JPH06504846A - ワンステップ側方流非吸収性アッセイ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ワンステ・・ブ　′　ア°°セイ 皮皿亘立互 本発明は免疫学的およびそれに関連するアッセイ法および装置に関し、特にサン ドイッチアッセイまたは競合アッセイを用いて生物学的試料を試験するためのア ッセイ法および装置に関する。

１１曵狡歪 特異的結合アッセイ、特にイムノアッセイの種々の形態に関する文献は広範囲で あり、市販商品は多数ある。多数の簡単で便利なパックされたアッセイが現在市 販されており、これら多数の商品の特許防衛が要求されてきた。

側方流プロトコールを用いて行われるアッセイが本明細書の発明に関して特に興 味深い点である。本明細書に参照として援用した１９９０年７月２４日に発行さ れた米国特許第４．９４３．５２２号は、そのような装置および方法を述べた引 例を記載している。本特許はそれ自身が装置の１部分から他の部分へと液体を導 くための非吸収性支持体に依存する側方流装置を示す。本発明は、非吸収性側方 流が可視部分、特に標識された粒子、例えば、染色されたラテックス、赤血球細 胞または分析目的物またはそれに対する競合物と反応し得るリポソームなどを、 ブロッキング剤で処理することにより非吸収性にした吸収性支持体を用いて、検 出のための捕捉ゾーン中に導くために用いられる方法および装置における改良を 、提示する。得られた結果は、非常に短い時間内（典型的には６０秒以内）に行 われ得るワンステップアッセイであり、ここで、導き出されたものは通常は捕捉 ゾーンに接触する試料において即時に利用可能である。

側方流アッセイの他の開示もまた、見られた。例えば、１９８９年８月２ｇ日に 発行された米国特許第４，８６１．７１１号には、分析目的物の検出に必要なす べての成分が単一のシートに埋め込まれた側方流アッセイが開示されている。側 方流は、クロマトグラフィ一様の動態を意味する。１９８９年３月１５日公開の 欧州特許出願第３０６，７７２号には、試料を付与するためのゾーンと、分析目 的物または標識特異的結合物質を結合し得る固定試薬を有する反応ゾーンとが分 離した、クロマトグラフ用媒体を含む側方流装置が記載されている。１９８８年 １１月９日に公開され、Ｕｎｉ　１ｅｖｅｒに譲渡された英国特許出願第２．２ ０４．３９８号には、装置中に付与された試料が標識された試薬を捕捉しくｐｉ ｃｋｓ　ｕｐ）、検出ゾーン内に浸透する側方流装置が記載されている。標識と しては金ゾルおよび着色粒子を包含する。米国特許第４．１６８、１４６号には 試験細片を通した側方流が記載されている；分析目的物の存在は、適切な発色指 示薬の添加により測定される。

１９８８年７月２７日に公開され、Ｓｙｍｂｉｏｔｉｃｓ　Ｃｏｒｐ、に譲渡さ れた欧州特許出願第２７６、１５２号には、２つの別の平面上で操作する吸収性 マトリックス側方流装置が記載されている。ＴｈｙｒｏｉｄＤｉａｇｎｏｓｔｉ ｃｓ　Ｉｎｃ、にすべて譲渡された米国特許第４．０９４．６４７号；第４．２ ３５．６０１号、および第４．３６１．５３７号には、展開流体中に置いたとき 試薬への結合および検出のための一連のゾーンを通して試料を移動させる、クロ マトグラフ用細片が記載されている。５ｙｎｔｅｘに譲渡された米国特許第４． ８５７．４５３号には、装置に不可欠の破壊可能な容器内に試薬が供給される装 置が記載されている。

Ｊａｎｓｓｅｎに譲渡された欧州特許第１５８．７４６号および米国特許第４． ７７５．６３６号には、特異的結合アッセイのための可視検出標識としての金属 ゾルの使用が記載されている。

Ｂｅｃｔｏｎ　Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎに譲渡された米国特許第４．７０３．０１７ 号には、分析目的物および／または可視トレーサーのための結合剤が固相支持体 の所定の領域に吸着または共有結合によって付与される試験細片装置が記載され ている。基質の１つまたはそれ以上の試験領域に結合剤を付与した後、試験基質 の残った結合能力を、アッセイに用いられる物質に特異的に結合しない１つまた はそれ以上の型のタンパク質で処理することによって飽和またはブロックする。

トレーサーは、アッセイ条件下で結合剤または結合剤に結合した分析目的物に結 合したときに、それ以上処理することなく支持体上で目視し得る。試験細片は分 析目的物を含む（または含むと思われる）試料と接触させるかまたはともにイン キュベートし；試料細片は複数の試験領域で提供され得る。Ｂｅｃｔｏｎ　Ｄｉ ｃｋｉｎｓｏｎに譲渡された米国特許第４．８５５．２４０号にはまた、米国特 許第４．７０３．０１７号に記載されたような試料およびトレーサーが平面的な 側方流装置上の異なる位置に付与されるアッセイが記載されている。

最初に言及した米国特許第４．９４３．５２２号以外は、これまで議論したすべ ての側方流法は吸収性支持体を用いている。支持体の吸収性の性質によりアッセ イの時間が延長され、５分またはそれ以上後でなければ結果が得られない。結果 の直接利用可能性の利点は、マトリックスのすべての領域において吸収性支持体 を非吸収性に変換すること、および装置全体の設計および小型化の結果として得 られた本発明の方法および装置によって与えられる。

