JPH0655149B2 - Ｌ―リジンの製造法 - Google Patents
Ｌ―リジンの製造法Info
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- JPH0655149B2 JPH0655149B2 JP60047515A JP4751585A JPH0655149B2 JP H0655149 B2 JPH0655149 B2 JP H0655149B2 JP 60047515 A JP60047515 A JP 60047515A JP 4751585 A JP4751585 A JP 4751585A JP H0655149 B2 JPH0655149 B2 JP H0655149B2
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- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
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- C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
- C12N15/77—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora for Corynebacterium; for Brevibacterium
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- Y10S435/822—Microorganisms using bacteria or actinomycetales
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Description
【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明はジヒドロジピコリン酸合成酵素（以下ＤＤＰＳ
と略す）の合成に関与する遺伝子を含むＤＮＡ断片とベ
クターＤＮＡとの組換え体ＤＮＡをコリネバクテリウム
属またはブレビバクテリウム属に属する微生物に保有さ
せ、該微生物を培地中で培養し、培養物中に生成蓄積し
たＬ−リジンを採取することを特徴とするＬ−リジンの
製造法に関する。従って、本発明はバイオインダストリ
ーの産業分野に関し、とくに畜産業において飼料添加物
として有用なＬ−リジンの製造分野に関する。
と略す）の合成に関与する遺伝子を含むＤＮＡ断片とベ
クターＤＮＡとの組換え体ＤＮＡをコリネバクテリウム
属またはブレビバクテリウム属に属する微生物に保有さ
せ、該微生物を培地中で培養し、培養物中に生成蓄積し
たＬ−リジンを採取することを特徴とするＬ−リジンの
製造法に関する。従って、本発明はバイオインダストリ
ーの産業分野に関し、とくに畜産業において飼料添加物
として有用なＬ−リジンの製造分野に関する。
従来の技術 コリネバクテリウム属やブレビバクテリウム属菌などの
いわゆるグルタミン酸生産菌を組換えＤＮＡ技法を用い
て改良し、Ｌ−リジンの生産性を向上させることについ
ては、特開昭56-160997，特開昭58-126789などに記載が
ある。
いわゆるグルタミン酸生産菌を組換えＤＮＡ技法を用い
て改良し、Ｌ−リジンの生産性を向上させることについ
ては、特開昭56-160997，特開昭58-126789などに記載が
ある。
発明が解決しようとする問題点 微生物を用いてＬ−リジンをより著量に製造する方法の
改良は常に解決すべき課題であり、本発明者らは組換え
ＤＮＡ技法をさらに有効に利用してこの課題を解決すべ
く研究を行った。
改良は常に解決すべき課題であり、本発明者らは組換え
ＤＮＡ技法をさらに有効に利用してこの課題を解決すべ
く研究を行った。
問題点を解決するための手段 Ｌ−リジン生合成に係るＤＤＰＳの合成に関与する遺伝
子とベクタープラスミドとの組換え体を保有する菌株を
用いればＬ−リジンの生産性が改良されることを見出し
本発明を完成するに至った。
子とベクタープラスミドとの組換え体を保有する菌株を
用いればＬ−リジンの生産性が改良されることを見出し
本発明を完成するに至った。
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明によれば、ＤＤＰＳの合成に関与する遺伝子を含
むＤＮＡ断片とベクターＤＮＡとの組換え体ＤＮＡを保
有させたコリネバクテリウム属またはブレビバクテリウ
ム属に属する微生物を培地に培養し、培養物中にＬ−リ
ジンを生成蓄積せしめ、該培養物からＬ−リジンを採取
することによりＬ−リジンを製造することができる。
むＤＮＡ断片とベクターＤＮＡとの組換え体ＤＮＡを保
有させたコリネバクテリウム属またはブレビバクテリウ
ム属に属する微生物を培地に培養し、培養物中にＬ−リ
ジンを生成蓄積せしめ、該培養物からＬ−リジンを採取
することによりＬ−リジンを製造することができる。
宿主微生物として用いるコリネバクテリウム属またはブ
レビバクテリウム属に属する微生物としては、いわゆる
グルタミン酸生産菌として知られる微生物は全て用いる
ことができるが、好適には下記の菌株が用いられる。
レビバクテリウム属に属する微生物としては、いわゆる
グルタミン酸生産菌として知られる微生物は全て用いる
ことができるが、好適には下記の菌株が用いられる。
コリネバクテリウム・グルタミン ATCC 13032 コリネバクテリウム・アセトアシドフィラム ATCC
13870 コリネバクテリウム・ハーキュリス ATCC 13868 コリネバクテリウム・リリウム ATCC 15990 ブレビバクテリウム・ディバリカツム ATCC 14020 ブレビバクテリウム・フラブム ATCC 14067 ブレビバクテリウム・イマリオフィラム ATCC 1
4068 ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム ATCC
13869 ブレビバクテリウム・チオゲンタリス ATCC 192
40 宿主微生物としては、リジン生産能を有しない野性株を
用いることもできるが、既にリジン生産性を有する菌株
を用いることもできる。リジン生産性菌株としては、ア
ミノ酸要求性変異株、アミノ酸アナログ耐性変異株など
公知の菌株が適用できる。
13870 コリネバクテリウム・ハーキュリス ATCC 13868 コリネバクテリウム・リリウム ATCC 15990 ブレビバクテリウム・ディバリカツム ATCC 14020 ブレビバクテリウム・フラブム ATCC 14067 ブレビバクテリウム・イマリオフィラム ATCC 1
4068 ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム ATCC
13869 ブレビバクテリウム・チオゲンタリス ATCC 192
40 宿主微生物としては、リジン生産能を有しない野性株を
用いることもできるが、既にリジン生産性を有する菌株
を用いることもできる。リジン生産性菌株としては、ア
ミノ酸要求性変異株、アミノ酸アナログ耐性変異株など
公知の菌株が適用できる。
ＤＤＰＳの合成に関与する遺伝子としては、真核生物、
原核生物、ウィルス、バクテリオファージまたはプラス
ミドに由来するものがいずれをも用いることができる。
原核生物である細菌たとえばエッシェリヒア属、コリネ
バクテリウム属、ブレビバクテリウム属、ミクロバクテ
リウム属、バチルス属、スタフィロコッカス属、ストレ
プトコッカス属またはセラチア属に属する菌株の該遺伝
子が好ましい。とくにこれらの細菌に属し、リジン生産
性を有する変異株由来の遺伝子が好適である。
原核生物、ウィルス、バクテリオファージまたはプラス
ミドに由来するものがいずれをも用いることができる。
原核生物である細菌たとえばエッシェリヒア属、コリネ
バクテリウム属、ブレビバクテリウム属、ミクロバクテ
リウム属、バチルス属、スタフィロコッカス属、ストレ
プトコッカス属またはセラチア属に属する菌株の該遺伝
子が好ましい。とくにこれらの細菌に属し、リジン生産
性を有する変異株由来の遺伝子が好適である。
該遺伝子を含むＤＮＡ断片を組込むためのベクターとし
ては、本願発明者らの開発に係るpCG1，pCG2，pCG4，pC
G11，pCE54およびpCB101などが好適に用いられる。これ
らベクターの製造法は特開昭57-134500、特開昭57-1837
99、特開昭58-35197および特開昭58-105999に記載があ
る。
ては、本願発明者らの開発に係るpCG1，pCG2，pCG4，pC
G11，pCE54およびpCB101などが好適に用いられる。これ
