JPH07110880B2 - 選択的免疫学的定量のためのモノクローナル抗体 - Google Patents
選択的免疫学的定量のためのモノクローナル抗体Info
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- JPH07110880B2 JPH07110880B2 JP1104804A JP10480489A JPH07110880B2 JP H07110880 B2 JPH07110880 B2 JP H07110880B2 JP 1104804 A JP1104804 A JP 1104804A JP 10480489 A JP10480489 A JP 10480489A JP H07110880 B2 JPH07110880 B2 JP H07110880B2
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- procollagen
- procollagen peptide
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- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
- G01N33/6887—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids from muscle, cartilage or connective tissue
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
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- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
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Description
【発明の詳細な説明】 プロコラーゲンペプチドIII型（PIIIP）は、プロコラー
ゲンIII型分子の分泌後細胞外除去を受けるコラーゲンI
II型のアミノ末端プロペプチドである。一方、プロコラ
ーゲンペプチドIII型はコラーゲナーゼでさらに、それ
自体公知のタンパク質化学の方法を用いて単離できるフ
ラグメントCol 1、Col 2およびCol 3に分離される（Now
ackら:Eur.J.Biochem.,70:205〜216,1976;Bruckner P.
ら:Eur.J.Biochem.,90:595〜603,1978）。
ゲンIII型分子の分泌後細胞外除去を受けるコラーゲンI
II型のアミノ末端プロペプチドである。一方、プロコラ
ーゲンペプチドIII型はコラーゲナーゼでさらに、それ
自体公知のタンパク質化学の方法を用いて単離できるフ
ラグメントCol 1、Col 2およびCol 3に分離される（Now
ackら:Eur.J.Biochem.,70:205〜216,1976;Bruckner P.
ら:Eur.J.Biochem.,90:595〜603,1978）。
ヨーロツパ特許第4,940号に記載されている放射免疫定
量法は、体液中の上記プロコラーゲンペプチドの濃度を
測定するのに使用できる。このペプチドの血清濃度の知
識からたとえば肝臓の繊維性疾患の活動性に関する情報
が提供される（Rohd,H.ら:Eur.J.Clin.Invest.,９,451
〜459,1979）。
量法は、体液中の上記プロコラーゲンペプチドの濃度を
測定するのに使用できる。このペプチドの血清濃度の知
識からたとえば肝臓の繊維性疾患の活動性に関する情報
が提供される（Rohd,H.ら:Eur.J.Clin.Invest.,９,451
〜459,1979）。
血清および他の体液中のプロコラーゲンペプチドIII型
およびプロコラーゲンIII型の正確な選択的定量はヨー
ロツパ特許出願第289,930号に提案されている。しかし
ながら、これは多数の遠心分離工程を必要とし、それが
定常的な臨床検査への使用を困難にしている。イムノラ
ジオメトリツクアツセイ（IRMA）法では、さらに単純な
操作が可能になる。この方法では２種の抗体が使用され
る。そのひとつは固体担体にカツプリングされるが、そ
れにより沈殿工程がひとつ、その結果遠心分離工程がひ
とつとピペツテイング工程がいくつか不要になる。
およびプロコラーゲンIII型の正確な選択的定量はヨー
ロツパ特許出願第289,930号に提案されている。しかし
ながら、これは多数の遠心分離工程を必要とし、それが
定常的な臨床検査への使用を困難にしている。イムノラ
ジオメトリツクアツセイ（IRMA）法では、さらに単純な
操作が可能になる。この方法では２種の抗体が使用され
る。そのひとつは固体担体にカツプリングされるが、そ
れにより沈殿工程がひとつ、その結果遠心分離工程がひ
とつとピペツテイング工程がいくつか不要になる。
ゲル過クロマトグラフイーでは特徴的なピークとして
これまで明らかにされていなかつたプロコラーゲンIII
型のフラグメントと反応するモノクローナル抗体が驚く
べきことに発見された。この抗体を、プロコラーゲンペ
プチドIII型および／またはプロコラーゲンIII型に対す
る特異性を有する他のモノクローナルまたはポリクロー
ナル抗体と組合せると、RIMA技術を用いたこれらの抗原
の定量が可能になる。
これまで明らかにされていなかつたプロコラーゲンIII
型のフラグメントと反応するモノクローナル抗体が驚く
べきことに発見された。この抗体を、プロコラーゲンペ
プチドIII型および／またはプロコラーゲンIII型に対す
る特異性を有する他のモノクローナルまたはポリクロー
ナル抗体と組合せると、RIMA技術を用いたこれらの抗原
の定量が可能になる。
したがつて、本発明は、 （１）未分解のプロコラーゲンIII型およびpN−コラー
ゲン（Ｃ末端プロペプチドを欠くプロコラーゲン）（ピ
ーク1a）、未分解のアミノ末端プロコラーゲンペプチド
III型（ピーク2a）、分子量がアミノ末端プロコラーゲ
ンペプチドIII型の分子量とCol 1の分子量の間にあるア
ミノ末端プロコラーゲンペプチドIII型の分解生成物
（ピーク3a）、ならびにCol 1およびCol 1と同じ分子量
をもつアミノ末端プロコラーゲンペプチドIII型の分解
生成物（ピーク4a）に対して第２図に＋の記号でプロッ
トされた反応パターンを有するモノクローナル抗体、 （２）ミエローマ系の細胞と、予めアミノ末端プロコラ
ーゲンペプチドIII型で免疫感作された動物からのリン
