JPH11236399A - モノクローナル抗体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 体液中のＡＧＥのひとつであるカルボキシメ
チル化ヘモグロビンを簡便に測定することの出来る新規
な免疫学的定量方法を提供すること。 【解決手段】 例えばハイブリドーマ２Ｂ３（生命研菌
寄第 １６６３２号）によって製造されたカルボキシメ
チル化ヘモグロビンに特異的に反応するモノクローナル
抗体を含んでなる免疫学的測定試薬を使用して、体液中
のカルボキシメチル化ヘモグロビンを測定する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、カルボキシメチル
化ヘモグロビンを特異的に認識するモノクローナル抗
体、該抗体産生細胞、該抗体を用いるカルボキシメチル
化ヘモグロビンの免疫学的測定方法、及び免疫学的測定
試薬に関する。

【０００２】

【従来の技術】近年、カルボキシメチル化タンパク質
（以下「ＣＭ−タンパク」と表記することもある。）は
メイラード反応後期生成物（以下「ＡＧＥ」と略すこと
もある。）の主要成分であると考えられており（Iked
a，Ｋ．，et．al．，Biochemistry，vol．35，p8075，1
996）、これらの定性或いは定量方法としては、特異抗
体を用いる方法や、ＣＭ−タンパクを加水分解してガス
クロマトグラフィー／質量分析にてカルボキシメチル化
（以下「ＣＭ化」と略すこともある。）されたアミノ酸
を検出する方法等が知られている。しかしながら、ガス
クロマトグラフィー／質量分析にてＣＭ−タンパクを間
接的に測定する方法は操作が煩雑であり感度も低いとい
う問題があることから、測定が容易であり感度も高い特
異抗体を用いる方法が多用されている。

【０００３】上記の特異抗体を用いた測定方法では、試
験管内（in vitro）で作製したＣＭ−タンパクについて
は酵素標識免疫学的測定法（ＥＬＩＳＡ法）、ラジオイ
ムノアッセイ法（ＲＩＡ法）、ウエスタンブロッティン
グ法による検出が可能であり、組織におけるＣＭ−タン
パクについては免疫学的組織染色法が可能である。とこ
ろが、体液中のＣＭ−タンパクについては、体液を直接
ＥＬＩＳＡ法やＲＩＡ法、ウエスタンブロッティング法
にて測定することは不可能であるため、ドットブロッテ
ィング法により検出を行うか、又は体液由来のＣＭ−タ
ンパクをアルカリやプロテナーゼＫ等で前処理を行い、
該タンパクを変性あるいは切断してからＥＬＩＳＡ法に
て検出する方法が行われていた。

【０００４】しかしながら、体液中のＣＭ−タンパクを
ドットブロッティング法で測定する場合には操作が煩雑
であるばかりでなく、ＣＭ−タンパク濃度を再現性良く
測定するための手技の習得に時間を要するという欠点が
あった。また、体液由来のＣＭ−タンパクをＥＬＩＳＡ
法で測定する場合には、上記のような前処理が必要であ
るが、該前処理工程でタンパク質のＣＭ化が起こらない
ように注意する必要があり、操作も煩雑で時間を要する
という問題があった。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】体液中のＡＧＥの中で
もカルボキシメチル化ヘモグロビン（以下「ＣＭ−Ｈ
ｂ」と略すこともある。）は、糖尿病或いは糖尿病合併
症との関連性が強く示唆されており、該ＣＭ−Ｈｂを測
定することは臨床検査等の見地から意義のあることであ
るが、上記したように、体液中のＣＭ−Ｈｂを簡単に測
定する方法はこれまで知られていない。本発明の課題
は、体液中のＣＭ−Ｈｂを簡単に測定する方法を開発す
ることにある。

【０００６】

【課題を解決するための手段】本発明者等は上記課題を
解決するために鋭意研究を重ねた結果、ＣＭ−Ｈｂとの
み特異的に反応するモノクローナル抗体を用いれば、被
検体を処理することなく簡便に血中のＣＭ−Ｈｂ濃度を
測定できることを見出し、本発明を完成するに至った。

【０００７】即ち、第一の本発明は、ＣＭ−Ｈｂに特異
的に反応するモノクローナル抗体である。また、第二の
本発明はＣＭ−Ｈｂに特異的に反応するモノクローナル
抗体を産生するハイブリドーマである。更に、第三の本
発明は、ＣＭ−Ｈｂに特異的に反応するモノクローナル
抗体を用いることを特徴とするＣＭ−Ｈｂの免疫学的測
定方法であり、第四の本発明は、ＣＭ−Ｈｂに特異的に
反応するモノクローナル抗体を含んでなるＣＭ−Ｈｂ測
定用免疫学的測定試薬である。

【０００８】

【発明の実施の形態】本発明のモノクローナル抗体は、
ＣＭ−Ｈｂに特異的に反応する。ここでＣＭ−Ｈｂと
は、ヘモグロビン（以下「Ｈｂ」と略すこともある）の
Ｎ末端アミノ基または側鎖アミノ基の水素が少なくとも
１箇所以上ＣＭ化されたＨｂを言う。なお、ＣＭ化部位
はＨｂのα鎖でもβ鎖でも良い。また、ＣＭ−Ｈｂに特
異的に反応するとは、例えばＣＭ化ＨＳＡ（ＨＳＡ：人
血清アルブミン）、ＣＭ化コラーゲン、ＣＭ化γグロブ
リン等の、ＣＭ−Ｈｂ以外のＣＭ−タンパクとは反応し
ないか、若しくは反応したとしても非常に弱くしか反応
しないことを言う。より具体的に言えば、ＣＭ−Ｈｂ以
外のＣＭ−タンパクとの反応よりもＣＭ−Ｈｂとの反応
の方が１００倍以上高いアフィニティを有することを言
う。なお、本発明のモノクローナル抗体は、ＣＭ−Ｈｂ
に特異的に反応するものであれば、そのタイプ（グロブ
リンクラス）は特に限定されず、現在知られているどの
ようなグロブリンクラスのものも含まれる。また、本発
明でいうモノクローナル抗体とは、通常のモノクローナ
ル抗体のみならず、該抗体の部分分解物（Ｆａｂ、Ｆａ
ｂ'、Ｆａｂ'２等）、及び該抗体の活性フラグメント
（抗体の抗原認識部位）が存在する部分構造等も含む。

【０００９】本発明のモノクローナル抗体の製造方法は
特に限定されないが、免疫用の抗原（以下「免疫原」と
いうこともある）としてＣＭ−Ｈｂを動物に免疫した後
に免疫動物から抗体産生細胞を分取し、分取した細胞を
好適な培地で培養して製造する方法、又は分取した上記
の抗体産生細胞を形質細胞腫細胞と融合させてハイブリ
ドーマとし、該ハイブリドーマを培養したり或いは動物
体内に移植して増幅させて製造する方法等により好適に
製造することが出来る。

【００１０】以下に、本発明のモノクローナル抗体を製
造することが出来るハイブリドーマ（以下、「本発明の
ハイブリドーマ」ともいう。）を用いて本発明のモノク
ローナル抗体を製造する方法について具体的に説明す
る。ここで、ハイブリドーマとは種類の異なる二つの細
胞（親株）を人工的に融合させてできる雑種細胞のこと
で、例えば、培養できるように樹立してある形質細胞腫
細胞と、生体からとった抗体産生細胞とを融合させるこ
とにより作ることが出来る。該ハイブリドーマは培養可
能であり、しかも抗体産生能を持つ。

【００１１】本発明のハイブリドーマとは、ＣＭ−Ｈｂ
に対して特異的な反応性を有するモノクローナル抗体を
産生できるものであれば特に制限されないが、一般に動
物の免疫、細胞融合、融合細胞の選択、特異抗体産生細
胞の選択、及びクローニング等の一連の工程を経て調製
されるハイブリドーマであって、ＣＭ−Ｈｂに対して特
異的な反応性を有するモノクローナル抗体を生産するも
のをいう。

【００１２】先ず、動物の免疫について説明する。免疫
原であるＣＭ−Ｈｂは、Ｈｂのアミノ酸の側鎖アミノ基
又はＮ末端アミノ基の水素をカルボキシメチル基に置換
することにより得られる。このときの方法としては公知
の方法が何ら制限なく使用でき、例えば「新生化学講座
１、タンパク質４」（日本生化学会編、第13〜16項、東
京化学同人、1991年３月20日発行）に記されている還元
アルキル化法により行うことが出来る。即ち、アルデヒ
ド化合物とＨｂをホウ酸緩衝液やリン酸緩衝液等の水溶
液に溶解し、水素化ホウ素ナトリウムや水素化シアノホ
ウ素ナトリウム等の水素化物還元剤の存在下でｐＨ８〜
１０の条件で反応させれることにより得られる。これよ
り高いｐＨ条件下であるとタンパク質等が変性する恐れ
があり、これより低いｐＨ条件下であると水素化物還元
剤が不安定になる。該反応を特異的且つ定量的に進行さ
せるために、反応温度は室温以下が好ましいが、さらに
好ましくは０〜１０℃で行うのが良い。得られたＣＭ−
Ｈｂ溶液は透析や限外濾過を行い、未反応の還元剤やア
ルデヒド化合物を除去して用いられる。

【００１３】次いで、上記のようにして得られたＣＭ−
Ｈｂを免疫原として動物に免役する。免疫に際して、使
用される免疫原は精製されたＣＭ−Ｈｂを含む溶液であ
れば特に制限されないが、フロイントの完全アジュバン
トと混合したものを用いるのが好ましい。免疫される動
物としては、哺乳動物が好ましく、例えばマウス、モル
モット、ラット、ウサギ、ヒツジ、ニワトリ等があげら
れるが、扱いやすさの点からマウスが特に好ましい。免
疫方法は、周知の適当な方法を適宜組み合わせて実施で
きる。通常は、動物の皮下、筋肉内、腹腔内の少なくと
も１箇所以上に免疫原を注射することによって行われる
が、形質細胞腫細胞と抗体産生細胞を高い確率で融合さ
せるためには皮下、特に四肢のリンパ節に免疫原を注射
することがより好ましい。初回免疫から約１〜２週間毎
に数回免疫を行い、最終免疫より約３〜５日後に免疫動
物から抗体産生細胞を分取する。抗体産生細胞として
は、脾臓細胞やリンパ節Ｂ細胞等の抗体産生能を有する
細胞を摘出すればよい。

