PT90369B

PT90369B - Processo para a preparacao de anticorpos monoclonais para a determinacao imunologica selectiva de peptido do procolagenio intacto (tipo iii) e de procolagenio (tipo iii) em fluidos corporais e processo de determinacao usando esses anticorpos

Info

Publication number: PT90369B
Application number: PT90369A
Authority: PT
Inventors: Volkmar Gunzler-Pukall; Dietrich Brocks; Henning Hachmann; Jurgen Punter; Rupert Timpl
Original assignee: Hoechst Ag
Priority date: 1988-04-27
Filing date: 1989-04-26
Publication date: 1994-08-31
Also published as: FI891953A; DK202189A; JPH0213396A; DK202189D0; FI98705B; DK169571B1; IE891372L; FI891953A0; NO891732L; PT90369A; ATE115963T1; GR3014957T3; EP0339443B1; NO179107B; DE58908787D1; FI98705C; IE66320B1; EP0339443A3; EP0339443A2; NO179107C

Description

Descrição referente à patente de invenção de HOECHST AKTIENGESELLSCHAFT, alemã, industrial e comercial, com sede em D-6230 Frankfurt/ /Elain 80, República Federal Alemã, (inventores: Dr. Dietrich Brocks, Dr. Volkmar Gunzler-Pukall, Dr. Henning Hachmann, Dr. Jíirgen Punter e Dr. Rupert Timpl, residentes na Alemanha Ocidental), para PROCESSO RARA A PREPARAÇÃO DE ANTICORPOS MONOCDONAIS RARA A DETERMINAgÃO IMUNOLOGICA SELECTIVA DO PEPTIDEO DO PROCQLAGENIO INTACTO (TIPO III ) E DE PROCOLAGENIO (TIPO III) EM FLUIDOS CORPORAIS E PROCESSO DE DETERMINAÇÃO USANDO ESSES ANTICORPOS»

Descrição peptideo de procolagénio (tipo III) (Ρ III P) é o propeptídeo aminoterminal do colagénio (tipo III), o qual é cindido extracelularmente após a secreção da molécula do procolagénio (tipo III) pode ser ainda cindido por sua vez com colagenase nos fragmentos Col. 1,

Col 2 e Col 3, os quais podem ser isolados por meio de métodos conhecidos em si da química das proteínas (Nowack,

H et al., Eur. J. Biochem. 70, 205 - 216 (1976), Bruckner

P. et al., Eur. J. Biochem 90, 595 - 603 (1978).

IM *

- 1 A concentração deste peptideo de procolagénio em fluidos corporais pode ser deteiminada com

Λ um método de determinação radioimunológica descrito na publicação de Patente Europeia N. 4940. 0 conhecimento da concentração do peptideo no soro pennite a previsão sobre a actividade das doenças fibróticas, como por exemplo do fígado /~Eohde, H et al. Eur. J. Clin. Invest. j), 451 - 459 (1979)_7·

No pedido de Patente Europeia 289 930 descreveu-se uma determinação exacta e selectiva do peptideo de procolagénio (tipo III) e do procolagénio (tipo III) no soro e em outros fluidos corporais. Neste método é no entanto necessário proceder a uma série de fases de centrifugação que dificulta a utilização deste ensaio em rotina de laboratório. Una manipulação mais simples possibilita um processo de ensaio da análise imunorradiométrica (I5MA). Neste processo utilizam-se dois anticorpos, um dos quais se encontra acoplado a um suporte sólido, evitando-se deste modo uma fase de precipitação e por consequência uma fase de centrifugação e algumas pipetagens.

Surpreendentemente verificou-se que um anticorpo monoclonal que até agora não tinha sido recinhecido como um pico isolado em cromatografia de filtração em gel reagia com um fragmento do procolagénio (tipo III).

En combinação com outros anticorpos monoclonais ou policlonais com especificidade para o peptideo de procolagénio (tipo III) e/ou para o procolagénio (tipo III) este anticorpo peimite a determinação deste antigene por meio da téc. nica de IHffA.

