HU216646B

HU216646B - Eljárás Medicago Sativa regenerálására és idegen DNS expresszálására

Info

Publication number: HU216646B
Application number: HU9300016A
Authority: HU
Inventors: Chariesse Marie Buising; Janice Schmidt; Dwight Tomes
Original assignee: Pioneer Hi-Bred International Inc.
Priority date: 1992-01-06
Filing date: 1993-01-06
Publication date: 1999-07-28
Also published as: CA2084347A1; AU6420496A; US5994626A; ATE176928T1; HUT66716A; US5731202A; GR3030201T3; JPH0698781A; EP0561082B1; AU3026092A; ES2129435T3; DE69228471T2; EP0561082A1; US5324646A; HU9300016D0; JPH09224512A; NZ245216A; DE69228471D1; CA2084347C

Abstract

A találmány a lűcerna, Medicagő sativa javítőtt transzfőrmálására ésregenerálására vőnatkőzik. A módszert lűcerna transzfőrmálásárahasználják részecskebőmbázási módszerrel. Az érett sziklevelekalkalmazásával akkőr kapják az őptimális eredményeket, ha a bőmbázást24–120 órás vízben való áztat ssal végzik. A lűcerna regenerálása éstranszfőrmálása nagymértékben javűl, ha éretlen szikleveleket, illetveéretlen embrióit használják a transzfőrmáláshőz és regeneráláshőz. Azéretlen sziklevelek azők, amelyek a bepőrzás űtán maximűm 25 nappalvannak, és előnyösen őlyan sziklevelek tartőznak ide, amelyeket 10–15nappal a bepőrzás űtán vágnak ki. Ezek a sziklevelek világőszöldszínűek, illetve áttetszőek. Az éretlen sziklevelek szőmatikűsembrióinak bőmbázásából származó növények megtartják aregenerálóképességüket. ŕ

Description

A növények transzformálása a biotechnológia egyik nagy eredménye, és hozzájárulását a nagyobb termőképességű növények, a jobb termés termesztéséhez, és ennek következtében az egész világban az élelmiszerellátás javításához széles körben elismerik. Bizonyos növényekben azonban különösen nehéz a transzformációt végrehajtani, és az értékes takarmánynövény, a lucerna (Medicago sativa) transzformálását erősen gátolták a növény tulajdonságai.

A lucerna transzformálását elsődlegesen két fő korlát gátolta: az alkalmazott transzformációs módszer, valamint az, hogy számos lucemafaj nagyon gyengén regenerálódik a szövetekből és a sejttenyészetekből.

Az első korlát abból származik, hogy a lucernát jelenleg elsődlegesen az Agrobacterium tumefaciens alkalmazásával transzformálják. Az Agrobacterium gazdatörzs specifitást mutat, és csak bizonyos Agrobacterium törzsek fertőznek néhány lucerna-genotípust. Ennek következtében a lucerna nagyon korlátozott mértékben transzformálható. A lucerna transzformálásának második fő akadálya az, hogy nagyon alacsony a regenerációs frekvenciája. Csak néhány variáns mutat közepes regenerációs frekvenciát, és azok a kiváló variánsok, amelyek nagyon jó termést adnak a szántófóldön, azok következetesen nagyon rosszul regenerálódnak. Ennek a két problémának a kombinációja egy nagyon komoly szűk keresztmetszetet jelentett a növény transzformálásában.

A lucerna más tulajdonságokat is mutat, amelyek megkülönböztetik egyéb takarmánynövényektől. Ha önmagával termékenyítik meg, akkor a virágpor esetleg nem csírázik ki, illetve ha mégis csírázik, később abbahagyja a csírázást. Tehát nem lehetséges egy igazi tenyészszülő előállítása a hibridek számára, ami lényegesen bonyolítja a nemesítést.

Megállapították, hogy a lucernának kilenc fő variánsa van: az M. falcata, Ládák, M. varia, Turkistan, Flamand, Chilei, Perui, Indiai és az Afrikai. A kiemelt szövetforrások, például az érett sziklevelek és hipokotilok azt mutatják, hogy a legtöbb termesztett variáns genotípusában a regenerációs frekvencia csak 10 százalék [Seitz-Rris, Μ. H. and E. T. Bingham, In vitro Cellular and Developmental Biology, 24(10), 1047-1052 (1988)]. Erőfeszítések történtek a regenerálás javítására, például oly módon hogy megpróbálkoztak az aszexuális szaporítással, abból a célból, hogy fenntartsák azokat a kivételes genotípusokat, amelyek rendelkeztek a regenerálódás képességével. Azonban az aszexuális módszerekkel végzett szaporításnak nincs gyakorlati jelentősége, ha számos genotípust érint. Bingham és mások megpróbálták megkerülni ezt a problémát, oly módon hogy újból és újból szelekciót végeztek. Az első ciklusban a regenerálódó genotípusokat választották ki, keresztezték, és új ciklusba vitték, egészen addig, amíg a regenerálódás elérte a 60%-ot vagy többet. Ennek a munkának volt az eredménye a Regen-S, amelyben a növények kétharmada volt képes a kalluszszövetből regenerálódni [E. T. Bingham et al., Crop Science, 15, 719-721 (1975)].

Emellett a kutatók úgy vélik, hogy a szomatikus embriogenezis a lucernában öröklődik, és csak viszonylag kis számú gén szabályozza. Ezért a regenerálás javítására tett erőfeszítéseket az embriogenezis genetikai kontrolljának izolálására fordították, valamint olyan nemesítési programokra, amelyekbe ez az információ bevihető [lásd például Μ. M. Hemandez-Femandez és B. R. Christie, Genome, 32, 318-321 (1989); I. M. Ray and E. T. Bingham, Crop Science, 29, 1545-1548 (1989)]. Ezt bonyolítják a lucerna előzőkben említett jellemzői.

