JPH0542270B2 - - Google Patents
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- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/92—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving lipids, e.g. cholesterol, lipoproteins, or their receptors
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- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
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Description
〔技術分野〕
本発明は、被検液中の3β−ヒドロキシステロ
イドまたは３−ケトステロイドの定量において、
3β−ヒドロキシステロイド、３−ケトステロイ
ド、3β−ヒドロキシステロイド・オキシダーゼ、
3β−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ、
NAD(P)、還元型NAD(P)、酸素（O2）および過
酸化水素（H2O2）の成分の関与する下記サイク
リング反応〔〕
イドまたは３−ケトステロイドの定量において、
3β−ヒドロキシステロイド、３−ケトステロイ
ド、3β−ヒドロキシステロイド・オキシダーゼ、
3β−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ、
NAD(P)、還元型NAD(P)、酸素（O2）および過
酸化水素（H2O2）の成分の関与する下記サイク
リング反応〔〕
従来より酵素的サイクリングとしては、NAD
サイクリング、NADPサイクリング、CoAサイ
クリングが知られている。NADサイクリングと
しては、例えばエタノールを基質とし、NADと
共にアルコールデヒドロゲナーゼを作用せしめ、
還元型NADを生成し、またこの還元型NADはオ
キサル酢酸を基質としてリンゴ酸デヒドロゲナー
ゼを作用せしめてNADとなすことによりNAD−
還元型NADのサイクリング反応を形成せしめる
方法がある〔日本生化学会編、「生化学実験講座」
５巻、酵素研究法（上）第121−135頁、株式会社
東京化学同人、1975年８月発行、森昭胤編集、
「神経伝達物質測定法マニユアル」第165〜172頁、
医歯薬出版株式会社、1979年11月発行〕。また上
記のリンゴ酸デヒドロゲナーゼの代りに還元型
NADオキシダーゼを用いて酸素および還元型
NADを消費して水分子およびNADを生成するサ
イクリングも知られている〔理化学研究所編、
「ライフサイエンス現状と将来」第30〜32頁、株
式会社創造ライフサイエンス研究会、1981年３月
発行〕。さらに基質としてヒドロキシステロイド
を用いてヒドロキシステロイドデヒデロゲナーゼ
を作用せしめ、NADを還元型NADとなし、次い
でこの還元型NADはテトラゾリウム塩とジアホ
ラーゼなどの転位酵素の作用でホルマザンを形成
しつつNADとなすサイクリング〔特開昭56−
144096号〕や、グルタチオンとデヒドロアスコル
ビン酸にグルタチオンデヒドロアスコルビン酸オ
キシドレダクターゼ作用せしめてデヒドロアスコ
ルビン酸をアスコルビン酸となし、このアスコル
ビン酸はアスコルビン酸オキシダーゼを用いて酸
素を消費して水分子およびデヒドロアスコルビン
酸を生成するデヒドロアスコルビン酸−アスコル
ビン酸のサイクリング反応も知られている〔特開
昭56−15149号〕。 その他酸素を消費して過酸化水素を生成する還
元型NADオキシダーゼを用いるNADサイクリン
グも知られている〔特開昭56−78599号〕。 〔発明が解決しようとする問題点〕 このように種々のサイクリング反応系が報告さ
れているが、最もよく汎用される過酸化水素を生
成する還元型NADオキシダーゼは、酵素自体の
精製が困難であるため、未だによく精製されてお
らず、従つて、測定に使用するには精度が悪く、
また、NADサイクリング法では、過剰のNADを
アルカリ性で熱処理して消去する工程が必須であ
り、その上、このときに用いたアルカリを中和せ
ねばならない、というはん雑な操作が必要であつ
た。 ステロイドホルモンは、生体試料中の濃度が低
く、一般的分光学測定法では直接定量することは
困難であつた。この分野において、本発明に最も
よく関連あるヒドロキシステロイドの測定法に関
する先行技術として、前記特開昭56−144096号発
明があるが、それは３−ヒドロキシステロイドデ
ヒドロゲナーゼとNADを用い、生ずる還元型
NADを340nｍで比色定量する方法であり、測定
感度が低いため、コレステロールを除いて、その
他の微量の血清中のスレロイドホルモンなどの測
定は困難であつた。 〔発明の解決するための手段〕 本発明者らは、ヒドロキシステロイドおよびケ
トステロイドの測定に関して、サイクリング反応
について種々研究した結果、3β−ヒドロキシス
テロイドを基質としてO2を消費してH2O2および
３−ケトステロイドを生成する3β−ヒドロキス
テロイドオキシダーゼを用い、それに加わえて、
３−ケトステロイドを基質とし還元型NAD(P)を
消費してNAD(P)および3β−ヒドロキシステロイ
ドを生成する3β−ヒドロキシステロイドデヒド
ロゲナーゼを用いる3β−ヒドロキシステロイド
−３−ケトステロイドの新しいサイクリング反応
を見出した。これに用いられる各試薬は安価かつ
純度よく供し得る上に、酸化作用のあるH2O2と
還元作用のある還元型NADが共存するにもかか
わらず、良好にサイクリング反応する新規なサイ
クリング反応である。またこのサイクリング反応
において、反応に関与する3β−ヒドロキシステ
ロイド、３−ケトステロイド、3β−ヒドロキシ
ステロイドオキシダーゼ、3β−ヒドロキシステ
ロイドデヒドロゲナーゼ、NAD(P)、還元型NAD
(P)、O2およびH2O2のうち、3β−ヒドロキシステ
ロイドまたは３−ケトステロイドを含有する被検
液を用いて、被検液の１成分以外の必要とする成
分を用いて反応せしめることにより、１分間当り
10サイクル以上のサイクリング反応を行うことが
できることを見出した。そして反応によつて生ず
る検出できる変化の量を定量することにより、被
検液中の成分を簡便かつ高感度にて正確に測定で
きることを見出し本発明を完成した。 〔発明の目的〕 本発明は上記の知見に基いて完成されたもので
あつて、被検液中の3β−ヒドロキシステロイド
または３−ケトステロイドの定量において、3β
−ヒドロキシステロイド、３−ケトステロイド、
3β−ヒドロキシステロイドオキシダーゼ、3β−
ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ、NAD
(P)、還元型NAD(P)、O2およびH2O2の成分の関与
する下記サイクリング反応〔〕
サイクリング、NADPサイクリング、CoAサイ
クリングが知られている。NADサイクリングと
しては、例えばエタノールを基質とし、NADと
共にアルコールデヒドロゲナーゼを作用せしめ、
還元型NADを生成し、またこの還元型NADはオ
キサル酢酸を基質としてリンゴ酸デヒドロゲナー
ゼを作用せしめてNADとなすことによりNAD−
還元型NADのサイクリング反応を形成せしめる
方法がある〔日本生化学会編、「生化学実験講座」
５巻、酵素研究法（上）第121−135頁、株式会社
東京化学同人、1975年８月発行、森昭胤編集、
「神経伝達物質測定法マニユアル」第165〜172頁、
医歯薬出版株式会社、1979年11月発行〕。また上
記のリンゴ酸デヒドロゲナーゼの代りに還元型
NADオキシダーゼを用いて酸素および還元型
NADを消費して水分子およびNADを生成するサ
イクリングも知られている〔理化学研究所編、
「ライフサイエンス現状と将来」第30〜32頁、株
式会社創造ライフサイエンス研究会、1981年３月
発行〕。さらに基質としてヒドロキシステロイド
を用いてヒドロキシステロイドデヒデロゲナーゼ
を作用せしめ、NADを還元型NADとなし、次い
でこの還元型NADはテトラゾリウム塩とジアホ
ラーゼなどの転位酵素の作用でホルマザンを形成
しつつNADとなすサイクリング〔特開昭56−
144096号〕や、グルタチオンとデヒドロアスコル
ビン酸にグルタチオンデヒドロアスコルビン酸オ
キシドレダクターゼ作用せしめてデヒドロアスコ
ルビン酸をアスコルビン酸となし、このアスコル
ビン酸はアスコルビン酸オキシダーゼを用いて酸
素を消費して水分子およびデヒドロアスコルビン
酸を生成するデヒドロアスコルビン酸−アスコル
ビン酸のサイクリング反応も知られている〔特開
昭56−15149号〕。 その他酸素を消費して過酸化水素を生成する還
元型NADオキシダーゼを用いるNADサイクリン
グも知られている〔特開昭56−78599号〕。 〔発明が解決しようとする問題点〕 このように種々のサイクリング反応系が報告さ
れているが、最もよく汎用される過酸化水素を生
成する還元型NADオキシダーゼは、酵素自体の
精製が困難であるため、未だによく精製されてお
らず、従つて、測定に使用するには精度が悪く、
また、NADサイクリング法では、過剰のNADを
アルカリ性で熱処理して消去する工程が必須であ
り、その上、このときに用いたアルカリを中和せ
ねばならない、というはん雑な操作が必要であつ
た。 ステロイドホルモンは、生体試料中の濃度が低
く、一般的分光学測定法では直接定量することは
困難であつた。この分野において、本発明に最も