【００１４】次に、細胞融合以降の工程について説明す
る。細胞融合することによりハイブリドーマを作成する
際に必要なもう一方の親株である形質細胞腫細胞として
は、一般に骨髄腫（ミエローマ）細胞が用いられる。骨
髄腫細胞としては、例えばマウス由来のＰ３Ｕ１、６５
３、ＳＰ２、Ｘ６３−Ａｇ８、ＮＳ−１、ＭＰＣ−１１
等、ラット由来のＡＧ１、ＡＧ２、ＡＧ３、ＲＣＹ３、
２１０等、ヒト由来のＳＫＯ−００７等が使用できる
が、マウス由来のものが好ましく、入手の容易さや実績
等から特にＰ３Ｕ１、６５３が好ましい。さらには、抗
体産生細胞と骨髄腫細胞とは同種動物由来であることが
好ましい。

【００１５】細胞融合は、ポリエチレングリコールを用
いる方法、センダイウイルスを用いる方法、電気融合等
が使用できるが、KohlerとMilsteinの方法（Nature，25
6，495-497（1975））またはこれに準じるポリエチレン
グリコールを用いた方法は操作が簡便であり好ましい。
該方法は、３０〜５０％ポリエチレングリコール（平均
分子量１，０００〜４，０００）を用いて３０〜４０℃
の温度で、抗体産生細胞と骨髄腫細胞とを１〜１０分間
混合することによって行われる。細胞融合により得られ
るハイブリドーマの選択は、ハイブリドーマのみが生育
できる選択培地中で培養することにより行うことができ
る。例えばＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミノプテリン、
チミジン）培地、Ｈａｚ（ヒポキサンチン−アザセリ
ン）培地が好ましいものとして挙げられる。例えばＨＡ
Ｔ選択方法は、細胞融合に前記のようなＨＧＰＲＴ（ヒ
ポキサンチン−グアニン ホスホリボシル トランスフ
ェラーゼ）欠損株であるミエローマ細胞を用いた場合に
有効である。細胞融合後ＨＡＴ培地で培養することによ
り、ＨＧＰＲＴ欠損株のミエローマ細胞はアミノプテリ
ンで生育が阻害され、アミノプテリンに耐性のハイブリ
ドーマのみを選択的に増殖させることができる。

【００１６】このようにして得られたハイブリドーマの
中から、ＣＭ−Ｈｂに対し特異的に反応するモノクロー
ナル抗体を産生しているものを選択する。この選択は、
上記培養によりハイブリドーマの増殖が認められたウェ
ルの培養上清中を採取し、ＣＭ−Ｈｂに対する抗体の有
無を、例えば、ＥＬＩＳＡ法のような酵素免疫測定法等
によって調べれば良い。続いて、ＣＭ−Ｈｂに対する抗
体が存在しているウェル中のハイブリドーマをクローニ
ングすれば良い。クローニングとは、上記特異抗体産生
細胞をひとつのクローンに由来する均一な細胞集団にす
ることであり、例えば限界希釈法、ソフトアガロー上の
コロニーを拾い上げる方法、シングルセルマニュピュレ
ーション法、ＦＡＣＳ法等が挙げられるが、限界希釈法
が簡便で好ましい。

【００１７】以上の方法により単一なモノクローナル抗
体産生細胞を選択することができる。選択されたハイブ
リドーマ細胞株は、２〜１０ｍｌの培地で増殖させ液体
窒素中で凍結保存しておくことができる。なお、本発明
のハイブリドーマのひとつであるハイブリドーマ２Ｂ３
は、工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託され、１
９９８年２月１０日に「ハイブリドーマ ＣＭ−Ｈｂ
２Ｂ３」｛寄託番号：生命研菌寄第１６６３２号（ＦＥ
ＲＭ Ｐ−１６６３２）｝として受託された。

【００１８】本発明のハイブリドーマを用いた本発明の
モノクローナル抗体の作成方法としては、ハイブリドー
マを用いた抗体の作成方方法として従来公知の方法が何
ら制限なく使用できる。例えば、ハイブリドーマを動物
の腹腔内に移植し増幅させ、腹水を回収することによっ
てモノクローナル抗体を作製することができる。このよ
うにして得られた抗体は、必要に応じて精製して使用す
ることができる。精製法としては、例えば硫酸アンモニ
ウム分画法、ポリエチレングリコール分画法、エタノー
ル分画法、プロテインＡカラムあるいはプロテインＧカ
ラム等を用いたアフィニティークロマトグラフィー法、
イオン交換カラムクロマトグラフィー法、ゲル濾過カラ
ムクロマトグラフィー法、電気泳動法等の常法を用いる
ことにより精製することができる。これらの中でアフィ
ニティークロマトグラフィー法が好ましく、特にプロテ
インＡカラムを用いる方法が好ましい。

【００１９】このようにして得られたモノクローナル抗
体は、ＣＭ−Ｈｂに対する反応特異性を確認するのが好
ましい。該確認は、該抗体がＣＭ−Ｈｂとは反応する
が、Ｎ末端及び側鎖アミノ基がＣＭ化されていないＨｂ
（以下「非ＣＭ−Ｈｂ」と略すこともある）あるいはＣ
Ｍ−Ｈｂ以外のＣＭ−タンパクとは反応しないことをＥ
ＬＩＳＡ法により調べることにより行うことが出来る。
非ＣＭ−Ｈｂの作成方法としては、ＣＭ−Ｈｂを認識す
るポリクローナル抗体を担持した担体を詰めたカラム
に、検体全血より得られたＨｂ（ＣＭ−Ｈｂを含む）を
流す操作を繰り返し、カラムの通過画分として非ＣＭ−
Ｈｂを得る方法等が挙げられる。ＣＭ−Ｈｂ以外のＣＭ
−タンパクとしては、上記のＣＭ−Ｈｂ作成と同様の方
法により作成されたＣＭ−ＨＳＡ等を使用することが出
来る。

【００２０】本発明のモノクローナル抗体はＣＭ−Ｈｂ
に特異的に反応するため、該モノクローナル抗体を使用
することにより、抗原抗体反応を利用して体液等の検体
中のＣＭ−Ｈｂを測定することが出来る。

【００２１】例えば、上記抗原抗体反応に基づく不溶性
担体の凝集反応を利用して検体中のＣＭ−Ｈｂを検出す
ることができる（免疫凝集法）。また、本発明のモノク
ローナル抗体あるいはＣＭ−Ｈｂに放射性物質、各種色
素類、コロイド類、酵素等を結合させて抗原抗体反応を
行った後に、該結合させた物質に由来する放射活性、酵
素活性等を測定することによって、検体中のＣＭ−Ｈｂ
を検出することが出来る（標識免疫測定法）。このと
き、使用できる放射性物質としては放射性ヨード、放射
性炭素等が挙げられる。色素としてはフルオレセインイ
ソチオシアネート、テトラメチルローダミン等の蛍光色
素類を使用するのが好ましいがこれに限定されるもので
はない。またコロイドとしては金コロイド等が使用でき
る。酵素としてはぺルオキシダ−ゼ、アルカリホスファ
ターゼ等が使用できる。さらに本発明のモノクローナル
抗体とともに、上記色素、コロイド類、酵素等を標識し
た二次抗体を使用してＣＭ−Ｈｂの検出に用いることも
できる。また本発明のモノクローナル抗体は、必要に応
じて他のＣＭ−Ｈｂに対するモノクローナル抗体又はポ
リクローナル抗体と組み合わせてＣＭ−Ｈｂの検出に用
いることができる。

【００２２】前記免疫凝集法について具体的に例示すれ
ば、定性的方法としてはラテックス凝集法、マイクロタ
イター法等が、定量的測定法としてはラテックス定量法
等がそれぞれ挙げられる。

【００２３】また、前記標識免疫測定法について具体的
に例示すれば、定量的測定法としてはラジオイムノアッ
セイ法、エンザイムノアッセイ法、蛍光イムノアッセイ
法、化学発光イムノアッセイ法等を、半定量的測定法と
してはウエスタンブロッティング法、ドットブロッティ
ング法等をそれぞれ例示できる。

【００２４】これら各測定法における操作、手順等は一
般に採用されているそれらと特に異ならず、公知の非競
合法や競合法、サンドイッチ法等に準じることができ
る。

【００２５】例えば標識免疫測定法における非競合法を
例示すると、検体由来の既知量のＨｂを固定化した固相
に対し、酵素あるいは放射性同位元素等によって標識さ
れた本発明のモノクローナル抗体を反応させ、洗浄した
後、固相に結合した酵素活性あるいは放射活性を測定す
ることによって行われる。反応及び洗浄後の残存活性が
大きいほど、固相に結合した本発明のモノクローナル抗
体の量が多いことになる。あるいは本発明のモノクロー
ナル抗体を固相に固定し、酵素あるいは放射性同位元素
等によって標識された検体由来の既知量のＨｂを反応さ
せてもよい。

【００２６】また競合法を例示すると、本発明のモノク
ローナル抗体を固定化した固相に対し、酵素あるいは放
射性同位元素等によって標識された人工的に作製した標
準ＣＭ−Ｈｂと検体とを競合的に反応させ、洗浄した
後、固相に結合した酵素活性あるいは放射活性を測定す
ることによって行われる。固相に残存する酵素あるいは
放射活性が少ないほど、検体中のＣＭ−Ｈｂによって標
準ＣＭ−Ｈｂの結合が競合的に阻害されたことになる。