光肌二皿丞 本発明は、生物学的試料中の分析目的物の存在または欠如を評価するための迅速 かつ正確な方法、およびこれらの方法を行うための装置を提供する。

従って、１つの局面では、本発明は生物学的試料中の分析目的物の存在または欠 如を測定するためのアッセイ装置を示す。

ここで、本装置は、標識ゾーンと接触して試料の非吸収性側方流を行い得る固相 支持体を含有する、試料受取ゾーンを含む。この標識ゾーンは、非吸収性側方流 を行い得、そして分析目的物と反応し得る特異的結合相手かまたは捕捉試薬と結 合するために分析目的物と競合するリガンドのいずれかに結合した可視部分を含 み得る。この標識ゾーンはその次に、非吸収性側方流中で捕捉ゾーンと接触する 。この捕捉ゾーンはまた、非吸収性側方流を行い得、そして分析目的物が結合し ているかまたは競合物に結合している可視部分の特異的結合相手を含み得る。こ れらのゾーンは、同一の固相支持体上または隣接する別の支持体またはマトリッ クス上に存在し得る。

３つのゾーンは非吸収性側方流中で、それらどうしの間に側方非吸収性液体流を 可能にするという意味で接触する。標識ゾーンおよび捕捉ゾーンはまた、それら のゾーン自身を通して非吸収性側方流によって液体を流す。捕捉ゾーンは、液体 を吸収する手段および３つのゾーンすべてを通して流れた粒子と隣接する。試料 受取ゾーンはさらに、非吸収性側方流を妨害することなく物理的な捕捉によって 残骸または妨害物質を試料から除去するために役立ち得る。

他の局面では、本発明は、分析目的物を含むまたは含むと思われる試料を本発明 の装置の試料受取ゾーンに付与することを包含するワンステップアッセイを行う 方法を示す。さらに他の局面では、本発明は本発明の装置を調製する方法、およ び吸収性マトリックスをブロッキング剤で処理することによって得られる改良さ れた非吸収性マトリックスを示す。

【ｉ些１垂星説亙 （図面のより詳細な説明は以下の実施例の節に示す）図１は、本発明の装置の側 方流の１つの実施態様の組み立てにおけるステップを示す◎ 図２は、ケース中に側方流板を設置した発明の装置の組み立てを示す。

日を　るための 本発明は、流体の非吸収性側方流を行う支持体上で行われるアッセイにおける改 良に関する。上記引例米国特許第４，９４３、５５２号において定義されたよう に、「非吸収性（ｎｏｎｂｉｂｕｌｏｕＳ）Ｊ側方流は、その中で溶解または分 散した液体の成分のすべてが非永久的に捕捉または「ろ過により除かれ（ｆｉｌ ｔｅｒｅｄｏｕｔ）Ｊ、実質的に等しい速さで、そして膜または支持体を通して 側面を流れる相対的に弱められていない流れで行われる、液体流を意味する。こ のことは、例えば１つまたはそれ以上の成分を、クロマトグラフ分離で起こるよ うに吸収（ａｂｓｏｒｂｉｎｇ）または「吸収（ｉｍｂｉｂｉｎｇ）Ｊ　Ｌ、得 る物質において起こり得る、１つまたはそれ以上の成分の選択的な保持とは区別 される。「吸収性（Ｂｉｂｕｌｏｕｓ）Ｊ物質としては、ニトロセルロースなど の、それらを通過する液体に含まれる成分にクロマトグラフ分離をもたらす未処 理の紙を包含する。

吸収性物質は、しかしながら、ブロッキング剤、特に相互作用力を弱めて支持体 の吸収性の性質を本質的に不能にするある種の界面活性剤およびタンパク質を付 与することによって、非吸収性側方流を示す物質に変換され得る。従って、非吸 収性物質は、多孔性ポリエチレンシートまたは他の不活性物質などの非吸収性流 を内因的に行い得る物質を包含するか、または吸収性物質をブロックした物質を 包含し得る。好ましいブロッキング剤としては、ウシ血清アルブミンの本質また はメチル化またはスクシニル化型のいずれか、ウマ血清またはウシ胎児血清など の全動物血清、および他の血液タンパク質が挙げられる。他のタンパク性ブロッ キング剤としてはカゼインおよび脱脂乾燥乳が包含される。

界面活性剤ペースのブロッキング剤もまた、用いられ得る。

適切な界面活性剤の型は、非イオン性、カチオン性、アニオン性および両イオン 性型から選択され、その選択はブロックされる膜の性質に基づく。適切な界面活 性剤プロ・ノキング剤の選択を決定する研究は、当該分野で公知である。界面活 性剤はタンパク質ベースのブロッキング剤と組み合わせて用いることが好ましい 。単独でまたはタンパク性ブロッキング剤との混合物中でのいずれでも用いられ 得る適切な界面活性剤は、ポリオキシエチレンソルビタンアルコール界面活性剤 （例えば、一連のツイーン）、Ｎｏｎ１ｄｅｔ　Ｐ−４０などのポリオキシエチ レンアルコール類またはＴｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００などのポリオキシエチレンエ ーテル類を包含する。ブロッキング剤およびブロッキング組成物の処方物の選択 は重要である。なぜならブロッキングは非吸収性流をもたらすために十分でなけ ればならず、しかし修飾された表面が分析目的物−標職一捕捉の相互作用を妨害 してはならないからである。