らベクターの製造法は特開昭57-134500、特開昭57-1837
99、特開昭58-35197および特開昭58-105999に記載があ
る。
ＤＤＰＳの合成に関与する遺伝子を含むＤＮＡ断片とベ
クターＤＮＡとの組換え体ＤＮＡは、試験管内で両ＤＮ
Ａを制限酵素で切断した後、ＤＮＡリガーゼを用いて再
連結し、この結合反応物を用いて該遺伝子が欠損したコ
リネバクテリウム属またはブレビバクテリウム属の変異
株を形質転換し、欠損形質が相補された形質転換株を選
択する組換えＤＮＡ技法によって得ることができる。こ
の組換えＤＮＡ技法は、特開昭57-186492および特開昭5
7-186489に記載の方法に従って行うことができる。
クターＤＮＡとの組換え体ＤＮＡは、試験管内で両ＤＮ
Ａを制限酵素で切断した後、ＤＮＡリガーゼを用いて再
連結し、この結合反応物を用いて該遺伝子が欠損したコ
リネバクテリウム属またはブレビバクテリウム属の変異
株を形質転換し、欠損形質が相補された形質転換株を選
択する組換えＤＮＡ技法によって得ることができる。こ
の組換えＤＮＡ技法は、特開昭57-186492および特開昭5
7-186489に記載の方法に従って行うことができる。
コリネバクテリウム属またはブレビバクテリウム属菌株
で直接組換え体ＤＮＡを選択する代わりに、例えば大腸
菌のごとく既に組換えＤＮＡ技法が確立している宿主ベ
クター系を用いることもできる。すなわち、該遺伝子の
供与体ＤＮＡとベクターＤＮＡの試験管内結合反応物を
用い、ＤＤＰＳまたはＴＨＰＳの合成に関与する遺伝子
の欠損した大腸菌の変異株を形質転換し、欠損形質が相
補された形質転換株を選択し、この形質転換株から該遺
伝子を含むクローン化ＤＮＡ断片を得ることができる。
該ＤＮＡをコリネバクテリウム属またはブレビバクテリ
ウム属細菌のベクターＤＮＡと試験管内で組換えて、コ
リネバクテリウム属またはブレビバクテリウム属細菌を
形質転換すれば、該細菌にクローン化した該遺伝子の組
換え体ＤＮＡを保有させることができる。
で直接組換え体ＤＮＡを選択する代わりに、例えば大腸
菌のごとく既に組換えＤＮＡ技法が確立している宿主ベ
クター系を用いることもできる。すなわち、該遺伝子の
供与体ＤＮＡとベクターＤＮＡの試験管内結合反応物を
用い、ＤＤＰＳまたはＴＨＰＳの合成に関与する遺伝子
の欠損した大腸菌の変異株を形質転換し、欠損形質が相
補された形質転換株を選択し、この形質転換株から該遺
伝子を含むクローン化ＤＮＡ断片を得ることができる。
該ＤＮＡをコリネバクテリウム属またはブレビバクテリ
ウム属細菌のベクターＤＮＡと試験管内で組換えて、コ
リネバクテリウム属またはブレビバクテリウム属細菌を
形質転換すれば、該細菌にクローン化した該遺伝子の組
換え体ＤＮＡを保有させることができる。
以下、コリネバクテリウム・グルタミクムのＤＤＰＳの
合成に関与する遺伝子（以下DDPS遺伝子またはdapAと略
記）を例にとって本発明をさらに詳細に説明する。
合成に関与する遺伝子（以下DDPS遺伝子またはdapAと略
記）を例にとって本発明をさらに詳細に説明する。
コリネバクテリウム・グルタミクムのdapAを含むＤＮＡ
断片は大腸菌の宿主、ベクター系を用いて予めクローン
化することができる。大腸菌を宿主として遺伝子をクロ
ーン化する方法はたとえばメソッド・イン・エンチモロ
ジィ(Methods in Enzymology)，68巻，レイ・ウ(Ray W
u)編(Ed.)アカデミック・プレス，ニューヨーク(Academ
ic Press,New York)（1979年）に記載されている。具体
的には下記のごとく行う。
断片は大腸菌の宿主、ベクター系を用いて予めクローン
化することができる。大腸菌を宿主として遺伝子をクロ
ーン化する方法はたとえばメソッド・イン・エンチモロ
ジィ(Methods in Enzymology)，68巻，レイ・ウ(Ray W
u)編(Ed.)アカデミック・プレス，ニューヨーク(Academ
ic Press,New York)（1979年）に記載されている。具体
的には下記のごとく行う。
コリネバクテリウム・グルタミクムATCC13032から抽出
した染色体ＤＮＡと大腸菌ベクタープラスミドpBR322
（アンピシリン耐性、テトラサイクリン耐性）とを制限
酵素SalIで切断した後、ファージＴ４のＤＮＡリガーゼ
で再連結する。
した染色体ＤＮＡと大腸菌ベクタープラスミドpBR322
（アンピシリン耐性、テトラサイクリン耐性）とを制限
酵素SalIで切断した後、ファージＴ４のＤＮＡリガーゼ
で再連結する。
同連結産物を用いて、大腸菌Ｋ12株亜株TM103〔hsdR−
（宿主特異的制限欠損），dapA-（DDPS欠損：ジアミノ
ピメリン酸要求性）〕を形質転換し、アンピシリンを含
む最小培地上で生育する形質転換株を選択する。出現し
たジアミノピメリン酸非要求性でアンピシリン耐性の形
質転換株の培養菌体から保有するプラスミドを常法によ
り分離することができる。さらに、プラスミドＤＮＡを
制限酵素で切断して、生成するＤＮＡ断片をアガロース
ゲル電気泳動で解析することにより、その構造を知るこ
とができる。こうして得られたプラスミドの一つがpCD1
である。pCD1はpBR322の唯一ケ所のSalI切断部位に4.2K
bのSalIＤＮＡ断片が挿入された構造を有している（第
１図）。
（宿主特異的制限欠損），dapA-（DDPS欠損：ジアミノ
ピメリン酸要求性）〕を形質転換し、アンピシリンを含
む最小培地上で生育する形質転換株を選択する。出現し
たジアミノピメリン酸非要求性でアンピシリン耐性の形
質転換株の培養菌体から保有するプラスミドを常法によ
り分離することができる。さらに、プラスミドＤＮＡを
制限酵素で切断して、生成するＤＮＡ断片をアガロース
ゲル電気泳動で解析することにより、その構造を知るこ
とができる。こうして得られたプラスミドの一つがpCD1
である。pCD1はpBR322の唯一ケ所のSalI切断部位に4.2K
bのSalIＤＮＡ断片が挿入された構造を有している（第
１図）。
pCD1ＤＮＡを用いて大腸菌Ｋ１２株亜株のＤＤＰＳ欠損
変異株AT998(Hfr dapA16)〔ジャーナル・オブ・バクテ
リオロジィ(J.Bacteriol.)，105，844(1971)〕を形質転
換して得られるアンピシリン耐性形質転換株はすべてジ
アミノピメリン酸非要求性であり、このことからpCD1の
4.2Kb SalI ＤＮＡ断片上には大腸菌のＤＤＰＳ欠損を
相補する機能をコードする、コリネバクテリウム・グル
タミクムの遺伝子dapAが存在することが明白である。
変異株AT998(Hfr dapA16)〔ジャーナル・オブ・バクテ
リオロジィ(J.Bacteriol.)，105，844(1971)〕を形質転
換して得られるアンピシリン耐性形質転換株はすべてジ
アミノピメリン酸非要求性であり、このことからpCD1の
4.2Kb SalI ＤＮＡ断片上には大腸菌のＤＤＰＳ欠損を
相補する機能をコードする、コリネバクテリウム・グル
タミクムの遺伝子dapAが存在することが明白である。
pCD1にクローン化されたdapAを含む4.2KbのSalI ＤＮ
Ａ断片をプラスミドpFC18（テトラサイクリン耐性、ス
ペクチノマイシン耐性）の唯一ケ所のSalI切断部位に挿
入させ、コリネバクテリウム属、ブレビバクテリウム属
およびエッシェリヒア属で複製可能な、いわゆるシャト
ル型の組換え体プラスミドpAC2を造成する。pFC18プラ
スミドは本発明者らが先に発明した、コリネバクテリウ
ム属およびブレビバクテリウム属のベクタープラスミド
pCG11（特開昭57-134500）を大腸菌のベクタープラスミ
ドpBR322のPstI切断部位に挿入させて作製したシャトル
型のベクタープラスミドである。同プラスミドの作製過
程および構造を第１図に示す。
Ａ断片をプラスミドpFC18（テトラサイクリン耐性、ス
ペクチノマイシン耐性）の唯一ケ所のSalI切断部位に挿
入させ、コリネバクテリウム属、ブレビバクテリウム属
およびエッシェリヒア属で複製可能な、いわゆるシャト
ル型の組換え体プラスミドpAC2を造成する。pFC18プラ
スミドは本発明者らが先に発明した、コリネバクテリウ
ム属およびブレビバクテリウム属のベクタープラスミド
pCG11（特開昭57-134500）を大腸菌のベクタープラスミ
ドpBR322のPstI切断部位に挿入させて作製したシャトル
型のベクタープラスミドである。同プラスミドの作製過
程および構造を第１図に示す。
pAC2プラスミドは次のような工程によって作製する。pF
C18およびpCD1プラスミドＤＮＡを制限酵素SalIで切断
後、混合してT4リガーゼを作用させる。次にこのＤＮＡ
混成液を用いてＤＤＰＳ欠損変異を有する大腸菌Ｋ１２
株亜株TM103を形質転換し、スペクチノマイシンを含む
