JPH0566960B2

JPH0566960B2 -

Info

Publication number: JPH0566960B2
Application number: JP60186877A
Authority: JP
Inventors: Kazuo Nitsuta; Takehiko Kunimoto; Hiroyasu Baba; Hidemasa Ogawa; Keiki Sato
Original assignee: Daiichi Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Daiichi Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1985-08-26
Filing date: 1985-08-26
Publication date: 1993-09-22
Also published as: JPS6248631A

Description

【発明の詳細な説明】

（目的）産業上の利用分野本発明は抗腫瘍血清因子に関するものである。従来の技術放線菌多糖体が抗腫瘍作用を有することが知ら
れている（特開昭59−124901号公報参照）。解決しようとする問題本発明者は、上記の多糖体が哺乳動物に投与さ
れた際に血清中に出現するタンパクが、それ自体
は直接の抗腫瘍作用を示さないが、生体に投与さ
れた場合に腫瘍を退縮させる作用を有することを
見出し、本発明を完成した。（構成）本発明は多糖体DN9769を投与された担癌ラツ
トの血清から分離精製されたタンパクである抗腫
瘍血清因子およびその製法に関するものである。用いる多糖体は前掲公報に製造法および物性が
示されているが、特に、PA−25と表示されてい
るDN9769物質が適当である。ラツトはドンリウ、バツフアロー、ウイスター
等の種類が適当であり、これに常法によつて
AH130，AH13，AH44，AH64，，AH66、吉田
肉腫、ウオルカー256等の癌細胞を接種し、担癌
ラツトを作る。その10日乃至20日後に多糖体を腹腔内等に投与
すると通常10〜30時間後に血清中に抗腫瘍因子の
生成が認められる。すなわち、この血清を担癌マ
ウスに投与すると腫瘍塊が縮小し、その中の生細
胞数が減少することが確認された。抗腫瘍血清因子を分離するには、ラツト血清を
ハイドロキシルアパタイト（バイオラド社、アメ
リカ）のカラムに付し、適当な濃度、例えば0.06
〜0.3Mのリン酸バツフアー（PH6.8）で溶出さ
せ、活性のある分画、例えば0.3Mでの溶出分画
をとり、必要に応じて濃縮し、セフアクリルＳ−
300スーパーフアイン（フアルマシア社、スウエ
ーデン）のカラムに付し、適当な溶出液、例えば
0.5M食塩含有0.02Mトリス塩酸バツフアー（PH
7.2）で溶出させ、比活性の最も大きい分画を取
り、FAとする。 FAは透析などで塩化ナトリウムなどの塩類お
よび低分子量物質を除いた後、DEAEトヨパール
（東洋曹達）のカラムに付し、トリス塩酸バツフ
アー（PH8.6）を用い食塩濃度勾配により溶出を
行なう。最初に溶出してくる分画が比活性が大で
あるのでこれを取り、FA−１とする。実施例１：抗腫瘍血清因子を含む血清の調製６週令の雄SPFドンリウ（Donryu）ラツトに、
ラツト同種腫瘍AH130腹水肝癌細胞１×10⁷個を
背部皮下に移植した。移植後14日目に
DN9769100mg／Kgを腹腔内投与し、24時間後に
エーテル麻酔下、腹大動脈より全採血を実施し
た。血液は採取後１時間静置し、遠心操作により
血清を分離した。この血清のＳ−180に対する抗腫瘍活性値は２
単位／mlであつた。又、バイオラドプロテインアツセイ液（バイオ
ラド社、米国）を用いて測定した蛋白１mg当りの
活性は0.025単位であつた。実施例２：フラクシヨンFAの製法とその活性あらかじめ0.02Mリン酸バツフアー（PH6.8）
で平衡化したハイドロキシルアパタイト（バイオ
ラド社、米国）をつめたカラム（径4.8cm、長さ
22cm）に実施例１で得た血清100mlをかけ、同バ
ツフアー500mlで洗つた後、順次、0.06M，
0.15M，0.30Mのリン酸バツフアー（PH6.8）の各
500mlで同カラムから各成分を溶出した。各濃度
のバツフアー溶出液の蛋白含有フラクシヨンを集
め、それぞれ48ml、75ml、及び65mlを得た。それ
ぞれのフラクシヨンの蛋白量（バイオラドプロテ
インアツセイ液、ウシ血清アルブミン（BSA）
標準）及び活性は表１に示す。表１ハイドロキシルアパタイトカラム溶出分画
の抗腫瘍効果（Ｓ−180）

