JPH0648995B2 - 固定化酵素もしくは固定化微生物による光学活性インドリン−２−カルボン酸の製造方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、固定化酵素或いは固定化微生物を用いてイン
ドリン−２−カルボン酸エステルを光学分割し、医薬品
合成原料として有用な光学活性インドリン−２−カルボ
ン酸を製造する方法に関する。更に詳しくは、一般式Ｉ （式中、Ｒは炭素数２〜１０個のアルキル基またはアル
ケニル基，ヒドロキシル基とハロゲン原子で単独或いは
同時に置換されている炭素数２〜１０個のアルキル基ま
たはアルケニル基、未置換又は置換脂環式炭化水素基、
未置換又は置換フェニル基またはベンジル基を表わ
す。）で表わされる（Ｒ，Ｓ）−インドリン−２−カル
ボン酸エステルＩと疎水性を有する担体に固定化された
立体選択的エステラーゼ活性を有する酵素もしくは微生
物とを接触，反応させて、式(R)−II で表わされる光学活性(R)−インドリン−２−カルボン
酸と、式(S)−Ｉ （式中、Ｒは前記と同じ） で表わされる光学活性インドリン−２−カルボン酸エス
テル(S)−Ｉを生成させ、固定化に用いた担体との親和
性の差を利用して、親水性のインドリン−２−カルボン
酸(R)−IIを水または緩衝液で回収，採取後、次いで、
担体に吸着，保持されているインドリン−２−カルボン
酸エステル(S)−Ｉをアルカリ加水分解し、生成する先
の(R)−IIと反対の旋光性を有する光学活性インドリン
−２−カルボン酸(S)−IIを溶出，採取する方法に関す
る。

これら光学活性インドリン−２−カルボン酸類化合物は
種々医薬品の原料となりうる重要な化合物である。例え
ば（Ｓ）−インドリン−２−カルボン酸は、アンジオテ
ンシンＩ変換酵素の阻害剤として有用な（Ｓ）−１−
〔（Ｓ）−３−メルカプト−２−オキソプロピル〕−イ
ンドリン−２−カルボン酸 構造式 等に利用できる〔ジャーナル・オブ・メデイシイナル・
ケミストリー（Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．），２６，３９
４（１９８３）〕。

（従来の技術と問題点） 従来酵素反応は遊離の酵素を反応器に加え、回分法で反
応が行われ、反応終了後、酵素は使いすてにされていた
が、酵素は一般的に高価であるためコスト的に不利とな
り、また不安定でもあるため酵素の工業的利用は限られ
ていた。さらに回分法では酵素反応終了後、反応生成物
を反応液から分離する方法として、有機溶媒で抽出分
離する方法、反応液を一旦有機溶媒で転溶するか、又
はそのまま反応液をカラムクロマトグラフィー処理する
ことによって分離する方法、反応液を一旦有機溶媒で
転溶するか、又はそのまま反応液を分留することによっ
て分離する方法などが行われてきたが、操作が繁雑で収
率が悪かったり、時間がかかったり、特別の装置が必要
であったりしてコストが高くなるという欠点があった。
このため近年、酵素や微生物の固定化が研究され、酵素
や微生物のくり返し使用、さらにはカラムに充填して連
続的に反応を行うことも可能となってきた。しかし、固
定化酵素を用いてラセミ体を原料として不斉水解と同時
に反応生成物を分離し、引き続き担体に吸着している未
反応エステルをアルカリ加水分解して溶出，採取するこ
と、更にそれを連続的に行って成功した例はこれまで報
告されていない。

（問題点を解決するための手段及び作用効果） 本発明者らは、さきに、インドリン−２−カルボン酸エ
ステルＩに作用し、光学活性インドリン−２−カルボン
酸(R)−IIと光学活性インドリン−２−カルボン酸エス
テル(S)−Ｉとに立体選択的に分割する酵素、あるいは
微生物を見出し、光学分割によるインドリン−２−カル
ボン酸の製造方法を見い出して提案している（特開昭６
１−９２５９５，同６１−９２５９６，同６１−２２７
７９６）。