よく関連あるヒドロキシステロイドの測定法に関
する先行技術として、前記特開昭56−144096号発
明があるが、それは３−ヒドロキシステロイドデ
ヒドロゲナーゼとNADを用い、生ずる還元型
NADを340nｍで比色定量する方法であり、測定
感度が低いため、コレステロールを除いて、その
他の微量の血清中のスレロイドホルモンなどの測
定は困難であつた。 〔発明の解決するための手段〕 本発明者らは、ヒドロキシステロイドおよびケ
トステロイドの測定に関して、サイクリング反応
について種々研究した結果、3β−ヒドロキシス
テロイドを基質としてO2を消費してH2O2および
３−ケトステロイドを生成する3β−ヒドロキス
テロイドオキシダーゼを用い、それに加わえて、
３−ケトステロイドを基質とし還元型NAD(P)を
消費してNAD(P)および3β−ヒドロキシステロイ
ドを生成する3β−ヒドロキシステロイドデヒド
ロゲナーゼを用いる3β−ヒドロキシステロイド
−３−ケトステロイドの新しいサイクリング反応
を見出した。これに用いられる各試薬は安価かつ
純度よく供し得る上に、酸化作用のあるH2O2と
還元作用のある還元型NADが共存するにもかか
わらず、良好にサイクリング反応する新規なサイ
クリング反応である。またこのサイクリング反応
において、反応に関与する3β−ヒドロキシステ
ロイド、３−ケトステロイド、3β−ヒドロキシ
ステロイドオキシダーゼ、3β−ヒドロキシステ
ロイドデヒドロゲナーゼ、NAD(P)、還元型NAD
(P)、O2およびH2O2のうち、3β−ヒドロキシステ
ロイドまたは３−ケトステロイドを含有する被検
液を用いて、被検液の１成分以外の必要とする成
分を用いて反応せしめることにより、１分間当り
10サイクル以上のサイクリング反応を行うことが
できることを見出した。そして反応によつて生ず
る検出できる変化の量を定量することにより、被
検液中の成分を簡便かつ高感度にて正確に測定で
きることを見出し本発明を完成した。 〔発明の目的〕 本発明は上記の知見に基いて完成されたもので
あつて、被検液中の3β−ヒドロキシステロイド
または３−ケトステロイドの定量において、3β
−ヒドロキシステロイド、３−ケトステロイド、
3β−ヒドロキシステロイドオキシダーゼ、3β−
ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ、NAD
(P)、還元型NAD(P)、O2およびH2O2の成分の関与
する下記サイクリング反応〔〕
本発明の被検液としては、3β−ヒドロキシス
テロイドまたは３−ケトステロイドを含有する
か、またはその１成分を遊離、生成する系が挙げ
られる。特に被検液中の１成分を遊離、生成する
系としては、種々のステロイドホルモン、即ち雄
性動物のアドロゲン、雌性動物のエストロゲンお
よびゲスターゲン、両性を通じてのコルチコイド
に大別される種々のステロイドホルモンの代謝
系、生合成系が挙られる。 これらの系に関与する種々の酵素活性の測定
や、あるいはこれらの系において生成する3β−
ヒドロキシステロイドまたは３−ケトステロイド
が本発明の方法によつて定量される。 本発明の測定法によつて定量され得る3β−ヒ
ドロキシステロイドおよび３−ケトステロイドの
例を挙げれば以下に示す通りである。 3β−ヒドロキステロイド： (1) アンドロゲン； プレグネノロン、17α−ヒドロキシプレグネ
ノロン、デヒドロエピアンドロステロン、アン
ドロステロン−3β、アンドロスタン−3β、17β
−ジオール、△5−アンドロステロン−3β、
17α−ジオール、アンドロスタン−3β、11β−
ジオール−17−オン。 (2) エストロゲン； エストラジオール、エストロン、エストリオ
ール、エキリン、エキレニン、エチニルエスト
ラジオール。 ３−ケトステロイド： (1) アンドロゲン； プロゲステロン、17α−ヒドロキシプロゲス
テロン、テストステロン、アンドロステンジオ
ン。 (2) コルチコイド； コルチコステロン、コルチゾール、コルチゾ
ン。 上記の定量すべき成分のいずれか１成分を含有
する被検液に3β−ヒドロキシステロイドオキシ
ダーゼ、3β−ヒドロキシステロイドデヒドロゲ
ナーゼ、還元型NAD(P)を加えて反応を行えばよ
い。 定量させるべき3β−ヒドロキシステロイドま
たは３−ケトステロイドの基質濃度は、5nM〜
30μM／５〜20μになるように調節すればよい。
反応温度は、式〔〕で示されるサイクリング反
応が円滑に進行する温度であればよく、通常好ま
しくは37℃である。反応時間は、基質濃度、酵素
濃度、反応温度により自から定るが、通常は１分
以上好ましくは２〜10分間でよい。使用される
3β−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼの
例としては、シユードモナステストステロニの産
生するものが市販されている（シグマ社、Ｕ、
Ｓ、Ａ）ので、それを用いればよく、使用量とし
ては一反応当り0.05u／ml以上、好ましくは、２
−4u／mlが使用される。 3β−ヒドロキシステロイドオキシダーゼとし
ては、一般にコレステロールオキシダーゼ
（EC1.1.3.6）として市販されている酵素でストレ
プトマイセス、ブレビバクテリウム、シゾフイラ
ム、コリネバクテリウム、アースロバクテリウ
ム、ノカルジア、ミコバクテリウム属の細菌が産
生する酵素で充分使用に耐えることができる。使
用量としては、0.2u／ml以上、好ましくは10〜
30u／mlが適当である。反応に用いられる還元型
NAD(P)としては、定量されてる基質に対して過
剰量であればよく、通常0.1〜2.0ｍＭが好まし
い。 以上記した基質濃度、酵素濃度、その他反応に
必要な成分の濃度量は適宜変更され得るものであ
つて、特に限定されるものではないことはいうま
でもない。 本発明のサイクリング反応〔〕としては、前
記したような各成分、即ち、3β−ヒドロキシス
テロイド、３−ケトステロイド、3β−ヒドロキ
システロイドデヒドロゲナーゼ、3β−ヒドロキ
システロイドオキシダーゼ、NAD(P)、還元型
NAD(P)、O2およびH2O2の成分が関与する下記反
応式〔〕で表わされる。
テロイドまたは３−ケトステロイドを含有する
か、またはその１成分を遊離、生成する系が挙げ
られる。特に被検液中の１成分を遊離、生成する
系としては、種々のステロイドホルモン、即ち雄
性動物のアドロゲン、雌性動物のエストロゲンお
よびゲスターゲン、両性を通じてのコルチコイド
に大別される種々のステロイドホルモンの代謝
系、生合成系が挙られる。 これらの系に関与する種々の酵素活性の測定
や、あるいはこれらの系において生成する3β−
ヒドロキシステロイドまたは３−ケトステロイド
が本発明の方法によつて定量される。 本発明の測定法によつて定量され得る3β−ヒ
ドロキシステロイドおよび３−ケトステロイドの
例を挙げれば以下に示す通りである。 3β−ヒドロキステロイド： (1) アンドロゲン； プレグネノロン、17α−ヒドロキシプレグネ
ノロン、デヒドロエピアンドロステロン、アン
ドロステロン−3β、アンドロスタン−3β、17β
−ジオール、△5−アンドロステロン−3β、
17α−ジオール、アンドロスタン−3β、11β−
ジオール−17−オン。 (2) エストロゲン； エストラジオール、エストロン、エストリオ
ール、エキリン、エキレニン、エチニルエスト
ラジオール。 ３−ケトステロイド： (1) アンドロゲン； プロゲステロン、17α−ヒドロキシプロゲス
テロン、テストステロン、アンドロステンジオ
ン。 (2) コルチコイド； コルチコステロン、コルチゾール、コルチゾ
ン。 上記の定量すべき成分のいずれか１成分を含有
する被検液に3β−ヒドロキシステロイドオキシ
ダーゼ、3β−ヒドロキシステロイドデヒドロゲ
ナーゼ、還元型NAD(P)を加えて反応を行えばよ
い。 定量させるべき3β−ヒドロキシステロイドま
たは３−ケトステロイドの基質濃度は、5nM〜
30μM／５〜20μになるように調節すればよい。
反応温度は、式〔〕で示されるサイクリング反
応が円滑に進行する温度であればよく、通常好ま
しくは37℃である。反応時間は、基質濃度、酵素
濃度、反応温度により自から定るが、通常は１分
以上好ましくは２〜10分間でよい。使用される
3β−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼの
例としては、シユードモナステストステロニの産
生するものが市販されている（シグマ社、Ｕ、
Ｓ、Ａ）ので、それを用いればよく、使用量とし
ては一反応当り0.05u／ml以上、好ましくは、２
−4u／mlが使用される。 3β−ヒドロキシステロイドオキシダーゼとし
ては、一般にコレステロールオキシダーゼ
（EC1.1.3.6）として市販されている酵素でストレ
プトマイセス、ブレビバクテリウム、シゾフイラ
ム、コリネバクテリウム、アースロバクテリウ
ム、ノカルジア、ミコバクテリウム属の細菌が産
生する酵素で充分使用に耐えることができる。使
用量としては、0.2u／ml以上、好ましくは10〜
30u／mlが適当である。反応に用いられる還元型
NAD(P)としては、定量されてる基質に対して過
剰量であればよく、通常0.1〜2.0ｍＭが好まし
い。 以上記した基質濃度、酵素濃度、その他反応に
必要な成分の濃度量は適宜変更され得るものであ
つて、特に限定されるものではないことはいうま
でもない。 本発明のサイクリング反応〔〕としては、前
記したような各成分、即ち、3β−ヒドロキシス
テロイド、３−ケトステロイド、3β−ヒドロキ
システロイドデヒドロゲナーゼ、3β−ヒドロキ
システロイドオキシダーゼ、NAD(P)、還元型
NAD(P)、O2およびH2O2の成分が関与する下記反
応式〔〕で表わされる。
