JP3078312B2

JP3078312B2 - 物質の製造法

Info

Publication number: JP3078312B2
Application number: JP02320440A
Authority: JP
Inventors: 瞭一勝亦; 正人池田; 恵子中西; 祐子笹尾
Original assignee: 協和醗酵工業株式会社
Priority date: 1990-11-22
Filing date: 1990-11-22
Publication date: 2000-08-21
Anticipated expiration: 2015-08-21
Also published as: DE69109243D1; DE69109243T2; JPH04190794A; EP0487333B1; KR940005580B1; EP0487333A2; US5595894A; EP0487333A3; KR920009977A; US5624828A

Description

【発明の詳細な説明】産業上の利用分野本発明は、コリネバクテリウム属またはブレビバクテ
リウム属に属し、組換え体プラスミドを保有する微生物
を用いた物質の製造法に関する。コリネバクテリウム属
またはブレビバクテリウム属に属する微生物は、各種の
アミノ酸の発酵生産に広く用いられている。

従来の技術コリネバクテリウム属またはブレビバクテリウム属菌
種の宿主・ベクター系を用いて、組換えDNA技術による
菌株改良が行われている。しかし、宿主微生物に導入し
た組換え体プラスミドは不安定で、脱落を起こすことが
あり、DNA技術を用いて作成した菌株を用いて、アミノ
酸を工業的規模で生産する場合の問題点となっている。

プラスミドを宿主微生物に安定に保持させる方法とし
て、他の菌種ではいくつかの方法が報告されている。た
とえばプラスミドそのものを遺伝的に安定に保持させる
方法として、大腸菌では低コピープラスミドpSC101の安
定な分配に関する遺伝子parをプラスミドに組み込んで
安定化を図る方法が知られている［ジーン（Gene）、2
3、105（1983）〕。また、プラスミドの脱落株の生育を
抑制することによって、プラスミド保有株のみを優位に
生育させる方法もある。小規模の培養で通常用いられる
抗生物質の培地への添加は、その例である。さらに、生
育に必須の形質を欠損した宿主とその欠損形質を相補す
る遺伝子を有するプラスミドとの組合せにより、プラス
ミドを安定に保持させる方法もある。たとえば、枯草菌
では、アラニンラセマーゼ遺伝子の欠損した宿主と野生
型の同遺伝子を有するプラスミドとの組合せを用いる方
法〔バイオテクノロジー（Bio/Technology）、３、1003
（1985）〕、また大腸菌では、ジアミノピメリン酸要求
性宿主とその要求性を相補する遺伝子を有するプラスミ
ドとの組合せを用いる方法（特開昭63−233790）があげ
られる。いずれの場合にも、プラスミド脱落株は細胞壁
の成分として必須のＤ−アラニンまたはジアミノピメリ
ン酸を合成できないため溶菌してしまい、プラスミド保
有株のみが増殖することになる。この両者の方法では、
工業的規模での発酵において一般的に用いられる動植物
または酵母由来の抽出物を含む培地で培養する場合に
も、それら天然栄養物中にはＤ−アラニン及びジアミノ
ピメリン酸が含まれないため、プラスミド脱落株の増殖
を抑制できる。

しかしながら、コリネバクテリウム属またはブレビバ
クテリウム属菌種においては、組換え体プラスミドを宿
主細胞内に安定に保持させる方法は確立されていない。

発明が解決しようとする課題組換え体プラスミドを保有するコリネバクテリウム属
またはブレビバクテリウム属菌種を用いて、工業的に大
規模なスケールで、物質たとえばアミノ酸などを製造す
る場合、種培養から本培養まで多数回の***増殖が伴う
ため、組換え体プラスミド脱落株が多くなる。これは生
産性の低下につながるので、組換え体プラスミドを宿主
微生物の細胞内に安定に保持させることによって、物質
を工業的に安価に製造する方法の開発が望まれている。

課題を解決するための手段本発明は、コリネバクテリウム属またはブレビバクテ
リウム属に属し、セリン要求性を有する微生物に、該セ
リン要求性を相補する遺伝子および所望の遺伝子を組み
込んだ組換え体プラスミドを導入して得られる形質転換
株を培地に培養し、培養物中に該形質転換株が生産する
物質を生成蓄積させ、該培養物から該物質を採取するこ
とを特徴とする物質の製造法を提供する。

以下に、本発明を詳細に説明する。

コリネバクテリウム属またはブレビバクテリウム属に
属する微生物は、セリンの分解力が強く、培地中に含ま
れるセリンが培養の初期に速やかに分解消費されるた
め、プラスミドの脱落したセリン要求性の宿主菌は増殖
できず、結果としてプラスミド保有株のみが継代培養さ
れることになり、従来用いられていた形質転換株を用い
た物質の製造法よりも効率よく物質が製造できる。