本発明者らは、これら酵素あるいは微生物の固定化と、
より簡便な生成物の分離技術を確立すべく鋭意努力を重
ねてきた。その結果、担体として、基質と生成物に対し
て親和性に差がある担体を選択し、該担体で酵素あるい
は微生物を固定化することによって、基質インドリン−
２−カルボン酸エステルの不斉加水分解と、生成物イン
ドリン−２−カルボン酸と未反応エステルの分離、さら
に未反応エステルを担体に吸着しているままアカリ加水
分解することにより生成するインドリン−２−カルボン
酸の回収とを順に行うことに成功し、本発明を完成し
た。以下に本発明を詳細説明する。

本発明の基質として用いられる、一般式 で表わされるインドリン−２−カルボン酸エステルは、
置換基Ｒが炭素数２〜１０個のアルキル基またはアルケ
ニル基、ヒドロキシル基とハロゲン原子で単独或いは同
時に置換されている炭素数２〜１０個のアルキル基また
はアルケニル基、未置換又は置換脂環式炭化水素基、未
置換又は置換フェニル基またはベンジル基の化合物であ
り、好ましくはエタノール，ブタノール，アミルアルコ
ール，ヘキサノール，グリセロール，エチレングリコー
ル，グリセロール−α−モノクロルヒドリン，2,3−ジ
クロル−１−プロパノール，1,3,5−ペンタントリオー
ル，シクロヘキサノール，ベンジルアルコール等のイン
ドリン−２−カルボン酸とのエステルである。

インドリン−２−カルボン酸エステルＩは、次のように
して得られる。即ち（Ｒ，Ｓ）−インドリン−２−カル
ボン酸に溶媒と反応試剤とを兼ねたアルコールを加え、
インドリン−２−カルボン酸の濃度５〜２０％（Ｗ／
Ｖ）の範囲で強酸性下、５０℃〜還流温度の範囲で１〜
５時間縮合反応を行う。この反応液に飽和重炭酸ソーダ
水を加え、ｐＨ７に調整後、酢酸エチル，クロロホル
ム，塩化メチレン，ヘキサン等のような疎水性有機溶媒
を用いて抽出し、更に濃縮すれば高純度の（Ｒ，Ｓ）−
インドリン−２−カルボン酸エステルＩが得られる。

ラセミ体Ｉを不斉的に加水分解して（Ｒ）−IIを生成さ
せる立体選択的なエステラーゼ活性を有する微生物とし
ては、例えばアルスロバクター(Arthrobacter)属、ブレ
ビバクテリウム(Brevibacterium)属に属する微生物があ
り、更に詳しくは、アルスロバクター・パラッフィネウ
ス(Arthrobacter paraffineus)ＡＴＣＣ ２１３１７、
アルスロバクター・ニコチアネ(Arthrobacter nicotian
ae)ＩＦＯ １４２３４、ブレビバクテリウム・プロト
フォルミ(Brevibacterium protophormiae)ＩＦＯ １２
１２８等がある。また、これら微生物の栄養源は通常、
資化しうる有機及び無機の炭素源、窒素源、ビタミン及
びミネラルを適宜配合したものを用い、培養温度は２０
〜４０℃、ｐＨ２〜８の範囲が用いられる。また通気撹
拌により微生物の生育を促進させることもできる。

こうして培養して得られた菌体は、そのまま疎水性をも
つ樹脂で固定化しても用いられるが、微生物菌体を破砕
後、硫安分画やアセトン処理して得られる粗酵素として
から、あるいは精製してから固定化しても使用できる。

本発明における酵素固定化用担体としては、疎水性をも
つ種々の担体が用いられる。本発明で用いられる疎水性
をもつ担体とは、水もしくは緩衝液中では不斉水解反応
によって生成した親水性化合物(R)−IIを吸着せず、未
反応のエステル化合物(S)−Ｉは疎水的相互作用によっ
て吸着するような性質をもつ担体であり、ｐＨ８〜１０
のアルカリ領域でも安定である担体であることが望まし
い。更に具体的な担体としては、例えば疎水性を持つ合
成吸着剤、疎水クロマトグラフィー用樹脂、疎水性を持
つ光架橋性樹脂、疎水性のウレタンプレポリマー樹脂、
疎水基を化学結合させて導入した高分子物質等が挙げら
れる。

