JPH0249600A - Ｎａｄ（ｐ）ｈの定量法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は還元型ニコチン了ミドアデニンジヌクレオチド
（リン酸）［：ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ）の定量法に関する。

さらに詳しくは、乳酸デヒドロゲナーゼ及び乳酸オキシ
ダーゼを用いてＮＡＤ（Ｐ）Ｈの量に対応する過酸化水
素を生成させ、これを定量する方法に関する。

本発明は、酵素反応によってＮＡＤ（Ｐ））（を生成す
る反応に係る反応物あるいは酵素活性の定量に適用でき
る。

従来技術及び問題点 従来■ＮＡＤ（Ｐ）Ｈの紫外部における吸収を直接測定
する方法、■ＮＡＤ（Ｐ）Ｈを電子伝達体を介して蛍光
物質に導き、その蛍光を測定する方法、■ＮＡＤ（Ｐ）
Ｈを電子伝達体を介してテトラゾリウム塩からホルマザ
ンに導き、これを比色定量する方法、■ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ
に電子伝達体を作用させ、スーパーオキシドジスムター
ゼ（ＳＯＤ）の存在下、あるいは非存在下に生成する過
酸化水素を定量する方法〔臨床化学・第１５巻・第１号
（１９８６）２０〜２７．特開昭５！Ｊ−２１０８９９
，特開昭６１１９１００〕、■ペルオキシダーゼ及びダ
イアホラーゼの存在下、特殊なロイコ型化合物を発色さ
せ、これを比色定量する方法（特開昭６Ｏ−８０６００
）、■ピリジン酵素と酸化酵素を組み合わせてＮＡＤ（
Ｐ）Ｈを一担還元型基質に変化させ、しかる後に過酸化
水素に導き、これを定量する方法（特開昭６２−１３８
２００号公報）、■グルタミン酸デヒドロゲナーゼ及び
グルタミン酸オキシダーゼを用いて生成する過酸化水素
を定量する方法（特開昭６０−４３３９８号公報）等が
知られている。

これらの方法は、感度が低い、生体試料中の他の成分の
影響を受は易い、連続分析への適用が困難である、ある
いは検体ブランクテストが必要である等の欠点がある。

特に、生体試料中の影響を受は易い他の比較的多量に含
まれる成分として生体試料例えば血清中には乳酸が存在
し、さらに乳酸デヒドロゲナーゼも存在していて目的成
分に由来するＮＡＤＨの定量に際して、試料にＮＡＤを
加えるか、ＮＡＤが生成すると乳酸が乳酸デヒドロゲナ
ーゼの作用を受けてＮＡＤＨが生成する。目的とする成
分に由来するＮＡＤＨにこの乳酸に由来するＮＡＤＨが
加わるた約の検体ブランクテストを行わなければならな
い。

課題を解決するための手段 本発明によれば試料中のＮＡＤ（Ｐ）Ｈにピルビン酸の
存在下、乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）を作用させて
、ＮＡＤ（Ｐ）及び乳酸を生成させ、該乳酸に酸素の存
在下乳酸オキシダーセ（ＬＯＸ）を作用させて、ピルビ
ン酸と過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）を生成させ該過酸化水素
を定量することによってＮＡＤ（Ｐ）Ｈを定量できる（
以下発明１という）。

この酵素反応の反応式が示される。

ＤＨ ピルビン酸＋ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ 乳酸＋０□□ピルビン酸＋Ｈ２Ｏ２ ↓ 定量 本発明の実施に際しては、各反応を順次行わせて目的を
達成できるが、試料にピルビン酸もしくはその塩、ＬＤ
Ｈ，ＬＯＸ及び要すればＨ２Ｏ２定量用試薬を一度に加
え、Ｈ２Ｏ２を定量することによってＮＡＤ（Ｐ）Ｈを
定量できる。

定量すべきＮＡＤ（Ｐ）Ｈが他の酵素反応によって生成
する場合核反応に必要な酵素、基質等とＮＡＤ（Ｐ）Ｈ
定量反応用試薬とを一緒に試料に加えることができる。

次の発明によれば、試料中の乳酸に乳酸オキシダーゼを
作用させて、ピルビン酸と過酸化水素に分解し、該過酸
化水素を消去した後、乳酸デヒドロゲナーゼの存在下ピ
ルビン酸もしくはその塩と試料中のＮＡＤ（Ｐ）Ｈとを
反応させて乳酸を生成させ、次いで生成した乳酸に乳酸
オキシダーゼを作用させて生成する過酸化水素を定量す
ることによりＮＡＤ（Ｐ）Ｈを正確に定量できる（以下
発明２という）。

