JPH0530977A - アスパルターゼをコードする遺伝子ｄｎａ及びその利用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】 ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３
株からアスパルターゼをコードする遺伝子ＤＮＡを単離
し、この遺伝子の塩基配列を決定した。 【効果】 このアスパルターゼをコードする遺伝子ＤＮ
Ａを導入したコリネ型細菌内で複製増殖可能なプラスミ
ドで形質転換されたブレビバクテリウム・フラバムＭＪ
−２３３はＬ−アスパラギン酸を高産生した。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、アスパルターゼ（Ｅ
Ｃ.４.３.１.１）をコードする遺伝子を含むコリネ型細
菌由来の遺伝子ＤＮＡ、該遺伝子ＤＮＡを含む組換えプ
ラスミド、該組換えプラスミドで形質転換されたコリネ
型細菌、及び該コリネ型細菌を用いるＬ−アスパラギン
酸の製造法に関する。

【０００２】Ｌ−アスパラギン酸は、必須アミノ酸の一
つとして蛋白質中にその存在が知られ、医薬や食品添加
物として用いられている。

【０００３】

【従来の技術】従来、Ｌ−アスパラギン酸の工業的製造
法としては、フマル酸とアンモニアを出発原料として、
アスパルターゼ活性を有する微生物を用いて製造する方
法が数多く提案されている〔例えば、Ｉ.Ｃhibata et a
l., Ａppl. Ｍicrobiol., 27,878 (1974)；特公昭６１
−２９７１８号公報；特開昭６０−１２０９８３号公報
等参照〕。しかしながら、これら従来提案されているＬ
−アスパラギン酸の製造法には改良に限界があり、新た
な観点から、遺伝子工学的手法による菌株の改良等によ
る、より効率的なＬ−アスパラギン酸の工業的製造法の
確立が望まれている。

【０００４】一方、アスパルターゼをコードする遺伝子
としては、エシェリヒア・コリ（Ｅscherichia coli）
由来の遺伝子（Ｊournal of Ｇeneral Ｍicrobiology,
130,p1271-1278, 1984 参照）及びシュードモナス・フ
ルオロエスセンス（Ｐseudomonas fluorescens）由来の
遺伝子（Ｊournal of Ｂiochemistry, 100, p697-705,1
986 参照）がよく研究されている。このうちエシェリヒ
ア・コリ由来のアスパルターゼは、蛋白分子量が１７万
から１９.３万で４量体を形成していることが知られて
いる（Ａrchives of Ｂiochemistry and Ｂiophysics,
147, p563-570, 1979 参照）。しかしながら、コリネ型細
菌由来のアスパルターゼをコードする遺伝子については
従来報告例がない。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、コリ
ネ型細菌由来のアスパルターゼをコードする遺伝子を単
離し、該遺伝子を同種であるコリネ型細菌に導入し、該
コリネ型細菌を用いて新たな観点から効率的にＬ−アス
パラギン酸を製造することである。

【０００６】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記目的
を達成すべく鋭意研究を重ねた結果、コリネ型細菌染色
体よりアスパルターゼ遺伝子を単離し、該遺伝子を適当
なベクタープラスミドに導入して、コリネ型細菌を形質
転換し、該形質転換されたコリネ型細菌を用いれば効率
的にＬ−アスパラギン酸を製造しうることを見い出し本
発明を完成するに至った。かくして本発明によれば、 (１) コリネ型細菌由来のアスパルターゼをコードする
遺伝子ＤＮＡ； (２) 該遺伝子ＤＮＡが導入された組換えプラスミド； (３) 該組換えプラスミドで形質転換されたコリネ型細
菌；及び (４) 該形質転換されたコリネ型細菌を用いフマール酸
またはその塩とアンモニアまたはアンモニウム塩とから
Ｌ−アスパラギン酸を製造する方法、が提供される。

【０００７】以下、本発明についてさらに詳細に説明す
る。

【０００８】本発明の「アスパルターゼをコードする遺
伝子ＤＮＡ」は、フマル酸とアンモニアからＬ−アスパ
ラギン酸への変換反応を触媒する酵素、すなわちアスパ
ルターゼ（ＥＣ.４.３.１.１）をコードする遺伝子ＤＮ
Ａである。アスパルターゼをコードする遺伝子は多数の
微生物が保有しているが、本発明では殊にコリネ型細菌
由来のものが好適である。