かかる担体への酵素の固定化は、公知の種々の方法によ
って行うことができる。例えば物理的吸着法，共有結合
法，イオン結合法，架橋法，包括法等が挙げられる。微
生物の場合には包括法等が挙げられる〔福井・千畑・鈴
木編，酵素工学，１５７−２４３頁，講談社（１９８
１）；千畑一郎編，固定化酵素，講談社）１９７
５）〕。

これらの固定化酵素或いは固定化微生物の調製法のう
ち、方法の簡便さ、担体の物理的強度及び安価さなどに
より、酵素の場合には疎水性を持つ合成吸着剤に酵素を
物理的に吸着させる方法、微生物の場合には疎水性を持
つ光架橋性樹脂或いは疎水性のウレタンプレポリマー樹
脂に微生物菌体を包括する方法が工業的に望ましい。

酵素或いは微生物の担体への担持量は、担体の担持能に
よって左右されるので必ずしも一義的ではないが、酵素
では担体の湿重量１ｇ当り約0.1mgないし約１００mg、
通常約１mgないし約２０mg程度でればよく、微生物菌体
では担体の湿重量１ｇ当り湿菌体0.1ｇないし１ｇ、通
常約0.15ｇないし約0.5ｇ程度であればよい。

本固定化酵素或いは固定化微生物を充填したカラムに負
荷できる基質の量としては、固定化した担体及び基質エ
ステルの種類によって変わるが、基質を負荷している途
中もしくは緩衝液を流し始めた時に未反応の基質がカラ
ムから排出されなければ排出される限界量まで可能であ
る。例えば合成吸着剤アンバーライトＸＡＤ−７を担体
とした固定化酵素を充填し、エチレングリコールのエス
テルを基質とした場合、そのカラム容積の１／５量まで
の基質を負荷することが可能である。基質のチャージ方
法としては、カラム式の場合は単にカラム上部に基質を
チャージして緩衝液を流せばよい。回分式の場合は基質
と固定化酵素あるいは固定化微生物とを混合すればよ
い。

本発明における不斉水解反応は通常１０℃〜６０℃の範
囲で可能であるが、２０℃〜４０℃で行うことが好まし
い。この不斉水解反応はｐＨ4.5〜１０の範囲で可能で
あるが、反応速度が大であるｐＨ６〜7.5の範囲で行う
ことが望ましい。また本反応では、不斉水解の進行に伴
いインドリン−２−カルボン酸を生じｐＨが低下する。
そのため基質化合物の負荷量が多いときには、緩衝液を
使用するなどしてｐＨを一定の範囲内に制御することが
望ましい。この目的に適する緩衝液としては無機酸塩，
有機酸塩いずれの緩衝液も使用することができる。

また、固定化酵素又は固定化微生物の担体に吸着してい
る未反応エステルのアルカリ水解は、固定化されている
酵素或いは微生物が失活しない程度で、かつエステルは
加水分解されるようなｐＨであればよく、酵素或いは微
生物によっても異なるが通常ｐＨ８〜１０が望ましい。

カラムを用いて反応させる場合にはｐＨを一定に保つと
いう観点からは、緩衝液の使用が望ましく固定化酵素或
いは固定化微生物をカラムに充填した後、ｐＨ７．０の
緩衝液を流し、次に基質のエステル化合物（Ｒ，Ｓ）−
Ｉを負荷し、負荷し終わったら再び緩衝液を流すことに
よってカラム内で不斉水解反応を行わせしめ、かつ生成
する親水的な化合物(R)−IIは緩衝液に溶かしカラムか
ら排出させる。この緩衝液画分を高速液体クロマトグラ
フィー（Ｆｉｎｅｐａｋ ＳＩＬ Ｃ₁₈，展開液；アセ
トニトリル−水＝1.5：１（ｖ／ｖ），検出；ＵＶ２１
５ｎｍ）により分析し、画分中に化合物(R)−IIがほと
んど認められなくなった時点で緩衝液をｐＨ８〜１０の
緩衝液に変えて流し、カラム内の固定化酵素或いは固定
化微生物に吸着している未反応の化合物(S)−Ｉを加水
分解し、先と反対の旋光性を有する(S)−IIとして脱
着，溶出する。この緩衝液画分を液体クロマトグラフィ
ー（条件、上と同じ）で分析し、画分中に化合物(S)−I
Iがほとんど認められなくなれば、ｐＨ８〜１０の緩衝
液から再びｐＨ7.0の緩衝液に変えて流し、基質エステ
ル化合物（Ｒ，Ｓ）−Ｉを再びカラムに負荷する。これ
らの一連の操作をくり返すことによって、化合物（Ｒ，
Ｓ）−Ｉの不斉水解と反応生成物の分離及びアルカリ水
解をパルス的に連続して行うことが可能である。