本発明の基礎をなす１つの改良は、本発明のアツセイ装置または一般的に非吸収 性側方流を利用するアツセイ装置における、膜または他の支持体の吸収性の特性 を非吸収性の膜または支持体へ変換することによって形成される、マトリックス または支持体の使用である。このことはブロッキング溶液を付与することによっ てなし遂げられる。Ｐｏｒｅｘ　ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓＣｏｒｐｏｒａｔｉ ｏｎによって製造されるポリエチレンシート材（上記で引用された米国特許第４ ．９４３．５２２号に記載されている）のような内因性の非吸収性支持体が側方 流アッセイに用いられ得る一方で、変換された微細孔型非吸収性支持体の使用は 好まれ、そして捕捉結合試薬のより効果的な固定、および結果として得られる感 受性の増大、側方流の改良、および検出速度の促進などのいくつかの利点を有す る。

紙またはニトロセルドースなどの吸収性支持体を非吸収性側方流を行い得る支持 体に変換するために、もとの支持体は表面の望ましくない反応性を処理するため に有効な濃度のブロッキング剤溶液で処理される。一般的には、この処理は１− ２０ｍｇ／ｍｌのタンパク質のタンパク質溶液などのブロッキング溶液を用いて およそ室温で数分から数時間行われる。得られた被覆物質は、次に風乾、凍結乾 燥、または他の乾燥方法によって表面に永久的に吸着される。

本発明のアッセイ装置におけるさらなる改良は、アッセイの設計それ自身にある 。本発明のアッセイ装置は、その中の少なくとも３つが非吸収性側方流を行う、 ４つの異なるゾーンを包含する。この装置は、分析目的物を含む試料が試料受取 ゾーンに付与され、そして次に標識ゾーンを通して捕捉ゾーンに流入するように 設計されている。捕捉ゾーンは次には過剰の液体試料を除去する手段と接触する 。一般的に、この手段はろ紙またはグラスファイバーフィルターなどの、一般的 に吸収性の性質がある吸収剤からなる。

担体多孔性物質およびその処理の選択は、本アッセイ装置においてそれぞれのゾ ーンが果たす特異的な機能を考慮して行われる。

試料受取ゾーンは、分析目的物含有試料の流れを単に開始させる用をなし、そし てこの目的のために分析目的物の保持が低い物質で構成されるべきである。この 特性を与えるための１つの手段は、試料受取ゾーンを中性のタンパク性ブロッキ ング剤で飽和し、次にブロッキング剤を固定する処理（例えば、凍結乾燥）を行 うことである。この処理の他の利点は、ぬれ性およびウィッキング作用を向上し て、試料の標識ゾーン内への移動を迅速化することである。試料受取ゾーンはま た、試料中に存在するいずれの望ましくない粒子をも捕捉する機械的なフィルタ ーとして機能し得る。

標識ゾーンは、捕捉ゾーンに蓄積すれば検出され得る可視部分を含む。可視部分 は、十分な量が存在すれば目視可能な単に染料または染料ポリマーであるかまた はあり得、そして染色ラテックスビーズ、リポソーム、または金属性、有機性、 無機性または染料ゾル、染色または着色細胞または生物体、赤血球などの粒子で あることが好まれる。リポソーム中に種々の染料を含むための手段は公知であり 、例えば、米国特許第４．６９５．５５４号に開示されており、下記実施例で用 いられる。

本アッセイで用いる可視部分は、生成物の性質および量を検出する手段を提供し 、そしてそれゆえ捕捉ゾーンにおけるそれらの出現は試料中の分析目的物の関数 でなければならない。一般的に、このことは、分析目的物に特異的に結合するか または捕捉ゾーン中の捕捉剤に対して分析目的物と競合するりガントへの、可視 部分の結合によって提供され得る。第１の取り組みでは、可視部分は分析目的物 に特異的に結合する特異的結合相手と結合する。例えば、分析目的物が抗原であ るとき、この抗原に特異的な抗体が用いられ得；　Ｆ（ａｂ’　）２、Ｆａｂま たはＦａｂ’などの抗体の免疫学的反応性フラグメントもまた、用いられ得る。

これらの可視部分、または［試験（ｔｅｓｔ）Ｊ可視部分は、次に試料が液流に よって標識ゾーンを通過して捕捉ゾーン内に搬入されるときに、試料中の分析目 的物に結合する。複合体が捕捉ゾーンに到達すると、分析目的物に特異的な、例 えば上記に示した抗体またはそのフラグメントのような捕捉剤は、分析目的物が 結合しているそれらの結合共役物を保持し、そして分析目的物を含まない結合共 役物を吸収性のゾーン内に通過させる。第２の取り組みでは、可視部分は捕捉ゾ ーン中の捕捉剤に対して分析目的物と競合するリガンド、最も典型的には、他の 分析目的物質自身の分子、に結合する。試料から得られた分析目的物および可視 部分と結合する競合物の両方は、次いで捕捉ゾーン内に搬入される。

分析目的物およびその競合物はどちらも次に、捕捉剤と反応する。この捕捉剤は またこの場合も分析目的物（およびその競合物）と典型的に特異的反応性である 。標識されていない分析目的物は従って捕捉ゾーンに保持される競合物−共役可 視部分の量を低減させ得る。可視部分の保持におけるこの低減は試料中の分析目 的物の測定基準となる。

