JPH064542B2

JPH064542B2 - 組換ヒトβ―インターフェロンを含有する医薬組成物及びその製造方法

Info

Publication number: JPH064542B2
Application number: JP61215063A
Authority: JP
Inventors: ヘルムートハニッシュボルフガング; マイケルフェルナンデスピーター; タフォロテランス
Original assignee: Cetus Corp
Current assignee: Novartis Vaccines and Diagnostics Inc
Priority date: 1985-09-13
Filing date: 1986-09-13
Publication date: 1994-01-19
Anticipated expiration: 2009-01-19
Also published as: ATE106247T1; CA1339707C; EP0215658A2; AU590896B2; EP0215658B1; US4992271A; AU6264286A; DE3689870D1; DE3689870T2; JPS6267032A; EP0215658A3

Description

【発明の詳細な説明】〔産業上の利用分野〕この発明は生化学工学の一般的分野に属する。さらに詳
しくは、この発明はヒト−インターフェロンのごとき生
物学的に活性な組換親油性蛋白質の製造に関する。さら
に具体的には、この発明は、遺伝的に形質転換された宿
主生物から親油性蛋白質を製造・回収するための改良さ
れた方法、比較的高純度の親油性蛋白質調製物、及びそ
の療法的に許容される製剤に関する。

〔従来の技術〕

天然インターフェロン(IFN)は、ウイルス、２本鎖ＲＮ
Ａ、他のポリヌクレオチド、抗原又はマイトジェンによ
る誘導の後に種々の細胞により生産される種特異的蛋白
質、しばしば糖蛋白質である。インターフェロンは、抗
ウイスル機能、抗増殖機能、免疫調節機能及び抗細胞機
能のごとき多くの生物学的活性を示す。少なくとも３つ
のタイプのヒト−インターフェロンが同定されており、
そしてそれらの抗ウイルス活性、抗増殖活性及びナチュ
ラルキラー細胞(NK)の活性化活性の点から特徴付けられ
ている。これらは、白血球、リンパ球、線維芽細胞及び
免疫系により生産され、そしてα、β、及びγインター
フェロンとして分類される。これらは、異る構造遺伝子
によりコードされた異る蛋白質であると報告されてい
る。

天然ヒトβ−インターフェロン（β−HIFN）は一般に、
ヒト繊維芽細胞培養物をポリ−ＩＣ（ポリ−リボイノシ
ン酸及びポリシチジル酸）によりスーパーインデュース
し、そしてこうして産生されたβ−HIFNをクロマトグラ
フ法及び電気泳動法により単離及び精製することにより
製造される。天然β−インターフェロン様の性質を示す
蛋白質又はポリペプチドはまた、ウイルス的に誘導され
たヒト細胞からポリ−Ａ−リッチ１２Ｓメッセンジャー
ＲＮＡを抽出し、このmRNAを鋳型として使用して２本鎖
cDNAを合成し、このcDNAを適当なクローニングベクター
に導入し、このベクターを用いて適当な微生物を形質転
換し、細菌を集め、そしてこの細菌からβ−HIFNを抽出
することにより、組換ＤＮＡ技法を用いて製造され得
る。Nagola S.等、Nature、284：316(1980)；GoeddelD.
V.等、Nature、287：411(1980)；Yelverton E.等、Nuc.
Acds Res.、９：731(1981)；Streuli M.等、Proc.Nat'
1.Acad.Sci.(U.S.)、78:2848(1981);1981年５月６日に
公開されたヨーロッパ特許出願No.28033；1981年７月１
５日に公開されたヨーロッパ特許出願No.321134;1981年
８月26日に公開されたヨーロッパ特許出願No.34307;及
び1981年６月１日に発行されたベルギー特許No.837397
は、組換ＤＮＡ技法を用いてβ−インターフェロンの製
造のために現在使用されている種々の方法を記載してい
る。発現した蛋白質又はポリペプチドは精製されそして
試験され、そして天然ＩＦＮの性質に類似する性質を示
すことが見出されている。従って、細菌的に製造された
ＩＦＮは抗ウイルス剤及び抗腫瘍剤としての滞在的な用
途を有する様であり、そしてこのような細菌発酵による
ＩＦＮの製造は、臨床試験のために十分な量のＩＦＮを
比較的低コストで提供することが期待される。

しかしながら、臨床研究において使用するための蛋白質
サンプルは比較的高純度でなければならず、そして毒性
の宿主細胞成分、細胞破片、並びに抽出及び精製の段階
で導入された他の外来化学物質により実質的に汚染され
ていてはならない。細菌的に生産された蛋白質の調製、
回収及び精製のために現在使用することができる幾つか
の方法が存在する。

Leibowitzの米国特許No.4,315,852は、細菌細胞から白
血球インターフェロンを酸抽出し、そして抽出物を中和
してインターフェロンを得る方法を記載しそして特許請
求している。

Derynck等、Nature、287：193(1980)は、５Ｍ尿素、１
％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）及び１％２−メル
カプトエタノールを含有する溶液を用いて、形質転換さ
れたＥ．コリ(E.coli)細胞を溶解することを教示してい
る。クロマトグラフィーにより精製された細胞溶解物は
インターフェロン活性を示した。

Scandella及びKornberg、Biochemistry、10：4447(1971)
は、細胞膜をＳＤＳで可溶化しそして可溶化された蛋白
質を１−ブタノールで沈澱せしめることによる、Ｅ．コ
リからのホスホリパーゼの調製を記載している。

Menge等の米国特許No.4,343,735は、水性多相系におい
て、この系中に可溶でありそしてポリエーテルの誘導体
であるイオン交換体の存在下で、インターフェロンを分
配することによりインターフェロンを精製する方法を教
示している。

Uemura等の米国特許No.4,343,736は、水−不溶化ヘパリ
ン上にインターフェロンを吸着せしめ、そして次に該イ
ンターフェロンを無機塩及びコンドロイチン硫酸塩の水
性溶液により溶出することによるインターフェロンの回
収方法を開示している。

Friesen等の米国特許No.4,289,689は、アフィニティー
クロマトグラフィー及び高圧液体クロマトグラフィーの
使用によるヒト天然β−インターフェロンの回収及び精
製方法を開示している。

Yabrov等の米国特許No.4,460,574は、ヒト−インターフ
ェロン感受性疾患の肛門又は尿性器治療のために使用さ
れる天然ヒトα−及びβ−インターフェロンを含んで成
る医薬組成物を開示している。

Leibowitz等の米国特許No.4,364,863は、低pH及び次に
高pH抽出法を用いて細菌から線維芽細胞インターフェロ
ンを抽出する方法を記載している。Benzon等のPCT WO 8
0/02229は、親油性蛋白質ではないα（白血球）インタ
ーフェロンの精製を開示している。

FP 42,246は、組換インターフェロンが所望の投与形の
ために適当な医薬として許容される非毒性担体に溶解さ
れ得ることを開示しているが、これ以上の詳細は記載し
ていない。