この酵素反応の反応式が示される。

ピルビン酸＋ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ□ 乳酸子ＮΔＤ（Ｐ） （反応２） ↓ 定量 この方法は、検体ブランクテストを必要としない優れた
且つ簡便な方法である。

発明２を実施するに際して反応を順次行わせても目的を
達成できるが、第１試薬としてＬＯＸ及びＨ２Ｏ２消去
剤（第１Ａ試薬）を調製し、試料に第１Ａ試薬を加えて
反応後、Ｈ２０を消去能力を失活させ、次いでＬＤＨ，
ピルビン酸もしくはその塩及び要すればＨ２０□定量用
試薬からなる第２試薬（第２Ａ試薬）を加えてＨ２Ｏ２
を定量することにより、正確にＮＡＤ（Ｐ）Ｈを定量で
きる。

ＬＯＸの反応はＬＤＨの反応に比べ著しく早いノテ、第
１試薬１：　Ｌ　ＯＸ　、　　Ｌ　Ｄ　Ｈ、Ｈ２０２消
去剤ピルビン酸もしくはその塩（第１Ａ′試薬）、第２
試薬にＨ２Ｏ２定量用試薬（第２Ａ’試薬）を配しても
ＮＡＤ（Ｐ）Ｈを正確に定量できる。

試料中にＮＡＤ（Ｐ）Ｈが存在せず、酵素反応によって
ＮＡＤ（Ｐ）Ｈが生成し、これを定量する場合、第１試
薬として第１Ａ’試薬を用い第２試薬として目的成分の
分解に必要な成分（酵素、基質等）及びＨ２Ｏ２定量用
試薬からなる試薬（第２Ａ″試薬）を調製し前記と同様
にして生成するＨ２Ｏ２を定量すればよい。

ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ生成反応に必要な試料の中、試料中の乳
酸消去反応を阻害せず且つ定量の目的に反しない成分は
第１試薬に加えてもよい。

Ｈ２Ｏ２消去剤としては、カタラーセが好ましく、その
失活にはアジ化す）　ＩＪウムが用いられる。

又、Ｈ２Ｏ２と反応してＨ２Ｏ２を分解し、反応を阻害
しない化合物であればいずれも用いうる。かかる化合物
の例として、ペルオキシダーゼの存在下Ｈ２Ｏ２と反応
して色素を生成しない化合物が知られている。フェノー
ル誘導体、アニリン誘導体ナフトール誘導体がかかる化
合物として例示され、特にペルオキシダーゼの存在下Ｈ
２Ｏ２と２種の化合物からなるカップリング剤と反応し
て色素を生成するが、カップリング剤の一方を用いると
Ｈ２Ｏ２は分解されるが色素を生成しない化合物は後の
Ｈ２０２定量反応の色源体として該カップリング剤の他
方の化合物を加えることにより目的成分に由来するＨ　
２０２を定量することができるので便利である（特公昭
６２−２１５１７　、同６１．−２３９９８　）。

上記いずれの方法においてもＨ２Ｏ。の定量法としてペ
ルオキシダーゼの存在下Ｈ２０２と色源体とを反応させ
て生成する色素によって着色した反応液の吸光度を測定
する場合、ペルオキシダーゼと色源体を別々に保存して
、あるいはキットとして構成させ、使用時に同時に加え
るか、ペルオキシダーゼを第１試薬に加える（第１Ｂ試
薬）方が好ましい。この場合、第２試薬は目的成分の分
解に必要な成分及び色源体（第２Ｂ試薬）からなる。

発明２において酸性の緩衝剤を用いるとの方向の反応が
進行するので、試料中の乳酸及びＮＡＤからＮＡＤＨが
生成せず、又検体試料中にＬＤＨ反応系以外に他の成分
からのＮＡＤＨ生成反応系が存在していて、第１試薬の
添加によりＮＡＤＨ生成反応が進行しても生成したＮＡ
ＤＨは、上記ＬＤＨの作用でＮＡＤ及び乳酸が生成し、
乳酸はＬＯＸによって分解され生成するＨ２Ｏ２はカタ
ラーセによって分解される。次いでカタラゼ阻害剤を加
えてこれを分解し、第２試薬を加えて反応させ生成する
Ｈ２Ｏ２を適当な手段で定量すればよい。