【０００９】アスパルターゼをコードする遺伝子を含む
ＤＮＡ断片（以下、これを「Ａ断片」と略称することが
ある）の供給源となる微生物は、コリネ型細菌であれば
特に限定されるものではないが、一般的には、ブレビバ
クテリウム・フラバムＭＪ−２３３（ＦＥＲＭ ＢＰ−
１４９７）およびその由来株；ブレビバクテリウム・ア
ンモニアゲネス（Ｂrevibacterium ammoniagenes）ＡＴ
ＣＣ６８７１、同ＡＴＣＣ１３７４５、同ＡＴＣＣ１３
７４６；ブレビバクテリウム・デバリカタム（Ｂreviba
cterium divaricatum）ＡＴＣＣ１４０２０；ブレビバ
クテリウム・ラクトファーメンタム（Ｂrevibacterium
lactofermentum）ＡＴＣＣ１３８６９；コリネバクテリ
ウム・グルタミカム（Ｃorynebacterium glutamicum）
ＡＴＣＣ３１８３１等が有利に使用される。

【００１０】これらの供給源微生物からＡ断片を調整す
るための基本的操作の一例を述べれば次のとおりであ
る。

【００１１】すなわち、Ａ断片は、上記コリネ型細菌、
例えばブレビバクテリウム・フラバム（Ｂrevibacteriu
m flavum）ＭＪ−２３３（ＦＥＲＭ ＢＰ−１４９７）
株の染色体上に存在し、この染色体を適当な制限酵素で
切断することにより生ずる切断断片の中から以下に述べ
る方法で分離、取得することができる。

【００１２】先ず、ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ
−２３３株の培養物から染色体ＤＮＡを抽出する。この
染色体ＤＮＡを適当な制限酵素、例えばＳau３ＡＩを用
いて、ＤＮＡ断片の大きさが約２０〜３０ｋｂになるよ
うに部分分解する。

【００１３】得られたＤＮＡ断片をコスミドベクター、
例えばｐＷＥ１５に挿入し、このコスミドをλＤＮＡ i
n vitro Ｐackaging Ｋit を用いる形質導入により、ア
スパルターゼ遺伝子が欠損した大腸菌変異株（Ｊournal
of Ｇeneral Ｍicrobiology, 130, p1271-1278, 1984
参照）に導入する。この大腸菌変異株をＬ−グルタミン
酸を単一炭素源とする培地に塗沫する。

【００１４】得られる形質転換株よりコスミドＤＮＡを
抽出し、制限酵素で解析することにより挿入されたブレ
ビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３株染色体由来の
Ａ断片を確認、取得することができる。

【００１５】かくして得られるＡ断片は、大きさが約２
０〜３０ｋｂと大きく、実用的でないので、さらに短か
い断片に特定化することが望ましい。

【００１６】そこで、上記で得られるＡ断片を含むコス
ミドを適当な制限酵素を用いて切断し、得られるＤＮＡ
断片を、大腸菌で複製可能なベクタープラスミドに挿入
しこのベクタープラスミドを通常用いられる形質転換
法、例えば、塩化カルシウム法、電気パルス法による形
質転換により、前記アスパルターゼが欠損した大腸菌変
異株に導入し、この大腸菌変異株をＬ−グルタミン酸を
単一炭素源とする培地に塗沫する。

【００１７】得られる形質転換株よりプラスミドＤＮＡ
を抽出し、制限酵素で解析することにより挿入されたブ
レビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３株染色体由来
のＡ断片を確認、取得することができる。

【００１８】このようにして得られるＡ断片の一つは、
上記ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３株の染
色体ＤＮＡを制限酵素Ｓau３Ａ１の部分分解により切り
出し、さらにそれを制限酵素ＥcoＲＩで切り出すことに
よって得られる大きさが約２.４ｋｂのＤＮＡ断片を挙
げることができる。

【００１９】この約２.４ｋｂのアスパルターゼをコー
ドする遺伝子を含むＤＮＡ断片を、各種の制限酵素で切
断したときの認識部位数及び切断断片の大きさを下記表
１に示す。

【００２０】なお、本明細書において、制限酵素による
「認識部位数」は、ＤＮＡ断片又はプラスミドを、制限
酵素の存在下で完全分解し、それらの分解物をそれ自体
既知の方法に従い１％アガロースゲル電気泳動および５
％ポリアクリルアミドゲル電気泳動に供し、分離可能な
断片の数から決定した値を採用した。