最小培地に生育する形質転換株を選択する。得られたス
ペクチノマイシン耐性かつジアミノピメリン酸非要求性
の形質転換株の一株の培養菌体からプラスミドＤＮＡを
抽出する。
C18およびpCD1プラスミドＤＮＡを制限酵素SalIで切断
後、混合してT4リガーゼを作用させる。次にこのＤＮＡ
混成液を用いてＤＤＰＳ欠損変異を有する大腸菌Ｋ１２
株亜株TM103を形質転換し、スペクチノマイシンを含む
最小培地に生育する形質転換株を選択する。得られたス
ペクチノマイシン耐性かつジアミノピメリン酸非要求性
の形質転換株の一株の培養菌体からプラスミドＤＮＡを
抽出する。
分離したプラスミドＤＮＡのSalI切断産物をアガロース
ゲル電気泳動することにより、プラスミドの構造を調
べ、pFC18ベクタープラスミドのSalI切断部位に、pCD1
由来の4.2KbのSalI ＤＮＡ断片が挿入した構造を有す
ることを確認する。さらに本プラスミドを用いて、大腸
菌Ｋ１２株亜株であるＤＤＰＳ欠損変異株AT998を形質
転換し、それらの欠損が相補されることから、本プラス
ミド上にpCD1に一旦クローン化されたコリネバクテリウ
ム・グルタミクムのdapAが組込まれていることを確認す
る。本プラスミドをpAC2と命名した（第１図）。
ゲル電気泳動することにより、プラスミドの構造を調
べ、pFC18ベクタープラスミドのSalI切断部位に、pCD1
由来の4.2KbのSalI ＤＮＡ断片が挿入した構造を有す
ることを確認する。さらに本プラスミドを用いて、大腸
菌Ｋ１２株亜株であるＤＤＰＳ欠損変異株AT998を形質
転換し、それらの欠損が相補されることから、本プラス
ミド上にpCD1に一旦クローン化されたコリネバクテリウ
ム・グルタミクムのdapAが組込まれていることを確認す
る。本プラスミドをpAC2と命名した（第１図）。
pAC2プラスミドを用いて、ホモセリン要求性変異を有す
るリジン生産菌コリネバクテリウム・グルタミクムＲＨ
６株（同株は工業技術院微生物工業技術研究所にFERM-B
P 704として寄託されている）を形質転換する。形質転
換は、本発明者らが先に発明し、特許出願したコリネバ
クテリウム属あるいはブレビバクテリウム属菌種のプロ
トプラストを用いる形質転換法（特開昭57-186492およ
び特開昭57-186489）により実施することができる。本
法を用い、コリネバクテリウム・グルタミクムＲＨ６株
のプロトプラストを形質転換後、スペクチノマイシンを
含む再生培地上で形質転換株を選択する。こうして得ら
れたスペクチノマイシン耐性形質転換株のうちの一株の
培養菌体から分離したプラスミドについて前節と同様の
制限酵素切断とアガロースゲル電気泳動による構造確認
と大腸菌Ｋ１２株亜株AT998の形質転換実験によるdapA
の存在確認を行い、pAC2プラスミドがＲＨ６株に導入さ
れたことを確認する。
るリジン生産菌コリネバクテリウム・グルタミクムＲＨ
６株（同株は工業技術院微生物工業技術研究所にFERM-B
P 704として寄託されている）を形質転換する。形質転
換は、本発明者らが先に発明し、特許出願したコリネバ
クテリウム属あるいはブレビバクテリウム属菌種のプロ
トプラストを用いる形質転換法（特開昭57-186492およ
び特開昭57-186489）により実施することができる。本
法を用い、コリネバクテリウム・グルタミクムＲＨ６株
のプロトプラストを形質転換後、スペクチノマイシンを
含む再生培地上で形質転換株を選択する。こうして得ら
れたスペクチノマイシン耐性形質転換株のうちの一株の
培養菌体から分離したプラスミドについて前節と同様の
制限酵素切断とアガロースゲル電気泳動による構造確認
と大腸菌Ｋ１２株亜株AT998の形質転換実験によるdapA
の存在確認を行い、pAC2プラスミドがＲＨ６株に導入さ
れたことを確認する。
pAC2形質転換株によるＬ−リジン生産は従来のＬ−リジ
ン発酵法に用いられる培養方法により行うことができ
る。すなわち、該形質転換株を炭素源、窒素源、無機
物、アミノ酸、ビタミンなどを含有する通常の培地中、
好気的条件下に温度、pHなどを調節しつつ培養を行え
ば、培養物中にリジンが生成蓄積するので培養液から活
性炭処理、イオン交換樹脂処理などの公知の方法でＬ−
リジンを回収する。
ン発酵法に用いられる培養方法により行うことができ
る。すなわち、該形質転換株を炭素源、窒素源、無機
物、アミノ酸、ビタミンなどを含有する通常の培地中、
好気的条件下に温度、pHなどを調節しつつ培養を行え
ば、培養物中にリジンが生成蓄積するので培養液から活
性炭処理、イオン交換樹脂処理などの公知の方法でＬ−
リジンを回収する。
かくしてpAC2を保有させたコリネバクテリウム属あるい
はブレビバクテリウム属菌株を用いることにより、非保
有株に比べ高い収率でＬ−リジンを生産することができ
る。
はブレビバクテリウム属菌株を用いることにより、非保
有株に比べ高い収率でＬ−リジンを生産することができ
る。
本発明の有用性はＤＤＰＳ遺伝子とコリネバクテリウム
属あるいはブレビバクテリウム属菌種のベクターとを形
質発現できる形で組み換えた組換え体ＤＮＡをコリネバ
クテリウム属またはブレビバクテリウム属菌種に導入す
ればＬ−リジン生産能を付与あるいは強化できる点にあ
る。本願明細書ではコリネバクテリウム・グルタミクム
由来のＤＤＰＳの合成に関与する遺伝子を用いる例を示
したが、代わりに他の生物の相当する遺伝子を用いて
も、リジン生産菌のリジン生産性を向上させることがで
きる。
属あるいはブレビバクテリウム属菌種のベクターとを形
質発現できる形で組み換えた組換え体ＤＮＡをコリネバ
クテリウム属またはブレビバクテリウム属菌種に導入す
ればＬ−リジン生産能を付与あるいは強化できる点にあ
る。本願明細書ではコリネバクテリウム・グルタミクム
由来のＤＤＰＳの合成に関与する遺伝子を用いる例を示
したが、代わりに他の生物の相当する遺伝子を用いて
も、リジン生産菌のリジン生産性を向上させることがで
きる。
またベクタープラスミドは連結されたＤＤＰＳの合成に
関与する遺伝子を安定に遺伝させるためにその自律複製
能を提供しているにすぎない。従って、本明細書に例示
したpFC18に限らずコリネバクテリウム属あるいはブレ
ビバクテリウム属で自律複製できるプラスミドや宿主染
色体などに組込まれて安定に遺伝してゆくファージベク
ターなども用いることができる。
関与する遺伝子を安定に遺伝させるためにその自律複製
能を提供しているにすぎない。従って、本明細書に例示
したpFC18に限らずコリネバクテリウム属あるいはブレ
ビバクテリウム属で自律複製できるプラスミドや宿主染
色体などに組込まれて安定に遺伝してゆくファージベク
ターなども用いることができる。
グルタミン酸高生産能を有するいわゆるグルタミン酸生
産菌は主な菌学的性質を同じくしているにもかかわら
ず、産業上の重要性から、各研究者により種々の菌名が
付けられており、属名までもコリネバクテリウム属ある
いはブレビバクテリウム属など種々である。しかしなが
ら、これらの菌群は細胞壁のアミノ酸構成やＤＮＡの塩
基組成が殆ど同じであることから同一の菌種であること
が指摘されていた。さらに最近、これら菌種の染色体Ｄ
ＮＡ間には７０〜８０％以上の相同性があることが示さ
れ、互いに非常に近縁な微生物であることが明白である
〔コマツ・ワイ(Komatsu,Y.)、レポート・オブ・ザ・フ
ァーメンタティブ・リサーチ・インスティテュート(Rep
ort of the Fermen-tative Research Institute),NO.5
5,1(1980)およびスズキ・ケイ(Suzuki,K.)：カネコ・テ
ィー(Kaneko,T.)andコマガタ・ケイ(Komagata,K.)：イ
ンターナショナル・ジャーナル・オブ・システマティッ
ク・バクテリオロジィ(Int.J.Syst.Bacteriol.),31,131
(1981)参照〕。
産菌は主な菌学的性質を同じくしているにもかかわら
ず、産業上の重要性から、各研究者により種々の菌名が
付けられており、属名までもコリネバクテリウム属ある
いはブレビバクテリウム属など種々である。しかしなが
ら、これらの菌群は細胞壁のアミノ酸構成やＤＮＡの塩
基組成が殆ど同じであることから同一の菌種であること
が指摘されていた。さらに最近、これら菌種の染色体Ｄ
ＮＡ間には７０〜８０％以上の相同性があることが示さ
れ、互いに非常に近縁な微生物であることが明白である
〔コマツ・ワイ(Komatsu,Y.)、レポート・オブ・ザ・フ
ァーメンタティブ・リサーチ・インスティテュート(Rep
ort of the Fermen-tative Research Institute),NO.5
5,1(1980)およびスズキ・ケイ(Suzuki,K.)：カネコ・テ