第１試薬の添加により、Ｈ２Ｏ２が生成すると試料中の
還元性物質例えばビリルビン、グルタチオン等も分解さ
れるので、目的成分に由来するＮＡＤ（Ｐ）Ｈの定量へ
の悪影響がなく、極めて優れた方法である。

本発明を実施する際には一般にｐＨ２〜１１の緩衝剤、
例えばリン酸塩、トリス−塩酸塩、コハク酸塩、ビス（
２−ヒドロキシエチル）イミノトリス（ヒドロキシメチ
ル）メタン（ビス−トリス）Ｎ−２−ヒドロキシエチル
ピペラジン−Ｎ′−２エタンスルホン酸（ＨＥＴＥＳ）
、酢酸塩、　Ｇｏｏｄ等の０．００５〜２　ｍｏｌ／β
中で、酵素の至適作用温度付近、通常５〜５０℃好まし
くは２５〜４０℃で行われる。

反応液中の各成分の濃度が示される。

Ｌ　Ｄ　Ｈ：　　　　　　　　　　　０．１〜１０００
１１／ｍｌＬ　Ｄ　Ｘ　：　　　　　　　　　　　　　
　Ｏ，１〜１０００　　ＩＩＩ／ｍｌピルビン酸もしく
はその塩　０．１〜１００　ｍＭ／βペルオキシダーゼ
　　　　　０．１〜１０００　ＩＩ／ｍ１反応後の反応
液による吸収を生成色素の極大吸収波長で試薬ブランク
を対照として測定し、予め既知量についての試験から求
めた検量線を利用して試料中のＮＡＤ（Ｐ）Ｈを定量す
る。

反応液中のＮＡＤ（Ｐ）Ｈは一般に０．００００１〜１
ｍｇ／ｍ＋となるように試薬液又は蒸留水で調製される
。

反応系には必要に応じてポリエチレングリコール〜モノ
ーｐ−ｉｓ○−オクチルフェニルエーテル（商品名Ｔｒ
ｉｔｏｎ　Ｘ　−１００）等の界面活性剤が用いられる
。

少量のフェノールをペルオキシダーゼの活性化あるいは
色素形成反応促進のために反応系に加えることができる
。

その他ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ生成反応に用いられる酵素の活性
化剤例えば塩化マグネシウムやその安定化剤、例えばア
ルブミンが０．０１〜２０ｍｇ／ｍｌで用いられる。

過酸化水素の定量法としてはペルオキシダーゼを用いる
以外に公知の手法がいずれも適用できる。

過酸化水素の生成量もしくは速度の測定法としては、化
学発光分析法、電気化学的分析法、けい光分析法１分光
学的分析法などが知られている（たとえば、有機合成化
学基会誌、第３９巻、第７号、　ｐ６５９〜６６Ｂ　（
１９１３１）参照）。本発明においては、そのいずれも
が適用可能であるが、本発明の目的から迅速かつ高感度
に過酸化水素を検出するシステムを採用することが好ま
しい。

代表的な過酸化水素の測定法をいくつか列挙すれば下記
のとおりである。

まず、化学発光分析法としては、ルミノールを赤血塩の
存在下で過酸化水素と反応させ、酸化に伴う発光量を測
定する方法が挙げられる。ルミノールの代わりにイソル
ミノール、ピロガロール。

ヒス（２，４，６−）リクロロフェニル）オキザレート
を、赤血塩の代わりにペルオキシダーゼ、ヘマチン、ヘ
ミン、塩化コバルトを使用する方法も知られている。

電気化学的分析法としては、クラーク型過酸化水素電極
を用いる方法が一般的である。過酸化水素をペルオキシ
ダーゼもしくはモリブデン酸塩などの触媒存在下でヨウ
素イオンと反応させてヨウ素イオン電極で測定する方法
も使用できる。

けい光分析法としては、ホモバニリン酸をパオキシダー
ゼの存在下で過酸化水素と反応させ、生成する２、２′
〜ジヒドロキシ−３，３′−ジメトキシビフェニル−５
，５′−ジ酢酸のけい光強度を測定する方法が挙げられ
る。ホモバニリン酸の代わりにｐ−ヒドロキシフェニル
酢酸、ジアセチルフルオレスシン誘導体（ジアセチルフ
ルオレスシン、ジアセチルジクロロフルオレスシンなど
）などを用いることもできる。

