JPH0532700A - 免疫グロブリンmの精製方法 - Google Patents
免疫グロブリンmの精製方法Info
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- JPH0532700A JPH0532700A JP3209840A JP20984091A JPH0532700A JP H0532700 A JPH0532700 A JP H0532700A JP 3209840 A JP3209840 A JP 3209840A JP 20984091 A JP20984091 A JP 20984091A JP H0532700 A JPH0532700 A JP H0532700A
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- JP
- Japan
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- immunoglobulin
- liquid
- treated
- nucleic acid
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- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Treatment Of Liquids With Adsorbents In General (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【目的】 免疫グロブリンMを高速度、かつ高純度で効
率よく精製する。 【構成】 クロマトグラフィーによる処理に先立ち被処
理液中の核酸を除去する工程と、その後シリカゲル若し
くは多孔質ポリマーを基材とする高速アフィニティ担体
にプロタミンを固定相としたアフィニティクロマトグラ
フィーにより精製処理する工程とを経ることにより、免
疫グロブリンMのみを選択的に効率よく回収するように
した。
率よく精製する。 【構成】 クロマトグラフィーによる処理に先立ち被処
理液中の核酸を除去する工程と、その後シリカゲル若し
くは多孔質ポリマーを基材とする高速アフィニティ担体
にプロタミンを固定相としたアフィニティクロマトグラ
フィーにより精製処理する工程とを経ることにより、免
疫グロブリンMのみを選択的に効率よく回収するように
した。
Description
【0001】
【産業上の利用分野】本発明は、免疫グロブリンMを高
速度、かつ高純度で効率よく精製することができるクロ
マトグラフィーによる免疫グロブリンMの精製方法に関
するものである。
速度、かつ高純度で効率よく精製することができるクロ
マトグラフィーによる免疫グロブリンMの精製方法に関
するものである。
【0002】
【従来の技術】試料内から有益な抗体を精製する方法と
して従来から種々のものが開発されており、その中で免
疫グロブリンMの精製方法としてはアガロースやアクリ
ルアミドのような軟質ゲルを用いたゲル濾過法が知られ
ている。ところが、この方法による場合には処理中にお
けるゲル強度の低下が著しいために被処理液を低速で流
す必要があり、精製処理に長時間要するという問題点が
あった。更には、高純度の免疫グロブリンMを精製する
ためにはイオン交換処理工程や粗密精製用の少なくとも
二段階のゲル濾過処理工程を組み合わせる必要があり、
処理が複雑となって非効率的であるとともに回収率も著
しく低下するという問題点があった。そこで、特開平2
−180900号公報にあるように親水性シリカゲルを
基材とする高速液体ゲル濾過クロマトグラフィーにより
免疫グロブリンMを効率的に精製する方法が提案されて
いるが、ゲル濾過処理であるために精製速度が遅く、ま
た特異的な吸着作用がなく高純度で効率的な精製処理が
できないという問題点があった。
して従来から種々のものが開発されており、その中で免
疫グロブリンMの精製方法としてはアガロースやアクリ
ルアミドのような軟質ゲルを用いたゲル濾過法が知られ
ている。ところが、この方法による場合には処理中にお
けるゲル強度の低下が著しいために被処理液を低速で流
す必要があり、精製処理に長時間要するという問題点が
あった。更には、高純度の免疫グロブリンMを精製する
ためにはイオン交換処理工程や粗密精製用の少なくとも
二段階のゲル濾過処理工程を組み合わせる必要があり、
処理が複雑となって非効率的であるとともに回収率も著
しく低下するという問題点があった。そこで、特開平2