米国特許No4,450,103は、適当な溶解剤による水性媒体
中での蛋白質の可溶化、２−ブタノール又は２−メチル
−２−ブタノールによる水性媒体からの蛋白質の抽出、
及びアルコール相からの蛋白質の沈澱を記載している。

Cancer Treatment Reports、62、1900−1906(1978)及び
EP89,245は、天然β−インターフェロンがヒト血清アル
ブミンと共に直接的に、pH7.2〜7.8の医薬として適合性
の水性媒体中に製剤化され得ることを開示している。

α−インターフェロン及び天然β−インターフェロンは
親油性蛋白質ではない。従って、これらはヒト血清アル
ブミンのごとき安定剤を添加することにより生理的pHの
製剤に直接に安定化及び可溶化され得る。これに対し
て、組換β−インターフェロンのごとき親油性蛋白質は
pH6.8〜7.8でヒト血清アルブミンを添加することによっ
ては可溶化されない。

親油性蛋白質の精製及び回数のための既存の方法の主た
る問題点は、蛋白質が臨床的及び療法的目的のために十
分に純粋な形で且つ十分に多量に製造されないこと、そ
してさらに得られた蛋白質調製物、特に組換ＤＮＡ技法
により製造された蛋白質調製物が残留毒性量の化学物
質、例えばＳＤＳ、並びに抽出及び精製段階において使
用された他の界面活性剤又は沈澱剤を含有することであ
る。従って、これらの調製物は、これらの蛋白質の療法
的使用、及び適用の範囲を決定するために設計された臨
床研究のためには許容されない。従って、親油性蛋白質
を臨床的及び療法的適用のために毒性レベルのＳＤＳを
伴わないで且つ十分に多量に回収する方法を手にするこ
とが望まれる。

1985年10月15日に公開されたEP158,487は、ヒト血清ア
ルブミン、還元化合物又はその組合わせを含んで成りそ
して溶液として３〜６のpHに調整されたインターロイキ
ン−２組成物を開示している。

〔発明が解決しようとする問題点〕

従って、この発明は比較的高純度の組換β−インターフ
ェロンのごとき親油性蛋白質の医薬として許容されるサ
ンプルを提供することを目的とする。

この発明の他の目的は、組換β−インターフェロンのご
とき親油性蛋白質の医薬として許容されるサンプルを又
は臨床的及び療法的用途のために十分な量において提供
することである。

この発明の他の目的は、ＳＤＳを実質上含有せず且つ生
物学的活性を喪失しておらず、又はこれらが医薬として
許容されるレベルにある親油性蛋白質、例えば組換β−
インターフェロン調製物を提供することである。

この発明の他の目的は、ＳＤＳのレベルが約１０ppm未
満である組換β−インターフェロン及びサンプルを提供
することである。

米国特許No.4,462,940はヒト組換β−インターフェロン
のごとき親油性蛋白質の生産、回収及び精製のための改
良された方法を記載しており、この方法は適当な可溶化
剤により蛋白質を水性媒体中に可溶化し、可溶化された
蛋白質を脂肪族アルコールにより抽出し、水性緩衝液に
よりアルコール相から蛋白質を沈澱せしめ、そして約1
0.5〜12.5のpH、好ましくは約１２のpHにおいて、約10.
5〜12.5のpH、好ましくは約１２のpHに調整された水に
対してあるいは約10.5〜12.5のpH、好ましくは約１２の
pHに調整された水と脂肪族アルコール好ましくはエタノ
ール及びグリセリンとの混合物に対して蛋白質をダイア
フィルトレートしてＳＤＳを実質的に除去するか又はそ
の濃度を医薬として許容されるレベルに低下せしめる。
蛋白質は場合によっては、ダイアフィルトレーションの
前にクロマトグラフィーのごとき常法による精製され
る。

上記の方法の好ましい具体例においては、細菌細胞を破
砕し、適当な可溶化剤によりインターフェロンを可溶化
し、可溶化されたインターフェロンを２〜６、好ましく
は４〜６の炭素鎖長の脂肪族アルコールにより抽出し、
アルコール相からインターフェロンを沈澱せしめ、イン
ターフェロンを常法、好ましくはゲル濾過クロマトグラ
フィーによりさらに精製し、そしてインターフェロン画
分を約10.5〜12.5のpH、好ましくは約１１のpHにおい
て、やはり約10.5〜12.5のpH、好ましくは約１１のpHに
調整された純粋、又は水と脂肪族アルコール、好ましく
はメタノール、エタノール、プロパノール、ブタノー
ル、グリセリン等との混合物に対してダイアフィルトレ
ートすることにより、細菌により生産されたヒトβ−イ
ンターフェロンを回収する。

〔問題点を解決するための手段〕

この発明は、蛋白質のための安定剤を含有するpH２〜４
の非毒性で不活性な療法的に適合性の水性キャリヤー媒
体中に溶解した生物学的に活性な組換β−HIFNの療法的
有効量を含んで成る安定な医薬組成物に関する。好まし
くは、安定剤はヒト血清アルブミン、ヒト血清アルブミ
ンとデキストロースとの混合物、ヒト血清蛋白質画分、
又は正常血清アルブミンである。

この発明はまた、宿主の細胞壁を破砕しそして破砕物中
の蛋白質を単離しそして精製することにより、β−HIFN
を生産するために形質転換された宿主からβ−HIFNを回
収する方法において、 (ａ)β−HIFNを含有する媒体のpHを約２〜４に調整する
段階； (ｂ)β−HIFN媒体に、約２〜４のpHにあらかじめ調整し
ておいたβ−HIFNのための安定剤を添加する段階；及び (ｃ)生じた組成物をおよそpH２〜４において凍結乾燥す
る段階；を含んで成る方法に関する。

pHを約２〜４に調整した後、これを好ましくは6.8〜7.8
のpH範囲に上昇せしめることができる。

この方法はさらに、この組成物に非毒性で不活性な医薬
として許容される水性担体を添加することができる。

〔具体的な説明〕

この明細書において、“親油性蛋白質”なる語は、pHが
約6.5〜7.8の間にあり室温及び大気圧の周囲条件下で水
性媒体中に溶解しないか又は容易には溶解しない蛋白質
を意味する。このような蛋白質の例には、ヒト組換β−
インターフェロン、及びリシンＡのごとき細胞毒性（変
性）成分を乳癌のごとき病理状態に対する抗体に接合せ
しめることにより調製されるイムノトキシンが包含され
る。“組換蛋白質”なる語は、組換ＤＮＡ技法により生
産される蛋白質を意志し、この技法においては一般にＤ
ＮＡが適当な発現プラスミドに挿入され、このプラスミ
ドが、異種性蛋白質を生産するために形質転換されるＤ
ＮＡに対して本来的でない宿主生物に挿入される。宿主
は、前記ＤＮＡに対して外的である任意の成分、例えば
細菌、酵母、ウイルス、哺乳類等である。好ましくは、
宿主は微生物であり、そして最も好ましくは細菌であ
る。