ィー(Kaneko,T.)andコマガタ・ケイ(Komagata,K.)：イ
ンターナショナル・ジャーナル・オブ・システマティッ
ク・バクテリオロジィ(Int.J.Syst.Bacteriol.),31,131
(1981)参照〕。
本明細書ではコリネバクテリウム・グルタミクムＲＨ６
に組換え体ＤＮＡを導入し、その遺伝子の形質発現に基
づくＬ−リジンの生産性の向上について例示したが、上
記の事実を踏まえればグルタミン酸生産菌全般での効果
が容易に類推される。その効果の有無は組換え体ＤＮＡ
がグルタミン酸生産菌中で安定に遺伝し、該遺伝子が形
質発現できることによっており、グルタミン酸生産菌間
のＤＮＡ相同性などにおける若干の相違は何ら関係がな
い。しかるにこれらの菌種がプラスミドの複製と遺伝子
発現に関わる機能を等しく保持していることは、本発明
者らが先にコリネバクテリウム・グルタミクム225-250
株から分離し、特許出願（特開昭57-183799）したプラ
スミドpCG4がコリネバクテリウム属およびブレビバクテ
リウム属菌種などグルタミン酸生産菌内で複製し、また
pCG4の保有するスペクチノマイシンおよび／またはスト
レプトマイシン耐性遺伝子が発現する（特開昭57-18649
2）ことから明らかである。さらには、ブレビバクテリ
ウム属菌種のトリプトファン生合成遺伝子がコリネバク
テリウム属菌種で、またコリネバクテリウ属菌種のヒス
チジン生合成遺伝子がブレビバクテリウム属菌種で発現
することも本発明者らにより示されており（特願昭58-2
5398および特願昭58-25397）、これらのことからも両属
菌種間で、遺伝子が相互に発現することが明白である。
従って本発明を適用しうる菌種はコリネバクテリウム・
グルタミクムのみならずコリネバクテリウム属およびブ
レビバクテリウム属菌種を含むグルタミン酸生産菌全て
が含まれる。
に組換え体ＤＮＡを導入し、その遺伝子の形質発現に基
づくＬ−リジンの生産性の向上について例示したが、上
記の事実を踏まえればグルタミン酸生産菌全般での効果
が容易に類推される。その効果の有無は組換え体ＤＮＡ
がグルタミン酸生産菌中で安定に遺伝し、該遺伝子が形
質発現できることによっており、グルタミン酸生産菌間
のＤＮＡ相同性などにおける若干の相違は何ら関係がな
い。しかるにこれらの菌種がプラスミドの複製と遺伝子
発現に関わる機能を等しく保持していることは、本発明
者らが先にコリネバクテリウム・グルタミクム225-250
株から分離し、特許出願（特開昭57-183799）したプラ
スミドpCG4がコリネバクテリウム属およびブレビバクテ
リウム属菌種などグルタミン酸生産菌内で複製し、また
pCG4の保有するスペクチノマイシンおよび／またはスト
レプトマイシン耐性遺伝子が発現する（特開昭57-18649
2）ことから明らかである。さらには、ブレビバクテリ
ウム属菌種のトリプトファン生合成遺伝子がコリネバク
テリウム属菌種で、またコリネバクテリウ属菌種のヒス
チジン生合成遺伝子がブレビバクテリウム属菌種で発現
することも本発明者らにより示されており（特願昭58-2
5398および特願昭58-25397）、これらのことからも両属
菌種間で、遺伝子が相互に発現することが明白である。
従って本発明を適用しうる菌種はコリネバクテリウム・
グルタミクムのみならずコリネバクテリウム属およびブ
レビバクテリウム属菌種を含むグルタミン酸生産菌全て
が含まれる。
以下本発明の実施例を示す。
実施例１ (1)宿主特異的制限欠損変異およびＤＤＰＳ欠損変異を
併せ持つ大腸菌Ｋ１２株亜株TM103株の造成： 大腸菌の宿主−ベクター系を用いて外来性遺伝子たるコ
リネバクテリウム・グルタミクムのＤＤＰＳの合成に関
与する遺伝子をより容易にクローン化するために、宿主
菌として宿主特異的制限欠損変異(hsdR2-)とＤＤＰＳ欠
損変異(dapA16-)とを併せ持つ大腸菌株の造成を次のよ
うにして行った。
併せ持つ大腸菌Ｋ１２株亜株TM103株の造成： 大腸菌の宿主−ベクター系を用いて外来性遺伝子たるコ
リネバクテリウム・グルタミクムのＤＤＰＳの合成に関
与する遺伝子をより容易にクローン化するために、宿主
菌として宿主特異的制限欠損変異(hsdR2-)とＤＤＰＳ欠
損変異(dapA16-)とを併せ持つ大腸菌株の造成を次のよ
うにして行った。
制限欠損変異を有する大腸菌Ｋ１２株亜株WA802(Escher
ichia coli K12 WA802,FERM BP-718)〔F-metB1 hsdR2
ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジィ(J.Mo
l.Biol.)，16，118(1966)〕から25μｇ／mlのリファン
ピシンに耐性となった自然突然変異株RF82を誘導した。
RF82株とＤＤＰＳ欠損変異株ＡＴ998(HfrdapA16)(Esche
richia coli K12 AT998,FERM BP-720)とをジアミノピメ
リン酸５０μｇ／mlを含むＬ培地〔バクト−トリプトン
(Difco)１％、イーストエキストラクト（大五栄養化
学）0.5％、ＮａＣｌ 0.5％、pH7.0にＮａＯＨで調整
中で３７℃ ３時間静置培養した。生理食塩水にて二回
遠心洗浄後、リファンピシン２５μｇ／ml、ジアミノピ
メリン酸５０μｇ／mlを含むＭ９最小寒天平板培地（ブ
ドウ糖２ｇ、NH4Cl１ｇ、Na2HPO4 ６ｇ、KH2PO4 ３
ｇ、MgSO4・７H2O 0.1ｇ、CaCl2・2H2O １５mg、サイ
アミン塩酸塩４mgおよび寒天１５ｇを水１に含み、pH
7.2に調整した培地）に塗布しリファンピシン耐性でメ
チオニン非要求性となった接合体を選択した。このよう
な接合体の中からジアミノピメリン酸要求性を示し、か
つ制限欠損変異を有している株を探し、その一株をTM10
3とした。制限欠損変異の有無は修飾機能の欠損した大
腸菌Ｋ１２株亜株C600r-m-(ATCC33525)〔エム・メセル
ソン(M.Meselson)，ジャーナル・オブ・モレキュラー・
バイオロジィ(J.Mol.Biol.,9,734)(1964)〕上で増殖し
たλファージの平板効率をもって判定した。λファージ
はE.coli K12λ溶原菌ATCC 10798より通常の方法で調製
した。すなわちWA802と同様の平板効率を示した株を制
限欠損変異を有する接合体とした。
ichia coli K12 WA802,FERM BP-718)〔F-metB1 hsdR2
ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジィ(J.Mo
l.Biol.)，16，118(1966)〕から25μｇ／mlのリファン
ピシンに耐性となった自然突然変異株RF82を誘導した。
RF82株とＤＤＰＳ欠損変異株ＡＴ998(HfrdapA16)(Esche
richia coli K12 AT998,FERM BP-720)とをジアミノピメ
リン酸５０μｇ／mlを含むＬ培地〔バクト−トリプトン
(Difco)１％、イーストエキストラクト（大五栄養化
学）0.5％、ＮａＣｌ 0.5％、pH7.0にＮａＯＨで調整
中で３７℃ ３時間静置培養した。生理食塩水にて二回
遠心洗浄後、リファンピシン２５μｇ／ml、ジアミノピ
メリン酸５０μｇ／mlを含むＭ９最小寒天平板培地（ブ
ドウ糖２ｇ、NH4Cl１ｇ、Na2HPO4 ６ｇ、KH2PO4 ３
ｇ、MgSO4・７H2O 0.1ｇ、CaCl2・2H2O １５mg、サイ
アミン塩酸塩４mgおよび寒天１５ｇを水１に含み、pH
7.2に調整した培地）に塗布しリファンピシン耐性でメ
チオニン非要求性となった接合体を選択した。このよう
な接合体の中からジアミノピメリン酸要求性を示し、か
つ制限欠損変異を有している株を探し、その一株をTM10
3とした。制限欠損変異の有無は修飾機能の欠損した大
腸菌Ｋ１２株亜株C600r-m-(ATCC33525)〔エム・メセル
ソン(M.Meselson)，ジャーナル・オブ・モレキュラー・
バイオロジィ(J.Mol.Biol.,9,734)(1964)〕上で増殖し
たλファージの平板効率をもって判定した。λファージ
はE.coli K12λ溶原菌ATCC 10798より通常の方法で調製
した。すなわちWA802と同様の平板効率を示した株を制
限欠損変異を有する接合体とした。
(2)コリネバクテリウム・グルタミクムのDDPS遺伝子(da
pA)のクローン化： クローン化は大腸菌の宿主、ベクター系にて実施した。
ベクターとして使用したpBR322は宝酒造社製の市販品を
用いた。供与体ＤＮＡとなる染色体ＤＮＡはコリネバク
テリウム・グルタミクムATCC13032から本発明者らが先
に示した方法〔特開昭58-126789実施例１第(1)項〕に従
って単離した。