本固定化酵素或いは固定化微生物を用いて回分法でラセ
ミ体化合物Ｉの不斉水解を行う場合には、生成する光学
活性な親水性化合物(R)−IIを含む水層と未反応の光学
活性な疎水性化合物(S)−Ｉを吸着している固定化酵素
或いは固定化微生物とを濾過もしくはゆるやかに遠心す
ることによって分離し、さらに固定化酵素或いは固定化
微生物が失活しない程度のｐＨ８〜１０にアルカリ溶液
を調整しながら、あるいはｐＨ８〜１０の緩衝液で固定
化酵素或いは固定化微生物に吸着しているエステルを加
水分解して脱着することによって、先の(R)−IIと反対
の旋光性をもつ光学活性な化合物(S)−IIを得ることが
でき、固定化酵素或いは固定化微生物は再反応に用いる
ことができる。

本方法で得られたインドリン−２−カルボン酸を含む画
分は、ｐＨを5.0付近に調整し、濃縮することにより析
出，沈澱させ、濾集するか、硫安で飽和後、ｐＨを5.0
付近に調整し、酢酸エチル，塩化メチレン等の有機溶媒
で抽出，濃縮することにより得ることができる。必要に
応じて、さらにアセトン等の有機溶媒中で晶析してもよ
い。

（実施例） 以下、実施例により本発明を具体的に説明するが、本発
明はこれらの実施例に限定されるものではない。

実施例１ 基質の合成 （Ｒ，Ｓ）−インドリン−２−カルボン酸エチレングリ
コールエステルＩａの合成 （Ｒ，Ｓ）−インドリン−２−カルボン酸II５０ｇとエ
チレングリコール２５０ｇを混合し、濃硫酸２０mlを加
えて９５〜１００℃の範囲で３時間、縮合反応を行っ
た。反応後、一旦冷却してから重炭酸ソーダ及び飽和重
炭酸ソーダ水を加えｐＨを7.0に調整した。次に塩化メ
チレン５００mlで３回（計1.5）抽出操作を行い、塩
化メチレン層を水１００mlで洗浄後、無水硫酸ソーダで
脱水処理し、更に減圧濃縮したところ（Ｒ，Ｓ）−Ｉａ
が50.2ｇ、７９％の収率で得られた。

同様の方法で（Ｒ，Ｓ）−インドリン−２−カルボン酸
５０ｇに対し、５倍量のアルコールを添加することによ
り、以下の基質 （Ｒ，Ｓ）−インドリン−２−カルボン酸グリセロール
α−モノクロルヒドリンエステル（Ｉｂ）45.4ｇ、収率
58.0％ （Ｒ，Ｓ）−インドリン−２−カルボン酸ブチルエステ
ル（Ｉｃ）53.8ｇ、収率８０％ （Ｒ，Ｓ）−インドリン−２−カルボン酸グリセロール
エステル（Ｉｄ）57.7ｇ、収率７９％ （Ｒ，Ｓ）−インドリン−２−カルボン酸シクロヘキサ
ノールエステル（Ｉｅ）52.3ｇ、収率６９％ （Ｒ，Ｓ）−インドリン−２−カルボン酸ベンジルアル
コールエステル（Ｉｆ）49.7ｇ、収率64.0％ （Ｒ，Ｓ）−インドリン−２−カルボン酸1,3,5−ペン
タトリオールエステル（Ｉｇ）59.5ｇ、収率73.3％ が得られた。尚、抽出溶剤として、塩化メチレンの代り
に（Ｒ，Ｓ）−インドリン−２−カルボン酸グリセロー
ルエステル（Ｉｄ）は酢酸エチルを、（Ｒ，Ｓ）−イン
ドリン−２−カルボン酸シクロヘキサノールエステル
（Ｉｅ）はヘキサンを用いた。

