体的に説明す
る。
ヒトプロティンＳの免疫学的測定方法； ヒトプロティンＳに対するポリクローナル抗体（第１抗
体）を適当な不溶性担体（例えばプラスチック容器）に
固定化する（以下これを“固定化抗体”という）。つい
で不溶性担体と測定しようとする試薬又は検体試料との
非特異的結合を避けるために適当な物質（例えば牛血清
アルブミン）で不溶性担体の表面を被覆する。
体）を適当な不溶性担体（例えばプラスチック容器）に
固定化する（以下これを“固定化抗体”という）。つい
で不溶性担体と測定しようとする試薬又は検体試料との
非特異的結合を避けるために適当な物質（例えば牛血清
アルブミン）で不溶性担体の表面を被覆する。
このようにして得られた第１抗体が固定化された不溶性
担体を検体試料と一定時間及び温度で接触させ反応させ
る。この間に固定化抗体（第１抗体）と検体試料中のヒ
トプロティンＳが結合する。ついで適当な洗浄液で洗っ
た後、適当な標識物質（例えば酵素）で標識したヒトプ
ロティンＳに対するモノクローナル抗体（第２抗体）の
溶液（例えば水溶液）を、不溶性担体における固定化抗
体に結合したヒトプロティンＳと一定時間及び温度で接
触させ第２抗体と反応させる。これを適当な洗浄液で洗
い、次いで不溶性担体上に存在する第２抗体に標識され
た標識物質の量を測定する。
担体を検体試料と一定時間及び温度で接触させ反応させ
る。この間に固定化抗体（第１抗体）と検体試料中のヒ
トプロティンＳが結合する。ついで適当な洗浄液で洗っ
た後、適当な標識物質（例えば酵素）で標識したヒトプ
ロティンＳに対するモノクローナル抗体（第２抗体）の
溶液（例えば水溶液）を、不溶性担体における固定化抗
体に結合したヒトプロティンＳと一定時間及び温度で接
触させ第２抗体と反応させる。これを適当な洗浄液で洗
い、次いで不溶性担体上に存在する第２抗体に標識され
た標識物質の量を測定する。
なお上記反応は、固定化抗体，標識抗体及びヒトプロテ
ィンＳを含有する検体試料を同時に混合し、一定時間及
び温度でこれら三者を同時に接触させて反応させること
もできる。
ィンＳを含有する検体試料を同時に混合し、一定時間及
び温度でこれら三者を同時に接触させて反応させること
もできる。
かくしてその値から検体試料中のフリーのヒトプロティ
ンＳの量を算出することができる。
ンＳの量を算出することができる。
測定試料及びキットの構成 ヒトプロティンＳの免疫学的測定用の測定試薬は、上述
した不溶性担体に結合した抗体と、標識抗体とからな
る。
した不溶性担体に結合した抗体と、標識抗体とからな
る。
また、ヒトプロティンＳの免疫学的測定用のキットは、
上記の測定試薬と、これら測定試薬を能率よく且つ簡便
に利用するための補助剤として、例えば固体状の試薬又
は液状の検体を溶解させるための溶解剤，不溶性担体に
結合した抗体を洗浄するために使用される洗浄剤，及び
酵素で標識化した抗体を用いる場合には、酵素活性を測
定するための基質及びその反応停止剤，その他の免疫学
的測定用のキットとして通常使用されるものが挙げられ
る。本発明の測定方法，測定試薬，又は測定用キットに
は、非特異的反応を低下させ高感度に測定するために、
界面活性剤，体液ないしはタンパク溶液，スキムミルク
等、なかでもスキムミルクを添加することができる。
上記の測定試薬と、これら測定試薬を能率よく且つ簡便
に利用するための補助剤として、例えば固体状の試薬又
は液状の検体を溶解させるための溶解剤，不溶性担体に
結合した抗体を洗浄するために使用される洗浄剤，及び
酵素で標識化した抗体を用いる場合には、酵素活性を測
定するための基質及びその反応停止剤，その他の免疫学
的測定用のキットとして通常使用されるものが挙げられ
る。本発明の測定方法，測定試薬，又は測定用キットに
は、非特異的反応を低下させ高感度に測定するために、
界面活性剤，体液ないしはタンパク溶液，スキムミルク
等、なかでもスキムミルクを添加することができる。
本発明のヒトプロティンＳの免疫学的測定方法等に使用
される不溶性担体としては、例えばポリスチレン，ポリ
エチレン，ポリプロピレン，ポリエステル，ポリアクリ
ルニトリル，弗素樹脂，架橋デキストラン，ポリサツカ
ライドなどの高分子、その他紙，ガラス，金属，アガロ
ース及びこれらの組合せなどを例示することができる。
される不溶性担体としては、例えばポリスチレン，ポリ
エチレン，ポリプロピレン，ポリエステル，ポリアクリ
ルニトリル，弗素樹脂，架橋デキストラン，ポリサツカ
ライドなどの高分子、その他紙，ガラス，金属，アガロ
ース及びこれらの組合せなどを例示することができる。
また不溶性担体の形状としては、例えばトレイ状，球
状，繊維状，棒状，盤状，容器状，セル，試験管などの
種々の形状であることができる。
状，繊維状，棒状，盤状，容器状，セル，試験管などの
種々の形状であることができる。
また、標識抗体の標識物質としては放射性物質，酵素又
は蛍光物質を使用するのが有利である。放射性物質とし
