JPH06508527A - 長期培養に維持されたホルモン分泌細胞 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （３１）、請求の範囲（２６）による方法及び該子孫を置（該工程のあと、該細 胞を約０．５　ｍＭから約２２ｍ１Ｊグルコースで接触させる。

（３２）、該細胞が該グルコース接触に応答し、インシュリン分泌の基底水準の 約１．２倍から約１３０倍の量で増加したインシュリン分泌を生じ、該基底水準 が、培地ミリリットルあたり、１．５×１００万細胞あたり、約２０ｕ［ＬＩか ら約２５０ｕ［ＬＩインシュリンの範囲にある請求の範囲（３１）により生成し た細胞培養。

（３３）、該応答が、約３０分から約２４時間を含んでいる期間をこえて生じて いる請求の範囲（３２）による細胞培養。

（３４）、請求の範囲（２９）による方法及び該子孫を置く該工程のあと、該子 孫を約２ｍＭから約９ｍＭグルコースと接触すること。

（３５）、該細胞が、該グルコース接触に応答して、インシュリン分泌の該基底 水準の約１．５倍から約１０倍の範囲の量で該インシュリン分泌に増加を生じる 請求の範囲（３４）の方法により生成した細胞培養。

（３６）、該置く工程につづき、該細胞を１ｍＭから６ｎ＋Ｍグルコースと接触 し、それにより該細胞にインシュリンの中間水準を分泌させ、そして該細胞をア ミノ酸と接触させることよりなる請求の範囲（２９）による方法。

（３７）、該細胞が、該アミノ酸接触に応答し、インシュリン分泌の該中間水準 の約１．３から約２．．０倍の範囲でインシュリン分泌の増加を生じる請求の範 囲（３６）により生じた細胞培養。

（３Ｂ）　、該アミノ酸が、アラニン及びアルギニンの少（とも１つである請求 の範囲（３７）による細胞培養。

（３９）、該アミノ酸が、約１０ｍＭの一度のアラニンよりなる請求の範囲（３ ８）による細胞培養。

（４０）、該アミノ酸が約２０ｍＭの濃度のアルギニンよりなる請求の範囲（３ ８）による細胞培養。

（４１）、ａ）培地に、少くとも１つの卵巣濾胞を置き、該濾胞が、卵に粘着し ている放射帯細胞及び卵よりなり：ｂ）おだやかに、該放射帯細胞を該卵から放 し、そしてＣ）おだやかに、該放射帯細胞を該卵からはがす工程よりなる生存で きる濾胞細胞をえる方法。

（４２）、工程（ｂ）が、該濾胞を***と接触することによりえられている請求 の範囲（４１）の方法。

（４３）、工程ｆｃ）が、該培地から吸出し、そして該卵から放射帯細胞の分離 か達成されるまで、該培地に該濾胞を排出することにより達成されている請求の 範囲（４１）の方法。

（４４）、更に該細胞を確立している培地に置くことを含む請求の範囲（４１） の方法。

（４５）、更に、該細胞を、約２４８から約３００ｍ０５ｍの滲透性をもつ定義 された培養培地に置き、該細胞の子孫を増すことよりなる請求の範囲（４４）の 方法。

（４６）、　ａ）少くとも１つの非腫瘍細胞を試験管内で、定義された培養培地 は該細胞の子孫の生存を促進でき、該子孫は該培地にホルモンの量を分泌し、そ して Ｃ）ホルモンの該量の少くとも１部を単離する工程よりなるホルモンをえる方法 。

（４７）、請求の範囲（４６）の方法及び該子孫を、該ホルモンの該分泌を刺激 するようにえらばれた分泌促進剤と接触させる更なる工程。

（４８）、該接触か、該細胞を、濾胞刺激ホルモン、黄体ホルモン、絨毛膜生殖 腺刺激物質、Ｋイオン、グルカゴン様ペプチド−１、グルコース、ＣＡＭＰ及び ＣＡＭＰの化学類縁物よりなる群からえらばれた分泌促進剤と接触することによ り達成されている請求の範囲（４７）の方法。

（４９）、請求の範囲（４６）の方法及び工程（ａ）に先立って、細胞供与者に ホルモン及びホルモン類縁薬の少くとも１つを投与することにより、該細胞を試 験管内で前処置すること。

（５０）、該前処置工程が、雌供与体を前処置することにより達成されている請 求の範囲（４９）による方法。

（５１）、該ホルモンが、濾胞刺激ホルモン、黄体形成ホルモン、絨毛膜生殖腺 刺激物質及び生殖腺刺激物質放出ホルモンよりなる群からえらばれている請求の 範囲（４９）の方法。

（５２）　、該工程（ａ）が、***前期の濾胞からえられた顆粒膜細胞を、該定 義された培養培地に置くことにより達成されている請求の範囲（５１）の方法。

（５３）、ａ）既知の生殖腺刺激物質の特定の量による接触への応答で、特定の ステロイドホルモンの既知量を分泌する確立された細胞ラインを提供し、該既知 の生殖腺刺激物質が、既知の生物効果をもち、 ｂ）該細胞ラインの細胞を、該未知の生殖腺刺激物質と接触させ、 Ｃ）該細胞をとりまく培地に分泌された該ステロイドホルモン量を決定し、そし て ｄ）該量を該既知量と比較して、該未知生殖腺刺激物質の生物効果 を決定する工程よりなる未知生殖腺刺激物質の検定法。

（５４）、該工程（ａｌが、該確立された細胞ラインとして、卵巣濾胞細胞を使 用することにより達成されている請求の範囲（５３）の方法。

（５５）、工程（ａｌが、人卵巣濾胞細胞を使用することにより達成されている 請求の範囲（５３）の方法。

（５６）、該工程（ａｌが、プロゲステロンの既知量を分泌している細胞ライン を与えることにより達成されている請求の範囲（５３）の方法。

（５７）、該工程（ａｌが、エストロゲンの既知量を分泌している細胞ラインを 与えることにより達成されている請求の範囲（５３）の方法。

（５８）、　ａ）、既知の毒素に特長的に応答を示す細胞をもつ確立された細胞 ラインを与え、該応答か該細胞ラインの該細胞のホルモン分泌像における既知の 変化であり、ｂ）、該細胞を該テスト化合物と接触させ、Ｃ）、工程（ｂｌのあ と、該細胞のホルモン分泌像を決定し、ｄ）、工程（ｂｌのあと、該細胞のホル モン分泌像を、ホルモン分泌像における該既知変化と比較し、該テスト化合物の 比較毒性を決定する 工程よりなるテスト化合物の毒性決定法。

（５９）　、ホルモン分泌細胞及び確立している培地よりなる細胞培養であって 、該確立している培地が； ａ）必須鉱物、塩、ビタミン、アミノ酸及び脂質をもつ基底の培地、 ｂ）　ｌ！衝系 Ｃ）約２４８　ｍｏｓｍから約３００　ｍｏｓｍの滲透性よりなり、該培養がＣ Ｏ！５％、０，５％及びＮ、９０％よりなる医療ガス混合物で供給されているこ とを特徴とする細胞培養。

（６０）、該培地が、更にラクテート及びピルベートよりなる群から選ばれた少 くとも１つのエネルギー源を含んでいる請求の範囲（５９）の細胞培養。

（６１）、該培地が更に、培地の全量の約０６５％から約１５％の量で血清を含 んでいる請求の範囲（５９）の細胞培養。

（６２）、該血清が、大血清及び定義された血清補充物の少くとも１つを含んで いる請求の範囲（６１）の細胞培養。

（６３）、該定義された培地が蛋白を含んでいる請求の範囲（５９）で定義され た細胞培養。

（６４）、該培地か更にラクテート及びピルベートよりなる群から選ばれた少く とも１つのエネルギー源を含んでいる請求の範囲（６３）の細胞培養。

（６５）、該滲透性が約２６９ｍ０５ｍから約２７５　ｍ０５ｍである請求の範 囲（６３）の細胞培養。

（６６）該分泌されたホルモンが、エストロゲン、プロゲスチン、濾胞刺激ホル モン、黄体形成ホルモン、人絨毛膜生殖腺刺激物質、チロキシン及びインシュリ ンよりなる群から選ばれている請求の範囲（５９）の細胞培養。

（６７）、該分泌されたホルモンが、エストロゲン、プロゲスチン、濾胞刺激ホ ルモン、黄体形成ホルモン、人絨毛膜生殖腺刺激物質、チロキシン及びインシュ リンよりなる群から選ばれている請求の範囲（６３）の細胞培養。

（６８）、ａ）、該ホルモン分泌ポテンシャルをもつ類似の細胞の集団から、人 濾胞刺激ホルモン、入貢体形成ホルモン、人グルカゴン又は人インシュリン分泌 ポテンシャルをもつ少くとも１つの細胞を選ぶこと、 ｂ）、該細胞を、確立している培地に置（こと、該確立している培地が、試験管 内で少くとも約！３８該細胞の生存を促進すること、 ｃ）、試験管内で該細胞の子孫を増殖すること、及びｄ）、試験管内で該細胞の 該子孫の生存を維持し、少くともある子孫が、工程ｂ）の発生から少くとも１年 後試験管内で生存できること、 の工程よりなる試験管内でホルモン分泌細胞を確立する方法。

（６９）　、細胞の該集団が、非腫瘍組織からえられている請求の範囲（６８） の方法により生じた細胞培養。

（７０）、ａ）約２４８ｒｎＯｓｍから約３００ｍ０５ｍの滲透性をもつ定義さ れた培養培地に少くとも１つの細胞を置くこと、該細胞が人濾胞刺激ホルモン、 入貢体形成ホルモン、人グルカゴン又は人インシュリン分泌ポテンシャルをもっ ことそして該細胞が該培地で増殖できて子孫を作ること、及びｂ）試験管内で該 細胞の子孫を増殖すること、該定義された培養培地が該細胞の子孫の少（ともあ るものの生存を促進できるので、該子孫の少くともあるものが、工程ａ）の発生 から少くとも１年後、試験管内で生存できることの工程よりなる試験管でホルモ ン分泌細胞の長期間維持の方法。

（７１）、該置く工程が、細胞を該定義された培養培地に置くことにより行はれ 、インシュリンの分泌にポテンシャルをもつ子孫を生じる請求の範囲（７０）の 方法。

（７２）、該細胞が非腫瘍組織からえられている請求の範囲（７０）の方法によ り生じた細胞培養。

（７３）、　ａ）試験管内で少くとも１つの非腫瘍細胞を定義された培養培地に 置くこと、該細胞はホルモン分泌ポテンシャルをもち、試験管内で増殖できて子 孫を作ること、ｂ）試験管内で、該細胞の子孫を、工程ａ）の発生から１年以上 増殖すること、該培養培地は該細胞の子孫の生存を促進できること、該子孫か該 培地にホルモンの量を分泌すること、そして Ｃ）ホルモンの該量の少くとも１部を単離することの工程よりなるホルモンをえ る方法。

（７４）、請求の範囲（７３）の方法及び該細胞子孫を、該ホルモンの該分泌を 刺激するため運ばれた分泌促進剤と接触することの更なる工程。

（７５）、該接触が、該細胞を、濾胞刺激ホルモン、黄体形成ホルモン、絨毛膜 生殖腺刺激物質、Ｋイオン、グルカゴン様ペプチド−１、グルコース、ｃＡＭＰ 及びｃＡＭＰの化学類縁物よりなる群から選ばれた分泌促進剤と接触することに より行はれている請求の範囲（７４）の方法。

（７６’）、該ホルモンが、エストロゲン、プロゲスチン、濾胞刺激ホルモン、 黄体形成ホルモン、人絨毛膜生殖腺刺激物質、チロキシン、グルカゴン及びイン シュリンよりなる群から選ばれている請求の範囲（７３）の方法。

（７７）、　ａ）試験管で１年以上増殖されており、既知の毒素に特長づけられ た応答を示す細胞をもつ確立された人細胞ラインを提供し、該応答が該細胞ライ ンの該細胞のホルモン分泌像で既知の変化であること、 ｂ）該細胞を該テスト化合物と接触させること、Ｃ）工程ｂ）後、該細胞のホル モン分泌像を決定すること及び ｄ）工程ｂ）後の該細胞のホルモン分泌像を、ホルモン分泌像において該既知変 化と比較し、該テスト化合物の比較毒性を決定すること の工程よりなるテスト化合物の毒性決定法。

浄書（内容に変更なし） 明　細　書 長期培養に維持されたホルモン分泌細胞技術分野 本発明は、ホルモン分泌細胞の長期増殖生体外培養、及び培養においてホルモン 分泌細胞を確立し、維持し、増殖する方法に関するものである。

背景技術 ホルモン分泌細胞は、代表的に１つ又は２つの特定のホルモンの合成及び分泌の ため、高度に分化され、特殊化されている。ホルモン分泌細胞の例は、脳下垂体 、子宮内膜、卵巣及びすい臓のある細胞を含んでいる。脳下垂体は、生殖腺刺激 物質、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）及び黄体形成ホルモン（ＬＨ）として知られ た糖蛋白質ホルモンの合成及び分泌に分化された細胞を含み、それらのホルモン は性腺で作用している。脳下垂体で分泌された生殖腺刺激物質は、血流に入り、 性腺に達し、そこでその影響を発揮する。卵巣内で、生殖腺刺激物質での刺激で 、卵子をとりまいている顆粒膜細胞が、***前濾胞内で分化し、エストロゲン及 びプロゲステロンを合成し分泌する。又子宮内膜の分化細胞は、エストロゲン及 びプロゲステロンを合成し、分泌する。すい臓内で、β−島細胞がインシュリン 分泌における増加で、増加した血糖濃度に応答している。

一般の細胞培養技術は、正常組織又は腫瘍からとられた繊維芽細胞の様に、試験 管内でのある種の細胞タイプの増殖に十分である。試験管内でホルモン分泌細胞 を維持することは、長らく科学者のゴールであった。然しなから、標準の培養條 件は、ホルモン分泌細胞の長期間生存又は増殖を促進しない。実際の目的のため 、培養細胞を確立することが望まれるてあらう。それは、その分化した機能、即 ち、特定ホルモンの合成と分泌を増し、遂行している。

第一の組織培養のため、正常の、又は腫瘍細胞が、動物又は人細胞供与体から移 され、実験室培養血中の液状化学媒体におかれ、そして生体内細胞環境をまねた 物理的条件下で培養器に維持される。媒体及び培養器環境は、制御された温度、 ｐＨ１栄養素、生育因子、病理に対する保護及びある場合には細胞付着に必要な 基質を与えている。然しなから、最適の培養条件下でさえ、殆んどのタイプの正 常細胞は培養において限定された寿命を有している。

代表的に、繊維芽細胞以外の細胞が、第一の組織で確立されているとき、それら は増殖しない：それらは、短期間にわたりその分化機能を遂行しつづけるか、又 は遂行しつづけないてあらう。細胞が、その自然の寿命の終りになると、それら は死ぬ。それ故、培養は、自己限定である。一般に、ホルモン分泌細胞は８〜１ ２日を越さない期間培養中生存する。その期間の間、細胞は細胞***のサイクル を殆んど行はないか、行はない。既知の技術を使って維持されているので、培養 においてホルモン分泌細胞の寿命の間に、そのような細胞は、代表的には、ホル モン生成における減少により証せられるように、機能の損失を生じる。

培養におけるホルモン分泌細胞の寿命を増加さすため、公表された技術は胚細胞 の使用を含んだ。胚細胞でスタートするという戦略は、胚細胞が成育細胞より比 較的分化が少く、それ故、最終的分化、即ち、ホルモン合成のための分化、にな る以前の細胞***の数サイクルを通じて進行すると期待されえるという事実に基 づかれている。分化しない細胞は、分化した細胞より大きな速度で増殖するとい う生物学の原則がある。一般に、時間により、細胞はホルモン合成及び分泌のた め、必要な細胞内機械を発展させることか信じられている。迅速に***すること は、最早や出来ない。

培養において細胞を確立する別の既知の戦略は、癌細胞でスタートすることであ る。癌細胞は増殖に対し大きなポテンシャル（ｐｏｔｅｎｔｉａｌ）をもつと期 待されるてあらうからである。然しなから、腫瘍又は他の癌損傷からえられた細 胞は、殆んど培養で確立も***もできない。一つの細胞ライン（ｌｉｎｅ）が、 試験管内確立の前８年間にわたりモルモット（ｈａｍｓｔｅｒ）はぼ袋に３０４ 連続移植を通して腫瘍細胞を増殖することにより、悪性人体絨毛膿瘍から確立さ れた（ＢｅＷｏ　ｃｅｌｌ　１ｉｎｅ　；　ＡＴＣＣＣＣＬ　９８　：　Ｍａｙ 　１９９０ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ　ｔｏ　ｔｈｅ　１９８８　Ａｍｅｒｉｃａｎ 　Ｔｉ５ｓｕｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）　ｃａｔ ａｌｏｇ　ｏｆ　ｃｅｌｌ　１ｉｎｅｓ）、ＢｅＷｏ細胞ラインは、人絨毛膜生 殖腺刺激物質（ｈＣＧ）　、ポリペプチド（ＰＯＩｙｐｅｐｔｉｄｅ）ホルモン 、人すい臓泌乳刺激ホルモン（ｈＰＬ）、エストロゲン及びプロゲスチンを生成 すると報じられた。異常抜型の細胞ラインが、卵巣の腺癌の患者の悪性腹水から 確立された（ＮＩＨ：　０ＶＣＡＲ−３：ＡＴＣＣＨＴＢ　１６１　；　ｒｅｆ 、　５ＬＩＰｒａ）　、　０ＶＣＡＲ−３細胞ラインは、アンドロゲン及びエス トロゲン受容体をもつと報じられた。然し、これらの細胞によるホルモンの合成 は報じられなかった。

ねずみの分岐系β−細胞ライン（ＲＩＮ）が、ねずみ島細胞腫からの培養で確立 された（Ｃ１ａｒｋ、　Ｓ、　、　Ａ、　、等、　１９８０．　Ｅｎｄｏｃｒｉ ｎｏｌｏｇｙ１２７　：　２７７９−２７８８）。ＲＩＮ細胞は、グルコース（ ｇｌｕｃｏｓｅ）の低レベルへの応答において、試験管内で、０．６ｍＭゲルコ ールの最大応答でインシュリンを分泌すると報じられた。この応答は、未熟ねず みβ−細胞のそれに比較でき、正常の成熟ねずみの島のそれと異なっている。そ の島はグルコース濃度への応答において、５ｍＭから１６ｍＭの範囲に分泌する 。