【表】
↑
NAD(P) 3β〓ヒドロキシス
テロイドデヒド 還元型
ロゲナーゼ
NAD(P)
この反応〔〕について述べれば、１モル比の
3β−ヒドロキシステロイドを基質として１モル
比のO2、通常溶存酸素を消費して3β−ヒドロキ
システロイドオキシダーゼの作用により１モル比
の３−ケトステロイドおよび１モル比のH2O2を
生成する3β−ヒドロキシステロイドオキシダー
ゼ系反応を形成し、また生成した１モル比の３−
ケトステロイドは１モル比の還元型NAD(P)の存
在下3β−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナー
ゼの作用により１モル比のNAD(P)および１モル
比の3β−ヒドロキシステロイドを生成する3β−
ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ系反応を
形成するが、生じた3β−ヒドロキシステロイド
はさらに上記3β−ヒドロキシステロイドオキシ
ダーゼ系反応を生じ、かくして3β−ヒドロキシ
ステロイド−３−ケトステロイドのサイクル反応
を形成するのである。従つて、このサイクリング
反応〔〕は、3β−ヒドロキシステロイド、３
−ケトステロイド、3β−ヒドロキシステロイド
オキシダーゼ、3β−ヒドロキシステロイドデヒ
ドロゲナーゼ、還元型NAD(P)とO2の６成分で構
成され得るものであるが、定量される基質で鵜あ
る3β−ヒドロキシステロイドと３−ケトステロ
イドはサイクリング反応〔〕によつていずれか
１成分を用いれば他の成分が生成されるため、い
ずれか１分を用いればよく、またその１成分が被
検液中の１成分であつてもよい。 さらにこのサイクリング反応〔〕における
H2O2と還元型NADを反応せしてめNADを生成
するより高感度な測定法となしてもよい。即ちサ
イクリング反応〔〕において、１分子のH2O2
と１分子の還元型NADを消費して２分子の水
（H2O）と１分子のNADを生成する反応を触媒す
る酵素であるNADペルオキシダーゼ
（EC.1.11.1.1）〔J.Biol.Chem.、225、557（1957）〕
を組合せ用いてなるもので、下記反応〔〕にて
表わされる。
NAD(P) 3β〓ヒドロキシス
テロイドデヒド 還元型
ロゲナーゼ
NAD(P)
この反応〔〕について述べれば、１モル比の
3β−ヒドロキシステロイドを基質として１モル
比のO2、通常溶存酸素を消費して3β−ヒドロキ
システロイドオキシダーゼの作用により１モル比
の３−ケトステロイドおよび１モル比のH2O2を
生成する3β−ヒドロキシステロイドオキシダー
ゼ系反応を形成し、また生成した１モル比の３−
ケトステロイドは１モル比の還元型NAD(P)の存
在下3β−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナー
ゼの作用により１モル比のNAD(P)および１モル
比の3β−ヒドロキシステロイドを生成する3β−
ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ系反応を
形成するが、生じた3β−ヒドロキシステロイド
はさらに上記3β−ヒドロキシステロイドオキシ
ダーゼ系反応を生じ、かくして3β−ヒドロキシ
ステロイド−３−ケトステロイドのサイクル反応
を形成するのである。従つて、このサイクリング
反応〔〕は、3β−ヒドロキシステロイド、３
−ケトステロイド、3β−ヒドロキシステロイド
オキシダーゼ、3β−ヒドロキシステロイドデヒ
ドロゲナーゼ、還元型NAD(P)とO2の６成分で構
成され得るものであるが、定量される基質で鵜あ
る3β−ヒドロキシステロイドと３−ケトステロ
イドはサイクリング反応〔〕によつていずれか
１成分を用いれば他の成分が生成されるため、い
ずれか１分を用いればよく、またその１成分が被
検液中の１成分であつてもよい。 さらにこのサイクリング反応〔〕における
H2O2と還元型NADを反応せしてめNADを生成
するより高感度な測定法となしてもよい。即ちサ
イクリング反応〔〕において、１分子のH2O2
と１分子の還元型NADを消費して２分子の水
（H2O）と１分子のNADを生成する反応を触媒す
る酵素であるNADペルオキシダーゼ
（EC.1.11.1.1）〔J.Biol.Chem.、225、557（1957）〕
を組合せ用いてなるもので、下記反応〔〕にて
表わされる。
【表】
↑
NAD(P) 3β〓ヒドロキシ 還
元型
ステロイドデヒ NAD(
P)
ドロゲナーゼ
このサイクリング反応〔〕においては、サイ
クリング反応〔〕にて生成したH2O2が、さら
に還元型NAD(P)とともに消費されてNAD(P)を生
成するために、サイクリング反応〔〕の１サイ
クルにて２分子の還元型NAD(P)の消費となり、
サイクリング反応〔〕に比べて２倍の還元型
NAD(P)の変化量となるので、より高感度に測定
できる。 さらにまた、この還元型NAD(P)を加える代り
にNADを反応液中に加え、このNAD(P)を基質と
する第２のデヒドロゲナーゼおよびそのデヒドロ
ゲナーゼ用の基質化合物を加え、これらNAD(P)、
第２のデヒドロゲナーゼ、デヒドロゲナーゼ用基
質化合物の各成分を組合せて用いてNADのサイ
クリング反応を行つて還元型NAD(P)を生成させ
てもよい。また、さらに上記の成分を用いてサイ
クリング反応〔〕を形成せしめ、反応によつて
生じたNAD(P)にこのNAD(P)のサイクリング反応
を組合せて、下記反応〔〕にて表わされる第２
のサイクリング反応を形成せしめてもよい。
NAD(P) 3β〓ヒドロキシ 還
元型
ステロイドデヒ NAD(
P)
ドロゲナーゼ
このサイクリング反応〔〕においては、サイ
クリング反応〔〕にて生成したH2O2が、さら
に還元型NAD(P)とともに消費されてNAD(P)を生
成するために、サイクリング反応〔〕の１サイ
クルにて２分子の還元型NAD(P)の消費となり、
サイクリング反応〔〕に比べて２倍の還元型
NAD(P)の変化量となるので、より高感度に測定
できる。 さらにまた、この還元型NAD(P)を加える代り
にNADを反応液中に加え、このNAD(P)を基質と
する第２のデヒドロゲナーゼおよびそのデヒドロ
ゲナーゼ用の基質化合物を加え、これらNAD(P)、
第２のデヒドロゲナーゼ、デヒドロゲナーゼ用基
質化合物の各成分を組合せて用いてNADのサイ
クリング反応を行つて還元型NAD(P)を生成させ
てもよい。また、さらに上記の成分を用いてサイ
クリング反応〔〕を形成せしめ、反応によつて
生じたNAD(P)にこのNAD(P)のサイクリング反応
を組合せて、下記反応〔〕にて表わされる第２
のサイクリング反応を形成せしめてもよい。
【表】
ロゲナーゼ用
ゲナーゼ基質化
基質化合物
合物の酸化物
以下サイクリング反応〔〕に基いて被検液中
の１成分〔→にて示す〕と、サイクリング反応
〔〕を形成する成分〔 にて示す〕とについ
て更に詳しく述べる。 (a) 被検液中の１成分が3β−ヒドロキシステロ
イドである場合：
ゲナーゼ基質化
基質化合物
合物の酸化物
以下サイクリング反応〔〕に基いて被検液中
の１成分〔→にて示す〕と、サイクリング反応
〔〕を形成する成分〔 にて示す〕とについ
て更に詳しく述べる。 (a) 被検液中の１成分が3β−ヒドロキシステロ
イドである場合：
【表】
このように3β−ヒドロキシステロイドを含
有、または遊離、生成する酵素反応系などの被
検液中の１成分が3β−ヒドロキシステロイド
である場合には、サイクリング反応〔ａ〕を
形成する成分として3β−ヒドロキシステロイ
ドオキシダーゼ、3β−ヒドロキシステロイド
デヒドロゲナーゼ、O2および還元型NAD(P)が
用いられる。このサイクリング反応〔ａ〕に
おいて、3β−ヒドロキシステロイドデヒドロ
ゲナーゼは被検液中の3β−ヒドロキシステロ
イドを基質として、１分子の3β−ヒドロキシ
ステロイドとO2とを消費して１分子のH2O2と
３−ケトステロイを生成し、さらにこの３−ケ
トステロイドを基質として3β−ヒドロキシス
テロイドデヒドロゲナーゼは１分子の３−ケト
ステロイドと還元型NAD(P)を消費して１分子
の３−ヒドロキシステロイドとNAD(P)を生成
し、３−ヒドロキシテロイド−３−ケトステロ
イドのサイクル反応を形成する。反応において
O2は反応系における溶存酸素を利用すればよ
いので、3β−ヒドロキシステロイドオキシダ
ーゼ、3β−ヒドロキシステロイドデヒドロゲ
ナーゼおよび還元型NAD(P)を測定のための試
薬として過剰量用いればよい。この被検液中の
3β−ヒドロキシステロイドの含有量は特に限
定されるものではないが、高濃度の場合には適
宜希釈して用いればよい。また用いられる3β
−ヒドロキシステロイドオキシダーゼや3β−
ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼの使用
量としては特に限定されるものではなく被検液
中の3β−ヒドロキシステロイドの量に基いて
適宜決定されるが、3β−ヒドロキシステロイ
ドの量と相対的に加減して用いればよいのであ
つて、通常１テスト当り3β−ヒドロキシステ
ロイドオキシダーゼは0.2単位／ml以上、好ま
しくは10−30単位／ml程度、3β−ヒドロキシ
ステロイドデヒドロゲナーゼは、0.05単位／ml
以上、好ましくは２−４単位／mlである。さら
に還元型NAD(P)の使用量としては被検液中の
3β−ヒドロキシステロイドの量と反応時間に
よるサイクリング数の積以上の量を用いればよ
く、通常3β−ヒドロキシステロイドの量に比
べて大過剰の量が用いられ、例えば50倍量以
上、好ましくは100〜10000倍量用いることがよ
いが、また、この量以上用いることを何んら限