標識ゾーンはまた、「対照」可視部分を含み得る。これは、特異的結合剤または 分析目的物の競合物を含有せず、そしてこれはまた液体流によって捕捉ゾーンの 対照領域に搬入される。これらの対照可視部分は、対照試薬に特異的な捕捉相手 と結合する対照試薬と結合し、そして次に捕捉ゾーンの別の「対照」部分に捕捉 して液体の流が予想された通りであることを確認し得る。対照で用いる可視部分 は、試験部分に用いるものと同じかまたは異なる色であり得る。異なる色が用い られるときは、結果の読み取り易さは増強される。

上記のすべてにおいて、標識ゾーンで着色された部分と共に選択されたブロッキ ング剤を使用すること、次にブロッキング剤または支持体を固定（例えば、凍結 乾燥によって）することは、本装置の改良された性能に対して最も重要である。

可視部分、特に粒子が風乾において凝集し、液体試料と接触したとき容易に再水 和しないことは、公知である。それゆえ、非吸収性表面への変換がなければ、可 視部分は試料と共に捕捉ゾーンに移送される代わりに、標識ゾーンに捕捉された まま残り得る。

可視部分で標識された分析目的物または標識された競合物が捕捉ゾーンを通過す るとき、標識された分析目的物または競合物は、そこに付与された特異的な試薬 の相互作用を介して、捕捉ゾーンの膜の少なくとも１部分「試験（ｔｅｓｔ）部 分」に結合される。この特異的な試薬は、分析目的物または試験可視部分に結合 した競合物と直接反応する。対照可視部分が用いられれば、試験可視部分が結合 する領域とは別の捕捉ゾーン内の領域において、その供給はそれらの捕捉に役に 立つ。

好ましくはそれらの「試験」相対物とは異なる色の対照可視部分は、分析目的物 または試験捕捉剤には特異的ではないが、対照バンドを表す捕捉ゾーン内の捕捉 領域中の物質には特異的な、対照結合剤によって提供される。このように、それ らは別の「対照」部分において直接検出される。例えば、下記で示される手順に おいて、標識対照ビーズはストレプトアビジンを含み、そして捕捉ゾーン内のそ れらの対照バンド部分はアビジンと特異的に結合するビオチンを含む。他の「無 関係な（ｆｒｒｅｌｅｖａｎｔ）　Ｊ結合対にはまた、分析目的物に関連しない 抗原／抗体反応なども、用いられ得る。

実験結果は、捕捉ゾーンにおいて試験可視部分のための捕捉ゾーンの場所上の可 視シグナルの存在または欠如に注目することによって読み取られる。対照領域の 使用は対照領域における色の出現が、負の結果に対してさえも、試験結果を読み 取り得る時の信号となるので、有用である。従って、予想された色が対照領域に 出現すれば、試験領域における色の存在または欠如が示され得る。試験および対 照領域に対する異なる色の使用は、この目的を促進する。

本質的には吸収性であるが非吸収性の流れ特性に変換し得るマトリックスの使用 は、この捕捉ゾーンの創作において特に有用である。捕捉試薬は、ブロッキング 剤を付与する前にマトリックスに付与され、その場所に固定され得、吸収性支持 体に捕捉試薬を付加するために頻繁に要求される活性化処理の必要性を回避し得 る。この工程では、捕捉試薬を結合する間のマトリックスの吸収性の性質は有利 であり得る。しかしながら、吸収性の膜を非吸収性の支持体に変換するブロック ／洗浄処理は、システムのすべての構成部分の欠陥のないそして迅速な流れを提 供する。

１分よりも短い時間を要求し、多（の場合捕捉ゾーンを通過して試料が流れると き本質的に即時の結果を提供するアッセイの速さは、ゾーンの非吸収性の性質お よびそれぞれのゾーンにおいて試料が通り抜けなければならない距離が短いため に成し遂げられ得る。診断装置の小型化により、米国特許第４、３６１．６３７ 号；米国特許第４．８６１．７１１号；米国特許第４．７４０．４６８号；およ び欧州特許第０３０６７７２　Ａ号に記載されたような類似の側方流アッセイに 開示されたよりも十分に短時間の、アッセイの著しい速さがもたらされる。小型 化は試料が捕捉ゾーンに接触すると同時に観察可能となり、かつ試料の試料受取 ゾーンへの添加とほとんど同時かまたは６０秒以内に起こるという即時の結果を 可能にする。出現の速さおよび正の目視可能な反応の強さは、試料中の分析目的 物の濃度に依存すると見なされる。正の目視可能な反応の出現の速さは、臨床的 に重要な分析目的物の濃度に最適な目視可能な結果を提供するように調整され、 そして最終ユーザーの要求に合うように時間調節され得る。

本発明の方法が適用され得る適切な分析目的物は、それに対する特異的結合相手 が見いだされ得るいずれの物質でもある。一般的には、医学的および生物学的に 重要なほとんどの分析目的物は、それらに対して調製された抗体またはこれらの 抗体の７ラグメントの中に、特異的結合相手を見いだし得る。適切な分析目的物 としては、ホルモン、酵素、リポタン゛　バク質、細菌性またはウィルス性抗原 、免疫グロブリン、リンホカイン、サイトカイン、薬物、可溶性癌抗原などの可 溶性分析目的物を包含する。これらの分析目的物としては、プロタミン、ヒスト ン、ポルホリル化（ｐｏｒｐｈｏｒｙｌａｔｅｄ）タンパク質、核タンパク質な ど、例えばトランスコルチン、エリスロポイエチン、トランスフェリン、種々の グロブリン、チロシン−結合グロブリン、種々のサブクラスＡ、　Ｇ、　ＤＳＥ およびＭの免疫グロブリン、種々の補体因子、血液凝固因子（例えばフィブリノ ーゲン、第■因子、組織トロンボプラスチン、およびトロンビン）などの種々の タンパク質を包含する。