前述のことから、腫瘍細胞は試験管内に確立することが困難であることが明らか である。更に、培養で確立される腫瘍細胞は、しばしば異状な特長をもち、その 有用性を消す。例えば、ホルモン合成又は分泌促進剤応答の損傷又は変化である 。

異常細胞が、試験管内で更に生長し易という考え方に基づいた戦略を使って、紫 外線の使用、化学発癌因子、及び腫瘍遺伝子の誘導を含んでいる種々の方法によ り、培養において正常細胞が転換されている。ねずみ顆粒膜細胞が、完全なＳＶ ４０ゲノムと活性化Ｈａ−ｒａｓ遺伝子との共トランスフェクションにより転換 された（Ｂａｕｍ、　Ｇ、ら、１９９０　Ｄｅｖｅｌｏｐ　Ｂｉｏｌ　１１２． １１５−１２８）。これらの細胞は、少くともある分化特性を保持すると報じら れた。即ち、それらは、ＣＡＭＰへの応答においてステロイドを合成できた。

培養で確立された他の細胞ラインは、新生児ねずみの正常島からえられたＵＭＲ 細胞（ＮＧ、　Ｋ、　、　ｌ！ｌ、　、ら、、　１９８７．　Ｊ、　Ｅｎｄｏｃ ｒｉｎｏｌ、　１１３　：８−１０）及びモルモット島の猿ウィルスー４０感染 によりえられたＨＩＴ細胞（Ｓａｎｔｅｒｒｅ、　Ｒ，、Ｆ、　、ら、、１９８ １．　ＰＮＡＳ　７８　：　４３３９−４３４３）を含んている。これら細胞ラ インのインスリン分泌出力は低く、グルコースへの応答は培養継代で失はれてい る。

培養のための出発材料として、非転換ホルモン分泌細胞の選択を促進するため、 生体内ホルモン処理の摂生が、供与者からの細胞の移動の前に使用された（Ａｍ ｓ　ｔｅｒｄａｍ、　Ａ、　、ら、１９８９　Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ１２ ４、　＋９５６−１９６４）。細胞は、婦人から除かれた卵胞からえられ、彼女 は試験管内受精のための準備でホルモン治療をうけた。分化機能の付加的促進の ため、細胞は細胞外間質に維持され、更に人絨毛膜生殖腺刺激物質（ｈＣＧ）で 処理された、細胞は分化された外観を持ち、培養でプロゲステロンを分泌したけ れども、細胞は僅か５日培養で生存すると報じられた。類似の研究で、細胞は８ 日生存すると報じられた（Ｐｅｌｌｉｃｅｒ、　Ａ、　、ら、　１９９０．Ｆｅ ｒｔｉｌｉｔｙ培養での分化の維持を促進する別の戦略は、卵母細胞及び複合体 圧（ｃｕｍｕｌｕｓ　ｃｏｍｐｌｅｘ）を含む完全な濾胞の成分の培養を含んだ （Ｖａｎｄｅｒｈｙｄｅｒ、　Ｂ、　Ｃ，ら、１９９０　Ｄｅｖｅｌｏｐ、　Ｂ ｉｏｌ、１４０　、　３０７−３１７）。

このタイプの［組合せ培養」で、二十日ねずみの顆粒膜細胞が、７日間分化状態 に維持された。

技術状況の上記の記述は、長期間培養においてホルモン分泌細胞を維持し、増殖 する方法が必要であることを明らかにしている。

その様な培養は、治療に有用なホルモンの生成のため、生物的工場として発展さ れえる。よく確立されたホルモン分泌細胞ラインは又生殖腺刺激物質製剤のよう に、薬への細胞応答に基づいた試験管内生物検定の可能性を与えるてあらう。加 えて、その様な細胞ラインは、薬及び他の化学物質の毒性のための試験管内生物 検定を与えるてあらう。確立された細胞ラインは又ホルモン欠如による疾患をな おすため、内植のための志願者になるてあらう。例えば、糖尿病は内植を通じて 安定化され、多分治癒されるてあらう。細胞の内植は、すい臘のインシュリン分 泌β−細胞の機能を置換する。

生殖腺刺激ホルモンの変化しない生理的に正しい製剤を造る方法のための必要性 か存在する。人の生殖腺刺激ホルモン製剤は、代表的にはＦＳＨ及びＬＨ両者を 含み、試験管内受精に導いている前処置をうけている婦人に投与される。投与さ れたｈＭＧは、婦人の卵巣を刺激し、多重前***濾胞（ｍｕｌｔｉｐｌｅ　ｐｒ ｅ−ｏｖｕｌａｔｏｒｙｆｏｌｌｉｃｌｅ）を生じ、それは引き続き試験管内受 精のため吸出される。現在、ｈＭＧは、閉経後の婦人の尿からえられている。尿 供与者の年令、内分泌物状態により、各ロット（ｌｏｔ）がことなり、違いは最 終製品に存在するイソホーム（ｉｓｏｆｏｒｍｓ）の濃度及びタイプにある。人 の下垂体前葉卵胞刺激ホルモン（ｈＦＳＨ）に少くとも１１のイソホームかあり 、入貢体形成ホルモン（ｈＬＨ）にクロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）による分析は 、ＦＳＨのイソホームの存在及び濃度にロット間の変動を示した（　５ｔｏｎｅ 、　Ｂ、　Ａ、ら。

靭とり　。異なるイソホームは、ことなる生物的効果を有している（ｇｈａｒｉ ｂ、Ｓ、Ｐ、、ら、１９９０　Ｉｎ　：　Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ　Ｒｅｖｉｅｗｓ 、　１１．　１７７−１９９）。

ＦＳＨのあるイソホームは、他よりもっと生物効果があるので、種々のｈＭＧ製 剤間の生物的効果にロット間変動がある。更に、製剤におけるＬＨイソホームの 存在は、製剤に存在するＦＨの生物的効果に影響を及ぼす。

現在、科学者は、望まれた一定の生物的効果の一般的に巧に処理されたＦＳＨを 生産することを試みている。一般的に処理された生殖腺刺激物質の治療的に有用 な製剤が開発できるように価格的に有効な検出法が必要とされている。

生殖腺刺激物質に対し、化学的検出法に２つの主たるものが存在している。ＨＰ ＬＣとラジオイミノアッセイ（ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）（ＲＩＡ） である。ＨＰＬＣ技術は精密であるが、同定できない。

ｈＭＧ製剤の化学的性質が生物効果に関係している。更にＨＰＬＣ技術は、相当 な技術熟練、機器及び技術労働の投資を要求する。生殖刺激物質の免疫学的認識 にもとすいたテスト（ＲＩＡ）は、生殖腺刺激物質の本質的に相異するイソホー ムと抗体の先天的交差反応性により限定されている。例えば、ＦＳＨ濃度のため の単純ＲＩＡ数値は、ことなる生物的効果の数種のＦＳＨイソホームを含みえる 。それ故、化学的検定に対する現技術は生殖腺刺激物質の治療用製剤の生物的効 果を評価する方法を提供しない。生殖腺刺激物質の生物的効果評価の必要性が、 米国Ｆｏｏｄ　ａｎｄ　ＤｒｕｇＡｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ　（Ｆ　Ｄ　Ａ 　）を含め敵国の国立機関により認められている。現在ＦＤＡにより受け入れら れている検出法は、１歯類動物により行はれた生体検出法である。ＦＳＨの生体 検出法は、スチールマンーボレイ検出法（Ｓｔｅｅｌｍａｎ−Ｐｏｈｌｅｙ　ａ ｓｓａｙ）で、二十日ねずみ子宮重量増加に基づいている。ＬＨの１つの生体検 出法は、ねずみのライジヒ細胞検出法である。未熟雄ねずみの貯精嚢における増 殖の度合が、ＬＨの生物的効果評価の指針である。しＨの別の生体検出法は、ね ずみ卵巣アスコルビン酸欠如テストである。これらの生体検出法は、不利点があ る。それらが多数の実験動物の犠牲を要求するからである。例えば、２０００の 二十日ねずみの犠牲が、ｈＭＧの一つの特定バッチ（ｂａｔｃｈ）の安定性因子 を測定するのに要求されている。２０００でのこの特徴は、最初のハツチの生物 的効果を確立するため要求された数を含んでいない。更にコスト的に有効な生物 検定のための必要性は明らかである。更に噌歯類動物細胞て行はれたテスト結果 は、人における生物的効果に必然的に適用できない。

便利であるが、治療的生殖腺刺激物質の現在の源は、大供与者の間の先天的生物 変異性により限定されている。人生残線刺激物質（人閉経期生殖腺刺激物質−ｈ ＭＧ）の主な源は、スイスの宗教会の会員により供与された尿である。修道院に 住んでいる閉経期をすぎた婦人は販売のため尿を集め、集められた尿のバッチか らその製品の各ロットをえる。集められた尿への各供与者の年令、内分泌物状況 が各バッチで違うので、生殖腺刺激物質の各製剤は化学組成と生物的効果でこと なっている。それ故、人生残線刺激物質の変化しない源に対する必要性がある。

文人の性ステロイドホルモンの生理学上の正確な製剤の源に対する必要性がある 。現在、治療的エストロゲン及びプロゲステロン化合物、及びその類縁物は、標 準化された化学合成により調製されている。然しなから、正常に婦人で作られ「 エストロゲン」と命名された化合物の組は、数種の異なる式とイソホームとを含 んでいる。同様に「プロゲスチン」と命名されたホルモンの組は、数種の異なる 化合物とイソホームを含んでいる。自然に生成されたエストロゲン及びプロゲス チンのタイプと量は、婦人の年令、全体としての生理学的状態、例えば、彼女の 月経周期における特定の時点、妊娠、又は閉経期、により変わる。与えられた治 療上の指示のための最適のステロイド含量は、なにも決定されなかった。たとえ 性ステロイドホルモンの最適化学像が決定されたとしても、化学合成が、複雑な ステロイド混合物の生産のための実際の経路とはならないてあらう。それ故、人 工ストロゲン及びプロゲステロンの生理学的に正確な混合物を先天的に与える方 法を開発することが望まれる。

毒性試験は、科学者が試験管系の使用を通して接近している別の分野である（ｆ ｏｒ　ｒｅｖｉｅｗ　ｓｅｅ　：　Ｎａｕ、Ｈ，１９９０Ｍｅｔｈｏｄｓ　１ｎ ２９−４３．　’）。現在、ホルモン分泌細胞にもとすいた試験管内系は大変部 分的に限定されている。培養でホルモン分泌細胞を維持することの先天的困難性 のためである。理論上、化合物の再生的毒性は、与えられたホルモンを特長的に 分泌する細胞からのホルモン分泌を妨げる化合物の能力により評価されえる。人 でない細胞ライン（支那モルモット卵巣、ＣＨＯ）が毒性学解析に広く利用され ている（　Ｔｓｕｓｈｉｍｏｔｏ、Ｇ、、ら、１９８３．　Ａｒｃｈ　Ｅｎｖｉ ｒｏｎ　ＣｏｎｔａｍＴｏｘｉｃｏｌ、　１２．７２１）。水陸両生動物の卵母 細胞が、腫瘍促進化合物試験の系として提案されている（米国特許第４９８３５ ２７号明細書、１９９１年１月８日）。ゼノバス（ｘｅｎｏｐｕｓ）ｉｆ丸の培 養基ヘノ移植が、***形成の間突然変異誘発及び遺伝毒性（ｇｅｎｏｔｏｘｉｃ ｉｔｙ）のテストに提案されている（米国特許第４９２９５４２号明細書、１９ ９０年５月２９日）。ねずみ胚線維芽細胞から確立された細胞ラインは、蛋白阻 害剤及び活性化剤のスクリーニング系として提案されている（米国特許第４９８ ０２８１号明細書、１９９０年１２月２５日）。

一般に、人は水陸両生動物、１歯類動物に較べ、異なった青感受性をもつと認め られているので、上記の提案された試験管内テスト系は、細胞の人でない発生に より限定されている。

それ故、以下の目的のため、長期培養で確立された人のホルモン分泌細胞ライン の必要性がある。（１）、治療用生殖腺刺激物質の生物検定、（２）大ホルモン の生産、（３）、薬の効果のテストとデザイン、（４）、薬と化学物質の毒性試 験、及び（５）ホルモン分泌不足を置換する内植。

開示。

この発明は、試験管内でホルモン分泌細胞を確立する方法及び少なくとも約１３ 日間、確立している培養媒体において、細胞の少（とも１部の生存を維持する方 法を提供している。

又この発明は、試験管内でホルモン分泌細胞の定義された培地において長期間維 持及び増殖の方法を提供している。

この発明に従ひ、細胞は、卵巣、栄養肝葉、子宮内膜、下垂体、すい臓又は甲状 腺からの正常又は腫瘍組織の動物又は大供与体からえられるであらう。試験管内 で、細胞は、その由来の組織又は＠瘍に特長的なホルモンを分泌する。分泌され たホルモンの例は、エストロゲン、プロゲスチン、生殖腺刺激物質（ＬＨ，ＦＳ ＨｌＲＣＧ）　、インシュリン、グルカゴン、及びチロキシンを含んでいる。細 胞は、増加したホルモン分泌で分泌促進剤による刺激に応答するてあらう。特に 、卵巣由来の細胞は、プロゲステロン、及び／又はエストロゲンの増加した分泌 で生殖腺刺激物質による刺激に応答するてあらう。

この発明の目的は、確立されたホルモン分泌細胞ラインの生産の方法を提供する ことであり、それは寒冷保存され、凍結貯蔵物から増殖されるてあらう、そして 試験管内で数世代にわたり特長的なホルモン分泌像を保持している。

この発明の目的は、培養でホルモン分泌細胞を増殖し、細胞の周りの培養媒体か ら分泌ホルモンを単離することにより、治療に有用なホルモンの生産方法を提供 することである。

この発明の更なる目的は、治療用ホルモン製剤の生物的効果のための試験管内生 物検定に適するホルモン分泌細胞を培養で提供することである。

この発明の付加的目的は、テストされる化学試薬による接触への応答で、試験管 内で、人細胞によるホルモン分泌における変化にもとすいた試験管内毒物検定法 を提供することである。

この発明の更なる目的は、ホルモン分泌鉄如を置換する検体に内植するのに有用 な長期間培養で維持された細胞を提供することである。

図面の簡単な説明 図１は、試験管内でホルモン分泌細胞を確立し、増殖する一般的方法の概略であ る。

図２は、図１における工程８の完了後、人卵巣濾胞細胞の代表的培養の光学顕微 鏡写真（４９００倍）である。

図３は、図２に描写された細胞の第２の例を提供している。

図４は、図２に描写された細胞の第３の例を提供している。

図５は、継代培養１週後、濾胞細胞の光学顕微鏡写真（約５６０倍）である。（ 例２参照） 図６は、濾胞細胞の代表的な初期継代培養の光学顕微鏡写真である（ＳＣ−１， 例２参照）。

図７は、連続の継代培養の２０回以上後の濾胞細胞の代表的継代培養の光学顕微 鏡写真（約２５００倍）である。細胞は、２５ｃｍ”フラスコで１５ｍ１培地あ たり】０＠細胞の密度で４日前に播種された。

図８は、９日前に培養におかれた下垂体由来の腺腫の切片の端での細胞の［芽株 様Ｊ発芽後成育の光学顕微鏡写真（約１１００倍）である。

図９は、下垂体腺腫の切片が１８日間培養された後成長している芽株様突起から 離れた細胞群の光学顕微鏡写真（２２００倍）である。

図１０は、図９における細胞の同し群の２日後にとられた別の光学顕微鏡写真で ある（最初の腫瘍切片に対し２０日間の培養期間）。倍率は図９におけると同じ であり、これら細胞の早い増殖を比較により説明している。

図１１は、増加したグルコース濃度への応答における人すい臓細胞による増加し たインシュリン分泌を描写しているヒストグラ発明の一般的方法の概略が、図１ に与えられている：工程は図、　１を参照して以下に示した。ホルモン分泌ポテ ンシャル（ｐｏｔｅｎｔｉａｌ）をもつ細胞が、ここに与えられた方法により、 外科用の組織サンプルから注意深く単離される。好ましくは、培養で確立される 細胞は、組織が処置の一部として除去されている間に、医療処置中の人供与者か ら得られる（工程２）。細胞は、おだやかに組織から単離される（工程３）そし て十分に生体内環境を模した条件下培養で確立され、細胞の生存が促進される（ 工程４−６）。確立している培養条件下３０日後（工程８）、細胞がホルモン分 泌ポテンシャルに対し選択される（工程９）。選択された細胞は、継代培養にお かれ、定義された培地で更に維持され、増殖される（工程１０及び１１）。定義 された培地は、細胞増殖、継代培養の連続生存を促進するように調合されている 。有用なホルモンが、培地から単離されるであろう（工程１２）。十分に細胞が 増殖した後、細胞培養は、増殖速度、ホルモン分泌、分泌促進剤及び毒素への応 答により特徴づけられている（工程１３）。

部分標本は冷保存され（工程１４）、細胞ライン特性の保持がテストされるてあ らう。細胞ラインが、十分に特長づけられると、確立された細胞ラインを指摘さ れ、ホルモンの生産又は生物的効果検定、毒性検定のため使用されるてあらう。

発明の一つの実施態様で、細胞は、試験管内受精を行っている供与者から除去さ れた卵濾胞細胞からえられている。濾胞抽出の時、供与者は組合されたホルモン 養生法で処置され、多重前***濾胞細胞の発展を刺激している（工程Ｉ）。ホル モン養生法は、卵巣の過剰刺激を制御するため、濾胞細胞刺激ホルモン（ＦＳＨ ）及び人閉経期ホルモン（ｈＭＧ）の組合された中度の黄体抑制のためループロ リドアセテ−）　（ｌｅｕｐｒｏｌｉｄｅ　ａｃｅｔａｔｅ）を含んでいる。卵 母細胞回復に先立つ３４時間で、人絨毛膜生殖腺刺激物質（ｈＭＧ）が投与され 、濾胞細胞の成長、分化を促進させる。上記のホルモン養生法は卵をとりまく顆 粒膜細胞の増殖を刺激する。