この明細書において使用する場合、“β−HIFN”はヒト
β−インターフェロン、又はβ−インターフェロン様ポ
リペプチドであって、組換ＤＮＡ技法によって生産さ
れ、そしてそのアミノ酸配列が非グルコシル化及び／又
はグリコシル化天然β−インターフェロンと同一である
か又は類似しておりあるいは実質的に相同なものであ
る。

蛋白質の正確な化学構造は多数の因子に依存するであろ
う。イオン化可能なアミノ基及びカルボキシル基が分子
中に存在する場合、特定の蛋白質を酸性もしくは塩基性
塩として、又は中性の形で得ることができる。適当な環
境条件下に置かれた場合にそれらの活性を保持している
すべてのこのような調製物がこの発明の蛋白質の定義の
範囲に属する。さらに、蛋白質の一次アミノ酸配列には
糖成分を用いる誘導体化（グリコシル化）、又は他の補
足的分子、例えば脂質、リン酸、アセチル基等による付
加(augument)、さらに一般的にはサッカライドとの接合
による付加を行うことができる。このような付加のある
観点は生産宿主の翻訳後プロセシング系により達成さ
れ、他のこのような修飾をインビトロで導入することが
できる。ともかく、このような修飾は、上に定義した蛋
白質の活性が破壊されない限り蛋白質の範囲に含まれ
る。言うまでもなく、このような修飾は種々のアッセイ
において蛋白質の活性を増殖するか又は低下せしめるこ
とによりその活性に定性的又は定量的に影響を与えると
予想される。

鎖中の個々のアミノ酸残基を酸化、還元、又は他の誘導
体化により修飾することができ、そして蛋白質を切断し
て活性を維持している断片を得ることができる。活性を
破壊しないこのような変化はその蛋白質配列を上記の定
義から排除しない。

最後に、翻訳中に配列に導入されるアミノ酸の欠失、付
加、又は変化による一時構造それ自体の変更を蛋白質の
活性を破壊することなく行うことができる。例えば、生
物学的活性のために必須ではなく、生物学的に活性な蛋
白質中に存在し、そしてジスルフィド連結を形成するた
めに開放されている少なくとも１個のシステイン残基を
除去するか又は他のアミノ酸で置き換えることにより分
子間架橋のため又は正しくない分子内ジスルフィド結合
形成のための部位を除去することができる。ミューテイ
ン(mutein)として知られるこのような変形された蛋白質
は1985年５月21日に発行された米国特許No.4,518,584に
記載されている。他の例において、IFNβ−のごとき生
物学的に活性な蛋白質の保存的アミノ酸がクロラミンＴ
又は過酸化物酸化に対して感受性の各メチオニン残基の
代りに使用され、追加の非感受性メチオニン残基はその
ように置換されない。この文脈における保存的アミノ酸
置換は、生物学的活性に不都合な影響を与えないもので
ありそして中性又は非極性アミノ酸置換あるいはメチオ
ニンの欠失を含むものとして定義される。

好ましくは、この発明において蛋白質はβ−HIFNであ
る。最も好ましくは、蛋白質は、ヒトIFN−β遺伝子に
より、又は（ａ）天然ヒトIFN−βのアミノ酸配列と少
なくとも実質的に同じアミノ酸配列及び（ｂ）天然ヒト
IFN−βと共通な生物学的活性を有する蛋白質をコード
するヒトIFN−β遺伝子の変形体により形質転換された
微生物により生産される非グリコシル化β−HIFNであ
る。アミノ酸配列の実質的同一とは、配列が同一である
か、又は合成蛋白質と天然ヒトIFN−βとの関の不都合
な機能的差異を生じさせない複数のアミノ酸の変化（欠
失、付加、置換）により異なることを意味する。このよ
うな蛋白質の例は、米国特許No.4,518,584に記載されて
いるIFN−β蛋白質である。最も好ましくは、アミノ酸
位置１７のシステイン残基がセリン残基により置き換え
られている_ser17IFN−βである。

この明細書において使用する場合、“生理的pH”なる語
は哺乳類にとって医薬的に許容されるpH、すなわち約7.
2〜7.6のpHを意味する。

この明細書において使用する場合、親油性蛋白質に適用
する際の“安定剤”なる語は、ダイアフィルトレートさ
れた蛋白質を変性及び生物学的活性の喪失から安定化す
るのみならず、医薬組成物がダイアフィルトレートされ
た蛋白質のpH6.8〜7.8の水性溶液から成りこれから蛋白
質が沈澱しないように親油性蛋白質を水性媒体中に可溶
化する非毒性、非療法性、非免疫原性組成物を意味す
る。このような安定剤は、それらの可溶化機能について
当業界において知られていない。このような安定剤の例
には蛋白質及び炭水化物が含まれ、好ましくは蛋白質は
ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）及びヒト血漿蛋白質画分
（ＰＰＦ）から選択され、そして炭水化物はマンニトー
ル、ソルビトール、グリセリン、デキストロースから選
択される。あるいはこれらの混合物から選択される。し
かし、これらに限定されない。

使用する安定剤のタイプ及びその濃度は主として使用さ
れるpH法及び配合、並びに蛋白質に依存するであろう。
例えば、IFN-β_ser17を用いる低pH配合のためにはＰＰ
Ｆが好ましい。

ＰＰＦは商業的に入手可能であり、そして８３％以上の
アルブミン及び１７％未満のグロブリン（α及びβ）か
ら成り、γ−グロブリンは蛋白質の１％未満である。血
漿中のα−及びβ−グロブリンは幾つかの機能を果し、
その１つは比較的不溶成の血液成分、例えばコレステロ
ール、脂溶性ビタミン及びホルモン類を安定な水溶液に
維持することである。炭水化物安定剤はpH２〜４に保持
され／凍結乾燥された配合においてのみ使用され得る。

安定剤の最終濃度は一般に、主として蛋白質及び安定剤
のタイプ並びに使用するpHに依存して0.1〜10ｗ／ｖ％
の範囲であり、低いpHのためには高い範囲が好ましい。
β−HIFNのためのＨＳＡについては0.5〜10ｗ／ｖ％の
範囲が典型的であり、そしてβ−HIFNのためのＰＰＦに
ついては0.1〜５ｗ／ｖ％が典型的である。

親油性組換蛋白質、例えば細菌により生産されたβ−HI
FNの回収のために使用される方法は、細胞性材料からの
蛋白質の可溶化及び単離のためのＳＤＳ又は類似の界面
活性剤並びにそれに続く蛋白質の取得のための酸沈澱を
用いる。中性又はそれに近いpHにおいて行われる他の精
製技法により最終蛋白質調製物中のＳＤＳレベルは約0.
1％に低下するが、しかしこのような残留レベルでも動
物に対する研究において毒性であり、そしてそれ故に療
法的又は臨床的適用のために許容されないことが見出さ
れている。４〜８のpH範囲におけるダイアフィルトレー
ション技法によるＳＤＳのそれ以上の除去は、蛋白質の
凝集及び沈澱に基くほとんど完全なβ−HIFN活性の喪失
をもたらす。ダイアフィルトレーション中に失われるβ
−HIFNの生物学的活性はＳＤＳの添加により回復し得
る。