ては125I,131I,14C,3Hなどを、酵素としてはアルカリ性
フォスファターゼ，パーオキシダーゼ，β−Ｄ−ガラク
トシダーゼなど、また蛍光物質としてはフルオレッセイ
ンイソチオシアネート，テトラメチルローダミンイソチ
オシアネートなどを使用することができるが、これらは
例示したものに限らず、免疫学的測定方法に使用されて
いるものであれば、他のものでも使用できる。
は蛍光物質を使用するのが有利である。放射性物質とし
ては125I,131I,14C,3Hなどを、酵素としてはアルカリ性
フォスファターゼ，パーオキシダーゼ，β−Ｄ−ガラク
トシダーゼなど、また蛍光物質としてはフルオレッセイ
ンイソチオシアネート，テトラメチルローダミンイソチ
オシアネートなどを使用することができるが、これらは
例示したものに限らず、免疫学的測定方法に使用されて
いるものであれば、他のものでも使用できる。
本発明のポリクローナル抗体は、従来公知の方法でヒト
プロティンＳを抗原として動物に免疫して得られる抗ヒ
トプロティンＳ抗血清の抗体成分として得られるものが
挙げられる。なかでも例えば山羊抗ヒトプロティンＳ−
ポリクローナル抗体，兎抗ヒトプロティンＳ−ポリクロ
ーナル抗体等が好ましく挙げられる。
プロティンＳを抗原として動物に免疫して得られる抗ヒ
トプロティンＳ抗血清の抗体成分として得られるものが
挙げられる。なかでも例えば山羊抗ヒトプロティンＳ−
ポリクローナル抗体，兎抗ヒトプロティンＳ−ポリクロ
ーナル抗体等が好ましく挙げられる。
本発明に使用されるモノクローナル抗体及びその製造方
法については、先に出願された特願昭61−296766号（昭
和61年12月15日出願：発明の名称“モノクローナル抗
体，ハイブリドーマ，モノクローナル抗体の製造方法及
びヒトプロテインＳの分離方法”）の特許出願明細書に
詳細に説明されている。
法については、先に出願された特願昭61−296766号（昭
和61年12月15日出願：発明の名称“モノクローナル抗
体，ハイブリドーマ，モノクローナル抗体の製造方法及
びヒトプロテインＳの分離方法”）の特許出願明細書に
詳細に説明されている。
（ホ）発明の効果 本発明により、溶液状態（例えば血漿中）のフリーのヒ
トプロティンＳを挟雑物の影響を受けることなく高い特
異性及び高い感度で容易に測定することができる。
トプロティンＳを挟雑物の影響を受けることなく高い特
異性及び高い感度で容易に測定することができる。
また、本発明によりC4bpとプロティンＳとの複合体の共
存下においてもフリーのヒトプロティンＳを正確かつ迅
速に測定し得るという、従来には存在しなかった試薬及
びキットが提供される。
存下においてもフリーのヒトプロティンＳを正確かつ迅
速に測定し得るという、従来には存在しなかった試薬及
びキットが提供される。
（ヘ）実施例 以下、実施例により本発明を詳述する。実施例中の％は
重量％を意味する。
重量％を意味する。
参考例１ 抗ヒトプロティンＳ（PS）モノクローナル抗
体と製造及び精製 精製したヒトプロティンＳを雌のBalb/Cマウス（４周
齢）２匹に対して14日間隔で４回免疫した。初回の免疫
はPBSに溶解した。50μｇのヒトプロテインＳを等量の
フロイントの完全アジュバント（Complete Freund's ad
juvant）と混合し、そのエマルジョンを、腹腔内に投与
した（0.5mg/head）、２回目,3回目は、同じく50μｇの
ヒトプロティンＳをフロイントの不完全アジュバント
（Freund's incomplete adjuvant）と混合し、同じく腹
腔内に投与した。最終免疫は30μｇのヒトプロテインＳ
をPBS溶液のまま、マウス尾静脈から追加投与した。最
終免疫の３日後に免疫したマウスの脾臓細胞を細胞融合
に用いた。
体と製造及び精製 精製したヒトプロティンＳを雌のBalb/Cマウス（４周
齢）２匹に対して14日間隔で４回免疫した。初回の免疫
はPBSに溶解した。50μｇのヒトプロテインＳを等量の
フロイントの完全アジュバント（Complete Freund's ad
juvant）と混合し、そのエマルジョンを、腹腔内に投与
した（0.5mg/head）、２回目,3回目は、同じく50μｇの
ヒトプロティンＳをフロイントの不完全アジュバント
（Freund's incomplete adjuvant）と混合し、同じく腹
腔内に投与した。最終免疫は30μｇのヒトプロテインＳ
をPBS溶液のまま、マウス尾静脈から追加投与した。最
終免疫の３日後に免疫したマウスの脾臓細胞を細胞融合
に用いた。
免疫したマウスの脾臓細胞と、同系マウスの骨髄腫細胞
（P3U1）を約2:1〜約15:1の割合で混合し、50％ポリエ
チレングリコール1540（和光純薬（製））を融合促進剤
としてKohlerとMilsteinの方法に従い細胞融合を行っ
た。融合後の細胞は、１×106cells/mlの細胞濃度とな
るように10％FCS・−RPMI−1640培地に懸濁し、96wells