パ球細胞との細胞融合によつて得られ、上記（１）に定
義された抗体を産生するハイブリドーマ細胞系統（hybr
idoma cell line）、 （３）上記（１）に定義された抗体の製造方法、 （４）上記（１）に定義された抗体を用いるプロコラー
ゲンペプチドIII型の免疫学的定量方法、 （５）上記（１）に定義されたモノクローナル抗体の有
効量を、単独または他の抗体とくにヨーロツパ特許出願
第289,930号に提案されているモノクローナル抗体の有
効量と組合せて、診断的に許容される担体と混合して含
有する、体液中のプロコラーゲンペプチドIII型の量を
確立するための診断用組成物、に関する。
ゲン（Ｃ末端プロペプチドを欠くプロコラーゲン）（ピ
ーク1a）、未分解のアミノ末端プロコラーゲンペプチド
III型（ピーク2a）、分子量がアミノ末端プロコラーゲ
ンペプチドIII型の分子量とCol 1の分子量の間にあるア
ミノ末端プロコラーゲンペプチドIII型の分解生成物
（ピーク3a）、ならびにCol 1およびCol 1と同じ分子量
をもつアミノ末端プロコラーゲンペプチドIII型の分解
生成物（ピーク4a）に対して第２図に＋の記号でプロッ
トされた反応パターンを有するモノクローナル抗体、 （２）ミエローマ系の細胞と、予めアミノ末端プロコラ
ーゲンペプチドIII型で免疫感作された動物からのリン
パ球細胞との細胞融合によつて得られ、上記（１）に定
義された抗体を産生するハイブリドーマ細胞系統（hybr
idoma cell line）、 （３）上記（１）に定義された抗体の製造方法、 （４）上記（１）に定義された抗体を用いるプロコラー
ゲンペプチドIII型の免疫学的定量方法、 （５）上記（１）に定義されたモノクローナル抗体の有
効量を、単独または他の抗体とくにヨーロツパ特許出願
第289,930号に提案されているモノクローナル抗体の有
効量と組合せて、診断的に許容される担体と混合して含
有する、体液中のプロコラーゲンペプチドIII型の量を
確立するための診断用組成物、に関する。
本発明を以下に、とくにその好ましい態様について詳細
に説明する。本発明はまた、特許請求の範囲に明示され
ている。
に説明する。本発明はまた、特許請求の範囲に明示され
ている。
モノクローナル抗体を製造するには、動物好ましくはた
とえばマウス、ラツト、ウサギまたはモルモツトのよう
なげつ齒類動物を、ヨーロツパ特許第4,940号の方法に
よつて単離されたプロコラーゲンペプチドIII型によ
り、アジユバントの存在下に免疫感作することができ
る。マウスの使用が好ましく、とくにSJL株のマウスが
好ましい。免疫応答は、たとえば４〜８週の間隔で、反
復ブースター注射することによつて増強される。免疫感
作の成否は、放射能結合検定で抗体の濃度を測定するこ
とによつてチエツクされる〔R.Timpl＆L.Risteli:Immun
ochemistry of the extracellular matrix,H.Furthmayr
編、第１巻、199頁（1982）〕。リンパ球細胞とミエロ
ーマ細胞系統（myeloma cell line）との融合の何日か
前に、動物を、アジエバントを使用せずにプロコラーゲ
ンペプチドIII型で処理する。リンパ球細胞は動物から
採取し、ミエローマ細胞系統と融合させる。このミエロ
ーマ細胞も同様に上述の動物種のひとつに由来するもの
を使用できるが、マウス由来のものが好ましく、とくに
細胞系統P3X63AG8.653と融合させる。同じ種のリンパ球
細胞とミエローマ細胞系統を融合させるのが有利であ
る。融合およびその後の細胞クローンの培養は、当業者
によく知られた方法で行われ、特異的抗体の濃度は細胞
培養液からの上清について、免疫学的結合検定を用いて
測定される。この過程から誘導される細胞クローンか
ら、IRMAに使用するため、ひとつのクローンを選択す
る。マウスミエローマ細胞系統P3X63AG8.653と、プロコ
ラーゲンペプチドIII型で予め免疫感作したSJL株マウス
からのリンパ球細胞との融合によつて製造され、第２図
に示すような反応パタンを有するモノクローナル抗体を
産生する細胞系統を用いるのがとくに好ましい。この細
胞系統は、1988年３月２日に、ブダペスト条約の条件に
従い、European Collection of Animal Cell Cultures
（ECACC）、PHLS Centre for Applied Microbiology an
d Research,Porton Down,Salisbury,SP4 OJG,U.K.に第8
8030202号としてブダペスト条約に基づく国際寄託とし
て寄託された。
とえばマウス、ラツト、ウサギまたはモルモツトのよう
なげつ齒類動物を、ヨーロツパ特許第4,940号の方法に
よつて単離されたプロコラーゲンペプチドIII型によ
り、アジユバントの存在下に免疫感作することができ
る。マウスの使用が好ましく、とくにSJL株のマウスが
好ましい。免疫応答は、たとえば４〜８週の間隔で、反
復ブースター注射することによつて増強される。免疫感
作の成否は、放射能結合検定で抗体の濃度を測定するこ
とによつてチエツクされる〔R.Timpl＆L.Risteli:Immun
ochemistry of the extracellular matrix,H.Furthmayr
編、第１巻、199頁（1982）〕。リンパ球細胞とミエロ
ーマ細胞系統（myeloma cell line）との融合の何日か
前に、動物を、アジエバントを使用せずにプロコラーゲ
ンペプチドIII型で処理する。リンパ球細胞は動物から
採取し、ミエローマ細胞系統と融合させる。このミエロ
ーマ細胞も同様に上述の動物種のひとつに由来するもの
を使用できるが、マウス由来のものが好ましく、とくに
細胞系統P3X63AG8.653と融合させる。同じ種のリンパ球
細胞とミエローマ細胞系統を融合させるのが有利であ
る。融合およびその後の細胞クローンの培養は、当業者
によく知られた方法で行われ、特異的抗体の濃度は細胞
培養液からの上清について、免疫学的結合検定を用いて
測定される。この過程から誘導される細胞クローンか
ら、IRMAに使用するため、ひとつのクローンを選択す
る。マウスミエローマ細胞系統P3X63AG8.653と、プロコ
ラーゲンペプチドIII型で予め免疫感作したSJL株マウス
からのリンパ球細胞との融合によつて製造され、第２図
に示すような反応パタンを有するモノクローナル抗体を
産生する細胞系統を用いるのがとくに好ましい。この細
胞系統は、1988年３月２日に、ブダペスト条約の条件に
従い、European Collection of Animal Cell Cultures