A jelen találmány tárgyát az előző megközelítésektől eltérő, a lucerna transzformálásának és regenerálásának javítása képezi. A DNS közvetlen bejuttatását mikrorészecskebombázással hajtjuk végre. A belövés eredménye az, hogy az Agrobacterium rendszer korlátáit sikerül leküzdeni.

Emellett, a lucerna regenerálásának korlátáit azzal kerüljük meg, hogy éretlen szikleveleket választunk a transzformáláshoz és a regeneráláshoz. Azt találtuk, hogy ha a lucerna éretlen szikleveleit használjuk, akkor a regenerálás gyakorisága jelentősen megnő, és ennek a módszernek a következtében nincsenek a lucerna típusából származó korlátok a regenerálásban. Még a kiváló termőképességű variánsok is regenerálhatok és transzformálhatok.

A találmány tárgya tehát a Medicago sativa transzformációs gyakoriságának javítása.

A jelen találmány tárgya továbbá a Medicago sativa regenerálódásának j avítása.

A jelen találmány tárgya továbbá, hogy lehetővé tegyük bármely Medicago sativa-variáns regenerálódását.

A találmány további tárgyai az alábbi leírásból lesznek nyilvánvalóak.

Mikrorészecskebombázást használunk abból a célból, hogy DNS-sel transzformáljuk a Medicago sativa-t, ennek eredménye pedig az, hogy bármely Medicago sativa-variánsba be tudunk juttatni DNS-t.

A találmány szerinti eljárásban a Medicago sativa éretlen szikleveleit használjuk bármely Medicago sativa-variáns transzformálására és regenerálására.

Az alábbiakban röviden ismertetjük a mellékelt ábrákat.

Az 1. ábra a pPHI251 plazmid térképe.

A 2. ábra a pPHI256 plazmid térképe.

A 3. ábra egy grafikon, amely a terméseredmények időbeli lefutását mutatja, az x tengelyen a sziklevél korát, az y tengelyen a regenerációs választ ábrázolva.

A 4. ábra egy regenerálási grafikon, a variánsokból az éretlen sziklevelek (üres oszlopok) és érett sziklevelek (fekete oszlopok) alkalmazásával kapott eredményeket ábrázolva.

Az 4. ábra a pPHI413 plazmid térképe.

Mikrorészecskebombázás

A növényi sejtek transzformálására használt mikrorészecskebombázás ismert a szakterületen jártas szakember számára. Az általános eljárást T. M. Klein és munkatársai írták le [Proceedings of the National Academy of Sciences, USA, 85, 4305-4309 (1988)]. Ez az idézet, valamint a későbbiekben említett idézetek a szakterületen jártas szakemberek tudását mutatják be, és mindegyi2

HU 216 646 Β két azzal a céllal idézzük, hogy referenciaként szolgáljanak. Az alapeljárások közé tartozik a nagy sűrűségű kis részecskék, mikrorészecskék beborítása DNS-sel, amelyeket azután a részecskepisztolyba vagy héliumpisztoly-berendezésbe helyezünk, és nagy sebességre gyorsítunk, azzal a céllal, hogy áthatoljanak a sejtfalakon, és a DNS-t vagy más anyagot a bombázott sejt belsejébe juttassuk.

A korábbi munkákban idegen géneket juttattak ezzel a módszerrel dohányszövet érintetlen növényi sejtjeibe, de ennek alkalmazása a gazdaságilag fontos lucemanövényre nem volt sikeres [Tömés et al., Plánt Molecular Biology, 14, 261-268 (1990)]. A lucerna bombázását a transzformálás kivitelezése céljából korábban nem közölték.

A DNS bejutását a növényi sejtbe először a tranziens expresszióval lehet igazolni. A rövid idejű expresszió azt a célt szolgálja, hogy a bombázás után 24-48 órával igazolja a DNS jelenlétét a növényi sejtekben. Ha a bombázás után 72 órával még expresszálódik, akkor ez azt mutatja, hogy a DNS-t sikerült bejuttatni a részecskepisztoly segítségével vagy más módszerrel, és a DNSvektor működik. Ha a bombázás után kettő-nyolc héttel még tovább expresszálódik, akkor azt a következtetést lehet levonni, hogy a DNS állandóan jelen van, és valószínűleg integrálódott a növényi genomba. Ennél a pontnál a túlélési képesség azt mutatja, hogy túlélte a nukleázok támadását, amelyek tipikusan a védelem nélküli idegen DNS-eket támadják meg. Az Ro növényekben való további expresszió azt mutatja, hogy a növényi sejtben stabil expresszió játszódott le. Ezt Southem-blot elemzéssel lehet megerősíteni. Ha keresztezést végzünk, és az R| generációt elemezzük, akkor ezzel a DNS expresszióját és örökölhetőségét tovább is megerősíthetjük.

Számos különböző növény sejtforrást használhatunk arra, hogy mikrorészecskebombázással transzformáljuk. Az érett magvak hipokotiljai, sziklevelei és a levélnyelek olyan növényi szövetek, amelyek a bombázás alanyai lehetnek. A bejelentő felfedezte, hogy ha szikleveleket használunk, akkor kielégítő transzformációt kapunk. Nem szándékunk semmilyen elmélethez ragaszkodni, de az a véleményünk, hogy a sziklevelek valószínűleg jobb forrásai a bombázáshoz használt sejteknek, mivel a bombázandó sejtek azok a sejtek, amelyek képesek teljes növényekké regenerálódni. Az érett sziklevelek emellett kényelmes szövetfonások, és könnyen kivághatok a magból.

Az érett magvakról származó sziklevelek használhatók a transzformálásban, vagyis azok a magvak, amelyek elérték a pihenő állapotot. Ezt a magot vízbe helyezzük, tipikusan egy vagy több napra, a gyökér áttöri a mag burkát, és a sziklevelet kivágjuk. Az éretlen sziklevelek használatát az alábbiakban részletesebben tárgyaljuk.