−180900号公報にあるように親水性シリカゲルを
基材とする高速液体ゲル濾過クロマトグラフィーにより
免疫グロブリンMを効率的に精製する方法が提案されて
いるが、ゲル濾過処理であるために精製速度が遅く、ま
た特異的な吸着作用がなく高純度で効率的な精製処理が
できないという問題点があった。
【0003】
【発明が解決しようとする課題】本発明は上記のような
従来の問題点を解決して、被処理液を従来の数倍以上の
流速で流すことができて高速度でかつ大量に精製処理を
行うことができるとともに、被処理液中から免疫グロブ
リンMのみを特異的かつ確実に吸着・分離し極めて高い
回収率で効率的に精製処理を行うことができる免疫グロ
ブリンMの精製方法を提供することを目的として完成さ
れたものである。
従来の問題点を解決して、被処理液を従来の数倍以上の
流速で流すことができて高速度でかつ大量に精製処理を
行うことができるとともに、被処理液中から免疫グロブ
リンMのみを特異的かつ確実に吸着・分離し極めて高い
回収率で効率的に精製処理を行うことができる免疫グロ
ブリンMの精製方法を提供することを目的として完成さ
れたものである。
【0004】
【課題を解決するための手段】上記の課題を解決するた
めになされた本発明の免疫グロブリンMの精製方法は、
クロマトグラフィーによる免疫グロブリンMの精製方法
において、被処理液中の核酸を除去した後、シリカゲル
若しくは多孔質ポリマーを基材とする高速アフィニティ
担体にプロタミンを固定相としたアフィニティクロマト
グラフィーにより精製処理することを特徴とするもので
ある。
めになされた本発明の免疫グロブリンMの精製方法は、
クロマトグラフィーによる免疫グロブリンMの精製方法
において、被処理液中の核酸を除去した後、シリカゲル
若しくは多孔質ポリマーを基材とする高速アフィニティ
担体にプロタミンを固定相としたアフィニティクロマト
グラフィーにより精製処理することを特徴とするもので
ある。
【0005】以下、本発明を図面を参照しつつ詳細に説
明する。図面はアフィニティクロマトグラフィーの原理
を示す概略図で、図中1はアフィニティクロマトグラフ
ィー、2は該アフィニティクロマトグラフィー1を構成
する例えばステンレス製やプラスチックス製等のカラ
ム、3は該カラム2の内部に充填された多孔質のシリカ
ゲル若しくは高分子ポリマーからなる高速アフィニティ
担体、4は該高速アフィニティ担体を基材とし、その表
面に固定相として形成された免疫グロブリンM吸着用の
プロタミンである。
明する。図面はアフィニティクロマトグラフィーの原理
を示す概略図で、図中1はアフィニティクロマトグラフ
ィー、2は該アフィニティクロマトグラフィー1を構成
する例えばステンレス製やプラスチックス製等のカラ
ム、3は該カラム2の内部に充填された多孔質のシリカ
ゲル若しくは高分子ポリマーからなる高速アフィニティ
担体、4は該高速アフィニティ担体を基材とし、その表
面に固定相として形成された免疫グロブリンM吸着用の
プロタミンである。
【0006】本発明においては、被処理液として例えば
免疫グロブリンMを低濃度で含む細胞培養上清などが使
用され、該被処理液はクロマトグラフィーによる処理が
行われる前段階として先ず核酸除去剤の添加やイオン交
換ゲル添加による処理によって死細胞より放出された液
中の核酸の除去が行われる。この核酸の除去処理は、後
述するプロタミンによる免疫グロブリンMの吸着作用を
向上させるためのものであって、クロマトグラフィー処
理において被処理液中に核酸と免疫グロブリンMが混在
している場合にはプロタミンにいずれもが吸着し、吸着
力の強い核酸が一旦吸着した免疫グロブリンMと処理中
に入れ換わっていく結果、回収率の低下を招くことにな
るという本発明者の知見に基づくものである。また、こ
の核酸は混在すると免疫グロブリンMの抗原結合活性を
減少させるために、本発明以外の方法においてもイオン
交換クロマトグラフィーの工程で除去されるものであ
る。
免疫グロブリンMを低濃度で含む細胞培養上清などが使
用され、該被処理液はクロマトグラフィーによる処理が
行われる前段階として先ず核酸除去剤の添加やイオン交
換ゲル添加による処理によって死細胞より放出された液
中の核酸の除去が行われる。この核酸の除去処理は、後
述するプロタミンによる免疫グロブリンMの吸着作用を
向上させるためのものであって、クロマトグラフィー処
理において被処理液中に核酸と免疫グロブリンMが混在
している場合にはプロタミンにいずれもが吸着し、吸着
