JPS6322526A - 肝細胞増殖因子 - Google Patents
肝細胞増殖因子Info
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Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
- C07K14/4753—Hepatocyte growth factor; Scatter factor; Tumor cytotoxic factor II
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
- A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
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- A—HUMAN NECESSITIES
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
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Description
【発明の詳細な説明】
産業上の利用分野
本R明Lt、肝細胞増殖因子(hepatocyteg
rowth factor : HG F ) 、詳
しくはヒト血液に山来し、肝細胞の増殖を可能とする新
しい蛋白性物質に関する。
rowth factor : HG F ) 、詳
しくはヒト血液に山来し、肝細胞の増殖を可能とする新
しい蛋白性物質に関する。
従 来 の 技 術
肝臓は、生体内中間代謝の中心的役割を果たすi!5度
に分化の進んだ原性器官であり、その機能は肝臓を構成
する肝実質細胞が担っている。しかして、例えばラット
の肝臓はそのほぼ2/3を切除しても、残された組織が
急速に増殖を開始し、約10日後には元の大きざに戻る
ことが知られ、この事実を利用して、ヒトでも肝癌jk
者等において肝組織の部分切除手術後、残された正常肝
組織からの増殖を持つ治療法が行なわれている。
に分化の進んだ原性器官であり、その機能は肝臓を構成
する肝実質細胞が担っている。しかして、例えばラット
の肝臓はそのほぼ2/3を切除しても、残された組織が
急速に増殖を開始し、約10日後には元の大きざに戻る
ことが知られ、この事実を利用して、ヒトでも肝癌jk
者等において肝組織の部分切除手術後、残された正常肝
組織からの増殖を持つ治療法が行なわれている。
上記肝臓の増殖(肝再生)機序につき、従来より各種の
研究が行なわれ、肝切除後のラットの血液中に何らかの
増殖促進因子が出現することが示唆され、該因子(ra
t hcpatocyte growth facto
r;rHG F )の部分精製に成功した例も種々報告
されている。しかしながら報告された各rHGFはその
分子艮や物理化学的性質の点で必ずしも一致せず、いま
だ不明な点が多く、またこれまでにヒトの血液中に同様
の肝細胞増殖因子が存在することを示した報告はなかっ
た。
研究が行なわれ、肝切除後のラットの血液中に何らかの
増殖促進因子が出現することが示唆され、該因子(ra
t hcpatocyte growth facto
r;rHG F )の部分精製に成功した例も種々報告
されている。しかしながら報告された各rHGFはその
分子艮や物理化学的性質の点で必ずしも一致せず、いま
だ不明な点が多く、またこれまでにヒトの血液中に同様
の肝細胞増殖因子が存在することを示した報告はなかっ
た。
本発明者らも、以前より上記肝細胞増殖促進因子につき
、鋭意研究を重ねてぎたが、その過程で劇症肝炎患3の
血清が高い肝細胞増殖活性を有すルコとを初めて見出し
た( 31oled、Res、、 6 。
、鋭意研究を重ねてぎたが、その過程で劇症肝炎患3の
血清が高い肝細胞増殖活性を有すルコとを初めて見出し
た( 31oled、Res、、 6 。
231 (1985))。
発明が解決しようとする問題点
本発明の目的は、上記本発明者らの研究に係わる劇症肝
炎患者血液中に存在する新しい肝細胞増殖因子を分離精
製して、その性質や臨床的応用のための知見を得ること
にある。
炎患者血液中に存在する新しい肝細胞増殖因子を分離精