Azt találtuk, hogy az érett sziklevelek transzformálásának optimális állapota akkor következik be, ha a bombázás a vízbe helyezés után 24-120 órával történik. Felfedeztük, hogy ennél a pontnál a regenerálás, a tranziens transzformáció és a kapott transzformáció az optimumnál van. 24 óránál korábban gyakorlati okokból nehezebb eltávolítani a mag burkát anélkül, hogy megsértenénk a sziklevelet. 120 óra után a növényt nehezebb regenerálni.

A szövetet egyszer vagy kétszer kell bombázni, az ennél több bombázás valószínűleg elpusztítja a sejteket.

A szövettenyészeteket is optimalizáltuk a maximális regenerációs lehetőségek irányába. Az alábbiakban ismertetett kísérletekben a Regen-S-t használtuk. Amint azt az előzőkben megjegyeztük, a Regen-S a jobb regenerációs potenciáljáról ismert. A továbbiakban a használt szövettenyészeteket ismertetjük. A regenerálásra optimalizált szövettenyészetnél a legfontosabb faktor a 2,4-diklór-fenoxi-ecetsav (2,4-D) magas koncentrációja a kinetin alacsony koncentrációjával szemben. A szövet/szerv tenyészetet általánosságban Atanassov és Brown írják le [Plánt Cell Tissue Organ Culture, 4,

111-122 (1985)].

Az alábbiakban ismertetjük a transzformált és transzformálatlan lucerna regenerálására használt táptalajokat. A szakterületen jártas szakember számára nyilvánvaló, hogy más, az ezektől a táptalajoktól lényegesen eltérő táptalajok is használhatók, és ezek is a találmány oltalmi körébe tartoznak. A leírást példákon keresztül adjuk meg.

Gamborg-féle alaptáptalaj

A Gamborg-féle B5 táptalaj széles körben használt táptalaj a növényi fajok tenyésztésében. A szakterületen jártas szakember számára jól ismert, és részletesen publikálták is [O. L. Gamborg, R. A. Miller, K. Ojima, Exp. Cell. Rés., 50, 151-158 (1968)]. Ez egy komponense az alábbiakban felsorolt táptalajoknak.

Módosított B5 táptalaj

Ezt a táptalajt Atanassov, A. és Brown, D. C. W. írja le (Plánt Cell Tissue Organ Culture, 3, 149-162 (1984)]. Egy tipikus összetételt írnak le a GIBCO Laboratories-nál, ez az alábbi: 1 mg/1 2,4-D, 0,2 mg/1 kinetin, 30 g/1 szacharóz, 3000 mg/1 KNO₃, 895 mg/1 CaCl₂, 800 mg/1 L-glutamin, 500 mg/1 MgSO₄x7H₂O, 100 mg/1 szerin, 10 mg/1 L-glutation, 1 mg/1 adenin, és azzal a módosítással, hogy az Atanassov által leírt gelrite helyett 9 g/1 Bacto Agart használnak. Ez az alábbiakban felsorolt táptalajoknak egy komponensét képezi.

Módszer táptalaj

Ez a táptalaj jól ismert a szakterületen jártas szakember számára, részletes leírását publikálták [T. Murashige and F. Skoog, PhysiologiaPlantarum, 75,473-497 (1962)]. Egy, a Gibco Láb által előállított készítmény összetétele az alábbi:

Komponens	mg/1
NH₄NO₃	1650,0
kno₃	1900,0
CaCl₂ x 2H₂O	440,0
MgSO₄ x 7H₂O^b	370,0
KH₂PO₄	170,0
Na₂-EDTA	37,3
FeSO₄ x 7H₂O	27,8

HU 216 646 Β

Komponens	mg/1
H₃BO₃	6,2
MnSO₄ x H₂O	16,9
ZnSO₄ x 7H₂O	8,6
KI	0,83
Na₂MoO₇ x 2H₂O	0,25
CuSO₄ x 5H₂O	0,025
CoC1₂ x 6H₂O	0,025

Blaydes-táptalaj és módosításai

Ezt a szakterületen jártas szakember számára jól ismert táptalajt D. F. Blaydes publikálta [Physiol. Plánt. 19, 748-753 (1966)].

A BO (alap Blaydes-táptalaj) az alábbi anyagokat tartalmazza literenként: 300 mg KH₂PO₄, 100 mg KN0₃, 1 g NH₄NO₃, 347 mg Ca(NO₃)₂x4H₂O, 35 mg MgSO₄x7H₂O, 65 mg KC1, 0,8 mg KI, 1,5 mg ZnO₄x7H₂O, 1,6 mg H₃BO₃, 4,4 mg MnSO₄xH₂O, 2 mg glicin, 0,1 mg tiamin-hidroklorid, 30 g szacharóz, 10 g (5,57 g FeSO₄x7H₂O 500 ml forró desztillált vízben oldva 7,45 g Na₂EDTA jelenlétében, pH=5,9-6,0).

A BI1 táptalaj összetétele ugyanaz, mint a BO összetétele, azzal a különbséggel, hogy 2-2 mg/1 NAA-t, Kinetint és 2,4-D-t tartalmaz.

A BOi2Y táptalaj ugyanaz, mint a BO összetétele, azzal a különbséggel, hogy még 100 mg/1 inozitot és 2 g/1 Bacto Yeast Extractot is tartalmaz. Az embrióindukció után a kiültetett növényi részeket el kell távolítani a 2,4-D hatása alól. A 2,4-D láthatóan gátolja az embrió fejlődését.

Schenk- és Hildebrandt- (SH) táptalaj

Ez a táptalaj a szakterületen jártas szakember számára jól ismert, részletesen Β. V. Schenk és A. C. Hildebrandt írta le [Can. J. Bot., 50, 199-204 (1975)]. Az SHII 9,05 pmol/l 2,4-diklór-fenoxi-ecetsavat (2,4D) és 9,30 μιηοΐ/ΐ kinetint tartalmaz.