マイクロプレート（Coster）に１ウエルあたり100μ
ずつ文注した。
（P3U1）を約2:1〜約15:1の割合で混合し、50％ポリエ
チレングリコール1540（和光純薬（製））を融合促進剤
としてKohlerとMilsteinの方法に従い細胞融合を行っ
た。融合後の細胞は、１×106cells/mlの細胞濃度とな
るように10％FCS・−RPMI−1640培地に懸濁し、96wells
マイクロプレート（Coster）に１ウエルあたり100μ
ずつ文注した。
融合細胞は、CO2インキュベーター（５％CO2,37℃）中
で培養し、ヒポキサンチン，アミノプテリン；チミジン
を含む培地（HAT培地）で培地交換を行い、HAT培地中で
増殖させて、脾臓細胞と、骨髄腫細胞から成るハイブリ
ドーマのスクリーニングを行った。
で培養し、ヒポキサンチン，アミノプテリン；チミジン
を含む培地（HAT培地）で培地交換を行い、HAT培地中で
増殖させて、脾臓細胞と、骨髄腫細胞から成るハイブリ
ドーマのスクリーニングを行った。
ハイブリドーマの培養上清中の抗体は抗原ヒトプロテイ
ンＳコーティングしたマイクロタイタープレートを用い
ELISA法により検出した。第２抗体には、アルカリホス
ファターゼ標識ウサギ抗マウスIgG抗体を用い、抗原PS
に対する結合性を調べた。融合細胞をまいた合計494の
ウエルのうち、487のウエルにコロニーの形成が認めら
れ、このうち抗原PSに対して結合性を示す抗体産生陽性
ウエルは94ウエルであった。
ンＳコーティングしたマイクロタイタープレートを用い
ELISA法により検出した。第２抗体には、アルカリホス
ファターゼ標識ウサギ抗マウスIgG抗体を用い、抗原PS
に対する結合性を調べた。融合細胞をまいた合計494の
ウエルのうち、487のウエルにコロニーの形成が認めら
れ、このうち抗原PSに対して結合性を示す抗体産生陽性
ウエルは94ウエルであった。
これらの抗体産生陽性ウエルのうち４つのウエルについ
て限界希釈法によるクローニングを２回繰り返して行
い、６個のクローンを得た。得られたクローンは、90％
FCS−10％DMSO中に懸濁させ液体窒素中に保存した。
て限界希釈法によるクローニングを２回繰り返して行
い、６個のクローンを得た。得られたクローンは、90％
FCS−10％DMSO中に懸濁させ液体窒素中に保存した。
各クローンの産生するモノクローナル抗体をクローンを
Balb/Cマウス腹腔内で増殖させ、その腹水からプロティ
ンＡ−Sepharose4Bカラムを用いて精製した。
Balb/Cマウス腹腔内で増殖させ、その腹水からプロティ
ンＡ−Sepharose4Bカラムを用いて精製した。
参考例２ 精製したモノクローナル抗体の性質 マウス腹水から精製した各クローンのIgGについてクラ
ス及びヒトプロティンＳに対する結合性を調べた。
ス及びヒトプロティンＳに対する結合性を調べた。
マウスモノクローナル抗体のクラスは、各クラス特異性
の抗マウス抗血清を用いて、オクタロニー法により決定
した。
の抗マウス抗血清を用いて、オクタロニー法により決定
した。
この結果を下記第２表に示した。
ヒトプロティンＳに対する結合性は、マイクロタイター
プレートに固相化したヒトプロティンＳと適当な濃度に
なるように希釈したモノクローナル抗体とを反応させ、
アルカリ性フォスファクターゼ標識化したヤギ抗マウス
IgGで検出することにより評価した。
プレートに固相化したヒトプロティンＳと適当な濃度に
なるように希釈したモノクローナル抗体とを反応させ、
アルカリ性フォスファクターゼ標識化したヤギ抗マウス
IgGで検出することにより評価した。
その結果６種類のモノクローナル抗体のヒトプロティン
Ｓに対する結合の強さは、2B9F12〜2B9C10＞3C3G8＞3C4
G4＞2B9G3＞＞2E12C7であることが判明した。
Ｓに対する結合の強さは、2B9F12〜2B9C10＞3C3G8＞3C4
G4＞2B9G3＞＞2E12C7であることが判明した。
参考例３ ヒトC4BとプロティンＳ複合体に対する反応
性 精製した前記６種類のモノクローナル抗体を10μg/mlの
濃度でマイクロタイタプレートにコーティングし、１％
BSAでBlocking後、適当な濃度になるように希釈したヒ
ト健常人血漿を加え、血漿中のC4bp−プロティンＳ複合
体とモノクローナル抗体とを反応させた。次に、アルカ
リ性フォスファターゼ標識化した抗C4bp抗体を加え、６
種類のモノクローナル抗体のC4bp−プロティンＳ複合体
に対する結合性を検出し、調べた。
性 精製した前記６種類のモノクローナル抗体を10μg/mlの
濃度でマイクロタイタプレートにコーティングし、１％
BSAでBlocking後、適当な濃度になるように希釈したヒ
ト健常人血漿を加え、血漿中のC4bp−プロティンＳ複合
体とモノクローナル抗体とを反応させた。次に、アルカ
リ性フォスファターゼ標識化した抗C4bp抗体を加え、６
種類のモノクローナル抗体のC4bp−プロティンＳ複合体
