MX2012014663A - Composiciones y metodos para mejorar la resistencia al tizon norteño de las hojas en maiz. - Google Patents

Abstract

La invención se refiere a los métodos y composiciones para identificar y seleccionar plantas de maíz con resistencia mejorada al tizón norteño de las hojas. Las plantas de maíz generadas por los métodos de la invención son también una característica de la invención.

Description

COMPOSICIONES Y METODOS PARA MEJORAR LA RESISTENCIA AL TIZON NORTEÑO DE LAS HOJAS EN MAIZ CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente descripción se refiere a las composiciones y métodos útiles para mejorar la resistencia al tizón norteño de las hojas en las plantas de maíz.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN El tizón norteño de las hojas (NLB, por sus siglas en inglés), inducido por el patógeno fúngico Exserohilum turcicum (anteriormente conocido como Helminthosporium turcicum) , es una seria enfermedad de marchitez foliar del maíz en muchos medios tropicales y templados. Los síntomas pueden estar en el intervalo de lesiones en forma de cigarro en las hojas inferiores a la destrucción completa del follaje, con lo que se reduce así la cantidad del área superficial de la hoja disponible para la fotosíntesis . Una reducción en la capacidad fotosintética conduce a una pérdida de la necesidad de carbohidratos necesaria para el llenado del grano, lo que impacta en el rendimiento del grano. Las regiones de media altitud de los trópicos, aproximadamente 900-1600 m por encima del nivel del mar, tienen un clima particularmente favorable para el tizón norteño de las hojas, ya que los períodos de rocío son largos y las temperaturas REF. : 236670 moderadas. Sin embargo, el tizón norteño de las hojas puede producir, además, pérdidas de 30-50 % en ambientes templados, tal como, en los Estados Unidos, durante las estaciones húmedas, particularmente, si la infección se establece en las hojas superiores de la planta por la etapa de floración.

El hongo Exserohilum turcicum (Et) pasa el invierno como micelio y conidio en los residuos de maiz que se dejan en la superficie del suelo. Los conidios se transforman en esporas en reposo y, durante el tiempo húmedo, cálido, se producen nuevos conidios que, después, el viento o la lluvia portan a las hojas inferiores de las plantas de maiz jóvenes. La infección requiere la presencia de agua en la superficie de la hoja por 6-18 horas y una temperatura entre 18.9 y 26.7 °C (66 y 80 °F) . Se produce la infección, se desarrollan lesiones a los 7-12 días y se producen nuevos conidios, que esparcen la infección a sitios secundarios. Las estrategias de gestión de las enfermedades incluyen la rotación de los cultivos, la destrucción de los residuos de maiz viejos por labranza, y la aplicación de fungicidas, estrategias que tienen como objetivo reducir el inoculo fúngico. Sin embargo, el método más eficaz y más preferido para el control del tizón norteño de las hojas es la plantación de híbridos resistentes .

Muchas variedades o razas de Exserohilum turcicum están presentes en la naturaleza, lo que deja a los cultivadores con dos opciones de híbridos: Los híbridos con resistencia parcial, que ofrecen protección de amplio espectro, bajo nivel, contra múltiples razas, e híbridos con resistencia específica a la raza, los cuales protegen contra una raza específica. Se han descrito las fuentes genéticas de la resistencia al Exserohilum turcic m, y se identificaron cuatro loci de resistencia al Exserohilum turcicum (anteriormente conocido como Helminthosporium turcicum) : Htl, Ht2, Ht3, y Htnl . El gen Htl mapea al brazo largo del cromosoma 2 en donde este se une estrechamente a umc36 (Coe, E.H. et al. (1988), Corn and Corn Improvement, 3.° edn . , págs. 81-258), sgcr506 (Gupta, M. et al. (1989) Maize Genet. Coop. Newsl. 63, 112), umcl50B (Bentolila, S. et al. (1991) Theor. Appl . Genet., 82:393-398), y picl8a (Collins et al. (1998) Molecular Plant-Microbe Interactions, 11:968-978), y está estrechamente flanqueado por umc22 y umcl22 (Li et al. (1998) Hereditas, 129:101-106) . El gen Ht2 mapea para el brazo largo del cromosoma 8 en el intervalo umc48-umc89 (Zaitlin et al. (1992) Maize Genet. Coop. Newsl., 66, 69-70), y el gen Ht3 mapea para el cromosoma 7 cerca de bnlgl666 (Van Staden, D et al. (2001) Maize Genetics Conference Abstracts 43:P134) . El gen Htnl mapea para el cromosoma 8, aproximadamente 10 cM distante de Ht2 y 0.8 cM distante del marcador RFLP umcll7 (Simcox and Bennetzen (1993) Maize Genet. Coop. Newl..67, 118-119; Simcox and Bennetzen (1993) Phytopathology, 83:1326-1330; Chung et al. (2010) Theor App Gen Epub) .

Los métodos para controlar el tizón norteño de las hojas mediante la reducción del inoculo fúngico requieren de tiempo y recursos adicionales por parte del agricultor y, además, pueden tener efectos perjudiciales en el medio ambiente. Esto hace que las plantaciones de híbridos resistentes sean aún más atractivas para los agricultores y el público en general. Asi, se prefiere proporcionar composiciones y métodos para identificar y seleccionar plantas de maíz con resistencia mejorada al tizón norteño de las hojas. Estas plantas pueden usarse en programas de cultivo para generar híbridos de alto rendimiento con resistencia al tizón norteño de las hojas.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN Se proporcionan composiciones y métodos para identificar y seleccionar plantas de maíz con resistencia mejorada al tizón norteño de las hojas.

En una modalidad se presentan métodos para seleccionar plantas de maíz con resistencia mejorada al tizón norteño de las hojas. Los métodos incluyen detectar uno o más alelos marcadores en la planta de maíz unidos a y asociados con: el haplotipo PH26N en NLB17_A, el haplotipo PH26N en NLB17_E, el haplotipo PH26N en NLB17_3, el haplotipo PH26N en NLB18_A, el haplotipo PH26N en NLB18_E, el haplotipo PH99N en NLB18_A, o el haplotipo PH99N en NLB18_E. Una planta de maíz que tiene uno o más alelos marcadores unidos a y asociados con cualquiera de los haplotipos enumerados anteriormente se selecciona después con resistencia mejorada al tizón norteño de las hojas.

En otra modalidad el alelo marcador puede unirse a cualquiera de los siguientes haplotipos: el haplotipo PH26N en NLB17_A, el haplotipo PH26N en NLB17_E, el haplotipo PH26N en NLB17_3, el haplotipo PH26N en NLB18_A, el haplotipo PH26N en NLB18_E, el haplotipo PH99N a NLB18_A, o el haplotipo PH99N a NLB18_E por 30 cMr 25, 20, 15, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1, 0.9, 0.8, 0.7, 0.6, 0.5, 0.4, 0.3, 0.2, o 0.1 cM.

En otra modalidad se presentan métodos para seleccionar plantas de maíz con resistencia mejorada al tizón norteño de las hojas. Los métodos incluyen detectar un haplotipo en la planta de maiz en donde el haplotipo puede ser cualquiera de los siguientes: el haplotipo PH26N en NLB17_A, el haplotipo PH26N en NLB17_E, el haplotipo PH26N en NLB17_3, el haplotipo PH26N en NLB18_A, el haplotipo PH26N en NLB18_E, el haplotipo PH99N en NLB18_A, o el haplotipo PH99N en NLB18_E. Una planta de maiz que tiene el haplotipo se selecciona, después, con resistencia mejorada al tizón norteño de las hojas.

En otra modalidad se proporcionan métodos para identificar plantas de maiz con resistencia mejorada al tizón norteño de las hojas al detectar al menos un alelo marcador asociado con la resistencia mejorada en el germoplasma de una planta de maíz. El locus marcador se puede seleccionar de cualquiera de los siguientes loci marcadores: PHM2798, b0302Hl, b0611N13, 2717_3, 2717_4, 108fl6_2, 31004, pco642297_3, bl09.m6, PHM18979, b0507L21, 2_2, 156K16, b0318il3, PHM4757, PHM13395-27, PHM4677-11, PHM3418-12, PHM15992-3, NLB5A, NLB3A, PHM4582, 9gl3-3, K, 6_7, 6_8, N, R, S, U, PHM2817-26, PHM7446-6, PHM13395-16, NLB17_A, NLB17_E, NLB17_3, NLB18_A, o NLB18_E; así como de cualquier otro marcador que esté unido a esos marcadores. El locus marcador comprende al menos un alelo que se asocia con la resistencia mejorada al tizón norteño de las hojas. Las plantas de maíz identificadas por este método son, además, de interés.

En otra modalidad se proporcionan métodos para identificar las plantas de maíz con resistencia mejorada al tizón norteño de las hojas mediante la detección de un haplotipo en el germoplasma de la planta de maíz, en donde el haplotipo se asocia con la resistencia mejorada al tizón norteño de las hojas. El haplotipo comprende alelos en uno o más loci marcadores, en donde el uno o más loci marcadores se encuentran dentro de un intervalo en el cromosoma 8 que comprende y flanqueado por: i. los marcadores PHM4582 y R, o ii . los marcadores 6_8 y R.

En otra modalidad el haplotipo es el haplotipo PH26N en NLB17_A, el haplotipo PH26N en NLB17_E, el haplotipo PH26N en NLB17_3, el haplotipo PH26N en NLB18_A, el haplotipo PH26N en NLB18_E, el haplotipo PH99N a NLB18_A, o el haplotipo PH99N a NLB18_E.

En otra modalidad se proporcionan métodos para seleccionar plantas de maíz con resistencia mejorada al tizón norteño de las hojas. En un aspecto, se obtiene una primera planta de maíz que tiene el haplotipo PH26N en NLB17_A, el haplotipo PH26N en NLB17_E, el haplotipo PH26N en NLB17_3, el haplotipo PH26N en NLB18_A, el haplotipo PH26N en NLB18_E, el haplotipo PH99N a NLB18_A, o el haplotipo PH99N a NLB18_E. La primera planta de maíz se puede cruzar después con una segunda planta de maíz, y las plantas de la progenie resultantes del cruce se pueden evaluar para la presencia del haplotipo. Las plantas de la progenie que poseen el haplotipo de la primera planta de maíz se pueden seleccionar por resistencia mejorada al tizón norteño de las hojas. Las plantas de la progenie seleccionadas por este método son, además, de interés.

En otra modalidad, la invención se refiere a un polinucleótido aislado que comprende: (a) al menos una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido capaz de conferir o mejorar la resistencia al tizón norteño de las hojas, en donde el polipéptido tiene una secuencia de aminoácidos de al menos 90 % identidad de secuencia, basado en el método de alineamiento Clustal V, cuando se compara con la sec. con núm de ident.:93, 95, o 97; o (b) un complemento completo de la secuencia de nucleótidos, en donde el complemento completo y la secuencia de nucleótidos consisten en el mismo número de nucleótidos y son 100 % complementarios. El polipéptido podría comprender la secuencia de aminoácidos de sec. con núm. de ident.:93, 95, o 97. La secuencia de nucleótidos podría comprender la secuencia de nucleótidos de sec. con núm. de ident.:92, 94, o 96.

En otra modalidad la invención se refiere a un vector que comprende el polinucleótido aislado reivindicado.

En otra modalidad la invención se refiere a un constructo de ADN recombinante que comprende el polinucleótido aislado de la invención unido operativamente a al menos una secuencia reguladora.

En otra modalidad la invención se refiere a una célula de maíz que comprende el constructo de ADN recombinante o el polinucleótido aislado de la invención.

En otra modalidad la invención se refiere a un proceso para producir una planta de maíz; el proceso comprende transformar una célula vegetal con el constructo de ADN recombinante de la invención y regenerar una planta a partir de la célula vegetal transformada.

En otra modalidad la invención se refiere a una planta de maíz que comprende el constructo de ADN recombinante de la invención .

En otra modalidad la invención se refiere a una semilla de maíz que comprende el constructo de ADN recombinante de la invención .

En otra modalidad la invención se refiere a un proceso para conferir o mejorar la resistencia al tizón norteño de las hojas; el proceso comprende transformar una planta con el constructo de ADN recombinante de la invención y, así, conferir o mejorar la resistencia al tizón norteño de las hojas .

En otra modalidad la invención se refiere a un proceso para determinar la presencia o ausencia del polinucleótido de la invención en una planta de maíz; el proceso comprende al menos uno de: (a) aislar moléculas de ácido nucleico de la planta de maíz y aumentar las secuencias homologas al polinucleótido de la invención, o (b) aislar moléculas de ácido nucleico de las plantas de maíz y realizar una hibridización Southern, o (c) aislar proteínas de la planta de maiz y realizar un ensayo de membrana de Western con anticuerpos para la proteína, o (d) aislar proteínas de la planta de maíz y realizar un ensayo ELISA con anticuerpos para la proteina, o (e) demostrar la presencia de secuencias de ARNm derivado del transcrito de ARNm y únicas para el locus de resistencia al tizón norteño de las hojas, y, asi, determinar la presencia del polinucleótido de la invención en la planta de maíz .

En otra modalidad la invención se refiere a un proceso para determinar la presencia o ausencia del locus de resistencia al tizón norteño de las hojas en una planta de maíz; el proceso comprende al menos uno de: (a) aislar moléculas de ácido nucleico de la planta de maíz y aumentar las secuencias únicas para el polinucleótido de la invención, o (b) aislar proteínas de la planta de maíz y realizar un ensayo de membrana de Western con anticuerpos para la proteína, o (c) aislar proteínas de la planta de maíz y realizar un ensayo ELISA con anticuerpos para la proteína, o (d) demostrar la presencia de secuencias de ARNm derivado del transcrito de ARNm y únicas para el locus de resistencia al tizón norteño de las hojas, y determinar asi la presencia del locus de resistencia al tizón norteño de las hojas en dicha planta de maíz.

En otra modalidad la invención se refiere a un proceso para alterar el nivel de expresión de una proteina capaz de conferir resistencia al tizón norteño de las hojas en una célula de maíz; el proceso comprende: (a) transformar una célula de maíz con el constructo de ADN recombinante de la invención y (b) cultivar la célula de maiz transformada bajo las condiciones adecuadas para la expresión del constructo de ADN recombinante, en donde la expresión del constructo de ADN recombinante resulta en la producción de niveles alterados de una proteina con la capacidad de conferir resistencia al tizón norteño de las hojas en la célula de maíz transformada en comparación con los niveles de expresión en una planta de maíz silvestre con resistencia al tizón norteño de las hojas.

En otra modalidad la invención se refiere a un proceso para alterar el nivel de expresión de una proteína capaz de conferir resistencia al tizón norteño de las hojas en una célula de maíz; el proceso comprende: (a) transformar una célula de maíz con el constructo de ADN recombinante de la invención; y (b) cultivar la célula de maíz transformada bajo las condiciones adecuadas para la expresión del constructo de ADN recombinante, en donde la expresión del constructo de ADN recombinante resulta en la producción de niveles alterados de una proteina con la capacidad de conferir resistencia al tizón norteño de las hojas en la célula de maíz transformada en comparación con los niveles de expresión en una planta de maíz silvestre con resistencia al tizón norteño de las hojas.

En otra modalidad la invención se refiere a un proceso para alterar el nivel de expresión de una proteina capaz de conferir resistencia al tizón norteño de las hojas en una planta de maiz; el proceso comprende: (a) transformar una célula vegetal de maiz con el constructo de ADN recombinante de la invención; y (b) regenerar una planta de maiz transformada a partir de la célula vegetal de maiz transformada; y (c) cultivar la planta de maíz transformada bajo condiciones adecuadas para la expresión del constructo de ADN recombinante, en donde la expresión del constructo de ADN recombinante resulta en la producción de niveles alterados de una proteina capaz de conferir resistencia al tizón norteño de las hojas en la planta de maíz transformada en comparación . con los niveles de expresión en una planta de maíz silvestre con resistencia al tizón norteño de las hojas.

En otra modalidad la invención se refiere a un proceso para alterar el nivel de expresión de una proteina capaz de conferir resistencia al tizón norteño de las hojas en una planta de maíz; el proceso comprende: (a) transformar una célula vegetal de maíz con el constructo de ADN recombinante de la invención; y (b) regenerar la planta de maíz transformada a partir de la célula vegetal de maíz transformada; y (c) cultivar la planta de maíz transformada bajo condiciones adecuadas para la expresión del constructo de ADN recombinante, en donde la expresión del constructo de ADN recombinante resulta en la producción de niveles alterados de una proteina capaz de conferir resistencia al tizón norteño de las hojas en la planta de maíz transformada en comparación con los niveles de expresión en una planta de maiz silvestre con resistencia al tizón norteño de las hojas.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La presente invención se comprenderá con mayor facilidad a partir de la siguiente descripción detallada y de las figuras acompañantes, así como del listado de secuencias que forman parte de la presente solicitud. El listado de secuencias contiene el código de una sola letra para los caracteres de la secuencia de nucleótidos y los códigos de tres letras para los aminoácidos como se define de conformidad con los estándares de IUPAC-IUBMB descritos en Nucleic Acids Research 13:3021-3030 (1985) y en el Biochemical Journal 219 (núm. 2): 345-373 (1984), que se incorporan en la presente invención como referencia en su totalidad. Los símbolos y el formato que se usan para los datos de las secuencias nucleótidas y de aminoácidos cumplen con las reglas que se exponen en el Título 37 del C.F.R., §1.822.

La FIG. 1 muestra el arreglo del mapa físico de los BAC secuenciados (obtenidos de Maize Genome Sequencing Project) en la región 8 del cromosoma en donde se localiza un QTL asociado con el tizón norteño de las hojas. Se indican las posiciones de los marcadores descritos en la presente descripción, que pueden usarse para la selección asistida por marcador (MAS, por sus siglas en inglés) .

La FIG. 2 muestra el arreglo de los ARNm y marcos de lectura abiertos predichos por Fgenesh en un BAC PH26N anotado. Se indican los marcos de lectura abiertos predichos por Fgenesh NLB17 y NLB18, que representan las proteínas quinasa putativas.

La FIG. 3 muestra el diagrama usado como una guía para contabilizar la infección por tizón norteño de las hojas.

BREVE DESCRIPCIÓN DEL LISTADO DE SECUENCIAS Las descripciones y el listado de secuencias adjuntos a la presente cumplen las reglas que determinan las descripciones de secuencias de nucleótidos y/o de aminoácidos en solicitudes de patente como se exponen en 37 C.F.R. §1.821-1.825. El listado de secuencias contiene el código de una sola letra para los caracteres de la secuencia de nucleótidos y los códigos de tres letras para aminoácidos como se define de conformidad con los estándares de IUPAC-IUBMB descritos en Nucleic Acids Res. 13:3021-3030 (1985) y en Biochemical J. 219 (2):345-373 (1984) que se incorporan en la presente descripción como referencia. Los símbolos y el formato que se usan para los datos de las secuencias de nucleótidos y de aminoácidos cumplen las reglas que se exponen en 37 C.F. . §1.822.

La sec. con núm. de ident.:l es la secuencia del cebador directo PHM2798.

La sec. con núm. de ident.:2 es la secuencia del cebador inverso PH 2798.

La sec. con núm. de ident.:3 es la secuencia del cebador directo b0302Hl.

La sec. con núm. de ident . : 4 es la secuencia del cebador inverso b0302Hl.

La sec. con núm. de ident.: 5 es la secuencia del cebador directo b061lN13.

La sec. con núm. de ident.: 6 es la secuencia del cebador inverso b0611N13.

La sec. con núm. de ident .: es la secuencia del cebador directo 2717_3.

La sec. con núm. de ident .: 8 es la secuencia del cebador inverso 2717_3.

La sec. con núm. de ident.: 9 es la secuencia del cebador directo 2717_4.

La sec. con núm. de ident.: 10 es la secuencia del cebador inverso 2717_4.

La sec. con núm. de ident.: 11 es la secuencia del cebador directo 108fl6_2.

La sec. con núm. de ident.:12 es la secuencia del cebador inverso 108fl6_2.

La sec. con núm. de ident.:13 es la secuencia del cebador directo 31004.

La sec. con núm. de ident.:14 es la secuencia del cebador inverso 31004.

La sec. con núm. de ident.:15 es la secuencia del cebador directo pco642297_3.

La sec. con núm. de ident.:16 es la secuencia del cebador inverso pco642297_3.

La sec. con núm. de ident.:17 es la secuencia del cebador directo bl09.m6.

La sec. con núm. de ident.:18 es la secuencia del cebador inverso bl09.m6.

La sec. con núm. de ident.:19 es la secuencia del cebador directo PH 18979.

La sec. con núm. de ident.:20 es la secuencia del cebador inverso PHM18979.

La sec. con núm. de ident.:21 es la secuencia del cebador directo b0507L21.

La sec. con núm. de ident.:22 es la secuencia del cebador inverso b0507L21.

La sec. con núm. de ident . :23 es la secuencia del cebador directo 2 2.

La sec. con núm. de ident.:24 es la secuencia del cebador inverso 2_2.

La sec. con núm. de ident.:25 es la secuencia del cebador directo 156K16.

La sec. con núm. de ident.:26 es la secuencia del cebador inverso 156K16.

La sec. con núm. de ident.:27 es la secuencia del cebador directo b0318il3.

La sec. con núm. de ident.:28 es la secuencia del cebador inverso b0318il3.

La sec. con núm. de ident.:29 es la secuencia del cebador directo PHM4757.

La sec. con núm. de ident.:30 es la secuencia del cebador inverso PHM4757.

La sec. con núm. de ident.:31 es la secuencia del cebador directo NLB5A.

La sec. con núm. de ident.:32 es la secuencia del cebador inverso NLB5A.

La sec. con núm. de ident.:33 es la secuencia de la sonda NLB5A.

La sec. con núm. de ident.:34 es la secuencia del cebador directo NLB3A.

La sec. con núm. de ident.:35 es la secuencia del cebador inverso NLB3A.

La sec. con núm. de ident.:36 es la secuencia de la sonda NLB3A.

La sec. con núm. de ident. 37 es la secuencia del cebador directo PHM2817-26.

La sec. con núm. de ident. 38 es la secuencia del cebador inverso PHM2817-26.

La sec. con núm. de ident. 39 es la secuencia del cebador directo PHM7446-6.

La sec. con núm. de ident. 40 es la secuencia del cebador inverso PHM7446-6.

La sec. con núm. de ident. 41 es la secuencia del cebador directo PHM4582.

La sec. con núm. de ident. 42 es la secuencia del cebador inverso PHM4582.

La sec. con núm. de ident. 43 es la secuencia del cebador directo 9gl3-3.

La sec. con núm. de ident. 44 es la secuencia del cebador inverso 9gl3-3.

La sec. con núm. de ident. 45 es la secuencia del cebador directo K.

La sec. con núm. de ident. 46 es la secuencia del cebador inverso K.

La sec. con núm. de ident. 47 es la secuencia del cebador directo 6_7.

La sec. con núm. de ident. 48 es la secuencia del cebador inverso 6 7.

La sec. con núm. de ident 49 es la secuencia del cebador directo 6_8.

La sec. con núm. de ident 50 es la secuencia del cebador inverso 6_8.

La sec. con núm. de ident 51 es la secuencia del cebador directo N.

La sec. con núm. de ident 52 es la secuencia del cebador inverso N.

La sec. con núm. de ident 53 es la secuencia del cebador directo R.

La sec. con núm. de ident 54 es la secuencia del cebador inverso R.

La sec. con núm. de ident 55 es la secuencia del cebador directo S.

La sec. con núm. de ident 56. es la secuencia del cebador inverso S.

La sec. con núm. de ident 57 es la secuencia del cebador directo U.

La sec. con núm. de ident 58 es la secuencia del cebador inverso U.

La sec. con núm. de ident 59 es la secuencia del cebador directo PHM13395-16.

La sec. con núm. de ident 60 es la secuencia del cebador inverso PHM13395-16.

La sec. con núm. de ident 61 es la secuencia del cebador directo PHM3418-12.

La sec. con núm. de ident.:62 es la secuencia del cebador inverso PHM3418-12.

La sec. con núm. de ident.:63 es la secuencia del cebador directo PHM13395-27.

La sec. con núm. de ident.:64 es la secuencia del cebador inverso PHM13395-27.

La sec. con núm. de ident.:65 es la secuencia del cebador directo PHM 677-11.

La sec. con núm. de ident.:66 es la secuencia del cebador inverso PHM4677-11.

La sec. con núm. de ident.:67 es la secuencia del cebador directo PH 15992-3.

La sec. con núm. de ident.:68 es la secuencia del cebador inverso PH 15992-3.

La sec. con núm. de ident.:69 es la secuencia del cebador directo NLB17_A.

La sec. con núm. de ident.:70 es la secuencia del cebador inverso NLB17_A.

La sec. con núm. de ident.:71 es la secuencia del cebador directo NLB17_E.

La sec. con núm. de ident.:72 es la secuencia del cebador inverso NLB17_E.

La sec. con núm. de ident.:73 es la secuencia del cebador directo NLB17 3.

La sec. con núm. de ident.:74 es la secuencia del cebador inverso NLB17_3.

La sec. con núm. de ident.:75 es la secuencia del cebador directo NLB18_A.

La sec. con núm. de ident.:76 es la secuencia del cebador inverso NLB18_A.

La sec. con núm. de ident.:77 es la secuencia del cebador directo NLB18_E.

La sec. con núm. de ident.:78 es la secuencia del cebador inverso NLB18_E.

La sec. con núm. de ident.:79 es la secuencia de la cola adicionada a los cebadores F de los conjuntos marcadores NLB17 y NLB18.

La sec. con núm. de ident.:80 es la secuencia de la cola adicionada a los cebadores R de los conjuntos marcadores NLB17 y NLB18.

La sec. con núm. de ident.:81 es la secuencia de referencia PHM13395.

La sec. con núm. de ident.:82 es la secuencia de referencia PHM4677.

La sec. con núm. de ident.:83 es la secuencia de referencia PHM3418.

La sec. con núm. de ident.:84 es la secuencia de referencia PHM15992.

La sec. con núm. de ident.:85 es la secuencia de referencia PHM2817.

La sec. con núm. de ident.:86 es la secuencia de referencia PHM7446.

La sec. con núm. de ident.:87 es la secuencia de referencia NLB17_A.

La sec. con núm. de ident.:88 es la secuencia de referencia NLB17_E.

La sec. con núm. de ident.:89 es la secuencia de referencia NLB17_3.

La sec. con núm. de ident.:90 es la secuencia de referencia NLB18_A.

La sec. con núm. de ident.:91 es la secuencia de referencia NLB18_E.

La sec. con núm. de ident.:92 es la secuencia de ADNc NLB17 de PH26N.

La sec. con núm. de ident.:93 es la secuencia de aminoácidos de la proteina codificada por la sec. con núm. de ident . : 92.

La sec. con núm. de ident.: 94 es la secuencia de ADNc NLB18 de PH99N.

La sec. con núm. de ident.: 95 es la secuencia de aminoácidos de la proteina codificada por la sec. con núm. de ident . : 9 .

La sec. con núm. de ident. : 96 es la secuencia de ADNc NLB18 de PH26N.

La sec. con núm. de ident.:97 es la secuencia aminoácidos de la proteína codificada por la sec. con núm. ident . : 96.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La presente invención proporciona composiciones alélicas en el maíz y métodos para identificar y seleccionar plantas de maíz con resistencia mejorada al tizón norteño de las hojas. Las siguientes definiciones se proporcionan como una ayuda para comprender la presente invención.

El término "alelo" se refiere a una de dos o más secuencias de nucleótidos diferentes que ocurren en un locus específico .

"Frecuencia del alelo" se refiere a la frecuencia (proporción o porcentaje) en la que un alelo está presente en un locus dentro de un individuo, dentro de una línea, o dentro de una población de líneas. Por ejemplo, para un alelo "A", individuos diploides del genotipo "AA", "Aa", o "aa" tienen frecuencias de alelos de 1.0; 0.5; o 0.0, respectivamente. La frecuencia alélica dentro de una línea se puede calcular al promediar las frecuencias alélicas de una muestra de individuos de esa línea. Del mismo modo, la frecuencia alélica dentro de una población de líneas se puede calcular al promediar las frecuencias alélicas de las líneas que conforman la población. Para una población con una cantidad finita de individuos o lineas, una frecuencia alélica se puede expresar como un recuento de los individuos o lineas (o cualquier otra agrupación especifica) que contiene el alelo.