A presente invenção refere-se por conseguinte a:

1. Um anticorpo monoclonal com o modelo de reacção apresentado na Figura 2 contra o procolagénio (tipo III) intacto e o colagénio pN (procolagénio, a que falta o proptideo C-teminal) (pico la), peptideo de procolagénio aminoterninal intacto (tipo III) (pico 2a), produtos de decomposição do peptideo de procolagénio aminoterminal (tipo III), cujo peso molecular se situa entre o do peptideo de procolagénio (tipo III) aminoterminal e o do Col 1 (pico 3a), bem como Col 1 e os produtos de decomposição do peptideo de procolagénio (tipo III) aminoterminal com um peso molecular igual ao do Col 1 (pico 4a).

2. Uma linha de células de hibridoma que é produzida por meio de fusão de uma linha de células de mieloma e de linfócitos de um animal previamente imunizado com peptídeo de procolagénio (tipo III) e que produz o anticorpo caracterizado em 1.

3. Un processo para a preparação do anticorpo caracterizado em 1.

4. Un processo para a determinação quantitativa imunológica do peptideo de procolagénio (tipo III) com o anticorpo caracterizado em 1.

5. Un conjunto de diagnóstico para a deterninaçâo da quantidade de peptideo de procolagénio (tipo III) em fluidos corporais, constituído por uma quantidade eficaz do anticorpo monoclonal caracterizado em 1 isoladamente ou em combinação com outros anticorpos, especialmente com uma quantidade eficaz do anticorpo monoclonal descrito no pedido de Patente Europeia 289 930, em mistura com uma substância veicular apropriada para diagnóstico.

Em seguida elucida-se a presente invenção em pormenor, especialmente nas suas fornas de concretização preferidas. Para além disso a invenção é definida nas reivindicações.

- 3 Para a preparaçao do anticorpo monoclonal podem imunizar-se animais, especialmente roedores, como por exemplo ratos, ratazanas, coelhos ou cobaias, com o peptideo de procolagénio (tipo III) o qual foi isolado de acordo com o processo da Patente Europeia 4940, na presença de adjuvante. De modo especialmente preferido utilizam-se ratos, especialmente da estirpe SJD. Reforça-se a resposta imune com injecçSes secundárias repetidas a intervalos de 4 a 8 semanas. Controla-se o decurso da imunização por determinação da concentração de anticorpos em ensaios radiológicos de ligação /~R. Timpl e 1. Risteli, Immunochemistry of the extracellular matrix, H. Purtmayr Ed. Vol. 1 199 (1982)_7· Alguns dias antes da fusão dos linfócitos com uma linha de células de mieloma, tratam-se os animais com peptideo de procolagénio (tipo III) sem adjuvante. Colhem-se linfócitos dos animais e fundem-se com uma linha de células de mieloma que pode ser originária igualmente de uma das espécies animais referidas, de preferência de ratos, especialmente com a linha de células P3X63AG8.653.

De modo vantajoso fundem-se linfócitos com uma linha de células de mieloma da mesma espécie. A fusão e a cultura que se segue dos clones celulares sao levadas a efeito de modo conhecido pelos especialistas na matéria, sendo a concentra çao dos anticorpos específicos no sobrenadante da cultura celular determinada por meio de um ensaio imunológico de ligação. De entre os clones celulares obtidos por meio deste processo selecciona-se um clone para utilização em IRMA. De modo especialmente preferido trabalha-se com uma linha de células preparadas por fusão de linfócitos de ratos da estirpe SJL imunizados com peptideo de procolagénio (tipo III) com a linha de células de mieloma de rato P3X63AG8.653 e com um anticorpo monoclonal com o modelo de reacção apresentado na Figura 2. Esta linha de células foi depositada em 2.3.1988 sob as condiçSes do Tratado de Budapeste na European Collection of Animal Cell Culturs (ECACC), PHLS Centre for Applied Microbiology and Research, Porton Down, Salisbury, SP40JG, Reino Unido com o número 88030202.