製して、その性質や臨床的応用のための知見を得ること
にある。
問題点を解決するための手段
本発明によれば、ヒト血液に由来し以下の理化学的性質
及び生理活性を有する蛋白性物質であることを15徴と
する肝細胞増殖因子(humanhepatocyte
growth factor ; h HG F )
が1足供される。
及び生理活性を有する蛋白性物質であることを15徴と
する肝細胞増殖因子(humanhepatocyte
growth factor ; h HG F )
が1足供される。
1)SDS−PAGE (非還元条件下)による111
定分子伝が約76000〜92000である、2)肝m
胞を増殖させる活性を有する、3)80℃、10分間の
加熱処理により上記活性が失活する、 4)トリプシン消化及びキモトリプシン消化により上記
活性が失活する、及び 5)ヘパリンに強い親和性を有する。
定分子伝が約76000〜92000である、2)肝m
胞を増殖させる活性を有する、3)80℃、10分間の
加熱処理により上記活性が失活する、 4)トリプシン消化及びキモトリプシン消化により上記
活性が失活する、及び 5)ヘパリンに強い親和性を有する。
本発明hHGFの上記特性及びその他の性状については
、後記実施例において詳述する。
、後記実施例において詳述する。
本発明のhHGFは急性肝炎、慢性肝炎、肝硬変、劇症
肝炎等の肝疾患の治療乃至は肝切除術後の治療薬として
、また上記各疾患の免疫学的診断を確立するための抗原
等として有用である。更に該hl−(GFの利用によれ
ば、ヒトをはじめとじて各種動物由来の肝細胞を、該h
HGFの存在下に生体外で極めて容易に増殖、維持する
ことができ、かくして増殖、維持される肝t8胞は、例
えば肝機能等の基礎的研究用、各種ホルモンもしくは薬
剤等の肝細胞に対する作用の研究用、肝疾患治療薬等の
スクリーニング試験用等に有用であり、更に発癌試験用
及び肝炎ウィルスの生体外培養における宿主細胞として
も有用である。本発明はかかる有用な生理活性物質を提
供するものである。
肝炎等の肝疾患の治療乃至は肝切除術後の治療薬として
、また上記各疾患の免疫学的診断を確立するための抗原
等として有用である。更に該hl−(GFの利用によれ
ば、ヒトをはじめとじて各種動物由来の肝細胞を、該h
HGFの存在下に生体外で極めて容易に増殖、維持する
ことができ、かくして増殖、維持される肝t8胞は、例
えば肝機能等の基礎的研究用、各種ホルモンもしくは薬
剤等の肝細胞に対する作用の研究用、肝疾患治療薬等の
スクリーニング試験用等に有用であり、更に発癌試験用
及び肝炎ウィルスの生体外培養における宿主細胞として
も有用である。本発明はかかる有用な生理活性物質を提
供するものである。
以下、本発明のhHG Fの製造方法につき詳述する。
本発明111−IGFは、ヒト血液、殊に劇症肝炎患者
の血液より効率よく、しかも高収率で単離することがで
きる。ここで原料として用いられる血液は、常法に従っ
て1nることができ、通常は血清もしくは血漿として有
利に使用し得る。尚、劇症肝炎患者の血液としては、血
漿交換療法に際して得られる患者血漿が好適である。
の血液より効率よく、しかも高収率で単離することがで
きる。ここで原料として用いられる血液は、常法に従っ
て1nることができ、通常は血清もしくは血漿として有
利に使用し得る。尚、劇症肝炎患者の血液としては、血
漿交換療法に際して得られる患者血漿が好適である。
上記原料からの本発明hl−IGFの製造は、基本的に
はこの種の生体物質からの蛋白性物質の分離に汎用され
る通常の方法と同様にして、目的とするh)l G F
の物理的、化学的性質を利用した各種処理操作に従い実
施することができる。該処理操作としては、例えば通常
の蛋白沈澱剤による処理、限外濾過、分子ふるいクロマ
トグラフィー(ゲル濾過)、遠心分離、電気泳動、イオ
ン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグ
ラフィー、逆相クロマトグラフィー、吸着クロマトグラ
フィー、透析法、これらの組み合せ等が挙げられる。
はこの種の生体物質からの蛋白性物質の分離に汎用され
る通常の方法と同様にして、目的とするh)l G F