本発明で用いられる宿主微生物としては、コリネバク
テリウム属またはブレビバクテリウム属に属し、セリン
要求性の菌株であればいずれでもよい。これらのセリン
要求株が、さらに他の性質、たとえば各種栄養要求性、
薬剤耐性、薬剤感受性等を併せて持っていてもよい。こ
のような菌株を誘導する際の親株としては、次のような
菌株をあげることができる。

コリネバクテリウム・グルタミクム ATCC13032 コリネバクテリウム・アセトアシドフィルム ATCC13870 コリネバクテリウム・ハーキュリス ATCC13868 コリネバクテリウム・リリウム ATCC15990 ブレビバクテリウム・フラブム ATCC14067 ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム ATCC13869 ブレビバクテリウム・ディバリカツム ATCC14020 ブレビバクテリウム・チオゲニタリス ATCC19240 本発明におけるセリン要求性変異株は、通常の変異処
理法、たとえば紫外線照射またはＮ−メチル−Ｎ′−ニ
トロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（NTG）や亜硝酸などの
化学処理を施した後、最少培地では生育できないが、セ
リンを含む最少培地では生育する変異株を分離すること
によって取得することができる。

本発明における宿主のセリン要求形質を相補する遺伝
子としては、いかなる微生物由来のものでもよい。その
ような遺伝子として、宿主がセリン生合成酵素の欠損変
異株である場合には、セリン生合成系遺伝子、具体的に
は３−ホスホグリセリン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子、ホ
スホセリンアミノトランスフェラーゼ遺伝子あるいはホ
スホセリンホスファターゼ遺伝子をあげることができ
る。

該DNAを組み込むためのベクターとしては、コリネ型
グルタミン酸生産菌中で自律複製できるものであれば特
に限定されないが、例えばpCG1（特開昭57−134500）、
pCG2（特開昭58−35197）、pCG4、pCG11（いずれも特開
昭57−183799）、pCE54、pCB101（いずれも特開昭58−1
05999）、pCE51、pCE52、pCE53〔いずれもモレキュラー
・アンド・ジェネラル・ジェネティクス（Mol.Gen.Gene
t.）196、175（1984）〕などのプラスミドを使用するこ
とができる。

宿主のセリン要求形質を相補する遺伝子は、次のよう
にして得ることができる。すなわち、染色体DNAとベク
ターDNAとの組換え体混成物を用いて、上記セリン要求
性変異を有する宿主を形質転換し、セリン非要求性とな
った形質転換株から目的の遺伝子を含む組換え体DNAと
して取得できる。形質転換は、プロトプラストを用いる
方法（特開昭57−186492および特開昭57−186489）によ
り実施することができる。

上記のようにして得られたセリン要求性変異株と該セ
リン要求性を相補する遺伝子を含む組換え体DNAを宿主
・ベクター系として用いて、有用遺伝子を含むDNA断片
をコリネバクテリウム属またはブレビバクテリウム属菌
種に導入する。また、他の宿主・ベクター系を用いて、
有用遺伝子を含むDNA断片を含む組換え体プラスミドを
作成し、該組換え体プラスミドにセリン要求性を相補す
る遺伝子をさらに組み込んだ組換え体プラスミドを、セ
リン要求性変異株に導入してもよい。

有用遺伝子としては、コリネバクテリウム属またはブ
レビバクテリウム属菌種に導入された場合に、該菌種に
物質の生産性を付与するものや、該菌種の生合成系を強
めるものなどがあげられる。具体的には、アミノ酸の生
合成経路上の律速ステップとなっている酵素の遺伝子
（特開平１−265892、特開昭63−105688、特開昭59−15
6292、特開昭60−24192、特開昭60−34197、特開昭63−
94985、特開昭59−156294、特開昭60−30693、特開昭62
−91193、特開昭61−209597、特開昭60−66989、特開昭
63−79597、特開昭63−102692、特開昭63−119688、特
開昭62−79788、特開昭62−186795、特開昭63−68091な
ど）があげられる。

セリン要求性を相補する遺伝子および有用遺伝子を組
み込んだ組換え体プラスミドを、セリン要求性を有する
微生物に導入して得られる形質転換株の培養は、該形質
転換株を炭素源、窒素源、無機物、アミノ酸、ビタミン
などを含有する培地中、好気的条件下、温度、pHなどを
調節しつつ培養を行えばよい。