pA)のクローン化： クローン化は大腸菌の宿主、ベクター系にて実施した。
ベクターとして使用したpBR322は宝酒造社製の市販品を
用いた。供与体ＤＮＡとなる染色体ＤＮＡはコリネバク
テリウム・グルタミクムATCC13032から本発明者らが先
に示した方法〔特開昭58-126789実施例１第(1)項〕に従
って単離した。
pBR322 ＤＮＡ ４μｇおよびコリネバクテリウム・グ
ルタミクムATCC13032の染色体ＤＮＡ８μｇを含む制限
酵素SalI用反応液（10mM Tris-HCl，7mM MgCl2，100mM
NaCl，pH7.5）120μに12単位のSalI（宝酒造社製）を
添加し、37℃で60分間反応後、65℃で10分間加温して反
応を停止した。該反応消化物にT4リガーゼ緩衝液(660mM
Tris-HCl，66mM MgCl2，100mMジチオスレイトール，pH
7.6)30μ，5mM ATP 30μ，T4リガーゼ（宝酒造社
製）0.3単位およびH2O 120μを加え、12℃で16時間反
応させた。
ルタミクムATCC13032の染色体ＤＮＡ８μｇを含む制限
酵素SalI用反応液（10mM Tris-HCl，7mM MgCl2，100mM
NaCl，pH7.5）120μに12単位のSalI（宝酒造社製）を
添加し、37℃で60分間反応後、65℃で10分間加温して反
応を停止した。該反応消化物にT4リガーゼ緩衝液(660mM
Tris-HCl，66mM MgCl2，100mMジチオスレイトール，pH
7.6)30μ，5mM ATP 30μ，T4リガーゼ（宝酒造社
製）0.3単位およびH2O 120μを加え、12℃で16時間反
応させた。
このリガーゼ反応物を大腸菌K12株亜株TM103の形質転換
に供した。TM103のコンピテントセルはダジェルトらの
方法〔ダジェルト・エム(Dagert,M.)et al：ジーン(Gen
e)6,23(1979)〕で調製した。すなわち、ジアミノピメリ
ン酸50μｇ／mlを補ったＬ培地50mlにTM103株を植菌
し、東京光電比色計で660nmにおける吸光度(OD)が0.5に
なるまで37℃で培養した。培養液を氷水中で10分間冷却
後、遠心集菌した菌体を冷却した0.1M塩化カルシウム20
mlに懸濁し、０℃に20分間置いた。菌体を遠心集菌し、
0.1M塩化カルシウム0.5mlに再懸濁し０℃で18時間放置
した。該懸濁液400μに前記リガーゼ反応混合物200μ
を添加混合し、０℃に10分間置いてから37℃で５分間
加温した。次いでジアミノピメリン酸50μｇ／mlを含む
Ｌ培地9mlを添加し37℃で２時間振盪培養した。生理食
塩水で２回遠心洗浄後、アンピシリン50μｇ／mlを添加
したM9最小寒天平板培地に塗布し、37℃で４日間培養し
た。出現したアンピシリン耐性かつジアミノピメリン酸
非要求性の形質転換株につきアンピシリン50μｇ／mlを
含むＬ寒天平板培地（寒天1.5％を含むＬ培地）上で単
集落分離を行った。
に供した。TM103のコンピテントセルはダジェルトらの
方法〔ダジェルト・エム(Dagert,M.)et al：ジーン(Gen
e)6,23(1979)〕で調製した。すなわち、ジアミノピメリ
ン酸50μｇ／mlを補ったＬ培地50mlにTM103株を植菌
し、東京光電比色計で660nmにおける吸光度(OD)が0.5に
なるまで37℃で培養した。培養液を氷水中で10分間冷却
後、遠心集菌した菌体を冷却した0.1M塩化カルシウム20
mlに懸濁し、０℃に20分間置いた。菌体を遠心集菌し、
0.1M塩化カルシウム0.5mlに再懸濁し０℃で18時間放置
した。該懸濁液400μに前記リガーゼ反応混合物200μ
を添加混合し、０℃に10分間置いてから37℃で５分間
加温した。次いでジアミノピメリン酸50μｇ／mlを含む
Ｌ培地9mlを添加し37℃で２時間振盪培養した。生理食
塩水で２回遠心洗浄後、アンピシリン50μｇ／mlを添加
したM9最小寒天平板培地に塗布し、37℃で４日間培養し
た。出現したアンピシリン耐性かつジアミノピメリン酸
非要求性の形質転換株につきアンピシリン50μｇ／mlを
含むＬ寒天平板培地（寒天1.5％を含むＬ培地）上で単
集落分離を行った。
純化した形質転換株の培養菌体からアンらの方法〔An,
G.,et al.,J.Bacteriol.,140400(1979)〕によりプラス
ミドＤＮＡを単離した。このプラスミドＤＮＡを制限酵
素消化とアガロースゲル電気泳動により解析した結果、
該プラスミドはpBR322の唯一ケ所のSalI切断部位に4.2K
bのSalI ＤＮＡ断片が挿入した構造を有していること
がわかった。
G.,et al.,J.Bacteriol.,140400(1979)〕によりプラス
ミドＤＮＡを単離した。このプラスミドＤＮＡを制限酵
素消化とアガロースゲル電気泳動により解析した結果、
該プラスミドはpBR322の唯一ケ所のSalI切断部位に4.2K
bのSalI ＤＮＡ断片が挿入した構造を有していること
がわかった。
このプラスミドをpCD1と命名した。
pCD1を大腸菌Ｋ１２株亜株のＤＤＰＳ欠損変異株AT998
株欠損変異株AT997の形質転換に供した。AT998株の形質
転換は前記のTM103株の形質転換と同様に行った。両株
から得られたアンピシリン耐性の形質転換株はいずれも
ジアミノピメリン酸非要求性となっていた。これらのこ
とからpCD1にクローン化された4.2KbのSalI ＤＮＡ断
片上にはコリネバクテリウム・グルタミクムのＤＤＰＳ
遺伝子(dapA)が存在することがわかる。
株欠損変異株AT997の形質転換に供した。AT998株の形質
転換は前記のTM103株の形質転換と同様に行った。両株
から得られたアンピシリン耐性の形質転換株はいずれも
ジアミノピメリン酸非要求性となっていた。これらのこ
とからpCD1にクローン化された4.2KbのSalI ＤＮＡ断
片上にはコリネバクテリウム・グルタミクムのＤＤＰＳ
遺伝子(dapA)が存在することがわかる。
なお、クローニングの工程で用いた宿主菌TM103株の保
有する制限欠損変異は、クローニングの頻度を上げるた
めに利用しているにすぎず、該変異を保有しない株を宿
主とすることもできる。
有する制限欠損変異は、クローニングの頻度を上げるた
めに利用しているにすぎず、該変異を保有しない株を宿
主とすることもできる。
(3)プラスミドpAC2の作製： コリネバクテリウム・グルタミクム由来のdapA遺伝子を
含む4.2KbのSalIＤＮＡ断片をシャトルベクタープラス
ミドpFC18（スペクチノマイシン耐性、テトラサイクリ
ン耐性）に再クローン化した。pFC18の作製は以下の工
程によって行った。
含む4.2KbのSalIＤＮＡ断片をシャトルベクタープラス
ミドpFC18（スペクチノマイシン耐性、テトラサイクリ
ン耐性）に再クローン化した。pFC18の作製は以下の工
程によって行った。
pCG11をそれを保有する株(ATCC 39022)から先に本発明
者らが記載した方法〔特開昭57-134500実施例１第(1)
項〕に従って単離した。pBR322は宝酒造社製の市販品を
用いた。
者らが記載した方法〔特開昭57-134500実施例１第(1)
項〕に従って単離した。pBR322は宝酒造社製の市販品を
用いた。
pCG11およびpBR322プラスミドＤＮＡそれぞれ４μｇを
含む制限酵素PstI用反応液〔20mMトリス−塩酸(pH7.
5)，10mM MgCl2，50mM(NH4)2SO4，0.01％ウシ血清アル
ブミン〕120μにPstI（宝酒造社製）８単位を添加
し、37℃で60分間反応させた。65℃10分間加温して反応
を停止した後、T4リガーゼ緩衝液30μ、5mM ATP 30μ
、T4リガーゼ0.3単位およびH2O120μを加え、12℃
で16時間反応させた。該リガーゼ反応物を用い、大腸菌
Ｋ１２株亜株WA802を実施例１第(2)項に示した方法で形
質転換した。スペクチノマイシン100μｇ／mlおよびテ
トラサイクリン25μｇ／mlを含むＬ寒天平板培地上に出
現した形質転換株の一株について同寒天培地上で単集落
分離を行い、純化した株の培養菌体からアンらの方法に
従ってプラスミドＤＮＡを単離した。該プラスミドＤＮ
Ａの構造を制限酵素切断とアガロースゲル電気泳動によ
り調べたところ、該プラスミドはｐＣＧ１１の唯一ケ所
のPstI切断部位にpBR322が挿入した構造を有していた
（第１図）。該プラスミドをpFC18と命名した。pFC18を
ベクターとして、コリネバクテリウム・グルタミクム由
来のdapAを含む組換え体プラスミドを以下の工程で作製
した。pFC18およびpCD1プラスミドＤＮＡそれぞれ４μ
ｇを含むSalI用反応液120μに制限酵素SalI8単位を添
加し37℃で60分間反応させた。
含む制限酵素PstI用反応液〔20mMトリス−塩酸(pH7.
