JPH0698781A - Ｍｅｄｉｃａｇｏ Ｓａｔｉｖａの再生方法およびＭｅｄｉｃａｇｏ Ｓａｔｉｖａ中で外来ＤＮＡを発現させる方法 - Google Patents

Ｍｅｄｉｃａｇｏ Ｓａｔｉｖａの再生方法およびＭｅｄｉｃａｇｏ Ｓａｔｉｖａ中で外来ＤＮＡを発現させる方法

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JPH0698781A
JPH0698781A JP5000852A JP85293A JPH0698781A JP H0698781 A JPH0698781 A JP H0698781A JP 5000852 A JP5000852 A JP 5000852A JP 85293 A JP85293 A JP 85293A JP H0698781 A JPH0698781 A JP H0698781A
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マリー ビジング チャリッセ
Dwight Tomes
トメス ドワイト
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エフ． シュミット ジャニス
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    • C12N15/8207—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation by physical or chemical, i.e. non-biological, means, e.g. electroporation, PEG mediated by mechanical means, e.g. microinjection, particle bombardment, silicon whiskers

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Abstract

(57)【要約】 【目的】アルファルファである、Medicago sativaの形
質転換および再生を改良する。 【構成】本発明の方法は、粒子加速を用いることによっ
てアルファルファを形質転換させるために用いられる。
24から120時間水を吸収させた後にボンバードメントを
行うと、成熟子葉の最適結果が得られる。アルファルフ
ァの再生および形質転換は、未成熟子葉または未成熟子
葉の胚を用いることにより大幅に改良される。未成熟子
葉は受粉後25日目であり、好ましくは受粉後10から15日
目に摘出された子葉であり、最も好ましくは受粉後約10
日目に摘出された子葉である。これらの子葉は半透明か
ら薄緑色である。未成熟子葉の体細胞胚のボンバードメ
ントにより得られた植物は、再生能力を保持する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、アルファルファであ
る、Medicago sativaの形質転換および再生方法、並び
にMedicago sativa中で外来DNAを発現させる方法に関す
る。
【０００２】
【従来の技術】植物の遺伝的形質転換は生物工学の分野
において大きく進歩したものの１つであり、それにより
改良植物および改良穀物が生産され、その結果、世界的
に食物の入手がより容易になったことが広く認識されて
いる。しかしある植物では形質転換はとりわけ困難であ
り、貴重な飼草穀物であるアルファルファ、Medicago s
ativaの形質転換はこの植物特有の特性によって阻害さ
れてきた。
【０００３】アルファルファの形質転換は主に２つの大
きな制限により妨げられてきた。すなわち、形質転換の
方法によって引き起こされる拘束、および多くのアルフ
ァルファの変種の組織培養物および細胞培養物からの再
生率の低さである。
【０００４】第一の制限は、アルファルファが現在主に
Agrobacterium tumifaciensを用いることにより形質転
換されるために生じる。Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍは
宿主菌株特異性を示し、特定のAgrobacterium菌株のみ
が２、３のアルファルファ遺伝子型に感染する。結果的
にアルファルファを形質転換させる能力はかなり制限さ
れてしまう。アルファルファの形質転換で２番目に大き
な阻害となるものは、その低い再生率である。２、３の
変種のみが適度の再生率を示すが、産業上で優れた能力
を示すこれらの優良変種はその低い再生剤で有名であ
る。これら２つの問題が、この植物を形質転換させるう
えでかなりのネックとなっている。
【０００５】アルファルファは、この他にも多くの穀物
植物とは異なる特性を示している。アルファルファは同
質四倍体であり、育種においてしばしば自家不和合とな
る。自家受粉すると花粉が生育せず、生育しても後に生
育が停止する。よって、雑種用の真の交配親を生産する
ことは不可能であり、そのことは育種を実質的に複雑な
ものとしている。
【０００６】アルファルファの大きな胚芽供給源として
は、M. falcata、Ladak、M. varia、トゥルケスタン（T
urkistan）産、フラマン産、チリ産、ペルー産、インド
産、およびアフリカ産の９つがあることが確定してい
る。成熟子葉および胚軸のような外植片供給源組織の培
養では、ほとんどの栽培変種における遺伝子型の再生率
は約10％にすぎないことが示されている。Seitz-Kris、
M.H.およびE.T. Bingham、In vitro Cellular and Deve
lopmental Biology 24 (10):1047-1052 (1988)参照。再
生を改良させる努力がなされており、それには再生特性
を有する個々の遺伝子型を維持するための無性増殖にお
ける試行が含まれている。しかし、多くの遺伝子型が含
まれる場合には、無性方法による増殖は実用的ではな
い。Binghamらは繰返し選択によりこの問題を解決しよ
うと試みた。１回目のサイクルで再生遺伝子型を選択
し、交配し、そして再生率が60％以上に改良されるまで
リサイクルした。この結果、植物の３分の２がカルス組
織から再生され得るRegen-Sが開発された。E.T.Bingham
ら、Crop Science 15:719-721 (1975)参照。
【０００７】さらに、研究者は、アルファルファの体細
胞胚形成は遺伝性であり、比較的少数の遺伝子により制
御されると考えた。よって、再生を改良させるための努
力は、胚形成の遺伝子制御の単離およびそのような情報
を導入する育種プログラムに向けられた。例えば、M.M.