Módosított SH-táptalaj

Ez a táptalaj a szakterületen jártas szakember számára jól ismert. Részletesen D. H. Mitten, S. J. Sato és T. A. Skokut írta le [Crop Sci. 24, 943-945 (1984)]. A módosított SH-táptalaj tartalmaz: 25 pmol/l a-naftalin-ecetsavat (NAA) és 10 pmol/l kinetint, a kalluszt az 50 μιηοΐ/ΐ 2,4-D-t és 5 μιηοΐ/ΐ kinetint tartalmazó SH táptalajra visszük át, majd 3 nappal később a BOi2Y-t tartalmazó regeneráló táptalajra viszszük át.

Az alábbiakat csak példaként említjük meg, és nem célunk, hogy ezekkel a találmány oltalmi körét szűkítsük.

Az alábbiakban említett összes kísérletben a már említett Regen-S-t használtuk. Ennek a variánsnak ismert a magas regenerációs potenciálja. Az Alfafa Vírus coat proteint (lucerna mozaikvírus burokfehérje, AMVcp), a foszfinotricinacetil-transzferázt (BAR), a neomicin-foszfotranszferázt (NPTII) és a βglükuronidázt (GUS) kódoló géneket transzformáljuk ebbe a genotípusba, a DuPont PDS 1000 részecskefegyver alkalmazásával. A lucerna mozaikvírus burokfehérje megvédheti a növényeket az AMV patogénektől, a BAR inaktiválja a nem szelektív foszfinotricin herbicidet, amely a Basta-táptalajban található, és végül az NPTII inaktiválja a kanamicint. Az NPTII-t és az AMVcp-t kódoló pPHI251 plazmidot használtuk. Ennek a plazmidnak a térképe az 1. ábrán látható. A pPHI256 plazmidot az alábbiakban jelzett módon külön használtuk BAR, AMVcp és GUS kódolására. Ennek a plazmidnak a térképét a 2. ábrán láthatjuk.

1. példa

Lucerna érett sziklevél transzformálása mikrorészecskebombázással, Basta-szelekcióval

Kiültetett növényrész: Regen-S érett sziklevelei

Plazmid: pPHI256 (GUS, AMVcp, BAR)

Bombázás: Lemezenként (8 lemez) 8 sziklevelet bombázunk kétszer, 1,8 pm átmérőjű volfrámrészecskékkel.

Tenyészet: 2 napig csíráztatott mag, az embrionális tengelyt eltávolítva a sziklevélből. A szikleveleket 0,25 mol/1 szorbitba áztatott szűrőlapokra helyezzük, és az adaxiális felszínt kétszer bombázzuk. Módosított B5 táptalajon 2 napig tenyésztjük.

nappal a bombázás után a szikleveleket módosított B5 táptalajon tenyésztjük, amely 2,5 mg/1 Bastát tartalmaz, az alábbi időtartamokig:

hét hét kalluszképzés/embriogenezis (B5 alap, 1 mg/12,4-D és 0,2 mg/1 kinetin) hét embriogenezis/embriófejlődés (B5 alap, 0,1 mg/1 NAA) hét embrióérés (BOÍ2Y alap, nincsenek hormonok)

Gyökereztetés 5 mg/1 Bastában Hajtáscsúcstenyészetek indítása

Eredmények: 60 embrió kinyerése megbámult és elpusztult a szelekció során abnormálist feláldoztunk a GUS hisztokémiai festéshez (mindegyik negatív) abnormálist újra tenyésztettünk kalluszképzés céljából (szintén GUS-negatív) normálisból 5 túlélte a magasabb szelekciót

Ebben a kísérletben öt növényt lehetett kinyerni a bombázott érett sziklevelek tenyészetéből módosított B5 táptalajon, amely 2,5 mg/1 Bastát tartalmazott. Mindegyik növényről kimutatható volt a polimeráz láncreakció alkalmazásával, hogy tartalmazza az AMVcp és a BAR géneket, amint az az 1. táblázatban látható. A β-glükuronidáz enzim aktivitása is kimutatható volt az öt növényben a GUS-vizsgálattal [Rao, G., Flynn, P., BioTechniques, 8 (1), 38-40 (1990)].

HU 216 646 Β

1. táblázat

Basta-szelekcióval kinyert lucemanövények

Növény	PCR	GUS»
AMVcp^b	BAR^C	Hajtás	Gyökér
Vizsgálat 1	Vizsgálat 2	Vizsgálat 1	Vizsgálat 2
El		+	3	-	2	2
E2	+	+	-	-	2	1
E3	+	+	-	1	-	NA
E4		+	2	-	2	NA
E5	+	+	-	-	-	-

^a Fluorimctriás GUS-vizsgálat, pg/pg összfehérje formájában kifejezve ^b Az AMVcp kódolórégió belsejét célzó oligonukleotidok ^c A CaMV promotert és a BAR kódolórégiót célzó oligonukleotidok

Az alábbiakban a szülők és az utódok PCR-elemzését mutatjuk be, ez azt mutatja, hogy 50% pozitív a BAR-ra. Az első három növény utódnövény, ezeket követi egy anyanövény, amelyben van BAR-expresszió, majd egy apai negatív kontroll, BAR-ra pozitív anyai növény, és kontrollok.

2. táblázat

A szülő és utódnövények PCR-elemzése

Minta	Forrás	BAR	AMV
B001E2xYAE92	Utód	+	-
B001E2xYAE92	Utód	-	-
BOOlE3xYAE92	Utód	-	-
Anyai BOO1E2	Anyai	+	-
YAE92 Apai	Apai	-	-
Anyai BOO1E3	Anyai	+	-
RA3 11-5 +kontroll’	NPTII+AMV	-	+
RA3 C308 - kontroll		-	-

• Ennek a pozitív kontrollnak a leírását Hill és munkatársai adták meg [Bio/Tcchnology, 9, 373-377 (1991)].