分光学的分析法としては、ペルオキシダーゼ法カタラー
ゼ法などが一般的である。ペルオキシダーゼ法は、電源
体をペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）の存在下で過酸化水素
と反応させ、生成する色素を比色定量する方法である。

電源体としては、たとえば０−ジアニシジン、４−メト
キシ−１−ナフトール、２．２’−アジノービス（３−
エチルベンゾチアゾリン）−６−スルホン酸（ＡＢＴＳ
＞などの単独試薬、４−アミノアンチピリン（４ＡＡ）
とフェノール系化合物（たとえば、フェノール。

ｐ−クロロフェノール、２，４．６−ドリブロモフエノ
ールなど）、アニリン系化合物（たとえば、Ｎ。

Ｎ−ジメチルアニリン（ＤＭＡ）、Ｎ、Ｎ−ジエチルア
ニリンなど）またはトルイジン系化合物（たとえば、Ｎ
、　　Ｎ−ジエチル−ｍ−トルイジンなど）との組み合
わせ試薬、３−メチル−２−ベンンチアゾリノヒドラゾ
ン、！＝Ｎ、Ｎ−ジメチルアニリンとの組み合わせ試薬
などを使用することができる。

カタラーゼ法としては、過酸化水素をカタラーゼの存在
下でアルコール（メタノールなど）と反応させ、生成す
るアルデヒドを発色系に導いて色素の吸光度測定を行う
方法などが挙げられる。

これらの過酸化水素の検出系はいずれも公知の方法であ
り、その実施にあたってはそれぞれ公知の操作、条件を
参照すればよい。

本発明を実施する際の最も好ましい方法は、ペルオキシ
ダーゼの存在下Ｈ２Ｏ２と電源体とを反応させて生成す
る色素による着色を比色定置する方法である。

この方法を実施するに際しては、発明１においてはペル
オキシダーゼ及び電源体も試薬に加えられる。発明２に
おいては第１試薬にペルオキシダーゼが、第２試薬に電
源体が加えられる。色素の生成量もしくは生成速度は、
例えば色素の吸収極大値における吸光度を測定すること
によって求めることができる。

本発明において、Ｈ２Ｏ２をペルオキシダーゼ及び色原
体を用いて定量する際、色原体としてカタラーゼ及びＮ
ＡＤ（Ｐ）Ｈの影響の小さいものが好ましく、又生体試
料にはヘモグロビン、ビリルビン等の極大吸収波長と離
れた極大吸収波長、特にλｍａＸが６００〜７５０ｎｍ
の色原体が好ましい。

かかる色原体として、特開昭５７−２９２９７号公報。

特開昭５！Ｊ−７４７１３号公報に記載の化合物、ある
いは般式（１） に記載されている化合物であり、表中の記号は下記定義
を有する。

〔式中Ｒ１，Ｒ２は水素、炭素数１〜６のアルキル例え
ば、メチル、エチル、プロピル、ブチル等を示し、Ｒ３
，Ｒ４はスルホアルキル（アルキルはＲ。

と同義を示す）を示す〕で表される化合物が好ましい。

本発明で用いられる代表的な色原体が第１表。

第２表、第３表に例示される。

第１表中の化合物は、特開昭５’ｌ−２９２９７号公報
第 表 Ａ　：　Ｎ（［：Ｒ３）２ Ｂ　：　Ｎ（Ｃ２１１Ｓ）２ １−′ Ｔ　：　Ｃ０ＮＨＣＨ。

Ｚ　：　Ｃ０ＮＨＣＩＩ２ＣＯＯＩＩ 第２表中の化合物は、特開昭５９−７４７１３号公報に
記載されている化合物であり、表中の記号は下記定義を
有する。

第３表中の記号は一般式（Ｉ） 義を有する。

において下記定 一般式（Ｉ） これらのものは次の原料１と２から１０倍モルの原料２
を下記条件下で反応させることにより得第 表 これらの色原体を用いる場合の極大吸収波長（λｍａｘ
）、及び感度、下記ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ定量法に用いた場合
の血清中の成分の影響、生成した色素の水への溶解性の
度合いが第４表に示される。