Hernandez-Fernandez、およびB.R. Christie、Genome
32:318-321 (1989)；I.M. RayおよびE.T. Bingham、Cro
p Science 29:1545-1548 (1989)を参照。これは、上述
したアルファルファの特性のために複雑になっている。
【０００８】
【発明の要旨】本発明は、前述の試行とは別の、アルフ
ァルファの形質転換および再生の改良に関する。DNAの
直接導入は、マイクロプロジェクタイルボンバードメン
トの使用により成し遂げられる。ボンバードメントを用
いた結果、上述したAgrobacteriumの制限が克服され
る。
【０００９】さらに、アルファルファの再生の限界は、
形質転換および再生のために未成熟子葉を選択すること
により克服される。アルファルファの未成熟子葉を用い
ることにより、再生はかなり改良され、そしてこの方法
で再生され得るアルファルファの種類は限定されないこ
とが判明した。よって、優良変種でさえ再生され得、形
質転換され得る。
【００１０】従って、本発明の目的は、Medicago sativ
aの形質転換率を改良することである。
【００１１】本発明の別の目的はMedicago sativaの再
生を改良することである。
【００１２】本発明のさらに別の目的はMedicago sativ
aのあらゆる変種を形質転換および再生することであ
る。
【００１３】本発明のさらに別の目的は、マイクロプロ
ジェクタイルボンバードメントを用いることにより、DN
AをMedicago sativaに形質転換させて、Medicago sativ
aのあらゆる変種にＤＮＡを導入させることである。
【００１４】本発明のさらに別の目的は、Medicago sat
ivaのあらゆる変種を形質転換および再生させるため
に、Medicago sativaの未成熟子葉を用いることであ
る。
【００１５】
【発明の構成】本発明のアルファルファの再生プロセス
は、アルファルファの未成熟子葉細胞の体細胞胚形成を
開始する工程を包含する。上記未成熟子葉細胞は、好ま
しくは受粉後25日目であり、さらに好ましくは受粉後10
から15日目であり、最も好ましくは受粉後10日目であ
る。また、上記子葉の色は好ましくは半透明から薄緑色
である。
【００１６】好適な実施態様では、アルファルファの優
良変種が再生される。上記変種は、好ましくは、Grimm
(Pi 452472)、Norseman、Lahontan、Turkistan (Pi 866
96)、Teton、Pi251689、Caliverde 65、Buffalo、Cod
y、Hairy Peruvian、Hairy Peruvian (B16-PLH)、Mesa
Sirsa、Sonora、DuPuits、Iroquois、Vernal、Culver、
Agate、Ramsey、El Unico、RegenS/ RA3、YAM93、およ
びYAE92からなる群から選択される。
【００１７】好適な実施態様では、上記未成熟子葉はア
ルファルファの種胚から摘出され、オーキシンと接して
いる子葉は細胞***および細胞成長を誘導し、体細胞胚
形成は未成熟子葉から生じる。
【００１８】本発明のアルファルファ植物の再生能力を
改良するプロセスは、植物の未成熟子葉細胞の体細胞胚
形成を開始する工程、および体細胞胚を成熟アルファル
ファ植物に栽培する工程、を包含する。好ましくは、上
記体細胞胚形成は再生不能のアルファルファの変種の未
成熟子葉の細胞により開始され、上記胚は再生可能植物
中で培養される。
【００１９】本発明のアルファルファの細胞中で外来DN
Aを発現させるプロセスは、外来DNAをキャリヤー粒子に
付着させる工程；少なくともいくつかの外来DNAが少な
くともいくつかの細胞の内部に挿入されるように、粒子
を細胞へ物理的に加速させて外来DNAを有する粒子で細
胞のボンバードメントを行う工程；および細胞中に外来
DNAの発現を確認する工程；を包含する。
【００２０】好適な実施態様では、上記外来DNAはアル
ファルファに形質転換される。また好ましくは、上記細
胞は１回または２回ボンバードメントが行われる。
【００２１】好適な実施態様では、ボンバードメントが
行われる細胞は成熟子葉の細胞である。好ましくは、上
記子葉は受粉後25日目である。好ましくは、約24時間か
ら約120時間水を吸収させた後に、上記子葉のボンバー
ドメントが行われる。
【００２２】好適な実施態様では、ボンバードメントが
行われる細胞は、未成熟子葉の細胞である。また好まし
くは、上記子葉は受粉後10から15日目であり、さらに好
ましくは、受粉後10日目である。また上記子葉の色は、
好ましくは半透明から薄緑色である。好ましくは、上記
細胞は、未成熟子葉から得られた体細胞胚の細胞であ
る。
【００２３】本発明の外来DNAをアルファルファ植物に
形質転換させるプロセスは、DNAをアルファルファの未
成熟子葉の細胞に導入する工程、および外来DNAが導入
された細胞をアルファルファ植物に栽培する工程、を包
含する。好ましくは上記未成熟子葉は受粉後10から15日
目であり、さらに好ましくは、受粉後10日目である。ま
た上記子葉の色は、好ましくは半透明から薄緑色であ
る。
【００２４】好適な実施態様では、上記外来DNAはキャ
リヤー粒子に付着し、少なくともいくつかのDNAが上記
未成熟子葉の細胞の内部に導入されるように粒子を未成
熟子葉へ加速させ、組織を成長促進培地上で培養し、そ
して得られた成長物を、導入されたDNAを含有する完全
成熟アルファルファ植物に栽培する。
【００２５】好適な実施態様では、上記外来DNAはプラ
スミドとして調製され、Agrobacteria tumefaciensに宿
り、Agrobacteria tumefaciensは上記アルファルファの
未成熟子葉細胞と結合して、外来DNAはアルファルファ