参考例１ アクチナーゼＥ（ストレプトマイセス・グリセウス由
来）（科研製薬（株）製）３ｇをｐＨ7.0の0.1Ｍリン酸
緩衝液６０mlに加えて混和し、濾過によって不溶物を除
いた。濾液にローム・アンド・ハース社製メタクリレー
ト系多孔質吸着剤アンバーライトＸＡＤ−７をメタノー
ルと水で洗浄後、湿重量６０ｇ（含水率７１％）を加
え、低温室（４℃）で一夜ゆっくり撹拌し、酵素を吸着
固定化した。固定化酵素懸濁液をグラスフィルターを用
いて吸引濾過し、さらにｐＨ7.0の0.1Ｍリン酸緩衝液１
００mlで３回（計３００ml）洗浄後、吸引濾過して湿潤
固定化酵素を得た。この固定化リパーゼを内径2.2cmの
カラムに高さ１５cmに充填し、３３℃に保温してラセミ
体のインドリン−２−カルボン酸エチレングリコールエ
ステル（Ｒ，Ｓ）−Ｉａ５ｇを負荷し、ｐＨ7.0の0.1Ｍ
リン酸緩衝液を毎時２０mlの流速で流して反応させた。
カラムからの排出液を２０mlずつフラクションコレクタ
ーで分取し、液体クロマトグラフィーで分析した。この
リン酸緩衝液画分には、不斉水解され生成した親水的な
インドリン−２−カルボン酸のみが含まれていた。該リ
ン酸緩衝液の画分３６０mlに飽和になるまで硫酸アンモ
ニウムを加え、更にｐＨを5.0に調整した。次に等量の
酢酸エチルを加え、３回該インドリン−２−カルボン酸
を抽出し、脱水後、減圧濃縮し、乾固物をアセトン−ヘ
キサン（８ml−２ml）で再結した。真空で乾燥後、比旋
光度▲〔α〕²⁵ _D▼−30.5゜（ｃ＝1.0、ジメチルホルム
アミド）〔文献値、前掲のジャーナル・オブ・メデイシ
イナル・ケミストリー，２６，３９４（１９８３），
〔α〕²⁵ _D＋34.5°（ｃ＝0.91、ジメチルホルムアミ
ド）〕を有する白色の粉末（Ｒ）−インドリン−２−カ
ルボン酸(R)−IIが1.51ｇ（（Ｒ，Ｓ）−Ｉａよりの収
率７７％）得られた。リン酸緩衝液を４００ml流した時
点で、該リン酸緩衝液にかえてｐＨ10.0の0.1ＭＫ_２Ｈ
ＰＯ_４−ＮａＯＨ溶液を毎時４０mlの流速で流し、カラ
ム内の固定化酵素の担体に吸着していた未反応のインド
リン−２−カルボン酸エチレングリコールエステルＩａ
を加水分解し、IIとして脱着，溶出した。IIを含む該ア
ルカリ緩衝液画分３００mlを２Ｎ塩酸でｐＨ5.0に調整
後、等量の酢酸エチルで３回抽出し、脱水後、減圧濃縮
した。乾固物をアセトン−ヘキサン（６ml−1.5ml）で
再結すると比施光度▲〔α〕²⁵ _D▼＋32.7゜（ｃ＝1.0、
ジメチルホルムアミド）を有する白色の粉末（Ｓ）−イ
ンドリン−２−カルボン酸（Ｓ）−IIが1.34ｇ（（Ｒ，
Ｓ）−Ｉａよりの収率６８％）得られた。