Un "amplicón" es un ácido nucleico amplificado, por ejemplo, un ácido nucleico que se produce por la amplificación de un ácido nucleico patrón por cualquier método de amplificación disponible (por ejemplo, PCR, LCR, transcripción, o similares).

El término "amplificar", en el contexto de la amplificación del ácido nucleico, es cualquier proceso por el cual se producen las copias adicionales de un ácido nucleico seleccionado (o una forma transcrita de este) . Los métodos de amplificación típicos incluyen varias polimerasas basados en los métodos de replicación, que incluyen la reacción en cadena de la polimerasa (PCR, por sus siglas en inglés) , métodos mediados por la ligasa tales como la reacción en cadena de la ligasa (LCR, por sus siglas en inglés) , y métodos de amplificación basados en el ARN (por ejemplo, por transcripción) .

El término "ensamblar" se aplica a un BAC y su propensión para unirse y formar tramos contiguos de ADN . Un BAC "se ensambla" a un contigo basado en un alineamiento de secuencia, si el BAC es secuenciado, o a través del alineamiento de su huella de BAC con respecto a las huellas de otros BAC . Los ensambles se pueden encontrar por medio del uso del Maize Genome Browser, que está disponible al público en internet.

Un alelo está "asociado con" un rasgo cuando está unido a este y cuando la presencia del alelo es un indicador que el rasgo deseado o forma del rasgo ocurrirá en una planta que comprende el alelo.

Un "BAC", o cromosoma artificial bacteriano, es un vector de clonación derivado del factor F de origen natural de Escherichia coli. Los BAC pueden aceptar insertos grandes de la secuencia de ADN. En el maíz, un número de BAC, o cromosomas artificiales bacterianos, cada uno con un inserto grande de ADN genómico de maíz, se agruparon en cóntigos (fragmentos genéticos contiguos de traslapamiento, o "ADN contiguo") .

El "retrocruzamiento" se refiere al proceso por el cual las progenies híbridas se retrocruzan repetidamente con uno de los genitores. En un esquema de retrocruzamiento, el genitor "donante" se refiere a la planta genitor con el gen deseado o locus a introgresar. El genitor "recipiente" (que se usa una o más veces) o genitor "recurrente" (que se usa dos o más veces) se refiere a la planta genitora en la cual el gen o locus se introgresa. Por ejemplo, ver Ragot, M. et al. (1995) Marker-assisted backcrossing : un ejemplo práctico, en Techniques et Utilisations des Marqueurs Moleculaires Les Colloques, Vol. 72, págs. 45-56, y Openshaw et al., (1994) Marker-assisted Selection en Backcross Breeding, Analysis of Molecular Marker Data, págs. 41-43. El cruce inicial da lugar a la generación de Fl; el término "BC1" se refiere entonces al segundo uso del genitor recurrente, "BC2" se refiere al tercer uso del genitor recurrente, y asi sucesivamente.

Un centimorgan ("cM") es una unidad de medida de la frecuencia de recombinación . Un cM es igual a una oportunidad de 1 % de que un marcador en un locus genético se separe de un marcador en un segundo locus debido al entrecruzamiento en una sola generación.

Como se usa en la presente descripción, el término "intervalo cromosómico" designa un tramo lineal contiguo de ADN genómico que reside en la planta en un solo cromosoma. Los elementos genéticos o genes localizados en un solo intervalo cromosómico están físicamente enlazados. El tamaño de un intervalo cromosómico no está particularmente limitado. En algunos aspectos los elementos genéticos localizados dentro de un solo intervalo cromosómico están genéticamente enlazados, típicamente, con una distancia de recombinación genética de, por ejemplo, menor o igual que 20 cM o, alternativamente, menor o igual que 10 cM. Esto es, dos elementos genéticos dentro de un solo intervalo cromosómico experimentan la recombinación a una frecuencia menor o igual que 20 % o 10 %.

Un "cromosoma" puede mencionarse también como un "grupo de enlace".

La frase "estrechamente enlazado", en la presente solicitud, significa que la recombinación entre dos loci enlazados se produce con una frecuencia igual a o menor que aproximadamente 10 % (es decir, se separan en un mapa genético por no más de 10 cM) . Dicho de otra manera, los loci estrechamente enlazados cosegregan al menos 90 % de las veces. Los loci marcadores son especialmente útiles en la presente invención cuando demuestran una probabilidad significativa de co-segregación (enlace) con un rasgo deseado (por ejemplo, resistencia patogénica) . Los loci estrechamente enlazados tales como un locus marcador y un segundo locus pueden exhibir una frecuencia de recombinación inter-locus de 10 % o menos, preferentemente, aproximadamente 9 % o menos, aún con mayor preferencia, aproximadamente 8 % o menos, aún con mayor preferencia, aproximadamente 7 % o menos, aún con mayor preferencia, aproximadamente 6 % o menos, aún con mayor-preferencia, aproximadamente 5 % o menos, aún con mayor preferencia, aproximadamente 4 % o menos, aún con mayor preferencia, aproximadamente 3 % o menos, y aún con mayor preferencia, aproximadamente 2 % o menos. En modalidades preferidas los loci relevantes exhiben una frecuencia de recombinación de aproximadamente 1 % o menos, por ejemplo, aproximadamente 0.75 % o menos, con mayor preferencia, aproximadamente 0.5 % o menos, o aún con mayor preferencia, aproximadamente 0.25 % o menos. Además, se dice que dos loci localizados en el mismo cromosoma y a tal distancia de modo que la recombinación entre ellos ocurra a una frecuencia menor que 10 % (por ejemplo, aproximadamente 9 %, 8 %, 7 %, 6 %, 5 %, 4 %, 3 %, 2 %, 1 %, 0.75 %, 0.5 %, 0.25 % o menor) son "proximales" entre si. En algunos casos, dos marcadores diferentes pueden tener las · mismas coordenadas del mapa genético. En ese caso, los dos marcadores están tan próximos uno a otro que se produce la recombinación entre ellos con tan baja frecuencia que es indetectable .

El término "complemento" se refiere a una secuencia de nucleótidos que es complementaria a un secuencia de nucleótidos determinada, es decir, las secuencias se relacionan por las reglas del apareamiento de base.

El término "ADN contiguo" se refiere a los fragmentos genéticos contiguos superpuestos.

Al referirse a la relación entre dos elementos genéticos, tales como un elemento genético que contribuye a la resistencia y un marcador proximal, el enlace de la fase de "acoplamiento" indica el estado en donde el alelo "favorable" en el locus de resistencia está físicamente asociado en la misma cadena cromosómica que el alelo "favorable" del locus marcador unido respectivo. En fase de acoplamiento ambos alelos favorables se heredan juntos por la progenie que hereda esa cadena cromosómica.

El término "cruzados" o "cruce" se refiere a la fusión de gametos mediante polinización para producir progenie (por ejemplo, células, semillas o plantas) . El término abarca tanto los cruces sexuales (la polinización de una planta por otra) y autofecundaciones (autopolinización, por ejemplo, cuando el polen y el óvulo son de la misma planta) . El término "cruzamiento" se refiere al acto de fusionar los gametos a través de la polinización para producir la progenie .

Una planta mencionada en la presente descripción como "diploide" tiene un conjunto apareado de cromosomas, en contraste con el "haploide" que tiene un conjunto sencillo de cromosomas .

Una planta conocida en la presente descripción como "doble haploide" se desarrolló mediante duplicación del conjunto de cromosomas. Una planta haploide doblada se considera una planta homocigota.

Una "linea élite" es cualquier línea que resulta del cultivo y selección para un rendimiento agronómico superior.

Como se usa en la presente descripción, los términos "que codifica" o "codificado", cuando se usan en el contexto de un ácido nucleico específico, se refiere a que el ácido nucleico comprende la información necesaria para dirigir la traducción de la secuencia nucleótida en una proteína específica. La información por la cual se codifica una proteína se especifica con el uso de codones . Un ácido nucleico que codifica una proteína puede comprender secuencias no traducidas (por ejemplo, intrones) dentro de las regiones traducidas del ácido nucleico o puede carecer de tales secuencias no traducidas intermedias (por ejemplo, como en ADNc) .

Una "cepa exótica de maíz" o un "germoplasma exótico de maíz" es una cepa o germoplasma derivado de un maíz que no pertenece a una línea o cepa élite disponible de germoplasma. En el contexto de un cruce entre dos plantas o cepas de germoplasma de maíz, un germoplasma exótico no se relaciona estrechamente por descendencia con el germoplasma élite con el cual se cruza. Más comúnmente, el germoplasma exótico no se deriva de ninguna línea élite de maíz conocida, sino se selecciona para introducir elementos genéticos novedosos (típicamente, alelos novedosos) en un programa de cultivo.

Un "alelo favorable" es el alelo en un locus particular que confiere, o contribuye a, un fenotipo agronómicamente deseable, por ejemplo, resistencia mejorada al tizón norteño de las hojas, y que permite la identificación de las plantas con ese fenotipo agronómicamente deseable. Un alelo favorable de un marcador es un alelo marcador que segrega con el fenotipo favorable.

"Fragmento" significa una porción de una secuencia de nucleótidos. Los fragmentos se pueden usar como sondas de hibridación o cebadores PCR por medio del uso de los métodos descritos en la presente descripción.

Un "mapa genético" es una descripción de las relaciones del enlace genético entre los loci en uno o más cromosomas (o cromosomas) dentro de un especie dada, representada, generalmente, en una forma diagramática o tabular. Para cada mapa genético, las distancias entre los loci se miden mediante las frecuencias de recombinación entre ellos, y las recombinaciones entre los loci pueden detectarse por medio del uso de una variedad de marcadores. Un mapa genético es un producto de la población de mapeo, los tipos de marcadores usados, y el potencial polimórfico de cada marcador entre poblaciones diferentes. El orden y las distancias genéticas entre los loci pueden diferir de un mapa genético a otro. Por ejemplo, 10 cM en el mapa genético derivado internamente (también conocido en la presente como " HB" para Pioneer Hi-Bred) es aproximadamente equivalente a 25-30 cM en el mapa de marco IB 2 2005 vecinos (un mapa de alta resolución disponible en maizeGDB) . Sin embargo, la información se puede correlacionar de un mapa a otro con el uso de un esquema general de los marcadores comunes. Una persona con experiencia en la técnica puede usar un marco de los marcadores comunes para identificar las posiciones de los marcadores y loci de interés en cada mapa genético individual .

Un "sitio en el mapa genético" es un sitio en un mapa genético con relación a los marcadores genéticos alrededor del mismo grupo de enlace, en donde se puede encontrar un marcador especifico en una especie especifica.

El "mapeo genético" es el proceso de definir la relación de enlace de los loci a través del uso de marcadores genéticos, poblaciones que se segregan para los marcadores, y principios genéticos estándares de la frecuencia de recombinación.

"Los marcadores genéticos" son los ácido nucleicos que son polimorficos en una población y donde los alelos de estos pueden detectarse y distinguirse por uno o más métodos analíticos, por ejemplo, RFLP, AFLP, isoenzima, SNP, SSR, y similares. El término se refiere, además, a secuencias de ácido nucleico complementarias a las secuencias genómicas, tales como los ácidos nucleicos que se usan como sondas. Los marcadores correspondientes a los polimorfismos alélicos entre los miembros de una población se pueden detectar mediante métodos bien establecidos en la técnica. Estos incluyen, por ejemplo, los métodos de amplificación específica de secuencia basados en la PCR, detección del polimorfismo de la longitud de fragmentos de restricción (RFLP, por sus siglas en inglés) , detección de marcadores de isoenzimas, detección de polimorfismos de polinucleótidos por hibridación especifica del alelo (ASH, por sus siglas en inglés), detección de las secuencias variables amplificadas del genoma de la planta, detección de la replicación de la secuencia auto sostenida, detección de repeticiones de secuencia simple (SSR, por sus siglas en inglés), detección de polimorfismos de un solo nucleótido (SNP, por sus siglas en inglés), o detección del polimorfismo de la longitud de fragmentos amplificados. (AFLP, por sus siglas en inglés). Los métodos establecidos son también conocidos para la detección de etiquetas de secuencia expresada (EST, por sus siglas en inglés) y marcadores SSR derivados de las secuencias EST y ADN polimórfico amplificado al azar (RAPD, por sus siglas en inglés) .

La "frecuencia de recombinación genética" es la frecuencia de un evento de entrecruzamiento (recombinación) entre dos loci genéticos. La frecuencia de recombinación se puede observar mediante el seguimiento de la segregación de los marcadores y/o rasgos después de la meiosis.

"Genoma" se refiere al ADN total, o todo el conjunto de genes, portado por un cromosoma o conjunto de cromosomas.

El término "genotipo" es la constitución genética de un individuo (o grupo de individuos) en uno o más loci genéticos, en contraste con el rasgo observable (el fenotipo) . El genotipo está definido por el o los 1 alelos de uno o más Joci conocidos que el individuo ha heredado de sus progenitores. El término genotipo se puede usar para referirse a la constitución genética de un individuo en un solo locus, en múltiples loci o, más generalmente, el término genotipo se puede usar para referirse a la composición genética de un individuo para todos los genes en su genoma.

"Germoplasma" se refiere al material genético de o desde un individuo (por ejemplo, una planta) , un grupo de individuos (por ejemplo, una linea, variedad o familia de plantas) o un clon derivado de una linea, variedad, especie o cultivo. El germoplasma puede ser parte de un organismo o célula o puede estar separado del organismo o célula. Generalmente, el germoplasma proporciona material genético con una composición molecular especifica que proporciona una base física para algunas o todas las cualidades hereditarias de un organismo o cultivo celular. Como se usa en la presente invención, el germoplasma incluye células, semillas o tejidos de los cuales se puede cultivar plantas o partes de plantas, tales como hojas, tallos, polen o células que se pueden cultivar para obtener una planta completa.

Una planta mencionada como un "haploide" tiene un solo conjunto (genoma) de cromosomas.

Un "haplotipo" es el genotipo de un individuo en una pluralidad de loci genéticos, es decir, una combinación de alelos. Típicamente, los loci genéticos descritos por un haplotipo están física y genéticamente unidos, es decir, en el mismo segmento cromosómico. El término "haplotipo" puede referirse a polimorfismos en un locus particular, tales como un solo locus marcador, o polimorfismos en múltiples Joci a lo largo de un segmento cromosómico. El primero puede mencionarse, además, como "haplotipos marcadores" o "alelos marcadores", mientras que el último puede referirse como "haplotipos de intervalo largo".

El término "heterogeneidad" se usa para indicar que individuos de un grupo difieren en el genotipo en uno o más loci diferentes.

Un "grupo heterótico" comprende un conjunto de genotipos que se desempeñan bien cuando se cruzan con genotipos de un grupo heterótico diferente (Hallauer et al. (1998) Corn breeding, págs . 463-564. En G.F. Sprague y J. . Dudley (ed.) Corn and corn improve ent) . Las lineas endogámicas se clasifican en grupo heteróticos y se subdividen, además, en familias con un grupo heterótico, basado en muchos criterios tales como pedigri, asociaciones basadas en el marcador molecular, y el desempeño en combinaciones híbridas (Smith et al. (1990) Theor. Appl . Gen. 80:833-840) . Los dos grupo heteróticos más ampliamente usados en los Estados Unidos se mencionan como "Iowa Stiff Stalk Synthetic" (BSSS) y "Lancaster" o "Lancaster Sure Crop" (algunas veces mencionado como NSS, o no tallo derecho) .

El término "heterocigoto" significa una condición genética, en donde alelos diferentes residen en el loci correspondiente en cromosomas homólogos.

El término "homogeneidad" indica que miembros de un grupo tienen el mismo genotipo en uno o más loci diferentes.

El término "homocigoto" significa una condición genética, en donde alelos idénticos residen en el loci correspondiente en cromosomas homólogos.

El término "híbrido" se refiere a la progenie obtenida entre el cruce de al menos dos genitores genéticamente no similares .

"Hibridación" o "hibridación del ácido nucleico" se refiere al apareamiento de las cadenas de ARN y ADN complementarias así como el apareamiento de cadenas simples de ADN complementarias.

El término "hibridar" significa formar pares de base entre las regiones complementarias de las cadenas de ácido nucleico .

Un "mapa genético IBM" puede referirse a cualquiera de los siguientes mapas: IBM, IBM2, vecinos IBM2, IBM2 E C0507, vecinos IBM2 2004, IBM2 2005 vecinos, marco vecino IBM2 2005, vecinos IBM2 2008, marco vecino IBM2 2008, o la última versión en el sitio web maizeGDB. Los mapas genéticos IBM se basan en una población B73 x Mol7 en la cual la progenie del cruce inicial se aparearon aleatoriamente por múltiples generaciones antes de construir las líneas endogámicas recombinantes para el mapeo. Las versiones más nuevas reflejan la adición de loci mapeados BAC y genéticos así como el refinamiento del mapa mejorado debido a la incorporación de la información obtenida a partir de otros mapas físicos o genéticos, los datos limpios, o el uso de nuevos algoritmos para producir los mapas compuestos a partir de mapas individuales .

El término "endogámico" se refiere a una línea que se produjo para homogeneidad genética.

El término "indel" se refiere a una inserción o deleción, en donde una línea se puede referir con una inserción en relación con la segunda línea, o la segunda línea se puede referir con una deleción en relación con la primera línea.

El término "introgresión" se refiere a la transmisión de un alelo deseado de un locus genético de un trasfondo genético a otro. Por ejemplo, la introgresión de un alelo deseado en un locus específico se puede transmitir a al menos una progenie por medio de un cruce sexual entre dos progenitores de la misma especie, en donde al menos uno de los progenitores tiene el alelo deseado en su genoma. Alternativamente, por ejemplo, la transmisión de un alelo puede ocurrir mediante la recombinación entre dos genomas donantes, por ejemplo, en un protoplasto fusionado, en donde al menos uno de los protoplastos donantes tiene el alelo deseado en su genoma. El alelo deseado puede ser, por ejemplo, un alelo seleccionado de un marcador, un QTL, un transgén o similares. En cualquier caso la progenie que comprende el alelo deseado se puede retrocruzar repetidamente a una linea con un trasfondo genético deseado y seleccionar para el alelo deseado, para obtener el alelo arreglado en un trasfondo genético seleccionado. Por ejemplo, el locus del cromosoma 2 descrito en la presente descripción se puede introgresar en un progenitor recurrente que no es resistente o solo parcialmente resistente a Et y/o al tizón norteño de las hojas. La línea progenitora recurrente con el locus o gen introgresado tiene entonces resistencia mejorada a Et y/o tizón norteño de las hojas.

El proceso de "introgresión" se menciona, frecuentemente, como "retrocruzamiento" cuando el proceso se repite dos o más veces.

Una "linea" o "cepa" es un grupo de individuos de familia idéntica que son, generalmente, endogámicos en cierto grado y, generalmente, homocigotos y homogéneos en la mayoría de loci (isogénicos o casi isogénicos) . Una "sublínea" se refiere a un subgrupo endogámico de descendientes genéticamente distintos a otros subgrupos igualmente endogámicos descendientes del mismo progenitor.

Como se usa en la presente descripción, el término "enlace" se usa para describir el grado con el cual un locus marcador se asocia con otro locus marcador o algún otro locus (por ejemplo, un locus con resistencia al norteño de las hojas) . La relación del enlace entre un marcador molecular y un fenotipo se da como una "probabilidad" o "probabilidad ajustada". El ¦ enlace se puede expresar como un limite o intervalo deseado. Por ejemplo, en algunas modalidades, cualquier marcador se une (genética y físicamente) a cualquier otro marcador cuando los marcadores están separados por menos de 50, 40, 30, 25, 20 o 15 unidades de mapeo (o cM) . En algunos aspectos es ventajoso definir un intervalo o enlace entre paréntesis, por ejemplo, entre 10 y 20 cM, entre 10 y 30 cM, o entre 10 y 40 cM. Mientras más estrechamente un marcador se enlace a un segundo locus, será un mejor indicador para el segundo locus de ese marcador. Así, los "loci estrechamente enlazados" tales como un locus marcador y un segundo locus exhiben una frecuencia de recombinación inter-locus de 10 % o menos, preferentemente, aproximadamente 9 % o menos, aún con mayor preferencia, aproximadamente 8 % o menos, aún con mayor preferencia, aproximadamente 7 % o menos, aún con mayor preferencia, aproximadamente 6 % o menos, todavía con mayor preferencia, aproximadamente 5 % o menos, aún con mayor preferencia, aproximadamente 4 % o menos, aún con mayor preferencia, aproximadamente 3 % o menos y, aún con mayor preferencia, aproximadamente 2 % o menos. En modalidades muy preferidas los loci relevantes exhiben una frecuencia de recombinación de aproximadamente 1 % o menos, por ejemplo, aproximadamente 0.75 % o menos, con mayor preferencia, aproximadamente 0.5 % o menos, o aún con mayor preferencia, aproximadamente 0.25 % o menos. Además, se dice que dos loci localizados en el mismo cromosoma y a tal distancia de modo que la recombinación entre ellos ocurra a una frecuencia menor que 10 % (por ejemplo, aproximadamente 9 %, 8 %, 7 %, 6 %, 5 %, 4 %, 3 %, 2 %, 1 %, 0.75 %, 0.5 %, 0.25 % o menor) son "proximales" entre si. Ya que un cM es la distancia entre dos marcadores que muestra una frecuencia de recombinación de 1 %, cualquier marcador se enlaza estrechamente (genética y físicamente) a cualquier otro marcador que esté muy próximo, por ejemplo, a o menos de 10 cM de distancia. Dos marcadores estrechamente enlazados en el mismo cromosoma se pueden posicionar 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1, 0.75, 0.5 o 0.25 cM o menos entre sí.

El término "desequilibrio de enlace" se refiere a una segregación no aleatoria de los loci o rasgos genéticos (o ambos). En cualquier caso, el desequilibrio de enlace implica que los loci relevantes se encuentran con suficiente proximidad física a lo largo de un cromosoma, de modo que se segregan juntos con una frecuencia mayor que la aleatoria (es decir, no aleatoria) (en el caso de los rasgos de cosegregación, los Joci en los que se basan los rasgos se encuentran con suficiente proximidad entre sí). Los marcadores que muestran desequilibrio de enlace se consideran unidos. Los Joci unidos cosegregan más del 50 % del tiempo, por ejemplo, de aproximadamente 51 % a aproximadamente 100 % del tiempo. En otras palabras, dos marcadores que cosegregan tienen una frecuencia de recombinación de menos de 50 % (y por definición, se separan al menos 50 c en el mismo cromosoma.) Como se usa en la presente descripción, el enlace puede ser entre dos marcadores o, alternativamente, entre un marcador y un fenotipo. Un marcador locus se puede "asociar con" (enlazar a) un rasgo, por ejemplo, resistencia al tizón norteño de las hojas. El grado de enlace de un marcador molecular a un rasgo fenotipico se determina, por ejemplo, como una probabilidad estadística de cosegregación de ese marcador molecular con el fenotipo.

El desequilibrio de enlace se evalúa más comúnmente con el uso de la medida r2, que se calcula con la fórmula descrita por Hill, W.G. y Robertson, A, Theor. Appl. Genet. 38:226-231(1968). Cuando r2 = 1, el DE completo existe entre los dos loci marcadores, lo que significa que los marcadores no se separan por recombinación y tienen la misma frecuencia del alelo. Los valores para r2 anteriores de 1/3 indican un DE suficientemente fuerte para ser útiles para el mapeo (Ardlie et al., Nature Reviews Genetics 3:299-309 (2002)). De ahí que los alelos están en desequilibrio de enlace cuando los valores de r2 entre los loci marcadores pareados son mayores o iguales que 0.33, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, o 1.0.

Como se usa en la presente descripción, "equilibrio de enlace" describe una situación en donde dos marcadores independientemente se segregan, es decir, se clasifican entre la progenie al azar. Los marcadores que muestran equilibrio de enlace se consideran no unidos (ya sea que estén o no en el mismo cromosoma) .

Un "locus" es una posición en un cromosoma en donde se localiza un gen o marcador.

El "logaritmo del valor de probabilidades (LOD) " o "puntuación LOD" (Risch, Science 255:803-804 (1992)) se usó como un mapeo del intervalo para describir el grado de enlace entre dos loci marcadores. Una puntuación LOD de tres entre dos marcadores indica que el enlace es 1000 veces más probable que el no enlace, mientras que una puntuación LOD de dos indica que el enlace es 100 veces más probable que el no enlace. Las puntuaciones LOD mayores que o iguales a dos se pueden usar para detectar el enlace.

"Maíz" se refiere a una planta de Zea mays L. sesp. mays y se conoce como "elote".

El término "planta de maíz" incluye: las plantas completas de maíz, células vegetales de maíz, protoplasto vegetal de maíz, célula vegetal de maíz o cultivo de tejido de maíz a partir del cual las plantas de maíz pueden regenerarse, callos de la planta de maíz, y células vegetales de maíz que están intactas en las plantas de maíz o partes de las plantas de maíz, tales como semillas de maíz, mazorca de maíz, flores de maíz, cotiledones de maíz, hojas de maíz, tallos de maíz, yemas de maíz, raíces del maíz, puntas radiculares del maíz y similares.

Un "marcador" es una secuencia de nucleótidos o producto codificado de esta (por ejemplo, una proteína) que se usa como un punto de referencia. Para que los marcadores sean útiles en las recombinaciones de detección, necesitan detectar las diferencias, o polimorfismos, dentro de la población que se monitorea. Para los marcadores moleculares, esto significa diferencias al nivel de ADN debido a las diferencias de la secuencia de polinucleótidos (por ejemplo, SSR, RFLP, FLP, y SNP) . La variabilidad genómica puede ser de cualquier origen, por ejemplo, inserciones, deleciones, duplicaciones, elementos repetitivos, mutaciones puntuales, eventos de recombinación, o la presencia y secuencia de elementos transponibles . Los marcadores moleculares pueden derivarse de los genómicos o ácidos nucleicos expresados (por ejemplo, EST) y pueden referirse a los ácido nucleicos usados como sonda o pares de cebadores capaces de amplificar los fragmentos de secuencia a través del uso de métodos basados en la PCR. Un gran número de marcadores moleculares del maíz se conocen en la técnica, y son publicados o disponibles a partir de varias fuentes, tales como el recurso de internet Maize GDB y el recurso de internet del Arizona Genomics Institute corren por la University of Arizona.

Los marcadores correspondientes a los polimorfismos alélicos entre los miembros de una población se pueden detectar mediante métodos bien establecidos en la técnica. Estos incluyen, por ejemplo, secuenciación de ADN, métodos de amplificación especifica de secuencia basada en PCR, detección de polimorfismos de longitud de fragmentos de restricción (RFLP, por sus siglas en inglés) , detección de marcadores de isozima, detección de polimorfismos polinucleótidos mediante hibridación especifica de alelo (ASH, por sus siglas en inglés), detección de secuencias variables amplificadas del genoma de la planta, detección de replicación de secuencia autosostenida, detección de repeticiones de secuencia simple (SSR, por sus siglas en inglés) , detección de polimorfismos de un solo nucleótido (SNP, por sus siglas en inglés) o detección de polimorfismos de la longitud de fragmentos amplificados (AFLP, por sus siglas en inglés) . Los métodos bien establecidos también son conocidos para la detección de etiquetas de secuencia expresada (EST, por sus siglas en inglés) y marcadores de SSR derivados de secuencias EST y ADN polimórfico amplificado aleatoriamente (RAPD, por sus siglas en inglés).

Un "alelo marcador", alternativamente, un "alelo de un locus marcador", se puede referir a uno de una gran variedad de secuencias nucleótidas polimórficas que se encuentran en un locus marcador en una población que es polimórfica para el locus marcador.