に対する結合性を検出し、調べた。
その結果、モノクローナル抗体2E12C7は、フリーのプロ
ティンＳに対しては非常に結合性が弱いが、C4bp−プロ
ティンＳ複合対に対しては、高度に特異的に結合性を示
し、６種類のモノクローナル抗体のC4bp−プロティンＳ
複合体に対する結合の強さは、2E12C7＞＞2B9F10〜2B9C
12＞3C3G8＞3C4G4＞2B9G3であることが判明した。
ティンＳに対しては非常に結合性が弱いが、C4bp−プロ
ティンＳ複合対に対しては、高度に特異的に結合性を示
し、６種類のモノクローナル抗体のC4bp−プロティンＳ
複合体に対する結合の強さは、2E12C7＞＞2B9F10〜2B9C
12＞3C3G8＞3C4G4＞2B9G3であることが判明した。
参考例２及び３で示されるように、C4bpとプロティンＳ
との複合体は認識せず、フリーのヒトプロティンＳを特
異的に認識して結合し得るモノクローナル抗体として2B
9F12及び2B9C10が得られた。
との複合体は認識せず、フリーのヒトプロティンＳを特
異的に認識して結合し得るモノクローナル抗体として2B
9F12及び2B9C10が得られた。
実施例１ （１）抗体固体化ビーズの調製 ポリスチレン製ビーズ（直径6mm）を、山羊抗ヒトプロ
ティンＳ抗体（ポリクローナル抗体:American Diagnost
ica社製）の20μg/mlの濃度を有するpH7.4の0.01Mリン
酸緩衝生理食塩水（PBS）溶液中に４℃の温度で１昼夜
放置した後、PBSで洗浄してから0.5％牛血清アルブミン
（BSA）水溶液中に４℃の温度で１昼夜放置してポスト
コーティング処理を実施することにより抗体固定化ビー
ズを得た。
ティンＳ抗体（ポリクローナル抗体:American Diagnost
ica社製）の20μg/mlの濃度を有するpH7.4の0.01Mリン
酸緩衝生理食塩水（PBS）溶液中に４℃の温度で１昼夜
放置した後、PBSで洗浄してから0.5％牛血清アルブミン
（BSA）水溶液中に４℃の温度で１昼夜放置してポスト
コーティング処理を実施することにより抗体固定化ビー
ズを得た。
（２）ホースラディシュ・ペルオキシダーゼ標識モノク
ローナル抗体の調製 フリーのヒトプロティンＳを特異的に認識するモノクロ
ーナル抗体（2B9F12）の1.0mg/mlのPBS溶液1.0mlに、Ｎ
−（ｍ−マレイミド安息香酸）−Ｎ−サクシンイミドエ
ステル（MBS）の10mg/mlのジメチルホルムアミド溶液50
μを添加し、25℃の温度で30分間反応させた後、セフ
ァデックスＧ−25を充填したカラムを用い、0.1Mリン酸
緩衝液（pH6.0）でゲル過を行い、マレイミド化モノ
クローナル抗体と未反応MBSとを分離した。
ローナル抗体の調製 フリーのヒトプロティンＳを特異的に認識するモノクロ
ーナル抗体（2B9F12）の1.0mg/mlのPBS溶液1.0mlに、Ｎ
−（ｍ−マレイミド安息香酸）−Ｎ−サクシンイミドエ
ステル（MBS）の10mg/mlのジメチルホルムアミド溶液50
μを添加し、25℃の温度で30分間反応させた後、セフ
ァデックスＧ−25を充填したカラムを用い、0.1Mリン酸
緩衝液（pH6.0）でゲル過を行い、マレイミド化モノ
クローナル抗体と未反応MBSとを分離した。
一方、ホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ（HRP）
の1.0mg/mlのPBS溶液2.0mlに、Ｎ−サクシンイミジル−
３−（２−ピリジルチオ）プロピオネート（SPDP）の10
mg/mlエタノール溶液を添加し、25℃で30分間反応させ
た後、セファデックスＧ−25を充填したカラムを用い、
0.01M酢酸緩衝液（pH4.5）でゲル過して精製し、ピリ
ジルジスルフィド化HRPを含有する画分を採取してコロ
ジオンバック中で氷冷下に約10倍に濃縮した。次に、こ
れに0.85％NaClと0.1Mジチオスレイトールとを含有する
0.1M酢酸緩衝液（pH4.5）1mlを添加して、25℃で30分間
撹拌してHRP分子中に導入したピリジルジスルフィド基
を還元した後、セファデックスＧ−25カラムを用い、0.
1Mリン酸緩衝液（pH6.0）でゲル過して、チオール化H
RPを含有する画分を得た。
の1.0mg/mlのPBS溶液2.0mlに、Ｎ−サクシンイミジル−
３−（２−ピリジルチオ）プロピオネート（SPDP）の10
mg/mlエタノール溶液を添加し、25℃で30分間反応させ
た後、セファデックスＧ−25を充填したカラムを用い、
0.01M酢酸緩衝液（pH4.5）でゲル過して精製し、ピリ
ジルジスルフィド化HRPを含有する画分を採取してコロ
ジオンバック中で氷冷下に約10倍に濃縮した。次に、こ
れに0.85％NaClと0.1Mジチオスレイトールとを含有する
0.1M酢酸緩衝液（pH4.5）1mlを添加して、25℃で30分間
撹拌してHRP分子中に導入したピリジルジスルフィド基
を還元した後、セファデックスＧ−25カラムを用い、0.