【００２７】更にサンドイッチ法を例示すると、ＣＭ−
Ｈｂと結合する物質を固定化した固相と検体とを接触さ
せ、該固相に結合した検体中のＣＭ−Ｈｂの量を、酵素
等によって標識されたＣＭ−Ｈｂと結合する物質によっ
て測定することによって行われる。ここで、あらかじめ
固相に吸着させておくＣＭ−Ｈｂと結合する物質と、酵
素等によって標識されたＣＭ−Ｈｂと結合する物質のど
ちらか一方、好ましくはその両方がＣＭ−Ｈｂと特異的
に結合する物質でなければならない。ＣＭ−Ｈｂと結合
する物質の少なくとも一方に本発明のモノクローナル抗
体を用いればよい。ＣＭ−Ｈｂと結合する他の物質とし
ては、ＣＭ−Ｈｂに対するポリクローナル抗体の他に、
抗Ｈｂ抗体等のＨｂが結合あるいは吸着することのでき
る物質を用いることができる。

【００２８】本発明の免疫試薬とは、本発明のモノクロ
ーナル抗体とＣＭ−Ｈｂの特異的な抗原抗体反応を利用
し、ＣＭ−Ｈｂを検出できる試薬であればその形態は特
に限定されない。例えば、前述した非競合法、競合法及
びサンドイッチ法等の各方法に対応するように、本発明
のモノクローナル抗体及び／又はＣＭ−Ｈｂを適宜不溶
性担体に担持した形態をとることが出来る。この様な各
免疫試薬を測定方法に応じて用いて、検体中のＣＭ−Ｈ
ｂと本発明のモノクローナル抗体とを接触させることに
よって起こる抗原抗体反応を検出することにより検体中
のＣＭ−Ｈｂが測定できる。この様な抗原抗体反応の検
出は、本発明の免疫試薬がいわゆる免疫凝集反応である
場合には不溶性担体の凝集等を利用して検出することが
できるし、本発明の免疫試薬がいわゆる標識免疫試薬で
ある場合には比色、発光、蛍光等の物理量の変化として
検出することができる。

【００２９】本発明の免疫試薬の具体的な態様を例示す
れば、定性試薬としてはラテックス凝集試薬、マイクロ
タイター試薬等を、定量試薬としてはラジオイムノアッ
セイ試薬、エンザイムイムノアッセイ試薬、蛍光イムノ
アッセイ試薬、化学発光イムノアッセイ試薬、ラテック
ス定量試薬等をそれぞれ例示できる。

【００３０】本発明のモノクローナル抗体あるいは検体
中のＣＭ−Ｈｂ抗原を担持する不溶性担体の種類及び形
状は、使用目的に応じて適宜選択すればよい。その材質
としては、通常の免疫測定用担体として用いられるも
の、例えばガラス、多糖類又はその誘導体、シリカゲ
ル、多孔性セラミックス、金属酸化物、赤血球、あるい
はポリプロピレン、ポリスチレン、ポリアクリルアミ
ド、ポリアクリロニトリル等の合成樹脂及びこれらに公
知の方法によりスルホン基、アミノ基等の反応性官能基
を導入したものが挙げられ、その形状としてはビーズ
状、テストプレート状、球状、ディスク状、チューブ
状、フィルター状等が例示できる。

【００３１】本発明のモノクローナル抗体または検体中
のＣＭ−Ｈｂの不溶性担体への固定化法は、物理的吸着
法、共有結合法、イオン結合法、架橋法等の公知の方法
が何ら制限なく使用できる。例えば固相としてマイクロ
プレートを用いた場合、モノクローナル抗体の溶液をマ
イクロプレートのウェルに注入し１〜４８時間反応させ
ることによって吸着させることができる。

【００３２】本発明の免疫試薬が標識免疫測定試薬であ
る場合、該試薬（本発明の標識免疫測定試薬ともい
う。）を用いたＣＭ−Ｈｂの測定の基本操作は通常の検
定法、例えばラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）法、ＥＬ
ＩＳＡ法、ウエスタンブロッティング法、ドットブロッ
ティング法等の酵素免疫測定（ＥＩＡ）法等に従うこと
ができる。これら各検定法における操作、手順等は一般
に採用されているそれらと特に異ならず、公知の非競合
法や競合法、サンドイッチ法等に準じることができる。
非競合法においては、例えば本発明のモノクローナル抗
体を不溶性担体に担持した試薬に、検体中のＣＭ−Ｈｂ
を接触させればよい（その逆でも良い）。競合法におい
ては、例えば人工的に作製した標準ＣＭ−Ｈｂを不溶性
担体に特定量担持し、一方で予め特定量の検体中のＣＭ
−Ｈｂと特定量の本発明のモノクローナル抗体を反応さ
せた後に、該不溶性担体と本発明のモノクローナル抗体
を接触させればよい。サンドイッチ法においては、例え
ば本発明のモノクローナル抗体を不溶性担体に特定量担
持した試薬に、検体中のＣＭ−Ｈｂを接触させ、更にＣ
Ｍ−Ｈｂに対する抗体を接触させればよい。これらの測
定方法により検体ＨｂのＣＭ化率、あるいは検体Ｈｂ中
のＣＭ化物の量を測定することができる。ここで、ＣＭ
化率とは、タンパク質のアミノ基が平均してどの程度Ｃ
Ｍ化されているかを示す指標である。

【００３３】なお、上記本発明の標識免疫測定試薬にお
ける標識剤としては放射性ヨード、放射性炭素等の放射
性物質、フルオレセインイソチオシアネートやテトラメ
チルローダミン等の蛍光物質、アルカリホスファターゼ
やパーオキシダーゼ等の酵素等をそれぞれ例示できる。
かかる方法にて得られた抗原抗体反応生成物は、放射
能、比色、蛍光、発光等を利用して検出される。

【００３４】また、標準ＣＭ−Ｈｂの標識は、ＣＭ−Ｈ
ｂのＨｂ部位をビオチン化抗Ｈｂ抗体で認識させた後に
アビジンを介して酵素標識する等、公知の方法が採用さ
れる。標識する物質としては酵素、放射性同位元素の他
に発光物質、蛍光物質等を用いることも可能である。酵
素はアルカリホスファタ−ゼ、ぺルオキシダ−ゼ、β−
D−ガラクトシダ−ゼ等が用いられる。酵素活性の測定
は、例えばアルカリホスファタ−ゼを用いた場合にはｐ
-ニトロフェニルリン酸等の基質と反応させ、酵素反応
により生じた反応生成物の量を吸光度を測定することに
より行う等、公知の方法が採用される。

【００３５】前記本発明の標識免疫測定試薬において、
不溶性担体に担持される本発明のモノクローナル抗体あ
るいは検体中のＣＭ−Ｈｂの量は、一般に不溶性担体の
表面積当たり０．０１〜１０００μｇ／ｃｍ²の割合で
あり、通常この程度の担持量を得るためには単体を０．
００１〜１０００μｇの検体中のＣＭ―Ｈｂあるいは本
発明のモノクローナル抗体と接触させれば良い。なお、
Ｈｂに対する抗体を不溶性担体に担持した場合には、上
記したように検体中のＣＭ―Ｈｂを接触させた後、更に
本発明のモノクローナル抗体を接触させればよい。この
時、不溶性担体に担持していない本発明のモノクローナ
ル抗体は、標識剤で標識されたものを使用することが好
ましい。

【００３６】また、本発明の免疫試薬が免疫凝集試薬で
ある場合、該試薬（本発明の免疫凝集試薬ともいう。）
を用いた検体中のＣＭ−Ｈｂ測定の基本操作は、通常の
検定法、例えば赤血球凝集反応法、受身凝集反応法、免
疫比蝋法、免疫比濁法等に従うことができる。これらの
各検定法における操作、手順等は一般に採用されている
それらに準じることができる。モノクローナル抗体を固
定化する固相としては特に制限されるものではないが、
ポリスチレン等でできたビーズやマイクロプレートが使
用される。例えば粒子状の不溶性担体１ｇに対して、本
発明のモノクローナル抗体を上記方法にて０．００１〜
１００ｍｇ担持した粒子（以下、「感作粒子」と略すこ
ともある）を、０．００１〜１５重量％となるように水
性媒体に分散させて免疫試薬の有効成分として使用すれ
ばよい。抗体を担持する不溶性担体の粒径は、抗原抗体
反応後の凝集の起こり安さや凝集の判別のし易さなどの
観点から、平均粒径が０．０５〜１０μｍの不溶性担体
を使用するのが好適である。かかる方法にて作成した感
作粒子を検体中のＣＭ−Ｈｂ抗原と接触させ、該感作粒
子の凝集の度合を測定すれば良い。粒子の凝集の度合は
目視、光学的測定等従来の方法が制限なく使用できる。

【００３７】後述する実施例にも示されるように、糖尿
病あるいは糖尿病合併症患者由来のＨｂに占めるＣＭ−
Ｈｂの割合は健常者のそれに比べて有意に高く、更に、
糖尿病合併症の重篤度と検体Ｈｂに占めるＣＭ−Ｈｂの
割合の間には正の相関が見らる。また、透析患者由来の
Ｈｂに占めるＣＭ−Ｈｂの割合も健常者のそれと比較し
て有意に高く、更に、透析アミロイドーシスを発症した
患者由来のＨｂにおいては、ＣＭ−Ｈｂの占める割合
が、透析アミロイドーシスを発症していない透析患者由
来のＨｂと比較して有意に高い。したがって、ＣＭ−Ｈ
ｂは、臨床検査の領域において糖尿病あるいは糖尿病合
併症のマーカー、あるいは透析患者におけるアミロイド
ーシスのマーカーとなりうる。即ち、血液中のＨｂのＣ
Ｍ化率を測定することにより、糖尿病あるいは糖尿病合
併症にかかっているか否かを判断したり、糖尿病の進行
度合いを予測したり、あるいは糖尿病合併症の発症や進
行度合いを予測したりすることが可能となり、また、透
析アミロイドーシスの発症の有無を予測することも可能
となる。