感度の測定は以下の方法で行われた。２０　ＩＩ／ｍｌ
のペルオキシダーゼ、　　８０／ｍｌの乳酸デヒドロゲ
ナーゼ、　　５１／ｍｌの乳酸オキシダーゼ、０．５ｍ
ｇ／ｍｌのピルビン酸ソーダ、５ｍｇ／ｍｌのトリトン
Ｘ−１０００．０１ｍｇ／ｍｌのフェノール、および第
１表中の化合物０．１　ｍｇ／ｍｌあるいは第２表中の
化合物０．１　ｍｇ／ｍ１．あるいは４−アミノアンチ
ピリン０．１　ｍｇ／ｍ１と第３表中の化合物０．１ｍ
ｇ／ｍｌを含有する１００ｍＭのビス（２−ヒドロキシ
エチル）イミノトリス（ヒドロキシメチル）メタン（Ｇ
ｏｏｄの緩衝液の一種）のｐＨ６，２５の緩衝液を調整
し、この３ｍｌに、５０μｆｆの３００１ｍｏｌ／ｆの
ＮＡＤＨ溶液を加える。３７℃で５分間反応させ、反応
液のλｍａＸにおけるＯＤを測定する。

色原体としてニトロテトラゾリウムブルーを用いた場合
のＯＤを１００として相対値を３表に示す。なおニトロ
テトラゾリウムブルーの場合、上記緩衝液から、ペルオ
キシダーゼ、乳酸デヒドロゲナーゼ、乳酸オキシダーゼ
、ピルビン酸ソーダフェノールを除去し、２０Ｌｌ／ｍ
ｌのジアホラーゼを加えてｐＨ７，０とした緩衝液を使
用して実験を行った。

血清中の成分の影響は、ビリルビン１０μｇ／ｍｌ。

もしくはシスティン１０　Ｍ／　３　ｍｌ、あるいは尿
酸１０μｇ／３ｍｌが存在する時、５〜１０％の影響を
±、１０〜２０％を＋、５％以下を−とじて示す。

生成した色素の水への溶解性の度合いは、ニトロテトラ
ゾリウムブルーと比較した場合の評価である。ＡＡはニ
トロテトラゾリウムブルーに比べ水への溶解性が著しく
良いもの、Ａは水への溶解性が良いもの、Ｂはニトロテ
トラゾリウムブルーと同程度しか水に溶けないものであ
ることを意味する。

λｍａｘが高く、感度が高く、生体成分の影響を受けず
、水に溶けやすいものほど、微量生体成分の定量に適し
ている。

第 表 本ニトロテトラゾリウムブル 本発明方法は、反応によってＮＡＤ（Ｐ）Ｈを化学量論
的に生成する反応系における反応物質あるいは酵素活性
の測定に適用できる。かかる反応系はＮＡＤ及びデヒド
ロゲナーゼを用いる多くの反応系が知られている。かか
る物質としてグルコース、ガラクトース、アルコ゛−ル
、リンゴ酸、アルデヒド、キサンチン、コレステロール
、胆汁酸。

ホスフォヘキソースイソメラーセ（ＰＨＩ）活性。

中性脂肪等があげられる。

これらの反応系が図式的に次に示され、反応系における
基質、酵素活性が測定できる。

グルコース＋ＡＴＰ　−一一 グルコース−６−リン酸十へＤＰ Ｄ−ガラクトノ−γ−ラクトン＋ ＮＡＤＨ＋Ｈ” リンゴ酸；　ＮＡＤ■ オキザル酢酸十ＮＡＤＨ＋Ｈの Ｒ−ＣＨＯ＋ＮＡＤ０＋Ｈ２０ Ｒ−ＣＯＯ−十ＮＡＤＨ＋２Ｈ■ キサンチン＋ＮＡＤの＋Ｈ２０ 尿酸十ＮＡＤＨ＋８０ Ｄ−グルコノ−δ〜ラクトン６−リン酸十ＮＡＤＨ＋Ｈ
０ 中性脂肪＋３Ｈ２０ グリセロール＋脂肪酸 ガラクトース＋ＮＡＤ０ ジヒドロキシアセトン＋ＮＡＤＨ十Ｈ”８、胆汁酸 ３α−ヒドロキシ胆汁酸十ＮＡＤ■ ９、　コレステロール 遊離型コレステロール＋ＮＡＤ’ １０、ＰＨ１活性 ＰＨＩ フラクトース−６−リン酸 グルコース−６−リン酸 グルコース−６−リン酸＋ＮＡＤ” これらのＮＡＤＨを生成する反応の脱水素酵素もしくは
その基質が試料に含まれていて、これを定量するに際し
ては、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈを生成するに必要な酵素もしくは
基質を試料に加え、次いで、本発明方法に従って生成し
たＮＡＤ（Ｐ）Ｈを定量することによって目的成分を定
量できる。

ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ生成反応とＮＡＤ（Ｐ）Ｈ定量反応が阻
害しないときは、両反応に必要な成分を一緒に加え、あ
るいは発明２においてはＮＡＤ（ＰンＨ生成反応に必要
な試薬を第２試薬に加えて分析を行えばよい。

一般に定量すべき成分が基質の場合はＨ２Ｏ２の総生成
量もしくは生成速度が、成分が酵素の活性であるときは
Ｈｘ　Ｏ２の生成速度が測定される。

以下に本発明の態様示す実施例を示す。

実施例１．（ＮＡＤＨの定量） ５０　ｍＭ　Ｇｏｏｄの緩衝液（ｐＨ６，２５）　　１
００ｍｌにペルオキシダーゼ１０００単位、乳酸デヒド
ロゲナーゼ８００単位、乳酸オキシダーゼ５００単位、
ピルビン酸ソーダ５０ｍｇ、）リドンＸ１００を５００
ｍｇ、　フェノール５ｍｇおよび■化合物Ｎｏ、　１を
１０ｍｇ、■化合物Ｎｏ、２０を１０ｍｇ、■化合物Ｎ
ｏ、２１を１０ｍｇ、■化合物Ｎｏ、２２を１０ｍｇ。

■化合物Ｎｏ、　２４を１０ｍｇ、■化合物Ｎｏ、　２
６を１０１１１ｇ＋　■化合物Ｎｏ、４５を１０ｍｇ、
■化合物Ｎｏ、５３を１０ｍｇ、■４４−アミノアンチ
ビ９２１ｍｇと化合物Ｎｏ、５６を１０ｍｇ、ｔＩｉ）
４−アミノアンチピリンＩＧｍｇと化合物Ｎｏ、５７を
１０ｍｇ、Ｑ４−アミノアンチピリン１０ｍｇと化合物
Ｎｏ、　６０を１０ｍｇ、■４アミノアンチピリン１０
ｍｇと化合物Ｎｏ、６５を１０ｍｇをそれぞれ溶解し、
試薬液とする。

別に１００，２００，３００，５００，１０００μｍｏ
ｌ＃！のＮＡＤＨ溶液を調製し、試験管に各５０ｍ１ず
つを分取し、上記試薬液を各々３ｍｌ加え、３７℃に５
分間放置した後、各λｍａＸにおける吸光度を試験盲検
を対照として測定する。

結果を第５表に示す。表中の値は吸光度である。

第 表 ＮＡＤＨ２度に対し、良好な定量性を示している。

実施例２．［ＰＨ１（ホスフォヘキソ ーゼ）活性の測定〕 （試薬組成） 試薬液１：　　　　ｐＨ７，５ リン酸１ナトリウム トリトンＸ−１００ 塩化マグネシウム ペルオキシダーゼ ＤＨ グルコース６リン酸デヒドロゲナーゼ ＯＸ ピルビン酸 ＡＤ 化合物番号５９ 試薬液２：　　　　ｐＨ７，５ リン酸１ナトリウム トリトンＸ−１００ ４−アミノアンチピリン フラクトース−６−リン酸 スイソメラ ０．１　Ｍ ０．１　　％ ５ｍｇ／ｍ１ ５１／ｍ１ ５　ＩＩ／ｍ１ ３　　Ｕ／ｍ１ ２．５Ｕ／ｍ１ ０、２５　ｍｇ／ｍ１ ０．８　　ｍｇ／ｍｌ ｌ　ｍｇ／ｍ１ １Ｍ ０１　％ １．５　ｍｇ／ｍ１ ９　ｍｇ／ｍｌ （操作法） ２．２５ｍ１■試薬液１を３７℃に保温し、ＰＨＩ（シ
グマ製）の■５０Ｕ／β溶液、■１００１１＃。