5)，10mM MgCl2，50mM(NH4)2SO4，0.01％ウシ血清アル
ブミン〕120μにPstI（宝酒造社製）８単位を添加
し、37℃で60分間反応させた。65℃10分間加温して反応
を停止した後、T4リガーゼ緩衝液30μ、5mM ATP 30μ
、T4リガーゼ0.3単位およびH2O120μを加え、12℃
で16時間反応させた。該リガーゼ反応物を用い、大腸菌
Ｋ１２株亜株WA802を実施例１第(2)項に示した方法で形
質転換した。スペクチノマイシン100μｇ／mlおよびテ
トラサイクリン25μｇ／mlを含むＬ寒天平板培地上に出
現した形質転換株の一株について同寒天培地上で単集落
分離を行い、純化した株の培養菌体からアンらの方法に
従ってプラスミドＤＮＡを単離した。該プラスミドＤＮ
Ａの構造を制限酵素切断とアガロースゲル電気泳動によ
り調べたところ、該プラスミドはｐＣＧ１１の唯一ケ所
のPstI切断部位にpBR322が挿入した構造を有していた
（第１図）。該プラスミドをpFC18と命名した。pFC18を
ベクターとして、コリネバクテリウム・グルタミクム由
来のdapAを含む組換え体プラスミドを以下の工程で作製
した。pFC18およびpCD1プラスミドＤＮＡそれぞれ４μ
ｇを含むSalI用反応液120μに制限酵素SalI8単位を添
加し37℃で60分間反応させた。
65℃10分間加温して反応を停止した後、T4リガーゼ緩衝
液30μ、5mM ATP30μ、T4リガーゼ0.3単位およびH2
O120μを加え12℃で16時間反応させた。
液30μ、5mM ATP30μ、T4リガーゼ0.3単位およびH2
O120μを加え12℃で16時間反応させた。
該リガーゼ反応物を大腸菌TM103株の形質転換に供し
た。形質転換は実施例１第(2)項に示した方法で行い、
スペクチノマイシン100μｇ／mlを含むM9最小寒天平板
培地上で形質転換株を選択した。得られたスペクチノマ
イシン耐性かつジアミノピメリン酸非要求性の形質転換
株の一株からアンらの方法に従ってプラスミドＤＮＡを
単離し、制限酵素切断とアガロースゲル電気泳動によ
り、構造を調べた。該プラスミドはpFC18の唯一ケ所のS
alI切断部位にpCD1に由来する4.2KbのSalI ＤＮＡ断片
が挿入された構造を有していた。該プラスミドをｐＡＣ
２と命名した。
た。形質転換は実施例１第(2)項に示した方法で行い、
スペクチノマイシン100μｇ／mlを含むM9最小寒天平板
培地上で形質転換株を選択した。得られたスペクチノマ
イシン耐性かつジアミノピメリン酸非要求性の形質転換
株の一株からアンらの方法に従ってプラスミドＤＮＡを
単離し、制限酵素切断とアガロースゲル電気泳動によ
り、構造を調べた。該プラスミドはpFC18の唯一ケ所のS
alI切断部位にpCD1に由来する4.2KbのSalI ＤＮＡ断片
が挿入された構造を有していた。該プラスミドをｐＡＣ
２と命名した。
ｐＡＣ２を用いて前記のAT998株を形質転換し、それぞ
れのスペクチノマイシン耐性形質転換株は同時にジアミ
ノピメリン酸要求性も相補されていることが確認され
た。
れのスペクチノマイシン耐性形質転換株は同時にジアミ
ノピメリン酸要求性も相補されていることが確認され
た。
(4)ｐＡＣ２のコリネバクテリウム・グルタミクムＲＨ
６株への導入： ｐＡＣ２を用いてコリネバクテリウム・グルタミクムＲ
Ｈ６株（ホモセリン要求性）の形質転換を行った。ＲＨ
６株の種培養0.1mlをホモセリン５０μg/mlを含む１０m
lのＳＳＭ培地〔ブドウ糖１０ｇ、NH4Cl ４ｇ、尿素２
ｇ、酵母エキス１ｇ、KH2PO4 １ｇ、K2HPO4 ３ｇ、Mg
Cl2・6H2O 0.4ｇ、FeSO4・7H2O １０mg、MnSO4・４〜
6H2O 0.2mg、ZnSO4・7H2O 0.9mg、CuSO4・5H2O 0.4m
g、Na2B4O7・10H2O 0.09mg、(NH4)6Mo7O24・4H2O 0.0
4mg、ビオチン３０μｇ、サイアミン塩酸塩１mgを水１
に含みpH7.2に調製した培地〕に接種し、３０℃で振
盪培養した。ＯＤが0.15になった時点で0.5単位／mlと
なるようにペニシリンＧを添加した。さらに培養を続
け、ＯＤが約0.6になったところで集菌し、１mg/mlのリ
ゾチームを含む２mlのＲＣＧＰ培地〔ブドウ糖５ｇ、カ
ザミノ酸５ｇ、酵母エキス2.5ｇ、K2HPO4 3.5ｇ、KH2P
O4 1.5ｇ、MgCl2・6H2O 0.41ｇ、FeSO4・7H2O １０m
g、MnSO4・４〜6H2O ２mg、ZnSO4・7H2O 0.9mg、(N
H4)6Mo7O24・4H2O 0.04mg、ビオチン３０μｇ、サイア
ミン塩酸塩２mg、コハク酸二ナトリウム１３５ｇ、ポリ
ビニルピロリドン（分子量10,000）３０ｇを水１に含
みpH7.2に調整した培地〕に懸濁し、３０℃で１４時間
緩やかに振盪してプロトプラスト化した。
６株への導入： ｐＡＣ２を用いてコリネバクテリウム・グルタミクムＲ
Ｈ６株（ホモセリン要求性）の形質転換を行った。ＲＨ
６株の種培養0.1mlをホモセリン５０μg/mlを含む１０m
lのＳＳＭ培地〔ブドウ糖１０ｇ、NH4Cl ４ｇ、尿素２
ｇ、酵母エキス１ｇ、KH2PO4 １ｇ、K2HPO4 ３ｇ、Mg
Cl2・6H2O 0.4ｇ、FeSO4・7H2O １０mg、MnSO4・４〜
6H2O 0.2mg、ZnSO4・7H2O 0.9mg、CuSO4・5H2O 0.4m
g、Na2B4O7・10H2O 0.09mg、(NH4)6Mo7O24・4H2O 0.0
4mg、ビオチン３０μｇ、サイアミン塩酸塩１mgを水１
に含みpH7.2に調製した培地〕に接種し、３０℃で振
盪培養した。ＯＤが0.15になった時点で0.5単位／mlと
なるようにペニシリンＧを添加した。さらに培養を続
け、ＯＤが約0.6になったところで集菌し、１mg/mlのリ
ゾチームを含む２mlのＲＣＧＰ培地〔ブドウ糖５ｇ、カ
ザミノ酸５ｇ、酵母エキス2.5ｇ、K2HPO4 3.5ｇ、KH2P
O4 1.5ｇ、MgCl2・6H2O 0.41ｇ、FeSO4・7H2O １０m
g、MnSO4・４〜6H2O ２mg、ZnSO4・7H2O 0.9mg、(N
H4)6Mo7O24・4H2O 0.04mg、ビオチン３０μｇ、サイア
ミン塩酸塩２mg、コハク酸二ナトリウム１３５ｇ、ポリ
ビニルピロリドン（分子量10,000）３０ｇを水１に含
みpH7.2に調整した培地〕に懸濁し、３０℃で１４時間
緩やかに振盪してプロトプラスト化した。
このプロトプラスト菌液１mlを2,500×ｇ、１５分間の
遠心にかけ、プロトプラストを沈殿させた。プロトプラ
ストをＴＳＭＣ緩衝液（１０mM MgCl2，30mM CaCl2，5
0mM Tris−HCl，pH7.5、400mM シュクロース）１mlに
懸濁して遠心洗浄後、ＴＳＭＣ緩衝液0.1mlに再懸濁し
た。該懸濁液に上記で単離したｐＡＣ２プラスミドＤＮ
Ａ２０μを混和し、次いで２０％W/Vのポリエチレン
グリコール（ＰＥＧ）6,000を含むＴＳＭＣ緩衝液0.8ml
を添加して混合した。３分後、ＲＣＧＰ培地２mlを添加
し、2,500×ｇ、５分間の遠心によりプロトプラストを
沈降させた。プロトプラストを１mlのＲＣＧＰ培地に懸
濁し、３０℃で２時間緩やかに振盪培養した。次いでこ
のプロトプラスト懸濁液0.1mlをスペクチノマイシン４
００μｇ／mlを含むＲＣＧＰ寒天培地（ＲＣＧＰ培地に
1.4％寒天を含む培地）に塗布し、３０℃で６日間培養
した。
遠心にかけ、プロトプラストを沈殿させた。プロトプラ
ストをＴＳＭＣ緩衝液（１０mM MgCl2，30mM CaCl2，5
0mM Tris−HCl，pH7.5、400mM シュクロース）１mlに
懸濁して遠心洗浄後、ＴＳＭＣ緩衝液0.1mlに再懸濁し
た。該懸濁液に上記で単離したｐＡＣ２プラスミドＤＮ
Ａ２０μを混和し、次いで２０％W/Vのポリエチレン
グリコール（ＰＥＧ）6,000を含むＴＳＭＣ緩衝液0.8ml
を添加して混合した。３分後、ＲＣＧＰ培地２mlを添加
し、2,500×ｇ、５分間の遠心によりプロトプラストを
沈降させた。プロトプラストを１mlのＲＣＧＰ培地に懸
濁し、３０℃で２時間緩やかに振盪培養した。次いでこ
のプロトプラスト懸濁液0.1mlをスペクチノマイシン４
００μｇ／mlを含むＲＣＧＰ寒天培地（ＲＣＧＰ培地に
1.4％寒天を含む培地）に塗布し、３０℃で６日間培養
した。
得られたスペクチノマイシン耐性形質転換株の一株から
先に本発明者らが記載した方法〔特開昭57-134500実施
例１第(1)項〕に従ってプラスミドＤＮＡを抽出した。
単離したプラスミドは制限酵素切断とアガロースゲル電
気泳動による解析によりｐＡＣ２と同一構造を有してい
ることがわかった。また同プラスミドにはｐＡＣ２同様
ＡＴ９９８株のジアミノピメリン酸要求性の相補能があ
ることが前項と同様の形質転換実験からわかった。この
ようにしてｐＡＣ２により形質転換されたことが確認さ
れた株がコリネバクテリウム・グルタミクムRH6/pAC2で
ある。
先に本発明者らが記載した方法〔特開昭57-134500実施
例１第(1)項〕に従ってプラスミドＤＮＡを抽出した。
単離したプラスミドは制限酵素切断とアガロースゲル電
気泳動による解析によりｐＡＣ２と同一構造を有してい
ることがわかった。また同プラスミドにはｐＡＣ２同様
ＡＴ９９８株のジアミノピメリン酸要求性の相補能があ
ることが前項と同様の形質転換実験からわかった。この
ようにしてｐＡＣ２により形質転換されたことが確認さ
れた株がコリネバクテリウム・グルタミクムRH6/pAC2で
ある。
(5)ｐＡＣ２保有株によるＬ−リジン生産： コリネバクテリウム・グルタミクムRH6/pAC2株およびプ
ラスミド非保有の親株ＲＨ６株のＬ−リジン生産を次の
ようにして行った。RH6/pAC2株およびＲＨ６株を３mlの
ＮＢ培地（ブイヨン２０ｇ、酵母エキス５ｇを水１に
含みpH7.2に調整した培地）中でそれぞれ３０℃、１６
時間振盪培養した。培養物0.5mlを５mlの生産培地Ｌ１
〔ブドウ糖１００ｇ、(NH4)2SO4 ３０ｇ、KH2PO4 0.5
ｇ、K2HPO4 0.5ｇ、MgSO4・7H2O １ｇ、FeSO4・7H2O
１０mg、MnSO4・４〜6H2O １０mg、ビオチン１００
μｇ、ホモセリン２００mg、炭酸カルシウム３０ｇを水
１に含み、pH7.2に調整した培地〕に接種し、３０℃
で７２時間振盪培養した。培養後、培養液中のＬ−リ
ジン生成量を酸性銅ニンヒドリン法〔Chi-nard.F.D.,ジ
ャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリィ（J.Bi