La "selección asistida por marcador" (o MAS, por sus siglas en inglés) es un proceso por el cual los fenotipos se seleccionan en base a los genotipos marcadores.

La "contra-selección asistida por marcador" es un proceso por el cual los genotipos marcadores se usan para identificar las plantas que no se seleccionarán, permitiéndoles ser eliminadas de un programa de cultivo o plantación .

Un "marcador haplotipo" se refiere a un combinación de alelos en un locus marcador.

¦ Un "locus marcador" es un lugar del cromosoma especifico en el genoma de una especie en donde se puede encontrar un marcador especifico. Un locus marcador se puede usar para rastrear la presencia de un segundo locus enlazado, por ejemplo, un locus enlazado que codifica o contribuye a la expresión de un rasgo fenotipico. Por ejemplo, un locus marcador puede usarse para monitorear la segregación de alelos en un locus, tal como un QTL o un solo gen, que están genéticamente o físicamente enlazados al locus marcador.

Una "sonda marcadora" es una secuencia o molécula de ácido nucleico que se puede usar para identificar la presencia de un locus marcador, por ejemplo, una sonda de ácido nucleico complementaria a una secuencia del locus marcador, a través de hibridación de ácido nucleico. Las sondas marcadoras que comprenden 30 o más nucleótidos contiguos del locus marcador ("toda o una porción" de la secuencia del locus marcador) se pueden usar para hibridación de ácido nucleico. Alternativamente, en algunos aspectos, una sonda marcadora se refiere a una sonda de cualquier tipo que tenga la capacidad de distinguir (es decir, genotipar) el alelo particular presente en un locus marcador.

El término "marcador molecular" puede usarse para referirse a un marcador genético, como se definió anteriormente, o un producto codificado de este (por ejemplo, una proteina) usada como un punto de referencia cuando se identifica un locus enlazado. Un marcador se puede derivar de secuencias de nucleótidos genómicas o de secuencias de nucleótidos expresados (por ejemplo, de un ARN empalmado o un ADNc) o de un polipéptido codificado. El término se refiere, además, a secuencias de ácido nucleico complementarias a o que flanquean las secuencias marcadoras, tales como ácidos nucleicos que se usan como sondas o pares de cebadores con la capacidad de amplificar la secuencia marcadora. Una "sonda marcadora molecular" es una secuencia o molécula de ácido nucleico que puede usarse para identificar la presencia de un locus marcador, por ejemplo, una sonda de ácido nucleico que es complementaria a una secuencia de locus marcador. Alternativamente, en algunos aspectos, una sonda marcadora se refiere a una sonda de cualquier tipo que tiene la capacidad de distinguir (es decir, genotipar) el alelo particular presente en un locus marcador. Los ácidos nucleicos son "complementarios" cuando específicamente se hibridizan en solución, por ejemplo, de acuerdo con las reglas de apareamiento de bases de Watson-Crick. Algunos de los marcadores descritos en la presente descripción se denominan, además, marcadores de hibridización cuando se localizan en una región indel, tal como la región no colineal descrita en la presente descripción. Esto se debe a que la región de inserción es, por definición, un polimorfismo frente a una planta sin la inserción. Así, el marcador necesita solamente indicar si la región indel está presente o ausente. Cualquier tecnología de detección de marcador adecuada puede usarse para identificar tal marcador de hibridación, por ejemplo, la tecnología SNP se usa en los ejemplos proporcionados en la presente descripción.

Un alelo correlaciona "negativamente" con un rasgo cuando se une a este y cuando la presencia del alelo es un indicador de que un rasgo deseado o forma del rasgo no ocurrirá en una planta que comprenda el alelo.

Los términos "secuencia nucleótida", "polinucleótido", "secuencia de ácido nucleico" y "fragmento de ácido nucleico" se usan indistintamente y se refieren a un polímero de ARN o ADN mono o bicatenario que contiene, opcionalmente, bases de nucleótidos sintéticas, no naturales o alteradas. Un "nucleótido" es una unidad monomérica a partir de la cual se construyen los polímeros de ADN o ARN, y consiste en una base purina o pirimidina, una pentosa, y un grupo de ácido fosfórico. Se hace referencia a los nucleótidos (habitualmente encontrados en su forma 5 ' -monofosfato) mediante su designación con una sola letra, de la siguiente manera: "A" para adenilato o desoxiadenilato para el ARN o ADN, respectivamente) , "C" para citidilato o desoxicitidilato, "G" para guanilato o desoxiguanilato, "U" para uridilato, "T" para desoxitimidilato, "R" para purinas (A o G) , "Y" para pirimidinas (C o T) , "K" para G o T, "H" para A, C o T, "I" para inosina y "N" para cualquier nucleótido .

Los términos "fenotipo", "rasgo fenotípico" o "rasgo" se refiere a uno o más rasgos de un organismo. El fenotipo se puede observar a simple vista o mediante cualquier otro medio de evaluación conocido en la técnica, por ejemplo, microscopía, análisis bioquímico o un ensayo electromecánico. En algunos casos, un fenotipo se controla directamente por un solo gen o locus genético, es decir, un "solo rasgo de genes". En otros casos, un fenotipo es el resultado de muchos genes .

Un "mapa físico" del genoma es un mapa que muestra el orden lineal de puntos de referencia identificables (que incluyen genes, marcadores, etc.) en el ADN cromosómico. Sin embargo, en contraste con los mapas genéticos, las distancias entre los puntos de referencia son absolutas (por ejemplo, se miden en pares de bases y fragmentos genéticos contiguos aislados y traslapados) y no en base a la recombinación genética .

Una "planta" puede ser una planta completa, cualquier parte de esta o un cultivo celular o tisular derivado de una planta. Asi, el término "planta" puede referirse a cualquiera de los siguientes: plantas completas, componentes de la planta u órganos (por ejemplo, hojas, tallos, raíces, etc.), tejidos vegetales, semillas, células vegetales, y/o la progenie de esta. Una célula vegetal es una célula de una planta, tomada de una planta o derivada a través del cultivo de una célula tomada de una planta.

Un "polimorfismo" es una variación en el ADN que es muy común para deberse meramente a una nueva mutación. Un polimorfismo debe tener una frecuencia de al menos 1 % en una población. Un polimorfismo puede ser un solo polimorfismo de nucleótido, o SNP, o un polimorfismo de inserción/deleción, también mencionado en la presente como un "indel".

Los términos "polipéptido" , "péptido" y "proteína" se usan indistintamente en la presente descripción para referirse a un polímero de residuos de aminoácidos. Los términos se aplican a polímeros de aminoácidos, en donde uno o más residuos de aminoácidos son un análogo químico artificial de un aminoácido correspondiente de origen natural, así como a polímeros de aminoácidos de origen natural. Los polipéptidos de las modalidades se pueden producir ya sea de un ácido nucleico descrito en la presente invención o mediante el uso de técnicas de biología molecular estándar. Por ejemplo, una proteína truncada de las modalidades se puede producir mediante la expresión de un ácido nucleico recombinante de las modalidades en una célula huésped adecuada o, alternativamente, mediante una combinación de procedimientos ex vivo, tales como la digestión y purificación de proteasas.

Un alelo correlaciona "positivamente" con un rasgo cuando se une a este y cuando la presencia del alelo es un indicador de que el rasgo o forma del rasgo ocurrirá en una planta que comprenda el alelo.

El valor de "probabilidad" o "valor p" es la probabilidad estadística de que la combinación particular de un fenotipo y la presencia o ausencia de un alelo marcador particular sea aleatoria. Así, mientras menor es el puntaje de probabilidad, mayor es la probabilidad de que un fenotipo y un marcador particular se cosegreguen. En algunos aspectos, el puntaje de probabilidad se considera "significante" o "insignificante". En algunas modalidades, un puntaje de probabilidad de 0.05 (p=0.05 o una probabilidad de 5 %) de la distribución aleatoria se considera un indicio significante de cosegregación . Sin embargo, una probabilidad aceptable puede ser cualquier probabilidad menor que 50 % (p=0.5). Por ejemplo, una probabilidad significante puede ser menor que 0.25, menor que 0.20, menor que 0.15, menor que 0.1, menor que 0.05, menor que 0.01 o menor que 0.001.

Un "marcador de producción" o "marcador SNP de producción" es un marcador que se desarrolló para propósitos de gran productividad. Los marcadores SNP de producción se desarrollan para detectar los polimorfismos específicos y se diseñan para usar con una variedad de químicas y plataformas. Los nombres de los marcadores usados aquí comienzan con un prefijo PHM para denotar el ^marcador híbrido pionero', seguido por un número que es específico para la secuencia de la cual se diseñó, seguido por a o a "-" y después un sufijo que es específico para el polimorfismo de ADN. Una versión del marcador puede, además, seguir (A, B, C, etc.), que denota la versión del marcador diseñado para ese polimorfismo específico.

El término "progenie" se refiere a las crías generadas de un cruce .

Una "planta progenie" se genera de un cruce entre dos plantas .

El término "locus de rasgo cuantitativo" o "QTL" (por sus siglas en inglés) se refiere a un locus genético polimórfico con al menos un alelo que se correlaciona con la expresión diferencial de un rasgo fenotipico en al menos un fondo genético, por ejemplo, en al menos una población de cultivo o progenie. Un QTL puede actuar a través de un solo mecanismo génico o por un mecanismo poligénico.

Una "secuencia de referencia" es una secuencia definida que se usa como una base para la comparación de la secuencia. La secuencia de referencia se obtiene por el genotipado de un número de lineas en el locus, que alinean la secuencia de nucleótidos en un programa de alineamiento de la secuencia (por ejemplo, Sequencher) y, después, se obtiene la secuencia de consenso del alineamiento. De ahí que una secuencia de referencia identifica los polimorfismos en los alelos en un locus . Una secuencia de referencia puede no ser una copia de una secuencia de ADN real; sin embargo, es útil para diseñar cebadores y sondas para polimorfismos reales en el locus.

En el enlace de la fase de "repulsión", el alelo "favorable" en el locus de interés se une físicamente con un alelo "desfavorable" en el locus marcador proximal y los dos alelos "favorables" no se heredan juntos (es decir, los dos loci están "fuera de fase" uno del otro) .

Un "cruce de prueba" es una prueba de la progenie derivada del cruzamiento de cada progenitor con el mismo espécimen de prueba, usualmente, una línea homocigota. El progenitor que se examina puede ser una variedad de polinización abierta, un cruce o una línea endogámica.

Las alineaciones de secuencias y los cálculos del porcentaje de identidad se . pueden determinar mediante varios métodos de comparación diseñados para detectar secuencias homologas que incluyen, pero no se limitan a, el programa Megalign® del paquete integrado para bioinformática LASERGENE® (ADNSTAR® Inc., adison, WI) . A menos que se indicara de otra manera, se realizó múltiples alineamientos de las secuencias proporcionadas en la presente descripción con el uso del método de alineamiento Clustal V (Higgins and Sharp, CABIOS. 5:151-153 (1989)) con los parámetros predeterminados ( PENALIZACION DE INTERRUPCIÓN=10 , PENALIZACION DE LONGITUD DE INTERRUPCIÓN=10 ) . Los parámetros predeterminados para alineamientos en pares y cálculo del porcentaje de identidad de las secuencias de proteínas con el uso del método Clustal V son KTUPLE=1, PENALIZACION DE INTERRUPCIÓN=3, VENTANA=5 y DIAGONALES GUARDADAS=5. En el caso de los ácidos nucleicos, estos parámetros son KTUPLE=2, PENALIZACION DE INTERRUPCIÓN=5 , VENTANA=4 y DIAGONALES GUARDADAS=4. Después del alineamiento de las secuencias por medio del uso del programa Clustal V, es posible obtener los valores de "porcentaje de identidad" y "divergencia" al ver la tabla de "distancias de la secuencia" en el mismo programa; A menos que se indique de otra manera, los porcentajes de identidad y divergencias proporcionadas y reivindicadas en la presente se calcularon de esta manera.

Un "alelo desfavorable" de un marcador es un alelo marcador que segrega con el fenotipo de planta desfavorable, lo que proporciona, por lo tanto, el beneficio de identificar plantas que pueden eliminarse de un programa de cultivo o plantación .

El término "rendimiento" se refiere a la productividad por unidad de área de un producto vegetal particular de valor comercial. Por ejemplo, el rendimiento del maíz se mide comúnmente en fanegas de semilla por acre o toneladas métricas de semilla por hectárea por estación. El rendimiento es afectado tanto por factores genéticos y ambientales. "Agronómicos", "rasgos agronómicos", y "rendimiento agronómico" se refieren a los rasgos (y elementos genéticos subyacentes) de una variedad vegetal dada que contribuyen a producir durante la temporada de crecimiento. Los rasgos agronómicos del individuo incluyen vigor de emergencia, vigor vegetativo, tolerancia a la tensión, resistencia o tolerancia a las enfermedades, resistencia herbicida, ramificación, florecimiento, fijación de la semilla, tamaño de la semilla, densidad de la semilla, estandarización, capacidad de trillado, y similares. El rendimiento es, por lo tanto, la culminación final de todos los rasgos agronómicos.

Las alineaciones de secuencias y los cálculos del porcentaje de identidad se pueden determinar mediante varios métodos de comparación diseñados para detectar secuencias homologas que incluyen, pero no se limitan a, el programa Megalign® del paquete integrado para bioinformática LASERGENE® (ADNSTAR® Inc., Madison, WI). A menos que se indicara de otra manera, se realizó múltiples alineamientos de las secuencias proporcionadas en la presente descripción con el uso del método de alineamiento Clustal V (Higgins and Sharp, CABIOS. 5:151 153 (1989)) con los parámetros predeterminados ( PENALIZACIÓN DE INTERRUPCIÓN=10 , PENALIZACION DE LONGITUD DE INTERRUPCIÓN=10 ) . Los parámetros predeterminados para alineamientos en pares y cálculo del porcentaje de identidad de las secuencias de proteínas con el uso del método Clustal V son KTUPLE=1, PENALIZACIÓN DE INTERRUPCIÓN=3, VENTANA=5 y DIAGONALES GUARDADAS=5. En el caso de los ácidos nucleicos, estos parámetros son KTUPLE=2, PENALIZACIÓN DE INTERRUPCIÓN=5 , VENTANA=4 y DIAGONALES GUARDADAS=4. Después del alineamiento de las secuencias por medio del uso del programa Clustal V, es posible obtener los valores de "porcentaje de identidad" y "divergencia" al ver la tabla de "distancias de la secuencia" en el mismo programa; A menos que se indique de otra manera, los porcentajes de identidad y divergencias proporcionadas y reivindicadas en la presente se calcularon de esta manera.

Las técnicas estándar de clonación molecular y de DNA recombinante usadas en la presente son conocidas en la técnica y se describen con mayor detalle en Sambrook, J. , Fritsch, E.F. and Maniatis, T. Clonación molecular: A Laboratory Manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press: Cold Spring Harbor, 1989 (de aquí en adelante "Sambrook") .

Antes de describir la presente invención detalladamente, se debe comprender que esta no se limita a modalidades particulares. Además, es necesario aclarar que la terminología que se usa en la presente invención tiene el propósito de describir modalidades particulares, pero no pretende ser limitante. Como se usa en la presente descripción y en las reivindicaciones anexas, los términos en singular y las formas singulares "un", "una" y "el", por ejemplo, incluyen los referentes plurales, a menos que el contenido lo indique claramente de otra manera. Así, por ejemplo, la referencia a "planta", "la planta" o "una planta" también incluye una gran variedad de plantas. Según el contexto, el uso del término "planta" también puede incluir progenie genéticamente similar o idéntica de la planta. El uso del término "un ácido nucleico" incluye, opcionalmente, varias copias de esa molécula de ácido nucleico.

Ahora, en cuanto a las modalidades: Resistencia al tizón norteño de las hojas El "tizón norteño de las hojas" (NLB, por sus siglas en inglés) , algunas veces denominado tizón norteño de la hoja del maíz (NCLB) , es la enfermedad causada por el patógeno Exserohilum turcicum. La enfermedad, caracterizada por lesiones en forma de cigarros en el tejido de la hoja, puede tener efectos severos en el rendimiento, particularmente en climas tropicales o durante las estaciones húmedas en climas templados .

Los ácidos nucleicos y los polipéptidos de las modalidades tienen un uso en los métodos debido a que confieren o mejoran la resistencia a los hongos a una planta. La fuente de la resistencia puede ser un locus genético de resistencia de origen natural introgresado mediante el cultivo en una población sensible de maíz que carece del locus de resistencia o, alternativamente, los genes que confieren la resistencia se pueden expresar ectópicamente como transgenes que confieren resistencia al expresarse en una población sensible. Asi, las composiciones y métodos descritos en la presente invención son útiles en la protección de las plantas contra patógenos fúngicos. "Resistencia a los patógenos", "resistencia a los patógenos fúngicos" y "resistencia a las enfermedades" pretenden referirse a que la planta previene los síntomas de las enfermedades que resultan de interacciones planta-patógeno. Es decir, se evita que los patógenos causen en la planta enfermedades o síntomas relacionados con las enfermedades o, alternativamente, se minimiza o se reduce los síntomas de las enfermedades causadas por el patógeno, tales como, por ejemplo, la reducción del estrés y la pérdida de producción relacionada. Un experto en la técnica podrá apreciar que las composiciones y métodos descritos se pueden usar con otras composiciones y métodos disponibles en la técnica para proteger las plantas de un ataque de patógenos.

Por lo tanto, los métodos de las modalidades se pueden usar para proteger las plantas de enfermedades, particularmente, de enfermedades causadas por patógenos fúngicos. Como se usa en la presente descripción, "resistencia fúngica" se refiere a resistencia o tolerancia mejorada a un patógeno fúngico cuando se compara con la de una planta silvestre. Los efectos pueden variar desde un ligero incremento en la tolerancia a los efectos del patógeno fúngico (por ejemplo, inhibición parcial) hasta la resistencia total, de tal manera que la planta no sea afectada por la presencia del patógeno fúngico. Un nivel de resistencia aumentado contra un patógeno fúngico particular, o contra un espectro más amplio de patógenos fúngicos constituye una resistencia fúngica "aumentada" o mejorada. Las modalidades de la invención mejorarán o aumentarán la resistencia de la planta al patógeno fúngico, de manera que la resistencia de la planta a un patógeno o patógenos fúngicos aumentará, lo que a su vez aumentará la resistencia a la enfermedad provocada por el patógeno fúngico. El término "mejorar" se refiere a superar, aumentar, amplificar, multiplicar, elevar, subir, y similares. En la presente descripción las plantas de la invención se describen como resistentes a la infección por Helminthosporium turcicum o con resistencia 'mejorada' a la infección por Helminthosporium turcicum como resultado del locus de resistencia de la invención. Por consiguiente, estas muestran, típicamente, resistencia aumentada a la enfermedad (tizón norteño de las hojas) en comparación con plantas equivalentes que son susceptibles a la infección por Helminthosporium turcicum ya que carecen del locus de resistencia .

La identificación de los marcadores moleculares y los alelos de los marcadores moleculares, que se asocian con la resistencia al tizón norteño de las hojas, permite la selección de la resistencia en base solamente a la composición genética de la progenie. Los métodos para identificar y seleccionar las plantas de maíz con resistencia mejorada al tizón norteño de las hojas a través de la evaluación de la composición genética (según se evaluó con el uso de los marcadores moleculares y sus alelos), se presentan en la presente descripción.

En otros aspectos pueden llevarse a cabo, además, métodos para conferir o intensificar la resistencia a los hongos en una planta que comprenden introducir en una planta al menos un cásete de expresión, en donde el cásete de expresión comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido antifúngico de las modalidades unido operativamente a un promotor que dirige la expresión en la planta. En estos métodos, la planta expresa el polipéptido, y así, confiere resistencia fúngica a la planta, o mejora el grado de resistencia inherente de la planta. En modalidades particulares, el gen o genes confieren resistencia al patógeno fúngico, Helmínthosporium turcicum.

La expresión de un polipéptido antifúngico de las modalidades puede estar dirigida a tejidos específicos de la planta, en donde la resistencia a los patógenos es particularmente importante, tales como, por ejemplo, las hojas, raíces, tallos o tejidos vasculares. Tal expresión específica del te ido se puede obtener mediante promotores preferenciales de la raíz, específicos de la hoja, específicos del tejido vascular, específicos del tallo o específicos de la semilla.

Mapeo genético - Identificación de los ioci genéticos asociados con la resistencia mejorada al Helmínthosporium turcicum Se reconoció desde hace mucho tiempo que la correlación específica de los loci genéticos con los fenotipos particulares, tales como resistencia al tizón norteño de las hojas, se puede mapear en un genoma del organismo. El productor de plantas puede usar ventajosamente los marcadores moleculares para identificar individuos deseados al detectar alelos marcadores que muestran una probabilidad estadísticamente significativa de cosegregación con un fenotipo deseado, y se manifiesta como desequilibrio de enlace Al identificar un marcador molecular o grupos de marcadores moleculares que cosegregan con un rasgo de interés, el productor es capaz de seleccionar rápidamente un fenotipo deseado por la selección del alelo marcador molecular adecuado (un proceso llamado selección asistida por marcadores, o MAS) . Esos marcadores se podrían usar también por los productores para diseñar genotipos in silicio y practicar la selección de todo el genoma.

Se dispone de una variedad de métodos bien conocidos en la técnica para detectar marcadores moleculares o grupos de marcadores moleculares que co-segregan con un rasgo de interés, tal como la resistencia al tizón norteño de las hojas. La idea básica sobre la que descansan estos métodos es la detección de marcadores, para los cuales los genotipos alternativos (o alelos) tengan fenotipos promedio significativamente diferentes. Así, se hace una comparación entre los loci marcadores de la magnitud de la diferencia entre los genotipos (o alelos) alternativos o del nivel de importancia de esa diferencia. Se deduce que los genes de rasgos están localizados más cerca del marcador o marcadores que tienen la mayor diferencia genotipica relacionada.

Dos de los métodos que se usan para detectar' loci de rasgos de interés son: 1) análisis de asociación basado en la población y 2) análisis de enlace tradicional. En un análisis de asociación basado en la población, las lineas se obtienen a partir de poblaciones preexistentes con fundadores múltiples, por ejemplo, lineas élite endogámicas. Los análisis de asociación basados en la población descansan en la desintegración del desequilibrio de enlace (DE) y en la idea de que en una población no estructurada, solamente las correlaciones entre los genes de control de un rasgo de interés y los marcadores estrechamente enlazados a esos genes permanecerán después de muchas generaciones de apareamiento aleatorio. En realidad, la mayoría de poblaciones preexistentes tiene subestructura poblacional. Por lo tanto, el uso de un método de asociación estructurada ayuda a controlar la estructura poblacional mediante la asignación de individuos en las poblaciones con el uso de datos obtenidos de los marcadores distribuidos aleatoriamente por todo el genoma, y así se minimiza el desequilibrio debido a la estructura poblacional dentro de las poblaciones de individuos (también denominadas subpoblaciones ) . Los valores fenotípicos se comparan a los genotipos (alelos) en cada locus marcador para cada línea en la subpoblación . Una relación marcador-rasgo significante indica la estrecha proximidad entre el locus marcador y uno o más loci genéticos involucrados en la expresión de ese rasgo.

Los mismos principios subyacen al análisis del enlace tradicional; sin embargo, el LD se genera al crear una población a partir de un número pequeño de fundadores. Los fundadores se seleccionan para maximizar el nivel de polimorfismo dentro de la población construida, y los sitios polimórficos se evalúan por su nivel de cosegregación con un fenotipo determinado. Un número de métodos estadísticos se han usado para identificar asociaciones de rasgos marcadores significativos. Uno de esos métodos es una aproximación de mapeo del intervalo (Lander y Botstein, Genetics 121:185-199 (1989), en el cual se probó cada una de las muchas posiciones a lo largo de un mapa genético (a intervalos de 1 cM) para la posibilidad de que un gen de control de un rasgo de interés se localice en esa posición. La información de genotipo/fenotipo se usa para calcular el puntaje LOD para cada posición del análisis (log de índice de probabilidad) . Cuando la puntuación LOD excede un valor umbral, existe evidencia significativa de la localización de un gen de control del rasgo de interés en esa posición en el mapa genético (el cual caerá dentro de dos loci marcadores particulares ) .

La presente invención proporciona un loci marcador molecular que demuestra co-segregación estadísticamente significativa con resistencia al tizón norteño de las hojas, según se determinó por las técnicas de mapeo de enlace tradicionales. La detección de estos loci marcadores o loci marcadores enlazados adicionales pueden usarse en los programas de cultivo de maíz asistidos por marcador para producir plantas con resistencia mejorada al tizón norteño de las hojas o para eliminar las plantas que no tienen resistencia mejorada al tizón norteño de las hojas a partir de programas de cultivo o plantación.

Marcadores asociados con resistencia al tizón norteño de las hojas Los marcadores asociados con la resistencia al tizón norteño de las hojas se identificaron en la presente descripción. Los métodos involucran detectar la presencia de uno o más alelos marcadores asociados con la resistencia mejorada en el germoplasma de la planta de maíz. La planta de maíz puede ser un híbrido o endogámica.

El locus marcador puede seleccionarse a partir de cualquiera de los loci marcadores proporcionados en la presente descripción que incluyen pero sin limitarse a: PHM2798, b0302Hl, b0611N13, 2717_3, 2717_4, 108fl6_2, 31004, pco642297_3, bl09.m6, PHM18979, b0507L21, 2_2, 156K16, b0318il3, PHM4757, PH 13395-27 , PHM4677-11, PHM3418-12, PHM15992-3, NLB5A, NLB3A, PHM4582, 9gl3-3, K, 6_7, 6_8, N, R, S, U, PH 2817-26, PH 7446-6, PHM13395-16, NLB17_A, NLB17_E, NLB17_3, NLB18_A, o NLB18_E; asi como cualquier otro marcador enlazado a estos marcadores (los marcadores enlazados pueden determinarse a partir del recurso MaizeGDB) .

Localización en el mapa físico Los elementos genéticos o genes que se localizan en un tramo lineal contiguo del ADN genómico en un solo cromosoma están físicamente enlazados.

El intervalo QTL asociado con la resistencia al tizón puede observarse en la FIG. 1 e incluye los BAC c0435bl8, c0009gl3, c0043il0, c0108fl6, c0117i01, c0010kl2, c0125i21, y C0064116. Cualquier polinucleótido que se asemeje al ADN contiguo entre y que incluye los BAC c0435bl8 y c0064116 (es decir, es 95 % idéntico en base al método de alineamiento Clustal V cuando se compara con la secuencia de ADN contigua entre y que incluye los BAC c0435bl8 y c0064116) , puede alojar los loci marcadores que se asocian con el rasgo de resistencia al tizón norteño de las hojas.

Relaciones de enlace Una medida común del enlace es la frecuencia a la cual los rasgos se cosegregan. Esto se puede expresar como un porcentaje de cosegregación (frecuencia de recombinación) o en centimorgans (cM) . El cM es una unidad de medida de la frecuencia de recombinación genética. Un cM es igual a la posibilidad de 1 % de que un rasgo en un locus genético se separe de un rasgo en otro locus debido al entrecruzamiento en una sola generación (lo cual significa que los rasgos se segregan juntos 99 % del tiempo). Debido a que la distancia cromosómica es aproximadamente proporcional a la frecuencia de eventos de entrecruzamiento entre rasgos, existe una distancia física aproximada que se correlaciona con la frecuencia de recombinación.

Los loci marcadores son por si mismos rasgos y se pueden evaluar de conformidad con análisis de asociación estándar mediante la localización de los loci marcadores durante la segregación. Así, un cM es igual a una oportunidad de 1 % de que un locus marcador se separe de otro locus debido al entrecruzamiento en una sola generación.