【００３８】このため、本発明の免疫学的測定試薬は、
糖尿病用診断試薬、糖尿病合併症用診断試薬、あるいは
透析アミロイドーシス用診断試薬、さらには糖尿病、糖
尿病合併症、あるいは透析アミロイドーシスの治療もし
くは予防用の薬剤の薬効評価試薬として有益に用いられ
る。即ち、本発明の免疫学的測定試薬を用いて臨床検査
に被検体として多用されている血液中のＣＭ−Ｈｂ抗原
量を測定した場合には診断試薬として働き、また糖尿病
あるいは糖尿病合併症用治療薬の投与による血液中に含
まれるＣＭ−Ｈｂの量あるいは割合の減少度等を測定す
る場合には薬効評価試薬として機能する。

【００３９】

【実施例】以下、実施例により本発明を具体的に説明す
るが、本発明は該実施例に限定されるものではない。

【００４０】実施例１ （１） 〔抗原の作成〕 以下の方法によりＣＭ−Ｈｂの生成及び精製を行った。
Ｈｂ（ＳＩＧＭＡ社）をホウ酸緩衝液（０．１Ｍ ｐＨ
９．０）中１ｍｇ／ｍｌとなるように調整し、この溶液
２００ｍｌを室温で２時間、１Mグリオキシル酸溶液１
８０ｍｌと共に撹拌後、さらに室温で２時間、１０ｍｇ
／ｍｌ水素化シアノホウ素ナトリウム溶液２０ｍｌと共
に撹拌することでＣＭ−Ｈｂを生成した。さらにリン酸
緩衝液（３．３ｍＭ ｐＨ７．４）中で透析膜を用いて
２０時間透析後、限外濾過を行い精製ＣＭ−Ｈｂを得
た。

【００４１】（２） 〔マウスの免疫〕 上記の方法で精製されたＣＭ−Ｈｂを、リン酸緩衝生理
食塩水（以下「ＰＢＳ」と略すこともある）に０．２ｍ
ｇ／ｍｌとなるよう希釈後、フロイントの完全アジュバ
ントと等量混合し、ＢＡＬＢ／ｃマウス（雌、５週令）
一匹当り０．２ｍｌを腹腔内投与することによって初回
免疫した。以後２週間間隔で3回、ＣＭ−ＨｂのＰＢＳ
溶液をフロイントの不完全アジュバントと等量混合した
溶液を、マウス1匹当り０．２ｍｌ腹腔内投与し追加免
疫を行った。最後の追加免疫の２週間後、ＣＭ−Ｈｂの
ＰＢＳ溶液０．１ｍｌを静脈内投与することにより最終
免疫した。

【００４２】（３） 〔細胞融合〕 上記の方法で最終免疫を行った３日後に免疫マウスから
脾臓を摘出し、脾臓細胞を１０％ウシ胎児血清（ＦＣ
Ｓ）を含むＲＰＭＩ‐１６４０培地に懸濁した。一方、
マウスミエローマ細胞Ｐ３Ｕ１を１０％ＦＣＳを含むＲ
ＰＭＩ‐１６４０培地で培養し、対数増殖期で細胞を集
め細胞融合に用いた。マウス脾臓細胞とＰ３Ｕ１をそれ
ぞれ血清を含まないＲＰＭＩ‐１６４０培地で3回洗浄
した後、５：１の比率で混合し、１，５００ｒｐｍで５
分間遠心して培地を除去した。細胞沈殿物に５０％ポリ
エチレングリコール１５００を０．５ｍｌ徐々に加え、
１，８００ｒｐｍで8分遠心した。次に血清を含まない
ＲＰＭＩ‐１６４０培地２０ｍｌを徐々に加えた後、
１，５００ｒｐｍで５分間遠心して上清を除去した。沈
殿した細胞をＨＡＴ培地（１×１０^-4Ｍヒポキサンチ
ン、４×１０^-7Ｍアミノプテリン、１．５×１０^-5Ｍチ
ミジン、２０％ＦＣＳを含むＲＰＭＩ−１６４０培地）
５０ｍｌに懸濁し、９６ウェルマイクロプレートの各ウ
ェルに０．１ｍｌずつ分注した。この融合細胞を５％Ｃ
Ｏ₂、３７℃で培養した。細胞融合の1日後に各ウェルに
０．１ｍｌずつＨＡＴ培地を加えた。７〜１０日後に増
殖したハイブリドーマのコロニーが観察された。ハイブ
リドーマが増殖してきたウェルは全部で２３５ウェル
（５３％）であった。

【００４３】（４） 〔スクリーニング〕 ハイブリドーマが十分増殖したウェルの上清を採取し、
以下のようにしてＥＬＩＳＡ法を行うことにより、ＣＭ
−Ｈｂに対する抗体を産生しているハイブリドーマを選
択した。

【００４４】上記の方法で得られたＣＭ−ＨｂをＰＢＳ
で１μｇ／ｍｌの濃度に希釈し、９６ウェルのＥＩＡ用
マイクロプレートに１ウェル当り１００μｌずつ分注
し、４℃で一晩インキュベーションした。マイクロプレ
ートからＣＭ−Ｈｂ溶液を除去し、０．０５％Ｔｗｅｅ
ｎ８０を含むＰＢＳ（以下「Ｔ−ＰＢＳ」と略すことも
ある）で３回洗浄した後、各ウェルに１％ウシ血清アル
ブミンを含むＰＢＳ（以下「Ｂ−ＰＢＳ」と略すことも
ある）を２５０μｌ加え４℃に保存し抗原吸着プレート
として以後の操作に用いた。抗原吸着プレートをＴ−Ｐ
ＢＳで３回洗浄し、ハイブリドーマ培地上清をそれぞれ
のウェルに１００μｌずつ加え３７℃で1時間インキュ
ベーションした。その後培地上清を除去し、T−ＰＢＳ
で3回洗浄した後、二次抗体溶液を各ウェルに１００μ
ｌずつ加え３７℃で１時間インキュベーションした。二
次抗体としては、ぺルオキシダ−ゼ標識抗マウス免疫グ
ロブリン抗体（カッペル社）をB−ＰＢＳで５００倍希
釈して用いた。二次抗体溶液を除去し、Ｔ−ＰＢＳで3
回洗浄した後、発色基質溶液を各ウェルに１００μｌず
つ加え室温で３０分間インキュベーションした。発色基
質溶液は、０．０１％過酸化水素、０．３ｍｇ／ｍｌＡ
ＢＴＳ、［2、2`−アジノビス（３−エチルベンゾチア
ゾリン−6−スルホン酸）二アンモニウム］、を含む
０．１Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ５．０）を用いた。適当
量の発色を確認後に１％ＳＤＳを各ウェルに加え反応を
停止し、波長４１０ｎｍでの吸光度を測定した。

【００４５】（５） 〔ハイブリドーマのクローニン
グ〕 上記の方法のスクリーニングによってＣＭ−Ｈｂと強く
反応するハイブリドーマを選択し、限界希釈法によりク
ローニングを行った。ハイブリドーマを２０％ＦＣＳを
含むＲＰＭＩ‐１６４０培地で０．５個／０．１ｍｌの
濃度となるように希釈し、９６ウェルマイクロプレート
の各ウェルに０．１ｍｌずつ分注した。この細胞を５％
ＣＯ₂、３７℃で培養した。ハイブリドーマが単一のコ
ロニーで増殖してきたウェルの培養上清について、上記
の方法と同様にしてＥＬＩＳＡ法を行い、ＣＭ−Ｈｂに
対する抗体を産生しているハイブリドーマを選択した。
その中でＣＭ−Ｈｂと最も強く反応するモノクローナル
抗体を安定的に産生するハイブリドーマとして2Ｂ３を
得た。得られたハイブリドーマ２Ｂ３は、「ハイブリド
ーマ ＣＭ−Ｈｂ ２Ｂ３」として工業技術院生命工学
工業技術研究所へ寄託した（寄託番号：生命研菌寄第１
６６３２号（ＦＥＲＭ Ｐ−１６６３２））。

【００４６】（６） 〔モノクローナル抗体の免疫グロ
ブリンクラス〕 ＥＬＩＳＡ法によるモノクローナル抗体タイピングキッ
ト（アメリカン・コ−レックス社）を用い、ハイブリド
ーマ培養上清中の抗体の免疫グロブリンクラスを調べ
た。このキットはマウス免疫グロブリンの各クラス、サ
ブクラスに特異的なウサギＩｇＧ抗体を用いて、上記の
ようなＥＬＩＳＡ法に準じた方法で免疫グロブリンクラ
スを調べるものである。ハイブリドーマ２Ｂ３が産生す
るモノクローナル抗体の免疫グロブリンクラスはＩｇＧ
であった。

【００４７】（７） 〔モノクローナル抗体の調整〕 ハイブリドーマ２Ｂ３株を、１０％ＦＣＳを含むＲＰＭ
Ｉ−１６４０培地で培養した。ハイブリドーマの培養上
清に等量の飽和硫酸アンモニウムを加え、遠心分離し沈
殿を分取した。この沈殿を少量の１０ｍＭトリス塩酸緩
衝液（ｐＨ８．５）に溶解させ、同じ緩衝液に対して透
析した。透析後遠心分離し不溶物を除き、これをＤＥＡ
Ｅ−セルロースカラムにかけた。緩衝液で洗浄後、食塩
濃度勾配により溶出しＩｇＧ画分を分取した。この画分
をゲル濾過ＨＰＬＣカラム（バイオラッド社、Bio−Sil
TSK250）にかけ、クロマトグラフィーを行うことによ
り精製モノクローナル抗体を得た。

【００４８】（８） 〔ＣＭ化ペプチド（ＣＭ−ペプチ
ド）の作成〕 Ｈｂのβ鎖Ｎ末端のバリン残基を含むペプチド（アミノ
酸配列：Ｖａｌ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｇ
ｌｕ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ 以下「ペプチドβＮ」と表記す
ることもある）、あるいはＨｂのβ鎖６６番目のリジン
残基を含むペプチド（アミノ酸配列：Ａｌａ−Ｈｉｓ−
Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａ
ｌａ−Ｐｈｅ−Ｓｅｒ−Ｃｙｓ 以下「ペプチドβ６
６」と表記することもある）、あるいはＨｂのα鎖６１
番目のリジン残基を含むペプチド（アミノ酸配列：Ｇｌ
ｙ−Ｈｉｓ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ａｌａ
−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｃｙｓ 以下「ペ
プチドα６１」と表記することもある）等をペプチド合
成装置を用いて固相法により合成した。アミノ酸のアミ
ノ基の保護はｔ−ブトキシカルボニル基（Ｂｏｃ）を用
い、Ｃ末端の保護基として不溶性の高分子担体であるプ
ラリドキシムレジン（Ｐａｍ ｒｅｓｉｎ）を用いた。