の物理的、化学的性質を利用した各種処理操作に従い実
施することができる。該処理操作としては、例えば通常
の蛋白沈澱剤による処理、限外濾過、分子ふるいクロマ
トグラフィー(ゲル濾過)、遠心分離、電気泳動、イオ
ン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグ
ラフィー、逆相クロマトグラフィー、吸着クロマトグラ
フィー、透析法、これらの組み合せ等が挙げられる。
特に好ましい上記操作の一例としては、まず原料、例え
ば血漿を56℃程度で約15分間加熱後、硫安分画する
ことにより、硫安温度約1.1〜2.1〜1の沈澱画分
に活性物として収1グすることができる。上記活性物は
更に例えば通常の担体を使用するゲル濾過、DEAE等
の陰イAン交操体を使用するイオン交換クロマトグラフ
ィー等により、精製Jることができる。殊に本発明者ら
の研究によれば、本発明のhHGFは、アフィゲルブル
ー(Arri−Get Blue 、 バイオ・7ト
ラホラトリ一ズ社)、ヘパリン及びヒドロキシアパタイ
トに強い結合性を有することが確認されており、之等の
クロマトグラフィーによる精製が最適である。
ば血漿を56℃程度で約15分間加熱後、硫安分画する
ことにより、硫安温度約1.1〜2.1〜1の沈澱画分
に活性物として収1グすることができる。上記活性物は
更に例えば通常の担体を使用するゲル濾過、DEAE等
の陰イAン交操体を使用するイオン交換クロマトグラフ
ィー等により、精製Jることができる。殊に本発明者ら
の研究によれば、本発明のhHGFは、アフィゲルブル
ー(Arri−Get Blue 、 バイオ・7ト
ラホラトリ一ズ社)、ヘパリン及びヒドロキシアパタイ
トに強い結合性を有することが確認されており、之等の
クロマトグラフィーによる精製が最適である。
上記各処理の操作、条件等は、通常のこの種の方法にお
けるそれらと同様のものとすることができる。
けるそれらと同様のものとすることができる。
上記方法により本発明hl−IGFが、単1lill精
製され、これは上記した特性にて特定される。
製され、これは上記した特性にて特定される。
尚、本発明hHGFは、SDS処理によっても活性(肝
細胞増殖活性)が保持されることが確認されており、従
って上記精製手段として、5O8PAGE (ドデシル
硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法)
をも好適に採用することができる。
細胞増殖活性)が保持されることが確認されており、従
って上記精製手段として、5O8PAGE (ドデシル
硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法)
をも好適に採用することができる。
実 施 例
以下に実施例を示し、本発明をより具体的に述べるが、
本発明はこれらに限定されるものではない。
本発明はこれらに限定されるものではない。
実施例1
(1)肝細胞増殖活性(1−I G F活性)の測定セ
グレン(3eglen )の方法(M ethods
1ncell biology、voll 3 、 p
29 、 Academicpress、 New
York (1976) )に従い、ウィスター糸
紐ラット(体重2000 )より、0.05%コラ−ゲ
ナーゼ(タイプエ、シグマ社)を用いて肝実質細胞を単
離した。この肝実質細胞を直径1.55cn+のウェル
を有するマルヂーウエル プラスデック ディツシュ(
Nunc)に5×104個10.2mQ/cm2の濃度
でまき込み、5%炭酸ガス含有空気気相下、37℃でl
Fi層培養した(Tanaka et al、、J、
Biochem、旦」−1937〜946 (1978
))。培養培地としては5%牛脂児血清(F CS 、
F 1ltron、 A 1tona 。
グレン(3eglen )の方法(M ethods
1ncell biology、voll 3 、 p
29 、 Academicpress、 New
York (1976) )に従い、ウィスター糸
紐ラット(体重2000 )より、0.05%コラ−ゲ
ナーゼ(タイプエ、シグマ社)を用いて肝実質細胞を単
離した。この肝実質細胞を直径1.55cn+のウェル