細胞に形質転換される。
【００２６】好適な実施態様では、上記DNAは、アルフ
ァルファの優良変種に形質転換される。
【００２７】本発明の外来DNAをアルファルファ植物に
形質転換させるプロセスは、外来DNAをキャリヤー粒子
に付着させる工程；少なくともいくつかのDNAがアルフ
ァルファ細胞の内部に導入されるように粒子をアルファ
ルファ細胞へ加速する工程；成長促進培地上で組織を培
養する工程；および得られた成長物を、導入されたDNA
を含有する完全成熟アルファルファ植物に栽培する工
程；を包含する。また好ましくは、上記細胞はアルファ
ルファの成熟子葉である。
【００２８】好適な実施態様では、本発明の外来DNAを
アルファルファ植物に形質転換させるプロセスは、上記
成熟子葉を摘出する工程、上記子葉に24から120時間水
を吸収させる工程、上記DNAを子葉の細胞に導入する工
程、およびDNAが導入された細胞をアルファルファ植物
に栽培する工程、をさらに包含する。
【００２９】本発明の外来DNAをアルファルファ植物に
形質転換させるプロセスは、アルファルファの未成熟子
葉の体細胞胚形成を開始する工程、DNAを胚の細胞に導
入する工程、およびDNAが導入された細胞をアルファル
ファ植物に栽培する工程、を包含する。
【００３０】（マイクロプロジェクタイルボンバードメ
ント）植物細胞を形質転換させるためのマイクロプロジ
ェクタイルボンバードメントは当業者に周知である。そ
の一般的プロセスは、T.M. Kleinら、Proc. Natl. Aca
d. Sci. USA 85:4305-4309 (1988)に記載されている。
この引例は本明細書全体に渡って引用されている他の引
例と共に、当業者の知識の度合いを示すものであり、そ
れぞれ本明細書に参考として援用されている。基本的プ
ロセスの一例としては、植物細胞壁および細胞膜を貫通
し、DNAまたは他の物質をボンバードメントが行われる
細胞の内部へ運ぶために、DNAを小さい高密度粒子であ
るマイクロプロジェクタイル上にコーティングし、次に
そのマイクロプロジェクタイルを粒子ガンまたはヘリウ
ムガン装置に載せ、高速で加速させている。
【００３１】好適な実施態様では、上記DNAは、アルフ
ァルファの優良変種に形質転換される。
【００３２】本発明の外来DNAをアルファルファ植物に
形質転換させるプロセスは、外来DNAをキャリヤー粒子
に付着させる工程；少なくともいくつかのDNAがアルフ
ァルファ細胞の内部に導入されるように粒子をアルファ
ルファ細胞へ加速する工程；成長促進培地上で組織を培
養する工程；および得られた成長物を、導入されたDNA
を含有する完全成熟アルファルファ植物に栽培する工
程；を包含する。また好ましくは、上記細胞はアルファ
ルファの成熟子葉である。
【００３３】好適な実施態様では、本発明の外来DNAを
アルファルファ植物に形質転換させるプロセスは、上記
成熟子葉を摘出する工程、上記子葉に24から120時間水
を吸収させる工程、上記DNAを子葉の細胞に導入する工
程、およびDNAが導入された細胞をアルファルファ植物
に栽培する工程、をさらに包含する。
【００３４】本発明の外来DNAをアルファルファ植物に
形質転換させるプロセスは、アルファルファの未成熟子
葉の体細胞胚形成を開始する工程、DNAを胚の細胞に導
入する工程、およびDNAが導入された細胞をアルファル
ファ植物に栽培する工程、を包含する。
【００３５】（マイクロプロジェクタイルボンバードメ
ント）植物細胞を形質転換させるためのマイクロプロジ
ェクタイルボンバードメントは当業者に周知である。そ
の一般的プロセスは、T.M. Kleinら、Proc. Natl. Aca
d. Sci. USA 85:4305-4309 (1988)に記載されている。
この引例は本明細書全体に渡って引用されている他の引
例と共に、当業者の知識の度合いを示すものであり、そ
れぞれ本明細書に参考として援用されている。基本的プ
ロセスの一例としては、植物細胞壁および細胞膜を貫通
し、DNAまたは他の物質をボンバードメントが行われる
細胞の内部へ運ぶために、DNAを小さい高密度粒子であ
るマイクロプロジェクタイル上にコーティングし、次に
そのマイクロプロジェクタイルを粒子ガンまたはヘリウ
ムガン装置に載せ、高速で加速させている。
【００３６】従来の研究では、この方法を用いて外来遺
伝子をタバコ組織の無傷植物中に運んだが、経済的に重
要な種であるアルファルファに応用することには成功し
なかった。Tomesら、Plant Molecular Biology 14:261-
268 (1990)参照。アルファルファを形質転換させるため
のマイクロプロジェクタイルボンバードメントについて
は、従来では報告されていない。
【００３７】DNAの植物への導入は、一過性の発現によ
り初めて示された。ボンバードメント後24から48時間の
植物細胞中にDNAの存在を確認することにより、短期間
の発現が認められた。ボンバードメント後72時間までの
発現は、DNAが粒子ガンまたは他の方法により運ばれる
こと、およびDNAベクターが機能することを示してい
る。ボンバードメント後２から８週間発現が継続する
と、DNAが永続し、しかも植物ゲノム中に統合されたら
しいと結論づけられ得る。この時点で永続し得るという
ことは、DNAが、防御されていない外来DNAを典型的に攻
撃するヌクレアーゼの攻撃にもかかわらず、生き延びた
ことを示している。さらに、Ｒ0植物が再生されてなお
発現が継続することは、植物細胞への安定した形質転換
が行われたことを示している。サザン分析によりこのこ
とが確認される。交配させ、Ｒ1世代を分析すると、さ
らにDNAの発現および遺伝性が確認される。
【００３８】いろいろな植物細胞供給源が、マイクロプ
ロジェクタイルボンバードメントによる形質転換に利用
され得る。胚軸、成熟種の子葉、および葉柄は、ボンバ