（ECACC）、PHLS Centre for Applied Microbiology an
d Research,Porton Down,Salisbury,SP4 OJG,U.K.に第8
8030202号としてブダペスト条約に基づく国際寄託とし
て寄託された。
本発明によるモノクローナル抗体はIgG、IgMおよびIgA
タンパク質クラスに属する。IgGクラス、とくにIgG2bサ
ブクラスの抗体はとくに有利に使用できる。細胞系統EC
ACC88030202から得られるモノクローナル抗体PIIIP 226
を用い、血清中に存在する抗原をゲル過クロマトグラ
フイーによつて分子量に応じて分画し、このクロマトグ
ラフイーから分画を放射免疫検定に用いた場合のモノク
ローナル抗体の性質を例示する。第２図は、モノクロー
ナル抗体PIIIP226によつて示されるゲル過クロマトグ
ラフイー溶出像を、ポリクローナル抗体が示す溶出像と
比較して表した図である。ピーク1/1aは完全プロコラー
ゲンIII型およびpN−コラーゲンIII型に相当する。ピー
ク2/2aは完全アミノ末端プロコラーゲンペプチドIII型
およびその類似サイズの分解生成物に相当する。ピーク
3aは、クロマトグラムにおいてプロコラーゲンペプチド
III型より小さいがCol 1より明らかに大きいピークを生
じるプロコラーゲンペプチドIII型の分解生成物を示
す。すなわち、各分解生成物の分子量は約45,000（プロ
コラーゲンペプチド）と約10,000（Col 1）の間にあ
る。ピーク4/4aはCol 1プラスアミノ末端プロコラーゲ
ンペプチドIII型のCol 1と同じ分子量の分解生成物に相
当する。ポリクローナル抗体での分析でも検出され、Co
l 1の分解生成物の分子量をもつ抗原分画またはCol 1で
ある抗原分画は、本発明のモノクローナル抗体でははる
かに弱くしか検出されないことが明らかである。したが
つて、本発明のモノクローナル抗体は、Col 1中には存
在しないアミノ末端プロコラーゲンペプチドIII型のエ
ピトープに対する特異的な作用を有する。さらに、ピー
ク２にポリクローナル抗体によつて検出される抗原のい
くつかは抗体PIIIP226によつて認識されず、その結果、
抗体PIIIP226ではピーク２の位置に２つのピーク（2aお
よび3a）が明らかである。ピーク3aは同様に、ドイツ特
許出願に提案されている抗体PIIIP296を用いては見出さ
れない。
タンパク質クラスに属する。IgGクラス、とくにIgG2bサ
ブクラスの抗体はとくに有利に使用できる。細胞系統EC
ACC88030202から得られるモノクローナル抗体PIIIP 226
を用い、血清中に存在する抗原をゲル過クロマトグラ
フイーによつて分子量に応じて分画し、このクロマトグ
ラフイーから分画を放射免疫検定に用いた場合のモノク
ローナル抗体の性質を例示する。第２図は、モノクロー
ナル抗体PIIIP226によつて示されるゲル過クロマトグ
ラフイー溶出像を、ポリクローナル抗体が示す溶出像と
比較して表した図である。ピーク1/1aは完全プロコラー
ゲンIII型およびpN−コラーゲンIII型に相当する。ピー
ク2/2aは完全アミノ末端プロコラーゲンペプチドIII型
およびその類似サイズの分解生成物に相当する。ピーク
3aは、クロマトグラムにおいてプロコラーゲンペプチド
III型より小さいがCol 1より明らかに大きいピークを生
じるプロコラーゲンペプチドIII型の分解生成物を示
す。すなわち、各分解生成物の分子量は約45,000（プロ
コラーゲンペプチド）と約10,000（Col 1）の間にあ
る。ピーク4/4aはCol 1プラスアミノ末端プロコラーゲ
ンペプチドIII型のCol 1と同じ分子量の分解生成物に相
当する。ポリクローナル抗体での分析でも検出され、Co
l 1の分解生成物の分子量をもつ抗原分画またはCol 1で
ある抗原分画は、本発明のモノクローナル抗体でははる
かに弱くしか検出されないことが明らかである。したが
つて、本発明のモノクローナル抗体は、Col 1中には存
在しないアミノ末端プロコラーゲンペプチドIII型のエ
ピトープに対する特異的な作用を有する。さらに、ピー
ク２にポリクローナル抗体によつて検出される抗原のい
くつかは抗体PIIIP226によつて認識されず、その結果、
抗体PIIIP226ではピーク２の位置に２つのピーク（2aお
よび3a）が明らかである。ピーク3aは同様に、ドイツ特
許出願に提案されている抗体PIIIP296を用いては見出さ
れない。
本発明の抗体の製造に際しては、抗原を得るのに適当な
原料の入手が重要である。既述のように、ヒトまたは動
物の高度に精製されたプロコラーゲンペプチドIII型
は、関連組織または病的体液をコラーゲナーゼで分解
し、反応溶液からプロコラーゲンペプチドを取出し、ク
ロマトグラフイー法および／または免疫吸着の組合せに
よつて精製するヨーロツパ特許第4,940号によつて有利
に単離される。
原料の入手が重要である。既述のように、ヒトまたは動
物の高度に精製されたプロコラーゲンペプチドIII型
は、関連組織または病的体液をコラーゲナーゼで分解
し、反応溶液からプロコラーゲンペプチドを取出し、ク
ロマトグラフイー法および／または免疫吸着の組合せに
よつて精製するヨーロツパ特許第4,940号によつて有利
に単離される。
本発明のモノクローナル抗体は、すべての種類の放射免
疫測定法たとえば連続飽和分析もしくは平衡分析、なら
びに他の競合的および非結合的結合検定たとえば蛍光、
酵素、化学発光もしくは他の免疫検定を包含する様々の
免疫学的方法に使用することができる。とくに免疫吸着
検定においてサンドイツチ法に使用するのに適してい
る。すなわち、本発明のモノクローナル抗体は、組織ま
たは体液中のプロコラーゲンペプチドIII型の単離およ
び特性づけ、ならびに定量的測定のための免疫学的方法
に使用することができる。使用される方法はそれ自体は
当業者によく知られた方法であり、プロコラーゲンペプ
チドIII型を含有する液体サンプルを、好ましくはプラ
スチツク材料から構成される固体マトリツクスとくにプ
ラスチツク試験管に結合させた本発明のモノクローナル
抗体と反応させ、ついで放射性または他のトレーサーを
付与されたポリクローナルまたは第２のモノクローナル
抗体好ましくはヨーロツパ特許出願第289,930号に提案
されているモノクローナル抗体の結合によりプロコラー
ゲンペプチドIII型の量を測定するのが有利である。こ
の方法はまた、ポリクローナル抗体またはモノクローナ
ル抗体とくにヨーロツパ特許出願第289,930号に提案さ
れているモノクローナル抗体を固体マトリツクスに結合
させて抗原と反応させ、この抗原をついで標識された本