を有するマルヂーウエル プラスデック ディツシュ(
Nunc)に5×104個10.2mQ/cm2の濃度
でまき込み、5%炭酸ガス含有空気気相下、37℃でl
Fi層培養した(Tanaka et al、、J、
Biochem、旦」−1937〜946 (1978
))。培養培地としては5%牛脂児血清(F CS 、
F 1ltron、 A 1tona 。
Au5tralia) 、1 μlvlデキサメサゾン
、100U/11112ペニシリン及び1 ’OOμg
/−ストレプトマイシンを添加したウィリアムスE培地
(フローラボラトリーズ社、以下「基本培地」と略す)
を使用した。培養開始後、4及び20時間開目被検試料
を含む基本培地に培地交換し、40時間開目基本培地の
みに交換した後、DNA合成を測定した。
、100U/11112ペニシリン及び1 ’OOμg
/−ストレプトマイシンを添加したウィリアムスE培地
(フローラボラトリーズ社、以下「基本培地」と略す)
を使用した。培養開始後、4及び20時間開目被検試料
を含む基本培地に培地交換し、40時間開目基本培地の
みに交換した後、DNA合成を測定した。
DNA合成は、3H−チミジン(A mersham社
)を4μCi /mQ (2Ci /ra mol )
添加した後、2時間37℃で培養を続け、DNAへの取
り込みを測定することにより行なった。尚、上記3H−
チミジンによるラベルに際し、iomvヒドロキシウレ
アを添加した群をコントロール群とした。
)を4μCi /mQ (2Ci /ra mol )
添加した後、2時間37℃で培養を続け、DNAへの取
り込みを測定することにより行なった。尚、上記3H−
チミジンによるラベルに際し、iomvヒドロキシウレ
アを添加した群をコントロール群とした。
上記培養によるラベル後、細胞を冷PBS、2%過塩素
酸及び95%エタノールで3回洗浄した。
酸及び95%エタノールで3回洗浄した。
次いで細胞を風乾し、2mMEDTA及び20mM
NaHCO3を含有する2%SDSの0.8mQで可溶
化し、その一部をとって放射能測定及び蛋白量測定に供
した。蛋白量の測定は、BSAを標準としてローリ−法
に従った。放射能測定により、被検試料により肝実質細
胞DNAに取込まれた3H−チミジン量を、コントロー
ルとのカウントの差として求め、これを肝実質細l11
1μり蛋白偕当り、1時間当りに換算してDNA合成活
性(dpm /hr/μ9蛋白)とし、被検試料のHG
F活性の指標とした。
NaHCO3を含有する2%SDSの0.8mQで可溶
化し、その一部をとって放射能測定及び蛋白量測定に供
した。蛋白量の測定は、BSAを標準としてローリ−法
に従った。放射能測定により、被検試料により肝実質細
胞DNAに取込まれた3H−チミジン量を、コントロー
ルとのカウントの差として求め、これを肝実質細l11
1μり蛋白偕当り、1時間当りに換算してDNA合成活
性(dpm /hr/μ9蛋白)とし、被検試料のHG
F活性の指標とした。
(2)本発明hl−IGFのl!l造
■ 劇症肝炎患者の血漿交換療法に際して111られた
患者血漿を原料として用いた。
患者血漿を原料として用いた。
まず原料血漿930mQを、56℃で15分間加熱し、
4℃で60分間遠心分離(105000(1)した。以
下の精製操作は全て4℃下で行なった。
4℃で60分間遠心分離(105000(1)した。以
下の精製操作は全て4℃下で行なった。
次いで、上澄液を同門の蒸留水で希釈し、これに3.8
M硫酸アンモニウム(p )−16,0)を添加して分
画した。1.15M〜2.05MIIi!l酸アンモニ
ウム沈澱分画を、PBS l)の少量に溶かし、同緩衝
液に対して透析した。
M硫酸アンモニウム(p )−16,0)を添加して分
画した。1.15M〜2.05MIIi!l酸アンモニ
ウム沈澱分画を、PBS l)の少量に溶かし、同緩衝
液に対して透析した。
透析液をPBS (−)で平衡化したアフィゲルブル−
のカラム(3,9X11cm)にかけ、PBS (−)
250ma及び1.4M Na CQを含むPBS
(−)(p 1−17.4)250−で順次洗浄した。
のカラム(3,9X11cm)にかけ、PBS (−)
250ma及び1.4M Na CQを含むPBS
(−)(p 1−17.4)250−で順次洗浄した。