Mientras más cerca esté el marcador de un gen de control de un rasgo de interés, más efectivo y ventajoso es ese marcador como un indicador de ese rasgo deseado. Los loci estrechamente enlazados exhiben una frecuencia de entrecruzamiento inter-locus de aproximadamente 10 % o menor, preferentemente, aproximadamente 9 % o menor, aún con mayor preferencia, aproximadamente 8 % o menor, aún con mayor preferencia , aproximadamente 7 % o menor, aún con mayor preferencia, aproximadamente 6 % o menor, aún con mayor preferencia, aproximadamente 5 % o menor, aún con mayor preferencia, aproximadamente 4 % o menor, aún con mayor preferencia, aproximadamente 3 % o menor, y aún con mayor preferencia, aproximadamente 2 % o menor. En modalidades muy preferidas, los loci relevantes (por ejemplo, un locus marcador y un locus objetivo) exhiben una frecuencia de recombinación de aproximadamente 1 % o menor, por ejemplo, aproximadamente 0.75 % o menor, con mayor preferencia, aproximadamente 0.5 % o menor, o aún con mayor preferencia, aproximadamente 0.25 % o menor. Asi, los loci están separados aproximadamente 10 cM, 9 c , 8 cM, 7 cM, 6 cM, 5 cM, 4 cM, 3 cM, 2 cM, 1 cM, 0.75 cM, 0.5 cM o 0.25 cM o menos. Dicho de otra manera, dos loci que se localizan en el mismo cromosoma y a una distancia tal que se produzca la recombinación entre los dos loci a una frecuencia de menos de 10 % (por ejemplo, aproximadamente 9 %, 8 %, 7 %, 6 %, 5 %, 4 %, 3 %, 2 %, 1 %, 0.75 %, 0.5 %, 0.25 %, o menos) se dice que están "próximos a" uno a otro.

Aunque los alelos marcadores particulares pueden mostrar co-segregación con el fenotipo de resistencia al tizón norteño de las hojas, es importante destacar que el locus marcador no es necesariamente responsable de la expresión del fenotipo de resistencia al tizón norteño de las hojas. Por ejemplo, no es un requerimiento que la secuencia de polinucleótidos marcadora sea parte de un gen que imparte resistencia mejorada al resistencia tizón norteño de las hojas (por ejemplo, sea parte del marco de lectura abierto del gen) . La asociación entre un alelo marcador especifico y el fenotipo de resistencia mejorada al tizón norteño de las hojas se debe a la fase de enlace por "acoplamiento" original entre el alelo marcador y el alelo en la linea de maíz ancestral de la cual se originó el alelo. Eventualmente, con una recombinación repetida, los eventos de entrecruzamiento entre el marcador y el locus genético puede cambiar esta orientación. Por esta razón, el alelo marcador favorable puede cambiar según la fase de enlace que exista dentro del progenitor resistente usado para crear las poblaciones de segregación. Esto no cambia el hecho de que el marcador puede usarse para monitorear la segregación del fenotipo. Únicamente cambia el alelo marcador que se considera favorable en una población de segregación especifica.

Los marcadores identificados en la presente descripción, que pueden usarse para identificar y seleccionar plantas de maíz con resistencia mejorada al tizón norteño de las hojas incluye: PHM2798, b0302Hl, b0611N13, 2717_3, 2717_4, 108fl6_2, 31004, pco642297_3, bl09.m6, PHM18979, b0507L21, 2_2, 156K16, b0318il3, PHM4757, PHM13395-27, PHM4677-11, PHM3418-12, PHM15992-3, NLB5A, NLB3A, PHM4582, 9gl3-3, K, ß_7, 6_8, N, R, S, U, PHM2817-26, PHM7446-6, PHM13395-16, NLB17_A, NLB17_E, NLB17_3, NLB18_A, o NLB18_E. Cualquier marcador dentro de 50 cM de PH 2798, b0302Hl, b061lN13, 2717_3, 2717_4, 108fl6_2, 31004, pco642297_3, bl09.m6, PHM18979, b0507L21, 2 2, 156K16, b0318il3, PHM4757, PHM13395-27, PHM4677-11, PH 3418-12, PHM15992-3, NLB5A, NLB3A, PHM4582, 9gl3-3, K, ß_7, 6_8, ?, R, S, U, PHM2817-26, PHM7446-6, PHM13395-16, NLB17_A, NLB17_E, NLB17_3, NLB18_A, o NLB18_E puede usarse como un marcador para la resistencia al tizón norteño de las hojas.

Intervalos cromosómicos Se proporcionan los intervalos cromosómicos que correlacionan con la resistencia al tizón norteño de las hojas. Una variedad de métodos muy conocidos en la técnica están disponibles para identificar los intervalos cromosómicos. Los límites de esos intervalos cromosómicos se diseñan para abarcar los marcadores que se enlazarán al gene de control del rasgo de interés. En otras palabras, el intervalo cromosómico se diseña de manera que cualquier marcador que se encuentre dentro de ese intervalo (incluso los marcadores terminales que definen los limites del intervalo) pueden usarse como un marcador para la resistencia al tizón norteño de las hojas. Cada intervalo comprende al menos un QTL y, además, puede claramente comprender más de un QTL. La proximidad estrecha de múltiples QTL en el mismo intervalo puede ofuscar la correlación de un marcador particular con un QTL particular, ya que un marcador puede demostrar enlace con más de un QTL. Por el contrario, por ejemplo, si dos marcadores en proximidad estrecha muestran cosegregación con el rasgo fenotípico deseado, algunas veces no está claro si cada uno de esos marcadores identifica el mismo QTL o dos QTL diferentes. No obstante, para realizar o practicar la invención, no es necesario saber cuántos QTL se encuentran en un intervalo particular.

Un intervalo en el cromosoma 8 que contiene uno o más QTL asociado con la resistencia al tizón norteño de las hojas puede definirse por e incluye los marcadores: a . PHM13395-27 y PHM4677 -11; b. PHM13395-27 y PHM3418 -12; c . 2717_4 y b0507L21; d. 108fl6_2 y pco642297_ 3; e . PHM2817-26 y PHM7446- 6; f . PHM4582 y R; y g- 6_8 y R.

Cualquier marcador localizado dentro de esos intervalos encuentra uso como un marcador para la resistencia al tizón norteño de las hojas en maíz.

Los intervalos cromosómicos se pueden definir también por los marcadores que se enlazan a (muestran desequilibrio de enlace con) un marcador de interés, y r2 es una medida común del desequilibrio de enlace (LD) en el contexto de los estudios de asociación. Si el valor r2 de LD entre cualquier locus marcador identificado en la presente descripción y otro marcador dentro del intervalo cromosómico 8 (descrito además en la presente descripción) es mayor que 1/3 (Ardlie et al., Nature Reviews Genetics 3:299-309 (2002)), los loci están enlazados .

Alelos marcadores y combinaciones haplotlpicas Un marcador de la invención puede ser además una combinación de alelos en uno o más loci marcadores, conocido de cualquier otra forma como haplotipo. Cualquiera de los alelos marcadores descritos en la presente descripción puede usarse solo o en combinación para identificar y seleccionar plantas de maíz con tizón norteño de las hojas mejorado. Esto incluye los marcadores CAPS PHM2798, b0302Hl, b0611N13, 2717_3, 2717_4, 108fl6_2, 31004, pco642297_3, bl09.m6, PHM18979, b0507L21, 2_2, 156K16, b0318il3, PHM4757, PHM4582, 9gl3-3, K, 6_7, 6_8, N, R, S, y U y sus alelos esperados (tamaños de banda) que se muestran en las Tablas 3 y 6 asi como los alelos marcadores SNP: una "G" en PHM13395-27, una "T" en PHM4677-11, una "A" en PH 3418-12, una "T" en PHM15992-3, una "C" en PHM2817-26, una "A" en PHM7446-6, y una "G" en PHM13395-16 (Tablas 4 y 7) .

Los haplotipos favorables incluyen, pero no se limitan a: el haplotipo PH26N en NLB17_A, el haplotipo PH26N en NLB17_E, el haplotipo PH26N en NLB17_3, el haplotipo PH26N en NLB18_A, el haplotipo PH26N en NLB18_E, el haplotipo PH99N a NLB18_A, y el haplotipo PH99N a NLB18_E .

El técnico con experiencia esperaría que podrían haber sitios polimórficos adicionales en los loci marcadores en y alrededor de los marcadores del cromosoma 8 e identificados en la presente invención, en donde uno o más sitios polimórficos están en desequilibrio de enlace (LD) con un alelo en uno o más de los sitios polimórficos en el haplotipo. Se dice que dos alelos particulares en sitios polimórficos diferentes están en LD si la presencia del alelo en uno de los sitios tiende a predecir la presencia del alelo en el otro sitio en el mismo cromosoma (Stevens, Mol. Diag. 4:309-17 (1999)).

Selección asistida por marcador (MAS) Los marcadores moleculares se pueden usar en una gran variedad de aplicaciones de cultivo de plantas (por ejemplo, ver Staub et al. (1996) Hortscience 31: 729-741; Tanksley (1983) Plant Molecular Biology Repórter. 1: 3-8) . Una de las principales áreas de interés es aumentar la eficiencia del retrocruzamiento e introgresion de genes por medio del uso de la selección asistida por marcadores (MAS) . Un marcador molecular que muestra enlace con un locus que afecta un rasgo fenotipico deseado proporciona una herramienta útil para la selección del rasgo en una población de plantas . Esto es particularmente cierto cuando el fenotipo es difícil de ensayar, por ejemplo, muchos rasgos de resistencia a la enfermedad, u ocurre en una etapa tardía en el desarrollo de la planta, por ejemplo, características del grano. Ya que los ensayos del marcador de ADN son menos trabajosos y toman menos espacio físico que el fenotipado en el campo, se pueden evaluar poblaciones mucho más grandes, lo que aumenta las oportunidades de encontrar un recombinante con el segmento objetivo de la línea donante que se mueve a la línea receptora. Mientras más cerca del enlace, más útil es el marcador, ya que es menos probable que ocurra la recombinación entre el marcador y el gen que provoca el rasgo, lo que puede resultar en falsos positivos. Al contar con marcadores de flanqueo, disminuyen las oportunidades de que ocurra la selección de los falsos positivos ya que podría ser necesario un evento de doble recombinación. La situación ideal es tener un marcador en el gen en sí mismo, de manera que recombinación no ocurra entre el marcador y el gen. Un marcador de este tipo se llama un "marcador perfecto".

Cuando un gen se introgresa por MAS, no es solamente el gen que se introduce sino también las regiones de flanqueo (Gepts. (2002) . Crop Sci; 42: 1780-1790). Esto se menciona como "arrastre por ligamento". En el caso en donde la planta donante no se relaciona mucho con la planta receptora, estas regiones de flanqueo portan genes adicionales que pueden codificar para rasgos agronómicamente indeseables. Este "arrastre por enlace" puede, además, resultar en un rendimiento reducido u otras características agronómicas negativas incluso antes de los múltiples ciclos de retrocruzamiento en la línea élite de maíz. Algunas veces esto se menciona "arrastre del rendimiento". El tamaño de la región de flanqueo puede disminuirse por retrocruzamiento adicional, aunque éste no siempre es exitoso, ya que los productores no tienen control del tamaño de la región o los puntos de ruptura de la recombinación (Young et al. (1998) Genetics 120:579-585). En el cultivo clásico, usualmente, es solo por casualidad que se seleccionen recombinaciones que contribuyan a una reducción del tamaño del segmento donante (Tanksley et al. (1989). Biotechnology 7: 257-264). Aun después de 20 retrocruzamientos en retrocruzamientos de este tipo, se puede esperar encontrar una pieza considerable del cromosoma donante enlazada todavía al gen que se selecciona. Con los marcadores, sin embargo, es posible seleccionar aquellos individuos raros que experimentaron la recombinación cerca del gen de interés. En 150 plantas retrocruzadas, hay un 95 % de oportunidad de que al menos una planta experimente un cruce dentro de 1 cM del gen, basado en una distancia de mapa de meiosis. Los marcadores permitirán la identificación inequívoca de esos individuos . Con un retrocruzamiento adicional de 300 plantas, habría un 95 % de oportunidad de un cruce dentro de 1 cM de distancia de mapa de meiosis del otro lado del gen, lo que genera un segmento alrededor del gen objetivo de menos de 2 cM basado en una distancia de mapa de meiosis simple. Esto se puede realizar en dos generaciones con los marcadores, mientras que esto hubiera requerido un promedio de 100 generaciones sin marcadores (Ver Tanksley et al., más arriba). Cuando se conoce la localización exacta de un gen, los marcadores de flanqueo que rodean el gen se pueden usar para seleccionar las recombinaciones en diferentes tamaños de población. Por ejemplo, en tamaños de población pequeños, las recombinaciones se pueden esperar lejos del gen, de manera que se requerirán marcadores de flanqueo más distales para detectar la recombinación.

La disponibilidad de mapas de enlace integrados del genoma del maiz que contienen densidades aumentadas de marcadores públicos del mai2 ha facilitado el mapeo genético del maiz y MAS. Ver, por ejemplo, los mapas IBM2 vecinos, que están disponibles en linea en el sitio web MaizeGDB.

Los componentes claves para la implementación de la MAS son: (i) definir la población dentro de la cual se determinará la asociación rasgo-marcador, la que puede ser una población segregante, o una población aleatoria o estructurada; (ii) monitorear la segregación o asociación de marcadores polimórficos en relación al rasgo, y determinar el enlace o asociación por medio del uso de métodos estadísticos; (iii) definir un conjunto de marcadores deseables en base a los resultados del análisis estadístico, y (iv) el uso y/o extrapolación de esta información al conjunto real del germoplasma del cultivo para permitir las decisiones de la selección basada en el marcador a efectuarse. Los marcadores descritos en esta descripción, asi como otros tipos de marcadores tales como SSR y FLP, se pueden usar también en los protocolos de selección asistida por marcador.

Los SSR se pueden definir como ensayos relativamente cortos de ADN repetidos en tándem con longitudes de 6 bp o menores (Tautz (1989) Nucleic Acid Research 17: 6463-6471; Wang et al. (1994) Theoretical and Applied Genetics, 88:1-6). Los polimorfismos surgen debido a la variación en el número de unidades de repetición, probablemente provocado por el deslizamiento durante la replicación del ADN (Levinson y Gutman (1987) Mol Biol Evol 4: 203-221). La variación en las longitudes repetidas puede detectarse mediante el diseño de cebadores de PCR para las regiones de flanqueo no repetitivas conservadas ( eber y May (1989) Am J Hum Genet . 44:388-396). Los SSR son muy adecuados para el mapeo y MAS ya que estos son multi-alélicos, codominantes , reproducibles y dóciles para la automatización de gran productividad (Rafalski et al. (1996) Generating and using DNA markers in plants. En: Non-mammalian genomic analysis: una guía práctica. Academic press. págs . 75-135).

Se pueden generar varios tipos de marcadores SSR, y los perfiles SSR de lineas resistentes se pueden obtener por electroforesis en gel de los productos de amplificación. El puntaje del genotipo marcador se basa en el tamaño del fragmento amplificado. Un servicio SSR para el maíz está disponible al público sobre bases contractuales por ADN Landmarks en Saint-Jean-sur-Richelieu, Quebec, Canadá.

Además, se pueden generar varios tipos de marcadores FLP. Más comúnmente, los cebadores de amplificación se usan para generar polimorfismos de longitud del fragmento. Esos marcadores FLP son de muchas maneras similares a los marcadores SSR, excepto que la región amplificada por los cebadores no es típicamente una región muy repetitiva. Aun así, la región amplificada, o amplicón, tendrá suficiente variabilidad entre el germoplasma, frecuentemente, debido a inserciones o deleciones, de tal manera que los fragmentos que se generan por los cebadores de amplificación se puedan distinguir entre individuos polimorfos, y se conoce que esos indel ocurren, frecuentemente, en el maíz (Bhattramakki et al. (2002). Plant Mol Biol 48, 539-547; Rafalski (2002b), más arriba) .

Los marcadores de SNP detectan sustituciones de nucleótidos de un solo par de base. De todos los tipos de marcadores moleculares, los SNP son los más abundantes, y tienen así el potencial para proporcionar la resolución del mapa genético (Bhattramakki et al. 2002 Plant Molecular Biology 48:539-547). Los SNP se pueden ensayar a un nivel de productividad aún más alto que los SSR, en un modo llamado de extrema productividad, ya que no requieren de grandes cantidades de ADN y la automatización del ensayo puede ser directa. Los SNP también tienen la promesa de ser sistemas de costos relativamente bajos. Estos tres factores juntos hacen los SNP altamente atractivos para su uso en MAS. Varios métodos se encuentran disponibles para genotipar el SNP que incluyen, pero no se limitan a, la hibridación, extensión del cebador, ligación de oligonucleótidos, clivaje por nucleasas, minisecuenciación y esferas codificadas. Tales métodos se revisaron en: Gut (2001) Hum Mutat 17 págs . 475-492; Shi (2001) Clin Chem 47, págs. 164-172; Kwok (2000) Pharmacogenomics 1, págs. 95-100; Bhattramakki and Rafalski (2001) Discovery and application of single nucleotide polymorphism markers in plants. En: . J. Henry, Ed, Plant Genotyping: The DNA Fingerprinting of Plants, CABI Publishing, allingford. Una amplia variedad de tecnologías comercialmente disponibles usan estos y otros métodos para interrogar los SNP que incluyen Masscode. TM. (Qiagen) , Invader . RT . (Third Wave Technologies), SnapShot . RTM . (Applied Biosystems), Taqman.RTM. (Applied Biosystems) y Beadarrays . TM. (Illumina) .

Un número de SNP juntos dentro de una secuencia, o a través de secuencias enlazadas, pueden usarse para describir un haplotipo para cualquier genotipo particular (Ching et al. (2002) , BMC Genet. 3:19 págs. Gupta et al. 2001 Rafalski (2002b), Plant Science 162:329-333). Los haplqtipos pueden ser más informativos que los SNP solos y pueden ser más descriptivos que cualquier genotipo particular. Por ejemplo, un solo SNP puede ser un alelo 'T1 para una linea o variedad especifica y con resistencia al tizón norteño de las hojas, pero el alelo "T" podría estar también en la población de cultivo de maíz que se usa para genitores recurrentes. En este caso, un haplotipo, por ejemplo, una combinación de alelos en los marcadores SNP enlazados, puede ser más informativo. Una vez que un haplotipo único se asigna a una región cromosómica donante, ese haplotipo puede usarse en esa población o cualquier subconjunto de esta para determinar si un individuo tiene un gen particular. Ver, por ejemplo, la patente núm. O2003054229. El uso de plataformas de detección de marcadores de gran productividad automatizada conocidas para las personas con experiencia en la técnica hace este proceso altamente eficaz y efectivo.

Además de los SSR, FLP y SNP, como se describió anteriormente, otros tipos de marcadores moleculares son también ampliamente usados, que incluyen pero no se limitan a, las etiquetas de secuencias expresadas (EST, por sus siglas en inglés) , marcadores SSR que se derivan de las secuencias EST, ADN polimórfico amplificado aleatoriamente (RAPD, por sus siglas en inglés) , y otros marcadores basados en el ácido nucleico.

Los perfiles de isozima y las características morfológicas vinculadas, en algunos casos, se usan también indirectamente como marcadores. Aunque no detectan directamente las diferencias de ADN, a menudo están influenciados por diferencias genéticas específicas. Sin embargo, los marcadores que detectan la variación de ADN son por mucho más numerosos y polimorfos que los marcadores morfológicos o isozimas (Tanksley (1983) Plant Molecular Biology Repórter 1:3-8).

Los alineamientos de secuencia o cóntigos pueden usarse, además, para encontrar secuencias en dirección 5' o en dirección 3' de los marcadores específicos enumerados en la presente invención. Estas nuevas secuencias, cercanas a los marcadores descritas en la presente descripción, se usan para descubrir y desarrollar marcadores funcionalmente equivalentes. Por ejemplo, los mapas físicos y/o genéticos diferentes se alinean a los marcadores equivalentes localizados no descritos dentro de esta descripción, pero que están dentro de regiones similares. Estos mapas pueden estar dentro de las especies de maíz, o a través de otras especies que se alinean genéticamente o físicamente con el maíz, tales como arroz, trigo, cebada o sorgo.

Generalmente, la MAS usa marcadores polimórficos que se identifican por tener una probabilidad de co-segregación significativa con la resistencia al tizón norteño de las hojas. Se supone que esos marcadores mapean cerca de un gen o genes que dan a la planta su fenotipo de resistencia al tizón norteño de las hojas, y se consideran indicadores del rasgo deseado, o marcadores. Las plantas se evalúan para la presencia de un alelo en el marcador, y se espera que las plantas que contienen un genotipo deseado en uno o más loci transfieran el genotipo deseado, junto con un fenotipo deseado, a su progenie.

PH 2798, D0302H1, b0611Nl3, 2717_3, 2717_4, 108fl6_2, 31004, pco642297_3, bl09.m6, PHM18979, b0507L21, 2_2, 156 16, b0318il3, PHM4757, PHM13395-27 , PH 4677-11 , PHM3418-12, PHM15992-3, NLB5A, NLB3A, PHM4582, 9gl3-3, , 6_ , 6_8, N, R, S, U, PHM2817-26, PHM7446-6, PHM13395-16, NLB17_A, NLB17_E, NLB17_3, NLB18_A, y NLB18_E, asi como otros marcadores genéticamente o físicamente mapeados para el mismo segmento cromosómico, pueden usarse para seleccionar plantas de maíz con resistencia mejorada al tizón norteño de las hojas. Sin embargo, no todos los marcadores genéticamente o físicamente mapeados para el mismo segmento cromosómico pueden usarse para seleccionar plantas de maíz con resistencia mejorada al tizón norteño de las hojas ya que el marcador puede no ser lo suficientemente informativo dentro de una población particular .

Los intervalos presentados en la presente descripción encuentran uso en MAS para seleccionar las plantas que demuestran resistencia mejorada al tizón norteño de las hojas. Cualquier marcador que mapea dentro del intervalo del cromosoma 8 definido por y que incluye los marcadores: a. PHM13395-27 y PHM4677-11; b. PH 13395-27 y PHM3418-12 ; c. 2717_4 y b0507L21; d. 108fl6_2 y pco642297_3; e. PHM2817-26 y PHM7446-6; f. PHM4582 y R; y g. 6_8 y R; por ejemplo, pueden usarse para este propósito .

Los métodos para la selección pueden involucrar detectar la presencia de uno o más alelo (s) marcador (es) enlazados a y en asociación con un alelo marcador o haplotipo asociado con la resistencia mejorada al tizón norteño de las hojas en una planta de maíz o germoplasma y, después, seleccionar la planta de maíz o germoplasma en base al alelo marcador detectado. El haplotipo puede ser el haplotipo PH26N en NLB17_A, el haplotipo PH26N en NLB17_E, el haplotipo PH26N en NLB17_3., el haplotipo PH26N en NLB18_A, el haplotipo PH26N en NLB18_E, el haplotipo PH99N en NLB18_A, o el haplotipo PH99N en NLB18_E.

Los métodos para la MAS pueden incluir, además, obtener una primera planta de maíz que comprende dentro de su genoma un haplotipo asociado con la resistencia mejorada al tizón norteño de las hojas tal como el haplotipo PH26N en NLB17 A, el haplotipo PH26N en NLB17_E, el haplotipo PH26N en NLB17_3, el haplotipo PH26N en NLB18_A, el haplotipo PH26N en NLB18_E, el haplotipo PH99N en NLB18_A, o el haplotipo PH99N en NLB18_E; cruzar la primera planta de maíz con una segunda planta de maíz con un nivel inferior de resistencia; y genotipar la progenie para la presencia del haplotipo de la primera planta de maíz. Las plantas de la progenie que poseen el haplotipo se la primera planta de maíz (es decir, el haplotipo que se asocia con la resistencia mejorada al tizón norteño de las hojas) se pueden seleccionar como que tienen resistencia mejorada al tizón norteño de las hojas.

Resistencia mejorada a través de la expresión ectópica de los transgenes Las modalidades de la invención abarcan, además, composiciones de polinucleótidos o proteínas aisladas o sustancialmente purificadas. Un polinucleótido o proteína "aislada" o "purificada" o una porción biológicamente activa de estos se encuentra práctica o esencialmente libre de componentes que normalmente acompañan o interactúan con el polinucleótido o proteína, tal como se encontró en su ambiente de origen natural. Así, un polinucleótido o proteína aislada o purificada está sustancialmente libre de otro material celular o medio de cultivo cuando se produce mediante técnicas recombinantes (por ejemplo, amplificación de PCR) o sustancialmente libre de precursores químicos u otras sustancias químicas cuando se sintetiza químicamente. Óptimamente, un polinucleótido "aislado" está libre de secuencias (por ejemplo, secuencias codificantes de proteína) que flanquean el polinucleótido (es decir, secuencias localizadas en los extremos 5' y 3' del polinucleótido) en el ADN genómico del organismo del cual se deriva el polinucleótido. Por ejemplo, en varias modalidades, el polinucleótido aislado puede contener menos que aproximadamente 5 kb, aproximadamente 4 kb, aproximadamente 3 kb, aproximadamente 2 kb, aproximadamente 1 kb, aproximadamente 0.5 kb o aproximadamente 0.1 kb de la secuencia nucleótida que flanquea naturalmente el polinucleótido en el ADN genómico de la célula de la cual se deriva el polinucleótido. Una proteína sustancialmente libre de material celular incluye preparaciones de proteína con menos de aproximadamente 30 %, aproximadamente 20 %, aproximadamente 10 %, aproximadamente 5 % o aproximadamente 1 % (en peso seco) de proteína contaminante. Cuando la proteína de las modalidades o una porción biológicamente activa de esta se produce de manera recombinante, el medio de cultivo representa, óptimamente, menos de aproximadamente 30 %, aproximadamente 20 %, aproximadamente 10 %, aproximadamente 5 % o aproximadamente 1 % (en peso seco) de precursores de sustancias químicas o sustancias químicas que no son las proteínas de interés.

Las modalidades abarcan los fragmentos y variantes de la secuencia de nucleótidos descrita, asi como las proteínas que codifica. El término "fragmento" se refiere a una porción de la secuencia de nucleótidos o una porción de la secuencia de aminoácidos y, por lo tanto, la proteína codificada de ese modo. Los fragmentos de una secuencia nucleótida pueden codificar fragmentos de proteína que retienen la actividad biológica de la proteína natural y, por lo tanto, tienen la capacidad de conferir resistencia a los hongos en una planta. Alternativamente, los fragmentos de una secuencia nucleótida útiles como sondas de hibridación no necesariamente codifican proteínas en fragmentos que retienen la actividad biológica. Así, los fragmentos de una secuencia nucleótida se pueden encontrar en el intervalo de al menos aproximadamente 15 nucleótidos, aproximadamente 50 nucleótidos, aproximadamente 100 nucleótidos y hasta la máxima longitud de secuencias nucleótidas que codifican el polipéptido de las modalidades.

Un fragmento de una secuencia nucleótida que codifica una porción biológicamente activa de un polipéptido de las modalidades codifica al menos aproximadamente 15, aproximadamente 25, aproximadamente 30, aproximadamente 40 o aproximadamente 50 aminoácidos contiguos o hasta la cantidad total de aminoácidos presentes en un polipéptido de longitud completa de las modalidades. Los fragmentos de una secuencia nucleótida útiles como sondas de hibridación o cebadores de PCR no requieren, generalmente, codificar una porción biológicamente activa de una proteina.

Como se usa en la presente descripción, "secuencia de longitud completa", con referencia un polinucleótido especifico, se refiere a tener una secuencia de ácido nucleico completa de una secuencia natural. "Secuencia natural" se refiere a una secuencia endógena, es decir., una secuencia no creada que se encuentra en el genoma de un organismo .