【００４９】他のリジン残基のアミノ基等を適当な方法
で保護した後、ジクロロメタン中０℃で２時間グリオキ
シル酸と反応後、さらに２時間水素化シアノホウ素ナト
リウムと反応することで、該ペプチドのβ鎖Ｎ末端のバ
リン残基、β鎖６６番目のリジン残基あるいはα鎖６１
番目のリジン残基のアミノ基に相当する部位だけをＣＭ
化した。０℃で１．５時間フッ化水素処理することで固
相樹脂よりペプチドを切り離すとともに保護基を除去し
て、高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により
精製した。これによりＨｂのβ鎖Ｎ末端のバリン残基だ
けがＣＭ化されたペプチド（アミノ酸配列：（ＣＭ）Ｖ
ａｌ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｇｌ
ｕ−Ｃｙｓ 以下「ＣＭ−ペプチドβＮ」と表記するこ
ともある）、あるいはＨｂのβ鎖６６番目のリジン残基
だけがＣＭ化されたペプチド（アミノ酸配列：Ａｌａ−
Ｈｉｓ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ（ＣＭ）−Ｖａｌ−Ｌ
ｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ｓｅｒ−Ｃｙｓ 以下
「ＣＭ−ペプチドβ６６」と表記することもある）、あ
るいはＨｂのα鎖６１番目のリジン残基だけがＣＭ化さ
れたペプチド（アミノ酸配列：Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−Ｇｌｙ
−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ（ＣＭ）−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ａｓｐ−
Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｃｙｓ 以下「ＣＭ−ペプチ
ドα６１」と表記することもある）を得た。それぞれの
ＣＭ−ペプチドの純度は質量分析及びアミノ酸分析によ
り確認した。

【００５０】（９）〔ＣＭ−ＨＳＡの作成〕 ホウ酸緩衝液（ｐＨ９）に溶解した１ｍｇ／ｍｌのＨＳ
Ａ １ｍｌに、ｐＨ９に調製した０．２５Mのグリオキ
シル酸（ＳＩＧＭＡ社製）１ｍｌを混合し、０℃で１２
時間放置した。その後、１ｍｇの水素化シアノホウ素ナ
トリウムを加え更に１２時間放置し、タンパク質のアミ
ノ基をＣＭ化した。また、対照として、グリオキシル酸
を添加しないこと以外は同様の方法でＨＳＡを処理し
た。

【００５１】上記各処理後のＨＳＡのＣＭ化率を、トリ
ニトロベンゼンスルホン酸（以下「ＴＮＢＳ」と略すこ
ともある）を用いて、ＣＭ化されたアミノ基と未反応の
アミノ基の比を測定することで、以下に示すような方法
により求めた。

【００５２】即ち、前記のＣＭ−ＨＳＡ及びグリオキシ
ル酸処理していないＨＳＡの各試料０．５ｍｌを、０．
１Mの四ホウ酸ナトリウムを含む０．１Mの水酸化ナトリ
ウム水溶液０．５ｍｌにそれぞれ加えた。次いで、再結
晶化し希塩酸で洗浄した後、蒸留水で１．１Mに調製し
たＴＮＢＳを、２０μｌ加え撹拌した。３０分後に１．
５ｍMの亜硫酸ナトリウムを含む９８．５ｍMのリン酸二
水素ナトリウムを２ｍｌ加えて反応を停止させ、蒸留水
で１０倍に希釈した後に４２０ｎｍの吸光度を測定し
た。ＣＭ−ＨＳＡの吸光度は０．０３であり、グリオキ
シル酸処理をしていないＨＳＡ（対照）の吸光度は１．
２５であった。上記のいずれのＨＳＡも含まない系で同
様の測定を行ったところ、吸光度は０．０３であったの
で、ＣＭ−ＨＳＡのＣＭ化率は１００％であることが解
った。

【００５３】かかる方法で得られたＣＭ−ＨＳＡは、２
０ｍＭ ＰＢＳで４℃にて２日間透析し、未反応のグリ
オキシル酸や水素化シアノホウ素ナトリウムを除去し、
精製ＣＭ−ＨＳＡを得た。

【００５４】（１０）〔モノクローナル抗体の性質〕 ＢＩＡ−ｃｏｒｅ（ファルマシア社）のセンサーチップ
上に、上記の方法で作成したＣＭ−Ｈｂ、市販Ｈｂ（Ｓ
ＩＧＭＡ社）、上記の方法で作成したＣＭ−ＨＳＡをア
ミンカップリング法により固定した。アミンカップリン
グに用いる試薬及び操作はＢＩＡ−ｃｏｒｅ用キット及
び通常の操作手順に従った。センサーチップ表面に固定
されたタンパク質量は５０〜６０ｎｇ／ｍｍ²であっ
た。ハイブリドーマ２Ｂ３が産生するモノクローナル抗
体をＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．４、０．１５Ｍ Ｎａ
Ｃｌ）に５０μｇ／ｍｌとなるよう溶解し、１０μｌ／
minの流速で３０μｌの該抗体溶液をセンサーチップに
注入し、センサーチップに固定化したそれぞれのタンパ
ク質と該モノクローナル抗体との親和定数を調べた。測
定及び解析はＢＩＡ−ｃｏｒｅでの通常の操作手順に従
った。上記センサーチップに固定化された各タンパク質
と本発明のモノクローナル抗体との親和定数を表１に示
す。

【００５５】

【表１】

【００５６】表１に示されるように、本発明の抗体はＣ
Ｍ−Ｈｂと特異的に結合した（親和定数：６．２８×１
０⁸）。Ｈｂ（ＳＩＧＭＡ社）やＣＭ−ＨＳＡ等とは結
合せず、該抗体はＣＭ化されていないＨｂやＨｂ以外の
ＣＭ−タンパクとは反応しない（親和定数：共に１×１
０³未満）ことが分かった。

【００５７】ＢＩＡ−ｃｏｒｅのセンサーチップ上に、
実施例１の方法で作成したＣＭ−ペプチド（ＣＭ−ペプ
チドβＮ、ＣＭ−ペプチドβ６６、ＣＭ−ペプチドα６
１）及びＣＭ化していない同一アミノ酸配列のペプチド
（ペプチドβＮ、ペプチドβ６６、ペプチドα６１）
を、Ｃ末端システイン残基を利用してチオールカップリ
ング法により固定した。チオールカップリングに用いる
試薬及び操作はＢＩＡ−ｃｏｒｅ用キット及び通常の操
作手順に従った。センサーチップ表面に固定されたペプ
チド量は５〜６ｎｇ／ｍｍ²であった。ハイブリドーマ
２Ｂ３が産生するモノクローナル抗体をＨＥＰＥＳ緩衝
液（ｐＨ７．４、０．１５Ｍ ＮａＣｌ）に５０μｇ／
ｍｌとなるよう溶解し、１０μｌ／minの流速で３０μ
ｌの該抗体溶液をセンサーチップに注入し、センサーチ
ップに固定化したそれぞれのペプチドと該モノクローナ
ル抗体との親和定数を調べた。測定及び解析はＢＩＡ−
ｃｏｒｅでの通常の操作手順に従った。結果を表２に示
す。

【００５８】

【表２】

【００５９】表２に示されるようにハイブリドーマ２Ｂ
３が産生するモノクローナル抗体は、β鎖Ｎ末端のアミ
ノ基がＣＭ化されたペプチド（ＣＭ−ペプチドβＮ）と
特異的に反応し（親和定数：７．８４×１０⁷）、他の
ＣＭ−ペプチド（ＣＭ−ペプチドβ６６、ＣＭ−ペプチ
ドα６１）及びＣＭ化していないペプチド（ペプチドβ
Ｎ、ペプチドβ６６、ペプチドα６１）とは反応しなか
った（親和定数：何れも１×１０³未満）。

【００６０】（１１）〔ＣＭ−Ｈｂに対するヤギポリク
ローナル抗体（抗ＣＭ−Ｈｂヤギポリクローナル抗体）
の作成〕 免疫用の動物としてヤギを選び、上記作成したＣＭ−Ｈ
ｂを抗原として以下の要領で免疫した。

【００６１】２ｍｇ／ｍｌになるように調製した該抗原
溶液１．５ｍｌにフロイントの完全アジュバント１．５
ｍｌを加えたものをヤギの皮下に注射した。その後、２
週間おきに２ｍｇ／ｍｌの該抗原０．７５ｍｌに、フロ
イントの完全アジュバント０．７５ｍｌを加えたものを
追加免疫した。この間、ＣＭ−Ｈｂに対するポリクロー
ナル抗体が産生されたか否かを確認するために、２週間
に１回ヤギの静脈から部分採血した。６週間後、抗ＣＭ
−Ｈｂヤギポリクローナル抗体が産生されたことをＥＬ
ＩＳＡ法で確認し、全採血した。

【００６２】（１２） 〔抗ＣＭ−Ｈｂヤギポリクロー
ナル抗体用アフィニティ精製カラムの作成 〕 ２５ｍｌのアフィゲル１５を７５ｍｌの１０ｍＭ酢酸緩
衝液（ｐＨ４．５）で洗浄した後、１０ｍｇ／ｍｌのＨ
ｂ溶液を６２．５ｍｌ加え、室温で１時間緩やかに撹拌
した。次いで、未反応のＨｂを濾過にて除去し、１Ｍの
エタノールアミンを３０ｍｌ加え、室温で緩やかに撹拌
し、未反応のＮ−ヒドロキシサクシイミドエステルをブ
ロッキングした。該Ｈｂを固定化した支持体をカラムに
詰め、２８０ｎｍの吸光度が０になるまでイオン交換水
で洗浄した。更に、２０ｍＭのＰＢＳでカラムを平衡化
した。