濾胞細胞成長相の終りに向って、顆粒膜細胞の２つの集団か発展する：１）濾胞 細胞を含んでいる基底層と接触を維持している壁顆粒膜細胞、２）卵に近い放射 帯細胞として知られた丘顆粒膜細胞、それは卵母細胞と他の周辺丘細胞両者への 空隙連結により結合されている。顆粒膜細胞分化の生殖腺刺激物質刺激は、細胞 −細胞接触における変化、細胞の形、細胞体質組織化、及びエストロゲン、プロ ゲステロン、プロゲスチン、細胞外マトリックス（ｍａｔｒｉｘ）成分の生合成 及びホルモン受容体により特長づけられている。ＦＳＨは、コレステロールのプ ロゲステロンへの代謝、アンドロゲンのエストロゲンへの転換のため要求された 酵素活性を刺激するため、未分化顆粒膜細胞上のＣＡＭＰ媒介メカニズムにより 作用する。濾胞細胞が成熟すると、ＦＳＨ及びエストロゲンは、ＬＨ受容体に伴 はれた顆粒膜細胞血漿膜の生産を刺激する。

ＦＳＨ地膚及びＬＨ受容体の合成後、顆粒膜細胞はＬＨに応答するようになり、 加えられたＬＨへの応答でプロゲステロンを合成するてあらう。

それ故、上記ホルモン処置養生法は、顆粒膜細胞の発展に好ましく、顆粒膜細胞 は基本的プロゲステロンの高レベル及びエストロゲン分泌を示す。例えば、その ような細胞は、治療用人性ホルモンの生産又は毒物によるホルモン分泌の減少に もとずく試験管内毒性検定に望まれる。濾胞細胞の発展が最適であるとき、濾胞 細胞は卵の試験管内受精のための準備に引き出される。これに関連して、「組織 」　（工程２）は完全な濾胞細胞を意味し、基底層、丘顆粒膜細胞、壁顆粒膜細 胞及び卵を含んでいる。一般に非胚芽ライン濾胞細胞は、抽出された卵を伴ひ（ 工程２）、これらの非胚芽ライン細胞は、普通試験管内受精方法の正常な経路の 間に分解されるてあらう。細胞は、医学研究のための非胚芽ライン細胞及び健康 注意使用のための開発を供与している患者の濾胞細胞から培養のため単離される （工程３）。

上記実施態様との対比で、ホルモン分泌の低い基本的レベルを示すが、増加した ホルモン分泌で生殖腺刺激物質に応答する濾胞細胞は、治療用生殖腺刺激物質製 剤の試験管内生物効果検定法に望ましい。それ故、第２の好ましい実施態様で、 濾胞細胞が、上記した前処置養生法の第一の部分のみを行っている供与者からえ られている。供与者は、ｈＭＧ及びＦＳＨをうけたが、ｈＣＧをうけていない。

この実施態様で、比較的分化していない濾胞細胞が、成熟前***濾胞細胞からよ りむしろ、生長している第一の濾胞細胞からえられている。

第３の好ましい実施態様で、濾胞細胞は、いかなる前処置養生法も行っていない 供与者からえられている。この実施態様で、比較的未分化の濾胞細胞が、ホルモ ン刺激前***濾胞細胞からよりも、第一の濾胞細胞からえられている。上記の第 ２の実施態様に類似して、この方法によりえられた濾胞細胞は、ホルモン分泌の 低基底レベルを示すが、増加したホルモン分泌で生殖腺刺激物質への応答能力を 保持している。それ故、この第３の実施態様でえられた細胞は、試験管内生殖腺 刺激物質生物効果検定法として有用である。

一般の方法と、この発明方法とを区別する重要な２つの特徴は、（１）組織が酵 素消化されない。（２）細胞が遠心分離されない、ことである。これは公表され た方法と対照的で、公表された方法は、組織マトリックスから細胞を放出するた め、コラゲナーゼ、ヒアルロニダーゼ、及びトリプシンの様な酵素での培養によ る組織マトリックスの消化を要求している。酵素処理後、一般法は、えられた残 層から細胞を単離するため遠心分離される。ここで「実質的に酵素がない（ｅｎ ｚｙｍｅ　ｆｒｅｅ）Ｊなる語は、プロセスで酵素か培養培地に添加されていな いことを意味している。蛋白分解酵素のような酵素の少量が、いかなる培地にも 存在し、その存在は［実質的に酵素がない」の語の定義内にある。

濾胞細胞を得るあとの最初の工程は、卵の有無にかかわらず、確立している培地 に細胞を置くことである（ＥＭ；工程４）。

「確立している培地１なる語は、細胞が***される生体内環境の重要なパラメー ターを本質的にまねている溶液を意味している。

確立している培地のための５つの特定の調合がここに開示されている。濾胞細胞 の生体内環境の重要なパラメーターは、滲透性を含み、それは培養ホルモン分泌 細胞で以前に使用された滲透性に比し減じられている。濾胞細胞流体の滲透性は 、一般に２７０−２７５　ｍ０５ｍの範囲にある。それ故、本発明の確立してい る培地の最終滲透性は、好ましくは、約２４８ｍ０５ｍから約３００　ｍ０５ｍ 、更に好ましくは、約２６０　ｍｏｓｍから約２８０　ｍ０５ｍ、最も好ましく は、約２７０　ｍ０５ｍから約２７５　ｍｏｓｍの範囲にある。

生体内ガス混合物に似た５％ＣＯ□１５％０２／９０％Ｎ、よりなる医療血中ガ ス混合物での確立されている培地中に細胞を浸すことが好まれる。又確立してい る培地に、約６．３５　ｍＭから約８．３５　ｍＭ、最も好ましくは７．３５　 ｍＭのグルタミン値に純粋のグルタミンを補給することが好ましい。

本発明の１つの好ましい実施態様で、確立している培地は、特定の供与者からえ られた血清を補給されている（確立している培地、同族血清；　ＥＭＮＳ）。好 ましくは、ＥＭＮＳは０．５％〜１５％同族血清、更に好ましくは、５％−１０ ％同族血清、最も好ましくは、７％−８％同族血清を含んでいる。同族血清の使 用は、細胞が生した個人に特殊である蛋白以外の蛋白を含まない環境を与え、そ れ故、供与された細胞の生存に好ましい。免疫反応が最低であるからである。加 えて、供与者の血清は、プロゲステロン、エストロゲン、生殖腺刺激物質のよう なホルモンの特定の内容及び濃度のため好ましいてあらう。

発明の別の実施態様で、確立している培地は特定の細胞供与者以外の個人からえ られた血清で補充されている（確立している培地、非同族血清、ＥＭＮＳ）。好 ましくは、ＥＭＮＳは０．５％−１５％５％非同族血清に好ましくは、５％−１ Ｏ％非同族血清、最も好ましくは、７％−８％非同族血清を含んでいる。高めら れたプロゲステロン生産のように、望まれた特性の細胞の生存を促進するため、 ホルモン、成長因子で培地を色々と補充することは、当業者には明らかである。

発明の更なる実施態様において、細胞は、成功的に定義された培地で確立され、 培地は血清を含まないが、むしろ牛血清アルブミン（ＢＳＡ）又はＢＳＡと購入 血清代用品の組合せで補充されている。「定義された培地」なる語は、人血清を 含まず、人血清含有培地より少かな未知、未検定成分を含んでいる培養媒体を意 味している。ＢＳＡのような、動物からの生成物を含んでいる培地は、完全に化 学合成成分よりなる培地として完全には定義されないことが理解される。然しな から、本発明の技術で、ＢＳＡ含有培地、血清代用品含有培地は、「定義された 培地」として意味されている。本発明で、包括的な語「定義された培地」は人血 清を含まないいかなる培地をも意味している。以下の実験例で３つの異った定義 された培地の式を与えている＝１）確立している培地−０１（ＥＭ−０１）；　 ２）定義された培地−１（ＤＭ−１）；３）定義された培地、血清代用品（ＤＭ ＳＳ）。これら３つの定義された培地は、人血清の代りに、ＢＳＡ及び／又は血 清代用品含有動物蛋白を含んでいる特長を分配している。

ここで、ｒ血清代用品」なる語は、蛋白と、好ましくは、培地の全容量の約５〜 約１５％の量添加された成長因子の組合せを意味している。ＥＭ−０１は、血清 が抗***抗体を含んだ供与者からの受精された卵の生存を促進するよう当初工夫 された。偶然に、又供与者血清のためのＢＳＡの代用は非胚芽ライン濾胞細胞の 生存を促進した。それは卵と同じ時間培養された。それ故、ＥＭ−ＯＩは濾胞細 胞に好ましく確立している培地である。ＤＭ−１及びＤＭＳＳと示された培地は 、当初ＥＭ含有人血清（ＥＭＮＳ及びＥＭＮＳ）において３０日後使用のため調 合された。然しなから、ＥＭ含有人血清にまえもって置かれることなしに、細胞 がＤＭ−１又はＤＭＳＳで成功的に確立されるてあらうことが発見サレタ。ＥＭ −０１、ＤＭ−１及びＤＭＳＳｌｔ、又ソレラカ一般の培養培地より低い滲透性 を持つことで、ＥＭ含有人血清の区別している特性を分配している。ＥＭ−０１ ，ＤＭ−１及びＤＭＳ　Ｓの滲透性は、好ましくは約２４８　ｍｏｓｍから約３ ００　ｍｏｓｍ、の範囲、更に好ましくは約２６０　ｍ０５ｍから約２８０　ｍ ０５ｍ、最も好ましくは約２７０ｍ０５ｍから約２７５ｍ０５ｍの範囲にある。

適切に、この方法に使用された培地調合剤は、グルコースに加えて、ラクテート 及びビルベイトのような付加的エネルギ源を含むてあらう。「エネルギ源ｊなる 語は、解糖作用を通じ、又はトリカルボン酸サイクル（Ｔ、Ｃ，Ａ）を通じてＡ ＴＰを作るよう細胞により使用されえる化学物質を意味している。

確立している培地でのように、定義された培地調合剤を、約６、３５　ｍＭから 約８．３５ｍＭ、　Ｒも好ましくは約７．３５　ｍＭグルタミンの量に加えられ たグルタミンで補充することは好ましい。

適切には、卵及び取りまいた非胚芽ライン濾胞細胞が、ともにＥＭ　（ＥＭＮＳ ；　ＥＭＮＳ、ＥＭ−０１，ＤＭ−ＩＳＤＭＳＳ　。

工程２ａ）に置かれる。約２４時間後、***がＥＭに添加され、細胞は更に２０ 〜２４時間培養されるてあらう（工程２ｂ）。***は光体酵素として知られた酵 素を提供すると信じられており、その酵素は卵をとりまくマトリックスから非胚 芽ライン細胞をおだやかに放出する。本発明の関連内で、***連結光体酵素の量 は僅かで、細胞を放出するため組織マトリックスを消化するための伝統的方法で 使用されているコラーゲンの様な大量の酵素に比較されないことが理解される。

***においての培養後、放線冠の細胞が、例１に記されたように中空針の使用を 通じて卵から手ではぎとられるてあらう（工程２ｃ）。適切に、卵に粘着してい ない濾胞細胞が単純にまわりの培地から単離されるてあらう（工程３）。

生存しえる細胞が解剖顕微鏡を通じて選ばれる（９０倍：工程５）。「生存しえ る」なる語は、培養皿の底に拡がっている単一層を示す細胞を意味している。本 発明の技術でよく知られるように、トリパン青染料排除の方法により、生存性が 細胞の分配できるサンプルで確認されるてあらう。再び本発明の方法は、工程３ におけると同様工程５でアムスターダム（Ａｍｓｔｅｒｄａｍ）ら（上記）及び ペリサー（Ｐｅｌｌｉｃｅｒ）ら（上記）の方法と区別される。遠心分離又は勾 配分離は本技術で使用されていない。代りに、細胞は、手でおだやかに選ばれ、 培養に対し単離される。それで遠心分離を行った細胞集団と比較し、大量の細胞 の完全な膜を保持している。再び本発明の方法は、細胞を単離するため組織の酵 素的消化を要求している技術と区別される。その様な既存の技術は、代表的にト リプシン又はコラゲナーゼにおける培養を含み、この発明の方法に望まれた細胞 に有害である。

選ばれた細胞は、ガラスのミクロピペットの助けで新細なＥＭに置かれ、更に２ ４から９６時間培養される（工程６）。最良の生体内ガス条件をまねるため、上 記の医療用臼ガス混合物で細胞を浸すことは、好ましい。この点で、細胞は新鮮 ＥＭ中５０〜＋００細胞を含んでいる培養に***されるてあらう（工程７）。

更に、選ばれた細胞は、約３０日までの間確立している培地に維持されている（ 工程８）。最初の１４日の間、培養培地は各６〜７日にのみとりかえられる。こ れは、培養の僅かな酵素圧低下を生じ、線維芽細胞に対し、生理学的選択である 。線維芽細胞のような早く***する細胞は、低０□雰囲気で生きのびないからで ある（Ａｌａｄｊｅｍ、　Ｓ、ら、１９８１　Ｐｌａｃｅｎｔａ　５ｕｐｐｌ　 ３．１７５）。低０．雰囲気は、顆粒膜由来の細胞に対しては付随的に正の選択 である。それらの正常の生体内環境が類似の条件にあるからである。

普通に、最初の培養で、細胞の大部分が生きのびえ、基質に付着することなく増 殖する。対照において、大くの細胞が培養板の底にひろがり、プラスチックに付 着を生じる。それ故、与えられた細胞培養は、懸濁液に浮いている細胞凝集塊、 プラスチック皿に粘着している細胞凝集塊、及び皿の底で単一層に広がっている 細胞を構成するてあらう。

確立している試験管内環境での約２０〜３０日後（工程８）、図２．３及び４で 描写されたように、形態学的基準により、ホルモン分泌ポテンシャルに対し細胞 がえらばれる（工程９）。細胞の円凝集塊は、選択されている細胞凝集塊の代表 的タイプである。

好ましくは、２〜１２細胞の小凝集塊が、最も好ましくは、４〜５細胞の凝集塊 がえらばれる。選ばれた凝集塊は、５０〜１５０細胞の群（工程９ａ）又は別に １０−１５細胞の群（工程１０）に組合される。これらの群は第一の継代培養に 指定されている（ＳＣ−１）。選ばれた凝集塊内、即ちお互「真珠のひも」タイ プ配列に境を接している、細胞の空間的配列のため、これらの凝集塊が１又は２ の先祖細胞の***から生じている娘細胞を含む高い確率をもつと考えられている 。しばしば単一細胞の子孫から生じる分岐糸に（ｃｌｏｎａｌｌｙ）選ばれた培 養をえることが望まれ、それ故、単一凝集塊が５Ｃ−１のため使用されるとき、 そのような培養を与える高い確率を持っている（例えば、１０−１２細胞の単一 凝集塊が培養の出発を形成している工程１０）。図６は、５Ｃ−１における濾胞 細胞の代表的初期継代培養を示している。

暗点が特に細胞の密な凝集塊で、その中で個々の細胞は、写真的に識別可能でな かった。暗点間にある明るい色の細胞層は、培養板の底に広がる細胞で、その上 にカメラの焦点が合はされた。

（写真の白い字は、単に記録保持指示で、この特許出願の情報を含んでいない。

） 引続いての継代培養処置におけるいかなる点でも分岐系選択の可能性があること が明らかてあらう。

ホルモン分泌ポテンシャルをもつ細胞の基準は、近似的に球体又は卵形体、凝集 塊内で大きさ、形の均質性を含んでいる。それは図２．３及び４における円形凝 集塊により説明されている。これらの選択基準は、位相差光学及び微小外科操作 を使用している濾胞細胞、及び特に顆粒膜細胞の出願人の観察及び濾胞細胞の組 織学的標本及び走査電子顕微鏡の研究にもとづかれている。上に記され、描写さ れた選択基準が、観察の分野における他の、選択されない細胞への比較の関連で 理解されることであることは本発明の技術における当業者には明らかてあらう。

（図２．３及び４）。

それ故、選択された細胞凝集塊は、非選択凝集塊より少ない細胞を含み、個々の 細胞は、非選択凝集塊の細胞よりもっと均質である。選択細胞は、滑らかな外観 の血漿膜をもち、しわくちゃな誘導縁の血漿膜の非選択膜と対照的である。又濾 胞細胞の場合において、選択された細胞の細胞質は、代表的には粒状よりむしろ 滑らかにみえる。

細胞を継代培養に移す方法（工程１０及び１１）：培養板の底上で成長し、底に 粘着している細胞の場合において、ガラスマイクロピペットの助けで板から細胞 をおだやかに切取ることにより、細胞は、継代培養のため収穫される。この方法 は、基質から細胞をはなすため、酵素的方法又は他の荒々しい方法、例えばカル シウムキレート化、を使用する方法とよい対照をなしている。勿論、懸濁液に成 長している細胞の場合、分離を必要としない。

選択された細胞は、定義された培地に移される（工程１０及び１１、例えば、Ｄ Ｍ−１，ＤＭＳＳ、上記に記述）。ここに記された定義された培地調合剤は、細 胞を増殖させ、ホルモン分泌能を維持する。細胞及び培地を含んでいる培養フラ スコ又は板は、上記の医療用血ガス混合物で浸され、３７°Ｃ培養器内に密封さ れる。好ましくは、少くとも約２ケ月、更に好ましくは、少くとも５．５ケ月、 最も好ましくは、１５ケ月以上の長期間の間、細胞は培養中増殖する。細胞培養 は、隔日に医療用血ガス混合物で浸され、増殖細胞集団の密度に従ひ必要とされ たように再分される。

発明のある実施態様で、定義された培地は、濾胞細胞培養に以前に使用されたよ り高い初期ｐＨをもっている。ＤＭ−１及びＤＭＳＳに指示された培地のｐＨ値 は、初めに７．６５に調整されている。一般の培養培地ｐＨの７．４と対照的で ある。高い初期ｐ）ｌを使用する理論的根拠は、胞状流体及び顆粒膜細胞が、生 体内で僅に高いＣＯ１環境に存在し、母性血清に比較すると、哺乳動物胚は高い ｐＨをもつという事実に基づかれている。（Ｎａｕ、　Ｈ，ら、　１９８６．Ｎ ａｔｕｒｅ　３２３２７６−２７９　；　Ｎａｕ、　Ｈ，１９９０上記）。本発 明の確立している培地の初期の高いｐＨは、同じ物の生産を最小にすることによ り、弱酸による損傷から細胞を保護するてあらう。弱酸の効果を制御できる種々 の別の技術があることは本発明の技術において当業者に明らかてあらう。それ故 、７．６５の初めのｐｌ（は、可能にする示唆としてのみ与えられており、本発 明方法における限定として解釈されない。

更に、ＥＭＨ３，ＥＭＮＳ及びＥＭ−０１を指示した確立している培地は、７． ２〜７．４５の範囲のｐＨ値を持っている。それ故更に一般的なｐＨが培養でホ ルモン分泌細胞を確立するため十分であり、培養でそのような細胞を増殖するに 十分てあらう。