Southem-blot elemzést végeztünk azokon a szülői növényeken, amelyeket kiónoknak találtunk, és amelyek PCR-módszerrel a BAR és az AMPVcp génekre pozitívoknak bizonyultak. Ebből látható tehát, hogy a növények öröklődő transzformációját értük el.

Összefoglalva, az látható, hogy a lucernából származó érett sziklevelek transzformációja elvégezhető a mikrorészecskebombázással. Azonban, amint azt megjegyeztük, a regeneráció tipikusan igen alacsony. A regenerációt jelentősen javítani lehet éretlen sziklevelek alkalmazásával a transzformálás és a regenerálás során. Éretlen sziklevelek

A szomatikus embriogenezis lehet közvetlen, amikor az embriók közvetlenül jönnek létre a sejtekből, 60 illetve lehet közvetett, amikor a kallusz képződik, amely dedifferenciálódáson megy keresztül.

Míg a múltban a kutatás arra irányult, hogy egy adott csíraplazmaforrást használjanak, olyan genotípu25 sokat válasszanak ki, amelyek jobb regenerálódóképességgel rendelkeznek, jobb regenerálódóképesség alapján szelektáljanak ki új variánsokat, illetve a növénynemesítési technikákban olyan génekre szelektáljanak, amelyek jobb regenerálódóképességgel rendel30 kező sejtvonalakat eredményeznek, ebben a találmányban egy teljesen eltérő megközelítést használunk [lásd például Mitten et al., Crop Science, 24, 943 (1984); Seitz, Kris and Bingham, In Vitro, 24, 1047 (1988); Brown and Atanassov, Plánt Cell Tissue Organ Cul35 tűre, 4, 111-122 (1985)]. A találmány tehát arra vonatkozik, hogy az éretlen szikleveleket használjuk arra, hogy a lucerna regenerálódását és ezzel a transzformálását megjavítsuk.

Az éretlen sziklevelek használata lényeges faktor40 nak bizonyult a regenerálásban. Ahogy a mag fejlődik, a beporzás után 0-5 nappal a magembrió alakja gömbszerű, általában nincs formája, színesen áttetsző. Körülbelül az ötödik napon szív alakú a megjelenése. Az embrió ezután rotáción esik át, és körülbelül a tizedik napon látható sziklevele van. A színe áttetszőtől világoszöldig változik, és ha egy szikét helyezünk a sziklevél mögé, akkor az majdnem látható. Körülbelül 15 nap elteltével a mag részeinek differenciálódása sokkal érzékelhetőbb, és a 20. napon sötétzöld a megjelenése.

A 25. naptól kezdődően a sötétzöld szín sárgába megy át. A 30. napon krémes fehér színű. Ennél a pontnál van a pihenési periódus.

A bejelentő azt találta, hogy azok az éretlen sziklevelek adnak jobb regenerálást, amelyek a beporzás után 55 25 nappal képződnek. A beporzás után 5-7 nappal a szív fázis látható, azonban gyakorlati szempontból nehéz kivágni a sziklevélrészt ebben a fázisban, és megkülönböztetni az embrió többi részétől. A sziklevelet könnyebben lehet izolálni a 10. nap körül, amikor átlátszó, illetve nagyon világos zöld színű. Előnyös a

HU 216 646 Β

10-15. nap közötti periódus, és ekkor jelentősen jobb regenerálódást kapunk. A sziklevél kivágásának legelőnyösebb időpontja a beporzás utáni körülbelül 10. nap és/vagy a sziklevél áttetsző, illetve világoszöld színű. A világoszöld színt a Pánton Color Chart PHS372 számhoz hasonlíthatjuk.

Az ismertetett módon használva az éretlen szikleveleket lehetséges olyan variánsok regenerálása, amelyek azelőtt soha nem voltak képesek a transzformációra és a regenerálódásra. Tehát, míg a múltban a regenerálható növények nem mindig az előnyös fenotípust hordozták, ma már a lucerna egészen kiváló vonalai is regenerálhatok. Ezek a kiváló vonalak tipikusan a kívánt terméstulajdonságokkal rendelkeznek, de nagyon gyengén regenerálódnak.

További eredmény, hogy ha éretlen szikleveleket használunk, akkor olyan kiváló vonalakat tudunk transzformálni, amelyeket korábban a DNS bejuttatása után nem lehetett regenerálni. A transzformálás elvégezhető bombázással, illetve a már korábban ismert Agrobacterium módszerrel, azzal, hogy a regenerálás most már lehetséges.

2. példa

A tipikus protokoll szerint az éretlen sziklevelet módosított B5 táptalajra visszük. 21-28 nap elteltével a szomatikus embriókat MS-táptalajra visszük, és hagyjuk, hogy megérjenek. A szakterületen jártas szakember számára természetesen számos ismert variánsa létezik ennek a protokollnak, és ezt csak példaként adjuk meg.

Az alábbiakban megjavított regenerálódást kapunk, ami a kiültetett növényrész korával korrelál.