【００２１】また、「切断断片の大きさ」及びプラスミ
ドの大きさは、アガロースゲル電気泳動を用いる場合に
は、エシェリヒア・コリのラムダファージ（λphage）
のＤＮＡを制限酵素Ｈind ＩＩＩで切断して得られる分
子量既知のＤＮＡ断片の同一アガロースゲル上での泳動
距離で描かれる標準線に基づき、また、ポリアクリルア
ミドゲル電気泳動を用いる場合には、エシェリヒア・コ
リのファイ・エックス１７４ファージ（φ×１７４phag
e）のＤＮＡを制限酵素Ｈae ＩＩＩで切断して得られる
分子量既知のＤＮＡ断片の同一ポリアクリルアミドゲル
上での泳動距離で描かれる標準線に基づき、切断ＤＮＡ
断片又はプラスミドの各ＤＮＡ断片の大きさを算出す
る。プラスミドの大きさは、切断断片それぞれの大きさ
を加算して求める。なお、各ＤＮＡ断片の大きさの決定
において、１ｋｂ以上の断片の大きさについては、１％
アガロースゲル電気泳動によって得られる結果を採用
し、約０.１ｋｂから１ｋｂ未満の断片の大きさについ
ては４％ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって得ら
れる結果を採用した。

【００２２】

【表１】 表 １ 制限酵素 認識部位数 切断断片の大きさ(kb) Ａva Ｉ １ １.７， ０.７ Ｃla Ｉ １ １.３， １.１ Ｈind III ２ １.７， ０.３５， ０.３５ 一方、上記したブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２
３３の染色体ＤＮＡを制限酵素ＥcoＲＩで切り出すこと
により得られる大きさが約２.４ｋｂのＤＮＡ断片につ
いては、その塩基配列をプラスミドｐＵＣ１８またはｐ
ＵＣ１９を用いるジデオキシヌクレオチド酵素法（dide
oxy chain termination 法）（Ｓanger,Ｆ. et al., Ｐ
roc. Ｎatl Ａcad. Ｓci. ＵＳＡ 74, 5463, 1977）に
より決定することができる。このようにして決定した上
記約２.４ｋｂのＤＮＡ断片の塩基配列中のオープンリ
ーテイングフレームの存在から決定したアスパルターゼ
をコードする遺伝子は、次の配列を有しており、５２６
のアミノ酸をコードする１５７８の塩基対から構成され
る： 〔配列〕 ATG TCT AAG ACG AGC AAC AAG TCT TCA GCA GAC TCA AAG AAT GAC GCA 48 Met Ser Lys Thr Ser Asn Lys Ser Ser Ala Asp Ser Lys Asn Asp Ala 1 5 10 15 AAA GCC GAA GAC ATT GTG AAC GGC GAG AAC CAA ATC GCC ACG AAT GAG 96 Lys Ala Glu Asp Ile Val Asn Gly Glu Asn Gln Ile Ala Thr Asn Glu 20 25 30 TCG CAG TCT TCA GAC AGC GCT GCA GTT TCG GAA CGT GTC GTC GAA CCA 144 Ser Gln Ser Ser Asp Ser Ala Ala Val Ser Glu Arg Val Val Glu Pro 35 40 45 AAA ACC ACG GTT CAG AAA AAG TTC CGA ATC GAA TCG GAT CTG CTT GGT 192 Lys Thr Thr Val Gln Lys Lys Phe Arg Ile Glu Ser Asp Leu Leu Gly 50 55 60 GAA CTT CAG ATC CCA TCC CAC GCA TAT TAC GGC GTG CAC ACC CTT CGT 240 Glu Leu Gln Ile Pro Ser His Ala Tyr Tyr Gly Val His Thr Leu Arg 65 70 75 80 GCG GTG GAC AAC TTC CAA ATC TCA CGA ACC ACC ATC AAC CAC GTC CCA 288 Ala Val Asp Asn Phe Gln Ile Ser Arg Thr Thr Ile Asn His Val Pro 85 90 95 GAT TTC ATT CGC GGC ATG GTC CAG GTG AAA AAG GCC GCA GCT TTA GCA 336 Asp Phe Ile Arg Gly Met Val Gln Val Lys Lys Ala Ala Ala Leu Ala 100 105 110 AAC CGC CGA CTA CAC ACA CTT CCA GCA CAA AAA GCA GAA GCA ATT GTC 384 Asn Arg Arg Leu His Thr Leu Pro Ala Gln Lys Ala Glu Ala Ile Val 115 120 125 TGG GCT TGT GAT CAG ATC CTC ATT GAG GGA CGC TGT ATG GAT CAG TTC 432 Trp Ala Cys Asp Gln Ile Leu Ile Glu Gly Arg Cys Met Asp Gln Phe 130 135 140 CCC ATC