力の強い核酸が一旦吸着した免疫グロブリンMと処理中
に入れ換わっていく結果、回収率の低下を招くことにな
るという本発明者の知見に基づくものである。また、こ
の核酸は混在すると免疫グロブリンMの抗原結合活性を
減少させるために、本発明以外の方法においてもイオン
交換クロマトグラフィーの工程で除去されるものであ
る。
【0007】次に、核酸が除去された被処理液はアフィ
ニティクロマトグラフィーにより精製処理が行われる。
この工程を図1に基づいて説明すると、アフィニティク
ロマトグラフィー1内に投入された被処理液はプロタミ
ン4により免疫グロブリンMのみが選択的に吸着され、
残余の液は下方部より排出されることとなる。この場
合、被処理液中には前工程において既に核酸が除去され
ているのでプロタミン4は免疫グロブリンMのみを確実
かつ効率的に吸着することとなり、しかも前記のプロタ
ミン4は高速アフィニティ担体3の表面層に固定相とし
て形成されたものであるので、被処理液を高速度かつ大
量に流してもプロタミン4の固定相が劣化することもな
く確実な免疫グロブリンMの吸着を行うことができる。
また、この際に被処理液中に例えば塩化ナトリウムのよ
うな不活性無機塩を加えておいた場合には、被処理液中
にアルブミン等の夾雑タンパク質が多量に含有されてい
たとしてもタンパク質のイオン間相互作用力を減少させ
て、プロタミン4に免疫グロブリンMのみの特異的な吸
着を行わせることができ、より効率的な処理ができるこ
ととなる。なお、前記の不活性無機塩の濃度は十分な効
果を発揮させるためには少なくとも0.2モル以上とし
ておくことが好ましい。
ニティクロマトグラフィーにより精製処理が行われる。
この工程を図1に基づいて説明すると、アフィニティク
ロマトグラフィー1内に投入された被処理液はプロタミ
ン4により免疫グロブリンMのみが選択的に吸着され、
残余の液は下方部より排出されることとなる。この場
合、被処理液中には前工程において既に核酸が除去され
ているのでプロタミン4は免疫グロブリンMのみを確実
かつ効率的に吸着することとなり、しかも前記のプロタ
ミン4は高速アフィニティ担体3の表面層に固定相とし
て形成されたものであるので、被処理液を高速度かつ大
量に流してもプロタミン4の固定相が劣化することもな
く確実な免疫グロブリンMの吸着を行うことができる。
また、この際に被処理液中に例えば塩化ナトリウムのよ
うな不活性無機塩を加えておいた場合には、被処理液中
にアルブミン等の夾雑タンパク質が多量に含有されてい
たとしてもタンパク質のイオン間相互作用力を減少させ
て、プロタミン4に免疫グロブリンMのみの特異的な吸
着を行わせることができ、より効率的な処理ができるこ
ととなる。なお、前記の不活性無機塩の濃度は十分な効
果を発揮させるためには少なくとも0.2モル以上とし
ておくことが好ましい。
【0008】次に、プロタミン4に吸着した免疫グロブ
リンMを解離させるため、カラム2内を洗浄液で洗浄
後、溶出液を投入してアフィニティクロマトグラフィー
1の下方部より該溶出液とともに免疫グロブリンMを回
収する。この場合、前記の溶出液としてpHが7.2〜
8.0のジオキサン若しくはエチレングリコール溶液を
用いた場合には、免疫グロブリンMの凝集沈澱を有効に
防止して効率的な回収ができることとなる。その後、回
収した免疫グロブリンMをゲル濾過クロマトグラフィー
等によって重量濾過処理し、純度の高い免疫グロブリン
Mを単離して精製処理を終了する。
リンMを解離させるため、カラム2内を洗浄液で洗浄
後、溶出液を投入してアフィニティクロマトグラフィー
1の下方部より該溶出液とともに免疫グロブリンMを回
収する。この場合、前記の溶出液としてpHが7.2〜
8.0のジオキサン若しくはエチレングリコール溶液を
用いた場合には、免疫グロブリンMの凝集沈澱を有効に
防止して効率的な回収ができることとなる。その後、回
収した免疫グロブリンMをゲル濾過クロマトグラフィー
等によって重量濾過処理し、純度の高い免疫グロブリン
Mを単離して精製処理を終了する。
【0009】
【実施例】ヒトモノクローナル抗体産生株の無血清培養
液に核酸除去剤を添加して15分間攪拌し、氷浴上で1
0分間放置した後3000rpm で10分間遠心分離して核酸
を核酸除去剤とともに沈澱除去した。得られた被処理液
を、pH7.6 のリン酸緩衝化生理食塩水(PBS)で洗浄
して平衡化されているアフィニティクロマトグラフィー
(商品名「HiPAC 」:米国クロマトケム社製)に24cm
/min の線流速で投入し、次いでPBSで洗浄後、pH7.