炭素源としてはグルコース、グリセロール、フラクト
ース、シュークロース、マルトース、マンノース、澱
粉、澱粉加水分解液、糖蜜などの炭水化物、ポリアルコ
ール、ピルビン酸、フマール酸、乳酸、酢酸などの各種
有機酸が使用できる。さらに微生物の資化性によって、
炭化水素、アルコール類なども用いられる。特に廃糖蜜
は好適に用いられる。

窒素源としてはアンモニアまたは塩化アンモニウム、
硫酸アンモニウム、炭酸アンモニウム、酢酸アンモニウ
ムなどの各種無機および有機アンモニウム塩類あるいは
尿素および他の窒素含有物質ならびにペプトン、NZ−ア
ミン、肉エキス、酵母エキス、コーン・スチープ・リカ
ー、カゼイン加水分解物、フィッシュミールまたはその
消化物、蛹加水分解物などの窒素含有有機物など種々の
ものが使用できる。

さらに無機物としては、リン酸第一水素カリウム、リ
ン酸第二水素カリウム、硫酸アンモニウム、塩化アンモ
ニウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一
鉄、硫酸マンガンおよび炭酸カルシウムなどを使用す
る。ビタミン、アミノ酸としては、使用する培地の炭素
源、窒素源などによって異なるが、必要に応じ、ビオチ
ン、サイアミンなどを添加する。また使用する菌株が、
要求性を示す場合は、その要求物質を添加する。

培養は振盪培養または通気攪拌培養などの好気的条件
下に行う。培養温度は、一般に20〜40℃が好適である。
培地のpHは、中性付近に維持することが望ましい。培養
期間は通常１〜５日間である。形質転換株による物質の
生産は、導入する組換え体プラスミドや宿主微生物の性
質により異なるが、好適には、アミノ酸の生合成系の遺
伝子を組み込んだ組換え体プラスミドを導入することに
よりアミノ酸の生産性を高めた形質転換株によるアミノ
酸の生産に用いられる。

以下に、実施例を示す。

実施例１コリネバクテリウム・グルタミクムのセリン合成に関
与する３−ホスホグリセリン酸デヒドロゲナーゼ（PGD
H）遺伝子を、トリプトファン合成系遺伝子含有プラス
ミドに組み込み、得られた組換え体プラスミドをPGDH遺
伝子欠損株コリネバクテリウム・グルタミクムSA95に保
有させ、Ｌ−トリプトファンの生産試験を行ったとこ
ろ、プラスミド保有株のみを選択的に増殖させることが
できた。

（１）コリネバクテリウム・グルタミクムATCC31833
の染色体DNAおよび組換え体プラスミドpCDtrp157とベク
ターpCG116の調製： NB培地（粉末ブイヨン20g、酵母エキス5gを水１に
含み、pH7.2に調整した培地）で増殖したコリネバクテ
リウム・グルタミクムATCC31833の種培養20mlを、半合
成培地SSM〔グルコース20g、（NH₄）₂SO₄ 10g、尿素3g,
酵母エキス1g,KH₂PO₄ 1g,MgCl₂・6H₂O 0.4g,FeSO₄・7H₂
O 10mg,MnSO₄・４〜6H₂O 0.2mg,ZnSO₄・7H₂O 0.9mg,CuS
O₄・5H₂O 0.4mg,Na₂B₄O₇・10H₂O 0.09mg、（NH₄）₆Mo₇O
₂₄・4H₂O 0.04mg、ビオチン30μｇおよびサイアミン塩
酸塩1mgを水１に含み、pH7.2に調整した培地〕400ml
に接種して30℃で振盪培養した。東京光電比色計で660n
mにおける吸光度（OD）を測定（以下特記しないかぎり
吸光度は660nmで測定）し、ODが0.2になった時点で培養
液へ0.5単位/ml濃度となるようにペニシリンＧを添加し
た。さらに培養を継続し、ODが0.6になるまで生育させ
た。

培養液から菌体を集菌し、TES緩衝液〔0.03Mトリス
（ヒドロキシメチル）アミノメタン（以下トリスと略
す）、0.005Mエチレンジアミン四酢酸二ナトリウム（以
下、EDTAと略す）、0.05M NaCl、pH8.0〕で洗浄後、リ
ゾチーム溶液（25％ショ糖、0.1M NaCl、0.05Mトリ
ス、0.8mg/mlリゾチーム、pH8.0）10mlに懸濁し、37℃
で２時間反応を行った。集菌した菌体から斎藤−三浦の
方法〔Saito,H.and Miura,K,:バイオキミカ・エ・バイ
オフィジカ・アクタ（Biochim,Biophys.Acta）、72,619
（1963）〕に従って高分子染色体DNAを単離した。