遊離の又は非結合の溶質について、よく混合された容器
からのダイアフィルトレーション中の除去速度は一次反
応速度に従う。その臨界ミセル濃度以下の非結合ＳＤＳ
は10,000ダルトンのカットオフの膜を通して障害されな
いで通過するのに十分に小さい分子であるから、その除
去速度は一次速度に従うと予想され、そしてそうであれ
ば、約1000μｇ／ｍｌの初期濃度のＳＤＳは７容量の置
換の後１μｇ／ｍｌ未満に低下するはずである。しかし
ながら、β−HIFNからＳＤＳの除去はこの理論的モデル
と合致しないことが見出され、ＳＤＳの除去の速度に実
質的に影響を与える蛋白質−ＳＤＳ相互作用が存在する
こと、及び４〜８のpH範囲におけるこの結合状態からの
ＳＤＳの除去が蛋白質−蛋白質相互作用を促進して蛋白
質の凝集又は沈澱をもたらすことが示された。一層高い
か又は一層低にpHにおいては幾つかの蛋白質が変性する
ことが知られているから、ＳＤＳの除去のための一層高
いか又は一層低いpHは好ましくないと予想されるかも知
れない。しかしながら、この発明に従えば、低イオン強
度でのダイアフィルトレーションによるか又は脱塩によ
るＳＤＳの除去の後、それぞれ塩基又は酸の添加による
pHの上昇又は低下が蛋白質を可溶化し、そして配合物中
のその生物学的活性を実質的に回復せしめる。

従って、この発明は、ＳＤＳの除去による親油性蛋白質
の凝集及び沈澱並びに蛋白質活性の喪失の問題を解決す
る。米国特許No.4,462,940中に記載されている１つの問
題解決策は、まずpHを約10.5〜12.5に調整し、そして場
合によっては蛋白質の部分的に精製されたサンプルをジ
チオスレイトール（ＤＴＴ）又はメルカプトエタノール
又はグルタチン又はシステインにより約６０℃及び約8.
5のpHにて還元した後に、10,000の分子量のカットオフ
の限外濾過膜を用いて蒸留水又はアルコールの水性混合
物に対してダイアフィルトレートして蛋白質の凝集を回
避することを含む。アルコールの例にはエタノール、ブ
タノール、グリセリン、マンニトール、ソルビトール、
デキストロース等が含まれる。

本発明の問題解決策は、精製された蛋白質プールのpHを
まず約２〜４に調整し、あらかじめ２〜４のpHに調整さ
れた安定剤を添加し、場合によってはこの混合物をイン
キュベートし、そしてそのpHを6.8〜7.8に上昇せしめる
ことを含む。インキュベーション時間は、主として蛋白
質のタイプ、安定剤のタイプ、正確なpH、並びに蛋白質
及び安定剤の濃度に依存し、そして典型的には０〜100
分間、好ましくは10〜100分間、さらに好ましくは15〜6
0分間、そして最も好ましくは15〜45分間の範囲であ
る。

さらに、他のしかしあまり好ましくない観点において、
この発明の問題解決策はpHが低い場合であり、安定剤及
び蛋白質プールを一緒に混合し、そして混合物をpHを２
〜４に調製し、そしてこのpHを徐々に又は一度に6.8〜
7.8に上昇せしめる。

従ってこの発明は、ＳＤＳレベルが毒性レベルより低く
そして適当なキュリヤー媒体中療法に許容される製剤に
再構成され得る比較的高純度の親油性組換蛋白質の回収
方法、及びＳＤＳレベルが１０p.p.m.未満であって通常
２〜６p.p.m.の範囲にある親油性蛋白質組成物、最も好
ましくはβ−HIFN組成物に関する。

この発明を実施するために、細菌が好ましい微生物宿主
であり、Ｅ．コリが最も好ましい。

一般に、蛋白質は高アルカリ性pH範囲において変性、ペ
プチド結合加水分解、個々のアミノ酸の加水分解、β−
エリミネーション、ラセミ化、異るアミノ酸の形成及び
類似の反応に対して感受性であるが、しかしβ−HIFNに
ついては、上記の分解的反応は検出されない。他方、こ
の蛋白質が約１１のpHにおいてダイアフィルトレートさ
れる場合、得られるβ−HIFNは純粋で且つ均一であり、
そして天然β−HIFNの比活性に近い高い比活性を示す。

この発明の方法の好ましい態様においては、破砕された
細胞を処理してβ−HIFN蛋白質を単離しそして精製し、
そして次に下記の段階を行う。

(ｒ)蛋白質をＧ２５クロマトグラフィーによりpH9.2〜1
1にて脱塩し； (ｓ)脱塩されたプールのpHを約3.5に調製し； (ｔ)ヒト血清アルブミン又は血漿蛋白質画分の溶液のpH
をpH3.5に調製し； (ｕ)前記ヒト血清アルブミン又は血漿蛋白質画分を前記
脱塩されたプールに添加し、そして15〜45分間インキュ
ベートし； (ｖ)所望により、蛋白質サンプルを凍結乾燥し；そして (ｗ)所望により、凍結乾燥された蛋白質サンプルを再溶
解する。

この発明の他の態様においては、破砕された細胞を処理
してβ−HIFN蛋白質を単離しそして精製し、そして次に
下記の段階を行う。

(ｒ)蛋白質をＧ２５クロマトグラフィーによりpH9.2〜1
1にて脱塩し； (ｓ)ヒト血清アルブミン又は血漿蛋白質画分を前記脱塩
されたプールに添加して混合物を形成し； (ｔ)前記混合物のpHを３〜４に低下せしめ； (ｕ)前記混合物を15〜45分間インキューベートし； (ｖ)所望により、蛋白質サンプルを凍結乾燥し；そして (ｗ)所望により、凍結乾燥された蛋白質サンプルを再溶
解する。

β−HIFNは好ましくは、Shaked等の米国特許No.4,530,7
87に記載されているようにｏ−ヨードソ安息香酸溶液を
用いて、又は“組換蛋白質におけるジスルフィド結合の
形成の促進方法”と題するKoths等の米国特許No.4,572,
798に記載されているように塩化銅を用いて、そのシス
テイン残基が架橋されてシスチンを形成するように酸化
される。この特許の開示を引用によりこの明細書に組み
入れる。