ードメントが行われ得る植物組織である。本出願人は、
子葉を用いると十分な形質転換が得られることを発見し
た。理論に拘束されることは好ましくないが、ボンバー
ドメントが行われる細胞は植物のもとになり得る細胞で
あるため、ボンバードメントが行われる組織源としては
子葉がより好適であると考えられる。成熟子葉もまた組
織源として適切であり、また種から容易に摘出される。
【００３９】休眠時期に入っている成熟種の子葉は形質
転換に用いられ得る。この種は、典型的には１日から数
日間水中に入れられ、根は種の外殻を突き抜け、そして
子葉が切開される。未成熟子葉に関しては、以下により
詳しく説明する。
【００４０】成熟子葉の最適な形質転換は、24から120
時間水を吸収させた後にボンバードメントを行うときに
生じることが判明した。この時点における再生、一過性
の形質転換、および得られた形質転換が最適であること
が判明した。24時間より前に子葉を損傷させることなく
種の外殻を除去することは、実用的により困難である。
120時間後に、植物を再生することはより困難である。
【００４１】組織は１回または２回ボンバードメントが
行われるべきであり、これ以上のボンバードメントは細
胞を殺す可能性がある。
【００４２】組織培養もまた、再生の可能性を最大限に
するように最適化させた。以下に述べる実施例ではRege
n-Sを用いた。前述のように、Regen-Sは再生を改良させ
る潜在能力を有することが知られている。以下に採用し
た組織培養物について述べる。組織培養において再生を
最適化させる最も重要な要素は、低濃度のキネチンより
もむしろ、高濃度の2,4-ジクロロフェノキシ酢酸（2,4-
D）である。組織／器官培養は、AtanassovおよびBrown
による、Plant Cell Tissue Organ Culture 4:111-122
(1985)に概説されている。
【００４３】（培地）以下に形質転換されたおよび形質
転換されていないアルファルファの再生に用いた培地に
ついて説明する。当業者は、本発明を逸脱しない範囲で
これらの培地を少なからず改変させて用いることが出来
る。以下に例を挙げて説明する。
【００４４】（Gamborgの基本培地）GamborgのB-5培地
は、植物種の培養培地として広く用いられている。これ
は当業者に周知であり、O.L. Gamborg、R.A. Miller、
K. Ojima、Exp. Cell. Res. 50:151-158 (1968)に詳細
に記載されている。これは以下に挙げる培地の成分を形
成する。
【００４５】（改変B5培地）この培地は、Atanassov,
A.およびBrown, D.C.W. Plant Cell Tissue and Organ
Culture 3:149-162 (1984)に記載されている。典型的混
合物が、GIBCO Laboratoriesにより製剤化されており、
以下のものを含有している：１mg/lの2,4-D、0.2mg/lの
キネチン、30g/lのスクロース、3000mg/lのKNO3、895mg
/lのCaCl2、800mg/lのl-グルタミン、500mg/lのMgSO4・7
H2O、100mg/lのセリン、10mg/lのL-グルタチオン、１mg
/lのアデニン、およびAtanassovに報告されているgelri
teの代わりに用いられる改変された、９g/lのbacto寒
天。これは以下に挙げる培地の成分を形成する。
【００４６】（MS培地）この培地は当業者に周知であ
り、T. MurashigeおよびF. Skoog、PhysiologiaPlantar
um 15:473-497 (1962)に詳細に記載されている。Gibco
Laboratoriesにより製剤化された典型的混合物は以下の
成分を含む：1650.0mg/LのNH4NO3、1900.0mg/LのKNO3、
440.0mg/LのCaCl2・2H2O、370.0mg/LのMgSO4・7H2O、170.
0mg/LのKH2PO4、37.3mg/LのNa2・EDTA、27.8mg/LのFeSO4
・7H2O、6.2mg/LのH3BO3、16.9mg/LのMnSO4・H2O、8.6mg/
LのZnSO4・7H2O、0.83mg/LのKl、0.25mg/LのNa2MoO4・2H2
O、0.025mg/LのCuSO4・5H2O、および0.025mg/LのCoCl2・6
H2O。
【００４７】（Blaydes培地およびその改変）これは当
業者に周知であり、D.F. Blaydes、Physiol. Plant. 1
9:748-753 (1966)に詳細に記載されている。
【００４８】BO（Blaydesの基礎培地）は１リットル当
り以下のものを含有している：300mgのKH2PO4、100mgの
KNO3、１gのNH4NO3、347mgのCa(NO3)2・4H2O、35mgのMgS
O4・7H2O、65mgのKCl、0.8mgのKI、1.5mgのZnSO4・7H2O、
1.6mgのH3BO3、4.4mgのMnSO4・H2O、２mgのグリシン、0.
1mgの塩酸チアミン、30gのスクロース、および高温の蒸
留水500ml中に7.45gのNa2EDTAを含有する、高温の蒸留
水500ml中FeSO4・7H2Oを5.57g含有する溶液（pH5.9-6.
0）を10g。
【００４９】BII培地はBOと同様であるが、各２mg/lのN
AA、キネチン、および2,4-Dを含有している。
【００５０】BOi2YはBOと同様であるが、100mg/lのイノ
シトールおよび２g/lのbacto酵母抽出物を含有してい
る。2,4-Dは胚の発育を阻害すると思われるため、胚誘
導後、外植片を2,4-Dの露出から除去しなければならな
い。
【００５１】（SchenkおよびHildebrandt(SH)培地）こ
の培地は当業者に周知であり、B.V. SchenkおよびA.C.