組換え体プラスミドpCDtrp157は、特開平１−265892
に開示されたコリネバクテリウム・グルタミクムの３−
デオキシ−Ｄ−アラビノ−ヘプツロソネート−７−ホス
フェートシンターゼ遺伝子およびトリプトファン合成系
遺伝子群を含むプラスミドである（第１図参照）。

ベクターとして用いるpCG116は、コリネバクテリウム
・グルタミクムのプラスミドpCG11（特開昭57−13450
0）上のStu IおよびPst I切断部位に、M13 mp18 RF
DNA（宝酒造社製）をEcoR Iで切断後、クレノー断片
（宝酒造社製）で平滑末端に修復し、さらにPst Iで切
断して得たリンカーを両者の各々、平滑末端、接着末端
を利用して結合させたプラスミドである。pCG116は分子
長約6.5Kbのプラスミドで、単一の制限酵素切断部位と
してBgl II,Pst I,Sal I,Xba I,BamH I,Sma I,Kpn Iお
よびSac Iを有し、ストレプトマイシンおよび／または
スペクチノマイシン耐性の表現型を与える（第１図参
照）。

pCDtrp157およびpCG116は各々を保有するコリネバク
テリウム・グルタミクムATCC31833から次の方法でそれ
ぞれ単離した。

pCDtrp157またはpCG116を保有するコリネバクテリウ
ム・グルタミクムATCC31833を、400mlSSM培地で、30℃
にて振盪培養し、上記と同様にしてペニシリンＧ処理
後、ODが約0.6になるまで生育させた。菌体を集菌しTES
緩衝液で洗浄後、リゾチーム溶液10mlに懸濁し、37℃で
２時間反応させた。反応液に5M NaCl 2.4ml、0.5M EDT
A（pH8.5）0.6ml、４％ラウリル硫酸ナトリウムと0.7M
NaClからなる溶液4.4mlを順次添加し、緩やかに混和
してから氷水上に15時間置いた。溶菌物を遠心管に移
し、４℃で60分間69,400×ｇの遠心分離にかけ上澄液を
回収した。これに重量百分率10％相当のポリエチレング
リコール（PEG）6,000（半井化学薬品社製）を加え、静
かに混和して溶解後、氷水上に置いた。10時間後、1,50
0×ｇで10分間遠心分離してペレットを回収した。TES緩
衝液5mlを加えてペレットを静かに再溶解してから1.5mg
/mlエチジウムブロマイド2.0mlを添加し、これに塩化セ
シウムを加えて静かに溶解し、密度を1.580に合わせ
た。

この溶液を105,000×ｇ、18℃で48時間超遠心分離に
かけ、紫外線照射下に検知される遠心チューブ下方の密
度の高い位置のバンドを遠心チューブの側面から注射器
で抜きとることによって、pCDtrp157およびpCG116プラ
スミドDNAをそれぞれ分離した。この分画液を等容量の
イソプロピルアルコール液〔容量百分率90％イソプロピ
ルアルコール、10％TES緩衝液（この混液中に飽和溶解
量の塩化セシウムを含む）〕で５回処理してエチジウム
ブロマイドを抽出除去し、しかる後にTES緩衝液に対し
て透析した。

（２） PGDH遺伝子を含むDNA断片のクローニング：上記（１）で、コリネバクテリウム・グルタミクムAT
CC31833から調製したpCG116プラスミドDNA3μｇを含む
反応液Ｙ−100（トリス10mM、MgCl₂6mM、NaCl100mM、pH
7.5）60μに６単位のSal I（宝酒造社製、以下特記し
ない限り、制限酵素は宝酒造社製）を添加し、37℃で60
分間反応させた。一方、コリネバクテリウム・グルタミ
クムATCC31833の染色体DNA3μｇを含むＹ−100反応液14
0μに６単位のSal Iを添加し、37℃で60分間反応させ
た。いずれも65℃で10分間加温して、反応を停止させ
た。

両反応液を混合し、10倍濃度のT4リガーゼ用緩衝液
（トリス660mM、MgCl₂66mM、ジチオスレイトール100m
M、pH7.6）40μ、5mM ATP、T4リガーゼ（宝酒造社
製）300単位および水120μを加え、12℃で16時間反応
させた。