Asi, un fragmento de una secuencia nucleótida de las modalidades puede codificar una porción biológicamente activa de un polipéptido o puede ser un fragmento que se pueda usar como sonda de hibridación o cebador de PCR con el uso de métodos descritos a continuación. Una porción biológicamente activa de un polipéptido antipatogénico se puede preparar al aislar una porción de una de las secuencias nucleótidas de las modalidades, expresar la porción codificada de la proteina y evaluar la capacidad de la porción codificada de la proteina para conferir o intensificar la resistencia a los hongos en una planta. Las moléculas de ácido nucleico que son fragmentos de una secuencia nucleótida de las modalidades comprenden al menos aproximadamente 15, aproximadamente 20, aproximadamente 50, aproximadamente 75, aproximadamente 100 o aproximadamente 150 nucleótidos o hasta la cantidad de nucleótidos presentes en una secuencia nucleótida de longitud completa descrita en la presente descripción.

El término "variantes" se refiere a secuencias sustancialmente similares. Para los polinucleótidos , una variante comprende una deleción y/o adición de uno o más nucleótidos en uno o más sitios internos dentro del polinucleótido activo y/o una sustitución de uno o más nucleótidos en uno o más sitios en el polinucleótido nativo. Como se usa en la presente descripción, un polinucleótido o polipéptido "nativo" comprende una secuencia nucleótida o secuencia de aminoácidos de origen natural, respectivamente. Un experto en la técnica sabrá que las variantes de los ácidos nucleicos de las modalidades se construirán de tal manera que se mantenga el marco de lectura abierta. Para los polinucleótidos, las variantes conservadoras incluyen las secuencias que, debido a la degeneración del código genético, codifican la secuencia de aminoácidos de uno de los polipéptidos de las modalidades. Las variantes alélicas de origen natural, tales como estas se pueden identificar con el uso de técnicas de biología molecular reconocidas, tales como, por ejemplo, las técnicas de reacción en cadena de la polimerasa (PCR, por sus siglas en inglés) y de hibridación, tal como se describe a continuación. Las variantes de polinucleótidos incluyen, además, polinucleótidos derivados sintéticamente, tales como los generados, por ejemplo, con mutagénesis sitio dirigida pero que aún codifican una proteína de las modalidades. Generalmente, las variantes de un polinucleótido particular de las modalidades tendrán al menos aproximadamente 40 %, aproximadamente 45 %, aproximadamente 50 %, aproximadamente 55 %, aproximadamente 60 %, aproximadamente 65 %, aproximadamente 70 %, aproximadamente 75 %, aproximadamente 80 %, aproximadamente 85 %, aproximadamente 90 %, aproximadamente 91 ¾, aproximadamente 92 %, aproximadamente 93 %, aproximadamente 94 %, aproximadamente 95 %, aproximadamente 96 %, aproximadamente 97 %, aproximadamente 98 %, aproximadamente 99 % o más de identidad de secuencias con ese polinucleótido particular, tal como lo determinan los programas y parámetros de alineamiento de secuencias descritos en otra sección de la presente invención.

Las variantes de un polinucleótido particular de las modalidades (es decir, el polinucleótido de referencia) también se puede evaluar mediante la comparación del porcentaje de identidad de secuencias entre el polipéptido codificado por una variante de polinucleótido y el polipéptido codificado por el polinucleótido de referencia. Así, se describen, por ejemplo, los polinucleótidos aislados que codifican un polipéptido con un porcentaje específico de identidad de secuencias al polipéptido de la sec. con núm. de identidad: 93, 95, o 97. El porcentaje de identidad de secuencias entre dos polipéptidos cualquiera se puede calcular con el uso de ' los programas y parámetros de alineamiento de secuencias descritos en otra sección de la presente invención. En donde se evalúa cualquier par específico de los polinucleotidos de las modalidades mediante la comparación del porcentaje de identidad de secuencias que comparten ambos polipéptidos que codifican, el porcentaje de identidad de secuencias entre los dos polipéptidos codificados es al menos aproximadamente 40 %, aproximadamente 45 %, aproximadamente 50 %, aproximadamente 55 %, aproximadamente 60 %, aproximadamente 65 %, aproximadamente 70 %, aproximadamente 75 %, aproximadamente 80 %, aproximadamente 85 %, aproximadamente 90 %, aproximadamente 91 %, aproximadamente 92 %, aproximadamente 93 %, aproximadamente 94 %, aproximadamente 95 %, aproximadamente 96 %, aproximadamente 97 %, aproximadamente 98 %, aproximadamente 99 % o mayor de identidad de secuencias.

Proteína "variante" se refiere a una protéína derivada de la proteína natural mediante deleción o adición de uno o más aminoácidos en uno o más sitios internos en la proteína natural y/o sustitución de uno o más aminoácidos en uno o más sitios en la proteína natural. Las variantes de proteínas abarcadas por las modalidades son biológicamente activas, en otras palabras, aún tienen la actividad biológica deseada de la proteína natural, es decir, la capacidad de conferir o intensificar la resistencia fúngica de la planta a los patógenos, tal como se describe en la presente invención. Tales variantes pueden resultar, por ejemplo, del polimorfismo genético o de la manipulación humana. Las variantes biológicamente activas de una proteina natural de las modalidades tendrán al menos aproximadamente 40 %, aproximadamente 45 %, aproximadamente 50 %, aproximadamente 55 %, aproximadamente . 60 %, aproximadamente 65 %, aproximadamente 70 %, aproximadamente 75 %, aproximadamente 80 %, aproximadamente 85 %, aproximadamente 90 %, aproximadamente 91 %, aproximadamente 92 %, aproximadamente 93 %, aproximadamente 94 %, aproximadamente 95 %, aproximadamente 96 %, aproximadamente 97 %, aproximadamente 98 %, aproximadamente 99 % o más identidad de secuencias a la secuencia de aminoácidos para la proteina natural, como lo determinan los programas y parámetros de alineamiento de secuencias descritos en otra sección de la presente invención. Una variante biológicamente activa de una proteina de las modalidades puede diferir de esa proteina por tan poco como aproximadamente 1-15 residuos de aminoácidos, tan poco como aproximadamente 1-10, como aproximadamente 6-10, tan poco como aproximadamente 5, tan poco como 4, 3, 2 o incluso 1 residuo de aminoácidos.

Las proteínas de las modalidades se pueden alterar de varias maneras que incluyen sustituciones, deleciones, truncamientos e inserciones de aminoácidos. Los métodos para tales procesos se conocen, generalmente, en la técnica. Por ejemplo, las variantes de las secuencias de aminoácidos y los fragmentos de las proteínas antipatogénicas se pueden preparar mediante mutaciones en el ADN . Los métodos para mutagénesis y alteraciones de polinucleótidos se conocen bien en la técnica. Ver, por ejemplo, Kunkel (1985) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 82:488-492; Kunkel et al. (1987) Methods in Enzymol. 154:367-382; patente de los Estados Unidos núm. 4, 873, 192; Walker y Gaastra, eds . (1983) Techniques in Molecular Biology (MacMillan Publishing Company, Nueva York) y las referencias citadas en esta. La guia con respecto a las sustituciones adecuadas de aminoácidos que no afectan la actividad biológica de la proteína de interés se puede encontrar en el modelo de Dayhoff et al. (1978) Atlas of Protein Sequence and Structure (Nati. Biomed. Res. Found. , Washington, D.C.), que se incorpora en la presente descripción como referencia. Las sustituciones conservadoras, tales como el intercambio de un aminoácido con otro que tenga propiedades similares, pueden ser óptimas.

Así, los genes y polinucleótidos de las modalidades incluyen tanto secuencias de origen natural como formas mutantes. De igual manera, las proteínas de las modalidades abarcan tanto proteínas de origen natural como variaciones y formas modificadas de estas. Tales variantes aún tendrán la capacidad deseada de conferir o intensificar la resistencia fúngica de la planta a los patógenos. Obviamente, las mutaciones que se harán en el ADN que codifica la variante no deben colocar la secuencia fuera del marco de lectura y, óptimamente, no crearán regiones complementarias que puedan producir estructuras secundarias de ARNm. Ver la patente núm. EP 0075444.

No se pretende que las deleciones, inserciones y sustituciones de la secuencias de proteínas que se abarcan en la presente descripción produzcan cambios radicales en las características de la proteína. Sin embargo, cuando es difícil predecir el efecto exacto de la sustitución, deleción o inserción antes de realizarla, una persona con experiencia en la técnica apreciará que el efecto se evaluará al evaluar las plantas transgénicas que se han transformado con la variante de proteína para determinar el efecto sobre la capacidad de la planta para resistir el ataque patógeno fúngico .

Las variante de polinucleótidos y proteínas abarcan, además, las secuencias y proteínas derivadas de procedimientos mutagénicos o recombinogénicos, que incluyen y no se limitan a, procedimientos como el barajado de ADN. Un experto en la técnica puede idear modificaciones que alterarían el intervalo de patógenos a los cuales responde la proteína. Con un procedimiento así, es posible manipular una o más secuencias codificantes de proteínas para crear una nueva proteína que tenga las propiedades deseadas. De esta manera, las bibliotecas de polinucleótidos recombinantes se generan a partir de una población de polinucleótidos de secuencias que comprende regiones de secuencias con una importante identidad de secuencias y que se pueden recombinar homólogamente in vitro o in vivo. Por ejemplo, con el uso de este método, los motivos secuenciales que codifican un dominio de interés se pueden mover entre el gen de proteínas de las modalidades y otros genes de proteínas conocidos para obtener un nuevo gen codificante de una proteína con una propiedad de interés mejorada, tal como la capacidad incrementada de conferir o intensificar la resistencia fúngica de la planta a los patógenos. Las estrategias para tal barajado de ADN se conocen en la técnica. Ver, por ejemplo, Stemmer (1994) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 91:10747-10751; Stemmer (1994) Nature 370:389-391; Crameri et al. (1997) Nature Biotech. 15:436-438; oore et al. (1997) J. Mol. Biol. 272:336-347; Zhang et al. (1997) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 94:4504-4509; Crameri et al. (1998) Nature 391:288-291; y las patentes de los Estados Unidos núm. 5, 605,793 y 5, 837, 458.

Los polinucleótidos de las modalidades se pueden usar para aislar las secuencias correspondientes de otros organismos, particularmente, otras plantas. De esta manera, los métodos como PCR, hibridación y similares se pueden usar para identificar tales secuencias en base a su homología de secuencias con las secuencias que se exponen en la presente descripción. Las modalidades abarcan las secuencias aisladas en base a su identidad de secuencias con las secuencias completas que se exponen en la presente descripción o con variantes y fragmentos de estas. Tales secuencias incluyen secuencias que son ortólogas de las secuencias descritas. Ortólogos" pretende referirse a genes derivados de un gen ancestral común y que se encuentran en especies diferentes como resultado de la especiacion. Los genes que se encuentran en especies diferentes se consideran ortólogos cuando sus secuencias de nucleótidos y/o sus secuencias de proteínas codificadas comparten al menos aproximadamente 60 %, aproximadamente 70 %, aproximadamente 75 %, aproximadamente 80 %, aproximadamente 85 %, aproximadamente 90 %, aproximadamente 91 %, aproximadamente 92 %, aproximadamente 93 %, aproximadamente 94 %, aproximadamente 95 %, aproximadamente 96 %, aproximadamente 97 %, aproximadamente 98 %, aproximadamente 99 % o mayor identidad de secuencias. Las funciones de los ortólogos frecuentemente se conservan muy bien entre las especies. Así, las modalidades abarcan los polinucleótidos aislados que se codifican para una proteína que confieren o intensifican la resistencia fúngica de las plantas a los patógenos y que se hibridizan bajo condiciones rigurosas a las secuencias descritas en la presente invención o a variantes o fragmentos de estas.

En un método de PCR, los cebadores de oligonucleótidos se pueden diseñar para ser usados en las reacciones de PCR para amplificar las secuencias de ADN correspondientes del ADNc o ADN genómico que se extrae del organismo de interés. Los métodos para diseñar cebadores de PCR y clonación de PCR se conocen, generalmente, en la técnica y se describen en Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2.° ed. , Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, Nueva York). Ver, además, et al., eds. (1990) PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (Academic Press, Nueva York); Innis y Gelfand, eds. (1995) PCR Strategies (Academic Press, Nueva York); y Innis and Gelfand, eds. (1999) PCR Methods Manual (Academic Press, Nueva York) . Los métodos conocidos de PCR incluyen, y no se limitan a, los métodos que usan cebadores emparejados, cebadores anidados, cebadores específicos únicos, cebadores degenerados, cebadores específicos del gen, cebadores específicos del vector, cebadores parcialmente mal emparejados y similares.

En las técnicas de hibridación se usa todo o parte de un polinucleótido conocido como una sonda que se hibridiza selectivamente a otros polinucleótidos correspondientes presentes en una población de fragmentos de ADN genómico clonado o fragmentos de ADNc (es decir, bibliotecas genómicas o de ADNc) de un organismo escogido. Las sondas de hibridación pueden ser fragmentos de ADN genómico, fragmentos de ADNc, fragmentos de ARN u otros oligonucleótidos y se pueden marcar con un grupo detectable tal como 32P o cualquier otro marcador detectable. Asi, por ejemplo, las sondas para hibridación se pueden realizar al marcar los oligonucleótidos sintéticos en base a los polinucleótidos de las modalidades. Los métodos para preparar sondas para hibridación y construir bibliotecas genómicas y de ADNc son generalmente conocidos en la técnica y se describen en Sambrook et al. (1989) más arriba .

Por ejemplo, un polinucleótido completo descrito en la presente invención o una o más porciones de este se puede usar como sonda con la capacidad de hibridizar específicamente a los polinucleótidos y ARN mensajeros correspondientes. Para lograr una hibridación específica bajo una gran variedad de condiciones, tales sondas incluyen secuencias que son únicas y, óptimamente, de al menos aproximadamente 10 nucleótidos de longitud, al menos aproximadamente 15 nucleótidos de longitud o al menos aproximadamente 20 nucleótidos de longitud. Tales sondas se pueden usar para amplificar los polinucleótidos correspondientes de un organismo escogido mediante PCR. Esta técnica se puede usar para aislar secuencias codificantes adicionales de un organismo deseado o como un ensayo diagnóstico para determinar la presencia de secuencias codificantes en un organismo. Las técnicas de hibridación incluyen evaluación por hibridación de bibliotecas de ADN en placas (ya sean placas o colonias; ver, por ejemplo, Sambrook et al. (1989) más arriba.

La hibridación de tales secuencias se puede realizar bajo condiciones rigurosas. Los términos "condiciones rigurosas" y "condiciones rigurosas de hibridación" se refieren a las condiciones bajo las cuales una sonda se hibridizará hasta su secuencia objetivo a cierto grado detectablemente mayor que otras secuencias (por ejemplo, al menos 2 veces el valor de base) . Las condiciones rigurosas dependen de la secuencia y serán diferentes en circunstancias diferentes. Al controlar el rigor de las condiciones de hibridación y/o lavado, es posible identificar las secuencias objetivo que son 100 % complementarias a la sonda (sondeo de homólogos) . Alternativamente, pueden ajustarse las condiciones de rigor para permitir cierto desapareamiento de las secuencias con el fin de detectar grados más bajos de similitud (sonda heteróloga) . Generalmente, una sonda tiene menos de aproximadamente 1,000 nucleotidos de longitud, óptimamente, menos de 500 nucleotidos de longitud.

Típicamente, serán condiciones rigurosas aquellas en las cuales la concentración de sal es menor que aproximadamente 1.5 M de iones Na, típicamente, una concentración de aproximadamente 0.01 a 1.0 M de iones Na (u otras sales) con un pH 7.0 a 8.3, y la temperatura es de al menos aproximadamente 30 °C para las sondas cortas (por ejemplo, 10 a 50 nucleótidos) y al menos aproximadamente 60 °C para las sondas largas (por ejemplo, más de 50 nucleótidos) . Además, pueden lograrse las condiciones rigurosas mediante la adición de agentes desestabilizadores, tales como la formamida. Las condiciones de rigor bajo ilustrativas incluyen la hibridación con una solución tampón de 30 a 35 % de formamida, 1 M NaCl, 1 % SDS (sodio dodecilo sulfato) a 37 °C, y un lavado en IX a 2X SSC (20X SSC = 3.0 M NaCl/0.3 M citrato trisódico) a 50-55 °C. Las condiciones de rigor moderado ilustrativas incluyen la hibridación en 40 a 45 % de formamida, 1.0 M de NaCl, 1 % de SDS a 37 °C, y un lavado en 0.5X a IX SSC a 55-60 °C. Las condiciones altamente rigurosas ilustrativas incluyen la hibridación en 50 % de formamida, 1 M de NaCl, 1 % de SDS a 37 °C y un lavado final en 0.1X SSC a 60-65 °C durante al menos 30 minutos. Opcionalmente, los reguladores de lavado pueden comprender de aproximadamente 0.1 % a aproximadamente 1 % de SDS. La duración de la hibridación es, generalmente, menor que aproximadamente 24 horas, usualmente, de aproximadamente 4 a aproximadamente 12 horas. La duración del tiempo de lavado será al menos el tiempo suficiente para alcanzar el equilibrio.

La especificidad es, típicamente, la función de los lavados posteriores a la hibridación; los factores críticos son la fuerza iónica y la temperatura de la solución de lavado final. Para los híbridos de ADN-ADN, el punto de fusión térmico (Tm) se puede calcular a partir de la ecuación de Meinkoth y Wahl (1984) Anal.. Biochem. 138:267-284: Tm = 81.5 °C + 16.6 (log M) + 0.41 (%GC) - 0.61 (% form) - 500/1; en donde M es la molaridad de cationes monovalentes, %GC es el porcentaje de nucleótidos de guanosina y citosina en el ADN, % form es el porcentaje de formamida en la solución de hibridación y L es la longitud del híbrido en pares de bases. Tm es la temperatura (con la fuerza iónica y el pH definidos a continuación) a la cual se híbrida el 50 % a una secuencia objetivo complementaria con una sonda perfectamente apareada. Tm se reduce en aproximadamente 1 °C para cada 1 % de falta de coincidencia; de este modo, Tm, la hibridación y/o las condiciones de lavado se pueden ajustar para lograr la hibridación a secuencias de la identidad deseada. Por ejemplo, si se buscan secuencias con =90 % de identidad, puede disminuirse Tm en 10 °C. Generalmente, se selecciona que las condiciones rigurosas sean aproximadamente 5 °C menores que Tm para la secuencia específica y sus complementos a una fuerza iónica y un pH definidos. Sin embargo, las condiciones severamente rigurosas pueden usar una hibridación y/o un lavado a l, 2, 3 o 4 °C menos que Tm; las condiciones moderadamente rigurosas pueden usar una hibridación y/o un lavado a 6, 7, 8, 9 o 10 °C menor que Tm; las condiciones de baja rigurosidad pueden usar una hibridación y/o un lavado a 11, 12, 13, 14, 15 o 20 °C menor que Tm. Al usar la ecuación, las composiciones de hibridación y lavado, y la Tm deseada, aquellos con experiencia ordinaria comprenderán que se describen esencialmente variaciones en el rigor de las soluciones de hibridación y/o lavado. Si el grado deseado de falta de coincidencia resulta en una Tm menor que 45 °C (solución acuosa) o 32 °C (solución de formamida) , lo mejor es incrementar la concentración del SSC, de tal manera que se pueda usar una temperatura más elevada. Una guía extensa para la hibridación de ácidos nucleicos se encuentra en Tijssen (1993) Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology—Hybridization with Nucleic Acid Probes, Parte I, Capítulo 2 (Elsevier, Nueva York); y Ausubel et al., eds. (1995) Current Protocols in Molecular Biology, Chapter 2 (Greene Publishing and Wiley-Interscience , Nueva York) . Ver Sambrook et al. (1989) más arriba.

Se puede usar varios procedimientos para determinar la presencia o ausencia de una secuencia de ADN, ARN o una proteína particular. Estos incluyen, por ejemplo, los ensayos por membrana de Southern, membrana de Northern, membrana de Western y ELISA. Los expertos en la técnica conocen bien las técnicas como estas y existe muchas referencias que proporcionan los protocolos detallados. Tales referencias incluyen Sambrook et al. (1989) más arriba, y Crowther, J.R. (2001), The ELISA Guidebook, Humana Press, Totowa, NJ, Estados Unidos .

Los siguientes términos se usan para describir las relaciones de las secuencias entre dos o más polinucleótidos o polipéptidos : (a) "secuencia de referencia", (b) "ventana de comparación", (c) "identidad de secuencias" y (d) "porcentaje de identidad de secuencias". (a) Como se usa en la presente descripción, "secuencia de referencia" es una secuencia definida que se usa como base para la comparación de secuencias. Una secuencia de referencia puede ser un subgrupo o la totalidad de una secuencia especifica; por ejemplo, un segmento de una secuencia de ADNc o de genes de longitud completa o la secuencia completa de ADNc o de genes. (b) Como se usa en la presente descripción1, "ventana de comparación" hace referencia a un segmento contiguo y especifico de una secuencia de polinucleótidos, en donde la secuencia de polinucleótidos en la ventana de comparación puede comprender adiciones o deleciones (es decir, interrupciones) en comparación con la secuencia de referencia (que no comprende adiciones ni deleciones) para el alineamiento óptimo de los dos polinucleótidos. Generalmente, la ventana de comparación tiene al menos aproximadamente 20 nucleótidos contiguos de longitud y, opcionalmente, puede tener aproximadamente 30, aproximadamente 40, aproximadamente 50, aproximadamente 100 o más. Los expertos en la técnica comprenden que para evitar una alta similitud con una secuencia de referencia debido a la inclusión de interrupciones, en la secuencia de polinucleótidos se introduce, típicamente, una penalización de interrupción y se sustrae de la cantidad de coincidencias.

Los métodos de alineamiento de secuencias para comparación se conocen bien en la técnica. Así, la determinación del porcentaje de identidad de secuencias entre dos secuencias se puede obtener con el uso de un algoritmo matemático. Los ejemplos no limitantes de tales algoritmos matemáticos incluyen el algoritmo de Myers y Miller (1988) CABIOS 4:11-17; el algoritmo de alineamiento local de Smith et al. (1981) Adv. Appl. Mat . 2:482; el algoritmo de alineamiento global de Needleman y Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48:443-453; el método para búsqueda de alineamientos locales de Pearson y Lipman (1988) Proc . Nati. Acad. Sci. 85:2444-2448; el algoritmo de Karlin y Altschul (1990) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 872264, modificado como en. Karlin y Altschul (1993) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 90:5873-5877.

Las implementaciones de programación de estos algoritmos matemáticos se pueden usar para la comparación de secuencias para determinar la identidad de secuencias. Tales implementaciones incluyen y no se limitan a: CLUSTAL en el programa PC/Gene (disponible de Intelligenetics, Mountain View, California); el programa ALIGN (versión 2.0) y GAP, BESTFIT, BLAST, FASTA y TFASTA en el paquete de programas de GCG de Wisconsin Genetics, versión 10 (disponible de Accelrys Inc., 9685 Scranton Road, San Diego, California, Estados Unidos) . Los alineamientos con el uso de estos programas se pueden realizar con los parámetros predeterminados. El programa CLUSTAL está descrito por Higgins et al. (1988) Gene 73:237-244 (1988); Higgins et al. (1989) CABIOS 5:151-153; Corpet et al. (1988) Nucleic Acids Res. 16:10881-90; Huang et al. (1992) CABIOS 8:155-65; y Pearson et al. (1994) Meth. Mol. Biol. 24:307-331. El programa ALIGN se basa en el algoritmo de Myers y Miller (1988) más arriba. Con el programa ALIGN se puede usar una tabla de peso de los residuos PAM120, una penalización de longitud de interrupción de 12 y una penalización de interrupción de 4 al comparar secuencias de aminoácidos. Los programas BLAST de Altschul et al (1990) J. Mol. Biol. 215:403 se basan en el algoritmo de Karlin y Altschul (1990) más arriba. Con el programa BLASTN se puede realizar búsquedas de nucleótidos BLAST, puntaje = 100, longitud de palabra = 12, para obtener secuencias nucleótidas homologas a una secuencia nucleótida que codifica una proteina de las modalidades. Las búsquedas de proteínas BLAST se pueden realizar con el programa BLASTX, puntaje = 50, longitud de palabra = 3 para obtener secuencias de aminoácidos homologas a una proteina o polipéptido de las modalidades. Para obtener alineamientos separados con propósitos de comparación puede usarse el Gapped BLAST (in BLAST 2.0) como se describe en Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389. Alternativamente, PSI-BLAST (in BLAST 2.0) puede usarse para realizar una búsqueda repetida que detecta las relaciones de distancia entre las moléculas. Ver Altschul et al. (1997) más arriba. Cuando se usa BLAST, Gapped BLAST, PSI-BLAST, es posible usar los parámetros predeterminados de los programas correspondientes (por ejemplo, BLASTN para secuencias nucleótidas, BLASTX para proteínas). Ver www.ncbi.nlm.nih.gov. El alineamiento también se puede realizar manualmente mediante la inspección.

A menos que se indique de otra manera los valores de identidad/similitud de secuencias que se proporcionan en la presente descripción se refieren al valor obtenido con el uso de la versión 10 de con los siguientes parámetros: % de identidad y % de similitud para una secuencia de nucleótidos con un peso de interrupción de 50 y un peso de longitud de 3, y la matriz de puntajes nwsgapdna . cmp; % de identidad y % similitud para una secuencia de aminoácidos con un peso de interrupción de 8 y un peso de longitud de 2, y la matriz de puntajes BLOSUM62; o cualquier programa equivalente a este. "Programa equivalente" se refiere a cualquier programa de comparación de secuencias que, para dos secuencias cualquiera en cuestión, genera un alineamiento con coincidencias idénticas de residuos de nucleótidos o aminoácidos y un porcentaje idéntico de identidad de secuencias en comparación con el. alineamiento correspondiente generado por la versión 10 de GAP.

GAP usa el algoritmo de Needleman y Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48:443-453 para encontrar el alineamiento de dos secuencias completas que maximiza la cantidad de coincidencias y minimiza la cantidad de interrupciones. GAP toma en consideración todos los alineamientos posibles, asi como las posiciones de interrupción y crea el alineamiento con la mayor cantidad de bases emparejadas y la menor cantidad de interrupciones. Permite proporcionar la penalización de creación de interrupciones y una penalización de extensión de interrupciones en unidades de bases emparejadas. GAP debe beneficiarse de la cantidad de penalizaciones de creación de interrupciones de coincidencias para cada interrupción que inserta. Si se selecciona una penalización de extensión de interrupciones mayor que cero, GAP debe, adicionalmente, obtener beneficios para cada interrupción insertada de la longitud por la penalización de extensión de interrupción. Los valores predeterminados de penalización de creación de interrupciones y de penalización de extensión de interrupciones en la versión 10 del paquete de programas de GCG de isconsin Genetics para secuencias de proteínas son 8 y 2, respectivamente. Para las secuencias nucleótidas la penalización predeterminada de creación de interrupciones es 50 mientras que la penalización predeterminada de extensión de interrupciones es 3. Las penalizaciones de creación de interrupciones y de extensión de interrupciones se pueden expresar como un entero seleccionado del grupo de enteros que consiste en de 0 a 200. Así, por ejemplo, las penalizaciones de creación de interrupciones y de extensión de interrupciones puede ser 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65 o mayor.