上記ｐＨ7.0及びｐＨ10.0の緩衝液による一連の操作に
おいて酵素の脱着は認められなかった。

参考例２ 参考例１において使用した固定化アクチナーゼＥ充填カ
ラムにｐＨ7.0の0.1Ｍリン酸緩衝液５０mlを流してから
参考例１と同様にしてラセミ体のインドリン−２−カル
ボン酸エチレングリコールエステル（Ｒ，Ｓ）−Ｉａ５
ｇを負荷し、ｐＨ7.0のリン酸緩衝液による不斉水解反
応と生成するカルボン酸の溶出及びｐＨ10.0の緩衝液に
よるアルカル水解とカルボン酸の脱着，溶出を行った。
さらに、この一連の反応，溶出操作を１０回くり返し連
続して行い、毎回ｐＨ7.0の緩衝液画分とｐＨ１０の緩
衝液画分を参考例１と同様にして処理した。その結果、
各回のｐＨ7.0の緩衝液画分から、比旋光度▲〔α〕²⁵ _D
▼−29.5゜〜30.9゜（ｃ＝1.0、ジメチルホルムアミ
ド）を有する（Ｒ）−インドリン−２−カルボン酸
（Ｒ）−IIを1.40ｇ〜1.56ｇ（（Ｒ，Ｓ）−Ｉａよりの
収率７１〜７９％）の範囲で得た。また、各回のｐＨ1
0.0の緩衝液画分から比旋光度▲〔α〕²⁵ _D▼＋30.3°〜
＋32.2゜（ｃ＝1.0、ジメチルホルムアミド）を有する
（Ｓ）−インドリン−２−カルボン酸（Ｓ）−IIを1.28
ｇ〜1.35ｇ（（Ｒ，Ｓ）−Ｉａよりの収率６５〜６９
％）の範囲で得た。

参考例３〜８ 参考例１において、基質のエステル及び酵素固定化用担
体を変えて参考例１と同様の操作を行い、表１の結果を
得た。基質の負荷量はすべて５ｇである。

参考例９〜１０ 参考例１において、酵素を変えて参考例１と同様の操作
を行い、表２の結果を得た。ただし、実施例９，１０に
おいては、エステルの加水分解にｐＨ9.0の緩衝液を用
いた。

比較例１ 下記の組成からなる栄養液体培地を調製し、２坂口フ
ラスコに４００mlずつ分注後、１２０℃、１５分殺菌し
た。

〔培地組成〕

グルコース４％、イーストエキス0.3％、肉エキス0.3
％、ペプトン0.3％、リン酸二アンニウム0.2％、リン酸
一カリウム0.1％（ｐＨ6.8） これとは別に同じ組成の培地にて前培養をしたシュード
モナス・アシドボランス(Pseudomonas acidovorans)Ｉ
ＦＯ １３５８２の種菌液１０mlを前記フラスコに接種
し、３０℃、２４時間振とうを行った。合計５本培養
し、培養液計２を得た。この培養液を遠心し、菌体を
集めた。この湿菌体２０ｇを２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐ
Ｈ7.0）４０mlに懸濁し、それにウレタンプレポリマー
ＰＵ−３（東洋ゴム工業（株）製）２０ｇを加え、４０
℃にてすばやく撹拌後、ただちに４℃に冷却し、３０分
間放置した。こうして得られた固定化微生物を約２mm角
に切断し、内径２．２cmのカラムに高さ１５cmに充填
し、３３℃に保温して、ｐＨ7.0の0.1Ｍリン酸緩衝液を
５０ml流してから基質インドリン−２−カルボン酸グリ
セロールエステル（Ｒ，Ｓ）−Ｉｄ ４ｇを負荷した。
ｐＨ7.0の0.1Ｍリン酸緩衝液を毎時１５mlの流速で流し
不斉水解反応を行わせ、カラムからの排出液を２０mlず
つフラクションコレクターで分取し、液体クロマトグラ
フィーで分析した。このリン酸緩衝液画分には、不斉水
解され生成した親水的なインドリン−２−カルボン酸の
みが含まれていた。該リン酸緩衝液の画分３００mlに飽
和になるまで硫酸アンモニウムを加え、更にｐＨを5.0
に調整し、等量の酢酸エチルで３回該インドリン−２−
カルボン酸を抽出した。酢エチ層を分離し、脱水後、減
圧濃縮し、乾固物をアセトン−ヘキサン（５ml−１ml）
で再結した。真空で乾燥後、比旋光度▲〔α〕²⁵ _D▼＋2
3.7°（ｃ＝1.0、ジメチルホルムアミド）を有する
（Ｓ）−インドリン−２−カルボン酸（Ｓ）−IIが1.05
ｇ得られた。