発明の抗体の結合で定量的に測定することによつても実
施できる。これらの方法では、プロコラーゲンペプチド
III型がプロコラーゲンIII型のアミノ末端にまだ連結し
ているかどうかは重要でない。ポリクローナル抗体を用
いる免疫学的測定では従来妨害となつていたプロコラー
ゲンペプチドIII型の分離生成物とくにCol 1は上述の検
定システムでは検出されない。
疫測定法たとえば連続飽和分析もしくは平衡分析、なら
びに他の競合的および非結合的結合検定たとえば蛍光、
酵素、化学発光もしくは他の免疫検定を包含する様々の
免疫学的方法に使用することができる。とくに免疫吸着
検定においてサンドイツチ法に使用するのに適してい
る。すなわち、本発明のモノクローナル抗体は、組織ま
たは体液中のプロコラーゲンペプチドIII型の単離およ
び特性づけ、ならびに定量的測定のための免疫学的方法
に使用することができる。使用される方法はそれ自体は
当業者によく知られた方法であり、プロコラーゲンペプ
チドIII型を含有する液体サンプルを、好ましくはプラ
スチツク材料から構成される固体マトリツクスとくにプ
ラスチツク試験管に結合させた本発明のモノクローナル
抗体と反応させ、ついで放射性または他のトレーサーを
付与されたポリクローナルまたは第２のモノクローナル
抗体好ましくはヨーロツパ特許出願第289,930号に提案
されているモノクローナル抗体の結合によりプロコラー
ゲンペプチドIII型の量を測定するのが有利である。こ
の方法はまた、ポリクローナル抗体またはモノクローナ
ル抗体とくにヨーロツパ特許出願第289,930号に提案さ
れているモノクローナル抗体を固体マトリツクスに結合
させて抗原と反応させ、この抗原をついで標識された本
発明の抗体の結合で定量的に測定することによつても実
施できる。これらの方法では、プロコラーゲンペプチド
III型がプロコラーゲンIII型のアミノ末端にまだ連結し
ているかどうかは重要でない。ポリクローナル抗体を用
いる免疫学的測定では従来妨害となつていたプロコラー
ゲンペプチドIII型の分離生成物とくにCol 1は上述の検
定システムでは検出されない。
ヨーロツパ特許出願第289,930号に提案されているモノ
クローナル抗体は、完全プロコラーゲンIII型およびpH
−コラーゲン（Ｃ末端プロペプチドを欠くプロコラーゲ
ン、ピーク4a）、完全アミノ末端プロコラーゲンペプチ
ドIII型（ピーク5a）、ならびにCol 1およびCol 1と同
じ分子量をもつアミノ末端プロコラーゲンペプチドIII
型の分解生成物（ピーク6a）に対して第３図に描かれた
反応パタンを示す。
クローナル抗体は、完全プロコラーゲンIII型およびpH
−コラーゲン（Ｃ末端プロペプチドを欠くプロコラーゲ
ン、ピーク4a）、完全アミノ末端プロコラーゲンペプチ
ドIII型（ピーク5a）、ならびにCol 1およびCol 1と同
じ分子量をもつアミノ末端プロコラーゲンペプチドIII
型の分解生成物（ピーク6a）に対して第３図に描かれた
反応パタンを示す。
このモノクローナル抗体の製造操作は上述の操作とほぼ
同じである。マウスミエローマ細胞系統P3X63AG8.653
と、プロコラーゲンペプチドIII型で免疫感作したSJL株
マウスからのリンパ球細胞との融合によつて製造された
細胞系統の使用がとくに好ましい。この細胞系統は、Eu
ropean Collection of Animal Cell Cultures（ECAC
C）、PHLS Centre for Applied Microbiology and Rese
arch,Porton Down,Salisbury,SP4 OJG,U.K.に第8704230
8号としてブダペスト条約に基づく国際寄託として寄託
されている。
同じである。マウスミエローマ細胞系統P3X63AG8.653
と、プロコラーゲンペプチドIII型で免疫感作したSJL株
マウスからのリンパ球細胞との融合によつて製造された
細胞系統の使用がとくに好ましい。この細胞系統は、Eu
ropean Collection of Animal Cell Cultures（ECAC
C）、PHLS Centre for Applied Microbiology and Rese
arch,Porton Down,Salisbury,SP4 OJG,U.K.に第8704230
8号としてブダペスト条約に基づく国際寄託として寄託
されている。
本発明を以下の実施例によりさらに説明する。とくに指
示がない限り、百分率の数値は重量に基づくものであ
る。
示がない限り、百分率の数値は重量に基づくものであ
る。
実施例１ プロコラーゲンペプチドIII型の製造 プロコラーゲンペプチドIII型はプロコラーゲンIII型に
37℃でコラーゲナーゼを作用させて製造される。この
間、ペプチドを変性剤に曝すことはしない。大量のペプ
チドを製造するためには改良方法を使用する。コラーゲ
ナーゼを作用させるまでの全工程は冷却室内で行う。可
溶化に用いられるNaCl溶液は0.05Mトリス塩酸塩,pH7.4,
0.01M EDTA,ナトリウムアジド（200mg/ml）ならびにプ
ロテアーゼ阻害剤、フエニルメチルスルホニルフルオラ
イド（３μg/ml）およびｐ−クロロメルクリ安息香酸
（３μg/ml）を含有する。
37℃でコラーゲナーゼを作用させて製造される。この
間、ペプチドを変性剤に曝すことはしない。大量のペプ
チドを製造するためには改良方法を使用する。コラーゲ
ナーゼを作用させるまでの全工程は冷却室内で行う。可
溶化に用いられるNaCl溶液は0.05Mトリス塩酸塩,pH7.4,
0.01M EDTA,ナトリウムアジド（200mg/ml）ならびにプ
ロテアーゼ阻害剤、フエニルメチルスルホニルフルオラ
イド（３μg/ml）およびｐ−クロロメルクリ安息香酸
（３μg/ml）を含有する。
ウシ胎児皮膚（3kg）を、1M NaCl 10l中で２日間ホモジ
ナイズし、抽出する。溶解したコラーゲンを抽出溶液か
ら、最終濃度が2.5Mになるように固体NaClを加えて沈殿
させる。沈殿を一夜攪拌したのち、遠心分離して（1800
×g,20分）集め、2.5M NaClで２回洗浄し、0.5M NaCl 1
0l中で一夜攪拌して再溶解する。少量の不溶物質を遠心
分離により除去する。この方法で得られたコラーゲンII
I型およびプロコラーゲンIII型の混合物は1.6M NaClで
沈殿する。沈殿をついで0.05Mトリス塩酸塩（pH8.0）2l
中に懸濁し、0.02M CaCl2を加えたのち、50℃に20分間
加熱し、ついで湿つた沈殿1gあたり1500Uの細菌性コラ
ーゲナーゼとともに37℃で３時間インキユベートする。