6 の10%ジオキサン溶液で免疫グロブリンMの溶出を
行った。精製された溶出液中の免疫グロブリンMの抗体
量を、酵素免疫測定法(ELISA法)で測定した結果回収
率が82%であり、更にゲル濾過クロマトグラフィー処
理を施して得られた最終回収率は74%で、従来に比べ
て2倍以上の回収率であった。また、回収された免疫グ
ロブリンMに対してSDS−ポリアクリルアミドゲル電
気泳動を行った結果、免疫グロブリンMの単一バンドの
みが検出され高純度のものであることも確認できた。更
には、精製処理に要する時間も従来の一週間に比べて一
日と大幅に短縮することができた。
液に核酸除去剤を添加して15分間攪拌し、氷浴上で1
0分間放置した後3000rpm で10分間遠心分離して核酸
を核酸除去剤とともに沈澱除去した。得られた被処理液
を、pH7.6 のリン酸緩衝化生理食塩水(PBS)で洗浄
して平衡化されているアフィニティクロマトグラフィー
(商品名「HiPAC 」:米国クロマトケム社製)に24cm
/min の線流速で投入し、次いでPBSで洗浄後、pH7.
6 の10%ジオキサン溶液で免疫グロブリンMの溶出を
行った。精製された溶出液中の免疫グロブリンMの抗体
量を、酵素免疫測定法(ELISA法)で測定した結果回収
率が82%であり、更にゲル濾過クロマトグラフィー処
理を施して得られた最終回収率は74%で、従来に比べ
て2倍以上の回収率であった。また、回収された免疫グ
ロブリンMに対してSDS−ポリアクリルアミドゲル電
気泳動を行った結果、免疫グロブリンMの単一バンドの
みが検出され高純度のものであることも確認できた。更
には、精製処理に要する時間も従来の一週間に比べて一
日と大幅に短縮することができた。
【0010】
【発明の効果】以上の説明からも明らかなように本発明
は、被処理液を従来の数倍以上の流速で流すことができ
て高速度でかつ大量に精製処理を行うことができるとと
もに、被処理液中から免疫グロブリンMのみを特異的か
つ確実に吸着・分離し極めて高い回収率で効率的に精製
処理を行うことができるものであり、更には精製処理時
間も短いために活性の高い免疫グロブリンMが得られる
という利点も有するものである。よって本発明は従来の
問題点を一掃した免疫グロブリンMの精製方法として、
産業の発展に寄与するところは極めて大である。
は、被処理液を従来の数倍以上の流速で流すことができ
て高速度でかつ大量に精製処理を行うことができるとと
もに、被処理液中から免疫グロブリンMのみを特異的か
つ確実に吸着・分離し極めて高い回収率で効率的に精製
処理を行うことができるものであり、更には精製処理時
間も短いために活性の高い免疫グロブリンMが得られる
という利点も有するものである。よって本発明は従来の
問題点を一掃した免疫グロブリンMの精製方法として、
産業の発展に寄与するところは極めて大である。
【図1】アフィニティクロマトグラフィーの原理を示す
概略図である。
概略図である。
1 アフィニティクロマトグラフィー
2 カラム
3 高速アフィニティ担体
4 プロタミン
【手続補正書】
【提出日】平成4年8月19日
【手続補正1】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】0009
【補正方法】変更
【補正内容】
【0009】
【実施例1】ヒトモノクローナル抗体産生株の無血清培
養液に核酸除去剤を添加して15分間攪拌し、氷浴上で
10分間放置した後3000rpm で10分間遠心分離して核
酸を核酸除去剤とともに沈澱除去した。得られた被処理
液を、pH7.6 のリン酸緩衝化生理食塩水(PBS)で洗
浄して平衡化されているアフィニティクロマトグラフィ
ー(商品名「HiPAC 」:米国クロマトケム社製)に24
cm/min の線流速で投入し、次いでPBSで洗浄後、pH
7.6 の10%ジオキサン溶液で免疫グロブリンMの溶出
を行った。精製された溶出液中の免疫グロブリンMの抗
体量を、酵素免疫測定法(ELISA法)で測定した結果回
収率が82%であり、更にゲル濾過クロマトグラフィー
処理を施して得られた最終回収率は74%で、従来に比
べて2倍以上の回収率であった。また、回収された免疫
グロブリンMに対してSDS−ポリアクリルアミドゲル