1Mリン酸緩衝液（pH6.0）でゲル過して、チオール化H
RPを含有する画分を得た。
次に、得られたマレイミド化モノクローナル抗体とチオ
ール化HRPとを混合し、コロジオンバックを用いて氷冷
下に4mg/mlの蛋白質濃度まで濃縮し、４℃で１昼夜放置
した後、ウルトロゲルAcA44（仏,LKB社製）を充填した
カラムを用いてPBSでゲル過することによりHRP標識モ
ノクローナル抗体を得た。
ール化HRPとを混合し、コロジオンバックを用いて氷冷
下に4mg/mlの蛋白質濃度まで濃縮し、４℃で１昼夜放置
した後、ウルトロゲルAcA44（仏,LKB社製）を充填した
カラムを用いてPBSでゲル過することによりHRP標識モ
ノクローナル抗体を得た。
（３）ヒトプロティンＳの測定 山羊抗ヒトプロティンＳ抗体を固定化したビーズ各１個
と精製したヒトプロティンＳを0,50,100,200,400ng/ml
の各濃度で含有する0.1％BSA含有PBS溶液（pH7.4）200
μと、HRP標識モノクローナル抗体を含有する0.1％BS
A含有PBS溶液（pH7.4）200μとを各試験管（ｎ＝２）
に添加して37℃の温度で１時間インキュベートした。
と精製したヒトプロティンＳを0,50,100,200,400ng/ml
の各濃度で含有する0.1％BSA含有PBS溶液（pH7.4）200
μと、HRP標識モノクローナル抗体を含有する0.1％BS
A含有PBS溶液（pH7.4）200μとを各試験管（ｎ＝２）
に添加して37℃の温度で１時間インキュベートした。
次に、試験管内の溶液を吸引除去した後、PBSで２回洗
浄し、試験管を交換してから、テトラメチルベンジジン
塩酸塩0.02％及び過酸化水素0.005％を含有する0.1Mリ
ン酸−クエン酸緩衝液（pH4.0）を400μずつ各試験管
に加え、37℃の温度で30分間インキュベートした後、反
応停止剤として0.1％NaF及び２％酢酸を含有する水溶液
1mlを各試験管に加えて酵素反応を停止させた。
浄し、試験管を交換してから、テトラメチルベンジジン
塩酸塩0.02％及び過酸化水素0.005％を含有する0.1Mリ
ン酸−クエン酸緩衝液（pH4.0）を400μずつ各試験管
に加え、37℃の温度で30分間インキュベートした後、反
応停止剤として0.1％NaF及び２％酢酸を含有する水溶液
1mlを各試験管に加えて酵素反応を停止させた。
次いで、この溶液を分光光度計を用いて650nmの波長の
吸収強度を測定し、これをヒトプロティンＳ濃度とプロ
ットすることにより、濃度依存性を有するヒトプロテイ
ンＳ濃度測定用の検量線を得た（第１図参照）。
吸収強度を測定し、これをヒトプロティンＳ濃度とプロ
ットすることにより、濃度依存性を有するヒトプロテイ
ンＳ濃度測定用の検量線を得た（第１図参照）。
血漿検体中のヒトプロティンＳの濃度測定として、正常
混合人血漿を0.1％BSA含有PBS溶液（pH7.4）で50倍に希
釈した溶液200μを、抗体固定ビーズ及びHRP標識モノ
クローナル抗体溶液200μと共に試験管に加え、上記
と同様にして免疫反応及び発色反応を行った後、分光光
度計にて吸光光度を測定した。この値を第１図の検量線
を用いて血漿中の濃度に換算したヒトプロティンＳ濃度
を求めた結果、血漿中濃度は10.4μg/mlであった。
混合人血漿を0.1％BSA含有PBS溶液（pH7.4）で50倍に希
釈した溶液200μを、抗体固定ビーズ及びHRP標識モノ
クローナル抗体溶液200μと共に試験管に加え、上記
と同様にして免疫反応及び発色反応を行った後、分光光
度計にて吸光光度を測定した。この値を第１図の検量線
を用いて血漿中の濃度に換算したヒトプロティンＳ濃度
を求めた結果、血漿中濃度は10.4μg/mlであった。
実施例２ 山羊抗ヒトプロティンＳ抗体の代りに兎抗ヒトプロティ
ンＳ抗体（ポリクローナル抗体:Diagnostica Stago社
製）を用いた他は実施例１と同様の方法で調製した、兎
抗ヒトプロティンＳ抗体固定ビーズ各１個と精製したヒ
トプロティンＳを0,50,100,200,400ng/mlの各濃度で含
有する0.5％BSA含有PBS溶液（pH7.4）200μと、実施
例１と同様の方法で調製したHRP標識マウス抗ヒトプロ
ティンＳ−モノクローナル抗体を含有する0.5％BSA含有
PBS溶液（pH7.4）200μとを各試験管（ｎ＝２）に添
加して37℃の温度で１時間インキュベートした。
ンＳ抗体（ポリクローナル抗体:Diagnostica Stago社
製）を用いた他は実施例１と同様の方法で調製した、兎
抗ヒトプロティンＳ抗体固定ビーズ各１個と精製したヒ
トプロティンＳを0,50,100,200,400ng/mlの各濃度で含
有する0.5％BSA含有PBS溶液（pH7.4）200μと、実施
例１と同様の方法で調製したHRP標識マウス抗ヒトプロ
ティンＳ−モノクローナル抗体を含有する0.5％BSA含有
PBS溶液（pH7.4）200μとを各試験管（ｎ＝２）に添
加して37℃の温度で１時間インキュベートした。
以降、実施例１（３）と同様に処理してテトラメチルベ
ンジジン塩酸塩0.02％及び過酸化水素0.005％を含有す
る0.1Mリン酸−クエン酸緩衝液（pH4.0）を400μずつ
各試験管に加え、37℃の温度で30分間インキュベートし
た後、反応停止剤として0.1％NaF及び２％酢酸を含有す
る水溶液1mlを各試験管に加えて酵素反応を停止させ
た。
ンジジン塩酸塩0.02％及び過酸化水素0.005％を含有す