次いで活性画分を2Mグアニジン塩酸(1)87.4>
350m12で溶出させ、溶出液をPBS (−)に対
して72時間(少なくとも5回液交換を行なう)透析し
た。
350m12で溶出させ、溶出液をPBS (−)に対
して72時間(少なくとも5回液交換を行なう)透析し
た。
透析液に、トリトンX−100(Tr目onX−100
)を最終濃度が0.013%となるように添加し、これ
を0.013%トリトンx−i o。
)を最終濃度が0.013%となるように添加し、これ
を0.013%トリトンx−i o。
を含むPBS (−)で平衡化したヘパリン−セファロ
ースカラム(ファルマシア社、1,6x5cn+)にか
けた。カラムを同PBS (−) 75m12、次いで
0.5M Na CQを含む同PBS (−>50戒
で各々洗浄した後、0.5Mから1.75MNaCQの
リニアグラジェントにより溶出させた。
ースカラム(ファルマシア社、1,6x5cn+)にか
けた。カラムを同PBS (−) 75m12、次いで
0.5M Na CQを含む同PBS (−>50戒
で各々洗浄した後、0.5Mから1.75MNaCQの
リニアグラジェントにより溶出させた。
上記でVlられた活性画分<0.84〜1.15M
NaCQ>を、0.013%トリトンX−100を含む
PBS (−)で2倍希釈した後、同PBS (−)で
平衡化したヒドロキシアバタイ]・カラム(バイオ・ラ
ドラボラトリーズ社、1゜6x5cm1流速20mQ/
hr)にかけた。カラムを同バッファー20mGで洗浄
し、次いで0.15MNaCQ及び0.013%トリト
ンX−100を含有する0、1Mリン酸ナトリウムバッ
ファー(p H7,1>20鵬で洗浄後、室温で、0.
1Mから0.5Mリン酸ナトリウムのリニアグラディエ
ンドにより溶出(21+12フラクシヨン)させた。
NaCQ>を、0.013%トリトンX−100を含む
PBS (−)で2倍希釈した後、同PBS (−)で
平衡化したヒドロキシアバタイ]・カラム(バイオ・ラ
ドラボラトリーズ社、1゜6x5cm1流速20mQ/
hr)にかけた。カラムを同バッファー20mGで洗浄
し、次いで0.15MNaCQ及び0.013%トリト
ンX−100を含有する0、1Mリン酸ナトリウムバッ
ファー(p H7,1>20鵬で洗浄後、室温で、0.
1Mから0.5Mリン酸ナトリウムのリニアグラディエ
ンドにより溶出(21+12フラクシヨン)させた。
上記溶出パターンを第1図に示ず。図において横軸はフ
ラクションNo、を、縦軸はHG F活性(曲線(1)
で示される)及びリン酸ナトリウム溌度(曲線(2)で
示される)をそれぞれ示す。
ラクションNo、を、縦軸はHG F活性(曲線(1)
で示される)及びリン酸ナトリウム溌度(曲線(2)で
示される)をそれぞれ示す。
活性の最も高い画分くフラクションN0.60〜66)
を集め、−20’Cで保存した。
を集め、−20’Cで保存した。
かくして、原料血漿から、20万倍以上に精製されたh
HGFを得た。
HGFを得た。
該hl−IGFのHGF活性は、加熱処理(80℃、1
0分間)及び酵素処理(0,lff1g/−トリプシン
、37℃、30分間及び0.1110/IIIQキモト
リプシン、37℃、30分間)により失活した。また0
、5M酢酸、0.1M酢M緩衝液(pH4,0)、同(
p )−15,0)、O,1Mリン酸緩衝液(E)11
7.4)及び0.1Mグリシン!l衝液<o 1−19
.5)のいずれの処理(4℃、20時間)によっても安
定であった。
0分間)及び酵素処理(0,lff1g/−トリプシン
、37℃、30分間及び0.1110/IIIQキモト
リプシン、37℃、30分間)により失活した。また0
、5M酢酸、0.1M酢M緩衝液(pH4,0)、同(
p )−15,0)、O,1Mリン酸緩衝液(E)11
7.4)及び0.1Mグリシン!l衝液<o 1−19
.5)のいずれの処理(4℃、20時間)によっても安
定であった。
■ 5DS−PAGE
レムリ(lacmIIlli)の方法(Nature
、 227゜680−685 (1970))に従い、
3%スタッキングゲル及び8%分離ゲル(厚さ1mm)
を用いて、tW下に5DS−PAGEを行なった。
、 227゜680−685 (1970))に従い、