【００６３】（１３） 〔抗ＣＭ−Ｈｂヤギポリクロー
ナル抗体のアフィニティ精製〕 作成した抗ＣＭ−Ｈｂヤギポリクローナル抗体を１ｍｇ
／ｍｌになるように２０ｍＭのＰＢＳで希釈したもの
を、１００ｍｇ程度になるように該アフィニティ精製カ
ラムにアプライした。次いで、２８０ｎｍの吸光度が０
になるまで２０ｍＭのＰＢＳを流速０．５ｍｌ／ｍｉｎ
で流した。カラムに結合しなかった抗体を抗ＣＭ−Ｈｂ
ヤギポリクローナル抗体として回収した。２８０ｎｍの
吸光度が０になったところで、２０ｍＭのＰＢＳから
０．１Ｍのグリシン緩衝液（ｐＨ３．０）に換え、カラ
ムに結合している不要なタンパク質を溶離させ、２０ｍ
ＭのＰＢＳでカラムを平衡化し、回収した抗体を再度カ
ラムにアプライし、カラムに結合しなかった抗体を回収
した。この操作を更に１回繰り返し、アフィニティ精製
した抗ＣＭ−Ｈｂヤギポリクローナル抗体を得た。該抗
体を用いて、検体中のＨｂをＣＭ−Ｈｂと非ＣＭ−Ｈｂ
とにアフィニティー精製により分離精製した。

【００６４】（１４）〔非ＣＭ−Ｈｂのアフィニティ精
製〕 上記と同様の方法で、抗ＣＭ−Ｈｂヤギポリクローナル
抗体を固定したアフィニティー精製カラムを作成した。
該カラムを用いて上記と同様の方法により、検体Ｈｂか
ら該カラムの３回目の通過画分として非ＣＭ−Ｈｂを分
離精製した。

【００６５】（１５）〔抗Ｈｂポリクローナル抗体のビ
オチン標識〕 該抗体のビオチン標識はプロテインビオチニレーション
システム（GIBCO社製）を用いて行った。

【００６６】市販の抗Ｈｂポリクローナル抗体（（株）
日本バイオテスト研究所製）を、１．５ｍｇ／ｍｌにな
るように２０ｍMのＰＢＳで調製した溶液に、０．０５
Ｍになるように炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．０）を
加えた。次いで、該抗体溶液６．７ｍｌに説明書に従っ
て作成した５０ｍｇ／ｍｌのＣＡＢ−ＮＨＳエステル溶
液２６μｌを加え、室温で１時間緩やかに撹拌し、０．
１１Ｍになるように塩化アンモニウムを加えて反応を停
止させた。その後、本キットに付属のカラムで抗体溶液
を脱塩した。更に、キット付属のａｖｉｄｉｎ／ＨＡＢ
Ａを用いて、導入されたビオチンのモル数を測定したと
ころ、抗Ｈｂポリクローナル抗体１モルに対してビオチ
ンは１４モル結合していた。

【００６７】（１６）〔非ＣＭ−Ｈｂと本発明で得られ
たハイブリドーマ２Ｂ３が産生するモノクローナル抗体
との反応性〕 上記の方法で得られた非ＣＭ−Ｈｂと本発明で得られた
ハイブリドーマ２Ｂ３が産生するモノクローナル抗体と
の反応性を調べた。

【００６８】ハイブリドーマ２Ｂ３が産生するモノクロ
ーナル抗体を、炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９）に３μ
g／ｍｌとなるよう希釈したものを、９６ウェルのＥＩ
Ａ用マイクロプレートの各ウェルに０．３ｍｌずつ加
え、３７℃で１時間放置し固定した。マイクロプレート
から抗体溶液を除去し、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を含む
トリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．４、０．１５Ｍ ＮａＣ
ｌ）で３回洗浄した後、各ウェルに、２０ｍＭ ＭＯＰ
Ｓ（ｐＨ７．４、０．０１％ Ｔｗｅｅｎ２０及び０．
１５Ｍ ＮａＣｌを含む）で希釈した非ＣＭ−Ｈｂ及び
ヒト全血検体のＨｂを、それぞれ各ウェル当たり１０
０、５０、２５、１２．５μｇとなるように０．１ｍｌ
ずつ加え、３７℃で１５分放置した。各ウェルより溶液
を除去し、０．５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むトリス塩酸緩
衝液（ｐＨ７．４、０．１５Ｍ ＮａＣｌ）で３回洗浄
した後、ビオチン化した抗Ｈｂポリクローナル抗体を２
０ｍＭＭＯＰＳ（ｐＨ７．４、０．１５Ｍ ＮａＣｌ）
に１μｇ／ｍｌとなるよう希釈し、各ウェルに０．１ｍ
ｌずつ加え３７℃で１５分放置した。溶液を除去し０．
１％Ｔｗｅｅｎ２０を含むトリス塩酸緩衝液（ｐH７．
４、０．１５Ｍ ＮａＣｌ）で３回洗浄した後、ＡＢＣ
キット（ベクスタイン社）に従いアビジンを介して抗原
抗体複合体（2Ｂ３―ＣＭ−Ｈｂ―ビオチン化抗Ｈｂ抗
体）をアルカリホスファターゼ標識した。溶液を除去し
０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を含むトリス塩酸緩衝液（ｐH
７．４、０．１５Ｍ ＮａＣｌ）で３回洗浄した後、発
色基質溶液を各ウェルに０．１ｍｌずつ加え、室温で4
分放置した。発色基質溶液はｐ−ニトロフェニルリン酸
の２−エタノールアミン水溶液（BIO-RAD社）。反応
後、０．５Ｍの ＮａＯＨを各ウェルに０．１ｍｌずつ
加え反応を停止し、波長４６０ｎｍでの吸光度を測定し
た。検体中のＣＭ−Ｈｂに由来する、発色強度の測定結
果を図１に示す。ヒト全血検体では濃度依存的に増加す
る反応が確認されたが、非ＣＭ−Ｈｂとは反応が確認さ
れず、該抗体は非ＣＭ−Ｈｂとは反応しないことが分か
った。

【００６９】以上の知見より、ハイブリドーマ２Ｂ３が
産生するモノクローナル抗体は、Ｎ末端のアミノ基の水
素がＣＭ化されたＨｂと特異的に反応することが判っ
た。

【００７０】実施例２ 〔モノクローナル抗体を用いた
サンドイッチ法によるヒト全血中のＣＭ−Ｈｂの定量〕 ハイブリドーマ２Ｂ３が産生するモノクローナル抗体を
用いて、ヒト全血中のＣＭ−Ｈｂの定量方法を検討し
た。実施例１（１６）と同様の方法で、サンドイッチＥ
ＬＩＳＡ法により検討した。検体試料として、２０ｍＭ
ＭＯＰＳ（ｐＨ７．４、０．０１％ Ｔｗｅｅｎ２０
及び０．１５Ｍ ＮａＣｌを含む）で２００、４００、
８００倍希釈した糖尿病患者及び健常者の全血を０．１
ｍｌずつ用いた。検体中のＣＭ−Ｈｂに由来する、発色
強度の測定結果を図２に示す。糖尿病患者の検体は、健
常者と比較して有意に高い値を示した。

【００７１】さらに、各検体の糖尿病合併症の重篤度
と、検体中のＣＭ−Ｈｂに由来する発色強度との関係を
図３に示す。各検体の糖尿病合併症の重篤度と、検体中
のＣＭ−Ｈｂに由来する発色強度の間には、有意な相関
が確認された。

【００７２】以上のことは、本発明で得られたハイブリ
ドーマ２Ｂ３が産生するモノクローナル抗体を免疫学的
測定法に用いることによって、糖尿病又は糖尿病合併症
の新規マーカーであるＣＭ−Ｈｂを容易に直接測定でき
ることを意味する。

【００７３】実施例３ 〔Ｈｂのカルボキシメチル化リ
ジン残基を認識するモノクローナル抗体の作成と、該抗
体を用いたサンドイッチ法によるヒト全血中のＣＭ−Ｈ
ｂの定量〕 実施例１（８）で作成した、β鎖６６番目のリジン残基
をＣＭ化したペプチド（ＣＭ−ペプチドβ６６）を用い
て、実施例１と同様の方法でマウスの免疫、細胞融合、
融合細胞の選択、特異抗体産生細胞の選択、クローニン
グ等を行い、抗ＣＭ−Ｈｂモノクローナルを産生するハ
イブリドーマ（１１Ｂ９）を得た。

【００７４】実施例１（１０）と同様の方法で、実施例
１（８）で作成したＣＭ−ペプチド（ＣＭ−ペプチドβ
Ｎ、ＣＭ−ペプチドβ６６、ＣＭ−ペプチドα６１）及
びＣＭ化していない同一アミノ酸配列のペプチド（ペプ
チドβＮ、ペプチドβ６６、ペプチドα６１）と、ハイ
ブリドーマ１１Ｂ９が産生するモノクローナル抗体との
相互作用をＢＩＡ−ｃｏｒｅを用いて調べ親和定数を計
算した。結果を表３に示す。

【００７５】

【表３】

【００７６】表３に示されるように、ハイブリドーマ１
１Ｂ９が産生するモノクローナル抗体は、β鎖６６番目
のリジン残基のアミノ基がＣＭ化されたペプチド（ＣＭ
−ペプチドβ６６）と特異的に反応し（親和定数：１．
２４×１０⁸）、他のＣＭ−ペプチド（ＣＭ−ペプチド
βＮ、ＣＭ−ペプチドα６１）及びＣＭ化していないペ
プチド（ペプチドβＮ、ペプチドβ６６、ペプチドα６
１）とは反応しなかった（親和定数：いずれも１×１０
³未満）。

【００７７】実施例１（１０）と同様の方法で、化学的
に合成したＣＭ−Ｈｂ、Ｈｂ（SIGMA社）、ＣＭ−ＨＳ
Ａ等とハイブリドーマ１１Ｂ９が産生するモノクローナ
ル抗体との相互作用をＢＩＡ−ｃｏｒｅを用いて調べ親
和定数を計算した。結果を表４に示す。