リン酸緩衝液を３４０ml流した時点で、該リン酸緩衝液
からｐＨ9.5の0.1ＭＫ_２ＨＰＯ_４−ＮａＯＨ緩衝液に変
えて毎分４０mlの流速で流し、カラム内の固定化微生物
の担体に吸着していた未反応のインドリン−２−カルボ
ン酸グリセロールエステルＩｄを加水分解してIIとし脱
着，溶出した。IIを含む該アルカリ緩衝液画分３００ml
を参考例１と同様に処理し、比旋光度▲〔α〕²⁵ _D▼−2
9.2゜（ｃ＝1.0、ジメチルホルムアミド）を有する白色
の粉末（Ｒ）−インドリン−２−カルボン酸（Ｒ）−II
を0.94ｇ得た。

実施例２〜３ 菌株を変えて、比較例１と同様の操作により、培養，固
定化，不斉加水分解と分離を行い、表３に示す結果を得
た。基質は（Ｒ，Ｓ）−Ｉａを４ｇ負荷した。

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】一般式Ｉ （式中、Ｒは炭素数２〜１０個のアルキル基またはアル
   ケニル基、ヒドロキシル基とハロゲン原子で単独或いは
   同時に置換されている炭素数２〜１０個のアルキル基ま
   たはアルケニル基、未置換又は置換脂環式炭化水素基、
   未置換又は置換フェニル基又はベンジル基を表わす。） で表わされる(R,S)−インドリン−２−カルボン酸エス
   テルと疎水性を有する担体に固定化された(R)−立体選
   択的エステラーゼ活性を有するアルスロバクター(Arthr
   obacter)属、ブレビバクテリウム(Brevibacterium)属に
   属する微生物由来の酵素を用いた固定化微生物もしくは
   固定化酵素とを接触、反応させて構造式(R)−II で表わされる光学活性(R)−インドリン−２−カルボン
   酸と、一般式(S)−Ｉ （式中、Ｒは前記と同じ） で表わされる光学活性(S)−インドリン−２−カルボン
   酸エステルとに不斉加水分解し、親水性のインドリン−
   ２−カルボン酸(R)−IIを水または緩衝液で溶出、採取
   後、固定化用担体に吸着、保持されているインドリン−
   ２−カルボン酸エステル(S)−Ｉをアルカリ加水分解
   し、生成する先の(R)−IIと反対の旋光性を有する光学
   活性インドリン−２−カルボン酸(S)−IIを溶出、採取
   することを特徴とする光学活性インドリン−２−カルボ
   ン酸の製造方法。
2. 【請求項２】酵素がアルスロバクター・パラッフィネウ
   ス(Arthrobacter paraffineus)、アルスロバクター・ニ
   コチアネ(Arthrobacter nicotianae)、ブレビバクテリ
   ウム・プロトフォルミ(Brevibacterium protophormiae)
   である微生物由来の酵素である特許請求の範囲第１項記
   載の製造方法。
3. 【請求項３】疎水性を持つ酵素或いは微生物の固定化用
   担体が、合成吸着剤，疎水クロマトグラフィー用樹脂，
   疎水性光架橋性樹脂又は疎水基を化学結合させて導入し
   た高分子物質である特許請求の範囲第１項または第２項
   記載の製造方法。
4. 【請求項４】不斉加水分解をカラムに充填した固定化酵
   素もしくは固定化微生物で行う特許請求の範囲第１項ま
   たは第２項記載の製造方法。
5. 【請求項５】不斉加水分解を回分式で行う特許請求の範
   囲第１項または第２項記載の製造方法。