最初の継代培養における最初の６日間（工程ｌＯ）、細胞数は約２倍、好ましく は約３倍又はそれ以上増加する。最初の継代培養の後の部分の間及び引続いての 継代培養の間に、細胞増殖速度は、好ましくは約７２時間、更に好ましくは、約 ４８〜３６時間又はそれ以下の倍の時間に増加する。図６は、培養における１４ 日後の初期継代培養の外観を示している（工程１０）。図６で、暗い点は２００ 細胞又はそれ以上よりなる大きな細胞凝集塊である：凝集塊間の明るい色の細胞 面積は、単一細胞、又は培養皿の底上に広っている少数の細胞よりなる層である 。

図７は、２０以上の継代培養後の濾胞細胞の顕微鏡写真である（工程１１）。そ れは写真日付の前４日、１０＠細胞／１５ｍ１／２５ｃｍ２の密度で培地に塗布 された。図７で、カメラのレンズは培養皿の底に近い細胞の低い層上にのみ焦点 があわされ、培地表面と最低の細胞層の間に多（の細胞の浮いている凝集塊の層 がある。それ故、図７で描写されたものに類似の培養の代表的細胞密度は、好ま しくは約３Ｘ１０’から約４Ｘ１０＠細胞／１５ｍ１／２５ｃｍ’である。

増殖期後、飽和細胞密度に達し、個々の培養は遅い又はためらった増殖を示すて あらう。発明の一実施態様で、そのような「冬眠中の」培養は、分泌促進剤への 応答のように、特性を分化したとき、有用てあらう。冬眠中の培養は、以下に記 するように、生殖腺刺激物質効力の生物検定法に有用てあらう。別に、増殖して いる培養も、生殖腺刺激物質生物検定法に使用されるてあらう。

発明の別の実施態様で、繰返された一連の継代培養により、似た細胞の大集団が 得られている（工程１１）。適切に、集団の蛋白は、冷凍保護培地に凍結され、 液体窒素に貯蔵される。（工程１４）。例１５に記されたように、冷凍細胞の原 案は、現在胚の冷凍に使用されている更に複雑な技術同様伝統技術を代表してい る。培養におけるあるホルモン分泌細胞、特に下垂体細胞の大きなサイズ（ｓｉ ｚｅ）のため（図８−１０；例１３）、冷凍技術を使用することは適している。

冷凍技術は、胚での使用に設計され、胚は比較的大きなサイズである。然しなか ら、少ない生存％が受容できると考へられるとき、単純で一般的技術が使用され るてあらう。解かすと、細胞は特長的な増殖と集団のホルモン分泌パターン（ｐ ａｔｔｅｒｎｓ）を示し、集団から細胞が引出された。好ましい実施態様で、細 胞集団が増殖され、定義された特性をもつ細胞の本質的に限定されない供給を提 供するため冷凍保存される。そのように特長づけられ、貯えられた集団は、「確 立された細胞ライン」として知られている。

確立している培地における時間（工程８）の間及び継代培養における時間（工程 ＩＯ及び１１）の間に、細胞は少くとも１つの人ホルモンを分泌できる。発明の 好ましい実施態様で、細胞は、代表的に人異性体組成物のエストロゲン及び／又 はプロゲスチンを、ホルモンの単離に十分な割合で分泌する。

発明の別の実施態様で、特定集団の細胞はステロイドホルモンの高い基底レベル を分泌しない。然しなから、検出できる増加したステロイドホルモン分泌で、細 胞は生殖腺刺激物質による刺激に応答する。好ましくは、例えば、ＦＳＨの最大 投与は、２４〜４８時間の間に培地に分泌されたステロイドホルモンの量におい て、２〜２０倍増、更に好ましくは４〜ｌＯ倍増、最も好ましくは、５〜８倍増 に刺激する。好ましくは、ステロイド分泌の増加は細胞に投与された生殖腺刺激 物質の投与量とタイプに相関されるてあらう。それ故集団のホルモン分泌像を定 義している。「ホルモン分泌像」なる語は、（１１細胞が応答する特定の分泌促 進剤、（２）ホルモンのタイプ、（３）特定の分泌促進剤への応答において分泌 されるホルモンの量を意味している。確立された細胞ラインは生殖腺刺激物質生 物効力の生物検定法として使用されるてあらう。

発明の更なる実施態様で、細胞は非腫瘍由来の最も好ましい組織人栄養肝葉組織 から引出されている。細胞は培養において確立され、上記の様に継代培養され、 例１２に示されている。栄養肝葉細胞は、好ましくはｈＣＧ及び他のホルモンを 分泌する。非腫瘍栄養肝葉山来の細胞の集団は、適切に強力な再生毒素の生物検 定法に使用されている。生物検定法は強力な毒素と接触することで、基底性ホル モン分泌の減少又は変化に基づかれている。

発明の他の実施態様で、細胞は入子宮内膜から引出される。子宮内膜細胞は、上 記方法のいずれかにより、培養において確立され、継代培養される。子宮内膜細 胞の集団は、培養でプロゲスチン及び／又はエストロゲンの高水準を分泌し、治 療に有用なホルモン製剤の源として使用できる。適切に、子宮内膜細胞集団は又 再生毒性の生物検定法に使用される。

発明の好ましい実施態様で、細胞が人工垂体腫瘍から単離されている。細胞が上 記方法のいずれかにより、及び例１３に示されたように、培養において確立され 、増殖されている。適切に、腫瘍組織が初めに約１〜３ｍｍ直径の切片に切断さ れ、個々の切片が１５〜２０日、確立している培地に置かれる。この時間の間に 、細胞の発芽後育成が進行し、腫瘍の当初切片から分離する（図８−１０）。細 胞の発芽後育成は「芽株様ｊ１器官に上昇を与えている細胞群のための胎生学の 語、として関係されている。分離された芽株細胞群は、定義された培地における 更なる増殖のため、個別の培養に移される。下垂体細胞は、ＦＳＨ又はＬＨのよ うに少くとも１つの人生残線刺激物質を分泌する。人ＦＳＨ又はＬＨは細胞培養 を取りまいている培地から単離され、治療用に任用な生殖腺刺激物質裂開を作る 。

発明の他の実施態様で、細胞が甲状腺又はすい臓の腫瘍又は正常組織から得られ 。ここに記した方法により試験管内で増殖されている。培養で甲状腺又はすい臓 細胞を確立するため、確立方法の変形が使用されている。組織は直接確立してい る培地に置かれ、組織は滅菌小力の使用を通じ小さい塊に裂かれる。塊は約５０ から３００の細胞を含んでいる。塊はいくつかの皿に割けられ、上記した医療用 血ガス混合物で浸される。それらは約２週密封容器にだもたれ、ガスは隔日に新 鮮化される。この時間に細胞は増殖する。２週後、細胞培養は再分され、確立し ている培地に更に８週維持されるてあらう。培養はこの時間の間に必要とされた ように再分されるてあらう、いかにすばやく培養が増殖するかに依存している。

各培養の培地はホルモン含量が検定される。甲状腺組織からの細胞はチロキシン を分泌し、すい臓からの細胞はインシュリンを分泌する。望まれたレベルのホル モンを含んでいる培養は、定義された培地における更なる培養のため選ばれる（ 図１、工程１０）。懸濁液培養が望まれるとき、培養容器の表面に粘着せず、培 地で懸濁し浮く細胞が選ばれるてあらう。

すい臓細胞は１年のような長期間、長期培養において維持されている。すい臓細 胞培養の蛋白は、例１７に記された方法により、ときどき冷凍される。これら冷 凍培養が解かされ、定義された培地におかれると、細胞はインシュリンを合成し 、分泌する能力を保持している。

ここで［インシュリン分泌の維持水準」なる語は、定義された培養培地に分泌さ れたインシュリン量を意味している。すい臓細胞を培養することで、ＤＭＳＳと してここに指示された培地を使用することが好まれる。然しなから、ここに記さ れた定義された培地はどれもすい臓細胞に使用されるてあらう。

本発明のすい臓細胞は約２ｕＩＵから約１０００ｕｌＵインシユリン／時間／１ ０６細胞／培養培地のミリリットルの維持水準を分泌する。更に細胞は約２０ｕ ｌＵ〜約４００ｕｌＵインシユリン／時間／１０ｓ細胞／培養培地ミリリットル の維持水準を分泌する。

重要なことに、本発明のすい臓細胞が長期間培養に維持されると、増加したイン シュリン分泌で、増加したグルコース及び増加したアミノ酸濃度に応答する能力 をもっている。すい臓細胞は１年間或は連続培養においてより長くこの機能を保 持している。

糖尿病てない人で、ランゲルハンス島内のβ−細胞は約３ｍＭから約８．８　ｍ Ｍの範囲で血中グルコース濃度にさらされている。血中グルコース濃度が約５ｍ Ｍ以上に上昇すると、正常なβ−細胞はインシュリンの正当な量を分泌し、血中 グルコースを４．４〜５．３　ｍＭにもどす正常化に効果を示す。正常検体にお いてインシュリン分泌に影響している他の因子は、血中のアラニン、アルギニン 、及びロイシンの様なアミノ酸の水準である。高められたアミノ酸水準はインシ ュリンの分泌を強めるので分泌が低いグルコース水準で刺激される。それ故、正 常なβ−細胞は、食事後上昇するグルコース及びアミノ酸に精巧に感じ、インシ ュリンの分泌か微妙に調節され、それらの水準を正常にもどしている。

対照において、タイプＩの若年発生糖尿病の大患者のすい臓細胞は、高められた グルコース水準への応答でインシュリンを分泌できない。外生的インシュリンに より制御されないなら、糖尿病の血中グルコース水準はｌ０ｍＭ又はそれ以上に なるてあらう。その時点でグルコースか腎臓を通じて失なわれ、脱水及び深い代 謝障害にみちびいている。タイプＩ糖尿病の成人の臨床的管理で、外生のインシ ュリンが適当な時に、適当な量投与され、血中グルコース水準を３．８８　ｍＭ 〜６．６６　ｍＭグルコースの間に維持するよう試みている。タイプ■糖尿病の 子供で、血中グルコースを高い水準、例えば、６．１ｍＭ〜９．４３　ｍＭ、に 維持することは安全と考えられている。子供は、余りに多くのインシュリンを受 け、危険な低血中グルコース水準に伴はれる徴候を知覚できないてあらうからで ある。明らかに、外生的インシュリン投与は正常なすい臓β−細胞の機能のため の不完全な代用品である。β−細胞は適切なインシュリン分泌でたえず変動して いるグルコース水準に連続的に応答している。

本発明の人すい臓細胞は、図１１に描写したように、培養培地で増加したグルコ ース水準に投与一応答様式における応答に能力をもっている。その上長期培養に おけるこれら細胞の試験管内応答は、第一の培養において正常成人β−細胞から 期待されたものに匹敵する細胞の応答性は数種の方法でテストされるてあらう。

テストを始めるため、細胞は同しタイプの新鮮な定義された培養培地に置かれ、 その中で長期間維持される。長期培養培地は好ましくは約６．５ｍＭから約８． ０　ｍＭグルコース、最も好ましくは７．４＋／−０，３ｍＭグルコースを含ん でいる。長期培養培地における好れたグルコース水準は、人血中グルコースの正 常範囲の高い端に匹敵しており、それて細胞はインシュリン生産の誘発を残した ままである。定義された培地に分泌されたインシュリン量は、上記の様に、「維 持水準」に関係されている。

別に、細胞内にインシュリンを貯めるため、グルコースへの細胞応答を増すため 、細胞は「グルコースの低い培地」における培養により、「グルコース飢餓状態 」てあらう。「グルコースの低い培地」なる語は、代表的には０から約２ｍＭグ ルコースの、正常生理的グルコース濃度以下を含む培養培地を意味している。グ ルコースへの応答実験テストに先立って、細胞は約１から約１６時間、好ましく は、約２時間、グルコース低培地で培養される。

それから、細胞は約０．５ｍＭから約３３ｍＭグルコースのグルコース濃度の範 囲にをかれる。対照として、数種の培養が増加したグルコースにさらされないが 、むしろ新鮮［グルコースの低い培地ｊ又はグルコースの高い正常生理学的濃度 （約７．４　ｍＭ）を含む正規の定義された培地におかれる。培地の試料は種々 の時間点で、インシュリン含量検定のため取り去られる。グルコースの低い培地 又は定義された培地かどうか、添加されたグルコースなしで対照培地に分泌され たインシュリンの量が、与えられたテストに対するインシュリン分泌の「基底水 準」として関係される。

約１ｍＭから約６ｍＭグルコースにさらされると、細胞は基底水準の約１．２倍 から約２．５倍のインシュリンを分泌する。又好ましくは、約６．　Ｉ　ｍＭか ら約１７ｍＭグルコースにさらされると、基底水準の約３から約１０倍のインシ ュリンを細胞か分泌する。一般に、本発明のすい臓細胞は最大に１１ｍＭ〜ｌ　 ６．５　ｍＭグルコースに応答する。

このグルコース応答パターンは、選択透過マクロカプセル（ｍａｃｒｏｃａｐｓ ｕｌｅ）に同封され、試験管内に注がれた新鮮に切除された大島細胞腫のそれに 匹敵している（Ａｌｔｍａｎ、　Ｊ、　Ｊ、　、ら、　１９８４゜Ｔｒａｎｓ、 　Ａｍ、　Ｓｏｃ、　Ａｒｔ、　Ｏｒｇａｎｓ　３０　：　３８２−３８６）。

カプセル化された島細胞腫は、最大に５．５　ｍｌＪグルコース（２２０ｕｌＵ インシュリン／分泌ｍｌ）に、そして１６．５　ｍＭグルコース（３５０ｕｌＵ インシュリン／分泌ｍｌ）に応答すると報じられた。

アミノ酸へのすい臓細胞の応答は、同様にテストされている。

細胞が種々のグルコース濃度を含む培地に置がれ、培養の一部が約０．５　ｍＭ から約４０ｍＭの範囲の濃度で、アラニン、又はアルギニンの様なアミノ酸にさ らされる。約０．５から約２４時間の培養時間のあと、好ましくは１．５時間後 、培地試料はインシュリン含量を検定される。

好ましくは、１．５時間、約１ｍＭグルコースに培養されると、すい臓細胞はイ ンシュリンの中間水準を分泌する。１０ｍＭアラニン力月ｍＭグルコースととも に添加されると、インシュリン分泌は分泌の中間水準を越え約１．１３倍刺激さ れる。２０ｍＭアルギニンが１ｍＭグルコースとともに添加されると、インシュ リン分泌は分泌の中間水準を越え約１．４倍刺激される。好ましく、類似のアミ ノ酸効果が２ｍＭグルコースにみられる。このアミノ酸応答は正常すい臓細胞か ら期待されたものに匹敵し、インシュリン分泌がアミノ酸により強化されている ので、多くのインシュリンがグルコースの低水準で分泌される。

長期培養における人すい臓細胞のこのテストは、本発明の細胞か、正常のβ−細 胞のある特性を保持することを示し、それ故糖尿病の治療にそれらが作用てあら う。

人インシュリンは現在市場的に遺伝的に設計された細菌の使用を通じて生産され ている。然し、本発明のすい臓細胞は、人インシュリンの生産に「生物工場」と して価値があると証明するであ切な変化に応答するので、それらは糖尿病患者へ の移植によい候補者であり、損傷された又は破壊されたβ−細胞の機能を置換す る。

細胞はカプセル化加工され、えられたカプセルは患者に内植されるてあらう。カ プセルは多孔性で、血流からグルコースを細胞に到達させ、細胞により分泌され たインシュリンをカプセル外に拡散させ、血流に分散させる。細胞は、試験管内 でグルコース濃度にすると同じ様式で、患者の血中グルコース濃度での変化に応 答するてあらうと期待されている。細胞によりえられたインシュリン分泌は、患 者の血中グルコース水準を正常化すると期待され、したかってそれから細胞はそ のインシュリン分泌を減じるてあらう。

単一細胞サブ−クロン（５ｕｂ−ｃｌｏｎｅ）培養が、本発明の細胞培養から確 立されるてあらうことは、細胞培養技術における技術者に明らかてあらう。丁度 １つの細胞の子孫である与えられた培養の細胞か、その特性で均質であると期待 されることにおいて単一細胞、サブ−クロン培養に利点があるてあらう。それか ら多くのサブ−クロン培養が、増殖の速度、グルコースへの応答のような種々の 望まれた特性のためスクリーン（５ｃｒｅｅｎ）されるてあらう。

最適の培養が各々の計画された使用に選ばれるてあらう。

ここで提供された方法が、***細胞のように、多くの付加的細胞タイプに使用さ れるてあらうことは、本発明の技術における技術者に明らかてあらう。***細胞 は培養における確立及び増殖に伝統的に困難であった。

以下に述べる実験例は、この発明の詳細な説明している。

実施例１ この実施例では、確立培地中でドナー血清を用いて培養しヒト顆粒層細胞を樹立 する方法を述べる。

細胞の出所二この実施例の細胞は胎外受精を受けている患者がら取出した卵子に 付随する濾胞細胞から得た。

ドナー血清：血液を、各細胞ドナーから、卵子を回収する２４時間前に集めて充 分に凝固させた。凝固した血液を２７０Ｏｒｐｍで１０分間遠心分離にかけた。

生成した透明な血清を注意深く取出して滅菌ファルコン管（Ｆａｌｃｏｎ　ｔｕ ｂｅ）に入れて再度遠心分離にかけて残留赤血球を除去した。この血清は溶血の 徴候がない場合のみ使用した。血清を取出し、別の滅菌ファルコン管に入れ、５ ７°Ｃにて３０分間、熱で不活性化した。この熱で不活性化された血清は、ＢＤ Ｍ及びＥＭを作るのに使用する前に、０．２０　ミクロンのナルジエンフィルタ ー（Ｎａｌｇｅｎｅ　ｆｉｌｔｅｒ）で濾過して滅菌ファルコン試験管に集めた 。

ＢＤＭとＥＭの配合は、“ＩＶＦ　Ｈａｍ”ｓ　Ｆ−１０’と呼ばれる基礎培地 の初期の配合に基いている。この培地は以下のプロトコルにしたがって合成した 。

ＩＶＦ　Ｈａｍ’ｓ　Ｆ　−１０：　Ｌ−グルタミン（ＧＩＢＣＯ）を含有する Ｈａｍ’ｓ　Ｆ　−１０の１０００ｒＩＬＩに、重炭酸ナトリウム０．９ｇ。

ベニンジン０．０７５　ｇ、ストレプトマイシン０．０７５　ｇ、および乳酸カ ルシウム０．２４５　ｇを添加した。浸透圧モル濃度を、細胞培養水（Ｉｆｆｉ 水、１８メガオームの水、ＧＩＢＣＯまたはＭ、Ａ、Ｂｉｏ）を用いて２８０〜 ２８５ｍ０５ｍの範囲に調節した。