電気泳動を行った結果、免疫グロブリンMの単一バンド
のみが検出され高純度のものであることも確認できた。
更には、精製処理に要する時間も従来の一週間に比べて
一日と大幅に短縮することができた。
養液に核酸除去剤を添加して15分間攪拌し、氷浴上で
10分間放置した後3000rpm で10分間遠心分離して核
酸を核酸除去剤とともに沈澱除去した。得られた被処理
液を、pH7.6 のリン酸緩衝化生理食塩水(PBS)で洗
浄して平衡化されているアフィニティクロマトグラフィ
ー(商品名「HiPAC 」:米国クロマトケム社製)に24
cm/min の線流速で投入し、次いでPBSで洗浄後、pH
7.6 の10%ジオキサン溶液で免疫グロブリンMの溶出
を行った。精製された溶出液中の免疫グロブリンMの抗
体量を、酵素免疫測定法(ELISA法)で測定した結果回
収率が82%であり、更にゲル濾過クロマトグラフィー
処理を施して得られた最終回収率は74%で、従来に比
べて2倍以上の回収率であった。また、回収された免疫
グロブリンMに対してSDS−ポリアクリルアミドゲル
電気泳動を行った結果、免疫グロブリンMの単一バンド
のみが検出され高純度のものであることも確認できた。
更には、精製処理に要する時間も従来の一週間に比べて
一日と大幅に短縮することができた。
【実施例2】マウス型モノクローナル抗体産生株の培養
上清中の核酸をイオン交換ゲルにイオン吸着させて除去
した。このマウス型免疫グロブリンMを30μg/mlの濃
度で含有する培養上清500mlをプロタミンを固定化し
た高速アフィニティカラムに直接、流速382cm/hrで
負荷した。培養上清を負荷後、マウス型免疫グロブリン
M以外のタンパクを0.2モル塩化ナトリウムを添加し
た20ミリモルリン酸緩衝液(pH6.8) を1084cm/hr
の流速で通液することにより洗い流した。カラム中のプ
ロタミンに選択的に吸着させたマウス型免疫グロブリン
Mは、77m モルリン酸−67m モルクエン酸緩衝液(p
H4) で流速361cm/hr で溶出させた。溶出液は1モル
Tris-Hcl(pH8)で直ちに中性に戻した後に、酸素免疫測
定法でマウス型免疫グロブリンM濃度を測定した。得ら
れたマウス型免疫グロブリンM画分は、タンパク量にし
て12.9mgであり、その回収率は86%であった。ま
た、マウス型免疫グロブリンMの精製度をSDS-ポリアク
リルアミドゲル電気泳動法およびゲル3過法により確認
したところ、純度95%以上であった。さらには、精製
処理に要した時間は3時間であり、mg/ml オーダーの高
濃度に濃縮された精製物が短時間で得られるようになっ
た。
上清中の核酸をイオン交換ゲルにイオン吸着させて除去
した。このマウス型免疫グロブリンMを30μg/mlの濃
度で含有する培養上清500mlをプロタミンを固定化し
た高速アフィニティカラムに直接、流速382cm/hrで
負荷した。培養上清を負荷後、マウス型免疫グロブリン
M以外のタンパクを0.2モル塩化ナトリウムを添加し
た20ミリモルリン酸緩衝液(pH6.8) を1084cm/hr
の流速で通液することにより洗い流した。カラム中のプ
ロタミンに選択的に吸着させたマウス型免疫グロブリン
Mは、77m モルリン酸−67m モルクエン酸緩衝液(p
H4) で流速361cm/hr で溶出させた。溶出液は1モル
Tris-Hcl(pH8)で直ちに中性に戻した後に、酸素免疫測
定法でマウス型免疫グロブリンM濃度を測定した。得ら
れたマウス型免疫グロブリンM画分は、タンパク量にし
て12.9mgであり、その回収率は86%であった。ま
た、マウス型免疫グロブリンMの精製度をSDS-ポリアク
リルアミドゲル電気泳動法およびゲル3過法により確認
したところ、純度95%以上であった。さらには、精製
処理に要した時間は3時間であり、mg/ml オーダーの高
濃度に濃縮された精製物が短時間で得られるようになっ
た。
【手続補正2】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】図面の簡単な説明
【補正方法】変更
【補正内容】
【図面の簡単な説明】
【図1】アフィニティクロマトグラフィーの原理を示す
概略図である。