コラーゲンを作用させたのち、生成した沈殿を遠心分離
で除き、溶液を0.005Mトリス−塩酸塩、pH8.0,6.8M尿素
で透析し、同じ緩衝液で予め平衡化したDEAE−セルロー
スカラム（5.0×30cm）を通過させる。
ナイズし、抽出する。溶解したコラーゲンを抽出溶液か
ら、最終濃度が2.5Mになるように固体NaClを加えて沈殿
させる。沈殿を一夜攪拌したのち、遠心分離して（1800
×g,20分）集め、2.5M NaClで２回洗浄し、0.5M NaCl 1
0l中で一夜攪拌して再溶解する。少量の不溶物質を遠心
分離により除去する。この方法で得られたコラーゲンII
I型およびプロコラーゲンIII型の混合物は1.6M NaClで
沈殿する。沈殿をついで0.05Mトリス塩酸塩（pH8.0）2l
中に懸濁し、0.02M CaCl2を加えたのち、50℃に20分間
加熱し、ついで湿つた沈殿1gあたり1500Uの細菌性コラ
ーゲナーゼとともに37℃で３時間インキユベートする。
コラーゲンを作用させたのち、生成した沈殿を遠心分離
で除き、溶液を0.005Mトリス−塩酸塩、pH8.0,6.8M尿素
で透析し、同じ緩衝液で予め平衡化したDEAE−セルロー
スカラム（5.0×30cm）を通過させる。
カラムに結合したタンパク質を、NaCl溶液でその濃度を
０から0.3Mに上昇させて洗い出す。溶出する総量は2lで
ある。カラムから流出した溶液について、236nmの吸収
と、プロコラーゲンIII型のアミノ末端セグメントに対
して特異的な抗体を用いてその抗原活性を調べる。通
常、プロコラーゲンペプチドIII型を含有するのはカラ
ムから溶出する最終ピークである。蒸留水で透析してペ
プチドから塩を除去し、凍結乾燥する。次の精製は、ア
ガロースA 1.5Mを含有するカラム（２×120cm）（Biora
dから入手）を1M CaCl2、0.05Mトリス塩酸塩、pH7.5で
平衡化して実施する。
０から0.3Mに上昇させて洗い出す。溶出する総量は2lで
ある。カラムから流出した溶液について、236nmの吸収
と、プロコラーゲンIII型のアミノ末端セグメントに対
して特異的な抗体を用いてその抗原活性を調べる。通
常、プロコラーゲンペプチドIII型を含有するのはカラ
ムから溶出する最終ピークである。蒸留水で透析してペ
プチドから塩を除去し、凍結乾燥する。次の精製は、ア
ガロースA 1.5Mを含有するカラム（２×120cm）（Biora
dから入手）を1M CaCl2、0.05Mトリス塩酸塩、pH7.5で
平衡化して実施する。
実施例２ ハイブリドーマの製造 SJL株のマウスに、例１のようにして得られたプロコラ
ーゲンペプチドIII型５μｇを完全フロインドアジユバ
ントの存在下に筋肉内注射して免疫感作する。免疫応答
はさらにプロコラーゲンペプチドIII型５μｇを不完全
フロインドアジユバントの存在下、４週後および３カ月
後に筋肉内注射することにより増強される。融合の３日
前にさらに50μｇのプロコラーゲンペプチドIII型を注
射して免疫応答を増強する。
ーゲンペプチドIII型５μｇを完全フロインドアジユバ
ントの存在下に筋肉内注射して免疫感作する。免疫応答
はさらにプロコラーゲンペプチドIII型５μｇを不完全
フロインドアジユバントの存在下、４週後および３カ月
後に筋肉内注射することにより増強される。融合の３日
前にさらに50μｇのプロコラーゲンペプチドIII型を注
射して免疫応答を増強する。
融合に際しては動物を屠殺し、脾臓細胞を単離する。脾
臓細胞をミエローマ細胞系統P3X63AG8.653と、ポリエチ
レングリコールの存在下に融合させる（得られた細胞系
統はECACCに番号88030202で寄託されている）。脾臓細
胞×P3X63AG8.653ハイブリツドは、融合混合物をヒポキ
サンチン／アミノプテリン／チミジン培地中で２週間に
わたつて培養して選択する。生成した細胞クローンを数
回サブクローニングするとモノクローナル細胞系が得ら
れる。生成した細胞コロニーの上清について、抗体の産
生を放射免疫結合検定法で検定する。この方法で二元性
モノクローナル抗体PIIIP226が得られる。
臓細胞をミエローマ細胞系統P3X63AG8.653と、ポリエチ
レングリコールの存在下に融合させる（得られた細胞系
統はECACCに番号88030202で寄託されている）。脾臓細
胞×P3X63AG8.653ハイブリツドは、融合混合物をヒポキ
サンチン／アミノプテリン／チミジン培地中で２週間に
わたつて培養して選択する。生成した細胞クローンを数
回サブクローニングするとモノクローナル細胞系が得ら
れる。生成した細胞コロニーの上清について、抗体の産
生を放射免疫結合検定法で検定する。この方法で二元性
モノクローナル抗体PIIIP226が得られる。
実施例３ 放射免疫結合検定法 300μｌの細胞培養上清、またはたとえばマウスの腹腔
中でハイブリドーマ細胞を培養したのちの腹水のような
他のサンプルを、125I−プロコラーゲンペプチドIII型
溶液（タンパク質1ng/100μｌ、FP4,940の例１に記載さ
れているようにして調製）100μｌと一夜インキユベー
トする。生成した抗原−抗体複合体を、ヒツジまたは他
の種からの抗−マウス1gG血清を加えて沈殿させる。遠
心分離し、上清をデカンテーシヨンで除去し、ついで沈
殿した放射能量をガンマシンチレーシヨンスペクトロメ
ーターで測定する。
中でハイブリドーマ細胞を培養したのちの腹水のような
他のサンプルを、125I−プロコラーゲンペプチドIII型
溶液（タンパク質1ng/100μｌ、FP4,940の例１に記載さ
れているようにして調製）100μｌと一夜インキユベー
トする。生成した抗原−抗体複合体を、ヒツジまたは他
の種からの抗−マウス1gG血清を加えて沈殿させる。遠
心分離し、上清をデカンテーシヨンで除去し、ついで沈
殿した放射能量をガンマシンチレーシヨンスペクトロメ
ーターで測定する。
実施例４ 抗体の放射性標識 ドイツ特許出願P3,714,633.5の例２に記載されたように
して得られたモノクローナル抗体PIIIP296または他の抗
体0.2mgを0.05Mリン酸緩衝液pH7.4中に含有する溶液0.2
mlをポリスチレン検定管（12×55mm）に取り、10μｌの
0.5Mリン酸緩衝液pH7.4で緩衝化した100MBqのNa125I溶
液を加える。20μｇのクロラミンＴの水溶液50μｌを加
え、１分間混合する。ついで20μｇの亜硫酸ナトリウム
水溶液50μｌを加えてヨード化反応を停止させる。次
に、陰イオン交換樹脂上クロマトグラフイーに付して、
未反応Na125Iを125I−標識抗体から除去する。精製125I
−標識抗体を含むクロマトグラフイー分画を、１の0.