定するものではない。さらにこのサイクリング
反応〔ａ〕の後反応によつて生ずる検出でき
る変化の量としては、反応によつて消費させる
O2の量、消費される還元型NAD(P)の量や生成
されるH2O2の量が挙られる。さらにこのサイ
クリング反応〔ａ〕における生成成分である
H2O2と消費される成分である還元型NAD(P)を
反応せしめて、前記反応〔〕で示したごと
く、より高感度の測定を行つてもよい。即ち、
このサイクリング反応〔ａ〕に、１分子
H2O2と１分子の還元型NAD(P)を消費して２分
子の水と１分子のNAD(P)を生成する反応を触
媒する酵素であるNAD(P)ペルオキシダーゼを
組合せ、サイクリング反応〔ａ〕にて生成し
たH2O2の量に対応して還元型NAD(P)と反応し
てNAD(P)を生成させるものである。この反応
においてNAD(P)ペルオキシダーゼは通常１テ
スト当り0.5単位以上用いればよく、好ましく
は１〜20単位程度用いればよい。また反応によ
つて生ずる検出できる変化の量としては、反応
によつて消費させる還元型NAD(P)の量にて測
定することが望ましい。 (b) 被検液中の１成分が３−ケトステロイドであ
る場合：
有、または遊離、生成する酵素反応系などの被
検液中の１成分が3β−ヒドロキシステロイド
である場合には、サイクリング反応〔ａ〕を
形成する成分として3β−ヒドロキシステロイ
ドオキシダーゼ、3β−ヒドロキシステロイド
デヒドロゲナーゼ、O2および還元型NAD(P)が
用いられる。このサイクリング反応〔ａ〕に
おいて、3β−ヒドロキシステロイドデヒドロ
ゲナーゼは被検液中の3β−ヒドロキシステロ
イドを基質として、１分子の3β−ヒドロキシ
ステロイドとO2とを消費して１分子のH2O2と
３−ケトステロイを生成し、さらにこの３−ケ
トステロイドを基質として3β−ヒドロキシス
テロイドデヒドロゲナーゼは１分子の３−ケト
ステロイドと還元型NAD(P)を消費して１分子
の３−ヒドロキシステロイドとNAD(P)を生成
し、３−ヒドロキシテロイド−３−ケトステロ
イドのサイクル反応を形成する。反応において
O2は反応系における溶存酸素を利用すればよ
いので、3β−ヒドロキシステロイドオキシダ
ーゼ、3β−ヒドロキシステロイドデヒドロゲ
ナーゼおよび還元型NAD(P)を測定のための試
薬として過剰量用いればよい。この被検液中の
3β−ヒドロキシステロイドの含有量は特に限
定されるものではないが、高濃度の場合には適
宜希釈して用いればよい。また用いられる3β
−ヒドロキシステロイドオキシダーゼや3β−
ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼの使用
量としては特に限定されるものではなく被検液
中の3β−ヒドロキシステロイドの量に基いて
適宜決定されるが、3β−ヒドロキシステロイ
ドの量と相対的に加減して用いればよいのであ
つて、通常１テスト当り3β−ヒドロキシステ
ロイドオキシダーゼは0.2単位／ml以上、好ま
しくは10−30単位／ml程度、3β−ヒドロキシ
ステロイドデヒドロゲナーゼは、0.05単位／ml
以上、好ましくは２−４単位／mlである。さら
に還元型NAD(P)の使用量としては被検液中の
3β−ヒドロキシステロイドの量と反応時間に
よるサイクリング数の積以上の量を用いればよ
く、通常3β−ヒドロキシステロイドの量に比
べて大過剰の量が用いられ、例えば50倍量以
上、好ましくは100〜10000倍量用いることがよ
いが、また、この量以上用いることを何んら限
定するものではない。さらにこのサイクリング
反応〔ａ〕の後反応によつて生ずる検出でき
る変化の量としては、反応によつて消費させる
O2の量、消費される還元型NAD(P)の量や生成
されるH2O2の量が挙られる。さらにこのサイ
クリング反応〔ａ〕における生成成分である
H2O2と消費される成分である還元型NAD(P)を
反応せしめて、前記反応〔〕で示したごと
く、より高感度の測定を行つてもよい。即ち、
このサイクリング反応〔ａ〕に、１分子
H2O2と１分子の還元型NAD(P)を消費して２分
子の水と１分子のNAD(P)を生成する反応を触
媒する酵素であるNAD(P)ペルオキシダーゼを
組合せ、サイクリング反応〔ａ〕にて生成し
たH2O2の量に対応して還元型NAD(P)と反応し
てNAD(P)を生成させるものである。この反応
においてNAD(P)ペルオキシダーゼは通常１テ
スト当り0.5単位以上用いればよく、好ましく
は１〜20単位程度用いればよい。また反応によ
つて生ずる検出できる変化の量としては、反応
によつて消費させる還元型NAD(P)の量にて測
定することが望ましい。 (b) 被検液中の１成分が３−ケトステロイドであ
る場合：
【表】
このように３−ケトステロイドを含有、または
遊離、生成する酵素反応系などの被検液中の１成
分が３−ケトステロイドである場合、サイクリン
グ反応〔ｂ〕を形成する成分としては3β−ヒ
ドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ、3β−ヒ
ドロキシスロイドオキシダーゼ、O2および還元
型NAD(P)が用いられる。このサイクリング反応
〔ｂ〕において、被検液中の３−ケトステロイ
ドを基質として、１分子の３−ケトステロイドと
還元型NAD(P)を消費して１分子のNAD(P)と3β−
ヒドロキシステロイドを生成し、さらにこの3β
−ヒドロキシステロイドを基質として3β−ヒド
ロキシステロイドオキシダーゼは、１分子の3β
−ヒドロキシステロイドとO2を消費して、１分
子のH2O2と３−ケトステロイドを生成する。か
くして３−ケトステロイド−3β−ヒドロキシス
テロイドのサイクル反応が生成される。この反応
においてO2は溶存酸素の利用で足りるので、3β
−ヒドロキシステロイドオキシダーゼ、3β−ヒ
ドロキシステロイドデヒドロゲナーゼおよび還元
型NAD(P)を測定のための試薬として過剰量用い
ればよい。また用いられる3β−ヒドロキシステ
ロイドデヒドロゲナーゼおよび3β−ヒドロキシ
ステロイドオキダーゼの使用量としては特に限定
されるものではなく、通常前者においては0.0単
位／ml以上、後者においては0.2単位／ml以上用
いればよく、好ましくは3β−ヒドロキシステロ
イドデヒドロゲナーゼ10〜30単位／ml程度、3β
−ヒドロキシステロイドオキシダーゼは２〜４単
位／ml程度であり、またこれ以上の酵素を用いて
もよい。さらに還元型NAD(P)の使用量としては
被検液中の３−ケトステロイドの量と反応時間に
よるサイクリング数の積以上の量を用いればよ
く、通常３−ケトステロイドの量に比べて大過剰
の量が用いられ、例えば50倍量以上好ましくは
100〜10000倍量用いることがよい。さらにこのサ
イクリング反応〔ｂ〕の後反応によつて生ずる
検出できる変化の量としては、消費されるO2の
量、消費される還元型NAD(P)の量や生成される
H2O2の量が挙られる。さらにこのサイクリング
反応〔ｂ〕に、前記〔〕で示したNAD(P)ペ
ルオキシダーゼを用いて、より高感度な測定法と
なしてもよい。 次に、前記反応式〔〕で示した第２のデヒド
ロゲナーゼおよびその基質を使用する方法につい
て詳述する。
遊離、生成する酵素反応系などの被検液中の１成
分が３−ケトステロイドである場合、サイクリン
グ反応〔ｂ〕を形成する成分としては3β−ヒ
ドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ、3β−ヒ
ドロキシスロイドオキシダーゼ、O2および還元
型NAD(P)が用いられる。このサイクリング反応
〔ｂ〕において、被検液中の３−ケトステロイ
ドを基質として、１分子の３−ケトステロイドと
還元型NAD(P)を消費して１分子のNAD(P)と3β−
ヒドロキシステロイドを生成し、さらにこの3β
−ヒドロキシステロイドを基質として3β−ヒド
ロキシステロイドオキシダーゼは、１分子の3β
−ヒドロキシステロイドとO2を消費して、１分
子のH2O2と３−ケトステロイドを生成する。か
くして３−ケトステロイド−3β−ヒドロキシス
テロイドのサイクル反応が生成される。この反応
においてO2は溶存酸素の利用で足りるので、3β
−ヒドロキシステロイドオキシダーゼ、3β−ヒ
ドロキシステロイドデヒドロゲナーゼおよび還元
型NAD(P)を測定のための試薬として過剰量用い
ればよい。また用いられる3β−ヒドロキシステ
ロイドデヒドロゲナーゼおよび3β−ヒドロキシ
ステロイドオキダーゼの使用量としては特に限定
されるものではなく、通常前者においては0.0単
位／ml以上、後者においては0.2単位／ml以上用
いればよく、好ましくは3β−ヒドロキシステロ
イドデヒドロゲナーゼ10〜30単位／ml程度、3β
−ヒドロキシステロイドオキシダーゼは２〜４単
位／ml程度であり、またこれ以上の酵素を用いて
もよい。さらに還元型NAD(P)の使用量としては
被検液中の３−ケトステロイドの量と反応時間に
よるサイクリング数の積以上の量を用いればよ
く、通常３−ケトステロイドの量に比べて大過剰
の量が用いられ、例えば50倍量以上好ましくは
100〜10000倍量用いることがよい。さらにこのサ
イクリング反応〔ｂ〕の後反応によつて生ずる
検出できる変化の量としては、消費されるO2の
量、消費される還元型NAD(P)の量や生成される
H2O2の量が挙られる。さらにこのサイクリング
反応〔ｂ〕に、前記〔〕で示したNAD(P)ペ
ルオキシダーゼを用いて、より高感度な測定法と
なしてもよい。 次に、前記反応式〔〕で示した第２のデヒド
ロゲナーゼおよびその基質を使用する方法につい
て詳述する。
【表】
テロ
イド
このようにサイクリング反応〔ａ〕を形成す
るための成分としては、３−ケトステロイドまた