Két variánsból származó növényeket három csoportba osztunk. Az első csoportba hat növényt tettünk az YAE92-ből, a második csoportba öt növényt tettünk az YAE92-ből, a harmadik csoportba pedig öt növényt tettünk az YAM93-ból. Az alábbiakban következő 3. táblázatban látható az egyes variánsok háttere. Mindegyik csoportot kizárólag a csoporton belül keresztez10 zük. A kapott növények közül az egyes racémot egyenként azonosítjuk, és az integritását fenntartjuk. A betakarítást a beporzás után adott időpontokban, 0-30 nap között végezzük, korábbi betakarítást végezve egy adott racémon és késői betakarítást végezve ugyanazon a racémon. A csoport integritását fenntartva, és a számozott racémokból végezve a betakarítást a kísérlet során, igazolható, hogy egy adott variánson belül is a genotípus variációja nem befolyásolja a regenerálódást, amíg a regenerálást az éretlen sziklevélből végezzük. Az adott időtartam alatt kinyert mindegyik sziklevél regenerálódott. A 3. ábra grafikonján az eredmények láthatók, az x tengelyen a sziklevél beporzás utáni korát ábrázoljuk, az y tengelyen pedig a regenerációs válaszokat. Az eredmények azt mutatják, hogy még ugyan25 annak a racémnak az esetében is jobb a regeneráció közvetlenül a beporzás után, egészen a 15. napig, és a regeneráció csökken egészen az érettségig.

A 4. táblázatban az időbeli lefutás értékelése látható. Azaz, az világos, hogy a kivágott sziklevél kora a kriti30 kus faktor, ami a regenerálást érinti.

3. táblázat

A csíraplazma százalékos hozzájárulása

	Yaria	Ládák	Turk	Falc	Chil	Peru	Indián	African	Flemish	Unk
YAE92	27	8	4	6	8	-	-	-	47	-
YAM93	23	8	10	8	7	2	-	-	42	-

4. táblázat 40

Regenerálás százalékos válaszként bemutatva, három lucemanövény-csoporton belüli kontrollált keresztezésből származó éretlen sziklevelekből

KOR (Beporzás utáni napok)	Az értékelt sziklevelek száma	Százalékos válasz
6	44	48
7	38	53
8	42	52
9	39	64
10	52	60
11	44	61
12	51	57
13	53	62
14	38	55
15	42	43
16	38	34

KOR (Beporzás utáni napok)	Az értékelt sziklevelek száma	Százalékos válasz
17	42	27
18	49	22
19	59	17
20	56	14
21	30	7
22	45	9
23	41	7
24	19	5
25	68	1
26	73	1
27	18	0
28	9	0
29	17	0
30	17	0

HU 216 646 Β

4. táblázat (folytatás)

KOR (Beporzás utáni napok)	Az értékelt sziklevelek száma	Százalékos válasz
31	15	0
32	11	0
33	15	0
34	9	0
35	10	0
36	17	0
37	18	0
38	14	0
39	11	0
40	12	0

Az tehát látható, hogy ha éretlen szikleveleket használunk a lucerna regenerálására, akkor jelentősen jobb eredményeket kapunk.

3. példa

Ez a kísérlet megerősíti, hogy az éretlen sziklevelek használata az, ami a magjavított regenerálódást eredményezi, és bármely csíraplazmaforrásra használható. Számos variánst, beleértve azokat is, amelyek nagyon gyengén regenerálódnak, sikerült az éretlen sziklevelek alkalmazásával regenerálni. Az 5. táblázatban felsorolt variánsok közül mindegyikből minimum tizenkét növényt ültettünk el, beporoztuk, azzal a különbséggel, hogy a Grimm (Pi 452472)-ből 15 növényt, a Mesa

Sirsa-variánsból 30 növényt, és a RA3 klónból 1 növényt ültettünk el és poroztunk be. Mindegyik azonosított racémot a beporzás után 10-15 nappal a beporzás után, illetve érett (körülbelül 30 nap) betakarítunk. Az éretlen és az érett szikleveleket a 2. példában leírtak alapján regeneráljuk.

Az alábbi 5. táblázatban bemutatott adatok azt mutatják, hogy az éretlen sziklevelek használata jelentősen megnöveli a regenerálást még azoknál a variánsoknál is, amelyek eladdig nagyon gyenge regenerá15 lást mutattak, illetve egyáltalán nem regenerálódtak. A 4. ábrán grafikusan mutatjuk be a regenerálásbeli különbségeket azoknál a variánsoknál, amelyeket nagyon nehéz regenerálni. A kiválasztott variánsok, és főleg azok, amelyek kiemelkedően rosszul regenerá20 lódnak, láthatók a fekete oszlopokban az érett sziklevelek százalékos regenerálódását figyelembe véve, illetve a csíkozott oszlopokban az éretlen sziklevelek regenerálódását figyelembe véve. Az éretlen sziklevelek használata minden esetben javított regenerálást eredményezett, beleértve azokat a variánsokat is, amelyek az érett sziklevelek alkalmazása esetén nem regenerálódtak.

5. táblázat

A százalékos regenerálás összehasonlítása a beporzás után 30 nappal levő érett sziklevelek, illetve a beporzás után 10-15 nappal levő éretlen sziklevelek esetében

Lucerna jele	A vizsgált érett sziklevelek száma	A regenerálódó érett sziklevevelek százaléka	A vizsgált éretlen sziklevelek száma	A regenerálódó éretlen sziklevevelek százaléka
Grimm (Pi 452472)	206	0	223	15
Norseman	152	28	198	37
Lahontan	167	2	184	30
Turkistan (Pi 86696)	176	8	186	18
Tetőn	145	3	175	16
ΡΪ251689	140	0	129	21
Caliverde65	138	0	167	27
Buffalo	127	1	158	20
Cody	161	0	183	31
Hairy Peruvian	147	4	166	18
Hairy Peruvian (BIG-PLH)	150	0	173	22
Mesa Sirsa	243	0	262	17
Sonora	110	11	127	23
DuPuits	138	6	145	24
Iroquois	143	0	158	26
Vemal	152	22	161	34
Culver	170	0	173	23
Agate	135	0	155	19
Ramsey	121	0	181	24

HU 216 646 Β

5. táblázat (folytatás)

Lucerna jele	A vizsgált érett sziklevelek száma	A regenerálódó érett sziklcvcvclck százaléka	A vizsgált éretlen sziklevclck száma	A regenerálódó éretlen sziklcvcvclck százaléka
El Unico	149	0	190	28
Regen-S/RA3	43	54	63	72
YAM93	164	0	196	34
YAE92	179	0	187	27

4. példa

Három különböző vizsgálatot végeztünk annak meghatározására, hogy az éretlen embriók transzformálhatók-e.