インスリン、グルカゴン、レラキシン、テロトロピン、ソマトトロピン、ゴナド トロピン、卵胞−刺激ホルモン、ガストリン、ブラジキニン、バソプレッシン、 および種々の放出因子もまた含まれる。クラミジア、淋菌、ペスト菌、志賀赤痢 菌、およびある種の真菌類（例えばマイコスボルム（Ｍｙｅｏｓｐｏｒｕｍ）お よびアスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉ　ｌ　１ｕｓ）など）から得られる広範 囲なまたは抗原性のポリサッカライドもまた、測定され得る。他の主要な群は、 他のオリゴヌクレオチドまたはタンパク質標的と特異的に反応するオリゴヌクレ オチド配列を含む。本発明の方法で測定し得る可溶性分析目的物の広範囲な一覧 表は、参照として援用した米国特許第３．９９６．３４５号に見いだされる。

以下の実施例は例示を意図としたものであり、本発明を限定するものではない。

（以下余白） 実」１Ｌ」 ヒト　ゴナドトロピン　ＣＧに　るビーズ　−　ワンステ・プア・・セイ　の 試験装置は３つの活性構成部分（試料受取ゾーン、粒子標識を含む標識ゾーンお よび捕捉ゾーン）を有する。非吸収性液体流を介して通じている３つの活性部分 は、これらの３つのゾーンを通して移送された過剰の液体を吸収または除去する 手段を利用し、装置の活性構成成分を支持するために組み立てられる。構成は以 下の通りである。

・　ゾーンの 試料受取ゾーンは、５ｏｎｔａｒａ　０−１００　ＤｕＰｏｎｔ　０ｒｌｏｎス パンレース織物から調製する。織物はメチル化ウシ血清アルブミン（メチル化Ｂ ＳＡ）で飽和することにより非吸収性にする。　非吸収性物質への変換はメチル 化ＢＳＡの１０＋ｓｇ／ｍｌ溶液を用いて室温で５分間、４７．６μｌ／ｃ■２ で処理することにより成し遂げられる。次に５ｏｎｔａｒａのパッドを凍結乾燥 フラスコに入れて一７０℃で少な（とも１時間凍結する。次に５ｏｎｔａｒａ膜 をＶｉｒｔｉｓ　Ｆｒｅｅｚａｍｏｂｉ　ｌｅ上で一夜凍結乾燥する。処理した 試料受取ゾーンはそのとき非吸収性であり、そしてこの試料受取ゾーンをスパン レース繊維がパッドの長い方の辺に平行になるようにＩＯＸ　７゜５■の長方形 に切断する。

一ゾーンの 標識ゾーンに封入する標識化対照ビーズを調製するために、初めに２．　Ｓｖ／ ｖ％濃度で懸濁された０、　５ｍｌの青色ラテックスビーズを、グリシン緩衝生 理食塩水（ＧＢＳ）　（１００ａＭグリシン、１７１１Ｍ　ＮａＣ１）で２回洗 浄する。ビーズをＣＢＳと接触させて超音波を１０分間照射し、次に３分間ミク ロ遠心分離する。

ペレット化したビーズを、０．４Ｂ／＋＊ｌのストレプトアビジンおよび０．２ 鳳ｇ／ｍｌのメチル化ＢＳＡのＣＢＳ溶液からなる結合溶液０゜５■ｌで処理す る。ペレット化したビーズを再懸濁し、そして１０分間超音波照射し、その次に 室温で一夜回転により攪拌する。

このビーズ調製物を次に３分間遠心分離し、上清を吸引して除（。ビーズベレッ トを次に１ｈ＋ｇ／ｍｌのメチル化ＢＳＡ０．５＋ｍｌに再懸濁する。この混合 物を、室温で４時間回転しながら攪拌し、ビーズ調製物を遠心分離してペレット を回収する。上清を吸引し、そして５ｈＭ）リス、ｐＨ８中のＬａｇ／＊ｌのメ チル化ＢＳＡからなるビーズ保存溶液でペレットを３回洗浄する。最終的なビー ズ調製物は固形分濃度１％でビーズ保存溶液中に調製される。

得られたビーズを、下記の捕捉ゾーンを介して非吸収性流によって処理する。そ れらは反応してビオチン−含有捕捉バンドに結合する。

モノクローナル抗−ｈＣＧを含む、分析目的物を標識するための「試験」ビーズ は、同様の方法で以下のように調製される１／２　（０，５）ｍｌの赤色ラテッ クスビーズ（対照および試験ビーズは異なる色であることが好ましい）を、１０ 分間、超音波照射により上記のように１膳ｌのＣＢＳで２回洗浄し、そして３分 間ミクロ遠心分離して回収する。ベレットビーズに、この場合は０．８■ｇ／■ ｌのモノクローナル抗−ｈＣＧおよび０．２ｍｇ／ｍｌのメチル化ＢＳＡのＣＢ Ｓ溶液からなる結合溶液０．５■ｌを加える。ペレットを再懸濁し、そして１０ 分間超音波照射し、その次に室温で一夜回転により攪拌する。３分間遠心分離し た後、上溝を吸引して除き、ビーズペレットを１０５ｇ／■ｌのメチル化ＢＳＡ ０．５ｍｌに再懸濁し、室温で４時間、回転しながら攪拌する。遠心分離および 上清の除去の後、ペレットを上記のビーズ保存溶液で３回洗浄する。