【表】ここで最も活性の高かつた0.3Mリン酸バツフ
アー溶出画分を分子量１万３千カツト限外濾過ホ
ローフアイバーHC（旭化成）を用いて15mlに濃
縮した。この濃縮液を、0.5Mの食塩を含む
0.02Mトリス塩酸バツフアー（PH7.2）であらか
じめ平衡化したセフアクリルＳ−300スーパーフ
アイン（フアルマシア社、スエーデン）をつめた
カラム（直径4.4cm、長さ88cm）にかけ、同バツ
フアーで溶出させるゲル濾過を行なつた。溶出液
はOD₂₈₀でモニターし、一フラクシヨン15mlで分
画を行つた。溶出パターンを第１図に示す。フラ
クシヨンNo.30〜35をFA，No.36〜44をFB，No.45〜
51をFCとし、それぞれの蛋白含量及び活性を表
２に示す。表２セフアクリルＳ−300カラム溶出
画分（FA，FB，FC）の抗腫瘍効果（Ｓ−180）

【表】実施例３：フラクシヨンFA1の製法、物性と抗腫
瘍活性実施例２で得たFAを0.05Mトリス塩酸バツフ
アー（PH8.6）に対し、４℃、20時間透析した。
この透析液を、同バツフアーで平衡化したDEAE
トヨパール650（東洋曹達）をつめたカラム（径
2.2cm、長さ45cm）にかけた。同バツフアー500ml
でカラムを洗浄した後、同バツフアー300mlと
0.5M食塩を含む同バツフアー300mlを用いる直線
的濃度勾配で溶出した。溶出パターンはOD₂₈₀で
モニターし、一分画15mlで分画分取した。この時
の溶出パターンを第２図に示す。食塩濃度約0.09〜0.12Mの所に溶出される画分
（フラクシヨンNo.13〜15）に強い活性が見出され、
この画分をFA1とした。FA1中には、約6.6mgの
蛋白が含まれ（バイオラドプロテインアツセイ
法、BSA標準）、その活性は82単位／mg蛋白であ
つた。FA1の物理化学的、生物学的性状は、以下
のとおりである。 (1) 紫外部吸収：λmax273nm（E¹%_1cn＝35.8）（第
３図参照） (2) 分子量：20万以上（ゲル濾過法） (3) 糖含量：0.16mg／mg蛋白（フエノール硫酸
法、グルコース標準） (4) アミノ酸組成（％）：（FA1の171μｇを塩酸
で、110℃24時間加水分解したものについて分
析）アスパラギン酸13.0、スレオニン8.6、セ
リン8.9、グルタミン酸12.1、プロリン6.1、グ
リシン9.3、アラニン8.0、シスチン（1/2）（除
外）、バリン8.5、メチオニン０、イソロイシン
5.1、ロイシン9.1、チロシン０、フエニルアラ
ニン０、ヒスチジン０、リジン7.7、アルギニ
ン3.7、トリプトフアン（除外） (5) FA1のＳ−180に対する抗腫瘍効果 JCL：ICR雌マウス（６週令）の皮下にＳ−
180腫瘍細胞を移植し、腫瘍移植後13，18，24日
目の３回FA1の70μｇを尾静脈より静脈内投与し
た。腫瘍移植後33日目に屠殺し、腫瘍重量を測定
し、FA1投与群（Ｔ）と無処置投与群（Ｃ）の平
均腫瘍重量の比（Ｔ／Ｃ、％）で腫瘍増加抑制効
果を求め、結果を表３に示した。