3%スタッキングゲル及び8%分離ゲル(厚さ1mm)
を用いて、tW下に5DS−PAGEを行なった。
即ち、上記■で得たhHGFを、セントリコン10(ア
ミコン社)を用いて約10倍に濃縮し、この濃縮hトI
GFを、サンプルバッファーの2倍濃縮液(6%SDS
、20%グリセロール及び0.025%ブロモフェノー
ルブルーを合む125IIIMトリス・塩酸緩衝液(f
)H6,8)からなる)の等昂と混合した侵、25℃で
1時間処理してサンプルとした。電気泳動後、分離ゲル
の3レーンを剃刀の刃で1.5Hにスライスした。
ミコン社)を用いて約10倍に濃縮し、この濃縮hトI
GFを、サンプルバッファーの2倍濃縮液(6%SDS
、20%グリセロール及び0.025%ブロモフェノー
ルブルーを合む125IIIMトリス・塩酸緩衝液(f
)H6,8)からなる)の等昂と混合した侵、25℃で
1時間処理してサンプルとした。電気泳動後、分離ゲル
の3レーンを剃刀の刃で1.5Hにスライスした。
切片を試験管に入れ、細かく切り、撹拌下、室温で20
時間を要して、0.013%トリトンX−100及び0
.02%SDSを含むPBS (−)1−で抽出し、H
GF活性の測定に供した。他のル−ンは、10%三塩化
酢酸で固定後、銀染色を行ない、分子量スタンダード(
ファルマシア社)から、推定分子伝を算出した。
時間を要して、0.013%トリトンX−100及び0
.02%SDSを含むPBS (−)1−で抽出し、H
GF活性の測定に供した。他のル−ンは、10%三塩化
酢酸で固定後、銀染色を行ない、分子量スタンダード(
ファルマシア社)から、推定分子伝を算出した。
上記結果を第2図に示す。図において横軸はスライスN
O1を、縦軸はHG F活性を示す。
O1を、縦軸はHG F活性を示す。
上記5DS−PAGEによれば、非還元条件下で、本発
明h HGFは、分子■約76000〜92000にわ
たるバンドとして泳動され、該バンド(スライスNo、
29〜34)に一致したトIGF活性が確認された。
明h HGFは、分子■約76000〜92000にわ
たるバンドとして泳動され、該バンド(スライスNo、
29〜34)に一致したトIGF活性が確認された。
■ 上記■において、ゲルスライスから抽出されたh+
(Gr:につき、再度、上記■と同様にして5DS−P
AGEを行なった。
(Gr:につき、再度、上記■と同様にして5DS−P
AGEを行なった。
その結果を第3図に示す。図において横軸はレーンNo
、を示し、レーン1は上記■におけるスライスNo、2
9を、レーン2は同スライスNo、30を、レーン3は
同スライスN0.31を、レーン4は同スライスNo、
32を、レーン5は同スライスNo、33を、レーン6
は同スライスNO,34をそれぞれ示ず。また縦軸は分
子量スタンダードから求めた分子量(X10−”)を示
す。
、を示し、レーン1は上記■におけるスライスNo、2
9を、レーン2は同スライスNo、30を、レーン3は
同スライスN0.31を、レーン4は同スライスNo、
32を、レーン5は同スライスNo、33を、レーン6
は同スライスNO,34をそれぞれ示ず。また縦軸は分
子量スタンダードから求めた分子量(X10−”)を示
す。
上記結果によれば、hHGFには、わずかに分子量の異
なるいくつかの分子型が存在し、それらは上記方法によ
り単離することができた。単離されたそれぞれの分子量
を、それらのトIGF活性と共に、下記第1表にポリ。
なるいくつかの分子型が存在し、それらは上記方法によ
り単離することができた。単離されたそれぞれの分子量
を、それらのトIGF活性と共に、下記第1表にポリ。
尚、HGF活性は染色強度に応じた値が得られた。
第 1 表
レーン 分 子 吊 トIGF活性(dpm/N0
0(非還元条件) hr/μg蛋白)1 約92
000 17.3 2 約88000 38.6 3 約86000 93.9 4 約83000と 約81000 31.2 5 約79000 70.5 6 約79000と 約76000 10.5 尚、上記において、還元条件下での5OS−PAGEに
よれば、いずれも分子ff156000〜65000及
び320oO〜35000の両グループにメインバンド
を与えた。このことより、hHGFはこれらがジスルフ