蛋白質を得るための詳細な方法は次の通りである。

形質転換された微生物を適当な増殖培地中で、典型的に
は680nmにて約１０以上の光学濃度（ＯＤ）に、そして
好ましくは680nmにて約50〜100のＯＤの増殖せしめる。
増殖培地の組成は使用される特定の微生物に依存するで
あろう。水性増殖培地は選択された微生物の栄養要求を
満たす化合物を含有する。増殖培地は典型的には資化性
炭素源及び窒素源、エネルギー源、マグネシウム、カリ
ウム及びナトリウムのイオン、並びに場合によってはア
ミノ酸並びにプリン及びピリミジン塩基を含有するであ
ろう。〔Review of Medical Microbiology,Lange Medic
al Publications，第１４版、80−85頁(1980)を参照の
こと。〕Ｅ．コリのための増殖培地は、当業界において
よく知られている。この発明の方法において使用される
特定の可溶化剤に依存して、該可溶化剤の水中での溶解
性を低下せしめるであろう増殖培地中の物質量を最少に
することが望ましい。例えば、カリウムイオンはＳＤＳ
の溶解性に影響を与え、そしてそのために、この方法に
おいてＳＤＳが使用される場合には最少に維持されるべ
きであり、あるいは濃縮段階後のダイアフィルトレーシ
ョンにより除去されるべきである。

培養物が所望の細胞濃度に達した後、場合によっては、
加熱により、又は細胞が死滅した後に容易に除去され得
る細胞変性剤、例えばクロロホルム又はトルエンを培地
に添加することにより、細胞死滅せしめる。次に、場合
によっては細胞を約20〜150ｍｇ／ｍｌ、好ましくは80
〜100ｍｇ／ｍｌ(680nmにおけるＯＤ：40〜300、好まし
くは160〜200)に、クロス−フロー濾過、遠心、又は他
の常用法により濃縮する。

この濃縮段階の後、微生物の細胞壁を破砕して濃縮物中
の粒状物の可溶化を促進する。生物学的活性についての
蛋白質アッセイは、蛋白質の多くが細胞膜に関連付けら
れている（すなわち、その中に含有されているか、又は
それに結合している）ことを示す。従って、細胞膜の破
壊が可溶化剤と膜との接触を増強し、そしてそれ故に膜
の関連付けられているインターフェロンが溶液中に移行
する速度を上昇せしめる。常用の細胞破砕技法、例えば
均質化(homogenization)、音波処理(sonication)、又は
圧力循環(pressure cycling)を本発明のこの段階におい
て使用することができる。必要であれば、破砕の前又は
後に、それぞれ濃縮物又は破砕物の液相のpHを、該濃縮
物又は破砕物中の可溶化剤及び粒状物の溶解を促進する
レベルに調整する。適当な緩衝液を添加することによ
り、又はNaOHによりpHをそのように調整することができ
る。ほとんどの場合、約７〜約８の範囲のpHが好まし
い。

破砕された細胞を処理するために種々の技法を使用する
ことができる。１つの方法においては、細胞が破砕され
た後、粒状物を破砕物中液相から分離し、そして可溶化
のために最適なpHに緩衝化された水性媒体中に再懸濁す
ることができる。可溶化後の細胞懸濁液の蛋白質濃度は
約２〜約１５ｍｇ／ｍｌ、好ましくは６〜８ｍｇ／ｍｌ
の範囲である。

親油性組換蛋白質を含む粒状細胞材料の可溶化は、破砕
と同時に又は破砕の後に引き続いて行うことができる。
破砕後の別個の段階として行うのが好ましい。可溶化は
好ましくは完全に行う。すなわち、破砕物中の粒状物
（例えば、蛋白質、脂質、核酸、リン酸質）の実質上す
べてを水性媒体中に溶解せしめる。粒状物の実質的に完
全な溶解は、適当な可溶化剤を水性懸濁液に添加するこ
とによって達成される。蛋白質を可溶化するために適切
な疎水性−親水性バランスを有し、そして有機相に抽出
され得る蛋白質と複合体を形成する界面活性剤（洗剤）
をこの発明において使用することができる。天然又は合
成強陰イオン界面活性剤、例えば脂肪酸のアルカリ金属
塩及びアルカリ金属アルキルサルフェーを使用すること
ができる。このように界面活性剤は通常10〜14個の炭素
原子を含有するであろう。ＳＤＳ及びラウリン酸ナトリ
ウムが特に好ましい可溶化剤である。この発明の方法に
おいて使用することができる他の可溶化剤の例には、ド
デシルスルホン酸ナトリウム、デシル硫酸ナトリウム、
テトラデシル硫酸ナトリウム、トリデシルスルホン酸ナ
トリウム、ミリスチン酸ナトリウム、カプロン酸ナトリ
ウム、カプリル酸ナトリウム、ナトリウムドデシルＮ−
サルコシネート、及びナトリウムテトラデシルＮ−サル
コシネートが含まれるがこれらに限定されない。

可溶化において使用される可溶化剤の量は特定の可溶化
剤及び可溶化されるべき蛋白質の量に依存する。ほとん
どの場合、約１：１〜10：１の可溶化剤と蛋白質の重量
比で十分である。ＳＤＳが使用される場合、約１：１〜
約５：１、好ましくは約３：１のＳＤＳ対蛋白質の比率
が使用される。15℃〜60℃の範囲の温度が一般に可溶化
において使用される。溶液と粒状物との間の接触を増強
し、そしてそれによって細胞材料を溶解するために必要
な時間を短縮するために混合を用いることができる。溶
液が実質的に透明である場合に可溶化が完全であると考
えられる。280nmにおける約4.0〜8.0の光学濃度が可溶
化工程の終点に特徴的である。

可溶化の後、必要であれば、溶液のイオン強度を、該溶
液と有機抽出剤とが実質的に不混和性であるレベルに調
整する。イオン強度は約0.05〜0.15の範囲である。この
目的のため、Nacl及び／又はこれに類似するものを包含
する無機塩を溶液に加える。このようなイオン強度が、
抽出後の相分離を可能にする。この工程で使用される抽
出剤はアルコール、例えば２−ブタノール、２−メチル
−２−ブタノール、又はこれらの混合物である。混合物
は好ましくは５０容量％未満の２−メチル−２−ブタノ
ールを含有する。２−ブタノールが好ましい抽出剤であ
る。可溶化物から親油性蛋白質を抽出するこれらのアル
コールの能力は特異的である。抽出物は一般に蛋白質の
水性溶液と約0.8：１〜約３：１、好ましくは約１：１
（抽出剤：水性溶液）の範囲の容量比で混合される。抽
出は常用の回分式又は連続式液−液抽出技法及び装置を
用いて行うことができる。抽出は一般に約20℃〜100℃
にて行い、約１分間〜１時間の接触時間を用いる。最適
接触時間は特定の可溶化剤及び抽出剤の組合わせに依存
する。ＳＤＳを使用する場合、上記の範囲内で短い時間
を用いることができる。ラウリン酸ナトリウムを使用す
る場合、上記範囲内で長い時間を用いなければならな
い。抽出混合物のpHは約６〜９の範囲であり、ＳＤＳを
使用する場合には約7.5のpHが好ましく、そしてラウリ
ン酸ナトリウムを使用する場合、約8.5のpHが好まし
い。