05Mトリス塩酸塩,pH8.0中に20gのツイーン20および14.6
gのNa2EDTAを溶解した液で希釈して標識抗体の濃度が20
0μg/lになるようにする。
して得られたモノクローナル抗体PIIIP296または他の抗
体0.2mgを0.05Mリン酸緩衝液pH7.4中に含有する溶液0.2
mlをポリスチレン検定管（12×55mm）に取り、10μｌの
0.5Mリン酸緩衝液pH7.4で緩衝化した100MBqのNa125I溶
液を加える。20μｇのクロラミンＴの水溶液50μｌを加
え、１分間混合する。ついで20μｇの亜硫酸ナトリウム
水溶液50μｌを加えてヨード化反応を停止させる。次
に、陰イオン交換樹脂上クロマトグラフイーに付して、
未反応Na125Iを125I−標識抗体から除去する。精製125I
−標識抗体を含むクロマトグラフイー分画を、１の0.
05Mトリス塩酸塩,pH8.0中に20gのツイーン20および14.6
gのNa2EDTAを溶解した液で希釈して標識抗体の濃度が20
0μg/lになるようにする。
実施例５ 検定管の抗体によるコーテイング 抗体をポリスチレン検定管（12×75mm）に固定化するに
は、0.01Mリン酸ナトリウム緩衝液,pH6.4中4mg/lの抗体
たとえばPIIIP226の溶液300μｌを各検定管に取り、室
温で一夜インキユベートする。ついで吸引して抗体溶液
を除去し、0.05Mトリス−クエン酸塩,pH7.5中ウシ血清
アルブミン１％濃度溶液500μｌを各検定管に加える。
室温で一夜インキユベーシヨン後、溶液を吸引して除去
する。抗体でコーテイングされた検定管をシリカゲルで
乾燥させる。
は、0.01Mリン酸ナトリウム緩衝液,pH6.4中4mg/lの抗体
たとえばPIIIP226の溶液300μｌを各検定管に取り、室
温で一夜インキユベートする。ついで吸引して抗体溶液
を除去し、0.05Mトリス−クエン酸塩,pH7.5中ウシ血清
アルブミン１％濃度溶液500μｌを各検定管に加える。
室温で一夜インキユベーシヨン後、溶液を吸引して除去
する。抗体でコーテイングされた検定管をシリカゲルで
乾燥させる。
実施例６ イムノラジオメトリツクアツセイ（ラジオイムノメトリ
ツクアツセー、IRMA） 分析用サンプルまたはプロコラーゲンペプチドIII型標
準液0.1mlを、実施例５に記載したようにしてモノクロ
ーナル抗体PIIIP226でコーテイングしたポリスチレン検
定管中で、リン酸緩衝食塩水（PBS）0.1mlとともに、室
温で２時間インキユベートする。次に検定管を各回1ml
のPBSで２回洗浄する。ついで200μｌの125I−標識抗体
PIIIP296（＝抗体40ng）または他の抗原を検定管に取
り、室温で２時間インキユベートする。検定管壁に結合
した抗体−抗原−125I−抗体複合体の放射能は、各回1m
lのPBSで２回洗浄しついでデカンテーシヨンしたのちガ
ンマシンチレーシヨンスペクトロメーターで測定する。
ツクアツセー、IRMA） 分析用サンプルまたはプロコラーゲンペプチドIII型標
準液0.1mlを、実施例５に記載したようにしてモノクロ
ーナル抗体PIIIP226でコーテイングしたポリスチレン検
定管中で、リン酸緩衝食塩水（PBS）0.1mlとともに、室
温で２時間インキユベートする。次に検定管を各回1ml
のPBSで２回洗浄する。ついで200μｌの125I−標識抗体
PIIIP296（＝抗体40ng）または他の抗原を検定管に取
り、室温で２時間インキユベートする。検定管壁に結合
した抗体−抗原−125I−抗体複合体の放射能は、各回1m
lのPBSで２回洗浄しついでデカンテーシヨンしたのちガ
ンマシンチレーシヨンスペクトロメーターで測定する。
次に異なる量のプロコラーゲンペプチドIII型を含む標
準液を用いて作成した検量プロツトと比較することによ
り未知サンプル溶液中のプロコラーゲンペプチドIII型
の濃度の計算が可能となる。第１図にはイムノラジオメ
トリツクスアツセイの検量プロツトを示す（B/Tは結合
放射能と使用した総放射能の比を意味する）。
準液を用いて作成した検量プロツトと比較することによ
り未知サンプル溶液中のプロコラーゲンペプチドIII型
の濃度の計算が可能となる。第１図にはイムノラジオメ
トリツクスアツセイの検量プロツトを示す（B/Tは結合
放射能と使用した総放射能の比を意味する）。
実施例７ PIIIP 226と反応するヒト血清中の抗原の分子量分布の
測定 血清1mlを、0.04％の非イオン界面活性剤たとえばポリ
エトキシ化ソルビタンモノラウレール（ツイーン20）を
含有するPBSで平衡化したN,N′−メチレンビスアクリル
アミド架橋アリルデキストラン上〔セフアクリル S300
カラム（1.6×130cm）〕ゲル過クロマトグラフイーに
よつて分画する。各0.2mlの分画を個々に、検討すべき
抗体の標識抗原量に関して制限される量（緩衝液0.1ml
中）および0.1mlの125I−標識プロコラーゲンペプチドI
II型（1ngのタンパク質を含む）と、４℃で一夜インキ
ユベートする。次に、予め検定した量のヒツジからの抗
−マウスIgG血清と10％ポリエチレングリコール（PEG60
00）の存在下に１時間インキユベートする。沈殿した抗
原−抗体複合体を遠視分離し（1500×ｇ）、デカンテー
シヨンしたのち、ガンマシンチレーシヨンスペクトロメ
ーター中で放射能を測定する。ついで、異なる量のプロ
コラーゲンペプチドIII型を含む標準溶液を用いて作成
した検量プロツトと比較することにより、使用した抗体
と反応する抗原のクロマトグラフイー分画中の濃度測定
することが可能である。第２図にPIIIP226を用いて測定
される抗原の溶出像を、ポリクローナル抗体を用いて測
定される抗原の溶出像と比較して示す。
測定 血清1mlを、0.04％の非イオン界面活性剤たとえばポリ
エトキシ化ソルビタンモノラウレール（ツイーン20）を
含有するPBSで平衡化したN,N′−メチレンビスアクリル
アミド架橋アリルデキストラン上〔セフアクリル S300
カラム（1.6×130cm）〕ゲル過クロマトグラフイーに
よつて分画する。各0.2mlの分画を個々に、検討すべき
抗体の標識抗原量に関して制限される量（緩衝液0.1ml
中）および0.1mlの125I−標識プロコラーゲンペプチドI
II型（1ngのタンパク質を含む）と、４℃で一夜インキ
ユベートする。次に、予め検定した量のヒツジからの抗
−マウスIgG血清と10％ポリエチレングリコール（PEG60