Hildebrant、Can. J. Bot. 50:199-204 (1975)に詳細に
記載されている。SHIIは、9.05uMの2,4-ジクロロフェノ
キシ酢酸（2,4-D）、および9.30uMのキネチンを含有し
ている。
【００５２】（改変SH培地）この培地は当業者に周知で
あり、D.H. Mitten、S.J. Sato、およびT.A. Skokut、C
rop Sci. 24:943-945 (1984)に詳細に記載されている。
改変SH培地は、25uMのα-ナフタレン酢酸（NAA）および
10uMのキネチンを含有しており、カルスは50uMの2,4-D
および５uMのキネチンを含有するSH培地に移され、さら
に３日後にBOi2Yを含有する再生培地に移される。
【００５３】以下に実施例を用いて本発明を説明する
が、これらの実施例は説明のためのものであり、本発明
の範囲を制限するものではない。
【００５４】
【実施例】以下に述べる各実施例では上述のRegen-Sを
採用した。この変種は、高い再生率を実現し得る潜在能
力を有することが知られている。アルファルファモザイ
クウイルス外殻タンパク質（AMVcp）、ホスホイノトリ
シン（Phosphinotricin）アセチルトランスフェラーゼ
（以下本明細書ではBARと記す）、ネオマイシンホスホ
トランスフェラーゼ（NPTII）、およびβ-グルクロニダ
ーゼ（GUS）をコードする遺伝子を、DuPont PDS 約1000
の粒子ガンを用いてこの遺伝子型に形質転換させた。ア
ルファルファモザイクウイルス外殻タンパク質は植物を
AMV病原体から防御し、BARは、Basta(登録商標)培地に
存在する非選択性除草剤ホスホイノトリシンを不活性化
し、そしてNPTIIはカナマイシンを不活性化する。NPTII
およびAMVcpをコードするプラスミドpPHI251を用いた。
このプラスミドの地図を図１に示す。プラスミドpPHI25
6を、以下に示すようにBAR、AMVcp、およびGUSをコード
する際に別々に用いた。このプラスミドの地図を図２に
示す。
【００５５】（実施例１）Basta(登録商標)選択でのア
ルファルファ成熟子葉の粒子ガンによる形質転換 外植片：Regen-Sの成熟子葉 プラスミド：pPHI256（GUS、AMVcp、BAR） ボンバードメント：１プレート当り８つの子葉（８プレ
ート）を、1.8μmのタングステン粒子で２回ボンバード
メント 培養：発芽後２日目の種および子葉から取り除いた胚軸 子葉を0.25Mのソルビトールで吸収させたフィルターに
プレートし、向軸表面を２回ボンバードメント 改変B5培地で２日間培養 ボンバードメント後３日目の子葉を、2.5mg/lのBasta
(登録商標)を含有する改変B5培地上で９週間培養（４週
間のカルス形成／胚形成(B5ベース、１mg/lの2,4-D、お
よび0.2mg/lのキネチン)、２週間の胚形成／胚発育(B5
ベース、0.1mg/lのNAA)、３週間の胚成熟(BOi2Yベー
ス、ホルモン含有なし)） ５mg/lのBasta(登録商標)で根付け 苗条先端の培養を開始 結果：60の胚が再生された 11は黒ずみ、選択工程中に死んだ 10は異常なため、GUS組織化学染色を行った（全て陰
性） 31は異常なため、カルス用に再培養した（これもGUSに
陰性） ８は正常であり、そのうち５が高い選択を生き抜いた 今回の実施例では、2.5mg/lのBasta(登録商標)を含有す
る改変B5培地上でボンバードメントが行われた成熟子葉
の培養物から５つの植物が再生された。表１に示すよう
に、各植物はポリメラーゼ鎖反応増幅の方法により、AM
VcpおよびBAR遺伝子を含有することが同定された。Rao,
G.およびFlynn, P., BioTechniques、Vol. 8、No. 1、
pp. 38-40 (1990)に記載されているGUSアッセイより、
β-グルクロニダーゼ酵素活性もまた５つの植物中に同
定された。
【００５６】
【表１】
【００５７】表２は、親および子孫のPCR分析によれ
ば、50％がBARに対して陽性であったことを示す。最初
の３つの植物は子孫であり、次はBARを発現する母方植
物であり、次いでBARに対して陰性の父方植物、BARに対
して陽性の母方植物、およびコントロールを示す。
【００５８】
【表２】
【００５９】クローンであることが判明しており、PCR
分析の結果、BARおよびAMVcp遺伝子に陽性であった親植
物について、サザン分析を行った。これにより、植物の
遺伝性形質転換が得られることがわかる。
【００６０】すなわち、マイクロプロジェクタイルボン
バードメントを用いることにより、アルファルファから
の成熟子葉の形質転換が達成されたことがわかる。しか
し上述のように、再生は概して低かった。形質転換およ
び再生において未成熟子葉を用いると、再生は飛躍的に
改良した。
【００６１】（未成熟子葉）体細胞胚形成は、胚が細胞
から直接形成されるのであれば直接的に、カルスが脱分
化により形成されるのであれば間接的に行われ得る。
【００６２】従来の研究では、再生が改良された系を開
発する植物育種技術において、特定の胚芽供給源の使
用、再生が改良された遺伝子型の選択、再生が改良され
た変種を作り出すための繰り返し選択、または遺伝子の
選択に着目してきたが、本発明では全く異なるアプロー
チをとった。例えば、Mittenら、Crop Science、24:943
(1984); Seitz, Kris & Bingham、In Vitro、24:1047
(1988); BrownおよびAtanassov、Plant Cell Tissue Or
gan Culture、4:111-122 (1985)を参照。従って、本発
明は、アルファルファの再生を改良して、それによりア
ルファルファの形質転換を改良するために、未成熟子葉