このリガーゼ反応混合物をコリネバクテリウム・グル
タミクムRS57（コリネバクテリウム・グルタミクムATCC
31833よりセリン要求性変異株として誘導されたPGDH遺
伝子欠損株）の形質転換に供した。RS57株の種培養4ml
を、セリン100μg/mlを含むSSM培地40mlに植菌して30℃
で振盪培養した。ODが0.2になった時点で上記（１）と
同様な方法でペニシリンＧ処理後、ODが0.6になるまで
生育させた。菌体を集菌し、該細胞をRCGP培地〔グルコ
ース5g、カザミノ酸5g、酵母エキス2.5g、K₂HPO₄ 3.5
g、KH₂PO₄1.5g、MgCl₂・6H₂O 0.41g、FeSO₄・7H₂O 10m
g、MnSO₄・４〜6H₂O 2mg、ZnSO₄・7H₂O 0.9mg、（N
H₄）₆Mo₇O₂₄・4H₂O 0.04mg、ビオチン30μｇ、サイア
ミン塩酸塩2mg、コハク酸二ナトリウム135g、ポリビニ
ルピロリドン（分子量10,000）30gを水１に含む培
地〕に1mg/mlのリゾチームを含む溶液（pH7.6）10mlに
約10⁹細胞/mlとなるように懸濁し、Ｌ型試験管に移して
30℃で16時間緩やかに振盪反応してプロトプラスト化し
た。

このプロトプラスト菌液0.5mlを小試験管にとり、2,5
00×ｇで５分間遠心分離し、TSMC緩衝液（MgCl₂10mM、C
aCl₂30mM、トリス50mM、ショ糖400mM、pH7.5）1mlに再
懸濁して遠心洗浄後、TSMC緩衝液0.1mlに再懸濁した。
この菌液に２倍高濃度のTSMC緩衝液と上記リガーゼ反応
液の１対１混合液100μを加えて混和し、次いでTSMC
緩衝液中に20％PEG6,000を含む液0.8mlを添加して混合
した。３分後、RCGP培地（pH7.2）2mlを添加し、2,500
×ｇで５分間遠心分離にかけて上澄液を除去し、沈降し
たプロトプラストを1mlのRCGP培地に懸濁してから、こ
の菌液0.2mlをスペクチノマイシン400μg/mlを含むRCGP
寒天培地（RCGP培地に1.4％寒天を含む培地、pH7.2）に
塗布し、30℃で７日間培養した。

寒天培地上に生育したコロニーをかき集め、生理食塩
水で２回遠心洗浄後、生理食塩水1mlに懸濁した。この
菌液をスペクチノマイシン100μg/mlを含有する最少寒
天培地M1〔グルコース10g,（NH₄）H₂PO₄ 1g,KCl 0.2
g、MgSO₄・7H₂O 0.2g,FeSO₄・7H₂O 10mg,MnSO₄・４〜6H
₂O 0.2mg,ZnSO₄・7H₂O 0.9mg,CuSO₄・5H₂O 0.4mg,Na₂B₄
O₇・10H₂O 0.09mg、（NH₄）₆Mo₇O₂₄・4H₂O 0.04mg、ビ
オチン50μｇ、ｐ−アミノ安息香酸2.5mg、サイアミン
塩酸塩1mgおよび寒天16gを水１中に含み、pH7.2に調
整した培地〕上に再塗布して30℃で３日間培養し、スペ
クチノマイシン耐性で、セリン非要求性となった形質転
換株を選択した。これらの形質転換株から上記（１）と
同様な方法によりプラスミドDNAを単離した。形質転換
株の一株から得られ、pCser571と命名したプラスミド
は、各種制限酵素による切断産物をアガロースゲル電気
泳動で解析した結果、pCG116のSal I切断部位に2.7kbの
Sal I DNA断片が挿入された構造を有していることがわ
かった（第１図参照）。

コリネバクテリウム・グルタミクムATCC31833およびp
Cser571を保有する形質転換株について、PGDH活性をE.S
ugimotoとL.I.Pizerの方法〔ジャーナル・オブ・バイオ
ロジカル・ケミストリー（J.Biol.Chem.）243、2081（1
968）に従って測定した。ATCC31833株のPGDH活性を１と
したときのpCser571を保有する形質転換株のPGDH活性は
約13倍に増加していたことから、pCser571に挿入されて
いる2.7kbのDNA断片上に、PGDH遺伝子が存在することを
確認した。

（３） PGDH遺伝子を含むDNA断片のpCDtrp157への連
結： pCser571プラスミドDNA3μｇを含むＹ−100反応液100
μに６単位のBamH Iを添加し、37℃で60分間反応後、
アガロースゲルから1.4kbのDNA断片を分画した。また、
pCDtrp157プラスミドDNA3μｇを含むＹ−100反応液100
μに６単位のBamH Iを加え、37℃で60分間反応後、65
℃で10分間加温して反応を停止させた。両反応液を混合
し、２容のエタノールを加えてDNAを沈澱回収後、水200
μに溶解した。