抽出が完了した後、水相及び抽出物相を分離し、そして
抽出物相から蛋白質を単離する。使用する特定の単離法
は使用する可溶化剤、及び最終生成物の純度の所望され
る程度に依存する。種々の単離技法、例えば沈澱、分子
篩クロマトグラフィー、アンフィニティークロマトグラ
フィー、及び電気泳動等を使用することができる。ＳＤ
Ｓを使用する場合、抽出物溶液を水性緩衝液と約2.0：
１〜約５：１、好ましくは約3:1の容量比で混合し、そ
してpHを典型的には約５〜７の範囲に下げることによ
り、目的の親油性蛋白質を他の蛋白質と一緒に抽出物か
ら沈澱せしめる。第２図に示すように、pH４〜８の範囲
におけるβ−HIFNの回収は、pHの上昇に従って蛋白質の
回収が下降する傾向にあることを示しており、約８のpH
においては約６０％より多く回収ロスが生ずる。上清か
らの沈澱物の分離及び該沈澱からの残留抽出剤の蒸発に
より、沈澱段階のpHが5.5より高い場合、蛋白質純度が
約９０％より高い生成物が得られる。この生成物はさら
に微量の核酸（１ｗ％未満〜２ｗ％）及びＳＤＳ（１ｗ
／ｖ未満）を含有する。当業界において公知の方法（ク
ロマトグラフィーを含むがこれに限定されない）により
さらに精製した後、ＳＤＳを、この発明の１つの態様に
おいてはpH約10.5〜12.5、好ましくはpH約１２でのダイ
アフィルトレーションにより除去することができる。第
２精製段階は任意的であり、そしてダイアフィルトレー
ションによるＳＤＳの除去のためには必要でない。可溶
化剤としてラウリン酸ナトリウムを使用する場合、pHを
下げた後に、これは蛋白質と一緒に抽出物から沈澱す
る。有機溶剤、例えばアセトン、メタノール等を用いて
蛋白質からラウリン酸ナトリウムを抽出する。ダイアフ
ィルトレーションに先立って、蛋白質を適当な還元剤に
より還元する。この目的のためにメルカプトエタノー
ル、グルタチオン、システイン及びジチオスレイトール
（ＤＴＴ）を用いることができ、ＤＴＴが最も好まし
い。

次に、こうして単離された蛋白質を上記の安定剤を用い
て水性キャリヤー媒体中に可溶化する。しかしながら、
可溶化が生ずるためには、安定剤を単に蛋白質に混合す
ることはできない。まず、適当な塩基を用いて安定剤の
pHを10.5〜12.5に、込ましくは約１２に上昇せしめなけ
ればならず、次にこの安定剤をpH10.5〜12.5のダイアフ
ィルトレートされた蛋白質プールに加え、そして最後に
得られた配合物のpHを約6.8〜7.8に低下せしめる。pHを
下げた後、蛋白質は媒体中に可溶化する。

破砕された細胞を処理するための他の方法が第４図
（ａ）及び第４図（ｂ）に示されている。この図は異種
性蛋白質を含有する屈折体を微生物宿主から回収する方
法を要約したものである。この方法においては、蛋白質
を屈折体から抽出し、そしてＳＤＳのごとき変性剤によ
り可溶化する。後でＳＤＳを脱塩カラムにより除去す
る。溶出液のpHを２〜４に調整し、安定剤のpHの別途pH
２〜４に調整し、安定剤を溶出液に加え、この混合物場
合によっては一般に、上記の因子に依存して約10〜100
分間インキュベートし、そしてpHを6.8〜7.8に調整す
る。

他の方法においては、第５図に示すように、破砕物をチ
ャオトロピック剤(chaotropic agent)で抽出し、蛋白質
を可溶化し、そして還元し、そして還元された蛋白質を
分離し、酸化し、精製し、そして回収する。インキュベ
ーション期間を用いる低pH調整法を用いて第５図中の配
合物が得られる。

療法的又は臨床的用途のための製剤に使用されるキャリ
ヤー担体は非毒性で不活性な水性ビヒクル、例えばヒト
又は動物に投与するための薬剤を製剤するために一般に
使用されるものである。キャリヤーはさらに、それが親
油性蛋白質の生物学的活性に影響を与えないように選択
される。

このようなキャリヤーの例には蒸留水、生理的塩水、リ
ンゲル溶液、デキストロース溶液、及びハンク溶液が含
まれる。凍結乾燥された親油性蛋白質を再溶解するため
に同じキャリヤーを使用することができる。

本発明の医薬組成物は、好ましくは非経口投与、特に好
ましくは皮下投与により投与され、β−インターフェロ
ンのユニットとして大人１人あたり4,500,000〜99,000,
000ユニット／日で投与される。本発明の医薬をマウス
に投与した場合、マウスが物理的に受容できる量におい
て、死をもたらさなかった。

次の例により、この発明をさらに説明する。これらの例
は説明のために記載するものであり、この発明の範囲を
なんら限定するものではない。これらの例において特に
ことわらない限り、すべての部及び％は固体については
重量基準であり、そして液体については容量基準であ
る。すべての温度は℃で示す。

例１． IFN-β_ser17は微生物的に生産されたIFN−βのミューテ
インであり、アミノ酸位置１７のシステインがセリン残
基により置き換えられている。IFN_ser17は２個の残りの
アミノ酸残基を有し、１つは位置３１に依存し、そして
他方は位置１４１に存在する。天然IFN−βにおいて、
位置３１及び141のシステインは相互反応してジスルフ
ィド橋を形成する。IFN-β_ser17を製造するためにこの
例において使用される遺伝子操作されたＥ．コリ株は、
アメリカン・タイプ・カルチュアー・コレクション、12
301パークラウンドライブ、ロックビル、メリーランド2
0852、米国に、1983年11月18日に受託番号No.39,517と
して寄託されている。

上記の遺伝子操作されたＥ．コリを下記の培地中で増殖
せしめた。

ダウコーニング・アンチホールＢの２５％溶液、グルコ
ールの５０％溶液、及び5N KOHを必要により添加した。

温度は３７±１℃に保持し、pHはNaOHにより6.5±0.1に
保持し、そして溶存酸素は空気飽和の３０ｗ／ｗ％に保
持した。光学濃度及び残留グルコース測定値を１４時間
目、及びその後約１時間ごとに取った。グルコースの消
費が４０±６ｇ／(680nmでのＯＤ＝10〜11)に達した
時、取得を行った。

取得材料を加圧下で微細孔クロス−フローフィルターを
通して循環せしめることによりそれを約３倍に濃縮し
た。取得材料が４〜５倍に濃縮されるまで、濃縮された
細胞を脱イオン水に対してダイアフィルトレートした。
次に、細胞をManton-Gualinホモジナイザーに4.1〜5.5
×10⁴kpa(0.6〜0.8psi)で通すことにより細胞を破砕し
た。最初の通過の後、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤ
Ｓ）−リン酸ナトリウム緩衝液を、２ｗ／ｖ％（ＳＤ
Ｓ）及び0.08Ｍリン酸ナトリウムの最終濃度となるよう
に添加し、そして可溶化を１時間続けた。次に、固体ジ
チオスレイトール（ＤＴＴ）を５０ｍＭの最終濃度に加
え、そしてホモジネートを９０±５℃に１０分間加熱し
た。得られた細胞懸濁液を２−ブタノールにより、２−
ブタノール：懸濁液の容量比１：１として静置ミキサー
中で抽出した。次に、混合物を遠心し、そして２−ブタ
ノール−リッチ相を集めた。