は3β−ヒドロキシステロイドのいずれか一方、
3β−ヒドロキシステロイドオキシダーゼ、3β−
ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ、O2、
NAD(P)または還元型NAD(P)のいずれか一方、第
２のデヒドロゲナーゼ、この第２のデヒドロゲナ
ーゼ用基質化合物が用いられる。このサイクリン
グ反応〔ａ〕において、第２のデヒドロゲナー
ゼは１分子のNAD(P)と第２のデヒドロゲナーゼ
用基質化合物を消費して、１分子の基質化合物と
酸化物の還元型NAD(P)を生成し、この還元型
NAD(P)はNAD(P)の生成を伴う３−ケトステロイ
ド−3β−ヒドロキシステロイドのサイクル反応
と共役するのである。この生成した還元型NAD
(P)は、その１分子当り等モル比の３−ケトステロ
イドとともに3β−ヒドロキシステロイドデヒド
ロゲナーゼの作用をうけて１分子のNAD(P)と3β
−ヒドロキシステロイドを生成し、さらに3β−
ヒドロキシステロイドオキシダーゼの作用によ
り、１分子の3β−ヒドロキシステロイドとO2を
消費して１分子のH2O2と３−ケトステロイドを
生成する。この反応においてもO2は溶存酸素の
利用で足りるので、3β−ヒドロキシステロイド
オキシダーゼ、3β−ヒドロキシステロイドデヒ
ドロゲナーゼ、NAD(P)〔または還元型NAD(P)〕、
第２のデヒドロゲナーゼ、この第２のデヒドロゲ
ナーゼ用基質化合物を測定のための試薬として過
剰量用いればよい。さらにこのサイクリング反応
〔ａ〕の後反応によつて生ずる検出できる変化
の量としては、消費されるO2の量または生成さ
れるH2O2の量が挙られる。 またこのサイクリング反応〔ａ〕に用いられ
る第２のデヒドロゲナーゼとしては、このデヒド
ロゲナーゼ用基質化合物とNAD(P)とを基質とし
てその基質化合物の酸化物および還元型NAD(P)
を生成する反応を触媒する酵素であればよく、た
とえば以下の反応を触媒するデヒドロゲナーゼと
このデヒドロゲナーゼ用基質化合物が例示され
る。 (a) 第２のデヒドロゲナーゼがＤ−アラビニトー
ルデヒドゲナーゼ（Ａ Dase：EC.1.1.1.11）
であり、デヒドロゲナーゼ用基質化合物がＤ−
アラビトールである組合せ反応： Ｄ−アラビトール＋NAD ―――――→ ADaseＤ−キシロース＋還元型NAD (b) 第２のデヒドロゲナーゼがラクテートデヒド
ロゲナーゼ（LDH、EC.1.1.1.27）、デヒドロゲ
ナーゼ用基質化合物がＬ−乳酸である組合せ反
応： Ｌ−乳酸＋NAD ―――→ LDHピルビン酸＋還元型NAD (c) 第２のデヒドロゲナーゼがマレイトデヒドロ
ゲナーゼ（デカルボキシレイテイング）
（EC.1.1.1.28）、デヒドロゲナーゼ用基質化合物
がＬ−リンゴ酸である組合せ反応： Ｌ−リンゴ酸＋NAD ―――――――――――――――――→ マレイトデヒドロゲナーゼ マレイトデヒドロゲナーゼ （デカルボキシレイテイング）ピルピン酸＋CO2＋還元
型NAD (d) 第２のデヒドロゲナーゼがグルコースデヒド
ロゲナーゼ（EC.1.1.147）、デヒドロゲナーゼ
用基質化合物がグルコースである組合せ反応： β−Ｄ−グルコース＋NAD ―――――――――――――――――→ ―――――――――――――――――→ グルコースデヒドロゲナーゼＤ−グルコノ−δ−ラクト
ン＋還元型NAD (e) 第２のデヒドロゲナーゼがホルメイトデヒド
ロゲナーゼ（EC.1.2.12）、デヒドロゲナーゼ用
基質化合物がギ酸である組合せ反応： ギ酸＋NAD ―――――――――――――――――→ ホルメイトデヒドロゲナーゼCO2＋還元型NAD (f) 第２のデヒドロゲナーゼがガラクト−スデヒ
ドロゲナーゼ（EC.1.1.1.48）、デヒドロゲナー
ゼ用基質化合物がＤ−ガラクトースである組合
せ反応： Ｄ−ガラクトース＋NAD ――――――――――――――――――→ ――――――――――――――――――→ ガラクトースデヒドロゲナーゼＤ−ガラクトノ−γ−ラ
クトン＋還元型NAD これらのサイクリング反応〔ａ〕に用いられ
る角試薬は被検液中の還元型NAD(P)やNAD(P)の
量に比べて大過剰に用いることが好ましい。さら
にこのNAD(P)のサイクリング反応は、前記反応
の〔ａ〕、〔ｂ〕において用いられる還元型
NAD(P)の代りに、NAD(P)、第２のデヒドロゲナ
ーゼ、第２のデヒドロゲナーゼ用基質を用いて、
還元型NAD(P)を生成する反応系としてサイクリ
ング反応〔〕を形成せしめるために利用しても
よい。 次いで、3β−ヒドロキシステロイドまたは３
−ケトステロイドを含有する被検液またはその１
成分を遊離、生成する酵素反応系の被検液を対象
として目的とする成分を定量するのであるが、定
量に当つては目的とする成分と前記のサイクリン
グ反応〔ａ〕、〔ｂ〕または〔〕ないし〔
ａ〕、または〔〕の反応に基いて行えばよい。
また被検液中の成分の一定量に対して各サイクリ
ング反応は10サイクル以上の反応を生ずることか
ら、少なくとも目的成分に比べてそのサイクル数
以上のモル比に相当した量の試薬を用いればよ
く、さらに極めて少量の被検液もしくは希釈した
被検液を用いればよい。またこの反応における媒
体としては、用いる各酵素の活性の安定なPH域の
ものであればよく、通常弱酸性ないし弱アルカリ
性、例えばPH6.5〜8.5のリン酸緩衝液、トリス−
HC1緩衝液、イミダゾール−HC1緩衝液、ジメ
チルグルタール酸−NaOH緩衝液、ピペス−
NaOH緩衝液などが用いられる。さらに反応に
当つては、通常37℃付近にて１分以上反応せしめ
ればよい。このサイクリング反応〔〕は、用い
る酵素の量やKm値によつて異なるが、通常１分
間当り50サイクル以上の反応を行うもので、好ま
しくは１分間当り60サイクル以上の反応を行うよ
うな酵素量、その他の試薬を用いればよい。 このようにして反応せしめた後、次いで反応に
よつて生ずる検出できる変化の量を定量するので
あるが、この検出できる変化としては、サイクリ
ング反応〔〕の3β−ヒドロキシステロイドま
たは３−ケトステロイドの１モル比の生成または
消費の１回サイクル反応において、モル比の成分
を消費するか、または生成する成分が挙られ、こ
れらの成分としては、消費されるO2、消費され
る還元型NAD(P)、生成されるH2O2の各成分が挙
られる。まず消費されるO2の量の定量に当つて
は、通常酸素電極を用いる電気化学的変化の量と
して定量すればよい。また還元型NAD(P)の消費
量の定量に当つては、あらかじめ用いた量の還元
型NAD(P)から反応後に残存する還元型NAD(P)の
差を求めることによつてなされる。この反応後に
残存する還元型NAD(P)の量またはあらかじめ用
いた還元型NAD(P)の量の定量は、公知の種々の
還元型NAD(P)の定量法が用いられる、この還元
型NAD(P)の定量法としては、例えば共存する
NAD(P)に特異的吸収波長でなく、還元型NAD(P)
の特異的吸収波長である吸収波長域の波長に基づ
いて吸光度測定すればよい。NAD(P)は260nｍ近
辺に特異的極大吸収波長を有し、還元型NADは
260nｍおよび340nｍ近辺に特異的極大吸収波長
を有することから、還元型NAD(P)の定量のため
の特異的吸収波長である吸収波長域としては
320nｍ〜360nｍ近辺であり、好ましくは340nｍ
近辺である。この波長により残存する還元型
NADを吸光度値として定量される。さらに別の
還元型NAD(P)の定量法としては、還元型NAD(P)
の水素原子の受容能を有する水素原子伝達系色原
体の発色による方法が挙られる。この水素原子伝
達系色原体としては、例えば３−（ｐ−ヨードフ
エニル）−２−（ｐ−ニトロフエニル）−５−フエ
ニル−2H−テトラゾリウム・クロラド、３−
（４，５−ジメチル−２−チアゾリル）−２，５−
ジフエニル−2H−テトラゾリウム・プロマイド、
３，3′−（４，４−ビフエニリレン）−ビス（２，
５−ジフエニル−2H−テトラゾリウム・クロラ
イド）、３，3′−（３，3′−ジメトキシ−４，４−
ビフエニリレン）−ビス〔２−（ｐ−ニトロフエニ
ル）−５−フエニル−2H−テトラゾリウム・クロ
ライド〕（別名：ニトロテトラゾリウム：NTB）、
３，3′−（３，3′−ジメトキシ−４，4′−ビフエニ
リレン）−ビス〔２，５−ビス（ｐ−ニトロフエ
ニル）−2H−テトラゾリウム・クロライド〕、３，
3′−（３，3′−ジメトキシ−４，4′−ビフエニリレ
ン）−ビス（２，５−ジフエニル−2H−テトラゾ
リウム・クロライド）などのテトラゾリウム塩や
２，６−ジクロロフエノールインドフエノールな
どが用いられる。これらのうち、好ましくは水溶
性テトラゾリウム塩とジアホラーゼまたはフエナ
ジンメトサルフエートを組合せ用いて電子伝達を
良好にしたものを用いればよい。この水素伝達系
色原体は還元型NAD(P)の水素原子を受けて呈色
するホルマザン色素を形成するもので、このホル
マザン色素をその吸収波長域、例えば500nｍ〜
550nｍにおける極大吸収波長域に基づいて吸光
度測定すればよい。さらに別の測定法としては、
例えば還元型NAD(P)にレザズリンなどの螢光用
試薬の共存下ジアホラーゼを作用せしめて反応に
よつて螢光する成分の量を定量してもよい。特に
還元型NAD(P)を定量するに当つては、サイクリ
ング反応〔〕においてH2O2の成分を伴うため
にカタラーゼを用いてH2O2を分解、消去せしめ
ることが好ましい。さらに感度を向上させるため
には、サイクリング反応〔〕の系にさらに
NADベルオキシダーゼ（EC.1.11..1.1）を作用さ
せ、生じたH2O2を還元型NADの減少に変え、２
倍の感度で測定する前記〔〕によつてもよい。
また生成する成分であるH2O2の定量に当つては、