その培地を、二つの５００ｍＡ’０．２０ミクロンのナルジエンフィルターユニ ットを用いて濾過滅菌した。ｐＨは７．７であった。

ＩＶ　Ｈａｍ’ｓ　Ｆ　−１０は、胚盤胞発育培地（ＢＤＭ）および樹立培地（ ＥＭ）と呼称される下記培地、ならびに実施例２　（ＤＭ−１）および実施例５ 　（ＥＭ−０１）に記載の培地の配合の基本として用いた。

胚盤胞発育培地（ＢＤＭ）：熱で不活性化した（３７°Ｃ１３０分間）ドナー血 清１．５ｒｎｌをＩＶＦ　Ｈａｍ’ｓ　Ｆ−１０８，５−に添加した。ｐＨは７ ．３５±０．６であった。その培地を二つの０．２０μｍナルジエンフィルター ユニットで濾過滅菌した。

樹立培地（ＥＭ）：ドナー血清１．５−をＩＶＦ　Ｒａｍ’ｓ　Ｆ−１０１８， ５艷に添加した。ｐＨは７．２〜７．４５であった。得られた培地は二つの０． ２０μｍナルジエンフィルターユニットで滅菌濾過した。

オイルプレート：ナンクロン培養プレート（Ｎｕｎｃｌｏｎ　ｃｕｌｔｕｒｅｐ ｌａｔｅ）　（ナンクロントップは使用しなかった）の底部に、鉱油１２−をお いてＩＶＦ　Ｈａｍ’ｓ　Ｆ　−１０に対して約１６時間平衡化して各オイルプ レートを製造した。油で覆っておいて５％Ｃ０１１５％Ｎ！　／９　ｏ％Ｏ！と ３７°Ｃにて一夜あらかじめ平衡化しておいた約０．４〜０．５　ｃｃのＥＭま たはＢＤＭのバブルを注意深くいれた。各オイルプレートはＥＭまたはＢＤＭの バブルを６個をもっていた。平衡化されたオイルで覆うことによって、バブル内 のｐＨが速く変化しないように保護された。

細胞ドナー：ドナーはすべて、胎外受精を選択した患者であり、卵子とともに吸 い出され、胎外受精が終った後は排棄されたであ、ろう濾胞細胞を自主的に提供 した。卵子回収を行う前に、２２歳〜４３歳の女性患者は多数の濾胞が発生する ように刺激するために混合ホルモン法で処置した。その処置には、一般に、卵巣 の高い刺激を制御するため、ヒト閉経ホルモン（ｈＭＧ）と濾胞刺激ホルモン（ ＦＳＨ）を混合した中心黄体の（ｍｉｄｌｕｔｅａｌ）抑制を行うための酢酸ロ イプロリドが含まれている。放射線免疫検定法（ＲＩＡ）を用いて、エストラジ オールとプロゲステロンの血清濃度を監視した。増殖濾胞の数とその大きさを測 定するのに超音波スキャンを用いた。卵母細胞の回収を行う３４時間（１１時間 ）前に、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）　１０，０００１Ｕを投与した。

濾胞の内容物は、膣を経由して卵母細胞を回収している間に吸出され、濾胞は３ ７°Ｃのダルベツコ溶液で洗浄した。溶液中の濾胞を、１５ｃｃ滅菌ファルコン 使い捨て試験管に集め、直ちに発生学試験室に移した。発生学試験室内では香料 は許されなかったことに注目すべきである。その理由はある種の香料由来の香気 が細胞の生存度に影響することが分かったからである。

卵子複合体を同定し、次に５ｃｃの温確立培地（ＥＭ）を含有するファルコン培 地つェル皿（＃３００７）に移した。１〜３個の卵子複合体を各収集皿中に置い た。卵子複合体は、卵子、その周囲の透明帯、放射帯、叩圧細胞および結合した 濾胞成分で構成されている。移転手順に対する時間制限は、ｐｔ（の変化と温度 変動を最小にするため９０秒間であった。収集皿は、ふたにすきまを設けて、直 ちに、５％ＣＯｘが入っている３７℃のインキュベーター（医学グレード）内に 入れた。

約５〜６千万分間経過後、卵子複合体をオイルプレートのＥＭバブル中に移した 。一般に１〜３回の卵子複合体を単一のＥＭバブル中に入れた。この操作中、Ｅ Ｍプレートは、７分間以上はインキュベーターの外に置かなかった。次いでオイ ルプレートは、濾過された５％Ｃｏｔ　１５％Ｏｘ　／９　ｏ％Ｎ、医学用混合 物を充填されたフェール−セーフ容器に入れ、密閉し、５％ＣＬインキュベータ ー中に３７°Ｃで４〜５．５時間入れた。

その卵子は次に、各ＥＭバブルに一滴の最終***懸濁液を添加することによって 受精された。添加される***の量は、各ＥＭバブル中、ｌ−当り約５〜６千万個 の***の最終濃度が得られるように調節した。そのオイルプレートを一夜、先に 述べたのと同様にしてインキュベートした。翌朝ＥＭバブルを検査したところ２ 種の細胞が存在していることが分かった。すなわち１）ＥＭ中の疎性細胞（ｌｏ ｏｓｅ　ｃｅｌｌ）および２）卵子としっかり複合した放射帯の細胞である。

卵子回収して約５０〜５２時間後のこの時点で、非生殖系細胞をさらに培養する ために選択した。

ａ）ＥＭ中で５０時間経過後の疎性細胞からの選択：卵子をＥＭから吸出し通常 のＩＶＦ法でインキュベートした。非生殖系細胞は、培養するために、プレート の底部に広がる単層を示した細胞から選択した。血液凝固物が付着している細胞 は避けた。選択した細胞を、新しく平衡化されたオイルプレート中の新しいＥＭ バブル中に入れた。移転は、ゆっくりはがして濾胞細胞を培養プレートから外し て行った。ホウケイ酸ガラス製滅菌移転ピペットはＨａｍ’ｓ　Ｆ　−１０で予 め被覆した。ナンクロン培養プレート（ＳＥＣＯ１米国、ペンシルベニア州、ロ ーリング・ヒルズ）の底部だけをこれらの培養に用いた。２０〜５０個の選択さ れた細胞を各ＥＭバブル中に入れた。（ｉ）これらの培養物をフェイル−セーフ 容器に入れ、５％Ｃｏｔ　１５％Ｏ＊　／　９０％Ｎ、で溜部しく　ｆ　１ｏｏ ｄ）、次いでその容器を密閉して５％ＣＯｔインキュベーター中に３日間入れて おいた。（ｎ）次に細胞を、６−のＥＭが入っているファルコン＃３００７のウ ェル皿中に入れ、ＩＶＦＨａｍ’ｓ　Ｆ　−１０と平衡化させた鉱油で覆った。

各培養ウェルに最初５〜１００個の細胞を接種し、次いで上記条件下で３０日間 保持した。この３０日間の確立期間中、培養物には、５〜６日間毎に新しいＥ　 Ｍ　１　ｍｌを供給した（すなわち６ｍｔ’入っているウェル中のＩｄを除いて 取換えた）。１５日経過後、いくつかの培養物中に、細胞が、継代培養が必要な 程度まで増殖した（すなわち細胞の数が３〜４倍に増大した）ことが明らかにな った。その細胞を、培養皿の底からゆるやかにはがし、細胞の小グループを、上 記のように、ＥＭが入っている新しい培養皿に移した。

ｆｂｌ　ＥＭ中５０〜５２時間経過後、卵子に付着している細胞からの選択：卵 子＋複合放射帯細胞を、ＢＤＭオイルプレート中の胚盤胞発育培地（ＢＤＭ）バ ブルに注意深く移した。続いて、卵子土付着細胞を２７％ゲージの皮下用針のオ リフィス中にゆるやかに吸引し次に卵をゆっくり放出することによって、付着し ている放射体細胞を手作業で卵子からはがし取った。このようにして、付着して いる放射帯細胞が、卵子を囲んでいる滑らかな膜の透明帯からはかしてとられた （はがされた卵子は、通常の胎外受精法にしたがって移植または低温保存するた めインキュベートし調整された）。ＢＤＭ中のはがされた放射帯細胞から、細胞 を上記の基準にしたがって選択し、上記１（ａｔ（ｉ、ｎ）に記載したのと同様 に培養して確立（株化）した。

合計３０日間のＥＭ培養の後、細胞は下記実施例２のようにして継代培養を行っ た。

実施例２ この実施例では、長期間の培養でホルモン分泌細胞を維持し増殖させる方法につ いて述べる。

培養物を樹立する初期の３０日間を終ってから（実施例１）、継代培養による選 択法を開始した。小グループの細胞の最初の継代培養物（ＳＣ−１）は手作業で 選択した。細胞の選択は、図２．３および４に示す選択基準にしたがって位相光 学法で行った。丸印をつけた細胞集塊は、ホルモン分泌の可能性が最も高いとし て選択された細胞集塊の種類の代表的なものである。２〜１２個の細胞の小さな 集塊を選択したが、最も多いのは４〜５個の細胞からなる集塊である。一般に、 選択された集塊中の細胞は半直線状に配列されすなわち互いに“真珠の首飾り” 形の配列で隣接している。選択された細胞は、形態がほぼ回転楕円体かまたは卵 形でほぼ均一の大きさと形をもっている。選択された細胞は一般的に滑らかに見 える膜を有し、顆粒細胞質よりも滑らかに見える。

短期間のうちにホルモンの分量を検定したいときは、選択された凝集塊は、ファ ルコン＃３０３７組織培養ウェル中、オイルで覆うことなく、４０ｃｃのＩＶＦ 　）ｌａｍ’ｓ　Ｆ−１０＋０．２５ｇのＢＳＡで構成された培地に、５Ｃ−ｔ と呼ばれ各々５０〜１５０個の細胞の培養物にグループ分けした。各培養物を、 培地５−が入っている個々のウェル中に入れ、培養物は医学用血液ガス混合物を 濯厩しく前記事項参照）、密閉容器に入れ３７°Ｃインキュベーターに入れた。

その培養物はこの培地中に３日間維持し、その後、培地のホルモン含量を検定し た。

あるいは、選択された凝集塊は、５Ｃ−１と呼ばれる、ｌＯ〜１５の細胞からな る小さな出発継代培養物にグループ分けした。

これらのグループは、下記のように処方された規定培地（ＤＭ−１）に入れた。

規定培地１　（ＤＭ−１）：　１００ｒｎＩのＩＶＦ　Ｈａｍ’ｓ　Ｆ　−１０ （上記実施例１参照）を、１００ｒｎｌの栄養Ｈａｍ’ｓ　Ｆ−１２と混合し、 ＨＥＰＥＳと重炭酸ジープで緩衝化し、次にグルタミンを補充しく７．３５ｍＭ グルタミン、Ｓｉｇｍａ社）、および３０ｒｄの組織培養水（Ｓｉｇｍａ社）、 細胞培養で検査した７、２ｇのＢＳＡ（Ｆｒａｃｔｉｏｎ　Ｖ、Ｓ　ｉ　ｇｍａ 社）、１５００［ＵのペニシリンＧおよび１．５■のストレプトマイシンを加え た。その培地は、使用する前に、５％ＣＯを雰囲気下３７℃にて一夜平衡化した 。最終の浸透圧モル濃度は２７２±１　ｍ０５ｍであった。ｐＨは７．６５に調 節した。

得られた培地は、ナルジエンフィルターユニットの０．４５μｍで一回および０ ．２０μｍで一回滅菌濾過を行った。

これらの継代培養物をＤＭ−１中で１４〜１５日間増殖させ、培地は５〜６日毎 に新しくした。この期間中に、細胞の数は一般に約１０〜３０倍に増大した。わ ずか１０〜１５個の出発細胞から確立された５Ｃ−１培養物は、わずか数日間で 放射線免疫検定法で検出可能なホルモンを分泌したことが見出された。約１５日 後、各５Ｃ−１培養物を約４〜６個の第二継代培養物（ＳＣ−２）に分割した。

５Ｃ−２中の細胞は、増殖させ、上記のようにして２０回以上継代培養した。培 地を各継代培養物から規則的な間隔をおいて収集して、分泌されたエストラジオ ール（Ｅ、）　、プロゲステロン、黄体形成ホルモン（ＬＨ）、濾胞刺激ホルモ ン（ＦＳＨ）、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）　、プロラクチン、テストステロ ン、およびヒト絨毛性性腺刺激ホルモンのβ鎖（β−ｈＣＧ）の存在について検 定した。Ｒａｄｉｏａｓｓａｙ　Ｓｙｓｔｅｍｓ　ｉｎ　Ｃ１１ｎｉｃａｌ　Ｅ ｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ。

１９８１年、Ｇ、　Ｅ、　Ａｂｒａｈａｍ編集（Ｂａｓｅｌ　；　Ｍａｒｃｅｌ 　Ｄｅｋｋｅｒ）　４７５〜５２９頁に記載されている定量放射線免疫検定法を 採用した。

プロゲステロン、テストステロン、エストラジオール、プロラクチン、甲状腺刺 激ホルモンおよび黄体形成ホルモンは、Ｃｏａｔ−ａ−Ｃｏｕｎｔ法（Ｄｉａｇ ｎｏｓｔｉｃ　Ｐｒｏｄｕｃｔｓ　Ｃｏｒｐ、、ロスアンゼルス）で検定した。

濾胞刺激ホルモンとβ−ｈＣＧは５ＥＲＯＮＯＭＡＴＡｃｌｏｎｅ法（５ｅｒｏ ｎｏ、イタリア）で検定した。

連続系列継代培養を４ケ月以上行った機種々の培養物からの分泌物の検定結果を 表１に示す。

表１ 結論：この方法を用いて、ヒト濾胞細胞を培養で増殖させ、次いで連続継代培養 に移して増殖とホルモン類の分泌を続けさせた。

一般に、連続継代培養を４ケ月以上行った後、いくつかの細胞培養物は中レベル −高レベルのエストロゲン、プロゲステロンおよびＦＳＨを分泌した。１００■ ／ｒｎｌのテストステロン（Ｓｉｇｍａ社、Ｔ−５６４１）を添加してステロイ ドを産生ずるために必要な基質を与えたところ、これらの継代培養物は、細胞を 最初に培養物に入れたときから１Ｃケ月間もホルモン類を分泌し続けることが見 出された。

実施例３ この実施例ではホルモン分泌性細胞の培養で達成された細胞増殖のレベルを示す 。

細胞計数法：実施例１のように最初の初代培養の接種を行い、次に実施例２のよ うに第一継代培養を行うために、細胞の数を、細胞を選択しているときに倒立相 顕微鏡によって直接計数してめた。接種後、種々の時点で細胞の数を、Ｍａｋｌ ｅｒ　ｃｏｕｎｔｉｎｇｃｈａｍｂｅｒ　（Ｓｅｆｉ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｉｎｓ ｔｒｕｍｅｎｔｓ、イスラエル、ハイファ）で多数の液滴中に含まれている細胞 の数を計数し平均することによってめた。Ｍａｋｌｅｒ　ｃｏｕｎｔｉｎｇ　ｃ ｈａｍｂｅｒは０．Ｏ１ｍ’　Ｘｏ、ＯＬＭ深さのグリッドを備えている。

細胞濃度の代表的試料は、懸濁培養物から直接得たか、または基板からはずした 細胞集団から得た。

試験結果：第一継代培養、５Ｃ−１の最初の６日間で、細胞数は一般に約３倍に 増大した。代表的５Ｃ−１の結果を以下の表２３Ｃ−１の後の部分の間および次 の継代培養中、細胞のｉ殖速度は、一般に約３日間で２倍の速度で増大した。

実施例２の表１に示したのと同様に、細胞は増殖した日日はホルモンを産生した 。

実施例４ この実施例ては、非相同ヒト血清を使って培養して濾胞細胞を確立することにつ いて述べる。

３名の個々の細胞ドナー由来の濾胞細胞は、細胞を、ＥＭの代わりにＤＭ中に直 接入れ、ＤＭ中に７日間維持したことを除いて、実施例１に記載されているのと 同様にして培養で確立した。次いてその細胞を、細胞ドナーの血清の代わりに異 なる個体からの血清を含有するＤＭもしくはＥＭである第二培地に移した。その 血清ドナーは、先に述べたホルモン処方計画で予め治療されていた、ＩＶＦプロ グラムに参加している女性である。ドナー血清“Ａ”についてのホルモンの水準 は、このホルモンによる前治療を受けている女性の正常な範囲内にあったが、一 方ドナー血清“Ｂ”についてのホルモンの水準は“過剰に刺激された（ｈｙｐｅ ｒｓ　ｔ　ｉｍｕ　ｌａ　１ｅｄ）”範囲内にあった。過剰刺激は、規則的なＩ ＭＦホルモン前治療を受けているいくらの患者に未知の理由で起こるが、高レベ ルのエストロゲンと血清巾約１．Ｏｎｇ／ｍｅまてのプロゲステロンの増大によ って示される。その細胞は、２〜３週間、ＤＭ中またはＥＭ中に（非相同血清） 維持し、その後、実施例２に記載されているのと同様にして継代培養を行った。

試験結果：濾胞細胞は培養で確立するのに成功し、表３に示すようにホルモンを 分泌した。

表３ 結論：細胞は非相同血清を含有するＥＭ中で樹立することができる。しかしホル モン分泌のレベルはエストロゲンのレベルによって影響され、また使用した血清 のプロゲステロンのレベルにも影響を受ける。

実施例５ この実施例では、血清を含有していない培養培地でホルモン分泌性細胞を樹立し 、維持し次いで増殖させる方法について述べる。

濾胞細胞を実施例１に記載したのと同様にしてドナーから得た。

この患者の血清には、有意な量の抗***抗体が含有されていた（全ＩｇＧの２０ ％以上が抗***であった）。それ故にこの患者からの卵子の受精を最適化するた めに、ドナー血清は、ＩＶＦ法を行っている間は使用されるどの培地にも入れな かった。

ドナー血清含有培地（ＧＭおよびＥＭ）の代わりにＢＳＡ補充培地（ＥＭ−１） を使用したことを除いて実施例１に記載されているようにして培養し、濾胞細胞 を得て選択し次いで確立した。