【００７８】

【表４】

【００７９】表４に示されるように、ハイブリドーマ１
１Ｂ９が産生するモノクローナル抗体はＣＭ−Ｈｂと特
異的に結合し（親和定数：４．５６×１０⁹）、Ｈｂ（S
IGMA社）やＣＭ−ＨＳＡ等とは結合せず、該抗体はＣＭ
化されていないＨｂやＨｂ以外のＣＭ−タンパクとは反
応しない（親和定数：いずれも１×１０³未満）ことが
分かった。

【００８０】実施例１（１６）と同様の方法で、実施例
１（１４）で作製した非ＣＭ−Ｈｂ及び人全血検体Ｈｂ
と、ハイブリドーマ１１Ｂ９が産生するモノクローナル
抗体との相互作用をサンドイッチＥＬＩＳＡ法により調
べた。測定結果を図４に示す。ヒト全血検体では濃度依
存的に増加する反応が確認されたが、非ＣＭ−Ｈｂとは
反応が確認されず、該抗体はＣＭ化されていないＨｂと
は反応しないことが分かった。

【００８１】以上の知見より、ハイブリドーマ１１Ｂ９
が産生するモノクローナル抗体は、β鎖６６番目のリジ
ン残基のアミノ基の水素がＣＭ化されたＨｂと特異的に
反応することが判った。

【００８２】実施例４ 〔ハイブリドーマ１１Ｂ９の産
生するモノクローナル抗体を用いたサンドイッチＥＬＩ
ＳＡ法によるヒト全血中のＣＭ−Ｈｂの定量〕 実施例１（１６）と同様の方法で、ハイブリドーマ１１
Ｂ９の産生するモノクローナル抗体を用いたサンドイッ
チＥＬＩＳＡ法により、透析患者の内、透析アミロイド
ーシスを発症している患者及び発症していない患者検体
中のＣＭ−Ｈｂの定量を行った。検体中のＣＭ−Ｈｂに
由来する発色強度の測定結果を図５に示す。透析アミロ
イドーシスを発症した患者検体中のＣＭ−Ｈｂ由来の発
色強度は、透析アミロイドーシスを発症していない患者
検体と比較して有意に高い値を示した。

【００８３】以上のことは、本発明で得られたハイブリ
ドーマ１１Ｂ９の産生するモノクローナル抗体を用いた
免疫学的測定方法が、透析アミロイドーシスの新規マー
カーであるＣＭ−Ｈｂの測定に有用であることを意味す
る。

【００８４】実施例５ 〔Ｈｂのカルボキシメチル化リ
ジン残基を認識するモノクローナル抗体の作成と、該抗
体を用いたサンドイッチ法によるヒト全血中のＣＭ−Ｈ
ｂの定量〕 実施例１（８）で作成した、α鎖６１番目のリジン残基
をＣＭ化したペプチド（ＣＭ−ペプチドα６１）を用い
て、実施例１と同様の方法でマウスの免疫、細胞融合、
融合細胞の選択、特異抗体産生細胞の選択、クローニン
グ等を行い、抗ＣＭ−Ｈｂモノクローナルを産生するハ
イブリドーマ（７Ｆ９）を得た。

【００８５】実施例１（１０）と同様の方法で、実施例
１（８）で作成したＣＭ−ペプチド（ＣＭ−ペプチドβ
Ｎ、ＣＭ−ペプチドβ６６、ＣＭ−ペプチドα６１）及
びＣＭ化していない同一アミノ酸配列のペプチド（ペプ
チドβＮ、ペプチドβ６６、ペプチドα６１）と、ハイ
ブリドーマ７Ｆ９が産生するモノクローナル抗体との相
互作用をＢＩＡ−ｃｏｒｅを用いて調べ親和定数を計算
した。結果を表５に示す。

【００８６】

【表５】

【００８７】表５に示されるように、ハイブリドーマ７
Ｆ９が産生するモノクローナル抗体は、α鎖６１番目の
リジン残基のアミノ基がＣＭ化されたペプチド（ＣＭ−
ペプチドα６１）と特異的に反応し（親和定数：２．５
６×１０⁷）、他のＣＭ−ペプチド（ＣＭ−ペプチドβ
Ｎ、ＣＭ−ペプチドβ６６）及びＣＭ化していないペプ
チド（ペプチドβＮ、ペプチドβ６６、ペプチドα６
１）とは反応しなかった（親和定数：何れも１×１０³
未満）。

【００８８】実施例１（１０）と同様の方法で、化学的
に合成したＣＭ−Ｈｂ、Ｈｂ（SIGMA社）、ＣＭ−ＨＳ
Ａ等とハイブリドーマ７Ｆ９が産生するモノクローナル
抗体との相互作用をＢＩＡ−ｃｏｒｅを用いて調べ親和
定数を計算した。結果を表６に示す。

【００８９】

【表６】

【００９０】表６に示されるようにハイブリドーマ７Ｆ
９が産生するモノクローナル抗体はＣＭ−Ｈｂと特異的
に結合した（親和定数：８．７５×１０⁸）。Ｈｂ（SIG
MA社）やＣＭ−ＨＳＡ等とは結合せず、該抗体はＣＭ化
されていないＨｂやＨｂ以外のＣＭ−タンパクとは反応
しない（親和定数：何れも１×１０³未満）ことが分か
った。

【００９１】実施例１（１６）と同様の方法で、実施例
１（１４）で作製した非ＣＭ−Ｈｂ及び人全血検体Ｈｂ
と、ハイブリドーマ７Ｆ９が産生するモノクローナル抗
体との相互作用をサンドイッチＥＬＩＳＡ法により調べ
た。測定結果を図６に示す。ヒト全血検体では濃度依存
的に増加する反応が確認されたが、非ＣＭ−Ｈｂとは反
応が確認されず、該抗体はＣＭ化されていないＨｂとは
反応しないことが分かった。

【００９２】以上の知見より、ハイブリドーマ７Ｆ９が
産生するモノクローナル抗体は、α鎖６１番目のリジン
残基のアミノ基の水素がＣＭ化されたＨｂと特異的に反
応することが判った。

【００９３】実施例６ 〔ハイブリドーマ７Ｆ９の産生
するモノクローナル抗体を用いたサンドイッチＥＬＩＳ
Ａ法によるヒト全血中のＣＭ−Ｈｂの定量〕 実施例１（１６）と同様の方法で、ハイブリドーマ７Ｆ
９の産生するモノクローナル抗体を用いたサンドイッチ
ＥＬＩＳＡ法により、透析患者の内、透析アミロイドー
シスを発症している患者及び発症していない患者検体中
のＣＭ−Ｈｂの定量を行った。検体中のＣＭ−Ｈｂに由
来する発色強度の測定結果を図７に示す。透析アミロイ
ドーシスを発症した患者検体中のＣＭ−Ｈｂ由来の発色
強度は、透析アミロイドーシスを発症していない患者検
体と比較して有意に高い値を示した。

【００９４】以上のことは、本発明で得られたハイブリ
ドーマ７Ｆ９の産生するモノクローナル抗体を用いた免
疫学的測定方法が、透析アミロイドーシスの新規マーカ
ーであるＣＭ−Ｈｂの測定に有用であることを意味す
る。

【００９５】比較例１ 〔抗ＣＭ−ＨＳＡウサギポリク
ローナル抗体の抗原特異性と該抗体を用いたサンドイッ
チＥＬＩＳＡ法によるヒト全血中のＣＭ−Ｈｂの定量〕 以下の方法で作成した抗ＣＭ−ＨＳＡウサギポリクロー
ナル抗体を用いて、該抗体の抗原特異性を調べるととも
に、該抗体を用いてサンドイッチＥＬＩＳＡ法によるヒ
ト全血中のＣＭ−Ｈｂの測定系の構築を試みた。

【００９６】（１）〔抗ＣＭ−ＨＳＡウサギポリクロー
ナル抗体の作製〕 体重が２ｋｇ以上のウサギに、実施例１（９）作成した
ＣＭ−ＨＳＡを抗原として以下の要領で免疫した。

【００９７】２ｍｇ／ｍｌになるように調製した該抗原
溶液０．５ｍｌにフロイントの完全アジュバント０．５
ｍｌを加えたものをウサギの耳静脈に注射した。その
後、２週間おきに２ｍｇ／ｍｌの該抗原０．２５ｍｌ
に、フロイントの完全アジュバント０．２５ｍｌを加え
たものを追加免疫した。この間、ＣＭ−ＨＳＡに対する
ポリクローナル抗体が産生されたか否かを確認するため
に、２週間に１回ウサギの外縁耳静脈から部分採血し
た。６週間後、抗ＣＭ−ＨＳＡポリクローナル抗体が産
生されたことをＥＬＩＳＡ法で確認し、全採血した。

【００９８】（２）〔抗ＣＭ−ＨＳＡウサギポリクロー
ナル抗体の精製〕 実施例１（１２）と同様の方法で、ＨＳＡをカラムに固
定化した抗ＣＭ−ＨＳＡウサギポリクローナル抗体用の
アフィニティー精製用カラムを作製した。該カラムを用
いて実施例１（１３）と同様にして、上記の方法で作成
した抗ＣＭ−ＨＳＡウサギポリクローナル抗体をアフィ
ニティー精製した。

【００９９】（３）〔抗ＣＭ−ＨＳＡウサギポリクロー
ナル抗体のビオチン標識〕 該抗体のビオチン標識は、実施例１（１５）と同様の方
法でプロテインビオチニレーションシステム（GIBCO社
製）を用いて行った。抗ＣＭ−ＨＳＡウサギポリクロー
ナル抗体１モルに対してビオチンは１４モル結合してい
た。

【０１００】（４）〔抗ＣＭ−ＨＳＡウサギポリクロー
ナル抗体の抗原特異性〕 抗ＣＭ−ＨＳＡウサギポリクローナル抗体の抗原特異性
を以下に示すような競合ＥＬＩＳＡ法で調べた。