ol.Chem.），199，91(1952)〕により比色定量した。結
果を第１表に示す。表からコリネバクテリウム・グルタ
ミクムのdapA組換え体プラスミドｐＡＣ２がＲＨ６株の
リジン生産能を強化することが明らかである。
ラスミド非保有の親株ＲＨ６株のＬ−リジン生産を次の
ようにして行った。RH6/pAC2株およびＲＨ６株を３mlの
ＮＢ培地（ブイヨン２０ｇ、酵母エキス５ｇを水１に
含みpH7.2に調整した培地）中でそれぞれ３０℃、１６
時間振盪培養した。培養物0.5mlを５mlの生産培地Ｌ１
〔ブドウ糖１００ｇ、(NH4)2SO4 ３０ｇ、KH2PO4 0.5
ｇ、K2HPO4 0.5ｇ、MgSO4・7H2O １ｇ、FeSO4・7H2O
１０mg、MnSO4・４〜6H2O １０mg、ビオチン１００
μｇ、ホモセリン２００mg、炭酸カルシウム３０ｇを水
１に含み、pH7.2に調整した培地〕に接種し、３０℃
で７２時間振盪培養した。培養後、培養液中のＬ−リ
ジン生成量を酸性銅ニンヒドリン法〔Chi-nard.F.D.,ジ
ャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリィ（J.Bi
ol.Chem.），199，91(1952)〕により比色定量した。結
果を第１表に示す。表からコリネバクテリウム・グルタ
ミクムのdapA組換え体プラスミドｐＡＣ２がＲＨ６株の
リジン生産能を強化することが明らかである。
発明の効果 本発明によれば、ＤＤＰＳの合成に関与する遺伝子とベ
クタープラスミドとの組換え体を保有させて、コリネバ
クステリウム属またはブレビバクテリウム属菌における
Ｌ−リジンの生産性を向上させることができる。
クタープラスミドとの組換え体を保有させて、コリネバ
クステリウム属またはブレビバクテリウム属菌における
Ｌ−リジンの生産性を向上させることができる。
第１図はベクタープラスミドｐＦＣ１８の作製工程を示
すフローシートである。図中Spc/Smはスペクチノマイシ
ンおよびストレプトマイシン、Ａｐはアンピシリン、Ｔ
ｃはテトラサイクリンの各耐性マーカーを示す。
すフローシートである。図中Spc/Smはスペクチノマイシ
ンおよびストレプトマイシン、Ａｐはアンピシリン、Ｔ
ｃはテトラサイクリンの各耐性マーカーを示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:15） (56)参考文献 特開 昭58−126789（ＪＰ，Ａ) 特開 昭59−210887（ＪＰ，Ａ) Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊ． Ａｐｐｌ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏ ｌ．（1982）15：227−231
Claims (4)
- 【請求項１】コリネバクテリウム属またはブレビバクテ
リウム属に属する微生物由来で、かつ生産されるリジン
によってフィードバック阻害を受けないジヒドロジピコ
リン酸合成酵素の合成に関与する遺伝子を含むＤＮＡ断
片とベクターＤＮＡとの組換え体ＤＮＡを保有させたコ
リネバクテリウム属またはブレビバクテリウム属に属す
る微生物を培地に培養し、培養物中にＬ−リジンを生成
蓄積せしめ、該培養物からＬ−リジンを採取することを
特徴とするＬ−リジンの製造法。 - 【請求項２】ＤＮＡ断片が、コリネバクテリウム・グル
タミクム由来である請求項１記載の製造法。 - 【請求項３】ＤＮＡ断片が両端がＳａｌＩによる切断部
位であり分子中にＢａｍＨＩの切断部位が１箇所、Ｐｖ
ｕIIの切断部位が２箇所あり、かつ分子長が約4.2Kbで
あることを特徴とする特許請求の範囲第１項記載の製造
法。 - 【請求項４】コリネバクテリウム属またはブレビバクテ
リウム属に属する微生物由来で、かつ生産されるリジン
によってフィードバック阻害を受けないジヒドロジピコ
リン酸合成酵素の合成に関与する遺伝子を含むＤＮＡ断
片とベクターＤＮＡとの組換え体ＤＮＡを保有させたコ
リネバクテリウム属またはブレビバクテリウム属に属す
る微生物が、コリネバクテリウム・グルタミクム ＲＨ６／ｐＡＣ２であることを特徴とする特許請求の範
囲第１項記載の製造法。
Priority Applications (7)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP60047515A JPH0655149B2 (ja) | 1985-03-12 | 1985-03-12 | Ｌ―リジンの製造法 |
| EP86103171A EP0197335B1 (en) | 1985-03-12 | 1986-03-10 | Process for producing l-lysine |
| DE8686103171T DE3677399D1 (de) | 1985-03-12 | 1986-03-10 | Verfahren zur herstellung von l-lysin. |
| DE198686103171T DE197335T1 (de) | 1985-03-12 | 1986-03-10 | Verfahren zur herstellung von l-lysin. |
| HU861867A HU196843B (en) | 1985-03-12 | 1986-05-06 | Process for producing l-lysine |
| CN86103512A CN1017906B (zh) | 1985-03-12 | 1986-05-23 | 生产l-赖氨酸的方法 |
| US07/356,614 US4954441A (en) | 1985-03-12 | 1989-05-25 | Process for producing L-lysine |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP60047515A JPH0655149B2 (ja) | 1985-03-12 | 1985-03-12 | Ｌ―リジンの製造法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS61209597A JPS61209597A (ja) | 1986-09-17 |
| JPH0655149B2 true JPH0655149B2 (ja) | 1994-07-27 |
Family
ID=12777244
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP60047515A Expired - Fee Related JPH0655149B2 (ja) | 1985-03-12 | 1985-03-12 | Ｌ―リジンの製造法 |
Country Status (6)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4954441A (ja) |
| EP (1) | EP0197335B1 (ja) |
| JP (1) | JPH0655149B2 (ja) |
| CN (1) | CN1017906B (ja) |
| DE (2) | DE197335T1 (ja) |
| HU (1) | HU196843B (ja) |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FR2602792B1 (fr) * | 1986-08-05 | 1989-10-20 | Transgene Sa | Procede de stabilisation d'un plasmide contenu dans une souche bacterienne et souche obtenue |
| DE3737729A1 (de) * | 1987-11-06 | 1989-05-18 | Degussa | Pendelvektor pz1, rekombinantes, ein aspartasegen enthaltendes plasmid, seine verwendung zur herstellung von aminosaeuren der aspartat-familie aus fumarat-haltigem naehrmedium und es enthaltende mikroorganismen |
| DE3823451C2 (de) * | 1988-07-11 | 1997-02-20 | Forschungszentrum Juelich Gmbh | Rekombinante DNA, damit transformierte Mikrooganismen und Verwendung dieser Mikroorganismen zur Herstellung von L-Lysin mit Hilfe dieser Mikroorganismen |
| DE3908201A1 (de) * | 1989-03-14 | 1990-09-27 | Degussa | Verfahren zur fermentativen herstellung von l-lysin |
| DE3943117A1 (de) * | 1989-12-27 | 1991-07-04 | Forschungszentrum Juelich Gmbh | Verfahren zur fermentativen herstellung von aminosaeure, insbesondere l-lysin, dafuer geeignete mikroorganismen und rekombinante dna |
| JP2876739B2 (ja) * | 1990-08-03 | 1999-03-31 | 味の素株式会社 | 発酵法によるｌ―リジンの製造法 |
| JP3078312B2 (ja) * | 1990-11-22 | 2000-08-21 | 協和醗酵工業株式会社 | 物質の製造法 |
| JP2000262288A (ja) * | 1999-03-16 | 2000-09-26 | Ajinomoto Co Inc | コリネ型細菌の温度感受性プラスミド |
| DE19912384A1 (de) * | 1999-03-19 | 2000-09-21 | Degussa | Verfahren zur fermentativen Herstellung von L-Aminosäuren unter Verwendung coryneformer Bakterien |