GAP presenta un miembros de la familia de los mejores alineamientos. Puede haber muchos miembros de esta familia y ningún otro miembro tiene mejor calidad. GAP muestra cuatro figuras de mérito por alineamientos: Calidad, relación, identidad y similitud. La calidad es la medida maximizada para alinear las secuencias. La relación es la calidad dividida por la cantidad de bases en el segmento más corto. La identidad porcentual es el porcentaje de los símbolos que realmente coinciden. La similitud porcentual es el porcentaje de los símbolos que son similares. Los símbolos que están en las interrupciones se ignoran. Una similitud se determina cuando el valor de la matriz de puntajes para un par de símbolos es mayor o igual que 0.50, el umbral de similitud. La matriz de puntajes que se usa en la versión 10 del paquete de programas del GCG de Wisconsin Genetics es BLOSUM62 (ver Henikoff and Henikoff (1989) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 89: 10915) . (c) Como se usa en la presente descripción, "identidad de secuencias" o "identidad" en el contexto de dos secuencias de polinucleótidos o de polipéptidos se refiere a los residuos en las dos secuencias que son iguales cuando están alineadas para la máxima correspondencia en una ventana de comparación específica. Cuando el porcentaje de identidad de secuencias se usa en referencia a proteínas, se reconoce que las posiciones de los residuos que no son idénticas difieren, frecuentemente, por sustituciones de aminoácidos conservadoras, en donde los residuos de aminoácidos se sustituyen por otros residuos de aminoácidos con propiedades químicas similares (por ejemplo, carga o hidrofobicidad) y, por lo tanto, no alteran las propiedades funcionales de la molécula. Cuando las secuencias difieren de sustituciones conservadoras, el porcentaje de identidad de secuencias se puede ajusfar ascendentemente para lograr la naturaleza conservadora de la sustitución. Se dice que las secuencias que difieren por tales sustituciones conservadoras tienen "similitud de secuencias" o "similitud". Los expertos en la técnica conocen los medios para realizar este ajuste. Típicamente, esto requiere el puntaje de una sustitución conservadora como un falta de coincidencia parcial y no completo; así, se incrementa el porcentaje de identidad de secuencias. Así, por ejemplo, en donde a un aminoácido idéntico se le da un puntaje de 1 y a una sustitución no conservadora se le da un puntaje de cero, a una sustitución conservadora se le da un puntaje entre cero y 1. Los puntajes de las sustituciones conservadoras se calculan, por ejemplo, como implementados en el programa PC/GENE ( Intelligenetics , Mountain View, California) . (d) Como se usa en la presente descripción, "porcentaje de identidad de secuencias" se refiere al valor determinado por la comparación de dos secuencias óptimamente alineadas en una ventana de comparación, en donde la porción de la secuencia de polinucleótidos en la ventana de comparación puede comprender adiciones o deleciones (es decir, interrupciones) en comparación con la secuencia de referencia (que no comprende adiciones o deleciones) para el alineamiento óptimo de las dos secuencias. Para calcular el porcentaje se determina la cantidad de posiciones en las cuales se produce la base de ácido nucleico o el residuo de aminoácido idéntico en las dos secuencias para obtener la cantidad de posiciones emparejadas, se divide la cantidad total de posiciones emparejadas por la cantidad total de posiciones en la ventana de comparación y el resultado se multiplica por 100 para obtener el porcentaje de identidad de secuencia .

El uso del término "polinucleótido" no pretende limitar las modalidades a los polinucleótidos que comprenden ADN. Las personas de habilidad ordinaria en la técnica reconocerán que los polinucleótidos pueden comprender ribonucleótidos y combinaciones de ribonucleótidos y desoxirribonucleótidos . Tales desoxirribonucleótidos y ribonucleótidos incluyen tanto moléculas de origen natural como análogos sintéticos. Los polinucleótidos de las modalidades abarcan, además, todas las formas de secuencias que incluyen, pero no se limitan a, formas monocatenarias, formas bicatenarias y similares.

Los polinucleótidos aislados de las modalidades pueden estar incorporados en constructos de ADN recombinante con la capacidad de introducirse y replicarse en una célula huésped. Un "vector" puede ser cualquier constructo que incluya un sistema de replicación, asi como secuencias con la capacidad de transcribir y traducir una secuencia codificadora de polipéptidos en cierta célula huésped. Se ha descrito una gran cantidad de vectores adecuados para la transfección estable de células vegetales o para el establecimiento de plantas transgénicas en, por ejemplo, Pouwels et al., Cloning Vectors: A Laboratory Manual, 1985, supp. 1987; Weissbach and Weissbach, Methods for Plant Molecular Biology, Academic Press, 1989; y Flevin et al., Plant Molecular Biology Manual, Kluwer Academic Publishers, 1990. Típicamente, los vectores de expresión vegetal incluyen, por ejemplo, uno o más genes clonados de plantas bajo el control transcripcional de las secuencias reguladoras 5 ' y 31 y un marcador de selección dominante. Tales vectores de expresión vegetal pueden contener, además, una región reguladora del promotor (por ejemplo, una región reguladora que controle la expresión inducible o constitutiva, regulada por el medio ambiente o por el desarrollo o la expresión específica de la célula o tejido) , un sitio de iniciación de la transcripción, un sitio de unión al ribosoma, una señal de procesamiento de ARN, un sitio de terminación de la transcripción y/o una señal de poliadenilación .

Los términos "constructo recombinante" , "cásete de expresión", "constructo de expresión", "constructo quimérico", "constructo", "constructo de ADN recombinante" y "fragmento de ADN recombinante" se usan indistintamente en la presente descripción y son fragmentos de ácido nucleico. Un constructo recombinante comprende una combinación artificial de fragmentos de ácido nucleico, incluso, pero sin limitarse a, secuencias reguladoras y codificantes que en la naturaleza no se encuentran juntas. Por ejemplo, un constructo de ADN recombinante puede comprender secuencias reguladoras y secuencias codificantes derivadas de distintas fuentes o secuencias reguladoras y secuencias codificantes derivadas de la misma fuente y dispuestas de diferente manera a como se encuentran en la naturaleza. Tales constructos se pueden usar por si solos o en combinación con un vector. Si se usa un vector, la elección del vector dependerá del método que se usará para transformar las células huésped de la manera que conocen los expertos en la técnica. Por ejemplo, puede usarse un vector plásmido. Los técnicos con experiencia están conscientes de los elementos genéticos que deben estar presentes en el vector para transformar, seleccionar y propagar exitosamente las células huésped que comprenden cualquiera de los fragmentos de ácido nucleico de las modalidades. La evaluación para obtener lineas que muestren el nivel de expresión deseado y el patrón de los polinucleótidos o del locus de resistencia se puede lograr por amplificación, análisis Southern de ADN, análisis Northern de la expresión de ARNm, análisis de inmunotransferencia de expresión de proteínas, análisis fenotípico y similares.

El término "constructo de ADN recombinante" se refiere a un constructo de ADN ensamblado de fragmentos de ácido nucleico obtenidos de distintas fuentes. Los tipos y orígenes de los fragmentos de ácido nucleico pueden ser muy diversos.

En algunas modalidades se proporciona, además, casetes de expresión que comprenden un promotor unido operativamente a una secuencia de nucleótidos heterólogos de las modalidades. Los casetes de expresión de las modalidades son útiles para generar plantas, células vegetales y microorganismos transformados y para practicar los métodos para inducir la resistencia fúngica de la planta a los patógenos descritos en la presente invención. El cásete de expresión incluirá las secuencias reguladoras 5' y 3' unidas operativamente a un polinucleótido de las modalidades. "Unido operativamente" se refiere a un enlace funcional entre dos o más elementos. "Secuencias reguladoras" se refiere a los nucleótidos que están ubicados en dirección 5' (secuencias 5' no codificantes), dentro o en dirección 3' (secuencias 3' no codificantes) de una secuencia codificante, y que puede influir en la transcripción, el procesamiento o la estabilidad del ARN o la traducción de la secuencia codificante asociada. Las secuencias reguladoras pueden incluir, pero no se limitan a, promotores, secuencias líderes de traducción, intrones y secuencias de reconocimiento de poliadenilación . Por ejemplo, un enlace operativo entre un polinucleótido de interés y una secuencia reguladora (por ejemplo, un promotor) es un enlace funcional que permite la expresión del polinucleótido de interés. Los elementos unidos operativamente pueden ser contiguos o no contiguos. Cuando se usa para referirse a una unión de dos regiones codificantes de proteína, "unidos operativamente" se refiere a que las regiones codificantes se encuentran en el mismo marco de lectura. El cásete puede contener, adicionalmente, al menos un gen adicional para cotransformarlo al organismo. Alternativamente, el o los genes adicionales se pueden proporcionar en múltiples casetes de expresión. Tal cásete de expresión se proporciona con una gran variedad de sitios de restricción y/o sitios de recombinación para la inserción del polinucleótido que codifica un polipéptido antipatogénico bajo la regulación transcripcional de las regiones reguladoras. El cásete de expresión puede contener, adicionalmente, genes marcadores de selección.

En la dirección de transcripción 5 '-3', el cásete de expresión incluirá una región de iniciación transcripcional (es decir, un promotor) , una región de iniciación de traducción, un polinucleótido de las modalidades, una región de terminación de traducción y, opcionalmente , una región de terminación transcripcional funcionales en el organismo huésped. Las regiones reguladoras (es decir, promotores, regiones reguladoras transcripcionales y regiones de terminación de traducción) y/o el polinucleótido de las modalidades pueden ser nativos/análogos a la célula huésped o entre sí. Alternativamente, las regiones reguladoras y/o el polinucleótido de las modalidades pueden ser heterologos a la célula huésped o entre sí. Como se usa en la presente descripción, "heteróloga", con referencia a una secuencia, es una secuencia que se origina de una especie extraña o, si es de la misma especie, una secuencia sustancialmente modificada de su forma natural en la composición y/o locus genómico mediante intervención humana intencional. Por ejemplo, un promotor unido operativamente a un polinucleótido heterólogo es de una especie diferente a la especie de la cual se derivó el polinucleótido o, si es de la misma especie/análogo, uno o ambos están sustancialmente modificados de su forma original y/o locus genómico o el promotor no es el promotor natural para el polinucleótido unido operativamente.

La región de terminación opcionalmente incluida puede ser natural con la región de iniciación transcripcional , con el polinucleótido de interés unido operativamente, con el huésped vegetal o se puede derivar de otra fuente (es decir, extraña o heteróloga) al promotor, el polinucleótido de interés, el huésped o cualquier combinación de estos. Las regiones de terminación convenientes están disponibles del Ti-plásmido de A. turnefaciens, tales como las regiones de terminación de la octopina sintasa y la nopalina sintasa. Ver, además, Guerineau et al. (1991) Mol. Gen. Genet. 262:141-144; Proudfoot (1991) Cell 64:671-674; Sanfacon et al. (1991) Genes Dev. 5:141-149; Mogen et al. (1990) Plant Cell 2:1261-1272; Munroe et al. (1990) Gene 91:151-158; Bailas et al. (1989) Nucleic Acids Res. 17:7891-7903; y Joshi et al. (1987) Nucleic Acids Res. 15:9627-9639. En modalidades particulares se usa el terminador del gen inhibidor II de proteasas de papa (Pinll) . Ver, por ejemplo, Keil et al. (1986) Nucí. Acids Res. 14:5641-5650; y An et al. (1989) Plant Cell 1:115-122, que se incorporan en la presente invención como referencia en su totalidad.

En la práctica de las modalidades, es posible usar varios promotores, que incluyen el promotor natural de la secuencia de polinucleótidos de interés. Los promotores se pueden seleccionar según el resultado que se desee. Una amplia variedad de promotores vegetales se describen en el informe reciente de Potenza et al. (2004) In Vitro Cell Dev Biol - Plant 40:1-22, que se incorpora en la presente descripción como referencia. Por ejemplo, los ácidos nucleicos se pueden combinar con promotores constitutivos, específicos del tejido, inducibles por patógenos u otros promotores para la expresión en plantas. Tales promotores constitutivos incluyen, por ejemplo, el promotor del núcleo del promotor Rsyn7 y otros promotores constitutivos descritos en la patente núm. WO 99/43838 y la patente de los Estados Unidos núm. 6,072,050; el promotor del núcleo CaMV 35S (Odell et al. (1985) Nature 313:810-812); actina del arroz (McElroy et al. (1990) Plant Cell 2:163-171); ubiquitina (Christensen et al. (1989) Plant Mol. Biol. 12:619-632 and Christensen et al. (1992) Plant Mol. Biol. 18:675-689); pEMU (Last et al. (1991) Theor. Appl . Genet . 81:581-588); MAS (Velten et al. (1984) EMBO J. 3:2723-2730); promotor ALS (patente de los Estados Unidos núm. 5,659,026), y similares. Otros promotores constitutivos incluyen, por ejemplo, las patentes de los Estados Unidos- núm. 5,608,149; 5,608,144; 5,604,121; 5,569,597; 5,466,785; 5,399,680; 5,268,463; 5,608,142; y 6,177,611.

Algunas veces puede ser favorable expresar el gen de un promotor inducible, particularmente, de un promotor inducible por patógenos. Esos promotores incluyen los de proteínas relacionadas con la patogénesis (proteínas PR, por sus siglas en inglés) , que se inducen luego de una infección por patógenos; por ejemplo, proteínas PR, proteínas SAR, beta-1, 3-glucanasa, quitinasa, etc. Ver, por ejemplo, Redolfi et al. (1983) Neth. J. Plant Pathol . 89:245-254; Uknes et al. (1992) Plant Cell 4:645-656; y Van Loon (1985) Plant Mol. Virol. 4:111-116. Ver también la patente núm. WO 99/43819, incorporada en la presente como referencia.

Son de interés los promotores que resultan en la expresión de una proteína localmente en o cerca del sitio de la infección de patógenos. Ver, por ejemplo, Marineau et al. (1987) Plant Mol. Biol. 9:335-342; Matton et al. (1989) Molecular Plant-Microbe Interactions 2:325-331; Somsisch et al. (1986) Proc. Nati. Acad. Sci . USA 83:2427-2430; Somsisch et al. (1988) Mol. Gen. Genet. 2:93-98; y Yang (1996) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 93:14972-14977. Ver además, Chen et al. (1996) Plant J. 10:955-966; Zhang et al. (1994) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 91:2507-2511; Warner et al. (1993) Plant J. 3:191-201; Siebertz et al. (1989) Plant Cell 1:961-968; patente de los EE. UU. núm. 5, 750, 386 (inducible por nemátodas) ; y las referencias allí citadas. Es de particular interés el promotor inducible para el gen PRms del maíz, cuya expresión está inducida por el patógeno Fusarium moniliforme (ver, por ejemplo, Cordero et al. (1992) Physiol. Mol. Plant Path. 41: 189-200) .

Además, debido a que los patógenos ingresan a las plantas a través de lesiones o daño causado por insectos, se puede usar un . promotor inducible por lesiones en las construcciones de las modalidades. Esos promotores inducibles por lesiones incluyen el gen inhibidor de la proteinasa (pin II, por sus siglas en inglés) de la papa (Ryan (1990) Ann. Rev. Phytopath. 28:425-449; Duan et al. (1996) Nature Biotechnology 14:494-498); wunl y wun2, patente de los EE. UU. núm. 5, 428, 148; winl y win2 (Stanford et al. (1989) Mol. Gen. Genet. 215:200-208); sistemina ( cGurl et al. (1992) Science 225:1570-1573); WIP1 (Rohmeier et al. (1993) Plant Mol. Biol. 22:783-792; Eckelkamp et al. (1993) FEBS Letters 323:73-76); gen MPI (Corderok et al. (1994) Plant J. 6 (2 ) : 141-150 ) ; y similares, que se incorporan en la presente descripción como referencia.

Los promotores regulados por sustancias químicas se pueden usar para modular la expresión de un gen en una planta mediante la aplicación de un regulador químico exógeno. Según el objetivo, el promotor puede ser un promotor inducible por sustancias químicas, en donde la aplicación de la sustancia química induce la expresión génica, o un promotor reprimible por sustancias químicas, en donde la aplicación de la sustancia química reprime la expresión génica. Los promotores inducibles por sustancias químicas se conocen en la técnica e incluyen, pero no se limitan a, el promotor In2-2 del maíz, que se activa mediante sustancias herbicidas protectoras de bencensulfonamida, el promotor GST del maíz, que se activa mediante compuestos electrofílicos hidrófobos que se usan como herbicidas previos a la emergencia y el promotor PR-la del tabaco, que se activa mediante ácido salicíldco. Otros promotores de interés regulados por sustancias químicas incluyen promotores que responden a los esteroides (ver, por ejemplo, el promotor inducible por glucocorticoides en Schena et al. (1991) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 88:10421-10425 y McNellis et al. (1998) Plant J. 14 ( 2 ): 247-257 ) y promotores inducibles por tetraciclina y represibles por tetraciclina (ver, por ejemplo, Gatz et al. (1991) Mol. Gen. Genet. 227:229-237, y las patentes de los Estados Unidos núm. 5,814,618 y 5,789,156), incorporados en la presente descripción como referencia.

Los promotores preferenciales de tejido se pueden usar para alcanzar una expresión intensificada de los polipéptidos de las modalidades dentro de un tejido vegetal particular. Por ejemplo, un promotor preferencial de tejido se puede usar para expresar un polipéptido en un tejido vegetal, en donde la resistencia a las enfermedades es particularmente importante, tales como, por ejemplo, las raices, el tronco o las hojas. Los promotores preferenciales de tejido incluyen los mencionados en Yamamoto et al. (1997) Plant J. 12(2): 255-265; Kawamata et al. (1997) Plant Cell Physiol. 38 (7): 792-803; Hansen et al. (1997) Mol. Gen Genet . 254 (3) : 337-343; Russell et al. (1997) Transgenic Res. 6 (2) : 157-168 ; Rinehart et al. (1996) Plant Physiol. 112 (3) : 1331-1341; Van Camp et al. (1996) Plant Physiol. 112 (2 ): 525-535; Canevascini et al. (1996) Plant Physiol. 112 (2) : 513-524; Yamamoto et al. (1994) Plant Cell Physiol. 35 (5) : 773-778 ; Lam (1994) Results Probl. Cell Differ. 20:181-196; Orozco et al. (1993) Plant Mol Biol. 23 (6) : 1129-1138; Matsuoka et al. (1993) Proc Nati. Acad. Sci. USA 90 (20) : 586-9590; y Guevara-Garcia et al. (1993) Plant J. 4 (3) : 495-505. Esos promotores pueden modificarse, si es necesario, para lograr una expresión débil.

Los promotores preferenciales de tejido vascular se conocen en la técnica e incluyen los promotores que dirigen selectivamente la expresión de proteínas en, por ejemplo, el xilema y el floema. Los promotores preferenciales de tejido vascular incluyen, pero no se limitan a, promotor del gen de la prunasina hidrolasa Prunus serótina (ver, por ejemplo, publicación internacional núm. WO 03/006651) y también los mencionados en la solicitud de patente de los Estados Unidos de serie núm. 10/109,488.

Los promotores preferenciales del tallo se pueden usar para dirigir la expresión de un polipéptido de las modalidades. Los promotores- ilustrativos preferenciales del tallo incluyen el promotor del gen MS8-15 del maíz (ver, por ejemplo, la patente de los Estados Unidos núm. 5,986,174 y la publicación internacional núm. WO 98/00533), y los mencionados en Graham et al. (1997) Plant Mol Biol 33(4): 729-735.

Los promotores preferidos de hoja se conocen en la técnica. Ver, por ejemplo, Yamamoto et al. (1997) Plant J. 12 (2) : 255-265; Kwon et al. (1994) Plant Physiol. 105:357-67; Yamamoto et al. (1994) Plant Cell Physiol. 35 (5) : 773-778; Gotor et al. (1993) Plant J. 3:509-18; Orozco et al. (1993) Plant Mol. Biol. 23 ( 6) : 1129-1138 ; y Matsuoka et al. (1993) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 90 (20) : 9586-9590.

Los promotores preferidos por la raíz son conocidos y se pueden seleccionar de la multiplicidad disponible en la literatura o de los recientemente aislados de las diversas especies compatibles. Ver, por ejemplo, Hire et al. (1992) Plant Mol. Biol. 20 (2 ): 207-218 (gen de la glutamina sintetasa especifico de la raíz de soja); Keller y Baumgartner (1991) Plant Cell 3 (10) : 1051-1061 (elemento de control especifico de la raiz en el gen GRP 1.8 de la judia verde); Sanger et al. (1990) Plant Mol. Biol. 1 ( 3 ): 33- 3 (promotor especifico de la raiz del gen de la manopina sintetasa (MAS) de Agrobacterium turnefaciens) ; y iao et al. (1991) Plant Cell 3(1): 11-22 (clon de ADNc de longitud completa que codifica glutamina sintetasa (GS) citosólica, que se expresa en las raices y los nodulos de las raices de la soja) . Ver, además, Bogusz et al. (1990) Plant Cell 2 (7) : 633-641, en donde se describe dos promotores específicos de la raiz aislados de genes de hemoglobina de la no leguminosa fijadora de nitrógeno Parasponia andersonii y la no leguminosa que no fija el nitrógeno Trema tomentosa. Los promotores de estos genes se unieron a un gen reportero de ß-glucuronidasa y se introdujeron en la no leguminosa Nicotiana tabacum y la leguminosa Lotus corniculatus, y en ambos casos, se conservó la actividad promotora especifica de la raiz. Leach y Aoyagi (1991) describen su análisis de los promotores de los genes inductores de raiz rolC y rolD con alta expresión de Agrobacterium rhizogenes (ver Plant Science (Limerick) 79 (1) : 69-76) . Llegaron a la conclusión de que el potenciador y los determinantes del ADN preferidos del tejido se encuentran disociados en esos promotores. Teeri et al. (1989) usaron la fusión génica para lacZ para demostrar que el gen de ADN-T Agrobacterium que codifica para la octopina sintasa es especialmente activo en la epidermis de la punta de la raíz y que el gen TR2 ' es específico para la raíz en la planta intacta y se estimula con las incisiones en el tejido de la hoja, una combinación de características especialmente deseable para usar con un gen insecticida o larvicida (ver EMBO J. 8 (2) : 343-350) . El gen TRl ' , fusionado a nptll (neomicina fosfotransferasa II), presentó características similares. Los promotores adicionales preferidos de la raíz incluyen el promotor del gen VfENOD-GRP3 (Kuster et al. (1995) Plant Mol. Biol. 29 ( ) : 759-772 ) ; y promotor rolB (Capana et al. (1994) Plant Mol. Biol. 25 (4 ) : 681-691. Ver, además las patentes de los Estados Unidos núm. 5,837,876; 5,750,386; 5,633,363; 5,459,252; 5,401,836; 5,110,732; y 5, 023, 179.

Los promotores "preferenciales de las semillas" incluyen tanto los promotores "específicos de las semillas" (promotores activos durante el desarrollo de las semillas, tales como promotores de proteínas de almacenamiento de semillas), así como los promotores "de la germinación de semillas" (promotores activos durante la germinación de las semillas). Ver Thompson et al. (1989) BioEssays 10:108, incorporados en la presente descripción como referencia. Tales promotores preferenciales de las semillas incluyen, pero no se limitan a, Ciml (mensaje inducido por citocinina) ; CZ19B1 (maíz 19 kDa zein) ; milps (mio-inositol-l-fosfato sintasa) (ver la patente núm. WO 00/11177 y la patente de los Estados Unidos núm. 6,225,529; que se incorporan en la presente descripción como referencia) . Gamma-zein es un promotor especifico del endosperma preferido. Glob-1 es un promotor especifico del embrión preferido. Para las dicotiledóneas, los promotores específicos de las semillas incluyen, pero no se limitan a, ß-faseolina del frijol, napina, ß-conglicinina, lectina de frijol de soja, cruciferina y similares. Para las monocotiledóneas , los promotores específicos de las semillas incluyen, pero no se limitan a, maíz 15 kDa zeína, 22 kDa zeína, 27 kDa zeína, g-zeína, ceroso, reducido 1, reducido 2, globulin 1 del maíz, etc. Ver también la patente núm. WO 00/12733, en donde se describe los promotores preferenciales de las semillas de los genes endl y end2, que se incorpora en la presente descripción como referencia.

Se conoce que las modificaciones adicionales de secuencias intensifican la expresión genética en un huésped celular. Estas incluyen la eliminación de las secuencias que codifican señales falsas de poliadenilación, señales del sitio de empalme exón-intrón, repeticiones similares a transposón y otras secuencias bien caracterizadas que pueden ser perjudiciales para la expresión genética. El contenido G-C de la secuencia se puede ajustar a un promedio de concentraciones para un huésped celular especifico, como se calcula como referencia para los genes conocidos expresados en la célula huésped. Cuando es posible, la secuencia se modifica para evitar estructuras secundarias de ARNm de horquillas .

Los casetes de expresión pueden contener, adicionalmente, secuencias líder 5'. Tales secuencias líder pueden actuar para intensificar la traducción. Los líderes de la traducción se conocen en la técnica e incluyen: líderes picornavirus, por ejemplo, líder de EMCV (región no codificante 5' de Encefalomiocarditis ) (Elroy-Stein et al. (1989) Proc. Nati. Acad. Sci . USA 86:6126-6130); líderes potyvirus, por ejemplo, líder de TEV (Tobacco Etch Virus) (Gallie et al. (1995) Gene 165 (2) :233-238) , líder de MDMV ( aize Dwarf Mosaic Virus) , y proteína de unión de cadena pesada de inmunoglobulina humana (BiP, por sus siglas en inglés) (Macejak et al. (1991) Nature 353:90-94); líder sin traducir del ARNm de la proteína recubierta del virus del mosaico de la alfalfa (AMV RNA 4) (Jobling et al. (1987) Nature 325:622-625); líder del virus del mosaico del tabaco (TMV, por sus siglas en inglés) (Gallie et al. (1989) en Molecular Biology of ARN, ed. Cech (Liss, Nueva York), páginas 237-256); y líder del virus moteado clorótico del maíz (MCMV, por sus siglas en inglés) (Lommel et al. (1991) Virology 81:382-385). Ver, además, Della-Cioppa et al. (1987) Plant Physiol. 84:965-968. Se puede usar, además, otros métodos conocidos para intensificar la traducción, por ejemplo, intrones y similares.

En la preparación del cásete de expresión se puede manipular los diversos fragmentos de ADN con el fin de proporcionar a las secuencias de ADN la orientación adecuada y, según corresponda, en el marco de lectura adecuado. Con este fin se debe usar adaptadores o conectores para unir los fragmentos de ADN o puede haber involucradas otras manipulaciones para proporcionar sitios de restricción convenientes, eliminación de ADN superfluo, eliminación de sitios de restricción o similares. Con este propósito puede haber mutagénesis in vitro, reparación de ' cebadores, restricción, apareamiento, resustituciones, por ejemplo, transiciones y transversiones.

El cásete de expresión también puede comprender un gen marcador de selección para la selección de células transformadas. Los genes marcadores de selección se usan para la selección de células o tejidos transformados. Los genes marcadores incluyen genes que codifican la resistencia a antibióticos, tales como los que codifican neomicina fosfotransferasa II (NEO) y higromicina fosfotransferasa (HPT) , asi como los genes que confieren resistencia a compuestos herbicidas, tales como glufosinato de amonio, bromoxinilo, imidazolinonas y 2 , -diclorofenoxiacetato (2,4-D) . Los marcadores de selección adicionales incluyen marcadores fenotipicos, tales como ß-galactosidasa y proteínas fluorescentes, tales como proteína fluorescente verde (GFP) (Su et al. (2004) Biotechnol Bioeng 85:610-9 y Fetter et al. (2004) Plant Cell 15:215-28), proteína fluorescente ciana (CYP) (Bolte et al. (2004) J. Cell Science 117:943-54 y Kato et al. (2002) Plant Physiol 129:913-42) , y proteina fluorescente amarilla (PhiYFP™ de Evrogen, ver, Bolte et al. (2004) J. Cell Science 117:943-54) . Para marcadores de selección adicionales, ver, generalmente, Yarranton (1992) Curr. Opin. Biotech. 3:506-511; Christopherson et al. (1992) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 89:6314-6318; Yao et al. (1992) Cell 71:63-72; Reznikoff (1992) Mol. Microbiol. 6:2419-2422; Barkley et al. (1980) en The Operon, págs . 177-220; Hu et al. (1987) Cell 48:555-566; Brown et al. (1987) Cell 49:603-612; Figge et al. (1988) Cell 52:713-722; Deuschle et al. (1989) Proc. Nati. Acad. Aci. USA 86:5400-5404; Fuerst et al. (1989) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 86:2549-2553; Deuschle et al. (1990) Science 248:480-483; Gossen (1993) Ph.D. Thesis, University of Heidelberg; Reines et al. '(1993) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 90:1917-1921; Labow et al. (1990) Mol. Cell. Biol. 10:3343-3356; Zambretti et al. (1992) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 89:3952-3956; Baim et al. (1991) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 88:5072-5076; Wyborski et al. (1991) Nucleic Acids Res. 19:4647-4653; Hillenand- issman (1989) Topics Mol. Struc. Biol. 10:143-162; Degenkolb et al. (1991) Antimicrob. Agents Chemother. 35:1591-1595; Kleinschnidt et al. (1988) Biochemistry 27:1094-1104; Bonin (1993) tesis Ph.D., Universidad de Heidelberg; Gossen et al. (1992) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 89:5547-5551; Oliva et al. (1992) Antimicrob. Agents Chemother. 36:913-919; Hlavka et al. (1985) Handbook of Experimental Pharmacology, Vol. 78 (Springer-Verlag, Berlin) ; Gilí et al. (1988) Nature 334:721-724. Tales descripciones se incorporan como referencia en la presente invención.