【０１０１】抗体濃度が１μｇ／ｍｌとなるように２０
ｍＭのＰＢＳで希釈した抗ＣＭ−ＨＳＡウサギポリクロ
ーナル抗体に、実施例１（９）の方法で作成したＣＭ−
ＨＳＡをそれぞれ０．１、１、１０、１００μｇ／ｍｌ
となるように添加した。この溶液を３７℃で１時間放置
し、ＣＭ−ＨＳＡで阻害された抗体溶液として使用し
た。

【０１０２】また、実施例１（１）の方法で調製したＣ
Ｍ−Ｈｂを１μｇ／ｍｌの抗ＣＭ−ＨＳＡウサギポリク
ローナル抗体溶液に、それぞれ０．１、１、１０、１０
０μｇ／ｍｌとなるように添加した。この溶液を３７℃
で１時間放置し、ＣＭ−Ｈｂで阻害された抗体溶液とし
て使用した。

【０１０３】同様に、Ｈｂ及びＨＳＡを１μｇ／ｍｌの
抗ＣＭ−ＨＳＡウサギポリクローナル抗体溶液に、それ
ぞれ０．１、１、１０、１００μｇ／ｍｌとなるように
添加した。この溶液を３７℃で１時間放置し、Ｈｂ及び
ＨＳＡで阻害された抗体溶液として使用した。

【０１０４】競合法ＥＬＩＳＡを行うにあたり、作成し
たＣＭ−ＨＳＡを１μｇ／ｍｌとなるように２０ｍＭの
ＰＢＳで希釈した。次いで、上記希釈したＣＭ−ＨＳＡ
溶液を９６穴イムノプレート（ＮＵＮＣ社製）に１ウェ
ル当たり１００μｌアプライし、３７℃で１時間放置
し、該ＣＭ−ＨＳＡをイムノプレートに固定した。１時
間後、イムノプレートに結合していないＣＭ−ＨＳＡを
除去し、０．５ｗｔ％のゼラチンを含む２０ｍＭのＰＢ
Ｓを１ウェル当たり１００μｌアプライし、３７℃で１
時間放置し、ＣＭ−ＨＳＡが結合していない部分をブロ
ッキングした。１時間後、該ゼラチン溶液を除去し、２
０ｍＭのＰＢＳで３回洗浄した後、上記濃度のＣＭ−Ｈ
ｂで阻害された抗体溶液を１ウェル当たり１００μｌア
プライし、３７℃で１時間放置した。その後、２０ｍＭ
のＰＢＳで３回洗浄し、上記作成したビオチン標識抗Ｃ
Ｍ−ＨＳＡウサギポリクローナル抗体を１ウェル当たり
０．１μｇアプライし、３７℃で１時間放置した。更
に、２０ｍＭのＰＢＳで３回洗浄し、取扱説明書に従い
調製したアルカリホスファターゼで標識されたビオチン
とアビジンの混合溶液（フナコシ社製：vectastain AB
Cキット）を１ウェル当たり１００μｌアプライし、３
７℃で１時間放置した。更に、０．０５ｗｔ％のＴｗｅ
ｅｎ２０を含む２０ｍＭのＰＢＳで３回洗浄し、アルカ
リホスファターゼ基質キット（BIO‐RAD社製）を用い
て、能書に従い調製した基質溶液を１ウェル当たり１０
０μｌアプライした。室温で５分間放置した後、０．４
Mの水酸化ナトリウム溶液を１ウェル当たり１００μｌ
加え、アルカリホスファターゼの反応を停止させ、４０
５ｎｍの吸光度を測定した。結果を図８に示す。この結
果より、ＣＭ−ＨＳＡのみならずＣＭ−Ｈｂを阻害剤と
して用いた場合でも、抗ＣＭ−ＨＳＡウサギポリクロー
ナル抗体とＣＭ−ＨＳＡとの反応が阻害されたことか
ら、作成した抗ＣＭ−ＨＳＡウサギポリクローナル抗体
はＣＭ−Ｈｂとも反応性を示すことが判った。

【０１０５】上記と同様の方法で、抗ＣＭ−ＨＳＡウサ
ギポリクローナル抗体と種々のタンパク質及びＣＭ化タ
ンパク質との反応特異性を調べた。抗ＣＭ−ＨＳＡウサ
ギポリクローナル抗体が特異的に反応する化合物及び反
応しない化合物を表７に示す。

【０１０６】

【表７】

【０１０７】この結果から、抗ＣＭ−ＨＳＡウサギポリ
クローナル抗体がＣＭ化されたタンパク質及びＣＭ化物
と結合することが示唆された。

【０１０８】（５）〔抗ＣＭ−ＨＳＡウサギポリクロー
ナル抗体を用いたサンドイッチ法によるヒト全血中のＣ
Ｍ−Ｈｂの定量〕 抗ＣＭ−ＨＳＡウサギポリクローナル抗体を用いて、実
施例１（１６）と同様の方法でサンドイッチＥＬＩＳＡ
法によりヒト全血中のＣＭ−Ｈｂの定量を行った。しか
しながら、該方法によりヒト全血中のＣＭ−Ｈｂの定量
を行うことはできなかった。

【０１０９】以上の結果から、ハイブリドーマ２Ｂ３が
産生するモノクローナル抗体を用いたＥＬＩＳＡ系では
検体中のＣＭ−Ｈｂを測定できたが（実施例１）、抗Ｃ
Ｍ−ＨＳＡウサギポリクローナル抗体を用いたＥＬＩＳ
Ａ系では、検体中のＣＭ−Ｈｂを測定することはできな
かった（比較例１）。このことより、種々のＣＭ−タン
パクを認識する抗体では、血中のＣＭ−ＨｂをＥＬＩＳ
Ａ法で検体の前処理を行うことなく検出することはでき
なかった。

【０１１０】

【発明の効果】本発明のモノクローナル抗体を使用すれ
ば、体液中のＣＭ−Ｈｂを煩雑な前処理を必要とするこ
となく、特異的にかつ簡便に測定することが可能となっ
た。このことは糖尿病、糖尿病合併症、透析アミロイド
ーシス等の新規マーカーであるＣＭ−Ｈｂを容易に直接
測定できることを意味するものであり、その工業的意義
は大きい。

【図面の簡単な説明】

【図１】 本図は、本発明のハイブリドーマ２Ｂ３が産
生するモノクローナル抗体と検体及び非ＣＭ−Ｈｂとの
反応性をサンドイッチＥＬＩＳＡ法にて調べた結果を示
す図である。

【図２】 本図は、糖尿病患者及び健常者それぞれ１０
検体中のＣＭ−Ｈｂ量を、ハイブリドーマ２Ｂ３が産生
するモノクローナル抗体を用いたサンドイッチＥＬＩＳ
Ａ法で測定した結果を示す図である。該図において、縦
軸は検体中のＨｂ１ｍｇ当たりに含まれるＣＭ−Ｈｂの
ユニット量（Ｕ）を表し、、横軸は糖尿病患者及び健常
者の区別を表す。

【図３】 本図は、糖尿病患者の単位検体Ｈｂに含まれ
るＣＭ−Ｈｂ量と各検体の糖尿病合併症重篤度との相関
関係を調べた結果を示す図である。該図において縦軸は
検体中のＨｂ１ｍｇ当たりに含まれるＣＭ−Ｈｂのユニ
ット量（Ｕ）を表し、横軸は糖尿病合併症の重篤度を表
す。

【図４】 本図は、本発明のハイブリドーマ１１Ｂ９が
産生するモノクローナル抗体と検体及び非ＣＭ−Ｈｂと
の反応性をサンドイッチＥＬＩＳＡ法にて調べた結果を
示す図である。

【図５】 本図は、透析患者の内、透析アミロイドーシ
スを発症した患者及び発症していない患者それぞれ１０
検体中のＣＭ−Ｈｂ量を、ハイブリドーマ１１Ｂ９が産
生するモノクローナル抗体を用いたサンドイッチＥＬＩ
ＳＡ法で測定した結果を示す図である。なお、該図にお
いて縦軸は検体中のＨｂ１ｍｇ当たりに含まれるＣＭ−
Ｈｂのユニット量（Ｕ）を表し、横軸は透析アミロイド
ーシスを発症した患者及び発症していない患者の区別を
表す。

【図６】 本図は、本発明のハイブリドーマ７Ｆ９が産
生するモノクローナル抗体と検体及び非ＣＭ−Ｈｂとの
反応性をサンドイッチＥＬＩＳＡ法にて調べた結果を示
す図である。

【図７】 本図は、透析患者の内、透析アミロイドーシ
スを発症した患者及び発症していない患者それぞれ１０
検体中のＣＭ−Ｈｂ量を、ハイブリドーマ７Ｆ９が産生
するモノクローナル抗体を用いたサンドイッチＥＬＩＳ
Ａ法で測定した結果を示す図である。なお、該図におい
て、縦軸は検体中のＨｂ１ｍｇ当たりに含まれるＣＭ−
Ｈｂのユニット量（Ｕ）を表し、横軸は透析アミロイド
ーシスを発症した患者及び発症していない患者の区別を
表す。

【図８】 本図は、作成した抗ＣＭ−ＨＳＡ抗体の抗原
特異性を競合ＥＬＩＳＡ法にて調べた結果を示す図であ
る。なお、該図において、縦軸は４０５ｎｍの吸光度を
表し、横軸は各阻害剤の添加量｛各ｗｅｌｌ当たりの添
加されたタンパク質（阻害剤）の量｝を表す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ // Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ｃ (72)発明者 三浦 圭介 山口県徳山市御影町１番１号 株式会社ト クヤマ内

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 カルボキシメチル化ヘモグロビンに特異
   的に反応するモノクローナル抗体。
2. 【請求項２】 請求項１記載のモノクローナル抗体を産
   生するハイブリドーマ。
3. 【請求項３】 請求項１記載のモノクローナル抗体を用
   いることを特徴とするカルボキシメチル化ヘモグロビン
   の免疫学的測定方法。
4. 【請求項４】 請求項１記載のモノクローナル抗体を含
   んでなるカルボキシメチル化ヘモグロビン測定用免疫学
   的測定試薬。