を用いることに関する。
【００６３】未成熟子葉を用いることは、再生において
重要な要素であることが判明した。種が発育するにつ
れ、受粉後約０から５日間で種胚は球形となり、一般に
外観のない半透明色になる。約５日目にハート形の外観
となる。次いで胚はローテーションし、約10日目に子葉
が見えてくる。その色は半透明から薄緑で、子葉の後ろ
にスカルペル（scalpel）をほぼ見ることが出来る。約1
5日目に種部分の分化がより明確になり、20日目までに
は暗緑色になる。25日目を過ぎると暗緑色が黄色味を帯
びてくる。30日目はクリームのような白色であり、この
時点では休眠プロセスが進行している。
【００６４】出願人は、再生を改良させる未成熟子葉
は、受粉後25日目の子葉であることを見いだした。受粉
後５から７日目で中心部が現れるが、この段階で子葉部
分を摘出し、それを胚の他の部分と切り離して分化させ
ることは実用的に困難である。子葉は、半透明から極薄
緑色になる初期段階の約10日目でより容易に採取され得
る。10から15日目の間の時期が好ましく、この時期では
かなり再生が改良される。子葉を摘出するのに最適な時
期は、受粉後約10日目および／または子葉が半透明から
薄緑色になる時期である。薄緑色は、Pantonカラーチャ
ート番号PMS372の色に相当する。
【００６５】本発明の未成熟子葉を用いた結果、従来で
は決して形質転換および再生し得なかった変種を再生す
ることが可能となった。従来の高度に再生可能な植物
は、好適な表現型を常に保持しているとは限らなかった
が、今ではアルファルファの優良系でさえも再生し得
る。これらの優良系は、典型的には所望の生産特性を有
しているが、再生率の低さが問題であった。
【００６６】未成熟子葉を用いた結果、従来ではDNAの
導入後には再生し得なかったような優良系の形質転換が
得られるようになった。形質転換は、ボンバードメント
によりまたは従来から既知の土壌細菌を用いることによ
り生じ得、今では再生も可能である。
【００６７】（実施例２）典型的プロトコールでは、未
成熟子葉外植片を改変B5培地にプレートすることが含ま
れている。21から28日後に、体細胞胚をMS培地に移し、
そこで成長させる。当業者に明らかに周知であるこのプ
ロトコールには多くの変法があり、以下に実施例を用い
て説明する。以下には、外植片日数に相関して再生が改
良されることを示す。
【００６８】２つの変種からの植物を３つの群に分け
た。YAE92からの６つの植物を第１の群に入れ、YAE92か
らの５つの植物を第２の群に入れ、YAM93からの５つの
植物を第３の群に入れた。表３は各変種の基礎特性を示
すものである。
【００６９】
【表３】
【００７０】各群は各群内だけで交配させた。得られた
植物から、各総状花序を別々に同定し、その状態を完全
なまま維持した。採取は、受粉後０から30日間隔で行っ
た。初めに番号をつけて総状花序を採取し、後にも同じ
番号をつけた総状花序を採取した。群を完全なまま維持
し、実験中に番号をつけた総状花序から採取することに
より、未成熟子葉から再生される限り、特定の変種内で
の遺伝子型の変化は、再生に影響しないことが示され
た。採取時に摘出された各子葉を再生させた。図３は、
子葉の受粉後日数をｘ軸に取り、再生率をｙ軸に取って
プロットしたグラフである。その結果、同じ総状花序か
らでさえ、受粉直後から受粉後約15日目まで再生率は増
加し、その後成熟するまで減少している。
【００７１】採取時期のスコアおよび評価を表４に示
す。この結果から、摘出された子葉の日齢は、再生にと
って極めて重要な要素であることが明らかである。
【００７２】
【表４】
【００７３】従って、未成熟子葉をアルファルファの再
生に用いると、再生が飛躍的に改良されることが示され
た。
【００７４】（実施例３）この実施例では、未成熟子葉
を用いることにより、再生が改良され、かつ、どのよう
な胚芽供給源にも適用され得ることを確認する。再生率
が低いか、またはほとんど再生しない変種を含む多くの
変種が、未成熟子葉を用いることにより再生された。Gr
imm（Pi 452472）の15植物、Mesa Sirsaの30植物、RA3
クローンの１植物を移植して受粉させたこと以外は、表
５に示す各変種のうち最小限の12植物を移植して受粉さ
せた。受粉後約10-15日目、および成熟時点（約30日
目）に同定した各総状花序を採取した。未成熟子葉およ
び成熟子葉は、実施例２に記載のように再生した。
【００７５】表５のデータは、未成熟子葉を用いること
により、従来は再生率が低いか、または全く再生しなか
った変種においてさえも、再生が実質的に改良されるこ
とを示している。図４は、再生が非常に困難である変種
において生じた再生の差異をグラフに示すものである。
選択した変種、および特に再生率が最低である変種の、
成熟子葉の再生率を黒塗り棒で、また未成熟子葉の再生
率を斜線棒で示した。未成熟子葉を用いることにより、
成熟子葉では全く再生しなかった変種も含めて、それぞ
れの場合で再生が改良された。
【００７６】
【表５】
【００７７】（実施例４）未成熟胚が形質転換され得る
か、を確認するために、３つの別々の実験を行った。
【００７８】第一の実験では、上述のように子葉をpPHI
413を用いてボンバードメントを行い（図５参照）、GUS
発現のレベルをアッセイした。42の試料のボンバードメ
ントを行った。最適発現は、ボンバードメント後48から
72時間で生じ、42の試料のうち26の試料が、平均1.7 pg
/μg全タンパク質でGUSを発現した。ボンバードメント
後５日目で、30の試料のうち６の試料が平均2 pg/μg全
タンパク質を示し、一方、ボンバードメント後17日目で
30の試料のうち3の試料が平均2 pg/μg全タンパク質を
示した。