このDNA溶液200μに10倍濃度のT4リガーゼ用緩衝液
40μ、5mM ATP40μ、T4リガーゼ300単位および水1
20μを加え、12℃で16時間反応させた。

このリガーゼ反応混合物を用いて、RS57株を上記
（２）と同様な方法により形質転換した。スペクチノマ
イシン400μg/mlを含むRCGP寒天培地上に生育したスペ
クチノマイシン耐性コロニーをかき集め、生理食塩水で
２回遠心洗浄後、生理食塩水1mlに懸濁した。この菌液
をスペタチノマイシン100μg/mlを含有する最少寒天培
地M1上に再塗布して30℃で３日間培養し、スペクチノマ
イシン耐性で、セリン非要求性となった形質転換株を選
択した。これらの形質転換株から上記（１）と同様な方
法によりプラスミドDNAを単離した。形質転換株の一株
から得られ、pDTS9901と命名したプラスミドは、各種制
限酵素による切断産物をアガロースゲル電気泳動で解析
した結果、pCDtrp157のBamH I切断部位に1.4kbのBamH I
断片が挿入された構造を有していることがわかった（第
１図参照）。このようにして作製したpDTS9901を保有す
るコリネバクテリウム・グルタミクムATCC21854（コリ
ネバクテリウム・グルタミクムATCC13032から誘導され
たフェニルアラニンおよびチロシンの要求株）株は、平
成１年６月２日付で、コリネバクテリウム・グルタミク
ムK82（FERM BP−2444）として工業技術院微生物工業技
術研究所（微工研）に、ブダペスト条約に基づいて寄託
されている。

（４） pCDtrp157またはpDTS9901を保有する菌株によ
るＬ−トリプトファンの生産およびプラスミドの安定
性：コリネバクテリウム・グルタミクムATCC21854（コリ
ネバクテリウム・グルタミクムATCC13032から誘導され
たフェニルアラニンおよびチロシンの要求株）およびコ
リネバクテリウム・グルタミクムSA95（コリネバクテリ
ウム・グルタミクムATCC21854より、セリン要求性変異
株として誘導されたPGDH遺伝子欠損株）（平成２年９月
21日付で微工研にFERM BP−3108として寄託）の種培養4
mlをフェニルアラニン、チロシンおよびセリン各100μg
/mlを含むSSM培地40mlに植菌して、30℃で振盪培養し
た。ODが0.2になった時点で上記（１）と同様な方法で
ペニシリンＧ処理後、ODが0.6になるまで生育させた。
菌体を集菌し、該細胞を上記（２）と同様な方法により
リゾチーム処理して、プロトプラスト化した。このプロ
トプラストをpCDtrp157およびpDTS9901を用いて、上記
（２）と同様な方法により形質転換した。スペクチノマ
イシン耐性となった形質転換株から、上記（１）と同様
な方法によりプラスミドDNAを単離した。これらのプラ
スミドの各種制限酵素での切断解析により、形質転換株
が、pCDtrp157またはpDTS9901を保有することを確認し
た。

形質転換株のＬ−トリプトファン生産試験を、太型試
験管により次のように行った。

種培地S1〔グルコース20g、ポリペプトン15g、酵母エ
キス15g、NaCl2.5g、尿素1g、Ｌ−チロシン200mg、Ｌ−
フェニルアラニン200mgを水１に含み、pH7.2に調整し
た培地〕3ml中で30℃、24時間振盪培養した種培養0.5ml
を生産培地P1〔グルコース60g、KH₂PO₄ 1g、K₂HPO₄ 1
g、MgSO₄・7H₂O 1g、（NH₄）₂SO₄ 20g、コーン・スチ
ープ・リカー10g、MnSO₄ 10mg、ビオチン30μｇ、CaCO₃
20gを水１に含み、pH7.2に調整した培地〕5mlの入っ
た太型試験管に接種し、30℃で72時間振盪培養した。培
養後、培養液を高速液体クロマトグラフィーを用いた
OPAポストカラム誘導体化法により定量して、Ｌ−トリ
プトファンの生成量を測定した。プラスミドの安定性試
験は、培養終了時の培養液を希釈後、NB寒天培地上に塗
布してコロニー分離し、得られたコロニーをスペクチノ
マイシン100μg/mlを含むNB寒天培地に移植して、同培
地上での生育の有無を観察することによって行った。