２−ブタノール−リッチ相をリン酸緩衝化塩溶液（ＰＢ
Ｓ）中0.1ｗ／ｖ％ＳＤＳの2.5容量と混合した。固体Ｄ
ＴＴを１ｍＭの最終濃度に加えた。混合物をpHの氷酢酸
により6.2±0.1に調整し、そしてこの混合物を遠心し
た。生じたペーストを集め、そして1N NaOHによりpHを
8.5±0.1に調整しながら、ＰＢＳ及び１０ｗ／ｖ％ＳＤ
Ｓの混合物に再懸濁した。固体ＤＴＴを100ｍＭの最終
濃度に加え、そして懸濁液を９０±５℃に１０分間加熱
した。次に、この懸濁液を約２５℃に冷却し、氷酢酸に
よりpHを5.5±0.1に調整し、そして溶液を濾過した。

次にこの溶液を、１％ＳＤＳ、５０ｍＭ酢酸ナトリウ
ム、１ｍＭ EDTA(pH5.5)から成る緩衝液と共にセファ
クリルＳ−200プレカラムに適用した。最高のインター
フェロン活性を含む画分をプールし、そして１０キロダ
ルトン分子量カットオフの限界濾過により濃縮した。

Shaked等、前掲、の方法を用いて蛋白質を酸化してスル
ヒドリン結合を生じさせた。０−ヨードソ安息香酸を水
中で混合し、混合物を約５分間音波処理し、そして撹拌
しそして２％NaOHをゆっくりと加えて8.2±0.2の最終pH
を得ることにより１ｍＭ０−ヨードソ安息香酸溶液を調
製した（塩基の添加に代えて追加の音波処理を用いるこ
とができる）。

Na₄P₂O₇・10H₂Oを２ｍＭの濃度に水を溶解することによ
り反応緩衝媒体を調製した。１０％酢酸を加えることに
よりこの溶液のpHを9.0に調整し、そしてＳＤＳを0.1％
に、そしてエチレンジアミン四酢酸(EDTA)を１ｍＭに、
０−ヨードソ安息香酸溶液を１５μＭになるように、溶
液に添加した。

緩衝媒体を、マクネチックスターラー及び9.0にセット
したpH電極を装着した反応容器に入れた。

IFN−_ser17調製物及び０−ヨードソ安息香酸溶液を、保
持容器から、等モル比のＩＦＮ及び酸化剤導入するよう
に調整されたペリスタルポンプを用いて反応混合物に導
入した。必要に応じて0.25Ｍ NaOHをペリスタルポンプ
を介して５ｍｌ／時で加えることにより、反応混合物を
pHを9.0に調節した。IFN−β溶液〔５０ｍＭ酢酸緩衝液
(pH5.5)中５ｍｇ／ｍｌ〕を２ｍｌ／時(7.0μmol／時）
の流速で約７時間添加し、０−ヨードソ安息香酸溶液を
７ｍｌ／時(7.0μmol／時）で同じ時間を加えた。その
後酸溶液の添加を続けて10〜15μＭの最終過剰量とし
た。反応を、逆相HPLCにより及びEllmanアッセイにより
IFN−β_ser17の残留チオール含量をアッセイすることに
より追跡した。6.5時間後、１０％酢酸を反応混合物に
加えてpHを5.5にすることにより反応を停止した。

次に、0.1％ＳＤＳ、１ｍＭEDTA及び５０ｍＭ酢酸ナト
リウム(pH5.5)から成る緩衝液を用いてセファクリル−2
00カラム上に生成物を負荷した。このカラムからのモノ
マーピークをプールし、そして0.1％ＳＤＳ、１ｍＭ E
DTA、及び５０ｍＭ酢酸ナトリウム(pH5.5）から成る緩
衝液を用いてセファデックスＧ−75カラム上にプールし
た。

Ｉ．ＰＰＦ配合Ｇ−75プールからの合計２２ｍｌのIFN−β（IFN−β1.
3mg/ml）の全部を、pH１１の緩衝液により平衡化された
脱塩Ｇ２５セファデックスカラム上に負荷した。合計4.
46ｍｌの2.2％の血漿蛋白質画分（ＰＰＦ）をpH３に調
整し、そして0.25ｍｇ／ｍｌのIFN−βを含有する5.56
ｍｌの脱塩ＩＦＮに加えた。ＰＰＦはコーンフランクシ
ョン(Cohn Fraction) ＩＶ₁に由来する。ＰＰＦはＨＳＡに類似するが、ＰＰ
Ｆはより多くのα−及ひβ−グロブリンを有する。フラ
クションＩＶ₁は最高量のα−及びβ−グロブリンを有
する。IFN−β及びＰＰＦの混合物を約４５分間インキ
ュベートし、そしてpH7.4に調整した。

II．PPF/HSA配合合計３０ｍｌの上記Ｇ−75IFN−βプールを10.5ｍｌに
濃縮し、そしてpHを１１に調整した。pH１１に十分に平
衡化したＧ２５セファデックスカラム上で濃縮物を脱塩
した。ＩＦＮの脱塩されたプールを使用して次の実験を
行った。

0.25ｍｇ／ｍｌのＩＦＮを含有する合計3.33ｍｌの脱塩
IFN−βを各実験において使用し、そして各混合物をpH
をインキュベーション前に３に調整し、そしてインキュ
ベーション後7.3〜7.5に調整した。結果を次の表に示
す。

視覚的に試験した場合、ＰＰＦ配合物が最良の透明度を
有し、５％ＨＳＡが次に良く、2.5％ＨＳＡがこれに続
くことが見出された。各配合物を凍結乾燥し、そして水
で再溶解した場合、ＨＳＡ配合物に比べてＰＰＦ配合物
がより透明に再溶解された。

インキュベーション期間を伴わないでpH３〜４にて行わ
れた実験は、インキュベーション期間を経験した実験か
らの明らかな差異を示さないようであった。しかしなが
ら、ＰＰＦの濃度の変化は透明度の顕著な差異をもたら
した。

pH３配合物を最適化するための実験は、５％ＨＳＡ配合
物が2.5％ＨＳＡ配合物に比べて明らかに良好であるこ
とを示した。さらに、１５分間から６０分間へのインキ
ュベーション時間の延長が溶解性を助けた。しかしなが
ら、５％ＨＳＡ１５分間のインキュベーションは2.5％
ＨＳＡ６０分間のインキュベーションより良好であるこ
とが見出された。

上記の結果は、IFN−βのためにはＰＰＦがＨＳＡより
も良好な安定剤であることを示している。さらに、pH３
での代表的な配合された蛋白質の生物学的活性の試験
は、IFN−βが生物学的に活性であることを示した。