Os anticorpos monoclonais da presen te invenção pertencem às classes das proteínas IgG, IgM e IgA. Os anticorpos da classe IgG, especiaimente da subclasse IgG2b, são utilizáveis de modo especiaimente vantajoso. Evidenciam-se as propriedades dos anticorpos monoclonais em relação do anticorpo monoclonal PIIIP obtido a partir da linha de células ECACC 88030202 quando os antigenes presentes no soro são separados por cromatografia de filtração em gel de acordo com os pesos moleculares e as fracçSes da cromatografia são utilizadas numa análise radioimunológica. Na Figura 2 mostra-se o perfil de eluição da cromatografia de filtração em gel apresentado pelo anticorpo monoclonal PIIIP em comparação com o perfil de eluição apresentado pelos anticorpos policlonais. 0 pico l/la corresponde ao procolagénio (tipo III) intacto ou ao colagénio pN (tipo III). 0 pico 2/2a corresponde ao peptideo de procolagénio (tipo III) aminoterminal e aos produtos de decomposição deste de dimensão semelhante. No pico 3a estão abrangidos os produtos da decomposição do peptideo de procolagénio (tipo III), os quais no cromatograma dão um pico menor do que o do peptideo de procolagénio (tipo III) mas nitidamente maior do que o de Col 1. 0 pesos moleculares dos produtos de decomposição situam-se entre cerca de 45 000 (peptideo de procolagénio) e cerca de 10 000 (Col l). 0 pico 4/4a corresponde a Col 1 bem como a produtos de decomposição do peptideo de procolagénio (tipo III) aminoterminal com um peso molecular igual ao do Col. 1. Verifica-se que a fracção antigénica que é abrangida na análise com anticorpos policlonais e que tem o peso molecular do produto de decomposição de Col 1 ou que é Col 1 se apresenta nitidamente mais fraca que os anticorpos monoclonais da presente invenção. Os anticorpos monoclonais da presente invenção apresentam também uma actividade especifica contra um epítopo do peptideo de procolagénio (tipo III) aminoteminal que não existe no Col. 1. Para além disso, uma fracção do antigene que é abrangida pelo anticorpo policlonal no pico 2 não é reconhecida pelo anticorpo PIIIP 226 de tal

modo que na posição do pico 2 com o anticorpo PIIIP 226 é possível reconhecer dois picos (2a e 3a). 0 pico 3a não se confunde com o anticorpo PIIIP 296 descrito no pedido de Patente Alemã.

Para a preparação dos anticorpos da presente invenção é importante dispor de uma fonte para a obtenção do antigene. Como já referido, isola-se peptídeo de procolagénio (tipo III) de origem humana com alto grau de pureza de modo vantajoso de acordo com o processo da Patente Europeia 4940, segundo o qual ee decompõe um tecido ou um fluido corporal patológico com colagenase, se separa o peptídeo de procolagénio a partir da solução nacional e se purifica por uma combinação de métodos cromatográficos e/ou de imunoadsorção.

anticorpo monoclonal da presente invenção pode ser usado em diferentes processos imunológicos, incluindo todas as formas de análise radioimunológicas por exemplo análise da saturação sequencial ou análise de equilíbrio, bem como outras análises de ligação competitiva e não competitiva, como análise de fluorescência, enzimática, de quimioluminescência e outras análises imunológicas.

E principalmente apropriado para utilização em processos de análise imunológica do tipo sanduíche. 0 anticorpo monoclonal pode por conseguinte ser usado em processos imunológicos para o isolamento e para a caracterização bem como para a deteiminaçâo quantitativa de peptídeo de procolagénio (tipo III) em tecidos e em fluidos corporais. Procede-se de acordo com a técnica da especialidade segundo métodos conhecidos em si, de modo vantajoso fazendo-se reagir uma amostra líquida que contém o peptídeo de procolagénio (tipo III) com o anticorpo monoclonal da presente invenção que se encontra acoplado a uma matriz sólida que de preferência é constituída por material plástico, especialmente tubos de plástico e deteiminando-se a quantidade do peptideo de procolagénio (tipo III) por ligação de anticorpos