| DE19924365A1 (de) | 1999-05-27 | 2000-11-30 | Degussa | Verfahren zur fermentativen Herstellung von L-Aminosäuren und für das accDA Gen codierende Nukleotidsequenzen |
| US6797509B1 (en) | 1999-07-09 | 2004-09-28 | Degussa-Huls Ag | Nucleotide sequences which code for the tal gene |
| DE19943587A1 (de) * | 1999-09-11 | 2001-03-15 | Degussa | Neue für das dapF-Gen codierende Nukleotidsequenzen |
| US7132272B2 (en) | 1999-10-05 | 2006-11-07 | Degussa Ag | Nucleotide sequence encoding corynebacterium glutamicum leucine response regulatory protein |
| US6713289B2 (en) | 1999-10-05 | 2004-03-30 | Degussa Ag | Nucleotide sequences which code for the eno gene |
| DE19947792A1 (de) * | 1999-10-05 | 2001-04-12 | Degussa | Neue für das Irp Gen codierende Nukleotidsequenzen |
| DE19947791A1 (de) * | 1999-10-05 | 2001-04-12 | Degussa | Neue für das eno-Gen codierende Nukleotidsequenzen |
| DE19956686A1 (de) * | 1999-11-25 | 2001-05-31 | Degussa | Neue für die Gene sucC und sucD codierende Nukleotidsequenzen |
| US6897055B2 (en) | 1999-11-25 | 2005-05-24 | Degussa Ag | Nucleotide sequences coding for the genes sucC and sucD |
| DE19958160A1 (de) * | 1999-12-02 | 2001-06-07 | Degussa | Neue für das gpm-Gen codierende Nukleotidsequenzen |
| DE19958159A1 (de) * | 1999-12-02 | 2001-06-07 | Degussa | Neue für das glk-Gen codierende Nukleotidsequenzen |
| US6927046B1 (en) * | 1999-12-30 | 2005-08-09 | Archer-Daniels-Midland Company | Increased lysine production by gene amplification using coryneform bacteria |
| US6818432B2 (en) | 2000-01-13 | 2004-11-16 | Degussa Ag | Nucleotide sequences encoding the ptsH gene |
| DE10001101A1 (de) * | 2000-01-13 | 2001-07-19 | Degussa | Neue für das ptsH-Gen codierende Nukleotidsequenzen |
| DE10014546A1 (de) * | 2000-03-23 | 2001-09-27 | Degussa | Für das dapC-Gen kodierende Nukleotidsequenzen und Verfahren zur Herstellung von L-Lysin |
| US20020081673A1 (en) * | 2000-06-02 | 2002-06-27 | Bettina Mockel | Novel nucleotide sequences coding for the glbO gene |
| DE10210527A1 (de) | 2002-03-09 | 2003-09-18 | Degussa | Allele des aceA-Gens aus coryneformen Bakterien |
| BRPI0510746A (pt) * | 2004-06-10 | 2007-11-20 | Univ Michigan State | sìntese de caprolactama a partir de lisina |
| BRPI0518845A2 (pt) | 2004-12-06 | 2008-12-09 | Sage Biosciences Inc | mÉtodo para aumentar a resistÊncia À inativaÇço ruminal de uma cepa de bactÉrias gram-positivas produtoras de lisina, suplemento alimentÍcio de lisina protegido no rémen, e, mÉtodos para aumentar o teor de lisina metabolicamente disponÍvel de uma raÇço alimentÍcia para ruminantes, e in vitro para avaliar a resistÊncia de uma cepa de bactÉrias produtoras de lisina para inativaÇço ruminal in vivo |
| DE102005013676A1 (de) | 2005-03-24 | 2006-09-28 | Degussa Ag | Allele des zwf-Gens aus coryneformen Bakterien |
| US20070092951A1 (en) | 2005-03-24 | 2007-04-26 | Degussa Ag | Alleles of the zwf gene from coryneform bacteria |
| DE102005043979A1 (de) | 2005-09-15 | 2007-03-22 | Forschungszentrum Jülich GmbH | Verfahren zur Produktion von Aminosäuren in aminosäureproduzierenden Mikroorganismen |
| DE102006032634A1 (de) | 2006-07-13 | 2008-01-17 | Evonik Degussa Gmbh | Verfahren zur Herstellung von L-Aminosäuren |
| DE102007005072A1 (de) | 2007-02-01 | 2008-08-07 | Evonik Degussa Gmbh | Verfahren zur fermentativen Herstellung von Cadaverin |
| WO2008103366A2 (en) * | 2007-02-20 | 2008-08-28 | Board Of Trustees Of Michigan State University | Catalytic deamination for carprolactam production |
| DE102008001874A1 (de) | 2008-05-20 | 2009-11-26 | Evonik Degussa Gmbh | Verfahren zur Herstellung von L-Aminosäuren |
| JP2011529087A (ja) * | 2008-07-24 | 2011-12-01 | ドラス コーポレイション | 環状アミドモノマーを作製する方法、ならびに関連する誘導体および方法 |
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| US9988624B2 (en) | 2015-12-07 | 2018-06-05 | Zymergen Inc. | Microbial strain improvement by a HTP genomic engineering platform |
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| US10544411B2 (en) | 2016-06-30 | 2020-01-28 | Zymergen Inc. | Methods for generating a glucose permease library and uses thereof |
| US10544390B2 (en) | 2016-06-30 | 2020-01-28 | Zymergen Inc. | Methods for generating a bacterial hemoglobin library and uses thereof |
| ES2939979T3 (es) | 2016-09-01 | 2023-04-28 | Ningxia Eppen Biotech Co Ltd | Corynebacterium para producir L-lisina por fermentación |
| US20200239897A1 (en) | 2017-06-07 | 2020-07-30 | Zymergen Inc. | Promoters from corynebacterium glutamicum and uses thereof in regulating ancillary gene expression |
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