過酸化水素電極を用いる電気化学的変化の量とし
て定量するか、またはH2O2と反応して検出でき
る反応物に変化する指示薬組成物を用いて定量し
てもよい。この指示薬組成物としては、通常色調
の変化を可視にて生ずる呈色薬組成物、光照射に
より螢光を発する螢光薬組成物や発色する発行薬
組成物である分光光学的手段によりその変化の量
を定量し得る組織物が用いられる。 このように本発明は、3β−ヒドロキシステロ
イドデヒドロゲナーゼと3β−ヒドロキシステロ
イドオキシダーゼを共役させて測定しようとする
基質の3β−ヒドロキシステロイド−３−ケトス
テロイドサイクル反応による被検液中の3β−ヒ
ドロキシステロイドまたは３−ケトステロイドの
新規な定量法であり、かつ１分間当り10サイクル
以上の高サイクル反応を行うために、従来技術の
100〜1000倍／10分という極めて高感度にて血中、
尿中など被検液中の3β−ヒドロキシステロイド
または３−ケトステロイド成分を測定できる優れ
た方法である。 次いで本発明の実施例を挙げて具体的に述べる
が、本発明はこれらによつて何んら限定されるも
のではない。 実施例 １ 下記の組成を有する反応液を用いた。 ●50ｍＭ リン酸緩衝液（PH7.5） ●3β−ヒドロキシステロイドオキシダーゼ（東
洋醸造製、Strep tomyces SP.由来）20単位／
ml ●3β−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ
（Pseudomonas teststeroni 由来、SIGMA社
製）２単位／ml ●1.5ｍＭ 還元型NAD（NADH2） ●0.1％ トリトンＸ−100 上記反応液0.5mlを小試験管にとり、37℃に加
温した後、被検液として０、５、10、15、20μM
のプレグネノロンを含有する溶液10μを添加
し、37℃て正確に10分間反応した。２％ドデシル
硫酸ナトリウム（SDS）溶液2.5mlを添加して反
応を停止し、反応液の吸光度を340nｍで測定し
た。その結果は、第１図に●−●にて示す通りで
極めて良好な定量性が得られた。なお、このとき
のサイクリング率は80サイクル／分であつた。ま
た上記反応組成における還元型NADの代りに、
還元型NAD(P)を用いて、以下同様に行なつた結
果、第１図に△−△で示す通り良好な定量性が得
られた。さらに上記の還元型NADを用いる反応
組成にNADH2ペルオコシダーゼを９単位／mlを
添加した反応液を用いて、同様の反応操作を行つ
た結果は第１図に○−○にて示す通りで、２倍の
吸光度の変化が得られた。 実施例 ２ 下記の組成を有する反応液を用いた。 ●50ｍＭ リン酸緩衝液PH8.0 ●3β−ヒドロキシステロイドオキシダーゼ20単
位／ml ●3β−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ
４単位／ml ●0.2ｍＭ 還元型NAD（NADH2） ●0.1％ トリトンＸ−100 上記反応液1.0mlを石英セル（1.0ml用）に加
え、37℃に設定した恒温セルホルダーを有する分
光光度計にセツトした。次いでこれに、各々０、
５、10、15、20、25μMのプレグネノロンを含有
する被検液10μを添加した後、37℃で反応し
た。反応開始後２分から４分目の２分間の吸光度
変化を340nｍの波長で測定した。その結果は第
２図の○−○にて示す通りでプレグネノロンの量
と吸光度の間に良好な直線関係が得られ、このと
きのサイクリング率は65サイクル／分であつた。 また同じ濃度になるようにプレグネノロンを添
加した人血清を用いて、以下同様に行つた結果、
第２図の●−●に示す通り同様に良好な定量性が
得られた。 実施例 ３ 実施例１に示した組成を有する0.5mlに０、５、
10、15、20μMのテストステロンを含有する溶液
10μを添加して、実施例１と同様の操作で反応
を行つた。その結果は第３図に示す通りで、テス
トステロンにおいても極めて良好な定量性が得ら
れた。 実施例 ４ 実施例２に示した組成の反応液1.0mlをガルバ
ニー型酸素電極を装着した反応槽に加え、37℃に
保温した。これに各々０、５、10、15、20μMの
プレグネノロンを含有する溶液10μを添加し
て、10分間37℃にて反応させたときの酸素消費量
を測定した。その結果は第４図に示す通りで、極
めて高感度に測定できた。 実施例 ５ 実施例１に示した反応液に、被検液として０、
５、10、15、20μMのプレグネノロン、アンドロ
ステロン、デヒドロイソアンドロステロンまたは
アンドロステンジオン−3β、17β−ジオンを含有
する溶液20μを添加し、実施例１に記したと同
様の操作を行つて測定した。その結果は第５図に
示す通りであつた。 図中○−○：プレグネノロン、●−●：アンド
ロステロン、△−△：デヒドロイソアンドロステ
ロン、▲−▲：アンドロステロン−3β、17β−ジ
オールを示す。 実施例 ６ プレグネノロンを０、５、10、15、20、25μM
の濃度になるように人血清に添加して被検液とし
た。この被検液20μを実施例１に示した反応液
に添加し、その他は実施例１に示した方法で反応
を行い、ブレグネノロンを測定した。その結果は
第６図に示す通りで良好な回収率が得られた。
イド
このようにサイクリング反応〔ａ〕を形成す
るための成分としては、３−ケトステロイドまた
は3β−ヒドロキシステロイドのいずれか一方、
3β−ヒドロキシステロイドオキシダーゼ、3β−
ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ、O2、
NAD(P)または還元型NAD(P)のいずれか一方、第
２のデヒドロゲナーゼ、この第２のデヒドロゲナ
ーゼ用基質化合物が用いられる。このサイクリン
グ反応〔ａ〕において、第２のデヒドロゲナー
ゼは１分子のNAD(P)と第２のデヒドロゲナーゼ
用基質化合物を消費して、１分子の基質化合物と
酸化物の還元型NAD(P)を生成し、この還元型
NAD(P)はNAD(P)の生成を伴う３−ケトステロイ
ド−3β−ヒドロキシステロイドのサイクル反応
と共役するのである。この生成した還元型NAD
(P)は、その１分子当り等モル比の３−ケトステロ
イドとともに3β−ヒドロキシステロイドデヒド
ロゲナーゼの作用をうけて１分子のNAD(P)と3β
−ヒドロキシステロイドを生成し、さらに3β−
ヒドロキシステロイドオキシダーゼの作用によ
り、１分子の3β−ヒドロキシステロイドとO2を
消費して１分子のH2O2と３−ケトステロイドを
生成する。この反応においてもO2は溶存酸素の
利用で足りるので、3β−ヒドロキシステロイド
オキシダーゼ、3β−ヒドロキシステロイドデヒ
ドロゲナーゼ、NAD(P)〔または還元型NAD(P)〕、
第２のデヒドロゲナーゼ、この第２のデヒドロゲ
ナーゼ用基質化合物を測定のための試薬として過
剰量用いればよい。さらにこのサイクリング反応
〔ａ〕の後反応によつて生ずる検出できる変化
の量としては、消費されるO2の量または生成さ
れるH2O2の量が挙られる。 またこのサイクリング反応〔ａ〕に用いられ
る第２のデヒドロゲナーゼとしては、このデヒド
ロゲナーゼ用基質化合物とNAD(P)とを基質とし
てその基質化合物の酸化物および還元型NAD(P)
を生成する反応を触媒する酵素であればよく、た
とえば以下の反応を触媒するデヒドロゲナーゼと
このデヒドロゲナーゼ用基質化合物が例示され
る。 (a) 第２のデヒドロゲナーゼがＤ−アラビニトー
ルデヒドゲナーゼ（Ａ Dase：EC.1.1.1.11）
であり、デヒドロゲナーゼ用基質化合物がＤ−
アラビトールである組合せ反応： Ｄ−アラビトール＋NAD ―――――→ ADaseＤ−キシロース＋還元型NAD (b) 第２のデヒドロゲナーゼがラクテートデヒド
ロゲナーゼ（LDH、EC.1.1.1.27）、デヒドロゲ
ナーゼ用基質化合物がＬ−乳酸である組合せ反
応： Ｌ−乳酸＋NAD ―――→ LDHピルビン酸＋還元型NAD (c) 第２のデヒドロゲナーゼがマレイトデヒドロ
ゲナーゼ（デカルボキシレイテイング）
（EC.1.1.1.28）、デヒドロゲナーゼ用基質化合物
がＬ−リンゴ酸である組合せ反応： Ｌ−リンゴ酸＋NAD ―――――――――――――――――→ マレイトデヒドロゲナーゼ マレイトデヒドロゲナーゼ （デカルボキシレイテイング）ピルピン酸＋CO2＋還元
型NAD (d) 第２のデヒドロゲナーゼがグルコースデヒド
ロゲナーゼ（EC.1.1.147）、デヒドロゲナーゼ
用基質化合物がグルコースである組合せ反応： β−Ｄ−グルコース＋NAD ―――――――――――――――――→ ―――――――――――――――――→ グルコースデヒドロゲナーゼＤ−グルコノ−δ−ラクト
ン＋還元型NAD (e) 第２のデヒドロゲナーゼがホルメイトデヒド
ロゲナーゼ（EC.1.2.12）、デヒドロゲナーゼ用
基質化合物がギ酸である組合せ反応： ギ酸＋NAD ―――――――――――――――――→ ホルメイトデヒドロゲナーゼCO2＋還元型NAD (f) 第２のデヒドロゲナーゼがガラクト−スデヒ
ドロゲナーゼ（EC.1.1.1.48）、デヒドロゲナー
ゼ用基質化合物がＤ−ガラクトースである組合
せ反応： Ｄ−ガラクトース＋NAD ――――――――――――――――――→ ――――――――――――――――――→ ガラクトースデヒドロゲナーゼＤ−ガラクトノ−γ−ラ
クトン＋還元型NAD これらのサイクリング反応〔ａ〕に用いられ
る角試薬は被検液中の還元型NAD(P)やNAD(P)の
量に比べて大過剰に用いることが好ましい。さら
にこのNAD(P)のサイクリング反応は、前記反応
の〔ａ〕、〔ｂ〕において用いられる還元型
NAD(P)の代りに、NAD(P)、第２のデヒドロゲナ