- 6 policlonais ou de um segundo anticorpo monoclonal, de preferência o anticorpo monoclonal descrito no pedido de Patente Europeia 289 930, o qual dispõe de uma marcação radioacti va ou outra. Este processo também pode ser levado a efeito fazendo-se reagir um anticorpo policlonal ou monoclonal, especialmente o anticorpo monoclonal descrito no pedido de Patente Europeia 289 93O> ligado a uma matriz sólida com um antigene, deteiminando-se quantitativamente em seguida esse antigene por ligação do anticorpo da presente invenção marcado. Nestes métodos nâo tem qualquer influência o facto de o peptideo ou procolagénio (tipo III) se encontrar ainda acoplado com a extremidade aminoteiminal do procolagénio (tipo III) ou nâo. Os produtos de degradação do peptideo de procolagénio (tipo III), este agora inconvenientes na deteiminaçâo imunológica por meio de anticorpos policlonais especialmente o Col 1, nâo influenciam o sistema de ensaio descrito.

anticorpo monoclonal descrito no pedido de Patente Europeia 289 930 apresenta o modelo de reacção que se mostra na Figura 3 em relação ao procolagénio (tipo III) intacto e ao colagénio pN (procolagénio a que falta o propetídeo C-teiminal, pico 4a), ao peptideo de procolagénio (tipo III) aminoteiminal (pico 5a) bem como ao Col 1 e aos produtos de decomposição do peptideo de procolagénio (tipo III) com um peso molecular igual ao do Col 1 (pico 6a).

Para a preparação deste anticorpo monoclonal procede-se no essencial como descrito acima. De preferência trabalha—se com uma linha de células preparada por fusão de linfócitos de ratos da estirpe SJL imunizados com peptideo de procolagénio (tipo III) com a linha de células de mieloma P3X63A&8.653. Esta linha de células encontra-se depositada na European Collection of Animal Cell Cultures (ECACC), PKLS Centre for Applied Microbiology and

- 7 Research, Porton Down, Salisbury, SP4OJG, Reino Unido, sob o número 87O423O8.

Nos exemplos que se seguem a presente invenção é elucidada mais em pormenor. Os dados em percentagem referem-se a peso sempre que nada em contrário seja indicado.

soauPLO ι

Preparação de peptldeo de Procolagénio (tipo III)

Preparau-se o peptldeo de procolagénio (tipo III) por acção de colagenase sobre procolagénio (tipo III) a 37°C. Nesta operação o peptldeo não sofre qualquer desnaturação. Para a preparação de quantidades maiores do peptldeo utilizou-se um processo modificado. Todas as fases do processo até à acção da colagenase foram realizadas na câmara fria. As diferentes soluçSes de NaCl foram realizadas, utilizadas para a preparação das soluções contêm Tris-HCl 0,05 M a pH 7,4, EDTA 0,01 M, azida de sódio (200 mg/ml) e os inibidores de protease fluoreto de fenilmetilsulfonilo (3 pg/ml) e p-cloromercuribenzoato (e pg/ /ml.)

Homogeneizou-se pele fetal de vitela (3 Kg) em 10 1 de NaCl 1 M e extraiu-se durante dois dias. 0 colagénio dissolvido precipitou a partir da solução de extracção por adiçao de NaCl sólido até uma concentração final de 2,5 M. Depois de agitar de um dia para o outro separou-se o precipitado por centrifugação (1800 x g, 20 minutos), lavou-se duas vezes com NaCl 2,5M e dissolveu-se novamente. Separaram-se pequenas quantidades de materiais insolúveis por centrifugação. A mistura de colagénio (tipo III) e de procolagénio (tipo III) obtida deste modo foi

- 8 precipitada com NaCl 1,6 M. 0 precipitado foi em seguida suspenso em 2 1 de Tris-HCl 0,05 M (pH 8,0) e após adição de GaClg 0,02 11 aqueceu-se durante 20 minutos a 50°C e em seguida incubou-se durante 3 horas a 37°C juntamente com 1500 U de colagenase bacteriana (C1SPA, Worthington, USA) por grama de precipitado húmido. Após deixar actuar a colagenase, separou-se o precipitado formado por centrifugação, dialisou-se contra Tris-HCl 0,005 M a pH 8,0 e ureia 6,8 M e fez-se passar através de uma coluna de DEAE-celulose (5,0 x 30 cm) que tinha sido equilibrada com o mesmo tampão.