Az első vizsgálatban a szikleveleket pPHI413 plazmiddal bombázzuk (lásd 5. ábra) a fentiek szerint, és a GUS-expresszió szintjét vizsgáljuk. Negyvenkét mintát bombáztunk. Az optimális expresszió a bombázás után 48-72 órával volt, mikor is a 42 mintából 26 expresszálta a GUS-t 1,7 pg/μΐ összfehérje értékben. Öt nappal a bombázás után 30 mintából hatban volt átlagban 2 pg/pg aktivitás, a bombázás után 17 nappal 30 mintából háromban volt átlagban 2 pg/^g összfehérjeakti vitás.

A második vizsgálatban a bombázásnak a szelekció alatt végzett lucemaregenerálásra gyakorolt hatását vizsgáltuk. A Regen-S éretlen szikleveleit a beporzás után 11 nappal gyűjtjük be. A szikleveleket kivágjuk az embrióból, háromszor bombázzuk volfrámrészecskékre adszorbeált pPHI251 plazmiddal (1. ábra), majd 25 mg/1 kanamicin-szulfátot tartalmazó módosított B5 táptalajon tenyésztjük. A szomatikus embriókat a kezelés után körülbelül két hónappal nyerjük ki, két hónapig hagyjuk száradni MS-táptalajon, majd 100 mg/1 kanamicin-szulfátot tartalmazó MS-táptalajon csíráztatjuk. A levélszöveteket kinyerjük, és vizsgáljuk a neomicin-foszfotranszferáz-aktivitásukat. Az eredmények a 6. táblázatban találhatók.

6. táblázat

Növény	NPTII-aktivitás pg'pg összfehérje	AMVcp (elisa)
CBX106	3	+
CBX107	2	-
CBY107	5	-
CBY108	4	-
CBZ108	1	-
CBX1I2	I	+
CBY112	3	-
CBZ112	1	-
CBA112	1	-
CBX115	2	-
CBX116	2	+
CBY116	3	-

Növény	NPTII-aktivitás pg'pg összfehérje	AMVcp (elisa)
CBX117	3	-
1 Regen-S 3-11	13	-
2 Regen- S 3-11	10	-
3 Regen-S 3-11	9	-
Regen-S negatív kontroll¹¹	0	-
Rambler pozitív kontroll^b	4	+

^a A negatív kontrollt TE-puffcrrel kezelt volfrámrészecskékkel bombáztuk, és kanamicint nem tartalmazó táptalajon regeneráltuk. ^b A Rambler pozitív kontroll egy korábban azonosított transzgenikus lucemanövcny, amelyről igazolták, hogy a neomicinfoszfotranszferáz gént tartalmazza és expresszálja [Hill ct al.,

3Q Bio/Technology, 9, 373-377 (1991)].

A harmadik vizsgálatban a találmánynak egy további megvalósítási módját mutatjuk be, és a bombázás hatását vizsgáljuk a transzformált kiváló lucernavariánsok regenerálására. Az éretlen szikleveleket a beporzás után 11 nappal levő embriókból vágjuk ki. A szomatikus embriókat regeneráljuk. A szomatikus embriókat ötször bombázzuk volfrámrészecskékkel, amelyekre a pPHI251 plazmidot adszorbeáltuk (1. ábra), majd 25 mg/1 kanamicin-szulfátot tartalmazó mó40 dosított B5 táptalajon tenyésztjük. Az embriókat 20 nappal a bombázás után 25 mg/1 kanamicin-szulfátot tartalmazó friss, módosított B5 táptalajra visszük át. A zöld szomatikus embriókat a bombázás után 50 nappal levesszük, és 100 mg/1 kanamicin-szulfátot tar45 talmazó MS-táptalajon hagyjuk megérni. A bombázás után 80 nappal levélmintákat veszünk, és vizsgáljuk a neomicin-foszfotranszferáz-aktivitásukat. Az eredmények a 7. táblázatban láthatók.

7. táblázat

Yam93 regeneráns	NPTII-aktivitás (pg'pg összfehérje)
CB93.1	11
CB93.2	13
CB93.3	3
CB93.4	8
CB93.5	4
CB93.6	9

HU 216 646 Β

7. táblázat (folytatás)

Yam93 rcgcncráns	NPTIl-aktivitás (pg/pg összfehérje)
Yam93 negatív kontroll	0
Rambler 10-1 -l^b	2

A negatív kontroll növényt ΤΠ-puffcrrcl kezelt volfrámrészecskékkcl bombázott éretlen sziklevelekből regeneráltuk. ^b A Rambler pozitív kontroll egy korábban azonosított transzgenikus luccmanövény, amelyről igazolták, hogy a ncomicinfoszfotranszferáz gént tartalmazza cs expresszálja [Hill ct al., Bio/Tcchnology, 9, 373-377 (1991)].

Az utóbbi vizsgálat azt igazolta, hogy ha éretlen embriókat használunk szomatikus embriók kialakítására, majd ezeket az embriókat bombázzuk, akkor még több növény nyerhető ki. Továbbá, azt találtuk, hogy a keletkező növény megtartja a regenerálóképességét. Az elit variánsok nemcsak regenerálhatok, hanem meg is tartják ezt a képességüket.

Az is látható továbbá, hogy az éretlen embriók vagy szomatikus embriók bombázása nem érinti hátrányosan a regenerálást, és a DNS expresszálódik ezekben a regenerálható sejtekben és növényekben.