【表】＊＊無処置群に対する有意差（Ｐ＜0.01）１腫瘍移植日を第０日とした時の経過日数２無処置群を100％とした時の腫瘍重量の割合３各群全匹中の腫瘍消失マウスの数参考例１：被験検体の抗腫瘍評価法６〜８週令のICRマウス（雌）に５×10⁶個の
Ｓ−180腫瘍細胞を皮下に移植する。移植12〜16
日後に被験検体を尾静脈より静脈内に投与し、24
時間後にマウスを屠殺し、腫瘍塊を摘出する。そ
れを細切後約0.15ｇを秤量し、0.125％トリプシ
ン添加培地を秤量量の10倍量加え、37℃２時間イ
ンキユベートすることにより細胞懸濁液を得る。
得られた懸濁液の生癌細胞数を計数し（Ｔ）、無
処置対照群（Ｃ）と比較し、Ｔ／Ｃ（％）を求め
る。ここで、Ｔ／Ｃ＝50％の効力を有する被験検
体を１単位と定義し、得られたＴ／Ｃ（％）から
各被験検体の単位を算出する。参考例２：L929に対する直接的抗細胞効果５×10⁴個のL929細胞を培地１mlと共に、24ウ
エル平底マイクロプレートの１ウエルに播種し、
被験検体25μを同時に添加し、５％炭酸ガス−
95％空気、湿度100％の条件下37℃で４日間培養
を行つた。はがれた細胞を洗い流した後、接着し
ている細胞を0.25％トリプシン溶液で処理し、細
胞懸濁液を得、そこに含まれる細胞数（Ｔ）を算
定した。生理食塩水のみ添加した群を対照群
（Ｃ）として、その抗細胞効果をＴ／Ｃ（％）とし
て求め、結果を表４に示した。なお、この時、抗
細胞効果陽性対照物質として、BGG前感作マウ
スに大腸菌内毒素（LPS）を投与して得られたマ
ウス血清を用いた。

【表】

【表】Ｔ／Ｃ（％）：無処置の細胞数を100とした時の各
処置群の細胞数の割合

【図面の簡単な説明】

第１図および第２図は溶出パターンであり、第
３図は紫外部吸収スペクトルである。

Claims

【特許請求の範囲】１多糖体DN9769を投与された担癌ラツトの血
清から分離精製され、次の物性を有するタンパク
である抗腫瘍血清因子。分子量（ゲル濾過法）：20万以上 UV吸収極大 273nm アミノ酸組成（％）：アスパラギン酸13.0、
スレオニン8.6、セリン8.9、グルタミン酸12.1、
プロリン6.1、グリシン9.3、アラニン8.0、シス
チン（1/2）（除外）、バリン8.5、メチオニン
０、イソロイシン5.1、ロイシン9.1、チロシン
０、フエニルアラニン０、ヒスチジン０、リジ
ン7.7、アルギニン3.7、トリプトフアン（除
外）Ｌ−929細胞に直接作用なし２担癌ラツトに多糖体DN9769を投与し、その
血清からハイドロキシルアパタイトおよびセフア
クリルＳ−300で分離後、DEAEトヨパールに吸
着させ、食塩含有0.05Mトリス−塩酸バツフアー
で溶出させ、次の物性分子量（ゲル濾過法）：20万以上 UV吸収極大 273nm アミノ酸組成（％）：アスパラギン酸13.0、
スレオニン8.6、セリン8.9、グルタミン酸12.1、
プロリン6.1、グリシン9.3、アラニン8.0、シス
チン（1/2）（除外）、バリン8.5、メチオニン
０、イソロイシン5.1、ロイシン9.1、チロシン
０、フエニルアラニン０、ヒスチジン０、リジ
ン7.7、アルギニン3.7、トリプトフアン（除
外）Ｌ−929細胞に直接作用なしを有するタンパクを得ることを特徴とする抗腫瘍
血清因子の製法。