As proteínas ligadas na coluna foram eluídas com uma solução de NaCl cuja concentração foi feita aumentar de 0 até 0,3M. 0 volume total de eluído foi de 2 1. A solução emergente da coluna foi observada no que se refere à sua absorção a 236 nm e à sua actividade antigénica por utilização de anticorpos que sâo específicos para o segmento aminoterminal do procolagénio (tipo III). Normalmente o último pico eluído da coluna contem o peptídeo de procolagénio (tipo III). 0 peptídeo foi purificado por diálise contra água destilada para eliminação de sais e foi liofilizado. Procedeu-se a uma purificação adicional numa coluna com agarose A 1,5 lí (2 x 120 cm) (Companhia Biorad) que foi equilibrada com CaClg 1 lí e Tris-HCl 0,05 lí a pH 7,5.

EWIPLO 2

Preparação de hibridomas

Imunizaram-se por via intramuscular ratos da estirpe SJ1 com 5 Jig de peptídeo de procolagénio (tipo III), que foi obtido de acordo com o Exemplo 1, na presença de adjuvante de Preund completo. Após quatro se- 9 -

manas e após três meses reforçou.-se a reacção imune por uma nova injecção intramuscular de 5 fig de peptideo de procolagénio (tipo III) na presença de adjuvante de Preund incompleto. Três dias antes da fusão reforçou-se a resposta imune por injecção de mais 50 pg de peptideo de procolagénio (tipo III).

Para a fusão mataram-se os animais e isolaram-se as células de baço. Na presença de polietileno glicol fundiram-se as células de baço com a linha de células de mieloma P3X63AG8.653· (A linha de células resultante foi depositada na ECACC sob o número 88030202). Por cultura da mistura de fusão em meio de hipoxantina-aminopterina-timidina durante um período de duas semanas seleecionaram-se os híbridos células de baçp x p3X63AG8.653· A fim de se obter uma linha de células monoclonal subclonaram-se várias vezes os clones celulares obtidos. Os sobrenadantes das colónias das células obtidas foram experimentados pelo ensaio de ligação radioimunológica no que se refere à produção de anticorpos. Deste modo obtem-se o anticorpo bimonoclonal PIIIP 226.

MM 3

Ensaio de ligação radioimune

Incubaram-se de um dia para o outro 300 ul de sobrenadante de cultura ou de uma outra amostra, como por exemplo ascites, após crescimento de células de hibridomas na cavidade abdominal de ratos, com 100 ul de uma solução de I-peptídeo de procolagénio (tipo III) (1 ng de proteína/lOO pl, preparado de acordo com o Exemplo 1 de EP 4940). Os complexos fornados antigene-anticorpo foram precipitados por adição de soro de IgG de vitela anti-rato ou de outra espécie. Após centrifugação e decantação do sobrenadante determinou-se a quantidade de radioactivida- 10 de precipitada num espectrómetro de cintilação gama.

ΣΧΣΜΡΙΟ 4

Marcação radioactiva dos anticorpos

Depositaram-se em tubos de ensaio de poliestireno (12 x 55 mm) 0,2 ml de uma solução com 0,2mg do anticorpo monoclonal PIIIP 296 obtido de acordo com o pedido de Patente Alemã P 37 14 633.5, Exemplo 2, ou de outro anticorpo em tampão de fosfato 0,05 M a pH 7,4 e tra125 taram-se com 100 MBq de solução de Na I tamponizada com 10 fil de tampão de fosfato 0, 5 M a pH 7,4. Após adição de 50 pl de uma solução aquosa de 20 ug de cloramina T, agitiu-se durante 1 minuto. Bn seguida faz-se terminar a reacção de iodação por adição de 50 ul de uma solução aquosa de 20 pg de dissulfito de sódio. 0 Na I que não reagiu foi em seguida separado do anticorpo marcado por cromatografia num peimutador de iões. As fracções cromatográficas que contêm o anticorpo marcado com I foram diluídas com uma solução de 20g de Tween 20 e 14,6 g de Na2EDTA em um litro de Tris.HCl 0,05 M a pH 8,0 de modo a obter-se uma concentração do anticorpo de 200 pg/l.

gOMELO 5

Revestimento dos tubos de ensaio com os anticorpos

Para a fixação dos anticorpos sobre os tubos de ensaio de poliestireno (12 x 75 mm) adicionaram-se a cada tubo 300 pl de uma solução de 4 mg/l de um anticorpo, por exemplo PIIIP 226, em tampão de fosfato de sódio 0,01 M a pH 6,4 e incubou-se de um dia para o outro à temperatura ambiente. Bn seguida aspirou-se & solução de anticorpo e adicionaram—se a cada tubo 500 μΐ de uma solução a 1% de albumina de soro de bovino em Tris-citrato a pH 7.5.