最終的なビーズ調製物は固形分濃度１％である。

最終的に、試験および対照の両方のビーズを含む標識ゾーンを調製するために、 試験ビーズを固形分濃度０．０６％でメチル化ＢＳＡに希釈し、対照ビーズを固 形分濃度０．０２％で同じ溶液に希釈する。得られた混合物を攪拌し、５ｏｎｔ ａｒａ　０−１００　ＤｕＰｏｎｔスパンレース織物膜上に４７．６μｌ／ｃ■ ２で流し込む。標識化パッドを次に室温で５分間静置し、そして凍結乾燥フラス コに入れて一７０℃で少なくとも１時間凍結する。得られた膜をＶＬｒｔｉｓ　 Ｆｒｅｅｚｅｍｏｂｉｌｅ上で一夜凍結乾燥する。標識−含有パッドを次にスパ ンレース繊維がパッドの長い方の辺に平行になるように、１０Ｘ７．５−ｍの長 方形に切断する。

ゾーン　の 捕捉ゾーン膜を調製するために、ニトロセルロースを以下のようにして非吸収性 にする。５ｃｈｌｅｉｃｈｅｒおよび５ｃｈｕｅｌｌから得られた８−１２μｌ の孔径を有するニトロセルロースは、チャート式記録計に固着され、モしてｈＣ Ｇ捕捉バンドはｓ　２Ｂ／ｍｌのウサギ抗−ｈＣＧ（Ａタンパク質によって精製 された）のトリス緩衝液溶液を用いて、７０　ｐｓｉのパルプ圧力、５　ｐｓｉ の容器圧力設定、１５秒／ｄｒｏｐの流体流、５００ｍｍ／分のチャートスピー ドによる手動式方法でＴｒｉ−Ｄａｃ分配システムを用いてｓ　２−ａｍ−間隔 をおいた平行線として分配される。これらは試験ビーズと反応性の線である。次 に膜を、トリス緩衝液に溶解した０、６■ｇ／ｍｌのビオチニル化したウサギの ガンマグロブリンを、前にスポットした抗−ｈＣＧ捕捉ゾーンの０．３Ｃ鳳上の 平行線にスポットする。これらは対照ビーズ上のストレプトアビジンと反応性の 線である。

１Ｇ−３０分間風乾した後、膜をブロッキング緩衝液（１０謹ｇ／ｌｌのメチル 化ＢＳＡの５０ｍＭ　）リス液）を含むトレー上に室温で１５分間静置する。膜 を取り除き、プロットし、そして次に洗浄緩衝液（５０１Ｍトリスマレエート、 ｐＨ５，４）を含むトレーに移し、室温で５分間静置する。ブロックされそして 洗浄された膜を次にプロットし、風乾し、装置を組み立てるまで室温でデシケー タ−中に保存する。

１１旦凰立立工 図１に構成部材１として示されている捕捉ゾーン膜の細片２０Ｘ７．５ｍｍを、 図１に構成部材５として示されている粘着性透明細片上の中央に固着する。透明 細片は、両面粘着テープ４４４（３Ｍ）を用いて粘着性にした７００Ｘ　１７ｍ ｍのＰ　２２００３Ｍの透明な細片である。

図１に構成部材２として示されている可視標識を含むパッドを次に、捕捉ゾーン パッドの隣に図１に示すようにｌａｍの重なりを持たせて固着する。構成部材３ として示されている試料受取パッドを、標識−含有パッドの隣に図に示すように １■識の重なりを持たせて設置する。

次に装置に、捕捉ゾーン膜の遠位の端に、図に示すように１■−の重なりを持た せて固着した、ＨＤ　Ｎｏ、９３９吸収材の２０Ｘ７゜５−１の長方形の吸収パ ッドを供給する。

次に、透明裏材上に作成した試験細片を、図２に構成部材６として示されている プラスチック蓋の溝の中央に細片の縦中央が合うようにしてプラスチック蓋で覆 う。捕捉線の両方の組は視界窓の中にさらされ、試料付与孔は試料受取パッドの 真上にある。最終的に、両面粘着テープ（３Ｍ）を用いて粘着性にした厚さ１１ １の不透明な白色プラスチックの７００Ｘ　１７ｍｍの底部細片である装置の底 部を、透明細片の他方の端に接着する。

実施例１に提示した方法と同様の方法で、相対的なリポソーム−含有装置を調製 する。試料受取パッド、捕捉ゾーン膜、および構成部材の裏材上の組み立ては、 実施例１に提示したものと金く同様である。標識化リポソーム−含有ゾーンパッ ドを、以下のように調製する： リポソームは米国特許第４．６９５．５５４号に提示された手順に従って調製さ れ、スルホロダミン染料を含有する。対照および試験リポソームには異なる色の 染料を用いる。