ＩＶＦ　Ｈａｍ’ｓ　Ｆ−１０（実施例１参照）　＋　Ｂ　Ｓ　Ａ　（Ｆｒａｃ ｔｉｏｎ　Ｖ、Ｓｉｇｍａ社）で構成されたＥＭ−１を最終濃度０．５％〜１． ０％まで添加した。ＥＭ−１の浸透圧モル濃度は２７３　ｍ０５ｍであった。ｐ Ｈは７．４１であった。

確立された濾胞細胞を、実施例２に記載されているのと同様にして培養して維持 し、継代培養し増殖させた。

試験結果：これらの条件下で、表４に示すように、細胞を増殖させ、ホルモンを 分泌させるのに成功した。表４の結果は７回目もしくは８回目の継代培養（ＳＣ −７と５Ｃ−８）中に得られた。

対照の培養物１００Ｂ−５−ＯＲ−０４はドナー血清を含有する培地（ＥＭ）で 樹立された。一方培養物１００　Ｂ−５−０Ｒ−０１と１００　Ｂ−５−０Ｒ− ０２は血清なしの培地（ＤＭ）で確立された。

表４ 培養物はどれも、検出可能な量のゴナドトロピン、ＦＳＨ。

ＬＨまたはβ−ｈＣＧを分泌しなかった。

結論＝ＤＭ中に最初に確立された細胞は、ＥＭ中に最初に確立された細胞に匹敵 する増殖速度を示す。しかしＤＭ中に確立された細胞は、連続継代培養の７もし くは８回目の後でさえも、基本ステロイドホルモンの産生の減少を示す。それ故 に、ＤＭ中で確立された細胞は、ゴナドトロピンの生物検定法のような、基本ス テロイドの分泌の少ない方が好都合な検定法に用いるのに有利である。

実施例に の実施例では、血清代替物を含有する規定培地（ＤＭＳＳ）中ての細胞の維持と 増殖について述べる。

濾胞細胞を実施例１に記載されているのと同様にして培養で樹立した。次に、こ の細胞は、ＢＳＡの量を規定培養培地（ＤＭ−１）に比べて減少させかつ血清代 替物を加えた（　Ｓｅｒｕ−Ｍａｘ、ロット番号：　１０７−Ｆ−４６０７、Ｓ 　ｉ　ｇｍａ社）ことを除いて実施例２に記載されているのと同様にして継代培 養を行った。Ｓｅｒｕ−Ｍａｘは、特に成分として、ウシ繊維芽細胞成長因子、 マウス表皮増殖因子およびウシインスリンのような成長因子、ならびにエタノー ルアミン、セレン、トランスフェリンおよびヒドロコルチゾンを含有している。

上記ロット番号のＳｅｒｕ−Ｍａｘの分析結果ははＳｉｇｍａ社から入手できる 。この培地配合物ＤＭＳＳはＤＭより一層規定された培地を示すがその理由はＢ ＳＡの一部分が一層規定された補充で置換されているからである（　Ｓｅｒｕ− Ｍａｘ）。ＤＭＳＳの処方は以下のとおりである。

規定培地、血清代替物（ＤＭＳＳ）：ＨＥＰＥＳと重炭酸ナトリウムで緩衝され た１００−のＨａｍ’　ｓ栄養Ｆ−１２に、５ｔｄのＬ−グルタミン補充物（グ ルタミンレベルを合計７．３５　ｍＭまで補充）（Ｓ　ｉ　ｇｍａ社）、１７ｍ １の細胞培養で試験した蒸留水（Ｓｉｇｍａ社）＋０．２５ｇの細胞培養で試験 したＢ　Ｓ　Ａ　（ｆｒａｃｔｉｏｎ　Ｖ、　Ｓｉｇｍａ社）、２．５＋ｎＭの ピルビン酸ナトリウム、１５００１０のペニシリンＧ、１．５■ストレプトマイ シンおよび！０％Ｓｅｒｕ−Ｍａｘ（Ｓｉｇｍａ社）を添加した。ロフト番号１ ０７Ｆ−４６０７のＳｅｒｕ−Ｍａｘの分析結果はＳｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａ ｌ　Ｃｏ、　（米国、ミズーリ州、セントルイス）から入手できる。最終の浸透 圧モル濃度は２７２±ｌ　ｍｏｓｍであった。

ｐＨは７．６５に調節した。最終容積１３６−を、二つの０．２０μｍナルジエ ンフィルターユニットで濾過滅菌した。

試験結果：ＤＭＳＳ中の細胞増殖は、ＤＭ−１内で増殖させた対照の細胞培養物 と同等に進行した。プロラクチンの合成はわずかに増殖したが存意ではなかった （　Ｓｅｒｕ−Ｍａｘに対する応答の０．４％）。プロゲステロンとエストラジ オールの合成レベルは、ＤＭ−１の対照に比べてＤＭＳＳ中で変化しなかった。

それに対して、Ｓｅｒｕ−ＭａＸの代わりに１０％または１５％のウシ胎児血清 （ＦＣＳ）を用いた場合、培養物中のホルモン含量はゼロに近（、かつ細胞の増 殖は存意に遅くなりなった（データは提示していない）。

結論：血清を補充した規定培地を使用することは、ヒトのホルモン分泌細胞の増 殖と維持された分泌の潜在能力について、ＦＣＳを補充した血清を使用するより も有利である。

実施例７ この実施例では***に対して暴露しなかった濾胞細胞の培養での確立、維持およ び増殖について述べる。

濾胞細胞は、卵子を吸出す前に、回収された特定の数の卵子だけを受精させるこ とを決定した患者から実施例１に記載したのと同様にして得た。この場合には、 ***に暴露されなかったことを除いて実施例１に記載されているのと同様に処置 された濾胞細胞を選択することができた。

細胞は、実施例１　（ａ）の場合と同様にＥＭバブル中の疎性細胞から選択した （実施例１（ｂ）と同様に卵子を囲む細胞を回収することは実用的ではなかった 。というのは***に暴露することは放射体の細胞を疎性にするのに恐らく必要だ からである）。この方法で得られた細胞の数は実施例１と比べて少なかったが、 培養には成功した。最初の細胞計数では、ｌバブル当り３個の複合体を有する１ 個のＥＭバブル当りわずかに１２〜２７個の細胞した回収できなかったことが分 かった。このことは、***の懸濁液を添加された複合体（同じ細胞ドナー）の場 合、初代培養について各ＥＭバブルから最初に回収された細胞カ月３１−１９８ 個の細胞であったことと対照的であった。不***暴露培養物は最終的に樹立され たが、充分な細胞培養物を確立するには１．５〜２週間追加する必要があった。

不***暴露培養物は約５週間維持され、その期間中のホルモン分泌状況は***に 暴露された培養物について表１に示したのと同等であった。

実施例８ この実施例では、ゴナドトロピンおよびｃＡＭＰによる刺激に応答してホルモン の分泌を増大する、培養で維持された細胞について述べる。

卵巣濾胞細胞の、系統１００Ｂ−ＯＲ−５Ａ、１００Ｂ５−ＯＲ−Ｂ、オ、ｉヒ １００　Ｂ　５−０Ｒ−Ｄハ、実施例１に記載されているのと同様に培養して確 立し、実施例２に記載しであるのと同様にして維持しかつ継代培養した。これら の系統からそれぞれ１．２および３と呼称する継代培養物を創製し、これらの培 養物を以下に述べる刺激プロトコルに使用した。

（ａ）　ゴナドトロピンによる刺激：ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈ　ＣＧＳＳ ｉｇｍａ社）を７５０　ｎｇ／−の量で培養培地（ＤＭ−１）に添加した。７０ 〜７６時間の後、培地のプロゲステロン含量が対照の約２倍に増大した。エスト ラジオールの合成もｈＣＧで刺激され、３０時間でエストラジオールの含量は対 照の０．４〜０．５倍に増大した。結果を以下の表５に示す。

（ｂｌ　ｃＡＭＰによる刺激：培養物を１ｍＭの８−Ｂｒ−ｃＡＭＰ（Ｓｉｇｍ ａ社）またはＦ　Ｓ　Ｈ（ｌ　ＩＬＩ／ｍＪ　；　Ｍｅｔｒｏｄｉｎ　（尿性卵 胞性刺激ホルモン）、ロット番号：　０７３２１０７０、イタリー、セロノ〕に 暴露した。下記の表６に示すように培養物中のプロゲステロン含量は２４時間に わたるｃＡＭＰによる刺激に応答して５〜１１倍に増大した。４８時間のＦＳＨ による刺激によってプロゲテロンの含量は６．５〜７．７倍に増大するに至った 。

表６ 結論：培養物の濾胞細胞は、その生体外での対応物すなわち顆粒層細胞に匹敵す るしかたでゴナドトロピンによる刺激に応答した。このことは、本発明によって 生体外で増殖させた濾胞細胞が顆粒層細胞の分化された特性を発現し、したがっ てゴナドトロピンの効力と化学的毒性についての生物検定法に有用になる可能性 があることを示している。

実施例９ この実施例ではゴナドトロピンの製剤の効力の検定法について濾胞細胞は、ｈＣ Ｇを含有していない卵巣刺激ホルモンの処方で前治療されたドナーから得た。し たがってその濾胞細胞は、培養のために選択される前には高レベルのゴナドトロ ピンには暴露されておらず高い基本レベルのプロゲステロンを分泌しなかった。

この細胞を実施例１に記載されているようにして培養で確立し、次いで実施例２ と実施例６と同様にして培養が増殖させた。これらの細胞がゴナドトロピンを含 有していない培養培地中に分泌したプロゲステロンの量は、一般に検出できなか ったが、エストラジオールは有意な量が合成された。

生物検定がなされるゴナドトロピン（例えば市販されているＦＳＨ製剤）を細胞 培養物に添加し、約２４．４８および７２時間の暴露期間の後、培養培地中のホ ルモン含量を測定して対照と比較した。この生体外生物検定法でのゴナドトロピ ンの効力を、最初に、高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ；５ｔｏｎｅ、 　Ｂ、Ａ。

らの１９９０年の前記文献）で得たＦＳＨ値と関連づける。続いてこの生物検定 法を使用する際に、ゴナドトロピン製剤の相対効力は、生物検定法の数値とＨＰ ＬＣの数値を比較することによって作成した標準曲線に、生物検定法の数値を当 てはめることによって得られる。

実施例１０ この実施例では、医薬などの化学化合物の潜在的毒性に関する生体外生物検定法 について述べる。

卵巣濾胞細胞を、実施例１に記載されているようにして培養で確立し、実施例２ 記載されているのと同様にして維持し継代培養を行った。継代培養物は、表１に 示したのに匹敵するレベルでプロゲステロンとエストロゲンを分泌した。

医薬の潜在的毒性を評価するために、上記細胞を、被検医薬および非毒性である ことが知られている対照化合物と接触させる。

非毒性化合物と接触させた細胞は基本的なレベルでステロイドホルモンを分泌し 続ける。試験医薬が毒性の場合は、ホルモン分泌のレベルは対照と比較して減少 する。

実施例１１ この実施例では一次小胞由来の細胞を培養で樹立し増殖させる方法について述べ る。

一次卵胞は、卵巣摘出手術を受けていた２名のドナーから得たがこれらのドナー は卵巣刺激ホルモンの処方による前治療を受けていなかった。

一次卵胞は卵巣組織の小片から手作業で単離した。−次卵胞複合体を培養物中に 入れ、ＤＭＳＳと呼ぶ培地中で６週間培養して維持した（実施例６参照）。５週 間培養した後、細胞がエストラジオールと検出可能な量のプロゲステロンを分泌 することがみと実施例１２ この実施例では、栄養膜起源のホルモン分泌細胞を培養して樹立し増殖させる方 法について述べる。

栄養腫細胞は子宮外妊娠のために手術を受けている細胞ドナーから入手した。多 数の栄養腫細胞を実施例１に記載されているのと同様にしてＥＭ中に直接入れ、 さらに実施例２と同様にしてＤＭ中で培養した。第ニゲループの栄養腫細胞を、 血清代替物を含有する別の種類の規定培地（ＤＭＳＳ、先に述べた実施例６に記 載されている処方）中に直接入れ、さらに増殖培地がＤＭＳ　Ｓであることを除 いて実施例２に記載されているのと同様にして培養した。

試験結果：栄養腫細胞は、一般に上記の両方の条件下での培養で増殖するのに成 功した。５Ｃ−３継代培養を６日間行った後、培地を、以下の表８に列挙したホ ルモンについて検定した。

５週間培養を行った後、栄養膜細胞は有意なレベルのβ−ｈＣＧの分泌（すなわ ち４３．９　ｏ＋［Ｕ／１０’細胞／１０ｍ／６日間）を維持した。

実施例１３ この実施例ではゴナドトロピン分泌性下垂体細胞を培養して樹立し、維持し、増 殖させる方法について述べる。

下垂体マクロアデノーマのセグメントを、経蝶形骨下垂体の手術を受けている男 性ドナーから得た。細胞の小集塊を周囲の組織からそぎ落し次いで細い滅菌ガラ ス針を用いて切開し手作業で単離した。これらの小片（直径が約０．５〜１．０ ｍ＋＊）を、ＤＭＳＳが入っている個々のウェル中に入れた（実施例６参照）。

異種の腫瘍領域から選択された細胞を示すいくつもの個々の培養物が生成した。

初代培養を６時間行った後培地を変え、さらに４２時間後、培地試料を採取した （初代培養の合計時間は４８時間：合成時間は４２時間）。表９に示すように、 初期の培養物はすべて、高レベルの黄体形成ホルモンおよび検出可能のレベルの ＦＳＨとプロゲステロンを分泌した。培養物の中の三つは検出可能なレベルのβ −ｈＣＧを分泌した。明らかに、検出可能な量のプロラクチンの分泌はなかった が、このことは、これらの細胞がラクトトロフ（Ｉａｃｔｏｔｒｏｐｈ）成分を もっていないことを示し、純粋なゴナドトロピン統（ｇｏｎａｄｏｔｒｏｐｈ　 ｌｉｎｅａｇｅ）の細胞であることを示唆した。

表９ １５日間培養した後（１０日間は合成時間）も細胞はホルモン類を分泌し続けた 。例えばＤ／Ａマクロ−０５についての値は、ＬＨが１１．３；ＦＳＨが４．０ ４．β−ｈＣＧが５．９　（ｍｉｌｌ／　ｉ）であった。２８日間培養した後（ ８日間は合成時間）、Ｄ／Ａマクロ−０５の培養物は３．０ｍ［Ｕ／−のＬＨを 含有していたが他のホルモン類は検出できなかった。これに対して、図９と１０ に示すように“芽体様（ｂｌａｓｔｅｍａ−１ｉｋｅ）”細胞の集塊を、培養２ ０日目に別の培養物に移したところ比較的多量のホルモンを分泌することか見出 された。例えば二つのこのような“芽体”のグループを一つの培養皿中で混合し たところ８日間にわたって３．０　ｍ［Ｕ／ｍｌのＬＨを分泌した。培養物中の 細胞の数が比較的少ないとすればこれは多量のホルモン分泌を示し、かつ“芽体 ”細胞が初代培養の最も生産的な構成員を示したことを示唆している。

治療上有用な形態のヒトゴナドトロピンを分泌する細胞系を確立する。このゴナ ドトロピンは細胞培養物の周囲の培地から単離し、胎外受精を行うため女性の前 治療に使う医薬組成物を製造するのに使用される。

実施例１４ この実施例では、ヒト子宮内膜細胞を生体外で確立し、維持し、増殖させる方法 について述べる。

子宮内膜細胞は子宮内膜生検を受けている女性のドナーがら得た。

この細胞は実施例１２に記載されているのと同様にして手作業で単離した。細胞 のグループを個々のウェル中に入れ、続いて、培地をＲＩＡで測定した、これら 細胞のホルモン分泌活性に基づいてさらに培養を行うために選択した。選択され た細胞のグループは、実施例１に記載されているのと同様に培養して確立し、次 に実施例２に記載されているように培養して増殖させた。表１０に示すように、 ４ケ月以上培養した後、上記細胞系の中の二つが非常に有意な量のエストロゲン とプロゲステロンを分泌し続けた。

したがってこれらの細胞系は治療用途向けにヒト性ステロイドホルモンを製造す るのに有用である。

表１Ｏ 実施例１５ この実施例ではホルモン分泌細胞の低温保存法について述へる。

濾胞細胞を下記の３種の低温保存培地に入れた。

Ａ）８０％ＤＭＳｓ１１０％ジメチルスルホキシド（ＤＭｓｏ；細胞培養試験済 、Ｓｉｇｍａ社）、１０％グリセリン（Ｓｉｇｍａ　Ｇｒａｄｅ。

Ｓ　ｉ　ｇｍａ社） Ｂ）試験卵黄緩衝剤（Ｔｅｓｔ−ｙｏｌｋ　Ｂｕｆｆｅｒ）　（Ｉｒｖｉｎｅ　 ５ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ。

米国、カリフォルニア州）＋１５％グリセリンＣ）８７．５％ＤＭＳＳ　（２％ ＢＳＡおよび３．４％スクロースを含有）＋１２．４％１．　２−プロパンジオ ール全溶液は滅菌０．２０μｍナルジエンフィルターでゆっくり濾過し次ｉ：５ ％ｃＯ＊１５％Ｏｓ　／９　ｏ％Ｎｔ（医学的ガス混合物）に対して１６〜２４ 時間平衡化した。低温保存剤ＡまたはＢ中の細胞は、約−１″Ｃ／分の速度で一 ３４°Ｃまで下げて凍結され次いで液体窒素下で貯蔵された。

低温保存剤Ｃに対して、細胞は以下の手順にしたがって処理した。

１、　１０ｍ１０ｍ１Ｄ＋２％ＢＳＡ１Ｆｒａｃｔｉｏｎ　Ｖ　（細胞培養試験 済、Ｓｉｇｍａ社）；３Ｘ１０＠の細胞の１２分間のインキュベーション、３７ ℃（３６〜３７℃）の範囲。

２、　１０ｍｔ’ｌ：８．７５ｒｎｌＤＭＳＳ＋２％ＢＳＡ＋１．２４ｍＪ１， ２−プロパンジオール（Ｓｉｇｍａ社）〕の１２２分のインキュベーション、ゆ るかに１分間回転攪拌；３ＸｌＯ’の細胞、室温（＝３５’Ｃ＋ｌ’Ｃ）。

３．１０ｄ（上記溶液Ｂ＋０．３４ｇスクロース（細胞培養試験済、Ｓｉｇｍａ 社）〕の１１２分のインキュベーション、ゆるやかに１分間回転攪拌；３Ｘ１０ ’（７）細胞；室温（＝３５°Ｃ＋ｌ″Ｃ）。