ーゼ、第２のデヒドロゲナーゼ用基質を用いて、
還元型NAD(P)を生成する反応系としてサイクリ
ング反応〔〕を形成せしめるために利用しても
よい。 次いで、3β−ヒドロキシステロイドまたは３
−ケトステロイドを含有する被検液またはその１
成分を遊離、生成する酵素反応系の被検液を対象
として目的とする成分を定量するのであるが、定
量に当つては目的とする成分と前記のサイクリン
グ反応〔ａ〕、〔ｂ〕または〔〕ないし〔
ａ〕、または〔〕の反応に基いて行えばよい。
また被検液中の成分の一定量に対して各サイクリ
ング反応は10サイクル以上の反応を生ずることか
ら、少なくとも目的成分に比べてそのサイクル数
以上のモル比に相当した量の試薬を用いればよ
く、さらに極めて少量の被検液もしくは希釈した
被検液を用いればよい。またこの反応における媒
体としては、用いる各酵素の活性の安定なPH域の
ものであればよく、通常弱酸性ないし弱アルカリ
性、例えばPH6.5〜8.5のリン酸緩衝液、トリス−
HC1緩衝液、イミダゾール−HC1緩衝液、ジメ
チルグルタール酸−NaOH緩衝液、ピペス−
NaOH緩衝液などが用いられる。さらに反応に
当つては、通常37℃付近にて１分以上反応せしめ
ればよい。このサイクリング反応〔〕は、用い
る酵素の量やKm値によつて異なるが、通常１分
間当り50サイクル以上の反応を行うもので、好ま
しくは１分間当り60サイクル以上の反応を行うよ
うな酵素量、その他の試薬を用いればよい。 このようにして反応せしめた後、次いで反応に
よつて生ずる検出できる変化の量を定量するので
あるが、この検出できる変化としては、サイクリ
ング反応〔〕の3β−ヒドロキシステロイドま
たは３−ケトステロイドの１モル比の生成または
消費の１回サイクル反応において、モル比の成分
を消費するか、または生成する成分が挙られ、こ
れらの成分としては、消費されるO2、消費され
る還元型NAD(P)、生成されるH2O2の各成分が挙
られる。まず消費されるO2の量の定量に当つて
は、通常酸素電極を用いる電気化学的変化の量と
して定量すればよい。また還元型NAD(P)の消費
量の定量に当つては、あらかじめ用いた量の還元
型NAD(P)から反応後に残存する還元型NAD(P)の
差を求めることによつてなされる。この反応後に
残存する還元型NAD(P)の量またはあらかじめ用
いた還元型NAD(P)の量の定量は、公知の種々の
還元型NAD(P)の定量法が用いられる、この還元
型NAD(P)の定量法としては、例えば共存する
NAD(P)に特異的吸収波長でなく、還元型NAD(P)
の特異的吸収波長である吸収波長域の波長に基づ
いて吸光度測定すればよい。NAD(P)は260nｍ近
辺に特異的極大吸収波長を有し、還元型NADは
260nｍおよび340nｍ近辺に特異的極大吸収波長
を有することから、還元型NAD(P)の定量のため
の特異的吸収波長である吸収波長域としては
320nｍ〜360nｍ近辺であり、好ましくは340nｍ
近辺である。この波長により残存する還元型
NADを吸光度値として定量される。さらに別の
還元型NAD(P)の定量法としては、還元型NAD(P)
の水素原子の受容能を有する水素原子伝達系色原
体の発色による方法が挙られる。この水素原子伝
達系色原体としては、例えば３−（ｐ−ヨードフ
エニル）−２−（ｐ−ニトロフエニル）−５−フエ
ニル−2H−テトラゾリウム・クロラド、３−
（４，５−ジメチル−２−チアゾリル）−２，５−
ジフエニル−2H−テトラゾリウム・プロマイド、
３，3′−（４，４−ビフエニリレン）−ビス（２，
５−ジフエニル−2H−テトラゾリウム・クロラ
イド）、３，3′−（３，3′−ジメトキシ−４，４−
ビフエニリレン）−ビス〔２−（ｐ−ニトロフエニ
ル）−５−フエニル−2H−テトラゾリウム・クロ
ライド〕（別名：ニトロテトラゾリウム：NTB）、
３，3′−（３，3′−ジメトキシ−４，4′−ビフエニ
リレン）−ビス〔２，５−ビス（ｐ−ニトロフエ
ニル）−2H−テトラゾリウム・クロライド〕、３，
3′−（３，3′−ジメトキシ−４，4′−ビフエニリレ
ン）−ビス（２，５−ジフエニル−2H−テトラゾ
リウム・クロライド）などのテトラゾリウム塩や
２，６−ジクロロフエノールインドフエノールな
どが用いられる。これらのうち、好ましくは水溶
性テトラゾリウム塩とジアホラーゼまたはフエナ
ジンメトサルフエートを組合せ用いて電子伝達を
良好にしたものを用いればよい。この水素伝達系
色原体は還元型NAD(P)の水素原子を受けて呈色
するホルマザン色素を形成するもので、このホル
マザン色素をその吸収波長域、例えば500nｍ〜
550nｍにおける極大吸収波長域に基づいて吸光
度測定すればよい。さらに別の測定法としては、
例えば還元型NAD(P)にレザズリンなどの螢光用
試薬の共存下ジアホラーゼを作用せしめて反応に
よつて螢光する成分の量を定量してもよい。特に
還元型NAD(P)を定量するに当つては、サイクリ
ング反応〔〕においてH2O2の成分を伴うため
にカタラーゼを用いてH2O2を分解、消去せしめ
ることが好ましい。さらに感度を向上させるため
には、サイクリング反応〔〕の系にさらに
NADベルオキシダーゼ（EC.1.11..1.1）を作用さ
せ、生じたH2O2を還元型NADの減少に変え、２
倍の感度で測定する前記〔〕によつてもよい。
また生成する成分であるH2O2の定量に当つては、
過酸化水素電極を用いる電気化学的変化の量とし
て定量するか、またはH2O2と反応して検出でき
る反応物に変化する指示薬組成物を用いて定量し
てもよい。この指示薬組成物としては、通常色調
の変化を可視にて生ずる呈色薬組成物、光照射に
より螢光を発する螢光薬組成物や発色する発行薬
組成物である分光光学的手段によりその変化の量
を定量し得る組織物が用いられる。 このように本発明は、3β−ヒドロキシステロ
イドデヒドロゲナーゼと3β−ヒドロキシステロ
イドオキシダーゼを共役させて測定しようとする
基質の3β−ヒドロキシステロイド−３−ケトス
テロイドサイクル反応による被検液中の3β−ヒ
ドロキシステロイドまたは３−ケトステロイドの
新規な定量法であり、かつ１分間当り10サイクル
以上の高サイクル反応を行うために、従来技術の
100〜1000倍／10分という極めて高感度にて血中、
尿中など被検液中の3β−ヒドロキシステロイド
または３−ケトステロイド成分を測定できる優れ
た方法である。 次いで本発明の実施例を挙げて具体的に述べる
が、本発明はこれらによつて何んら限定されるも
のではない。 実施例 １ 下記の組成を有する反応液を用いた。 ●50ｍＭ リン酸緩衝液（PH7.5） ●3β−ヒドロキシステロイドオキシダーゼ（東
洋醸造製、Strep tomyces SP.由来）20単位／
ml ●3β−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ
（Pseudomonas teststeroni 由来、SIGMA社
製）２単位／ml ●1.5ｍＭ 還元型NAD（NADH2） ●0.1％ トリトンＸ−100 上記反応液0.5mlを小試験管にとり、37℃に加
温した後、被検液として０、５、10、15、20μM
のプレグネノロンを含有する溶液10μを添加
し、37℃て正確に10分間反応した。２％ドデシル
硫酸ナトリウム（SDS）溶液2.5mlを添加して反
応を停止し、反応液の吸光度を340nｍで測定し
た。その結果は、第１図に●−●にて示す通りで
極めて良好な定量性が得られた。なお、このとき
のサイクリング率は80サイクル／分であつた。ま
た上記反応組成における還元型NADの代りに、
還元型NAD(P)を用いて、以下同様に行なつた結
果、第１図に△−△で示す通り良好な定量性が得
られた。さらに上記の還元型NADを用いる反応
組成にNADH2ペルオコシダーゼを９単位／mlを
添加した反応液を用いて、同様の反応操作を行つ
た結果は第１図に○−○にて示す通りで、２倍の
吸光度の変化が得られた。 実施例 ２ 下記の組成を有する反応液を用いた。 ●50ｍＭ リン酸緩衝液PH8.0 ●3β−ヒドロキシステロイドオキシダーゼ20単
位／ml ●3β−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ
４単位／ml ●0.2ｍＭ 還元型NAD（NADH2） ●0.1％ トリトンＸ−100 上記反応液1.0mlを石英セル（1.0ml用）に加
え、37℃に設定した恒温セルホルダーを有する分
光光度計にセツトした。次いでこれに、各々０、
５、10、15、20、25μMのプレグネノロンを含有
する被検液10μを添加した後、37℃で反応し
た。反応開始後２分から４分目の２分間の吸光度
変化を340nｍの波長で測定した。その結果は第
２図の○−○にて示す通りでプレグネノロンの量
と吸光度の間に良好な直線関係が得られ、このと
きのサイクリング率は65サイクル／分であつた。 また同じ濃度になるようにプレグネノロンを添
加した人血清を用いて、以下同様に行つた結果、
第２図の●−●に示す通り同様に良好な定量性が
得られた。 実施例 ３ 実施例１に示した組成を有する0.5mlに０、５、
10、15、20μMのテストステロンを含有する溶液
10μを添加して、実施例１と同様の操作で反応
を行つた。その結果は第３図に示す通りで、テス
トステロンにおいても極めて良好な定量性が得ら
れた。 実施例 ４ 実施例２に示した組成の反応液1.0mlをガルバ
ニー型酸素電極を装着した反応槽に加え、37℃に
保温した。これに各々０、５、10、15、20μMの
プレグネノロンを含有する溶液10μを添加し
て、10分間37℃にて反応させたときの酸素消費量
を測定した。その結果は第４図に示す通りで、極
めて高感度に測定できた。 実施例 ５ 実施例１に示した反応液に、被検液として０、