る0.1Mリン酸−クエン酸緩衝液（pH4.0）を400μずつ
各試験管に加え、37℃の温度で30分間インキュベートし
た後、反応停止剤として0.1％NaF及び２％酢酸を含有す
る水溶液1mlを各試験管に加えて酵素反応を停止させ
た。
次いで、この溶液を分光光度計を用いて650nmの波長の
吸収強度を測定し、これをヒトプロティンＳ濃度に対し
てプロットすることにより、基線の吸収強度が0.15と若
干高いものの濃度依存性の良い検量線が得られた。
吸収強度を測定し、これをヒトプロティンＳ濃度に対し
てプロットすることにより、基線の吸収強度が0.15と若
干高いものの濃度依存性の良い検量線が得られた。
実施例３ C4bp−プロティンＳ−複合体共存下でのヒトプロティン
Ｓの測定 ヒトプロティンＳを夫々4.0,8.0μg/mlの濃度で含有す
る試料を、0.1％BSA含有PBS溶液（pH7.4）で50倍に希釈
する際にDahlback［Dahlback,B.,Seminars in Thrombos
is ＆ Hemostasis;10;139〜148（1984）］の方法で分離
したC4bp−プロティンＳ−複合体を、希釈前の濃度が夫
々60,120,240,360,480μg/mlの濃度になるように添加し
た。
Ｓの測定 ヒトプロティンＳを夫々4.0,8.0μg/mlの濃度で含有す
る試料を、0.1％BSA含有PBS溶液（pH7.4）で50倍に希釈
する際にDahlback［Dahlback,B.,Seminars in Thrombos
is ＆ Hemostasis;10;139〜148（1984）］の方法で分離
したC4bp−プロティンＳ−複合体を、希釈前の濃度が夫
々60,120,240,360,480μg/mlの濃度になるように添加し
た。
次に、この各溶液を試料に用いて実施例１と同様の方法
でヒトプロティンＳの濃度を測定した。
でヒトプロティンＳの濃度を測定した。
その結果、試料中のヒトプロティンＳの濃度はC4bp−プ
ロティンＳ−複合体の存在しない場合の濃度と測定誤差
範囲内で同一であり、本測定方法はC4bp−プロティンＳ
−複合体を測定することなく、フリーのヒトプロティン
Ｓのみを選択的に測定することが認められた（第２図参
照）。
ロティンＳ−複合体の存在しない場合の濃度と測定誤差
範囲内で同一であり、本測定方法はC4bp−プロティンＳ
−複合体を測定することなく、フリーのヒトプロティン
Ｓのみを選択的に測定することが認められた（第２図参
照）。
比較例１ 実施例１における抗体固定ビーズの作製において、山羊
抗ヒトプロティンＳ−ポリクローナル抗体の代りにマウ
ス抗ヒトプロティンＳ−モノクローナル抗体（2B9C10）
を用いる他は実施例１と同様の方法で作製した、マウス
抗ヒトプロティンＳ−モノクローナル抗体を固定したビ
ーズ各１個と精製したヒトプロティンＳを、0,50,100,2
00,400ng/mlの各濃度を含有する0.1％BSA含有PBS溶液
（pH7.4）200μと、実施例１と同様の方法で作製した
HRP標識マウス抗ヒトプロティンＳ−モノクローナル抗
体（2B9F12）を含有する0.1％BSA含有PBS溶液（pH7.4）
200μとを各試験管（ｎ＝２）に添加して37℃の温度
で１時間インキュベートした。
抗ヒトプロティンＳ−ポリクローナル抗体の代りにマウ
ス抗ヒトプロティンＳ−モノクローナル抗体（2B9C10）
を用いる他は実施例１と同様の方法で作製した、マウス
抗ヒトプロティンＳ−モノクローナル抗体を固定したビ
ーズ各１個と精製したヒトプロティンＳを、0,50,100,2
00,400ng/mlの各濃度を含有する0.1％BSA含有PBS溶液
（pH7.4）200μと、実施例１と同様の方法で作製した
HRP標識マウス抗ヒトプロティンＳ−モノクローナル抗
体（2B9F12）を含有する0.1％BSA含有PBS溶液（pH7.4）
200μとを各試験管（ｎ＝２）に添加して37℃の温度
で１時間インキュベートした。
以降、実施例１（３）と同様に処理して、テトラメチル
ベンジジン塩酸塩0.02％及び過酸化水素0.005％を含有
する0.1Mリン酸−クエン酸緩衝液（pH4.0）を400μず
つ各試験管に加え、37℃の温度で30分間インキューベー
トした後、反応停止剤として0.1％NaF及び２％酢酸を含
有する水溶液1mlを各試験管に加えて酵素反応を停止さ
せた。
ベンジジン塩酸塩0.02％及び過酸化水素0.005％を含有
する0.1Mリン酸−クエン酸緩衝液（pH4.0）を400μず
つ各試験管に加え、37℃の温度で30分間インキューベー
トした後、反応停止剤として0.1％NaF及び２％酢酸を含
有する水溶液1mlを各試験管に加えて酵素反応を停止さ
せた。
次いで、この溶液について分光光度計を用いて650nmの
波長の吸収強度を測定し、これをヒトプロティンＳ濃度
に対してプロットして、プロティンＳ測定用検量線を得
た（第３図参照）。
波長の吸収強度を測定し、これをヒトプロティンＳ濃度
に対してプロットして、プロティンＳ測定用検量線を得
た（第３図参照）。
本発明の第１図と比較すると明らかなように、この検量
線は基線が吸光度0.2と高く、またプロティンＳ濃度200
ng/mlの吸光度は0.38と比較的に低い値を示している。
そして検量線の勾配が極めて緩やかなために、プロティ
ンＳ測定の測定感度が不十分になってしまうので、測定
系としては好ましくないと判断される。これはプロティ
ンＳに対するモノクローナル抗体の抗原親和性が十分に
は高くないためと考えられる。