Após incubação de um dia para o outro à temperatura ambiente aspirou-se a solução. Os tubos revestidos de anticorpos foram secos sobre gel de sílica.

EXBEPLO 6

Análise imunorradiométrica (Radioimunnumetric Assay, IBMA)

Incubaram-se à temperatura ambiente durante 2 horas 0,1 ml da amostra a analisar ou do padrão de peptideo de procolagénio (tipo III) em tubos de ensaio de poliestireno, que tinham sido revestidos com o anticorpo monoclonal PIIIP 226 de acordo com o Exemplo 5, com adição de 0,1 ml de solução salina tamponizada com fosfato (PBS). Bn seguida lavaram-se os tubos de ensaio duas vezes com 1 ml de PBS em cada lavagem. Depois, adicionaram-se nos tubos 200 μΐ de anticorpo PIIIP 296 marcado com ^^i (=40 ng de anticorpo) ou de outro anticorpo e incubou-se durante 2 horas à temperatura ambiente. Determinou -se num espectrómetro de cintilação gama a radioactividade do cotplexo anticorpo-antigene- I-anticorpo ligado à parede dos tubos de ensaio após duas lavagens com 1 ml de PBS em cada lavagem seguidas de decantação.

Por comparação com uma curva padrão para cuja preparação se utilizaram padrões com diferentes quantidades de peptideo de procolagénio (tipo III), pode determinar-se a concentração de peptideo de procolagénio (tipo III) na amostra de solução desconhecida a analisar.

Na figura 1 apresenta-se a curva padrão da análise imunorradiométrica (B/ϊ significam proporçSes entre a radioactividade ligada e a actividade total).

- 12 axaMH.0 7

Letenninaçâo da distribuição de pesos moleculares do antigene que reage com PIIIP 226 em soro humano

Separou-se 1 ml de soro por cromatografia de filtração em gel através de alildextrano, reticulado com N,Ν’-metileno-bisacrilamida /coluna de ' 'Sephacryl S 300 (1,6 x 130 cm)_J7 equilibrada em PBS com 0,04$ de um detergente não iónico, por exemplo um monilaurato de sorbitano polietoxilado (Tween 20). Incubaram-se de um dia para o outro a 4°C 0,2 ml de cada fracção com uma quantidade limitante do anticorpo a investigar (0,1 ml de tampão) em relação com a quantidade do anticorpo marcado e 0,1 ml de peptideo de procolagénio (tipo III) marcado com ^1 (conteúdo 1 ng de proteina). Sn seguida incubou-se durante 1 hora com uma quantidade previamente analisada de soro de vitela de IgG anti-rato na presença de 10$ de polietilenglicol (PEG 6000). Separaram-se por filtração os complexos antigene-anticorpo precipitados (1500 x g) e após decantar-se deteiminou-se a radioactividade no espectrómetro de cil tilação gama. Por comparação com uma curva padrão, para cuja preparação se utilizaram padrões com quantidades diferen tes de peptideo de procolagénio (tipo III), detenninou-se então a concentração do antigene nas fracçSes cromatográficas que reagiram com o anticorpo utilizado. A figura 2 mostra o perfil de eluição do antigene determinado por meio de PIIIP em comparação com o perfil do antigene deteiminado por meio do anticorpo monoclonal.