00）の存在下に１時間インキユベートする。沈殿した抗
原−抗体複合体を遠視分離し（1500×ｇ）、デカンテー
シヨンしたのち、ガンマシンチレーシヨンスペクトロメ
ーター中で放射能を測定する。ついで、異なる量のプロ
コラーゲンペプチドIII型を含む標準溶液を用いて作成
した検量プロツトと比較することにより、使用した抗体
と反応する抗原のクロマトグラフイー分画中の濃度測定
することが可能である。第２図にPIIIP226を用いて測定
される抗原の溶出像を、ポリクローナル抗体を用いて測
定される抗原の溶出像と比較して示す。
第１図は本発明の定量方法に用いられるPIIIPを含む標
準液で作成した検量曲線の例である。第２図および第３
図はそれぞれ、モノクローナル抗体PIIIP226およびPIII
P296の反応パタンをポリクローナル抗体のそれと比較し
た図である。
準液で作成した検量曲線の例である。第２図および第３
図はそれぞれ、モノクローナル抗体PIIIP226およびPIII
P296の反応パタンをポリクローナル抗体のそれと比較し
た図である。
フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｇ０１Ｎ 33/577 Ｂ // Ｃ１２Ｎ 15/02 Ｃ１２Ｐ 21/08 9161−4Ｂ (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 ユルゲン・ピユンター ドイツ連邦共和国デー‐6238 ホフハイ ム・アム・タウヌス．ライヒエンベルガー ヴエーク11 (72)発明者 ルーペルト・テイムプル ドイツ連邦共和国デー‐8035 ガウテイン グ．ユーリウス‐ヘルリンシユトラーセ３ (56)参考文献 特開 昭58−168961（ＪＰ，Ａ) Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，135 ［２］（1983）Ｐ．197−202 Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．，108［３ ］（1982）Ｐ．310−318
Claims (9)
- 【請求項１】未分解のプロコラーゲンIII型およびpN−
コラーゲンIII型（ピーク1a）、未分解のアミノ末端プ
ロコラーゲンペプチドIII型（ピーク2a）、分子量がア
ミノ末端プロコラーゲンペプチドIII型の分子量とCol 1
の分子量の間にあるアミノ末端プロコラーゲンペプチド
III型の分解生成物（ピーク3a）、ならびにCol 1および
Col 1と同じ分子量をもつアミノ末端プロコラーゲンペ
プチドIII型の分解生成物（ピーク4a）に対して下図に
＋の記号でプロットされた反応パターンを有するモノク
ローナル抗体。 上記図は、モノクローナル抗体が示すヒト血清のゲル濾
過クロマトグラフィーの溶離プロフィル（＋）を、ポリ
クローナル抗体が示す溶離プロフィル（□）と比較して
示したものである。図において、横軸はゲル濾過クロマ
トグラフィーの分画を、縦軸は該分画中の抗原の濃度を
示す。 - 【請求項２】Col 1には存在しないアミノ末端プロコラ
ーゲンペプチドIII型のエピトープに対してのみ反応す
る請求項１に記載のモノクローナル抗体。 - 【請求項３】マウスミエローマ細胞系統P3×63AG 8.653
と、プロコラーゲンペプチドIII型で予め免疫感作したS
JL株マウスからのリンパ球細胞とを融合させて得られる
ハイブリドーマ細胞系統ECACC 88030202が産生する請求
項１の図に示される反応パターンを有するモノクローナ
ル抗体PIIIP226。 - 【請求項４】ミエローマ細胞系統からの細胞と、予めプ
ロコラーゲンペプチドIII型で免疫感作した動物からの
リンパ球細胞との細胞融合によって形成された、請求項
１から３のいずれかに記載の抗体を産生するハイブリド
ーマ細胞系統。 - 【請求項５】マウスミエローマ細胞系統P3×63AG 8.653
と、プロコラーゲンペプチドIII型で予め免疫感作したS
JL株マウスからのリンパ球細胞とを融合させて得られ、
請求項１の図に示す反応パターンを有するモノクローナ
ル抗体PIIIP226を産生するハイブリドーマ細胞系統ECAC
C88030202。 - 【請求項６】（ａ）動物（但しヒトを除く）をアミノ末
端プロコラーゲンペプチドIII型で免疫感作し、（ｂ）
リンパ球細胞を採取してミエローマ細胞と融合させ、
（ｃ）請求項１または２に指示した性質を有する抗体の
存在によってハイブリッドを選択してクローン化し、
（ｄ）このクローンから抗体を得ることからなる請求項
１から３のいずれかに記載のモノクローナル抗体を製造
する方法。 - 【請求項７】（ａ）アミノ末端プロコラーゲンペプチド
III型またはプロコラーゲンIII型を含有する液体サンプ
ルを請求項１から３のいずれかに記載のモノクローナル
抗体と反応させ、（ｂ）アミノ末端プロコラーゲンペプ
チドIII型またはプロコラーゲンIII型の量を生成した抗
原−抗体複合体を介して測定することからなる抗体を用
いるプロコラーゲンペプチドIII型の免疫学的定量方
法。 - 【請求項８】（ａ）請求項１から３のいずれかに記載の
モノクローナル抗体を固体支持体にカップリングさせ、
（ｂ）アミノ末端プロコラーゲンペプチドIII型または
プロコラーゲンIII型を含有する液体サンプルを上記抗
体と反応させ、（ｃ）結合した抗原を、プロコラーゲン
ペプチドIII型またはプロコラーゲンIII型に対してのみ
反応する標識モノクローナルまたはポリクローナル抗体
によって検出することからなる抗体を用いるプロコラー
ゲンペプチドIII型の免疫学的定量方法。 - 【請求項９】工程（ｂ）に使用するモノクローナル抗体
は、未分解プロコラーゲンIII型およびpN−コラーゲン
（ピーク4a）、未分解アミノ末端プロコラーゲンペプチ
ドIII型（ピーク5a）ならびにCol 1およびCol 1と同じ
分子量をもつアミノ末端プロコラーゲンペプチドIII型
の分解生成物（ピーク6a）に対して下図に＋の記号でプ
ロットされた反応パターンを有する抗体である請求項８
に記載の方法。 上記図は、モノクローナル抗体が示すヒト血清のゲル濾
過クロマトグラフィーの溶離プロフィル（＋）を、ポリ
クローナル抗体が示す溶離プロフィル（○）と比較して
示したものである。図において、横軸はゲル濾過クロマ
トグラフィーの分画を、縦軸は該分画中の抗原の濃度を