ィド結合により結合した蛋白性物質であり、上記7種の
分子型はいずれも実質的にhHGFとして同一であると
推定された。
0(非還元条件) hr/μg蛋白)1 約92
000 17.3 2 約88000 38.6 3 約86000 93.9 4 約83000と 約81000 31.2 5 約79000 70.5 6 約79000と 約76000 10.5 尚、上記において、還元条件下での5OS−PAGEに
よれば、いずれも分子ff156000〜65000及
び320oO〜35000の両グループにメインバンド
を与えた。このことより、hHGFはこれらがジスルフ
ィド結合により結合した蛋白性物質であり、上記7種の
分子型はいずれも実質的にhHGFとして同一であると
推定された。
■ 用量依存効果
上記■で得られたhHGFを用いて、HGF活性の川口
依存性を調べた。
依存性を調べた。
結果を第4図に示す。図中、横軸はhトIGFの濃度(
nlJ/ 1110 )を、縦軸はHGF活性(dpm
/hr/μg蛋白)を示す。また図においてrmEGF
Jはマウス上皮生長因子(和光純薬社)の25 ng/
−を用いた結果を示す。
nlJ/ 1110 )を、縦軸はHGF活性(dpm
/hr/μg蛋白)を示す。また図においてrmEGF
Jはマウス上皮生長因子(和光純薬社)の25 ng/
−を用いた結果を示す。
■ 上記■で得たhHGF、インスリン、マウス上皮生
長因子(mEGF、和光純薬社)及びヒト上皮生良因子
(h EGF、湧水製薬社)の組合せによる、肝細胞増
殖効果を確認試験した。
長因子(mEGF、和光純薬社)及びヒト上皮生良因子
(h EGF、湧水製薬社)の組合せによる、肝細胞増
殖効果を確認試験した。
結果を下記第2表に示す。
表中、ラベリング インデックスは、オートラジオグラ
フィー (3ioned、Res、 6.231(19
85))に従って、3)(−チミジンでラベルされた核
数の計測によって算出されたものであり、少なくとも2
50個以上の細胞の測定による百分率で示される。該イ
ンデックスは、肝実質細胞の増殖を反映する指標である
。また、表中HGF活性及びラベリング インデックス
の結果は、それぞれ平均値±SD (3回試験の場合、
2回数試験の場合は、平均値)で示される。
フィー (3ioned、Res、 6.231(19
85))に従って、3)(−チミジンでラベルされた核
数の計測によって算出されたものであり、少なくとも2
50個以上の細胞の測定による百分率で示される。該イ
ンデックスは、肝実質細胞の増殖を反映する指標である
。また、表中HGF活性及びラベリング インデックス
の結果は、それぞれ平均値±SD (3回試験の場合、
2回数試験の場合は、平均値)で示される。
第 2 表
第2表より、hトIGFの肝臓細胞増殖活性は、インス
リン、mE G F及びhE G Fのそれらよりも強
く、しかもそれらと相加的或いは相乗的であることが判
る。
リン、mE G F及びhE G Fのそれらよりも強
く、しかもそれらと相加的或いは相乗的であることが判
る。
尚、hl」GFの肝細胞増殖活性は、位相差顕微鏡下に
おける、肝実質細胞の核***像の観察及びウェル内の総
核数の増加によっても観察された。
おける、肝実質細胞の核***像の観察及びウェル内の総
核数の増加によっても観察された。
第1図は本発明hHGFのヒト0キシアパタイトカラム
からの溶出を示すグラフである。第2図及び第3図は、
それぞれ本発明hHGFの5DS−PAGEによる分析
結果を示すものである。第4図は本発明h HGFのm
m依存曲線を示すものである。 (以 上) 一″へ 代理人 弁理士 三 枝 英 二 ;J、仄二図面の浄
2″(内容に変更なし〕 第2図 スライスNo。 図面の6會シ()’I O−i::変更なし)第3図 レーンN。 手続補正力(方式) 昭和61年10月27日 1 事件の表示 昭和61年特許願第166495号 2 発明の名称 肝細胞増殖因子 3 補正をする者 事件との関係 特許出願人 橋 本 修 治 (ほか3名) 4代理人 大阪市東区平野町2の10 沢の鴎ビル(6521)弁
理士 三枝英二 5 補正命令の日付 昭和61年9月30日 6 補正の対象 図面(第2図及び第3図) 7 補正の内容 別紙添附の通り 補 正 の 内 容 1 第2図及び第3図を別紙の通り訂正します。 (以 上)