５、10、15、20μMのプレグネノロン、アンドロ
ステロン、デヒドロイソアンドロステロンまたは
アンドロステンジオン−3β、17β−ジオンを含有
する溶液20μを添加し、実施例１に記したと同
様の操作を行つて測定した。その結果は第５図に
示す通りであつた。 図中○−○：プレグネノロン、●−●：アンド
ロステロン、△−△：デヒドロイソアンドロステ
ロン、▲−▲：アンドロステロン−3β、17β−ジ
オールを示す。 実施例 ６ プレグネノロンを０、５、10、15、20、25μM
の濃度になるように人血清に添加して被検液とし
た。この被検液20μを実施例１に示した反応液
に添加し、その他は実施例１に示した方法で反応
を行い、ブレグネノロンを測定した。その結果は
第６図に示す通りで良好な回収率が得られた。
第１図および第２図は本発明方法によるプレグ
ネノロンの測定結果を示し、第３図は本発明方法
によるテストステロンの測定結果を示し、第４図
は本発明方法によるプレグネノロンの測定結果を
示し、第５図は本発明方法によるプレグネノロ
ン、アンドロステンジオン、デヒドロイソアンド
ロステロン、アンドロステロン−3β、17β−ジオ
ールの測定結果を示し、第６図は本発明方法によ
るプレグネノロンの測定結果を示す。
ネノロンの測定結果を示し、第３図は本発明方法
によるテストステロンの測定結果を示し、第４図
は本発明方法によるプレグネノロンの測定結果を
示し、第５図は本発明方法によるプレグネノロ
ン、アンドロステンジオン、デヒドロイソアンド
ロステロン、アンドロステロン−3β、17β−ジオ
ールの測定結果を示し、第６図は本発明方法によ
るプレグネノロンの測定結果を示す。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ 被検液中の3β−ヒドロキシステロイドまた
は３−ケトステロイドの定量において、3β−ヒ
ドロキシステロイド、３−ケトステロイド、3β
−ヒドロキシステロイド・オキシダーゼ、3β−
ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ、NAD
(P)、還元型NAD(P)、酸素（O2）および過酸化水
素（H2O2）の成分の関与する下記サイクリング
反応〔〕 【表】 ロイドデヒドロゲナー
ゼ
を形成せしめるように被検液中の成分とサイクリ
ング反応〔〕を形成する成分とを反応せしめ、
次いで反応によつて生ずる検出できる変化の量を
定量することを特徴とする新規な高感度酵素的測
定法。 ２ サイクリング反応〔〕において、１分子の
H2O2と１分子の還元型NADを消費して２分子の
水分子と１分子のNADを生成する反応を触媒す
るNADペルオキシダーゼを作用せしめ、次いで
反応によつて生ずる検出できる変化の量を定量し
てなる特許請求の範囲第１項記載の測定法。 ３ 検出できる変化の量が、還元型NAD消費量
である特許請求の範囲第２項記載の測定法。 ４ サイクリング反応〔〕における生成NAD
(P)において、NAD(P)を基質とする第２のデヒド
ロゲナーゼおよびそのデヒドロゲナーゼ用基質化
合物を用いて生成NAD(P)に作用せしめ、NAD(P)
を還元型NAD(P)にサイクリングせしめてなる第
２サイクリング反応を形成せしめることを含む特
許請求の範囲第１項記載の測定法。 ５ 検出できる変化の量が、O2消費量である特
許請求の範囲第１項記載の測定法。 ６ 検出できる変化の量が、H2O2生成量である
特許請求の範囲第１項記載の測定法。 ７ 検出できる変化の量が、還元型NAD(P)消費
量である特許請求の範囲第１項記載の測定法。 ８ 3β−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナー
ゼが、シユードモナス テストステロニー
（Psudomonas testeroni）が産生する酵素である
特許請求の範囲第１項記載の測定法。 ９ 3β−ヒドロキシステロイド・オキシダーゼ
が、ストレプトマイセス（Streptomyces）属、
ブレビバクテリウム（Brevibacterium）属、シ
ゾフイラム（Schizophylum）属、コリネバクテ
リウム（Corynebacterium）属、セルロモナス
（Cellulomonas）属、ミコバクテリウム属
（Mycobacterium）、ノカルデイア属
（Nocardia）またはアルスロバクター
（Arthrobacter）属が産生する酵素である特許請
求の範囲第１項記載の測定法。
Priority Applications (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP15143884A JPS6131097A (ja) | 1984-07-23 | 1984-07-23 | 新規な高感度酵素的測定法 |
| DE3526334A DE3526334C2 (de) | 1984-07-23 | 1985-07-23 | Hochempfindlicher quantitativer enzymatischer Assay |
| US06/757,953 US4791057A (en) | 1984-07-23 | 1985-07-23 | Highly sensitive enzymatic assay method |
| FR8511228A FR2567906B1 (fr) | 1984-07-23 | 1985-07-23 | Procede de dosage enzymatique tres sensible |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP15143884A JPS6131097A (ja) | 1984-07-23 | 1984-07-23 | 新規な高感度酵素的測定法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6131097A JPS6131097A (ja) | 1986-02-13 |
| JPH0542270B2 true JPH0542270B2 (ja) | 1993-06-28 |
Family
ID=15518609
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP15143884A Granted JPS6131097A (ja) | 1984-07-23 | 1984-07-23 | 新規な高感度酵素的測定法 |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4791057A (ja) |
| JP (1) | JPS6131097A (ja) |
| DE (1) | DE3526334C2 (ja) |
| FR (1) | FR2567906B1 (ja) |
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| DE2633728C3 (de) * | 1976-07-27 | 1979-07-12 | Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim | NADH-Peroxidase, ihre Gewinnung und Verwendung |
| FR2394553A1 (fr) * | 1977-02-09 | 1979-01-12 | Inst Nat Sante Rech Med | Nouveau procede d'extraction et de purification de 3 et de 3 -hydroxysteroidedeshydrogenase, enzymes pures ainsi obtenues et applications de ces enzymes a divers dosages et syntheses. |
| DE2924875A1 (de) * | 1979-06-20 | 1981-01-29 | Boehringer Mannheim Gmbh | Verfahren zur gewinnung von cholesterinoxidase |
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-
1984
- 1984-07-23 JP JP15143884A patent/JPS6131097A/ja active Granted
-
1985
- 1985-07-23 FR FR8511228A patent/FR2567906B1/fr not_active Expired
- 1985-07-23 DE DE3526334A patent/DE3526334C2/de not_active Expired - Lifetime
- 1985-07-23 US US06/757,953 patent/US4791057A/en not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
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| JPS6131097A (ja) | 1986-02-13 |
| DE3526334C2 (de) | 1995-02-02 |
| FR2567906A1 (fr) | 1986-01-24 |
| DE3526334A1 (de) | 1986-01-30 |
| FR2567906B1 (fr) | 1987-04-30 |
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