線は基線が吸光度0.2と高く、またプロティンＳ濃度200
ng/mlの吸光度は0.38と比較的に低い値を示している。
そして検量線の勾配が極めて緩やかなために、プロティ
ンＳ測定の測定感度が不十分になってしまうので、測定
系としては好ましくないと判断される。これはプロティ
ンＳに対するモノクローナル抗体の抗原親和性が十分に
は高くないためと考えられる。
第１図は、本発明の測定方法（実施例１）におけるヒト
プロティンＳ測定用の検量線を示している。 第２図は本発明の測定方法（実施例３）におけるヒトプ
ロティンＳの測定において、C4bp−プロティンＳ−複合
体を共存させて測定した結果を示している。図中、−○
−は、試料中のヒトプロティンＳ濃度8.0μg/ml,−●−
は試料中のヒトプロティンＳ濃度4.0μg/mlを表わす。 第３図は、本発明のポリクローナル抗体の代りにマウス
抗ヒトプロティンＳモノクローナル抗体を用いた測定方
法（比較例１）におけるヒトプロティンＳ測定用の検量
線を示している。
プロティンＳ測定用の検量線を示している。 第２図は本発明の測定方法（実施例３）におけるヒトプ
ロティンＳの測定において、C4bp−プロティンＳ−複合
体を共存させて測定した結果を示している。図中、−○
−は、試料中のヒトプロティンＳ濃度8.0μg/ml,−●−
は試料中のヒトプロティンＳ濃度4.0μg/mlを表わす。 第３図は、本発明のポリクローナル抗体の代りにマウス
抗ヒトプロティンＳモノクローナル抗体を用いた測定方
法（比較例１）におけるヒトプロティンＳ測定用の検量
線を示している。
フロントページの続き (72)発明者 鈴木 英明 東京都小金井市桜町２―７―18 (56)参考文献 特開 昭59−163565（ＪＰ，Ａ) 特開 昭63−151856（ＪＰ，Ａ) ＢＬＯＯＤ，Ｖｏｌ．67，Ｎｏ．６, （1986），Ｐ．1583−1590
Claims (4)
- 【請求項１】不溶性担体に結合した抗体と標識抗体とを
用いてヒトプロティンＳの免疫学的測定を行うに際し、
いずれか一方の抗体としてヒトプロティンＳを特異的に
認識するポリクローナル抗体を用い、他方の抗体として
ヒト補体系制御因子のC4bpとプロティンＳとの複合体は
認識せず、フリーのヒトプロティンＳを特異的に認識し
て結合し得るモノクローナル抗体を用いることを特徴と
するヒトプロティンＳの免疫学的測定方法。 - 【請求項２】不溶性担体に結合した抗体が、山羊及び／
又は兎抗ヒトプロティンＳ−ポリクローナル抗体であ
り、標識抗体がマウス抗ヒトプロティンＳ−モノクロー
ナル抗体であることを特徴とする請求項１記載のヒトプ
ロティンＳの免疫学的測定方法。 - 【請求項３】不溶性担体に結合した抗体と標識抗体とか
らなり、いずれか一方の抗体がヒトプロティンＳを特異
的に認識するポリクローナル抗体であり、他方の抗体が
ヒト補体系制御因子のC4bpとプロティンＳの複合体は認
識せず、フリーのヒトプロティンＳを特異的に認識して
結合し得るモノクローナル抗体であるヒトプロティンＳ
の免疫学的測定用の測定試薬。 - 【請求項４】不溶性担体に結合した抗体と標識抗体とか
らなり、いずれか一方の抗体がヒトプロティンＳが特異
的に認識するポリクローナル抗体であり、他方の抗体が
ヒト補体系制御因子のC4bpとプロティンＳの複合体は認
識せず、フリーのヒトプロティンＳを特異的に認識して
結合し得るモノクローナル抗体であるヒトプロティンＳ
の免疫学的測定用の測定試薬と、これに（ａ）溶解剤，
（ｂ）洗浄剤及び酵素で標識化した抗体を用いる場合に
は、（ｃ）酵素活性を測定するための基質及びその反応
停止剤を組合わせてなるヒトプロティンＳの免疫学的測
定用のキット。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP63279479A JPH07117535B2 (ja) | 1987-11-06 | 1988-11-07 | ヒトプロテインｓに免疫学的測定方法、それに用いる測定試薬及びキット |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP62-279362 | 1987-11-06 | ||
| JP27936287 | 1987-11-06 | ||
| JP63279479A JPH07117535B2 (ja) | 1987-11-06 | 1988-11-07 | ヒトプロテインｓに免疫学的測定方法、それに用いる測定試薬及びキット |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH021555A JPH021555A (ja) | 1990-01-05 |
| JPH07117535B2 true JPH07117535B2 (ja) | 1995-12-18 |
Family
ID=26553298
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP63279479A Expired - Lifetime JPH07117535B2 (ja) | 1987-11-06 | 1988-11-07 | ヒトプロテインｓに免疫学的測定方法、それに用いる測定試薬及びキット |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH07117535B2 (ja) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP5891491B2 (ja) * | 2011-03-14 | 2016-03-23 | 株式会社シノテスト | 試料中の総プロテインｓタンパク質量の測定試薬及び測定方法 |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS59163565A (ja) * | 1983-03-08 | 1984-09-14 | Toray Ind Inc | 高分子抗原の微量定量法 |