El listado de los genes marcadores de selección descrito más arriba no pretende ser limitante. En las modalidades se puede usar cualquier gen marcador de selección.

En ciertas modalidades las secuencias de ácido nucleico de las modalidades se pueden apilar con cualquier combinación de secuencias polinucleótidas de interés para crear plantas con un fenotipo deseado. Este apilamiento puede realizarse por una combinación de genes dentro del constructo de ADN, o por cruzamiento de una linea que contiene el locus de resistencia con otra linea que comprende la combinación. Por ejemplo, los polinucleótidos de las modalidades pueden estar apilados con cualquier otro polinucleótido de las modalidades o con otros genes. Las combinaciones generadas también pueden incluir múltiples copias de cualquiera de los polinucleótidos de interés. Los polinucleótidos de las modalidades también se pueden apilar con cualquier otro gen o combinación de genes para producir plantas con una gran variedad de combinaciones de rasgos deseados que incluyen, pero no se limitan a, los rasgos deseables para alimentos para animales, tales como genes con alto contenido de aceite (por ejemplo, patente de los Estados Unidos núm. 6,232,529); aminoácidos balanceados (por ejemplo, hordothionins (patentes de los Estados Unidos núm. 5,990,389; 5,885,801; 5,885,802; y 5,703,409); cebada con alto contenido de lisina (Williamson et al. (1987) Eur. J. Biochem. 165:99-106; y la patente núm. WO 98/20122); y proteínas con alto contenido de metionina (Pedersen et al. (1986) J. Biol. Chem. 261:6279; Kirihara et al. (1988) Gene 71:359; y Musumura et al. (1989) Plant Mol. Biol. 12: 123)); mayor digestabilidad (por ejemplo, proteínas de almacenamiento modificadas (solicitud de los Estados Unidos núm. de serie 10/053,410, presentada el 7 de noviembre de 2001) ; y tioredoxinas (solicitud de los Estados Unidos núm. de serie 10/005,429, presentada el 3 de diciembre de 2001)), cuyas descripciones se incorporan como referencia en la presente descripción. Los polinucleótidos de las modalidades pueden apilarse, además, con rasgos deseables para la resistencia a los insectos, enfermedades o herbicidas (por ejemplo, proteínas tóxicas de Bacillus thuringiensis (patentes de los Estados Unidos núra. 5,366,892; 5,747,450; 5,737,514; 5723,756; 5,593,881; Geiser et al (1986) Gene 48:109); lectinas (Van Damme et al. (1994) Plant Mol. Biol. 24:825); genes de desintoxicación de fumonisina (patente de los Estados Unidos núm. 5,792,931); genes de avirulencia y resistencia a las enfermedades (Jones et al. (1994) Science 266:789; Martin et al. (1993) Science 262:1432; Mindrinos et al. (1994) Cell 78:1089); mutantes de acetolactato sintasa (ALS, por sus siglas en inglés) que conducen a la resistencia a herbicidas, tales como las mutaciones S4 y/o Hra inhibidores de glutamina sintasa, tales como fosfinotricina o basta (por ejemplo, gen bar); y resistencia al glifosato (genes EPSPS, genes GAT, tales como los descritos en la publicación de la solicitud de patente de los Estados Unidos núm. 2004/0082770 y, además, en las patentes núm. WO02/36782 y WO03/092360) ) ; y rasgos deseables para procesar o para el proceso de productos, tales como alto contenido de aceite (por ejemplo, patente de los Estados Unidos núm. 6,232,529); aceites modificados (por ejemplo, genes de la desaturasa de ácidos grasos (patente de los Estados Unidos núm. 5,952,544; O 94/11516) ) ; almidones modificados (por ejemplo, ADPG pirofosforilasas (AGPasa) , almidón sintasas (SS, por sus siglas en inglés), enzimas ramificadoras del almidón (SBE, por sus siglas en inglés) y enzimas desramificadoras del almidón (SDBE, por sus siglas en inglés) ) ; y polímeros o bioplásticos (por ejemplo, patente de los Estados Unidos núm. 5,602,321; beta-cetotiolasa, polihidroxibutirato sintasa y acetoacetil-CoA reductasa (Schubert et al. (1988) J. Bacteriol. 170:5837-5847) facilitan la expresión de polihidroxialcanoatos (PHA) ) , cuyas descripciones se incorporan en la presente descripción como referencia. Además, es posible combinar los polinucleótidos de las modalidades con polinucleótidos para proporcionar rasgos agronómicos, tales como rasgos de esterilidad masculina (por ejemplo, ver la patente de los Estados Unidos núm. 5.583,210), de resistencia del tallo, de tiempo de floración o de tecnología de transformación, tales como regulación del ciclo celular o selección de genes (por ejemplo, WO 99/61619; WO 00/17364; WO 99/25821), cuyas descripciones se incorporan en la presente descripción como referencia.

Estas combinaciones apiladas se pueden crear por cualquier método que incluye, pero no se limita a, cruzamiento de plantas mediante cualquier metodología convencional o TopCross® o por transformación genética. Si las características se apilan mediante la transformación genética de las plantas, las secuencias de polinucleótidos de interés se pueden combinar en cualquier momento y orden. Por ejemplo, una planta transgénica que comprende una o más características deseadas se puede usar como el objetivo para introducir otras características por transformación posterior. Las características se pueden introducir simultáneamente en un protocolo de transformación simultánea con los polinucleótidos de interés proporcionados por cualquier combinación de casetes de transformación. Por ejemplo, si se van a introducir dos secuencias, las dos secuencias pueden estar contenidas en casetes de transformación (trans) separados o en el mismo cásete de transformación (cis) . La expresión de las secuencias puede estar controlada por el mismo promotor o por promotores diferentes. En algunos casos, puede ser deseable introducir un cásete de transformación que suprimirá la expresión del polinucleótido de interés. Esto se puede combinar con cualquier combinación de otros casetes de supresión o casetes de sobreexpresión para generar la combinación de características deseadas en la planta.

Los métodos de las modalidades pueden requerir, pero no se limitan a, introducir un polipéptido o un polinucleótido en una planta. "Introducir" se refiere a presentar el polinucleótido a la planta. En algunas modalidades el polinucleótido se presentará de tal manera que la secuencia tenga acceso al interior de una célula de la planta, incluso a su posible inserción en el genoma de una planta. Los métodos de las modalidades no dependen de un método particular para introducir una secuencia en una planta, únicamente en que el polinucleótido gane acceso al interior de al menos una célula de la planta. Los métodos para introducir polinucleótidos en las plantas se conocen en la técnica e incluyen, pero no se limitan a, métodos de transformación estable, métodos de transformación transitoria y métodos mediados por virus.

El término "transformación" se refiere a la transferencia de un fragmento de ácido nucleico en el genoma de un organismo huésped, lo cual resulta en una herencia genéticamente estable. Los organismos huésped que contienen los fragmentos de ácido nucleico transformados se conocen como organismos "transgénicos" . El término "célula huésped" se refiere a la célula en la cual se lleva a cabo la transformación del constructo de ADN recombinante y puede incluir una célula de levadura, una célula bacteriana y una célula vegetal Los ejemplos de métodos de transformación de plantas incluyen la transformación mediada por Agrobacterium (De Blaere et al., 1987, Meth. Enzymol . 143:211) y la tecnología de transformación acelerada por partículas o "disparo de genes" (Klein et al., 1987, Nature (London) 327:70-73; patente de los Estados Unidos núm. 4,945,050), entre otros.

"Transformación estable" se refiere que el constructo de nucleótidos que se introdujo en una planta se integra en el genoma de la planta y tiene la capacidad de ser heredado por la progenie de esta. "Transformación transitoria" o expresión transitoria se refiere que un polinucleót'ido se introduce en una planta y no se integra en el genoma de la planta o un polipéptido se introduce en una planta.

Los protocolos de transformación, asi como los protocolos para introducir secuencias de polipéptidos o polinucleótidos en las plantas pueden variar según el tipo de planta o célula vegetal, es decir, monocotiledónea o dicotiledónea, a la que está dirigida la transformación. Los métodos adecuados para introducir polipéptidos y polinucleó idos en las células vegetales incluyen microinyección (Crossway et al. (1986) Biotechniques 4:320-334), electroporación (Riggs et al. (1986) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 83:5602-5606, Agrobacteriujn-transformación mediada (patentes de los Estados Unidos núm. 5,563,055 y 5,981,840), transferencia de genes directa (Paszkowski et al. (1984) EMBO J. 3:2717-2722) , y aceleración de partículas balística (ver, por ejemplo, Sanford et al., patentes de los Estados Unidos núm. 4,945,050; 5,879,918/ 5,886,244; y 5,932,782; Tomes et al. (1995) en Plant Cell, Tissue, and Organ Culture: Fundamental Methods, ed. Gamborg and Phillips (Springer-Verlag, Berlín); McCabe et al. (1988) Biotechnology 6:923-926); y transformación de Lecl (patente núm. WO 00/28058). Ver, además, Weissinger et al. (1988) Ann . Rev. Genet. 22:421-477; Sanford et al. (1987) Particulate Science and Technology 5:27-37 (cebolla); Christou et al. (1988) Plant Physiol. 87:671-674 (frijol de soja); McCabe et al. (1988) Bio/'Technology 6:923-926 (frijol de soja); Finer y Mc ullen (1991) In Vitro Cell Dev. Biol. 27P: 175-182 (frijol de soja); Singh et al. (1998) Theor. Appl . Genet . 96:319-324 (frijol de soja); Datta et al. (1990) Biotechnology 8:736-740 (arroz); Klein et ai. (1988) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 85:4305-4309 (maíz); Klein et al. (1988) Biotechnology 6:559-563 (maíz); patentes de los Estados Unidos núm. 5,240,855; 5,322,783 y 5,324,646; Klein et al. (1988) Plant Physiol. 91:440-444 (maíz); Fromm et al. (1990) Biotechnology 8:833-839 (maíz); Hooykaas-Van Slogteren et al. (1984) Nature (Londres) 311:763-764; patente de los Estados Unidos núm. 5,736,369 (cereales); Bytebier et al. (1987) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 84:5345-5349 (Liliaceae) ; De Wet et al. (1985) en The Experimental Manipulation of Ovule Tissues, ed. Chapman et al. (Longman, Nueva York), págs. 197-209 (polen); Kaeppler et al. (1990) Plant Cell Reports 9:415-418 y Kaeppler et al. (1992) Theor. Appl. Genet. 84:560-566 (transformación mediada por triquitas); D'Halluin et al. (1992) Plant Cell 4:1495-1505 (electroporación) ; Li et al. (1993) Plant Cell Reports 12:250-255 y Christou y Ford (1995) Annals of Botany 75:407-413 (arroz); Osjoda et al. (1996) Nature Biotechnology 14:745-750 (maíz mediante Agrobacterium turnefaciens) ; las cuales se incorporan en la presente descripción como referencia.

En la técnica se conocen métodos para la inserción objetivo de un polinucleótido en un sitio específico en el genoma de la planta. En una modalidad la inserción del polinucleótido en un sitio genómico deseado se logra con el uso de un sistema de recombinación específica de sitio. Ver, por ejemplo, las patentes núm. W099/25821, W099/25854, WO99/25840, W099/25855 y 099/25853, que se incorporan en la presente descripción como referencia. En resumen, el polinucleótido de las modalidades puede estar contenido en el cásete de transferencia flanqueado por dos sitios de recombinación no idénticos. El cásete de transferencia que se introduce en la planta incorpora establemente en el genoma un sitio objetivo flanqueado por dos sitios de recombinación no idénticos que corresponden a los sitios del cásete de transferencia. Se proporciona una recombinasa adecuada y el cásete de transferencia se integra en el sitio objetivo. Así, el polinucleótido de interés se integra en una posición cromosomica específica en el genoma de la planta.

Las células que se han transformado se pueden cultivar en plantas, de conformidad con los modos convencionales. Ver, por ejemplo, McCormick y col. (1986) Plant Cell Reports 5:81-84. Estas plantas se pueden cultivar y polinizar ya sea con las mismas cepas transformadas o con cepas diferentes y la progenie resultante tiene una expresión constitutiva de la característica fenotípica deseada identificada. Se pueden cultivar dos o más generaciones para asegurarse de que la expresión de la característica fenotípica deseada se mantiene y se hereda en forma estable y, después, se cosechan las semillas para asegurarse de que se ha logrado la expresión de la característica fenotípica deseada. De esta manera, las modalidades proporcionan semillas transformadas (también denominadas "semillas transgénicas") que tienen un constructo de nucleótidos de las modalidades, por ejemplo, un cásete de expresión de las modalidades, que se incorpora establemente en el genoma.

Como se usa en la presente descripción, el término "planta" puede ser una planta completa, cualquier parte de esta o un cultivo celular o tisular derivado de una planta. Así, el término "planta" puede referirse a cualquiera de los siguientes: plantas completas, componentes u órganos de plantas (que incluyen, pero no se limitan a, embriones, polen, óvulos, semillas, hojas, flores, ramas, frutos, granos, espigas, mazorcas, vainas, tallos, raíces, puntas de raíces, anteras y similares), tejidos vegetales, células vegetales, protoplastos de plantas, cultivos tisulares de células vegetales de los cuales se puede regenerar la planta de maíz, callos de plantas, matas de plantas y semillas de plantas. Una célula vegetal es una célula de una planta, ya sea tomada directamente de una semilla o planta o derivada a través del cultivo de una célula tomada de una planta. El término "grano" se refiere a la semilla madura producida por agricultores comerciales con otros propósitos aparte del cultivo o reproducción de especies. La progenie, variantes y mutantes de las plantas regeneradas se incluyen, además, en el alcance de las modalidades, siempre que estas partes comprendan los polinucleótidos introducidos.

Las modalidades de la presente invención se pueden usar para conferir o intensificar la resistencia fúngica de las plantas a los patógenos o para proteger del ataque del patógeno fúngico en las plantas, especialmente, el maíz {Zea mays) . Protegerá distintas partes de la planta del ataque por patógenos; las partes incluyen, pero no se limitan a, tallos, mazorcas, hojas, raices y panojas.

Antes de describir la presente invención detalladamente, se debe comprender que esta no se limita a modalidades particulares. Además, es necesario aclarar que la terminología que se usa en la presente invención tiene el propósito de describir modalidades particulares, pero no pretende ser limitante. Como se usa en la presente descripción y en las reivindicaciones anexas, los términos en singular y las formas singulares "un", "una" y "el", por ejemplo, incluyen los referentes en plural, a menos que el contenido lo indique claramente de otra manera. Así, por ejemplo, la referencia a "planta", "la planta" o "una planta" también incluye una gran variedad de plantas. Según el contexto, el uso del término "planta" también puede incluir progenie genéticamente similar o idéntica de la planta. El uso del término "un ácido nucleico" incluye, opcionalmente, varias copias de esa molécula de ácido nucleico EJEMPLOS Los siguientes ejemplos se proporcionan para ilustrar, pero no limitar, las reivindicaciones anexas, Se entiende que los ejemplos y modalidades que se describen en la presente invención son únicamente para ilustrar y que los expertos en la técnica reconocerán varios reactivos o parámetros que se pueden alterar sin apartarse del espíritu de la invención o del alcance de las reivindicaciones anexas.

Ejemplo 1 Fenotipado de la infección por el tizón norteño de las hojas Las plantas de maíz pueden evaluarse para el tizón norteño de las hojas (NLB) en una escala de 1 a 9, en donde las puntuaciones de 1-3 indican "susceptible", las puntuaciones de 4-6 indican "intermedio", y las puntuaciones de 7-9 indican "resistente". El diagrama de puntuación en la FIG. 3 puede usarse como una guía, con énfasis en las lesiones por encima de la espiga. Las- lesiones pueden verificarse como causadas por infección del tizón norteño de las hojas al verificar que las lesiones tienen forma de cigarro o bote con lados lisos y/o al enviar una muestra a un laboratorio de diagnóstico para confirmar la identidad del patógeno.

A las dos a cuatro semanas después del florecimiento, pueden obtenerse puntuaciones a partir de unas pocas lineas susceptibles conocidas y después compararlas con sus puntuaciones históricas. Si las lineas susceptibles conocidas indican al menos dos puntos más altos que sus puntuaciones históricas, la puntuación de las lineas en el conjunto de prueba pueden retrasarse, lo que permite de ese modo que la enfermedad avance a un estado de infección estándar. El periodo de evaluación puede extenderse solamente antes de la senescencia de la planta. Asi, si las puntuaciones son demasiado altas después de 4-5 semanas, la presión de la enfermedad es insuficiente para una puntuación efectiva.

Si las puntuaciones de las lineas susceptibles conocidas correlacionan con sus puntuaciones históricas en el periodo de tiempo de 2-4 semanas después del florecimiento y hasta antes de la senescencia de la planta, las lineas de prueba se pueden anotar en una base de trazos por medio del uso de los diagramas de puntuaciones en la FIG. 3 como una guia.

Ejemplo 2 Mapeo fino de la resistencia QTL Chr8 NLB de PH26N (HtBC) Desarrollo de la población y mapeo QTL inicial Una linea endogámica de maíz registrada tropical inadaptada, PH26N, se identificó como una fuente de resistencia al tizón norteño de las hojas (NLB) . Para facilitar la detección de no o más QTL asociados con la resistencia al tizón norteño de las hojas, se creó una población BC3 haploide duplicada de 228 lineas, con PH26N como el dador y PH581 como el genitor recurrente. El análisis de la enfermedad se realizó como se describió en el EJEMPLO 1, y se identificaron varias lineas con niveles altos de resistencia a las razas de NLB 0 y 1, y posiblemente otras. Se seleccionó una linea de doble haploide que exhibe resistencia al NLB. Esta linea se retrocruzó otra vez con PH581, y la progenie resultante fue autofecundada . La población BC4S1 posterior de 730 lineas se fenotipo después para la resistencia al NLB.

Un QTL referido en la presente descripción como HtBC mapeado a un intervalo de -2.2 cM entre los marcadores SNP PHM13395-27 (129.7 cM) y PHM4677-11 (131.9 cM) en el cromosoma 8 en el cubo 5 (Ver la TABLA 4 para información del marcador SNP) . A partir de la población BC4S1, se seleccionaron, genotiparon y fenotiparon 129 plantas, y después se fenotiparon para la resistencia al NLB a través de la prueba de la progenie. Esto condujo a la identificación de 13 recombinantes dentro de un intervalo de 0.9 cM definido por los marcadores PHM13395-27 (129.7 cM) y PHM3418-12 (130.6 cM) (Ver TABLA 4 para información del marcador SNP).

En un esfuerzo por obtener recombinantes adicionales para facilitar los esfuerzos de mapeo fino, 118 lineas de la población BC4S1 que fueron heterocigotas a través del intervalo QTL se seleccionaron y autofecundaron, y se plantaron las semillas de la progenie. A partir de la población BC4S2, 2477 plantas se cultivaron y genotiparon, y 372 plantas se seleccionaron y autofecundaron . Las semillas de las lineas selecionadas se plantaron en filas; las plantas se genotiparon; y las filas se anotaron para la resistencia al NLB. Como resultado, se identificaron 73 recombinantes adicionales dentro del mismo intervalo QTL de' 0.9 cM. En total, se identificaron 86 lineas recombinantes para usarse para el mapeo adicional.

Desarrollo del marcador CAPS y mapeo fino El intervalo QTL HtBC se delimitó, además, por medio del uso de 86 lineas recombinantes y un conjunto de nuevos marcadores. Debido a la falta de secuencias genómicas de PH26N o PH581, se usó B73 como un genoma de referencia para desarrollar los nuevos marcadores. Las secuencias génicas y de bajas copias dentro del intervalo QTL se identificaron a partir de los extremos BAC y BAC B73 secuenciados en la región, los que se obtuvieron a partir del Proyecto de secuenciación del genoma del maíz, y se dirigieron para el desarrollo del marcador del sitio polimórfico amplificado y cortado (CAPS, por sus siglas en inglés) . Se diseñaron cebadores marcadores a partir de loci objetivos por medio del uso de Primer3 (Rozen and Skaletsky (2000) Primer3 de WWW para los usuarios generales y para los programadores biólogos. En: Krawetz Sf Misener S (eds) Bioinformatics Methods and Protocole : Methods in Molecular Bíology. Humana Press, Totowa, NJ, págs. 365-386) y muestras de ADN de líneas parentales de PH26N y PH581-se extrajeron mediante el uso del método PUREGENE . RTM (Qiagen) . Los productos PCR se obtuvieron por medio del uso de la configuración y parámetros a continuación (TABLAS 1A y IB) y se limpiaron por medio del uso del protocolo ExoSAP-IT . RTM estándar (USB-Cleveland, OH, Estados Unidos) . La secuenciación del ADN se realizó mediante el uso de la química ABI BigDye terminador V3.1 en secuenciadores capilares ABI 3730 (Applied Biosystems) . Las secuencias resultantes se alinearon en el Sequencher (GeneCodes) y se analizaron para los polimorfismos del sitio de restricción derivados de los SNP o inserción/deleción (INDEL) que producen un marcador CAPS rápidamente distinguible. Las muestras de ADN de líneas recombinantes se usaron como plantilla en las reacciones PCR, y los productos PCR se usaron para los ensayos del marcador CAPS (TABLA 2) . Los fragmentos polimórfico resultantes se anotaron mediante el uso de electroforesis en gel estándar con tinción con bromuro de etidio. En total, se desarrollaron catorce nuevos marcadores CAPS capaces de distinguir los genotipos derivados de PH581 contra los genotipos derivados de PH26N (TABLA 3) .

Tabla 1A: Configuración de la PCR Mezcla de reacción ADN muestra 2 ul Hot StarTaq Master Mix (Qiagen) 5 ul ddH20 1 ul Cebador F (10 uM) .5 ul Cebador R (10 uM) .5 ul Volumen total Tabla IB: Parámetros PCR Etapa Temperatura Tiempo Núm . de ciclos Desnaturalización inicial 95 C 15 min IX Desnaturalización 95 C 30 s Apareamiento 55 o 60 C* 60 s Extensión 72 C 1 min 40X Extensión final 72 C 10 min IX Tabla 2: Ensayos del marcador CAPS Producto PCR ul Enzima de restricción ul Amortiguador 5 ul ddH20 5 ul Volumen total 15 ul Tabla 3: Marcadores CAPS para distinguir los genotipos derivados de PH581 A partir de genotipos derivados de PH26N Tamaño (s) del Tamaño (s) del BAC CAPS Tamaño Marcador Cebador F Cebador R fragmento fragmento ob etivo RE B73 (bp) 5 PH581 PH26N Sec. con Sec. con PHM2798 C0520J24 núm. de núm. de HaelII 1292 1292 474, 818 ident . : 1 ident . : 2 Sec. con Sec. con b0302Hl b0302Hl núm. de núm. de AluI 445 223, 145, 77 368, 66 ident . : 3 ident. : 4 Sec. con Sec. con c0043I10/ 299, 168, 63, b0611N13 núm. de núm. de Rsal 584 380, 180, 23 C0009G13 54 ident . : 5 ident . : 6 15 Sec. con Sec. con C0043I10/ 2717_3 núm. de núm . de Hhal 484 444, 40 260, 239 C0009G13 ident . : 7 ident . : 8 Sec. con Sec. con C0108F16/ núm. de núm. de BstXI 451 263, 188 451 C0043I10 ident . : 9 ident. : 10 Sec. con Sec. con C0108F16/ 108fl6_2 núm. de núm. de Hinfl 427 427 286, 135 C0043I10 ident . : 11 ident . : 12 Sec. con Sec. con C0108F16/ 31004 núm. de núm. de AflIII 427 427 300, 127 C0043I10 ident . : 13 ident . : 14 Sec. con Sec. con pco642297 BsiHKA C0117L01 núm. de núm. de 550 318, 232 520 3 I ident . : 15 ident . : 16 Sec. con Sec. con C0117L01/ bl09.m6 núm. de núm. de AluI 401 182, 132, 87 262, 127 C0108F16 ident . : 17 ident. : 18 C0117L01/ Sec. con Sec. con PHM18979 HincII 486 486 234, 260 C0010K12 núm. de núm. de ident . : 19 ident. : 20 Sec. con Sec. con 199, 175, 58, b0507L21 C0125I21 núm. de núm. de Hhal 434 374, 58, 2 2 ident . : 21 ident . : 22 Sec. con Sec. con 2 2 c0064L16 núm. de núm. de Xbal 412 412 262, 150 ident. : 23 ident. : 24 Sec. con Sec. con Tsp509 156K16 C0064L16 núm. de núm. de 562 562 290, 272 I ident . : 25 ident . : 26 Sec. con Sec. con b0318il3 C0064L16 núm. de núm. de Bsmal 473 400, 73 245, 155, 73 ident. :27 ident . : 28 Sec. con Sec. con PHM4757 C0384O20 núm. de núm. de Taql 457 457 222, 169, 66 ident. : 29 ident . : 30 Mapeo fino por medio del uso de los marcadores CAPS (descritos en la TABLA 3) y las 86 lineas recombinantes definidas adicionalmente en el intervalo QTL HtBC para una región definida por y que incluye los marcadores 2717_4 y b0507L21. Los intervalos abarcan cinco B73 BAC (c0043il0, c0108fl6, c0117101, c0010kl2, y c0125i21; FIG. 1) y representan -552 kb en la secuencia genómica del maíz (Proyecto de secuenciación del genoma del maí z ) .

Un conjunto adicional de líneas recombinantes se generó de las líneas BC4S1 y BC4S2 descritas anteriormente. Se seleccionaron las líneas heterocigotas a través del intervalo QTL HtBC, se autofecundaron, y se cosecharon en masa, y se plantó la semilla de la progenie. Las plantas se genotiparon con dos marcadores SNP de producción disponibles, PHM13395-27 (129.7 cM) y PHM15992-3 (128.8 cM) para identificar los recombinantes heterocigotos a través de la región (Ver TABLA 4 para la información del marcador SNP) . Trescientos noventa recombinantes se identificaron y genotiparon con los mismos marcadores CAPS usados anteriormente para delimitar el QTL a un intervalo de cinco BAC (2717_4 y 507L21), y 34 recombinantes abarcados en el intervalo QLT más estrecho.

Se seleccionaron catorce recombinantes para ensayar para la resistencia al NLB en el invernadero mediante la prueba de la progenie. Para el ensayo en invernadero, se cultivó Exserohilum turcicum en medio artificial para producir esporas para la inoculación artificial. Las esporas se recogieron y suspendieron en agua estéril, y la suspensión se diluyó a 1 x 10i esporas/ml. Cien micro litros (µ?) de la suspensión de esporas se usaron para inocular cada plántula en cultivo en el invernadero en la etapa V3. Veinticuatro horas después de la primera inoculación, las plantas se inocularon nuevamente y se colocaron después en una cámara húmeda toda la noche a temperatura ambiente. Las plantas se sacaron de la cámara húmeda y se colocaron en un banco del invernadero por la duración de la prueba, y las plantas se regaron y fertilizaron regularmente según fue necesario. La puntuación para la incidencia de la enfermedad, como resistente (0) o susceptible (1), se hizo a los 9 y 12 días después de la primera inoculación para cada planta.