第１表から明らかなように、pDTS9901を保有するSA95
株は、プラスミドが培養終了時まで安定に保持されてい
る。

実施例２コリネバクテリウム・グルタミクムのセリン合成に関
与するPGDH遺伝子をスレオニン合成系遺伝子含有プラス
ミドに組み込み、得られた組換え体プラスミドPGDH遺伝
子欠損株コリネバクテリウム・グルタミクムSA24に保有
させ、Ｌ−スレオニンの生産試験を行ったところ、プラ
スミド保有株のみを選択的に増殖させることができた。

（１）組換え体プラスミドpChom10およびベクターpCG
115の調製： pChom10は、特開昭62−91193に開示されたコリネバク
テリウム・グルタミクムのホモセリンデヒドロゲナーゼ
（HD）遺伝子とホモセリンキナーゼ（HK）遺伝子を含む
3.6kbのDNA断片が、ベクターpCE54（特開昭58−10599
9）のSal I切断部位に挿入されたプラスミドである（第
２図参照）。

ベクターとして用いるpCG115は、プラスミドpCG11
（特開昭57−134500）上のBal IIおよびPst I切断部位
に、M13 mp18RF DNAをBamH IおよびPst Iで切断した
リンカーを、両者の同一接着末端を利用して結合させた
プラスミドである。pCG115は分子長約6.4kbのプラスミ
ドで、単一の制限酵素切断部位としてXba I、Sal Iおよ
びPst Iを有し、ストレプトマイシンおよび／またはス
ペクチノマイシン耐性の表現型を与える（第２図参
照）。

pChom10およびpCG115は、各々を保有するコリネバク
テリウム・グルタミクムATCC31833の培養菌体から、実
施例１（１）と同様な方法により単離した。

（２） HD遺伝子とHK遺伝子を含むDNA断片のpCG115へ
の連結：上記（１）で調製したpChom10プラスミドDNAおよびpC
G115プラスミドDNAを各々３μｇ含むＹ−100反応液200
μに、６単位のSal Iを添加し、37℃で60分間反応
後、65℃で10分間加熱して反応を停止させた。

このDNA溶液200μに10倍濃度のT4リガーゼ用緩衝液
40μ、5mM ATP 40μ、T4リガーゼ300単位および水1
20μを加え、12℃で16時間反応させた。

このリガーゼ反応混合物を用いて、コリネバクテリウ
ム・グルタミクムK54（コリネバクテリウム・グルタミ
クムATCC31833よりスレオニン要求性変異株として誘導
されたHK遺伝子欠損株）（FERM P−8258）を実施例１
（２）と同様な方法により形質転換した。スペクチノマ
イシン400μg/mlを含むRCGP寒天培地上に生育したスペ
クチノマイシン耐性コロニーをかき集め、生理食塩水で
２回遠心洗浄後、生理食塩水1mlに懸濁した。この菌液
をスペクチノマイシン100μg/mlを含有する最少寒天培
地M1上に再塗布して30℃で３日間培養し、スペクチノマ
イシン耐性で、スレオニン非要求性となった形質転換株
を選択した。これらの形質転換株から、実施例１（１）
と同様な方法により、プラスミドDNAを単離した。形質
転換株の一株から得られ、pCGhom10と命名したプラスミ
ドは、各種制限酵素による切断産物をアガロースゲル電
気泳動で解析した結果、pCG115のSal I切断部位に3.6kb
のSal I断片が挿入された構造を有していることがわか
った（第２図参照）。

（３） PGDH遺伝子を含むDNA断片のpCGhom10への連
結： pCser571プラスミドDNA3μｇを含むＹ−100反応液100
μに、６単位のSal Iを添加し、37℃で60分間反応
後、アガロースゲルから2.7kbのDNA断片を分画した。ま
た、pCGhom10プラスミドDNA3μｇを含むＹ−100反応液1
00μに、0.5単位のSal Iを加え、37℃で10分間部分消
化後、アガロースゲルから10.0kbのDNA断片を分画し
た。両反応液を混合し、２容のエタノールを加えてDNA
を沈澱回収後、水200μに溶解した。

このDNA溶液200μに、10倍濃度のT4リガーゼ用緩衝
液40μ、5mM ATP40μ、T4リガーゼ300単位および
水120μを加え、12℃で16時間反応させた。

このリガーゼ反応混合物を用いて、RS57株を実施例１
（１）と同様な方法により形質転換し、スペクチノマイ
シン耐性でセリン非要求性となった形質転換株を選択し
た。形質転換株の一株から得られ、pCHS10と命名したプ
ラスミドは、各種制限酵素による切断産物をアガロース
ゲル電気泳動で解析した結果、pCGhom10上に２ヵ所ある
Sal I切断部位の一方に、2.7kbのSal I断片が挿入され
た構造を有していることがわかった（第２図参照）。