４、　溶液Ｃの１．５ｍｌ当り約１０’個の細胞を三つの低温バイアル（ｃｒｙ ｏｖｉａｌに）に入れる。

５゜　４°Ｃで１０分間冷却する。

Ｐｌａｎｅｒ　Ｃｅ１ｌ　Ｆｒｅｅｚｅｒ　Ｒ２０４に対する冷凍プログラム； 液体／蒸気相窒素（ＰＬＡＮＥＲＰｒｏｄｕｃｔｓ　Ｌｔｄ、）ランプｌニー２ °Ｃ／分で一７°Ｃ±０．５°Ｃまで下げる。

ランプ２ニー７°ＣでＮ、蒸気下１５分間保持する。

ランプ２の開始時に、液体Ｎ！蒸気で予め冷却された鉗子を、冷却バイアル中の メニスカスの頂部に接触させることによって該頂部に接種する（結晶化がはじま る）。

ランプ３ニー０．３°Ｃ／分で一３４°Ｃまで下げる。

ランプ４ニー３４°Ｃで３０分間保持し、次に速やかに低温バイアルをＮ２蒸気 貯蔵低温タンクに移す。

低温保存剤Ｃを用いる冷凍法の融解： 融解溶液： 溶液ａ：ＤＭＳＳ＋２％ＢＳＡ。

溶液ｂ：１．０−の溶液Ａ＋０．６８ｇのスクロース。

溶液ｃ：８．８ｍ／の溶液Ｂ＋１．２ｍｌの１．　２−プロパンジオール。

全溶液を０．２０μｍナルジエンフィルターで滅菌濾過を行った。

下記の融解溶液を１５ｒｎＩフアルコン試験管中に調製した。

溶液ｂ　溶液Ｃ 溶液ＴＩ　０ｒｎＩ＋６ｍｔ’ ７２　２ｍｔ’　＋４ｍｌ’ Ｔ３　３ｍｌ＋　３ｍ１ ７４　４ｍ／　＋２Ｊ Ｔ５　５ｍｌ　＋　ｌ＋ｎＩ Ｔ６　６ｍｊ＋Ｏｍ１ これらの融解溶液をルース／オーブントップ試験管中で医学的ガス混合物に対し て平衡化させた。凍結低温バイアルを３０°Ｃの水浴中で迅速に融解させた。そ のバイアルを開いて、細胞を直ちに、ナンクロンペトリ皿中の６ｒＩＬｌの培地 “Ｔｌ″に移し、ガスを入れた（医学的ガス混合物）密閉ガラス容器中に室温で ８分間入れた。

その細胞を、６ｄのＴＩ温溶液入っている第二ナンクロン（底部）培養皿に移し 、再度ガスを入れてさらに８分間インキュベートした。このステップを各融解溶 液（Ｔ２〜Ｔ６）について繰返した。融解して再び水和した細胞を、ｌＯ〜１５ −のＤＭＳＳ＋１０％Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ　Ｅｎｈａｎｃｉｎｇ　Ｓｕｐｐｌｅ ｍｅｎｔ　（Ｈ６０２０またはＨ８１４２、Ｓ　ｉ　ｇｍａ社）が入っている２ ５ａｎ”ファルコン組織培養フラスコに移した。

低温保存剤ＡまたはＢ中に保存された細胞を、１ケ月後に、凍結バイアルを３６ ℃の湯浴に入れることによって融解させた。融解された細胞は、直ちに、１５− のＤＭＳＳが入っている２５ｃｍ”ファルコン組織培養フラスコに移した。

融解された細胞の８０％が、トリパンブルー色素排除試験法によって生存可能で あることが分かった。１週間培養を行った後、融解された細胞は一般に、それら の起源の培養物と同等の速度で増殖し、そのそれぞれの親培養物のホルモン分泌 特性を保持していた。

実施例１に の実施例では、甲状腺およびすい臓の組織由来のホルモン分泌細胞を培養で確立 するための本発明の方法の使用について述べる。

甲状腺腫瘍の切片を３０歳の女性ドナーから得た。すい臓組織の切片は、すい臓 の損傷のため手術を受けている初老の女性ドナーのすい臓の機業から得た。約５ ０〜３００個の細胞を含有する小塊を組織からはがしとって、実施例１３に記載 されているのと同様にして確立培養培地に入れた。その培養物は、１日おきに、 上記の医学的ガス混合物で溜部した。２週間後に、培養物は小区分に分割して新 しい確立培地に入れた。さらに８週間培養を行った後、細胞は、細胞の増殖速度 によって、必要な場合は小区分に分割した。

初代培養の８週間にわたる合計時間の後（１０日間は合成時間）、甲状腺細胞は 、培地中に、７．３μｇ／ＤＩの濃度（商業的臨床試験室による検定）でチロキ シン（Ｔ４）を蓄積した。このことは、成人の血清の通常の範囲の４〜１２μｇ ／ＤＩに比べてかなりの量のチロキシン分泌を示しており、かつ甲状腺細胞が、 ８週間の培養後に少なくとも一つの分化された甲状腺の機能を実行していたこと を示している。この細胞は検出可能な量のプロゲステロンまたはＬＨを全く分泌 しなかったが、合成の４週間にわたってエストロゲンを２５５　ｐｇ／ｒｄの量 で蓄積した。この細胞は、培養期間を通して濾胞様集塊のままであった。

上記すい臓の細胞は、８週間の初代培養中、１５ｍ１のＤＭＳ　Ｓ中（２５ａｎ ″フアルコンフラスコ）の懸濁液内で増殖した。培地は検定を行うために期間が ６〜８週間経過した培養物（２週間の合成時間）から収集した。すい臓起源の細 胞について予想されるように、これらの細胞は検出可能な量のプロゲステロン、 エストロゲンまたはＬＨを分泌しななかった。アミラーゼとインスリンの濃度は 、５ｉｅｒｒａ　Ｎｅｖａｄａ　Ｌａｂｓ　（米国、ネバダ州、レノ）カ検定し た。培地中のアミラーゼの濃度は非常に低く５Ｕ／ｌであった（ヒト血清につい ての正常な範囲＝３４−１２２Ｕ／ｊ！である）。

このことは、培養物中に外分泌すい臓起源の非常に少数の細胞が存在していたこ とを示した。これに対して、はとんどの培養物の培地は４００　［０／−以上の インスリンを含有していた（絶食個体の正常な範囲＝９．１〜２１．７１０／ｄ ）。このことは培養物がすい臓の内分泌小島起源のβ−細胞を含有していること とその細胞が培地にインスリンを活発に分泌していることを示している。個々の 培養物は、増殖速度と分泌されたインスリンの量にしたがってさらに増殖させる ために選択した。

上記すい臓細胞は、サブクローン化してヒトインスリンを産生じかつ外分泌性す い臓細胞を含有しない培養物を産生ずることができる。

結論二本発明の方法は、多様な用途に有用な細胞培養物を得るために、すい臓の インスリン産生細胞を含めて多種類の細胞に成功裡に適用することができる。

実施例１７ この実施例では、長期培養時のインスリン分泌細胞の維持、および凍結および融 解後の細胞のインスリン分泌性能の維持について述べる。

実施例１６に記載のすい臓細胞培養物をほぼ３〜５日毎に継代させて４７世代を 得た。継代は０．５〜１．Ｏｒｄの細胞懸濁液を、フラスコ中のＩＯ−の新しい 培地内に入れて行った。各フラスコは医学的血液ガス混合物（前記事項参照）で 溜部し、密閉し、次いてインキュベーター中に３７°Ｃで維持した。一般に各フ ラスコは１日おきに新しいガスで溜部した。４７回の継代までに細胞は９．５ケ 月間、連続培養を行った。

４７世代のすい臓細胞の一部分を低温保存剤へを用いて実施例１５に記載した方 法にしたがって凍結した。この細胞は、凍結して一日間貯蔵した後、実施例１５ に記載した方法にしたがって融解させた。

この融解させた細胞と、凍結させなかった４７世代由来の細胞とをＤＭＳＳ培地 に入れて１１０７０ｒｐで５分間遠心分離にかけた。生成したペレットを洗浄し 、３０ｔｘ＆’の培地Ｐ　Ｄ　Ｍ　（ＭｇＳＯａ（ＭｇＣＩ　１は含有していな い）＋２％Ｂ　Ｓ　Ａ　Ｆｒａｃｔｉｏｎ　Ｖを含有しリン酸塩で緩衝されたダ ルベツコの塩溶液、最終の浸透圧モル濃度は２７２　ｍ０５ｍに調節した〕中に ３７℃で再懸濁させた。

その細胞を３７°Ｃで３０分間インキュベートし、次いで先に述べたのと同様に して遠心分離にかけて再懸濁させた。細胞の計数と生存度はトリパンブルー排除 法で測定した。

次にその細胞を、遠心分離にかけ、次いで培地ＰＤＭ　（前記事項参照）の３量 部と前記実施例６に定義されたのと同様のＤＭＳＳの一員部とからなる基礎培地 中に再懸濁させた。その細胞を、下記の表１１に示すように１〜２１ｍＭの範囲 の濃度にてＤ（＋）グルコース中で１．５時間または３時間インキュベートした 。ＲＩＡ分析を行ったところ、表１１に示すように細胞かグルコースに応答して インスリンを分泌したことが分かった。

結論、すい臓細胞は、長期培養中、維持され、その培養期間中、グルコース濃度 の増大に応答してインスリンを分泌する性能か維持された。さらに、凍結され次 いで融解された細胞はグルコースに応答する性能を保持し、その応答は凍結され なかった細胞と同等であった。

実施例１８ この実施例ではヒトすい臓細胞のグルコースに対する応答の時間経過を示す。

実施例１６由来のヒトすい臓細胞培養物を連続培養で５５世代維持した。その時 点で培養は１２ケ月間であった。

試験を行う２時間前に、細胞を１１０７Ｏｒｐで５分間遠心分離し、次に１量部 のＤＭＳＳと６量部のＰＤＭで構成されたグルコースの少ない培地中に再懸させ た。その細胞をグルコースの少ない培地（グルコース不足培地）中、約１．５Ｘ ｌＯ″細胞／−の濃度にて、１Ｏｒｎｉ培養フラスコ内で３７°Ｃで２時間イン キュベートした。

次に細胞を遠心分離にかけ、ｌ置部のＤＭＳＳと６量部のＰＤＭとからなる実験 培地中に再懸濁させた。この実験培地中のグルコース濃度は１．１ｍＭであった 。この培地に、下記表１２に示す濃度のグルコースを添加し、細胞を種々の時間 インキュベートした。

試料を集めて、インスリン含量を検定して表１２に示す。

表　１２ ＭＣＣ０４１２９１１，５００，ＯＯＯ細胞／ｒｄ！　フラスコ中１０ｍ１の培 養物結論：この細胞は、グルコースの増大する濃度に対して段階的投与量応答方 式（ｇｒａｄｅｄ　ｄｏｓｅ−ｒｅｓｐｏｎｓｅ　ｆａｓｈｉｏｎ）で応答し、 １６、５　Ｍのグルコース濃度で最大の応答を行い、その応答は、初代培養にお ける正常なヒトβ細胞から予想される応答と同等である。その最大応答は、イン スリン分泌の基本レベルの約２０倍〜１２８倍の範囲であった。

実施例１９ この実施例では、連続培養中のすい臓細胞がグルコースに応答してインスリンを 分泌する性能を保持していることを示す。

継代世代２１の実施例１６由来のヒトすい臓細胞の一部分を、実施例１７記載の 方法にしたがって凍結し、９．５ケ月後、実験する前に融解させた。継代世代６ ０の細胞を１年間連続培養で１年間維持した。両方のグループの細胞を、実施例 １８に記載されている様にして、実験を行う前２時間グルコースの少なし）状」 こした。得られた培養物を、ＲＰＭＩ−１６４０−Ｙのインキュベーション培地 〔１ＯＯｒｄのグルコース不足ＲＰＭ−１６４０（Ｒ１３８３、Ｓｉｇｍａ社） 、ＩｇのＢＳＡ　Ｆｒａｃｔｉｏｎ　Ｖ、　１．５ｒＲ１のＨＥＰＥＳ溶液、５ ．５１ｄの組織培養水、１５００ＩＵのペニシリンＧＳ１．５■のストレプトマ イシン、ｐＨ７，４〜７．６、最終浸透圧モル濃度は２７２ｍ０５ｍに調節した 〕中、１０’細胞／−／ウェルの濃度で２４ウエルのプレート中に入れた。

その細胞を、図１１に示す各種の濃度のグルコ−中で９０分間または５時間イン キュベートした。

結果：継代２１で凍結された細胞は、１１ｍＭと１６．５　ｍＭのグルコース濃 度に対して最大の応答を示し、５時間インキュベーションの場合、対照と比べて インスリンの分泌は８〜９．５倍に増大した。１年間連続培養で維持された細胞 （継代世代６０）は、５．６．１１および１６．５　ｍＭのグルコースに応答し 、インスリン分泌の増大は対照と比べて３〜４．５倍の範囲内であった（図１１ ）。

実施例２０ この実施例では、長期間培養したすい臓細胞のアミノ酸に対する応答を示す。

継代世代４７のヒトすい臓細胞を、上記実施例！７に記載のようにして実験用に 調製した。その細胞を、６量部のＰＤＭ＋１量部のＤＭＳＳ培地中、１０’細胞 ／−の濃度にて、各種濃度のグルコースとともにインキュベートした。アラニン （１０ｍＭ）またはアルギニン（２０ｍＭ）を添加して細胞を９０分間インキュ ベートし、その時点で試料を採取してインスリン含量を検定した。結果を表１３ に示す。

表１３ グルコースで刺激されるインスリン分泌に対するアミノ酸の作用 結果ニゲルコース濃度が低い場合（１，２および６ｍＭ）、アラニンは、グルコ ースによる刺激だけの場合のレベルを越えてインスリ分泌を増大させた。アラニ ンの作用は２ｍＭグルコースの場合に最も顕著であり、このとき、アラニンはグ ルコースだけの刺激のときの１．２５倍にインスリン分泌を増大させた。アルギ ニンは１ｍＭグルコースの場合に顕著な作用を有し、そのとき、アルギニンはグ ルコースだけの刺激のときの１．４倍にインスリン分泌を増大させた。

実施例２１ この実施例では、長期間培養で維持されたヒトすい臓細胞が免疫反応性インスリ ンを含有していることを示す。

実施例１６由来て継代世代４７のヒトすい臓細胞を一２０°Ｃメタノールで固定 して透過性を上げ、マウントしくｍｏｕｎｔ）、および−次抗体として、Ｐｅｎ １ｎｓｕｌａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、（米国、カリフォルニア州、ベルモ ント）から入手したモルモットに生成させた抗ヒトインスリン抗体を用い、標準 免疫化学法（Ｈａｒｌｏｗら、１９８８年、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　：　Ａ　Ｌ ａｂｏｒａｔｏｒｙ　ＭａｎｕａｌＳＣｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　ＨａｒｂｏｒＬ ａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）によって染色した。二次抗体は、抗モルモットＩｇＧ （全分子）−３ｉｇｍａ社（Ｔ−７１５３）由来のＴＲＩＴＣコンジュゲー）　 （Ｒｂ）であった。−次抗体の代わりに負の対照として、細胞を、合成ヒトイン スリンと共に前インキュベートして抗インスリン抗体を吸収させた同じ一次抗イ ンスリン抗血清とともにインキュベートした。得られた細胞をＨｏｅｃｈｓｔ社 の染料３３２５８で対比染色を行った。免疫染色された細胞は、インスリンに対 するローダミン染料のラベリングを明るくするためにＺｅｉｓｓ　＃　１５フイ ルターを用い、Ｚｅｉｓｓ　Ｉ　Ｍ　３５顕微鏡で観察し写真を撮った。同じ細 胞の視野を、その視野内のすべての細胞の核のＤＮＡのＨｏｅｃｈｓｔ染料によ るラベリングを明るくするためＺｅｊｓｓ　＃　２フイルターを用いて観察し写 真を撮った。細胞核の写真を、ローダミンで標識をつけた細胞の細胞質のカウン ターパート写真と比べて視野中のいくつかの細胞が免疫反応性インスリンを含有 しているかを測定した。

結果：対照はバックグランド染色を全く示さなかった。標識をつけた核の数と、 インスリンに対して免疫反応性の細胞の数とを比較した結果、培養物中の細胞の ６０％以上が、蛍光染色の各種の強度で免疫反応性のインスリンを含有している ことが明らかになった。