示す。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE3814216.3 | 1988-04-27 | ||
| DE3814216 | 1988-04-27 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0213396A JPH0213396A (ja) | 1990-01-17 |
| JPH07110880B2 true JPH07110880B2 (ja) | 1995-11-29 |
Family
ID=6353005
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP1104804A Expired - Lifetime JPH07110880B2 (ja) | 1988-04-27 | 1989-04-26 | 選択的免疫学的定量のためのモノクローナル抗体 |
Country Status (12)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0339443B1 (ja) |
| JP (1) | JPH07110880B2 (ja) |
| AT (1) | ATE115963T1 (ja) |
| CA (1) | CA1338324C (ja) |
| DE (1) | DE58908787D1 (ja) |
| DK (1) | DK169571B1 (ja) |
| ES (1) | ES2065350T3 (ja) |
| FI (1) | FI98705C (ja) |
| GR (1) | GR3014957T3 (ja) |
| IE (1) | IE66320B1 (ja) |
| NO (1) | NO179107C (ja) |
| PT (1) | PT90369B (ja) |
Families Citing this family (12)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6010862A (en) * | 1987-11-06 | 2000-01-04 | Washington Research Foundation | Methods of detecting collagen type III degradation in vivo |
| DE4225038C2 (de) * | 1992-07-29 | 1995-11-30 | Boehringer Mannheim Gmbh | Herstellung und Verwendung von Antikörpern gegen Kollagen |
| JP2703116B2 (ja) * | 1993-07-28 | 1998-01-26 | ベーリンガー マンハイム ゲーエムベーハー | コラーゲンまたはコラーゲン断片を検出するためのイムノアッセイ |
| GB9506050D0 (en) | 1995-03-24 | 1995-05-10 | Osteometer A S | Assaying collagen fragments in body fluids |
| JPH10507266A (ja) | 1994-10-17 | 1998-07-14 | オステオミーター・ビオ・テク・エー／エス | 体液中のコラーゲンの断片化パターンの評価とコラーゲンの代謝に関連する疾患の診断 |
| US6107047A (en) * | 1996-03-21 | 2000-08-22 | Osteometer Biotech A/S | Assaying protein fragments in body fluids |
| GB9617616D0 (en) | 1996-08-22 | 1996-10-02 | Osteometer Biotech As | Assaying protein fragments in body fluids |
| ATE202632T1 (de) | 1996-12-09 | 2001-07-15 | Osteometer Biotech As | Sandwichtest zum nachweis von kollagenfragmenten |
| US6117646A (en) * | 1997-09-22 | 2000-09-12 | Osteometer Biotech A/S | Assaying protein fragments in body fluids |
| US7541149B1 (en) | 1998-05-28 | 2009-06-02 | Siemens Healthcare Diagnostics, Inc. | Monoclonal antibody and assay for detecting PIIINP |
| US6602980B1 (en) | 1998-06-19 | 2003-08-05 | Washington Research Foundation | Collagen type III synthetic peptides for collagen resorption assays |
| US6916903B2 (en) | 1998-06-19 | 2005-07-12 | Washington Research Foundation | Collagen type III synthetic peptides for collagen resorption assays |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE3209149A1 (de) * | 1982-03-13 | 1983-10-06 | Hoechst Ag | Verfahren zur gemeinsamen immunologischen bestimmung von prokollagen-peptid (typ iii) und prokollagen-peptid col 1 (typ iii) und verfahren zur herstellung von anti-prokollagen-peptid col 1 (typ iii)-serum |
-
1989
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