からの溶出を示すグラフである。第2図及び第3図は、
それぞれ本発明hHGFの5DS−PAGEによる分析
結果を示すものである。第4図は本発明h HGFのm
m依存曲線を示すものである。 (以 上) 一″へ 代理人 弁理士 三 枝 英 二 ;J、仄二図面の浄
2″(内容に変更なし〕 第2図 スライスNo。 図面の6會シ()’I O−i::変更なし)第3図 レーンN。 手続補正力(方式) 昭和61年10月27日 1 事件の表示 昭和61年特許願第166495号 2 発明の名称 肝細胞増殖因子 3 補正をする者 事件との関係 特許出願人 橋 本 修 治 (ほか3名) 4代理人 大阪市東区平野町2の10 沢の鴎ビル(6521)弁
理士 三枝英二 5 補正命令の日付 昭和61年9月30日 6 補正の対象 図面(第2図及び第3図) 7 補正の内容 別紙添附の通り 補 正 の 内 容 1 第2図及び第3図を別紙の通り訂正します。 (以 上)
Claims (1)
- (1)ヒト血液に由来し、以下の理化学的性質及び生理
活性を有する蛋白性物質であることを特徴とする肝細胞
増殖因子。 1)SDS−PAGE(非還元条件下)による推定分子
量が約76000〜92000である、 2)肝細胞を増殖させる活性を有する、 3)80℃、10分間の加熱処理により上記活性が失活
する、 4)トリプシン消化及びキモトリプシン消化により上記
活性が失活する、及び 5)ヘパリンに強い親和性を有する。
Priority Applications (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP61166495A JP2564486B2 (ja) | 1986-07-14 | 1986-07-14 | 肝細胞増殖因子 |
CA000538802A CA1300010C (en) | 1986-07-14 | 1987-06-04 | Hepatocyte growth factor |
US07/058,211 US5004805A (en) | 1986-07-14 | 1987-06-04 | Hepatocyte growth factor |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP61166495A JP2564486B2 (ja) | 1986-07-14 | 1986-07-14 | 肝細胞増殖因子 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPS6322526A true JPS6322526A (ja) | 1988-01-30 |
JP2564486B2 JP2564486B2 (ja) | 1996-12-18 |
Family
ID=15832427
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP61166495A Expired - Lifetime JP2564486B2 (ja) | 1986-07-14 | 1986-07-14 | 肝細胞増殖因子 |
Country Status (3)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US5004805A (ja) |
JP (1) | JP2564486B2 (ja) |
CA (1) | CA1300010C (ja) |
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KR20160146736A (ko) | 2014-04-28 | 2016-12-21 | 에자이 알앤드디 매니지먼트 가부시키가이샤 | Hgf의 동결건조 제제 |
KR20180127322A (ko) | 2016-03-17 | 2018-11-28 | 에자이 알앤드디 매니지먼트 가부시키가이샤 | 활성 간세포 성장 인자(hgf)를 생성하는 방법 |
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