試験リポソームとして、腹水から精製されたモノクローナル抗−ｈＣＧを用いる 。腹水は４℃における、５０％ＳＡＳ力、ノドであり、Ｇ−２５カラム上で１０ １Ｍトリス中に脱塩される。抗体を次に、および１０ｍＭ）リスの塩勾配を用い てさらに精製する。画分を、２８０ｎ■でモニターし、そしてピークを集めて１ Ｍリン酸ナトリウム中に緩衝交換する。

抗体を３■ｇ／重ｌに希釈し、そして８．５モル当量の５ＰＤＰを加える。

溶液を２７℃で３０分間インキュベートシ、そしてＧ２５および０．１Ｍ酢酸ナ トリウム上で緩衝交換する。物質をＩＭ　ＤＴＴの酢酸ナトリウム溶液で還元し て、最終濃度を５０ｍＭにし、そして２７°で２５分間インキュベートし、次い でトリス酢酸緩衝液を有するＧ２５上で緩衝交換する。リポソームおよび抗体の 相対量を、抗体のＢあたりのリンを８μモルと仮定して測定し、そして１冒ｌの 未結合リポソームに１Ｍモルのリンを供給する。リポソームを次に、１Ｍトリス を滴下してｐＨ８に調整し、２７℃で２時間、抗体と結合させる。

得られた抗体−共役リポソームを、Ｃ６Ｐａ５ｔ　Ｐｌｏｗカラム上で大きさを そろえ、５６Ｓｎｍで０．２５単位の吸収を示すようにリポソーム保存緩衝液で 希釈する。

リポソーム含有パッドを次に、５Ｏｎｔａｒａパツドを３５層ｌで５６５ｎ■で ０．０６の吸収を示すように希釈した抗−ｈＣＧ−共役リポソームの液体溶液で 飽和して、１０Ｘ７．５ｍｍのアブセイパッドに調製する。この希釈に用いるリ ポソーム保存緩衝液は、１０％のシ１糖および１０■ｇ／ｍｌのメチル化ＢＳＡ を含有する。標識パッドを室温で５分間静置し、そして凍結乾燥フラスコに入れ て一７０℃で少なくとも１時間凍結する。膜を次に、Ｖｉｒｔｌｓ　Ｆｒｅｅｚ ｅｍｏｂｉｌｅ中で一夜凍結乾燥する。

実施例１の装置を実験台上に平面的に設置し、１滴あたり約３０μｌの、２滴の 試料を、試料受取ゾーンに付与する。３つのゾーンを通して、視界窓の上部に青 色対照バンドが現れている吸収ゾーンに接する非吸収性側方流に、液体を１分よ り短い時間で流す。試料中に少なくとも５０ｍ１Ｕ／ｍｌのｈＣＧが存在すれば 、ｈＣＧ捕捉領域に他の赤色バンドが目視される。

口ｇｕｒｅ　２ 国際調査報告 フロントページの続き （７２）発明者　ゴインズ、ケレン　エイ。

アメリカ合衆国　カリフォルニア　９２１２９サンディエゴ、コルテ　ガンソ　 １３８１６

Claims (41)