Claims

Κ Ε I V INDICAÇÕES

- i3 Processo para a preparação do anticorpo monoclonal com o padrão de reacção apresentado no esquema a seguir em relação ao procolagénio intacto (tipo III) e a pN-colagénio (pico la), ao peptideo aminoterminal do procolagénio intacto (tipo III) (pico 2a), a produtos de degradação do peptideo amino terminal do procolagénio intacto (tipo III), cujo peso molecular se situa entre o do peptideo aminoterminal do procolagénio (tipo III) e o do Col 1 (pico 3a), bem como a col 1 a produtos de degradação do peptideo aminoterminal do procolagénio tipo III com peso molecular igual ao de Col 1 (pico 4a) caracterizado por

a) se imunizarem animais com peptideo aminoterminal do procolagénio (tipo III),

- 14 b) se recuperarem linfócitos e se fundirem com células de mieloma,

c) se seleccionarem os híbridos com referência à presença de um anticorpo com as propriedades referidas numa das reivindicações 1 a 3 e se clonarem e

d) se obter o anticorpo a partir dos referidos clones.

Processo de acordo com a reivindica çao 1, caracterizado por na fase d) ser obtido o anticorpo monoclonal com actividade especifica contra um epitopo do peptideo aminoterminal do procolagénio (tipo III) não exixtente em Col 1.

- 3- Processo de acordo com a reivindica ção 1, caracterizado por na fase d) ser obtido o anticorpo monoclonal que pertence à classe IgG.

Processo de acordo com a reivindica ção 1, caracterizado por se utilizar a linha de células de hibridoma ECACC 88030202 para a realização da fase d).

- 0 Processo para a determinação imunológica quantitativa de peptideo do procolagénio (tipo III) com um anticorpo caracterizado por

a) fazer reagir uma amostra líquida que contém peptideo amino-terminal do procolagénio (tipo III) em procolagénio (tipo III) com o anticorpo monoclonal obtenivel de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 3 e

- 15 b) deteiminar a quantidade do peptideo aminoteiminal do procolagénio (tipo III) ou do procolagénio (tipo III) por meio do complexo antigene-anticorpo formado.

- 6^ Processo para a determinação imunológica quantitativa de peptideo do procolagénio (tipo III) com um anticorpo caracterizado por

a) acoplar a uma matriz sólida o anticorpo monoclonal obte nível de acordo com qualquer das reivindicaçSes 1 a 3,

b) fazer reagir uma amostra liquida que contém peptideo aminoterminal do procolagénio (tipo III) ou procolagénio (tipo III) com o anticorpo referido e

c) determinar o antigene ligado através de um anticorpo monoclonal ou policlonal com especificidade para o peptídeo do procolagénio (tipo III) ou para o procolagénio (tipo III).

- 7- Processo de acordo com a reivindica ção 6, caracterizado por na fase a) se usar um anticorpo monoclonal ou policlonal com especificidade para o peptíde de procolagénio (tipo III) e/ou para o procolagénio (tipo III) e na fase c) se usar o anticorpo monoclonal marcado obtenível de acordo com qualquer das reivindicaçSes 1 a 3·

- 8- Processo de acordo com a reivindica ção 6, caracterizado por na fase b) o anticorpo monoclonal usado ser o anticorpo que apresenta o padrão de reacção apresentado no esquema a seguir em relação ao procolagénio intacto (tipo III) e a pN-colagénio (pico 4-a), ao peptideo aminoterminal do procolagénio intacto (tipo III) (pico 5a) beà como a Col 1 e a produtos de degradação do peptideo aminoterminal do procolagénio (tipo III) com peso molecular i£ual ao de Col 1 (pico 6a).

- 9^ Processo de acordo com a reivindicação 7, caracterizado por na fase a) o anticorpo monoclonal usado ser o anticorpo que apresenta o padrão de reacção apresentado no esquema mencionado na reivindicação 8 em relação ao procolagénio intacto (tipo III) e a pN-colagénio (pico 4a), ao peptideo aminoteiminal do procolagénio intacto (tipo III) pico 5a) bem como a Col 1 e a produtos de degradação do peptideo aminoterminal do procolagénio (tipo III)

- 17 com peso molecular igual ao de Col 1 (pico 6a).

- 10^ Processo de acordo com qualquer das reivindicações 8 ou 9 caracterizado por o anticorpo monoclo nal usado ser o anticorpo PIIIP 296 da linha de células de hibridoma ECACC 87O423O8.

A requerente reivindica a prioridade do pedido alemão apresentado em 27 de Abril de 1988, sob o n? 38 14 216.3·