■２００Ｕ＃！、■４００　ＬＩ＃を５０頭添加攪拌し
、５分後に試料液２を０．７５ｍ１加えて均一にした後
、５９５ｎｍにおける１０分後の吸光度を測定した。

第１図に得られた検量線を示す。

実施例３．（総胆汁酸の定量） （試薬組成） 試薬液１・　　　ｐＨ６，２５ ０５％ １　ｍｇ／ｍ１ １　ｍｇ／ｍ１ ０、１　ｍｇ／ｍｌ ゼ　　　　　１０　Ｌｌ／＋ｒ＋１ ８　ＩＩ／ｍ１ ５　Ｕ／ｍ１ ４　ｍｇ／ｍｌ トリトンＸ−１００ ピルビン酸 アルブミン フ　エ　ノ　−ル ベルオキシダ ＤＨ ＯＸ ＮΔＤ 試薬液２： ｐ　Ｈ７，０ トリトンχ−１００１，０％ ３　α−ヒＣロ士システａイドデヒド０　　　　６　υ
／ｍｌゲナーゼ 試薬液２にＡ：化合物番号１を０．１　ｍｇ／＋＋＋］
、　Ｂ：化合物番号２０を０．１　ｍｇ／ｍｌ、　Ｃ：
化合物番号２１をＯ，１ｍｇ／ｍｌ、　Ｄ　：化合物番
号２６を０．１　ｍｇ／ｍｌ、Ｅ：化合物番号２７をＱ
、１ｍｇ／ｍｌをそれぞれ溶解したものを試薬液２−Ａ
、ｌ−Ｂ、２−Ｃ。

２−Ｄ、２−Ｅとする。

試薬液１の２．２５ｍ１を３７℃に保温し、生血清５０
ρを添加攪拌する。５分後に５種類の各試薬液２を０．
７５ｍ１加えて均一にした後、さらに３７℃にて５分間
放置する。各色原体のλｍａｘにおける吸光度を試薬盲
検を対照として測定し、予め既知の濃度で作成した検量
線より血清中の総胆汁酸濃度を算出する。結果を高速液
体クロマトグラフィー法（ＨＰＬＣ法）を用いて測定し
た数値と対比して第６表に併記する。

第　　　　６　　　　表 総胆汁酸濃度（μｍｏｌ／β） 血清試料１〜５には乳酸がそれぞれ９．８，１２．３５
．６，１４．１及び８．２ｍｇ／４１２含まれていたが
、その影響は認められなかった。

結果はＨＰＬＣ法に対し、良く相関した測定値を示して
いる。

実験例４．（ＰＨＩ活性の定量） 実施例２において用いた試薬液１の２．２５ｍ１ｌ’を
３７℃に保温し、生血清５０μｇを添加攪拌する。

５分後に実験例２において用いた試薬液２を０．７５ｍ
１加えて均一にした後、さらに３７℃にて１０分間装置
する。色原体のλｍａｘ、　５９５ｎｍにおける吸光度
を試薬盲検を対照として測定し、予め既知の活性で作成
した検量線より血清中ＰＨＩ活性を算出する。結果を、
ＮＡＤＨの生成を紫外吸収により定量する方法（ＵＶ法
）と対比して第７表に併記する。またこの血清中の乳酸
値を「デタミナ−ＬＡＪのキット　（協和メデックス社
製）によって定量した。結果にみるように、乳酸の影響
を受けずＵＶ法と良い相関を示している。

第７表　ＰＨ１活性（ｍｌｌｌ／ｆ） 第１図

【図面の簡単な説明】

第１図は、ホスフォヘキソースイソメラーゼの検量線を
示す。 ０Ｑ ：１００ ＰＨＩ　　活性　（％）

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. （１）試料中のＮＡＤ（Ｐ）Ｈにピルビン酸もしくはそ
   の塩の存在下、乳酸デヒドロゲナーゼを作用させてＮＡ
   Ｄ（Ｐ）及び乳酸を生成させ、該乳酸に酸素の存在下乳
   酸オキシダーゼを作用させてピルビン酸と過酸化水素を
   生成させ、該過酸化水素を定量することを特徴とするＮ
   ＡＤ（Ｐ）Ｈの定量法。
2. （２）試料中の乳酸に乳酸オキシダーゼを作用させてピ
   ルビン酸と過酸化水素に分解し、該過酸化水素を消去し
   た後、乳酸デヒドロゲナーゼの存在下、ピルビン酸と試
   料中のＮＡＤ（Ｐ）Ｈとを反応させて乳酸を生成させ、
   次いで生成した乳酸に乳酸オキシダーゼを作用させて生
   成する過酸化水素を定量することを特徴とするＮＡＤ（
   Ｐ）Ｈの定量法。