概略図である。
【図2】マウス型モノクローナル抗体産生株の培養上清
から、プロタミン固定化アフィニティカラムによりマウ
ス型免疫グロブリンMが精製される工程を示すグラフで
ある。
から、プロタミン固定化アフィニティカラムによりマウ
ス型免疫グロブリンMが精製される工程を示すグラフで
ある。
【符号の説明】
1 アフィニティクロマトグラフィー
2 カラム
3 高速アフィニティ担体
4 プロタミン
【手続補正3】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図2
【補正方法】追加
【補正内容】
【図2】
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 FI 技術表示箇所
// C12P 21/08 8214−4B
G01N 33/531 A 8310−2J
(C12P 21/08
C12R 1:91)
Claims (3)
- 【請求項1】 クロマトグラフィーによる免疫グロブリ
ンMの精製方法において、被処理液中の核酸を除去した
後、シリカゲル若しくは多孔質ポリマーを基材とする高
速アフィニティ担体にプロタミンを固定相としたアフィ
ニティクロマトグラフィーにより精製処理することを特
徴とする免疫グロブリンMの精製方法。 - 【請求項2】 核酸を除去した被処理液に不活性無機塩
を添加し、シリカゲルを基材とする高速アフィニティ担
体を用いることを特徴とする請求項1に記載の免疫グロ
ブリンMの精製方法。 - 【請求項3】 プロタミンに吸着した免疫グロブリンM
をジオキサン若しくはエチレングリコール溶液により解
離することを特徴とする請求項1または請求項2に記載
の免疫グロブリンMの精製方法。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP3209840A JP2945181B2 (ja) | 1991-07-26 | 1991-07-26 | 免疫グロブリンmの精製方法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP3209840A JP2945181B2 (ja) | 1991-07-26 | 1991-07-26 | 免疫グロブリンmの精製方法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPH0532700A true JPH0532700A (ja) | 1993-02-09 |
JP2945181B2 JP2945181B2 (ja) | 1999-09-06 |
Family
ID=16579493
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP3209840A Expired - Lifetime JP2945181B2 (ja) | 1991-07-26 | 1991-07-26 | 免疫グロブリンmの精製方法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JP2945181B2 (ja) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2011049201A1 (ja) * | 2009-10-22 | 2011-04-28 | 富士化学株式会社 | 抗菌剤及び抗菌性製品 |
-
1991
- 1991-07-26 JP JP3209840A patent/JP2945181B2/ja not_active Expired - Lifetime
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2011049201A1 (ja) * | 2009-10-22 | 2011-04-28 | 富士化学株式会社 | 抗菌剤及び抗菌性製品 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JP2945181B2 (ja) | 1999-09-06 |
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