A fentiekben igazoltuk a Medicago sativa transzformálását, részecskebombázásos transzformálását, valamint azt, hogy éretlen sziklevelek alkalmazásával lehetséges a Medicago sativa javított regenerálása. Olyan variánsok regenerálását sikerült elérni, amelyek korábban nem regeneráltak, vagy nagyon gyengén regeneráltak. Tehát ezeknek a variánsoknak a transzformációja is lehetséges.

A találmány tehát a megjelölt célkitűzéseit elérte.

Claims

SZABADALMI IGÉNYPONTOK

1. Eljárás lucerna regenerálására, azzal jellemezve, hogy a lucerna éretlen sziklevele sejtjeinek szomatikus embriógenezisét iniciáljuk.
2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az éretlen sziklevélsejtek legfeljebb 25 nappal beporzás utániak.
3. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az éretlen sziklevélsejtek 10-15 nappal beporzás utániak.
4. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az éretlen sziklevélsejtek 10 nappal beporzás utániak.
5. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a sziklevél áttetsző vagy világoszöld színű.
6. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a lucernának egy kiváló variánsát regeneráljuk.
7. A 6. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a variánst az 5. táblázatban felsoroltak közül választjuk.
8. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az éretlen sziklevelet a lucerna magembrióiból kivágjuk, a sziklevelet egy auxinnal érintkezésbe hozzuk, ezáltal a sejtosztódást és -növekedést indukáljuk, és így az éretlen sziklevél szomatikus embriógenezisét váltjuk ki.
9. Eljárás egy lucemanövény regenerációs képességének javítására, azzal jellemezve, hogy a növény éretlen szikleveleinek sejtjeiben szomatikus embriógenezist indukálunk, majd a szomatikus embriót érett lucemanövénnyé neveljük.
10. A 9. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a szomatikus embriógenezist nem regenerálható lucemanövény-variánsok éretlen sziklevelei sejtjeiben iniciáljuk, majd az embriót regenerálható növénnyé neveljük.
11. Eljárás idegen DNS expresszálására lucemasejtekben, azzal jellemezve, hogy:

a DNS-t éretlen sziklevelekből nyert szomatikus embriók sejtjeiben expresszáljuk oly módon, hogy az idegen DNS-t hordozórészecskékhez kötjük; a részecskéket fizikailag a sejtek irányában felgyorsítjuk, és a sejteket így olyan részecskékkel bombázzuk, amelyeken úgy van rajta az idegen DNS, hogy annak legalább egy része bejut legalább a sejtek egy részének a belsejébe;

majd igazoljuk az idegen DNS expresszióját a sejtekben.
12. A 11. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az idegen DNS-t lucernába transzformáljuk.
13. A 11. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a sejteket egyszer vagy kétszer bombázzuk.
14. A 11. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy legfeljebb 25 nappal beporzás utáni sziklevelek sejtjeit bombázzuk.
15. All. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a sejteket a sziklevelek 24-120 órás vízfelszívását követően bombázzuk.
16. A 11. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy 10-15 nappal beporzás utáni sziklevelek sejtjeit bombázzuk.
17. A 11. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy 10 nappal beporzás utáni sziklevelek sejtjeit bombázzuk.
18. A 11. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy áttetsző vagy világoszöld színű sziklevelek sejtjeit bombázzuk.
19. Eljárás idegen DNS lucemanövényekbe történő transzformálására, azzal jellemezve, hogy a DNS-t éretlen lucemasziklevelek sejtjeibe juttatjuk, és az idegen DNS-t tartalmazó sejteket lucemanövényekké neveljük.
20. A 19. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a DNS-t 10-15 nappal beporzás utáni sziklevelek sejtjeibe juttatjuk.
21. A 19. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a DNS-t 10 nappal beporzás utáni sziklevelek sejtjeibe juttatjuk.
22. A 19. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a DNS-t áttetsző vagy világoszöld színű sziklevelek sejtjeibe juttatjuk.
23. A 19. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az idegen DNS-t egy hordozórészecskéhez kötjük, a részecskét egy éretlen sziklevélbe lőjük, oly módon, hogy a DNS legalább egy része az éretlen szik9

HU 216 646 Β levélsejtek belsejébe kerül, a szövetet növekedést elősegítő táptalajon tenyésztjük, majd a kapott megnövekedett szövetet olyan érett lucemanövénnyé neveljük, amely tartalmazza a bejuttatott DNS-t.
24. A 19. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az idegen gént Agrobacterium tumefaciensben fennmaradó plazmidba juttatjuk, majd az Agrobacterium tumefaciens sejteket az éretlen lucemasejtekkel úgy kombináljuk, hogy az idegen DNS a lucemasejtekbe transzformálódik.
25. A 19. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a DNS-t a lucerna kiváló termóképességű variánsába transzformáljuk.
26. Eljárás idegen DNS transzformálására lucernanövényekbe, azzal jellemezve, hogy az idegen DNS-t hordozórészecskéhez kötjük, a részecskét felgyorsítva éretlen sziklevélbe juttatjuk úgy, hogy a DNS legalább egy része a sziklevélsejtek belsejébe kerül, a szövetet növekedést elősegítő táptalajon tenyésztjük, majd a kapott megnövekedett szövetet olyan érett lucemanövénnyé neveljük, amely tartalmazza a bejuttatott DNS-t.
27. A 26. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a sziklevelet kivágjuk, és hagyjuk, hogy a sziklevél vizet szívjon magába 24-120 óra hosszat, a DNS-t bejuttatjuk a sziklevél sejtjeibe, majd a sejteket a DNS-t tartalmazó lucemanövényekké neveljük.
28. Eljárás idegen DNS lucemanövényekbe történő transzformálására, azzal jellemezve, hogy lucerna éretlen szikleveleinek a szomatikus embriógenezisét iniciáljuk, a DNS-t az embrió sejtjeibe juttatjuk be, majd a DNS-t tartalmazó sejteket lucemanövényekké neveljük.