（４） pCGhom10またはpCHS10を保有する菌株によるＬ
−スレオニン生産およびプラスミドの安定性：コリネバクテリウム・グルタミクムATCC13032および
コリネバクテリウム・グルタミクムSA24（コリネバクテ
リウム・グルタミクムATCC13032よりセリン要求性変異
株として誘導されたPGDH遺伝子欠損株）を、pCGhom10お
よびpCHS10を用いて、実施例１（２）と同様な方法によ
り形質転換した。スペクチノマイシンに耐性となった形
質転換株から、実施例１（１）と同様な方法によりプラ
スミドDNAを単離した。これらのプラスミドの各種制限
酵素による切断解析の結果、形質転換株がpCGhom10また
はpCHS10を保有することを確認した。

形質転換株のＬ−スレオニン生産試験を太型試験管に
より、次のように行った。

グルコース２％を含むNB培地3ml中で30℃、24時間振
盪培養した種培養0.5mlを、生産培地Ｔ〔廃糖蜜200g、K
H₂PO₄ 0.3g、MgSO₄・7H₂O 0.4g、（NH₄）₂SO₄ 20g、Fe
SO₄・7H₂O 10mg、MnSO₄・４〜6H₂O 10mg、コーン・ス
チープ・リカー8g、サイアミン塩酸塩200μｇ、ビオチ
ン200μｇ、CaCO₃ 40gを水１に含み、pH7.2に調整し
た培地〕5mlの入った太型試験管に接種し、30℃で72時
間振盪培養した。培養後、培養液を高速液体クロマト
グラフィーを用いたOPAポストカラム誘導体化法により
定量して、Ｌ−スレオニンの生成量を測定した。プラス
ミドの安定性試験は、実施例１（４）と同様な方法によ
り行った。

第２表から明らかなように、pCHS10を保有するSA24株
は、プラスミドが培養終了時まで安定に保持されてい
る。

発明の効果本発明によれば、宿主にセリン要求性変異を付与し、
それを相補する遺伝子を組換え体プラスミドに保有させ
ることで、プラスミド保有株のみを安定に継代培養する
ことができる。

【図面の簡単な説明】

第１図はpDTS9901の制限酵素切断地図とその作製工程を
示す。太い実線部分の染色体DNA断片上にはDS遺伝子
が、斜線部分の染色体DNA断片上にはトリプトファン生
合成遺伝子が、また破線部分の染色体DNA断片上にはPGD
H遺伝子が含まれている。第２図はpCHS10の制限酵素切断地図とその作製工程を示
す。太い実線部分の染色体DNA断片上にはHD遺伝子とHK
遺伝子が、また破線部分のDNA断片上にはPGDH遺伝子が
含まれている。プラスミドの大きさはキロベース（kb）で表示されてい
る。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩ //(Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:13） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:15） (Ｃ１２Ｐ 13/04 Ｃ１２Ｒ 1:13） (Ｃ１２Ｐ 13/04 Ｃ１２Ｒ 1:15） (Ｃ１２Ｐ 13/08 Ｃ１２Ｒ 1:15） (Ｃ１２Ｐ 13/22 Ｃ１２Ｒ 1:15） (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C12N 15/00 - 15/90 C12N 1/00 - 1/38 C12P 13/00 - 13/24 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＭＥＤＬＩＮＥ（ＳＴＮ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】コリネバクテリウム属またはブレビバクテ
リウム属に属し、セリン要求性を有する微生物に、該セ
リン要求性を相補する遺伝子およびアミノ酸の生合成経
路上の律速ステップとなっている酵素の遺伝子を組み込
んだ組換え体プラスミドを導入して得られる形質転換株
を、培地に培養し、培養物中に該形質転換株が生産する
アミノ酸を生成蓄積させ、該培養物からアミノ酸を採取
することを特徴とするアミノ酸の製造方法。
【請求項２】セリン要求性を相補する遺伝子が、３−ホ
スホグリセリン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子、ホスホセリ
ンアミノトランスフェラーゼ遺伝子またはホスホセリン
ホスファターゼ遺伝子である請求項１記載の製造方法。
【請求項３】コリネバクテリウム属またはブレビバクテ
リウム属に属し、セリン要求性を有する微生物に、該セ
リン要求性を相補する遺伝子およびアミノ酸の生合成経
路上の律速ステップとなっている酵素の遺伝子を組み込
んだ組換え体プラスミドを導入して得られる形質転換
株。
【請求項４】セリン要求性を相補する遺伝子が、３−ホ
スホグリセリン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子、ホスホセリ
ンアミノトランスフェラーゼ遺伝子またはホスホセリン
ホスファターゼ遺伝子である請求項３記載の形質転換
株。