III．低pHマンニトール配合 pHが２〜４に保持され、そしてpH２〜４において凍結乾
燥される場合、２〜４の低pHにて組換βインターフェロ
ン製剤を安定化するために安定剤を使用することができ
る。しかしながら、pHが４以上に上昇すればマンニトー
ルのごとき炭水化物安定剤は親油性蛋白質を安定化する
ために機能しないであろう。pHが生理的pHに上昇する場
合、ＨＳＡのごとき蛋白質安定剤のみが蛋白質を可溶化
するであろう。

〔結論〕

この明細書に記載したこの発明の方法及び組成物が、比
較的高純度であり、残留ＳＤＳレベルが約１０ppm未満
であり、そして臨床及び療法用の非毒性の不活性な生理
的に許容されるキャリヤー媒体中療法的に許容される調
整物に製剤化され得る親油性蛋白質調製物をもたらす。
この発明の主たる利点は、蛋白質調製物中のＳＤＳレベ
ル（若干の患者において肝臓毒性を相乗し得）が約２〜
２０p.p.m.に、好ましくは約２０p.p.m.未満に、そして
さらに好ましくは約２〜６p.p.m.に（これらは療法的に
許容される）低下する点にある。記載された好ましい具
体例は特にβ−HIFNに関するが、この発明の精製法はβ
−HIFNに類似する親脂性を有する他の蛋白質の精製に使
用することができる。

以上、この発明の好ましい態様を記載したが、この発明
の範囲がこの範囲に限定されるものではない。

【図面の簡単な説明】

第１図（ａ）及び第１図（ｂ）は、この発明の工程段階
のフローチャートを示し、この場合pHはダイアフィルト
レーション中アルカリ性pHに上昇せしめる。第２図は、組換ヒトβ−インターフェロンの全体に対す
る回収の％及び沈澱段階中の生成物の純度を、約４〜８
の範囲でのpHの関数としてプロットしたグラフである。第３図は、組換ヒトβ−インターフェロンの抗ウイルス
活性を約６〜１２の範囲でのpHの関数としてプロットし
たグラフである。第４図（ａ）及び第４図（ｂ）は、この発明の工程段階
のフローチャートを逐次的に示しており、この方法にお
いては蛋白質は屈折体から回収され、そしてpHは安定剤
添加のために酸性pHに低げられる。第５図は、この発明の工程段階のフローチャートであ
り、この方法においては蛋白質が抽出されそして安定化
され、そして安定剤添加のためpHが酸性pHに下げられ
る。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者テランスタフォロアメリカ合衆国，カリフォルニア 94611, オークランド，サマセツトロード 379 エー (56)参考文献特開昭60−59000（ＪＰ，Ａ)

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】蛋白質のための安定剤を含有する非毒性で
不活性な療法的に適合性の水性キャリヤー媒体中に溶解
した生物学的に活性な組換β−HIFNの療法的有効量を含
んで成る界面活性剤を実質上含有しない安定な医薬組成
物又はその凍結乾燥医薬組成物。
【請求項２】前記安定剤がヒト血漿蛋白質画分であり、
そして0.1〜５ｗ／ｖ％の量で存在する、特許請求の範
囲第１項に記載の組成物。
【請求項３】前記安定剤がヒト血清アルブミンであり、
そして約0.5〜10ｗ／ｖ％の濃度範囲で存在する、特許
請求の範囲第１項に記載の組成物。
【請求項４】前記安定剤がヒト血清アルブミンとデキス
トロースとの混合物であり、そしてそれぞれが1.25ｗ／
ｖ％の量で存在する、特許請求の範囲第１項に記載の組
成物。
【請求項５】β−HIFNの有効量が前記キャリヤーml当り
0.1〜１mgの範囲である、特許請求の範囲第１項に記載
の組成物。
【請求項６】β−HIFNが_ser17IFN−βである特許請求の
範囲第１項に記載の組成物。
【請求項７】蛋白質のための安定剤を含有する非毒性で
不活性な療法的に適合性の水性キャリヤー媒体中に溶解
した生物学的に活性な組換β−HIFNの療法的有効量を含
んで成る界面活性剤を実質上含有しない安定な医薬組成
物又はその凍結乾燥医薬組成物の製造方法であって、β
−HIFNを生産するために形質転換された宿主細胞の細胞
壁を破砕した後に、（ａ）β−HIFNを含有し界面活性剤を実質上含有しない
媒体のpHを２〜４に調製する段階；（ｂ）β−HIFN媒体に、２〜４のpHにあらかじめ調整し
ておいたβ−HIFNのための安定剤を添加する段階；及び（ｃ）生じた組成物をpH２〜４において凍結乾燥段階；をこの順序で含んで成る方法。
【請求項８】前記安定剤がマンニトールである、特許請
求の範囲第７項に記載の方法。
【請求項９】β−HIFNが_ser17IFF−βである、特許請求
の範囲第７項に記載の方法。
【請求項１０】蛋白質のための安定剤を含有する非毒性
で不活性な療法的に適合性の水性キャリヤー媒体中に溶
解した生物学的に活性な組換β−HIFNの療法的有効量を
含んで成る界面活性剤を実質上含有しない安定な医薬組
成物又はその凍結乾燥医薬組成物の製造方法であって、
β−HIFNを生産するために形質転換された宿主細胞の細
胞壁を破砕した後に、（ａ）β−HIFNを含有し界面活性剤を実質上含有しない
媒体のpHを２〜４に調製する段階；（ｂ）β−HIFN媒体に、２〜４のpHにあらかじめ調整し
ておいたβ−HIFNのための蛋白質安定剤を添加する段
階；及び（ｃ）生ずる組成物のpHを6.8〜7.8に上昇せしめる段
階；をこの順序で含んで成る方法。
【請求項１１】β−HIFNが_ser17IFN−βである、特許請
求の範囲第１０項に記載の方法。
【請求項１２】蛋白質のための安定剤を含有する非毒性
で不活性な療法的に適合性の水性キャリヤー媒体中に溶
解した生物学的に活性な組換β−HIFNの療法的有効量を
含んで成る界面活性剤を実質上含有しない安定な医薬組
成物又はその凍結乾燥医薬組成物の製造方法であって、
β−HIFNを生産するために形質転換された宿主細胞の細
胞壁を破砕した後に、（ａ）β−HIFNを蛋白質安定剤と混合して界面活性剤を
実質上含有しない組成物を得、そして該組成物のpHを２
〜４に調整する段階；及び（ｂ）生ずる組成物のpHを6.8〜7.8に上昇せしめる段
階；をこの順序で含んで成る方法。
【請求項１３】段階（ａ）の直前に、β−HIFNをクロマ
トグラフィーによりpH9.2〜11において脱塩する、特許
請求の範囲第12項に記載の方法。
【請求項１４】β−HIFNが_ser17IFN−βである、特許請
求の範囲第12項に記載の方法。