Basado en los datos de la recombinación obtenidos de los catorce recombinantes (mediante el uso del ensayo de invernadero) , se delimitó adicionalmente el intervalo QTL HtBC a un intervalo que abarca dos BAC (c0108fl6, c0117101; FIG. 1), que se define por e incluye los marcadores y representa en la secuencia genómica del maíz (Proyecto de secuenciación del genoma del maíz) .

Tabla 4: Marcadores SNP HtBC Marcadores Cebador F Cebador SNPS Posición 308 de la Sec. con Sec. con sec. con núm. de PHM13395-27 núm. de núm. de ident . : 81 ident . : 63 ident . : 64 PH581 = A, PH26N = G posición 281 de la Sec. con Sec. con sec. con núm. de PHM4677-11 núm. de núm . de ident . : 82 ident . : 65 ident . : 66 PH581= G, PH26N = T posición 392 de la Sec. con Sec. con sec. con núm. de PHM3418-12 núm. de núm. de ident . : 83 ident . : 61 ident. : 62 PH581 = C, PH26N = A Posición 518 de la Sec. con Sec. con sec. con núm. de PHM15992-3 núm. de núm. de ident . : 84 ident . : 67 ident. : 68 PH581 = G, PH26N = T Construcción, ensayo y ensamblaje de la biblioteca BAC de PH26N.

En un esfuerzo por caracterizar el contenido del gen de la región genómica dentro del intervalo QTL HtBC, se construyó una biblioteca BAC a partir de PH26N. Los núcleos se aislaron de aproximadamente 200 plántulas PH26N etioladas, embebidas en agarosa de bajo punto de fusión y Usadas en gel. El ADN de alto peso molecular embebido se digirió parcialmente con Hind III, y 150-300 kb fragmentos se fraccionaron dos veces por electroforesis en gel agarosa con campo eléctrico homogéneo limitado (CHEF, por sus siglas en inglés) . Los fragmentos micro-eluidos se ligaron en el vector pCCBACl (Epicentro) según las condiciones del fabricante, y se electroporaron en células Epi300. Más de 56,000 clones (4X) se arreglaron individuamente, se dispusieron en membranas de nilón, y se seleccionaron por hibridación no radioactiva para dos sondas adyacentes al marcador de flanqueo izquierdo 108fl6_2, NLB5A y NLB3A (TABLA 5) . Dos BAC positivos se identificaron a partir de este ensayo (cbacPH26Nh.pkl36.o20, cbacPH26N . pk016. p6) y se confirmaron por PCR con cebadores a partir de las sondas y de los marcadores de flanqueo. Estos BAC se secuenciaron y ensamblaron juntos, lo que resultó en un contigo secuencia de 215 kb.

Tabla 5: Información del cebador y sonda para NLB5A y NLB3A Cebador F Cebador R Sonda Sec. con núm. Sec. con núm. Sec. con núm. de NLB5A de ident.:31 de ident.:32 ident.:33 Sec. con núm. Sec. con núm. Sec. con núm. de NLB3A de ident.:34 de ident.:35 ident . : 36 Genes candidatos HtBC El intervalo QTL HtBC estrecho contiene dos genes candidatos similares a la proteína cinasa (PK) en tándem predichos que se refieren en la presente descripción como NLB17 y NLB18 (FIG. 2) . Las secuencias de ADNc de esos genes candidatos se representan por la sec. con núm. de ident. :92 y sec. con núm. de ident. :96, respectivamente, y la secuencias de aminoácidos de los . polipépt idos codificados predichos se representan por las sec. con núm. de ident. :93 y 97.

Ejemplo 3 Mapeo fino de resistencia QTL Chr8 NLB de PH99N (Htnl) Mapeo QTL inicial La linea PH99N se identificó como una fuente de resistencia al tizón norteño de las hojas (NLB) . En un esfuerzo por identificar uno más QTL .asociados con la resistencia al NLB en las poblaciones PH99N, BC4 y BC4S1 se desarrollaron mediante el uso de PH581 como el genitor recurrente (susceptible) . A partir de esas poblaciones, 505 y 583 plantas, respectivamente, se genotiparon con marcadores SNP y se ensayaron para la resistencia al NLB por medio del uso de un análisis de plantas sencillo. Un QTL mencionado en la presente descripción como Htnl se mapeó para un intervalo de 0.6 cM entre marcadores SNP PHM2817-26 (128.8 y PHM7446-6 ( 129.4 ) (TABLA 7) en el cromosoma 8 en el cubo 5. A partir de estos experimentos se seleccionaron 100 lineas heterocigotas recombinant es para los ensayos de prueba de la progenie (ver EJEMPLO 2 con respecto a los métodos de ensayo de invernadero) para la resistencia al NLB en el invernadero.

Desarrollo del marcador CAPS y mapeo fino El mapeo fino de Htnl se inició por medio del uso de 100 recombinantes heterocigotos descritos anteriormente. Las secuencias génicas y de baja copia dentro del intervalo QTL, a partir del genoma de referencia B73, se determinaron para el desarrollo del marcador CAPS (ver EJEMPLO 2 para los métodos) . Diez nuevos marcadores CAPS que distinguen los genotipos derivados de PH99N de los genotipos derivados de PH581 se desarrollaron (TABLA 6) y se usaron para caracterizar adicionalmente los genotipos de los recombinantes.

Tabla 6: Marcadores CAPS para distinguir los genotipos derivados de PH581 De los genotipos derivados de PH99N Tamaño (s) Tamaño (s) del Marcador BAC Tamaño del Cebador F Cebador R CAPS RE fragmento 5 CAPS objetivo B73 (bp) fragmento PH581 PH99N Sec. con Sec. con PH 4582 c0435bl8 núm. de núm . de Avall 595 5995 363, 232 ident . : 41 ident. :42 10 Sec. con Sec. con 9gl3-3 C0009G13 núm. de núm. de Muí 500 484, 16 357, 127, 16 ident. : 43 ident . : 44 Sec. con Sec. con C0009G13/ K núm. de núm. de MaelII 402 278, 124 211, 124, 67 C0043I10 15 ident . : 45 ident . : 46 Tamaño (s) del Tamaño (s) del Marcador BAC Tamaño Cebador F Cebador R CAPS RE fragmento fragmento CAPS ob etivo B73 (bp) PH581 PH99N Sec. con Sec. con 273, 173, 6 7 C0043I10 núm. de núm. de S MspI 524 446, 57, 21 57, 21 ident . : 7 ident. :48 Sec. con Sec. con c0043il0/ 6 8 núm. de núm. de spI 554 312, 238, 4 550, 4 c0108f16 ident. : 9 ident. :50 Sec. con Sec. con C0108F16/ N núm. de núm. de BsrDI 491 491 248, 243 C0117L01 ident . : 51 ident . : 52 Sec. con Sec. con R C0117L01 núm. de núm. de Bbsl 465 214, 146, 105 364, 105 ident . : 53 ident . :5 Sec. con Sec. con C0125I21 núm. de núm. de Stul 477 477 383, 94 ident.: 55 ident.: 56 Tamaño (s) Tamaño (s) del Marcador BAC Tamaño del Cebador F Cebador R CAPS RE fragmento CAPS objetivo B73 (bp) fragmento PH581 PH99N Sec. con Sec. con U C0064L16 núm. de núm. de Xmnl 472 250, 222 472 ident . : 57 ident . : 58 Sec. con Sec. con 274, 167, PH 4757 C0384O20 núm. de núm. de Bsmal 457 ¦Al, 11, 5 11, 5 ident. :29 ident . : 30 10 15 El mapeo de recombinación delimitó el intervalo QTL a la región definida por y que incluye los marcadores PHM4582 y R. Esta región abarca cinco B73 BAC (c0435bl8, cQ009gl3f c0043il0, c0108fl6, C0117L01; FIG . 1) y representa -475 kb en la secuencia genómica del maíz (Proyecto de secuenciación del genoma del maíz) .

Para obtener los recombinantes adicionales, las lineas BC4 que eran heterocigotas a través del nuevo intervalo QTL se seleccionaron, autofecundaron, y se cosecharon en masa. A las 4876 lineas BCSl segregantes resultantes se les partieron los granos y se genotiparon con dos marcadores SNP de producción disponibles en el área adyacente a Htnl QTL, PHM13395-16 (129.6 cM) y PHM3418-12 (130.6 cM) (ver TABLA 7). A partir de la población BCSl, se seleccionaron 932 lineas recombinantes y se autofecundaron, y las semillas de la progenie de 761 de las lineas recombinantes seleccionadas se plantaron y genotiparon con los mismos marcadores CAPS usados anteriormente para delimitar Htnl al intervalo de cinco BAC, PHM4582 y R. Se identificaron diez recombinantes adicionales y se anotaron posteriormente para la resistencia al NLB a través de las pruebas de la progenie en ensayos de invernadero (como se describe en el EJEMPLO 2) y después genotipados con los cuatro marcadores CAPS restantes en el intervalo Htnl. El intervalo QTL Htnl se refino adicionalmente al intervalo definido por y que incluye los marcadores 6_8 y R, que incluye dos BAC (c0108fl6, c0117L01; FIG. 1) y representa -224 kb en la secuencia genómica del maíz (Proyecto de secuenciacion del genoma del maíz) .

Tabla 7: Marcadores Htnl SNP Marcadores Cebador F Cebador R SNPS Posición 316 en la sec.

Sec. con Sec. con núm. con núm. de PHM2817-26 núm. de de ident . : 37 ident . : 85 ident. : 38 PH581 = T, PH99N = C Posición 231 en la sec. con Sec. con con núm. núm. de PHM7446-6 núm. de dent. :39 ident. : 86 ident. : 0 PH581= G, PH99N = A Posición 183 en la sec. con Sec. con Sec. con núm. núm. de ident .

PHM13395-16 núm. de de ident . : 59 de ident . : 81 ident. : 60 PH581=A, PH99N =G Posición 392 en la sec.

Sec. con con núm. de Sec. con núm.

PHM3418-12 núm . de ident. de de ident . : 61 ident . : 62 ident . : 83 PH581=C, PH99N= ? Genes candidatos Htnl El intervalo QTL Htnl abarca 82.9 kb basado en la secuencia genómica derivada del ensamblaje de la secuencia BAC de PH26N (EJEMPLO 2; El QTL HtBC coincide con el intervalo QTL Htnl. El QTL HtBC coincide con el intervalo QTL Htnl. En consecuencia, los dos genes candidatos similares a la proteina quinasa (PK) en tándem predichos (NLB17, NLB18) que se identificaron como genes candidatos para HtBC son probablemente, además, genes candidatos para Htnl, si está presente en esta región del genoma de Htnl. Sin embargo, parece que Htnl carece de NLB17. Las sec. con núm. de ident. :94 y 95 representan la secuencia de nucleótidos del ADNc de NLB18 en PH99N y la secuencia de aminoácidos del producto de proteina codificado, respectivamente.

Ejemplo 4 Análisis del haplotipo de los genes candidatos Htnl y Chr8 NLB HtBC Los haplotipos pueden ser más informativos que los SNP solos y pueden ser más descriptivos que cualquier genotipo particular. Adicionalmente, una vez que se asignó un único haplotipo a una región cromosómica donante, ese haplotipo puede usarse en esa población o cualquier subconjunto de esta para determinar si un individuo tiene un gen y/o alelo particular. (Ver, por ejemplo la patente núm. WO2003054229) .

El análisis del haplotipo se realizó por medio de la resecuenciación de los dos genes candidatos QTL similares a la proteína quinasa (PK) para HtBC y Htnl (NLB17, NLB18) mediante el " uso de un panel de líneas de maíz fenotipadas para el tizón norteño de las hojas. La naturaleza altamente conservada del dominio catalítico de la quinasa de los dos genes candidatos similares a la PK en tándem fue un desafío para el diseño del cebador PCR. Además, la falta de EST para estos dos genes hizo difícil determinar su estructura exacta. Por lo tanto, para facilitar el diseño de cebadores específicos capaces de distinguir esos dos loci y amplificarlos de un panel diverso de líneas de maíz, se realizó un alineamiento de secuencia múltiple por medio del uso ClustalW de secuencias genómicas de B73 y PH26N que abarcan el dominio PK de NLB17 y NLB18. A partir de este alineamiento, se desarrollaron tres cebadores para amplificar específicamente las porciones de NLB17 , y se diseñaron dos para NLB18 (TABLA 8). Las colas de secuenciación cortas se añadieron a estos cebadores para facilitar la secuenciación. La PCR y la secuenciación se realizaron como se describió previamente (TABLAS 1A y IB; EJEMPLO 1) .

Tabla .8 : Marcadores diseñados para los genes candidatos NLB17 y NLB18 Marcador BAC Objetivo Cebador F* Cebador R' NLB17_A c0108fl6/ Proteína quinasa Sec. con núm. Sec. con c0117L01 putativa núm. 1 de ident . : 69 núm. de ident . : 70 NLB17_E c0108fl6/ Proteína quinasa sec. con núm. Sec. con c0117L01 putativa núm. 1 de ident.: 71 núm. de ident. : 72 NLB17_3 c0108fl6/ Proteína quinasa Sec. con núm. Sec. con C0117L01 putativa núm. 1 de ident. :73 núm. de ident. : 74 NLB18_A c0117L01 Proteína quinasa Sec. con núm. Sec. con putativa núm. 2 de ident. :75 núm. de ident . : 76 NLB18_E C0117L01 Proteína quinasa Sec. con núm. Sec. con putativa núm. 2 de ident.: 77 núm. de ident. : 78 * Cola de secuenciación añadida al cebador F: Sec. con núm. de ident . : 79 A Cola de secuenciación añadida al cebador R: Sec. con núm. de ident . : 80 Los marcadores se usaron para resecuenciar los cinco amplicones correspondientes a partir de un panel de 190 lineas endogámicas de maíz, que incluyen PH26N y PH99N. SNP e INDEL se usaron para clasificar las lineas endogámicas en el panel en varios grupos de haplotipo (TABLA 9) .

Tabla 9: Información del amplicón de NLB17 y NLB18 Longitud Profundidad de (fuera de Amplicón SNPS INDEL Haplotipos consenso las 190 (bp) * lineas) NLB17_A (sec. con núm. de 707 86 lineas ident . : 87) NLB17_E (sec. con núm. 10 961 104 lineas de ident . : 88) NLB17_3 (sec. con núm. 61 10 539 113 lineas de ident . : 89) Longi ud Profundidad de (fuera de Amplicón SNPS INDEL Haplotipos consenso las 190 (bp)* lineas) NLB18_A (sec. con núm. 29 100 lineas de ident . : 90) NLB18_E 171 lineas (sec. con núm. 12 624 (posible de ident. : 91) duplicación) * La longitud de consenso puede contener pocas bases a' partir de las colas de secuenciación .

La tasa de éxito de la amplificación para varios cebadores estuvo en el intervalo de 45-90 %. Ésta falta de amplificación puede ser un indicador adicional de diversidad en la región del gen candidato entre el panel de las lineas endogámicas. Dado el alto grado de no colinealidad génica entre las lineas de maíz, es posible que esos genes no estén presentes en las líneas probadas o que los genes fueran demasiado diferentes, con SNP en el sitio de iniciación, lo que causa que los cebadores no se aparearon adecuadamente. Es interesante que ninguno de los tres cebadores de NLB17 produjeran un producto en PH99N, lo que sugiere que este gen no está presente y así, no es un gen candidato para la resistencia QTL al Htnl NLB. La TABLA 10 muestra la información del haplotipo para PH26N en cada uno de los marcadores NLB17. La TABLA 11 muestra la información del haplotipo para PH26N y PH99N en cada uno de los marcadores NLB18.

Tabla 10: Información del haplotipo NLB17 para PH26N 5 25 5 25 Tabla 11: Información del haplotipo NLB18 para PH26N y PH99N 5 20 Ejemplo 5 Uso de NLB17 y NLB18 como transgenes para crear plantas de maíz resistentes Los genes NLB17 y NLB18 pueden expresarse, además, como transgenes tanto solos o en combinación, lo que permite la modulación de su expresión en diferentes circunstancias. Los siguientes ejemplos muestran cómo los genes NLB17 y/o NLB18 pueden expresarse en diferentes formas para combatir diferentes enfermedades o proteger diferentes porciones de la planta, o simplemente mover los genes NLB17 y/o NLB18 en diferentes lineas de maíz como transgenes.

Ejemplo 5a: En este ejemplo, un gen candidato se expresa por medio del uso de su propio promotor.

Para transformar el gen completo, incluso el promotor y las regiones codificantes de proteínas, los fragmentos de ADN que contienen la región codificante completa y aproximadamente 2 kb de la región en dirección 5' se amplifican por PCR con el uso del clon BAC como plantilla de ADN. Para facilitar la clonación por medio del uso de la tecnología Gateway® (Invitrogen, Carlsbad, Estados Unidos), los sitios attB se incorporan en los cebadores de PCR y el producto amplificado se clonó en el vector pDONR221 por la reacción de recombinación BP Gateway®. El fragmento resultante, flanqueado por los sitios attL, se mueve por la reacción de recombinación LR de Gateway® a un vector binario. Después, el constructo de ADN se usa para la transformación del maíz, tal como se describe en el Ejemplo 6.

Ejemplo 5b: Para expresar un gen candidato a lo largo de la planta a un nivel bajo, la región codificante del gen y sus terminadores se colocan detrás de los promotores de un gen de actina del arroz (patentes de los Estados Unidos núm. 5, 641,876 y núm. 5, 684,239) o el gen F3.7 (patente de los Estados Unidos 5,850,018). Para facilitar la clonación con el uso de la tecnología Gateway® (Invitrogen, Carlsbad, Estados Unidos), los sitios attB se incorporan en los cebadores de PCR que se usan que se el gene candidato que empiezan 35 bp en dirección 5' de su codón de iniciación. Se agregó un sitio Notl al cebador attBl. El producto amplificado se clona en el vector pDONR221 por la reacción de combinación BP de Gateway® (Invitrogen, Carlsbad, Estados Unidos). Después de la clonación, el gen resultante se flanquea por los sitios attL y tiene un sitio Notl en 35 bp en dirección 5' del codón de iniciación. Posteriormente, los fragmentos del promotor se amplifican por PCR con el uso de cebadores que contienen sitios Notl. Cada promotor se fusiona al sitio Notl del gen candidato. En la etapa final, el constructo del gen quimérico se mueve por la reacción de recombinación LR de Gateway® (Invitrogen, Carlsbad, Estados Unidos) en el vector binario PHP20622. Esto se usa para la transformación del maíz como se describió en el Ejemplo 6.

Ejemplo 5c: Para expresar el (los) gen (es) candidato (s) a través de toda la planta a un nivel alto, la región codificante del gen y su terminador se colocan detrás del promotor, la región 5' sin traducir y un intrón de un gen de ubiquitina del maiz (Christensen et al. (1989) Plant Mol. Biol. 12:619-632; Christensen et al. (1992) ' Plant Mol. Biol. 18:675-689). Para facilitar la clonación por medio del uso de la tecnología Gateway® (Invitrogen, Carlsbad, Estados Unidos), los sitios attB se incorporan en los cebadores de PCR que se usan para la amplificación del gen candidato que empieza a 142 bp en dirección 5' del codón de iniciación. El producto amplificado se clona en pDONR221 (Invitrogen, Carlsbad, USA) por medio del uso de una reacción de recombinación BP de Gateway® (Invitrogen, Carlsbad, Estados Unidos) . Después de la clonación, el gen resultante se flanquea por los sitios attL. En la etapa final, el clon se mueve por la reacción de recombinación LR de Gateway® (Invitrogen, Carlsbad, Estados Unidos) a un vector que contenía el promotor de ubiquitina del maíz, la región sin traducir 5' y el primer intrón del gen ubiquitina como es descrito por Christensen et al. (más arriba) seguido por los sitios ATTRl y R2 Gateway® para la inserción del gen candidato, detrás del cásete de expresión de ubiquitina. El vector contiene, además, un gen marcador adecuado para la transformación del maíz, por lo que el plásmido resultante, que porta el gen quimérico (promotor de la ubiquitina del maíz - región sin traducir 5' de ubiquitina - intrón ubiquitina 1 - gen candidato) , es adecuado para la transformación del maíz como es descrito en el Ejemplo 6.

Ejemplo 5d: Para expresar el (los) gen (es) candidato (s) en una raíz preferida, la expresión del nivel bajo, la región codificante del gen y su terminador se colocan detrás de un promotor preferencial de las raíces, tal como, pero sin limitarse a, el promotor de maíz NAS2, el promotor de maíz Cyclo (solicitud de patente de los Estados Unidos publicada el 13 de julio de 2006 núm. US 2006/0156439), el promotor de maíz ROOTMET2 (patente núm. O05063998, publicada el 14 de julio de 2005), el promotor CR1BI0 (patente núm. WO06055487, publicada el 26 de mayo de 2006) , el CRWAQ81 (patente núm. WO05035770, publicada el 21 de abril de 2005) y el promotor de maíz ZRP2.47 (número de acceso NCBI: U38790; GI núm. 1063664). El fragmento descrito en el Ejemplo 5b que contiene la región codificante del gen candidato flanqueada por los sitios attL y que contiene un sitio único de Notl 35 bp en dirección 5' del codón de iniciación se usa para facilitar la clonación con el uso de la tecnología Gateway® (Invitrogen, Carlsbad, Estados Unidos) . El factor del promotor se amplifica por PCR con el uso de cebadores que contienen sitios Notl. Cada promotor se fusiona al sitio Notl del gen candidato. En la etapa final, el constructo del gen quimérico se mueve por la reacción de recombinación LR de Gateway® (Invitrogen, Carlsbad, Estados Unidos) en el vector binario PHP20622. Esto se usa para la transformación del maíz como se describió en el Ejemplo 6.

Ejemplo 6 Transformación de maíz mediada por Agrobacterium y regeneración de plantas transgénicas Los constructos de ADN recombinante descritos en los Ejemplos 5a-5d pueden usarse para preparar plantas de maíz transgénico de la siguiente manera.

El maíz se transforma con los constructos de polinucleótidos seleccionados descritos en los Ejemplos 5a y 5c con el uso del método de Zhao (patente de los Estados Unidos núm. 5,981,840, y la publicación de la patente núm. W098/32326) . En resumen, los embriones inmaduros se aislaron del maíz y los embriones se ponen en contacto con una suspensión de Agrobacterium, en donde las bacterias pudieron transferir un constructo de polinucleót idos a al menos una célula de al menos uno de los embriones inmaduros (etapa 1: etapa de la infección). En esta etapa, los embriones inmaduros se sumergen en una suspensión de Agrobacterium para iniciar la inoculación. Los embriones se cocultivan durante un periodo con el Agrobacterium (etapa 2: la etapa de cocultivo) . Los embriones inmaduros se cultivan en un medio sólido después de la etapa de infección. Después del periodo de cocultivo se realiza una etapa de "reposo" opcional. En esta etapa de reposo, los embriones se incuban en presencia de al menos un antibiótico que inhibe el crecimiento de Agrobacterium sin la adición de un agente selectivo para los transformantes de la planta (etapa 3: etapa de reposo) . Los embriones inmaduros se cultivan en un medio sólido con antibiótico, pero sin un agente de selección, para eliminar el Agrobacterium y para proporcionar una fase de reposo para las células infectadas. A continuación, los embriones inoculados se cultivan en un medio que contiene un agente selectivo, y se recupera el callo transformado en crecimiento (etapa 4: la etapa de selección) . Después el callo se regeneró en plantas (etapa 5: etapa de regeneración) , y los callos cultivados en medio selectivo se cultivaron en un medio sólido para regenerar las plantas.

Ejemplo 7 Evaluación de plantas transgénicas Las plantas transgénicas se elaboran tal como se describe en el Ejemplo 6 por medio del uso de los constructos descritos en los Ejemplos 5a a 5d. Estos pueden evaluarse para la resistencia al tizón norteño de las hojas por medio del uso del protocolo descritos en el Ejemplo 1.

Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro a partir de la presente descripción de la invención.

Claims (10)

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones .

1. Un método para seleccionar una planta de maíz con resistencia mejorada al tizón norteño de las hojas, caracterizado porque comprende: a. detectar en la planta de maíz un primer alelo marcador que se enlaza y se asocia con un haplotipo seleccionado del grupo que consiste en : i. el haplotipo PH26N en NLB17_A, ii. el haplotipo PH26N en NLB17_E, iii. el haplotipo PH26N en NLB17_3, iv. el haplotipo PH26N en NLB18_A, v. el haplotipo PH26N en NLB18_E, vi. el haplotipo PH99N en NLB18_A, o vii. el haplotpo PH99N en NLB18_E; y b. seleccionar la planta de maíz que tiene el primer alelo marcador.

2. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el primer alelo marcador se enlaza al haplotipo por 20 cM.

3. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el primer alelo marcador se enlaza al haplotipo por 1 cM.

4. Un método para seleccionar una planta de maíz con resistencia mejorada al tizón norteño de las hojas, caracterizado porque comprende: a. detectar en la planta de maíz un haplotipo seleccionado del grupo que consiste en: i. el haplotipo PH26N en NLB17_A, ii. el haplotipo PH26N en NLB17_E, iii. el haplotipo PH26N en NLB17_3, iv. el haplotipo PH26N en NLB18_A, v. el haplotipo PH26N en NLB18_E, vi. el haplotipo PH99N en NLB18_A, o vii. el haplotipo PH99N en NLB18_E y b. seleccionar la planta de maíz que tiene el haplotipo .

5. Un método para identificar una planta de maíz que muestra resistencia mejorada al tizón norteño de las hojas, caracterizado porque comprende detectar en el germoplasma de la planta de maíz un alelo de un locus marcador, en donde: a. el locus marcador es PH 2798, b0302Hl, b0611N13, 2717_3, 2717_4, 108fl6_2, 31004, pco642297_3, bl09.m6, PHM18979, b0507L21, 2_2, 156K16, b0318il3, PH 4757, PHM13395-27, PHM4677-11, PHM3418-12, PHM15992-3, NLB5A, NLB3A, PHM4582, 9gl3-3, K, 6_7, 6_8, N, R, S, U, PH 4757, PHM2817-26, PHM7446-6, PH 13395-16, NLB17_A, NLB17_E , NLB17_3, NLB18_A, o NLB18_E; y b. el alelo se asocia con la resistencia mejorada al tizón norteño de las hojas.

6. Un método para identificar una planta de maíz que muestra resistencia mejorada al tizón norteño de las hojas, caracterizado porque comprende detectar en el germoplasma de la planta de maiz un haplotipo que comprende alelos en uno o más locl marcadores, en donde: a. uno o más loci marcadores se localizan dentro de un intervalo cromosómico que comprende y es flanqueado por: i. los marcadores PHM4582 y R; o ii. 6_8 y R; y b. el haplotipo se asocia con la resistencia mejorada al tizón norteño de las hojas.

7. El método de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque el haplotipo es: el haplotipo PH26N en NLB17_A, el haplotipo PH26N en NLB17_E, el haplotipo PH26N en NLB17_3, el haplotipo PH26N en NLB18_A, el haplotipo PH26N en NLB18_E, el haplotipo PH99N a NLB18_A, o el haplotipo PH99N a NLB18_E .

8. Un método para seleccionar una planta de maiz que muestra resistencia mejorada al tizón norteño de las hojas, caracterizado porque comprende: a. obtener una primera planta de maíz que comprende dentro de su genoma : i . el haplotipo PH26N en NLB17_A, ii . el haplotipo PH26N en NLB17_E, iii . el haplotipo PH26N en NLB17_3, iv. el haplotipo PH26N en NLB18_A, V. el haplotipo PH26N en NLB18_E, vi . el haplotipo PH99N en NLB18_A, o vii . el haplotpo : PH99N en : NLB18_E; cruzar la primera planta de maíz con una segunda planta de mai z ; c. evaluar las plantas de la progenie para los alelos; y d. seleccionar las plantas progenie que poseen los alelos .

9. Una planta de maíz, caracterizada porque es identificada por cualquiera de los métodos de conformidad con las reivindicaciones 5-7.

10. Una planta de maíz, caracterizada porque es seleccionada por cualquiera de los métodos de conformidad con las reivindicaciones 1-4, y 8.