| JPH07117534B2 (ja) * | 1986-12-17 | 1995-12-18 | 帝人株式会社 | ヒトプロテインｓに対するモノクローナル抗体を用いた免疫学的測定試薬及びキット |
-
1988
- 1988-11-07 JP JP63279479A patent/JPH07117535B2/ja not_active Expired - Lifetime
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| ＢＬＯＯＤ，Ｖｏｌ．６７，Ｎｏ．６，（１９８６），Ｐ．１５８３−１５９０ |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH021555A (ja) | 1990-01-05 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US4902614A (en) | Monoclonal antibody to human protein C | |
| US10830771B2 (en) | PIVKA-II assay method and method for manufacturing reagent or kit for PIVKA-II immunoassay | |
| DK158246B (da) | Sandwichfremgangsmaade til bestemmelse af carcinoembryonalt antigen og oploesning til brug ved denne fremgangsmaade | |
| JP2867325B2 (ja) | 抗ｐｉｖｋａ−ｉｉ抗体産生ハイブリドーマ及び免疫学的測定方法 | |
| EP0271810B1 (en) | Immunological determination of free human protein s and c4bp-protein s complex | |
| EP0315447A2 (en) | Method of immunological measurement of human protein S and reagent and kit therefor | |
| US5187067A (en) | Immunological determination of free human protein S and C4bp-protein S complex | |
| JPH07238099A (ja) | モノクローナル抗体及びこれを用いる免疫学的測定法 | |
| US4812395A (en) | Method for detecting enzymatic activity using particle agglutination | |
| JPH07117535B2 (ja) | ヒトプロテインｓに免疫学的測定方法、それに用いる測定試薬及びキット | |
| JP2518602B2 (ja) | ヒトプロテインｓに対するモノクロ―ナル抗体を用いた免疫学的測定試薬及びキット | |
| JP2742886B2 (ja) | 好中球コラゲナーゼの免疫学的定量法 | |
| JP3334904B2 (ja) | プラスミン−抗プラスミン複合体に対するモノクローナル抗体、その製造方法およびその使用 | |
| JPH07117534B2 (ja) | ヒトプロテインｓに対するモノクローナル抗体を用いた免疫学的測定試薬及びキット | |
| JP2507317B2 (ja) | プラスミン―α２プラスミンインヒビタ―複合体の測定方法 | |
| EP0181762B1 (en) | Method for detecting enzymatic activity using particle agglutination | |
| JP3292937B2 (ja) | 残留農薬分析法 | |
| JP2609908B2 (ja) | 慢性関節リウマチ疾患の診断用試薬 | |
| JP2002316999A (ja) | モノクローナル抗体 | |
| JP2523171B2 (ja) | 免疫測定方法及びそれに用いる試薬キット | |
| JPS6265693A (ja) | 活性型ヒト血液凝固第▲ｘｉ▼因子の免疫学的定量法 | |
| US4812396A (en) | Method for detecting enzymatic activity using particle agglutination | |
| JPH0789116B2 (ja) | モノクローナル抗体を用いた免疫学的測定方法およびそのためのキット | |
| JP2509001B2 (ja) | ヒト・トロンボモジユリンの免疫学的測定方法、そのための試薬及びそのためのキツト | |
| JPS63290963A (ja) | 酵素標識抗体感作ラテックス及びそれを用いた酵素免疫測定法 |