工程 ＩＬＬＩ／ｒＵ’ｍ　ＯＯＯ’ＯＯＬ　／　伊（Ｇ／、ｒ＋”／：／：）　ｎ１ ｒｌ（自発）手続補正書（方式） ％式％ １、事件の表示 国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ　９２１０５２６７２　発明の名称 長期培養に維持されたホルモン分泌細胞３、補正をする者 事件との関係　特許出願人 ４、代理人　■１０５ 明細書、請求の範囲及び要約の翻訳文 フロントページの続き （５１）　Ｉｎｔ、　ｃｔ、　５　識別記号　庁内整理番号ＧＯＩＮ　３３／７ ４　７０５５−２ＪＩ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）．ａ）．ホルモン分泌ポテンシャルをもつ非腫瘍類似細胞の集団からホル モン分泌ポテンシャルをもつ少くとも１つの細胞を選択する工程； ｂ）．該細胞を確立している培地に置き、該確立している培地が試験管内で少く とも約１３日間該細胞の生存又は増殖を促進している工程；及び ｃ）．試験管内で少くとも４ケ月該細胞の子孫の生存を維持している工程よりな る試験管内でホルモン分泌細胞を確立する方法。 （２）．該細胞が、（ａ）滑らかな外側膜、（ｂ）近似的に球形及び実質的に卵 形の１つ、（ｃ）非顆粒状細胞質及び（ｄ）約２から約１２細胞の数の細胞凝集 塊の部分で、サイズ及び形が殆んど均質である、ことよりなる群から選ばれた少 くとも２つの特長を持つように、該細胞が選ばれている請求の範囲（１）による 方法。 （３）．該子孫を複数の細胞培養に再分する工程を更に包含している請求の範囲 （１）による方法。 （４）．該選択が顕微鏡を通じて眼の観察により達成され、個々の細胞及び細胞 凝集塊の少くとも１つの吸出しの工程を更に包含している請求の範囲（２）の方 法。 （５）．該方法が遠心しない請求の範囲（１）の方法。 （６）．該方法が実質的に酵素を含まない請求の範囲（５）の方法。 （７）．請求の範囲（１）の方法及び工程（ａ）に先立ち、生体内細胞の該群を 自然にとりまいた生物流体と実質的に同じ化学組成をもつ溶液に、類似細胞の該 集団を含む細胞の群を置き、該溶液内細胞の該群の濃度が該生物流体に生じてい る細胞の濃度以下であること及び工程（ａ）に先立ち、生存細胞の特長をもつ細 胞をえらぶことにより、該溶液における細胞の該群から細胞の該集団を分離し、 該溶液から該細胞を移すこと。 （８）生存細胞の特長をもつ細胞を選ぶ該工程が、（ａ）．滑らかな血漿膜をも つ細胞、 （ｂ）．培養皿の底上に単一層に拡っている細胞及び（ｃ）．血凝塊のない細胞 よりなる群からえらばれた特長をもつ細胞をえらぶことにより達成されている請 求の範囲（７）の方法。 （９）．請求の範囲（１）の該工程（ｂ）が、約２４８ｍＯｓｍから約３００ｍ Ｏｓｍの滲透性をもつ確立している培地に該細胞を置くことにより達成されてい る請求の範囲（１）、（２）、（３）及び（８）のいずれか１つの方法。 （１０）．該工程（ｂ）が、 （ｉ）必須の鉱物、塩、ビタミン、アミノ酸及び脂質を包含する基底培地、 （ｉｉ）緩衝系、 （ｉｉｉ）約６．３５ｍＭから約８．３５ｍＭの量のグルタミン、及び（ｉｖ） ラクテイト及びピルベイトよりなる群から選ばれた少くとも１つのエネルギー源 を更にもつ確立している培地に該細胞を置くことにより達成されている請求の範 囲（９）の方法。 （１１）．該置く工程が、該細胞を、更に培地の全量の約０．５％〜約１５％の 量の血清代用品をもつ確立している培地に置くことにより達成されている請求の 範囲（９）の方法。 （１２）．該置く工程が、該細胞を、更に培地の全量の約５％〜約１５％量の血 清代用品をもつ確立している培地に置くことにより、達成されている請求の範囲 （９）の方法。 （１３）．該置く工程が、該細胞を、人血清をもつ確立している培地に置くこと により達成されている請求の範囲（１１）の方法。 （１４）．請求の範囲（１３）の方法及び該細胞の供与者の血から該血清をえて いる付加工程。 （１５）．該工程（ｂ）が、該細胞を、約０．５％〜約３．０％（Ｗ／Ｖ）の量 の哺乳動物血清蛋白を更に持つ確立している培地に置くことにより、達成されて いる請求の範囲（９）の方法。 （１６）．該置く工程が、該細胞を、牛血清アルブミンをもつ確立している培地 に置くことにより達成されている請求の範囲（１５）の方法。 （１７）．請求の範囲（９）の方法により生成された細胞培養。 （１８）．細胞の該集団が、卵巣、子宮内膜、下垂体、甲状腺及びすい臓よりな る群から選ばれた組織から引出されている請求の範囲（９）の方法により生成し た細胞培養。 （１９）．ａ）少くとも１つの非腫瘍性細胞を、約２４８ｍＯｓｍから約３００ ｍＯｓｍの滲透性をもつ定義された培養培地に置き、該細胞がホルモン分泌ポテ ンシャルを持ち、該細胞が該培地で増殖できて子孫を作り、そして ｂ）試験管内で該細胞の子孫を増殖し、培養で少くとも４ケ月、該定義された培 養培地が、該細胞の子孫のすくなくともあるものの生存を促進している 工程を包含する試験管内でホルモン分泌細胞の長期間維持の方法。 （２０）．請求の範囲（１９）の方法及び工程（ａ）に先立ち、該細胞を、卵巣 、子宮内膜、栄養胚葉、下垂体、甲状腺及びすい臓よりなる群がら選ばれた組織 からえていること。 （２１）．該置く工程が、細胞を該定義された培養培地に置くことにより達成さ れ、エストロゲン、プロゲスチン、濾胞刺激ホルモン、黄体形成ホルモン、人絨 毛膜生殖腺刺激物質、チロキシン、グルカゴン及びインシュリンよりなる群に属 している少くとも１つのホルモンの分泌にポテンシャルをもち、子孫を生じるで あろう請求の範囲（１９）の方法。 （２２）．該工程（ａ）が、該細胞を、（ｉ）必須鉱物、塩、ビタミン、アミノ 酸及び脂質を含んでいる基底培地、 （ｉｉ）緩衝系、 （ｉｉｉ）蛋白及び （ｉｖ）ラクテート及びピルベートよりなる群からえらばれた少くとも１つのエ ネルギー源より更になる培養培地に置くことにより達成されている請求の範囲（ １９）の方法。 （２３）．該培養培地が、培地の全量の約５％〜約１５％の量に血清代用品を含 んでいる請求の範囲（２２）の方法。 （２４）．該置く工程が、該細胞を、約２６９ｍＯｓｍから約２７５ｍＯｓｍの 範囲で滲透性をもつ定義された培養培地に置くことにより達成されている請求の 範囲（１９）の方法。 （２５）．請求の範囲（１９）、（２０）及び（２１）のいずれか１つの方法に より生成された細胞培養。 （２６）．該細胞がすい臓から引出され、該細胞がインシュリンの維持水準を分 泌する請求の範囲（１９）の方法により生成された細胞培養。 （２７）．インシュリンの該維持水準が、定義された培養培地のミリリットル当 たり、１０５細胞あたり、約２ｕＩＵから約１０００ｕＩＵインシュリン／時間 である請求の範囲（１９）による細胞培養。 （２８）．インシュリンの該維持水準が、定義された培養培地のミリリットル当 たり、１０５細胞あたり、約２０ｕＩＵから約４００ｕＩＵ／時間である請求の 範囲（１９）による細胞培養。 （２９）．該増殖工程につづき、該子孫をグルコースの低い培地におき、該細胞 にインシュリンの基底水準を分泌させることを含んでいる請求の範囲（１９）に よる細胞方法。 （３０）．インシュリンの該基底水準が、グルコースの低い培地のミリリットル あたり、１．５百万細胞あたり、約２０ｕＩＵから約２５０ｕＩＵインシュリン ／時間である請求の範囲（２９）により生成した細胞培養。 （３１）．請求の範囲（２６）による方法及び該子孫を置く該工程のあと、該細 胞を約０．５ｍＭから約２２ｍＭグルコースで接触させる。 （３２）．該細胞が該グルコース接触に応答し、インシュリン分泌の基底水準の 約１．２倍から約１３０倍の量で増加したインシュリン分泌を生じ、該基底水準 が、培地ミリリットルあたり、１．５×１００万細胞あたり、約２０ｕＩＵから 約２５０ｕＩＵインシュリンの範囲にある請求の範囲（３１）により生成した細 胞培養。 （３３）．該応答が、約３０分から約２４時間を含んでいる期間をこえて生じて いる請求の範囲（３２）による細胞培養。 （３４）．請求の範囲（２９）による方法及び該子孫を置く該工程のあと、該子 孫を約２ｍＭから約９ｍＭグルコースと接触すること。 （３５）．該細胞が、該グルコース接触に応答して、インシュリン分泌の該基底 水準の約１．５倍から約１０倍の範囲の量で該インシュリン分泌に増加を生じる 請求の範囲（３４）の方法により生成した細胞培養。 （３６）．該置く工程につづき、該細胞を１ｍＭから６ｍＭグルコースと接触し 、それにより該細胞にインシュリンの中間水準を分泌させ、そして該細胞をアミ ノ酸と接触させることよりなる請求の範囲（２９）による方法。 （３７）．該細胞が、該アミノ酸接触に応答し、インシュリン分泌の該中間水準 の約１．３から約２．０倍の範囲でインシュリン分泌の増加を生じる請求の範囲 （３６）により生じた細胞培養。 （３８）．該アミノ酸が、アラニン及びアルギニンの少くとも１つである請求の 範囲（３７）による細胞培養。 （３９）．該アミノ酸が、約１０ｍＭの濃度のアラニンよりなる請求の範囲（３ ８）による細胞培養。 （４０）．該アミノ酸が約２０ｍＭの濃度のアルギニンよりなる請求の範囲（３ ８）による細胞培養。 （４１）．ａ）培地に、少くとも１つの卵巣濾胞を置き、該濾胞が、卵に粘着し ている放射帯細胞及び卵よりなり；ｂ）おだやかに、該放射帯細胞を該卵から放 し、そしてｃ）おだやかに、該放射帯細胞を該卵からはがす工程よりなる生存で きる濾胞細胞をえる方法。 （４２）．工程（ｂ）が、該濾胞を***と接触することによりえられている請求 の範囲（４１）の方法。 （４３）．工程（ｃ）が、該培地から吸出し、そして該卵から放射帯細胞の分離 が達成されるまで、該培地に該濾胞を排出することにより達成されている請求の 範囲（４１）の方法。 （４４）．更に該細胞を確立している培地に置くことを含む請求の範囲（４１） の方法。 （４５）．更に、該細胞を、約２４８から約３００ｍＯｓ皿の滲透性をもつ定義 された培養培地に置き、該細胞の子孫を増すことよりなる請求の範囲（４４）の 方法。 （４６）．ａ）少くとも１つの非腫瘍細胞を試験管内で、定義された培養培地に 置き、該細胞は試験管内で増殖できて子孫を作り、ｂ）試験管で、少くとも４ケ 月該細胞の子孫を増殖し、該培養培地は該細胞の子孫の生存を促進でき、該子孫 は該培地にホルモンの量を分泌し、そして ｃ）ホルモンの該量の少くとも１部を単離する工程よりなるホルモンをえる方法 。 （４７）．請求の範囲（４６）の方法及び該子孫を、該ホルモンの該分泌を刺激 するようにえらばれた分泌促進剤と接触させる更なる工程。 （４８）．該接触が、該細胞を、濾胞刺激ホルモン、黄体ホルモン、絨毛膜生殖 腺刺激物質、Ｋイオン、グルカゴン様ペプチド−１、グルコース、ＣＡＭＰ及び ＣＡＭＰの化学類縁物よりなる群がらえらばれた分泌促進剤と接触することによ り達成されている請求の範囲（４７）の方法。 （４９）．請求の範囲（４６）の方法及び工程（ａ）に先立って、細胞供与者に ホルモン及びホルモン類縁薬の少くとも１つを投与することにより、該細胞を試 験管内で前処置すること。 （５０）．該前処置工程が、雌供与体を前処置することにより達成されている請 求の範囲（４９）による方法。 （５１）．該ホルモンが、濾胞刺激ホルモン、黄体形成ホルモン、絨毛膜生殖腺 刺激物質及び生殖腺刺激物質放出ホルモンよりなる群からえらばれている請求の 範囲（４９）の方法。 （５２）．該工程（ａ）が、***前期の濾胞からえられた顆粒膜細胞を、該定義 された培養培地に置くことにより達成されている請求の範囲（５１）の方法。 （５３）．ａ）既知の生殖腺刺激物質の特定の量による接触への応答で、特定の ステロイドホルモンの既知量を分泌する確立された細胞ラインを提供し、該既知 の生殖腺刺激物質が、既知の生物効果をもち、 ｂ）該細胞ラインの細胞を、該未知の生殖腺刺激物質と接触させ、 ｃ）該細胞をとりまく培地に分泌された該ステロイドホルモン量を決定し、そし て ｄ）該量を該既知量と比較して、該未知生殖腺刺激物質の生物効果 を決定する工程よりなる未知生殖腺刺激物質の検定法。 （５４）．該工程（ａ）が、該確立された細胞ラインとして、卵巣濾胞細胞を使 用することにより達成されている請求の範囲（５３）の方法。 （５５）．工程（ａ）が、人卵巣濾胞細胞を使用することにより達成されている 請求の範囲（５３）の方法。 （５６）．該工程（ａ）が、プロゲステロンの既知量を分泌している細胞ライン を与えることにより達成されている請求の範囲（５３）の方法。 （５７）．該工程（ａ）が、エストロゲンの既知量を分泌している細胞ラインを 与えることにより達成されている請求の範囲（５３）の方法。 （５８）．ａ）．既知の毒素に特長的に応答を示す細胞をもつ確立された細胞ラ インを与え、該応答が該細胞ラインの該細胞のホルモン分泌像における既知の変 化であり、ｂ）．該細胞を該テスト化合物と接触させ、ｃ）．工程（ｂ）のあと 、該細胞のホルモン分泌像を決定し、ｄ）．工程（ｂ）のあと、該細胞のホルモ ン分泌像を、ホルモン分泌像における該既知変化と比較し、該テスト化合物の比 較毒性を決定する 工程よりなるテスト化合物の毒性決定法。 （５９）．ホルモン分泌細胞及び確立している培地よりなる細胞培養であって、 該確立している培地が； ａ）必須鉱物、塩、ビタミン、アミノ酸及び脂質をもつ基底の培地、 ｂ）緩衝系 ｃ）約２４８ｍＯｓｍから約３００ｍＯｓｍの滲透性よりなり、該培養がＣＯ２ ５％、Ｏ２５％及びＮ２９０％よりなる医療ガス混合物で供給されていることを 特徴とする細胞培養。 （６０）．該培地が、更にラクテート及びピルベートよりなる群から選ばれた少 くとも１つのエネルギー源を含んでいる請求の範囲（５９）の細胞培養。 （６１）．該培地が更に、培地の全量の約０．５％から約１５％の量で血清を含 んでいる請求の範囲（５９）の細胞培養。 （６２）．該血清が、人血清及び定義された血清補充物の少くとも１つを含んで いる請求の範囲（６１）の細胞培養。 （６３）．該定義された培地が蛋白を含んでいる請求の範囲（５９）で定義され た細胞培養。 （６４）．該培地が更にラクテート及びピルベートよりなる群から選ばれた少く とも１つのエネルギー源を含んでいる請求の範囲（６３）の細胞培養。 （６５）．該滲透性が約２６９ｍＯｓｍから約２７５ｍＯｓｍである請求の範囲 （６３）の細胞培養。 （６６）．該分泌されたホルモンが、エストロゲン、プロゲスチン、濾胞刺激ホ ルモン、黄体形成ホルモン、人絨毛膜生殖腺刺激物質、チロキシン及びインシュ リンよりなる群から選ばれている請求の範囲（５９）の細胞培養。 （６７）．該分泌されたホルモンが、エストロゲン、プロゲスチン、濾胞刺激ホ ルモン、黄体形成ホルモン、人絨毛膜生殖腺刺激物質、チロキシン及びインシュ リンよりなる群から選ばれている請求の範囲（６３）の細胞培養。 （６８）．ａ）．該ホルモン分泌ポテンシャルをもつ類似の細胞の集団から、人 濾胞刺激ホルモン、人黄体形成ホルモン、人グルカゴン又は人インシュリン分泌 ポテンシャルをもつ少くとも１つの細胞を選ぶこと、 ｂ）．該細胞を、確立している培地に置くこと、該確立している培地が、試験管 内で少くとも約１３日該細胞の生存を促進すること、 ｃ）．試験管内で該細胞の子孫を増殖すること、及びｄ）．試験管内で該細胞の 該子孫の生存を維持し、少くともある子孫が、工程ｂ）の発生から少くとも１年 後試験管内で生存できること、 の工程よりなる試験管内でホルモン分泌細胞を確立する方法。 （６９）．細胞の該集団が、非腫瘍組織からえられている請求の範囲（６８）の 方法により生じた細胞培養。 （７０）．ａ）約２４８ｍＯｓｍから約３００ｍＯＳｍの滲透性をもつ定義され た培養培地に少くとも１つの細胞を置くこと、該細胞が人濾胞刺激ホルモン、人 黄体形成ホルモン、人グルカゴン又は人インシュリン分泌ポテンシャルをもつこ とそして該細胞が該培地で増殖できて子孫を作ること、及びｂ）試験管内で該細 胞の子孫を増殖すること、該定義された培養培地が該細胞の子孫の少くともある ものの生存を促進できるので、該子孫の少くともあるものが、工程ａ）の発生か ら少くとも１年後、試験管内で生存できることの工程よりなる試験管でホルモン 分泌細胞の長期間維持の方法。 （７１）．該置く工程が、細胞を該定義された培養培地に置くことにより行はれ 、インシュリンの分泌にポテンシャルをもつ子孫を生じる請求の範囲（７０）の 方法。 （７２）．該細胞が非腫瘍組織からえられている請求の範囲（７０）の方法によ り生じた細胞培養。 （７３）．ａ）試験管内で少くとも１つの非腫瘍細胞を定義された培養培地に置 くこと、該細胞はホルモン分泌ポテンシャルをもち、試験管内で増殖できて子孫 を作ること、ｂ）試験管内で、該細胞の子孫を、工程ａ）の発生から１年以上増 殖すること、該培養培地は該細胞の子孫の生存を促進できること、該子孫が該培 地にホルモンの量を分泌すること、そして ｃ）ホルモンの該量の少くとも１部を単離することの工程よりなるホルモンをえ る方法。 （７４）．請求の範囲（７３）の方法及び該細胞子孫を、該ホルモンの該分泌を 刺激するため選ばれた分泌促進剤と接触することの更なる工程。 （７５）．該接触が、該細胞を、濾胞刺激ホルモン、黄体形成ホルモン、絨毛膜 生殖腺刺激物質、Ｋイオン、グルカゴン様ペプチド−１、グルコース、ｃＡＭＰ 及びｃＡＭＰの化学類縁物よりなる群から選ばれた分泌促進剤と接触することに より行はれている請求の範囲（７４）の方法。 （７６）．該ホルモンが、エストロゲン、プロゲスチン、濾胞刺激ホルモン、黄 体形成ホルモン、人絨毛膜生殖腺刺激物質、チロキシン、グルカゴン及びインシ ュリンよりなる群から選ばれている請求の範囲（７３）の方法。 （７７）．ａ）試験管で１年以上増殖されており、既知の毒素に特長づけられた 応答を示す細胞をもつ確立された人細胞ラインを提供し、該応答が該細胞ライン の該細胞のホルモン分泌像で既知の変化であること、 ｂ）該細胞を該テスト化合物と接触させること、ｃ）工程ｂ）後、該細胞のホル モン分泌像を決定すること及び ｄ）工程ｂ）後の該細胞のホルモン分泌像を、ホルモン分泌像において該既知変 化と比較し、該テスト化合物の比較毒性を決定すること の工程よりなるテスト化合物の毒性決定法。