【特許請求の範囲】
1. １．試料中の分析目的物の存在または欠如を検出するためのアッセイ装置であっ て、該アッセイが、分析目的物の少なくとも１つの部分と特異的結合相手とを結 合することを包含し、以下を含む、アッセイ装置： （ａ）液体試料の、（ｂ）と接触する非吸収性側方流において、非吸収性側方流 を行う固相支持体マトリックスを含有する、試料受取ゾーン； （ｂ）液体試料の非吸収性側方流を行う固相支持体マトリックス、および該分析 目的物と特異的に結合するかまたは競合するリガンドに結合した可視部分を含有 する少なくとも１つのアッセイ標識を含み、（ｃ）と接触する非吸収性側方流中 に存在する、標識ゾーン； （ｃ）非吸収性側方流を行う固相支持体マトリックス、およびその中の少なくと も１つの部分において該アッセイ標識に結合し得る少なくとも１つの捕捉試薬を 含有し、（ｄ）と隣接する、捕捉ゾーン； （ｄ）吸収ゾーン。
2. ２．前記捕捉試薬が、分析目的物に特異的な抗体またはその免疫学的に反応し得 るフラグメントである、請求項１に記載の装置。
3. ３．前記アッセイ標識が、前記分析目的物と結合するために該分析目的物に対す る特異的結合相手に結合する可視部分を含む、請求項１に記載の装置。
4. ４．前記分析目的物に対する特異的結合相手が抗体またはその免疫学的に反応し 得るフラグメントである、請求項３に記載の装置。
5. ５．前記アッセイ標識が、前記捕捉試薬に対する前記分析目的物の競合物に結合 する可視部分を含む、請求項１に記載の装置。
6. ６．前記分析目的物の前記競合物が他の分析目的物またはその類似の免疫活性類 似物である、請求項５に記載の装置。
7. ７．前記試料受取ゾーンおよび標識ゾーンが、非吸収性側方流を行うように変換 するための前処理を行った吸収性物質を含有する、請求項１に記載の装置。
8. ８．前記吸収性物質がＯｒ１ｏｎまたはポリエステル繊維、またはＯｒｌｏｎと 、ポリエステルまたはレーヨンとの混合物である、請求項７に記載の装置。
9. ９．前記前処理が前記吸収性物質をブロッキング剤で飽和することを包含する、 請求項７に記載の装置。
10. １０．前記前処理がさらに前記飽和工程後に凍結乾燥を行うことを包含する、請 求項９に記載の装置。
11. １１．前記ブロッキング剤が界面活性剤またはタンパク質である、請求項９に記 載の装置。
12. １２．前記ブロッキング剤がメチル化ＢＳＡである、請求項１１に記載の装置。
13. １３．前記捕捉ゾーンが非吸収性側方流を行うように変換するために前処理され た吸収性物質を含有する、請求項１に記載の装置。
14. １４．前記吸収性物質がニトロセルロース、ポリエステルまたはセルロースとの ニトロセルロース混合物、またはナイロンである、請求項１３に記載の装置。
15. １５．前記前処理が前記吸収性物質をブロッキング剤で飽和することを包含する 、請求項１３に記載の装置。
16. １６．前記ブロッキング剤が界面活性剤またはタンパク質である、請求項１５に 記載の装置。
17. １７．前記ブロッキング剤がメチル化ＢＳＡである、請求項１６に記載の装置。
18. １８．前記前処理がブロッキング後の洗浄液を用いて洗浄することをさらに包含 する、請求項１３に記載の装置。
19. １９．前記ブロッキング剤およびブロッキング後の洗浄液が有機カチオンまたは アニオンを含む緩衝液である、請求項１８に記載の装置。
20. ２０．前記緩衝液がトリスーマレエートである、請求項１９に記載の装置。
21. ２１．前記標識ゾーンがさらに、対照結合試薬に結合する可視部分を含む対照標 識を含有し、そして、前記捕捉ゾーンがさらに、前記アッセイ標識に対する前記 捕捉試薬が配置された位置とは異なる該捕捉ゾーンの部分において該対照結合試 薬に対する特異的結合相手を含む、請求項１に記載の装置。
22. ２２．前記対照試薬がアビジンまたはその誘導体であり、そして該対照試薬に対 する前記特異的結合相手がピオチンである、請求項２１に記載の装置。
23. ２３．前記アッセイ標識および対照標識が肉眼で区別可能である、請求項２１に 記載の装置。
24. ２４．前記アッセイ標識および対照標識が異なる色である、請求項２３に記載の 装置。
25. ２５．前記可視部分が粒子である、請求項１に記載の装置。
26. ２６．前記粒子が着色ラテックスビーズ、赤血球、金属ゾルまたはリポソーム含 有染料である、請求項２５に記載の装置。
27. ２７．試料中の分析目的物の存在または欠如を測定する方法であって、該試料を 請求項１に記載の装置の試料受取ゾーンに付与することにより、該試料を標識ゾ ーンおよび捕捉ゾーンを通して吸収ゾーン内に流入させること、およびアッセイ 標識に結合し得る捕捉試薬を含む部分中の該補足ゾーンにおける可視部分の存在 または欠如を検出すること、 を包含する方法。
28. ２８．前記分析目的物がヒト絨毛膜ゴナドトロピン（ｈＣＧ）である、請求項２ ７に記載の方法。
29. ２９．前記分析目的物に対する特異的結合相手がｈＣＧと免疫反応し得るモノク ローナル抗体である、請求項２８に記載の方法。
30. ３０．前記捕捉試薬がウサギ抗−ｈＣＧである、請求項２９に記載の方法。
31. ３１．前記可視部分が粒子である、請求項２７に記載の方法。
32. ３２．前記粒子が着色ラテックスビーズ、赤血球、金属ゾルまたはリボソーム含 有染料である、請求項２７に記載の方法。
33. ３３．前記検出が試料の付与から１分以内に起こる、請求項２７に記載の方法。
34. ３４．前記検出が試料が捕捉ゾーンに侵入した後即時に起こる、請求項２７に記 載の方法。
35. ３５．その表面上に該液体試料を受け取るように定義された試料付与ゾーン、お よび少なくとも１つの指示薬ゾーンを有し、該分析目的物または該分析目的物の 誘導体に結合し得る結合対の構成部材が該指示薬ゾーンに固定されている非吸収 性側方流膜を含有し；そして 該付与ゾーンおよび指示薬ゾーンの側方の間隙が、付与ゾーンに導入された液体 試料が非吸収性側方流により指示薬ゾーンを通して流れて固定化部材が該分析目 的物またはその誘導体と反応することを可能にするように形成され、その結果分 析目的物の存在または欠如またはおよその量が指示薬ゾーンで測定される、 液体試料中の分析目的物の存在または欠如を測定する装置において、 該非吸収性側方流膜として、吸収性膜が非吸収性側方流を行うように前処理して 変換された該吸収性膜を用いることを包含する、改良。
36. ３６．前記前処理が前記吸収性膜をブロッキング剤で飽和することを包含する、 請求項３５に記載の改良。
37. ３７．前記ブロッキング剤が界面活性剤またはタンパク質である、請求項３５に 記載の改良。
38. ３８．前記ブロッキング剤がメチル化ＢＳＡである、請求項３７に記載の改良。
39. ３９．特異的結合アッセイを行うための非吸収性側方流マトリックスを得る方法 であって、吸収性マトリックスを非吸収性マトリックスに変換するために吸収性 マトリックスをブロッキング剤で前処理することを包含する、方法。
40. ４０．前記ブロッキング剤が界面活性剤またはタンパク質である、請求項３９に 記載の方法。
41. ４１．前記ブロッキング剤がメチル化ＢＳＡである、請求項４０に記載の方法。