【００７９】第二の実験では、選択によりアルファルフ
ァの再生に及ぼすボンバードメントの影響を調べた。Re
gen-Sの未成熟子葉を受粉後11日目に採取した。子葉を
胚から摘出して、プラスミドpPHI251を用いて３回ボン
バードメントを行い（図１）、タングステン粒子へ吸着
させ、25mg/lの硫酸カナマイシンを含有する改変B5培地
上で培養した。処理後約２カ月で体細胞の胚を採取し、
MS培地上で２カ月完全に乾燥させて、100mg/lの硫酸カ
ナマイシンを含有するMS培地上で発芽させた。葉の組織
を採取して、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ
（NPTII）活性をアッセイした。結果を表６に示す。
【００８０】
【表６】
【００８１】第三の実験は、本発明のさらに別の実施態
様を示しており、形質転換されたアルファルファの優良
変種の再生に及ぼすボンバードメントの影響を調べた。
受粉後11日目の胚から未成熟子葉を摘出した。体細胞胚
を再生させた。体細胞胚を、プラスミドpPHI251（図
１）で吸着させたタングステン粒子を用いて５回ボンバ
ードメントを行い、25mg/lの硫酸カナマイシンを含有す
る改変B5培地上で培養した。25mg/lの硫酸カナマイシン
を含有する新しい改変B5培地に、ボンバードメント後20
日目に胚を継代培養した。ボンバードメント後50日目に
緑色の体細胞胚を採取して、100mg/lの硫酸カナマイシ
ンを含有するMS培地上で成長させた。ボンバードメント
後80日目に葉の試料を取り出し、ネオマイシンホスホト
ランスフェラーゼ活性をアッセイした。その結果を表７
に示す。
【００８２】
【表７】
【００８３】最後の実験は、体細胞胚を形成させるため
に未成熟子葉を用いて胚のボンバードメントを行うと、
さらに多くの植物が再生されることを示している。さら
に、得られた植物は、この再生能力を保持することが判
明した。優良変種が再生され得るだけでなく、この特性
をも保持され得る。
【００８４】さらに、未成熟子葉または体細胞胚のボン
バードメントは、再生に悪影響を及ぼさないこと、およ
びこれらの新しい再生可能な細胞および植物中にDNAが
発現することが示されている。
【００８５】以上のことから、Medicago sativaの形質
転換、粒子加速による形質転換、および実質的に改良さ
れたMedicago sativaの再生は、未成熟子葉を用いるこ
とにより可能であることが示された。このことにより、
従来では再生されなかった、または極めて再生率が低か
った変種の再生が達成された。従って、これらの同じ変
種の形質転換が今や可能となった。
【００８６】本発明の方法は、粒子加速を用いることに
よってアルファルファを形質転換させるために用いられ
る。24から120時間水を吸収させた後にボンバードメン
トを行うと、成熟子葉の最適結果が得られる。アルファ
ルファの再生および形質転換は、未成熟子葉または未成
熟子葉の胚を用いることにより大幅に改良される。未成
熟子葉は受粉後25日目であり、好ましくは受粉後10から
15日目に摘出された子葉であり、最も好ましくは受粉後
約10日目に摘出された子葉である。これらの子葉は半透
明から薄緑色である。未成熟子葉の体細胞胚のボンバー
ドメントにより得られた植物は、再生能力を保持する。
【図面の簡単な説明】
【図１】プラスミドpPHI251の地図である。
【図２】プラスミドpPHI256の地図である。
【図３】ｘ軸が子葉の日齢およびｙ軸が再生率を示す、
時間毎の採取結果を示すグラフである。
【図４】各変種の未成熟子葉（斜線棒）および成熟子葉
（黒塗り棒）による再生率を示すグラフである。
【図５】プラスミドpPHI413の地図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 チャリッセ マリー ビジング アメリカ合衆国 アイオワ 50325，ポー ク カウンティ，デモイン，フォレスト サークル 10495 (72)発明者 ドワイト トメス アメリカ合衆国 アイオワ 50061，ポー ク カウンティ，カミング，ビーチウッド ８ (72)発明者 ジャニス エフ． シュミット カナダ国 エス７エヌ ０ゼッド１，サス カチェワン，サスカトゥーン，ビクトリア アベニュー 1107−606

Claims (32)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】アルファルファの未成熟子葉細胞の体細胞
    胚形成を開始する工程を包含する、アルファルファの再
    生プロセス。
  2. 【請求項２】前記未成熟子葉細胞が受粉後25日目であ
    る、請求項１に記載のプロセス。
  3. 【請求項３】前記未成熟子葉細胞が受粉後10から15日目
    である、請求項１に記載のプロセス。
  4. 【請求項４】前記未成熟子葉細胞が受粉後10日目であ
    る、請求項１に記載のプロセス。
  5. 【請求項５】前記子葉が半透明から薄緑色である、請求
    項１に記載のプロセス。
  6. 【請求項６】アルファルファの優良変種が再生される、
    請求項１に記載のプロセス。
  7. 【請求項７】前記変種が、Grimm (Pi 452472)、Norsema
    n、Lahontan、Turkistan (Pi 86696)、Teton、Pi25168
    9、Caliverde 65、Buffalo、Cody、Hairy Peruvian、Ha
    iry Peruvian (B16-PLH)、Mesa Sirsa、Sonora、DuPuit
    s、Iroquois、Vernal、Culver、Agate、Ramsey、El Uni
    co、RegenS/RA3、YAM93、およびYAE92からなる群から選
    択される、請求項６に記載のプロセス。
  8. 【請求項８】前記未成熟子葉がアルファルファの種胚か
    ら摘出され、オーキシンと接している該子葉が細胞***
    および細胞成長を誘導し、該未成熟子葉から体細胞胚形
    成が生じる、請求項１に記載のプロセス。
  9. 【請求項９】アルファルファ植物の再生能力を改良する
    プロセスであって、該植物の未成熟子葉細胞の体細胞胚
    形成を開始する工程、および該体細胞胚を成熟アルファ
    ルファ植物に栽培する工程、を包含するプロセス。
  10. 【請求項１０】前記体細胞胚形成が再生不能のアルファ
    ルファの変種の未成熟子葉細胞により開始され、該胚が
    再生可能植物中で培養される、請求項９に記載のプロセ
    ス。
  11. 【請求項１１】アルファルファの細胞中で外来DNAを発
    現させるプロセスであって、 該外来DNAをキャリヤー粒子に付着させる工程；少なく
    ともいくつかの該外来DNAが少なくともいくつかの該細
    胞の内部に挿入されるように、該粒子を該細胞へ物理的
    に加速させて、該外来DNAを有する粒子で該細胞のボン
    バードメントを行う工程；および該細胞中に該外来DNA
    の発現を確認する工程；を包含するプロセス。
  12. 【請求項１２】前記外来DNAがアルファルファに形質転
    換される、請求項１１に記載のプロセス。
  13. 【請求項１３】前記細胞が、１回または２回ボンバード
    メントが行われる、請求項１１に記載のプロセス。
  14. 【請求項１４】成熟子葉の細胞のボンバードメントが行
    われる、請求項１１に記載のプロセス。
  15. 【請求項１５】前記子葉が受粉後25日目である、請求項
    １４に記載のプロセス。
  16. 【請求項１６】約24時間から約120時間水を吸収させた
    後に、前記子葉のボンバードメントが行われる、請求項
    １４に記載のプロセス。
  17. 【請求項１７】未成熟子葉の細胞のボンバードメントが
    行われる、請求項１１に記載のプロセス。
  18. 【請求項１８】前記子葉が受粉後10から15日目である、
    請求項１７に記載のプロセス。
  19. 【請求項１９】前記子葉が受粉後10日目である、請求項
    １７に記載のプロセス。
  20. 【請求項２０】前記子葉が半透明から薄緑色である、請
    求項１７に記載のプロセス。
  21. 【請求項２１】前記細胞が未成熟子葉から得られた体細
    胞胚の細胞である、請求項１１に記載のプロセス。
  22. 【請求項２２】外来DNAをアルファルファ植物に形質転
    換させるプロセスであって、該DNAをアルファルファの
    未成熟子葉の細胞に導入する工程、および外来DNAが導
    入された該細胞をアルファルファ植物に栽培する工程、
    を包含するプロセス。
  23. 【請求項２３】前記未成熟子葉が受粉後10から15日目で
    ある、請求項２２に記載のプロセス。
  24. 【請求項２４】前記未成熟子葉が受粉後10日目である、
    請求項２２に記載のプロセス。
  25. 【請求項２５】前記未成熟子葉が半透明から薄緑色であ
    る、請求項２２に記載のプロセス。
  26. 【請求項２６】前記外来DNAがキャリヤー粒子に付着
    し、少なくともいくつかかのDNAが前記未成熟子葉の細
    胞の内部に導入されるように該粒子を未成熟子葉へ加速
    させ、組織を成長促進培地上で培養し、そして得られた
    成長物を、導入された該DNAを含有する完全成熟アルフ
    ァルファ植物に栽培する、請求項２２に記載のプロセ
    ス。
  27. 【請求項２７】前記外来DNAがプラスミドとして調製さ
    れ、Agrobacteria tumefaciensに宿り、該Agrobacteria
    tumefaciensが前記アルファルファの未成熟子葉の細胞
    と結合して、該外来DNAが該アルファルファ細胞に形質
    転換される、請求項２２に記載のプロセス。
  28. 【請求項２８】前記DNAがアルファルファの優良変種に
    形質転換される、請求項２２に記載のプロセス。
  29. 【請求項２９】外来DNAをアルファルファ植物に形質転
    換させるプロセスであって、 該外来DNAをキャリヤー粒子に付着させる工程；少なく
    ともいくつかのDNAがアルファルファ細胞の内部に導入
    されるように該粒子を該アルファルファ細胞へ加速する
    工程；成長促進培地上で組織を培養する工程；および得
    られた成長物を、導入された該DNAを含有する完全成熟
    アルファルファ植物に栽培する工程；を包含するプロセ
    ス。
  30. 【請求項３０】前記細胞がアルファルファの成熟子葉で
    ある、請求項２９に記載のプロセス。
  31. 【請求項３１】前記成熟子葉を摘出する工程、該子葉に
    24から120時間水を吸収させる工程、前記DNAを該子葉の
    細胞に導入する工程、および該DNAが導入された該細胞
    をアルファルファ植物に栽培する工程、をさらに包含す
    る、請求項３０に記載のプロセス。
  32. 【請求項３２】外来DNAをアルファルファ植物に形質転
    換させるプロセスであって、アルファルファの未成熟子
    葉の体細胞胚形成を開始する工程、該DNAを該胚の細胞
    に導入する工程、および該DNAが導入された該細胞をア
    ルファルファ植物に栽培する工程、を包含するプロセ
    ス。
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