GAT GTG TTC CAG GGT GGC GCA GGT ACC TCA CTG AAC ATG AAC 480 Pro Ile Asp Val Phe Gln Gly Gly Ala Gly Thr Ser Leu Asn Met Asn 145 150 155 160 ACC AAC GAA GTT GTT GCC AAC CTT GCA CTT GAG TTC TTA GGC CAT GAA 528 Thr Asn Glu Val Val Ala Asn Leu Ala Leu Glu Phe Leu Gly His Glu 165 170 175 AAG GGC GAG TAC CAC ATC CTG CAC CCC ATG GAT GAT GTG AAC ATG TCC 576 Lys Gly Glu Tyr His Ile Leu His Pro Met Asp Asp Val Asn Met Ser 180 185 190 CAG TCC ACC AAC GAT TCC TAC CCA ACT GGT TTC CGC CTG GGC ATT TAC 624 Gln Ser Thr Asn Asp Ser Tyr Pro Thr Gly Phe Arg Leu Gly Ile Tyr 195 200 205 GCT GGA CTG CAG ACC CTC ATC GCT GAA ATT GAT GAG CTT CAG GTT GCG 672 Ala Gly Leu Gln Thr Leu Ile Ala Glu Ile Asp Glu Leu Gln Val Ala 210 215 220 TTC CGC CAC AAG GGC AAT GAG TTT GTC GAC ATC ATC AAG ATG GGC CGC 720 Phe Arg His Lys Gly Asn Glu Phe Val Asp Ile Ile Lys Met Gly Arg 225 230 235 240 ACC CAG TTG CAG GAT GCT GTT CCC ATG AGC TTG GGC GAA GAG TTC CGA 768 Thr Gln Leu Gln Asp Ala Val Pro Met Ser Leu Gly Glu Glu Phe Arg 245 250 255 GCA TTC GCG CAC AAC CTC GCA GAA GAG CAG ACC GTG CTG CGT GAA GCT 816 Ala Phe Ala His Asn Leu Ala Glu Glu Gln Thr Val Leu Arg Glu Ala 260 265 270 GCC AAC CGT CTC CTC GAG GTC AAC CTT GGT GCA ACC GCA ATC GGT ACT 864 Ala Asn Arg Leu Leu Glu Val Asn Leu Gly Ala Thr Ala Ile Gly Thr 275 280 285 GGT GTG AAC ACT CCA GCA GGC TAC CGC CAC CAG GTT GTC GCT GCT CTG 912 Gly Val Asn Thr Pro Ala Gly Tyr Arg His Gln Val Val Ala Ala Leu 290 295 300 TCT GAG GTC ACC GGA CTG GAA CTA AAG TCC GCA CGT GAT CTC ATT GAG 960 Ser Glu Val Thr Gly Leu Glu Leu Lys Ser Ala Arg Asp Leu Ile Glu 305 310 315 320 GCT ACC TCT GAC ACC GGT GCA TAT GTT CAT GCG CAC TCC GCA ATC AAG 1008 Ala Thr Ser Asp Thr Gly Ala Tyr Val His Ala His Ser Ala Ile Lys 325 330 335 CGT GCA GCC ATG AAA CTG TCC AAG ATC TGT AAC GAT CTA CGT CTG CTG 1056 Arg Ala Ala Met Lys Leu Ser Lys Ile Cys Asn Asp Leu Arg Leu Leu 340 345 350 TCT TCT GGT CCT CGT GCT GGC TTG AAC GAA ATC AAT CTG CCA CCA CGC 1104 Ser Ser Gly Pro Arg Ala Gly Leu Asn Glu Ile Asn Leu Pro Pro Arg 355 360 365 CAG GCT GGT TCC TCC ATC ATG CCA GCC AAG GTC AAC CCA GTG ATC CCA 1152 Gln Ala Gly Ser Ser Ile Met Pro Ala Lys Val Asn Pro Val Ile Pro 370 375 380 GAA GTG GTC AAC CAG GTC TGC TTC AAG GTC TTC GGT AAC GAT CTC ACC 1200 Glu Val Val Asn Gln Val Cys Phe Lys Val Phe Gly Asn Asp Leu Thr 385 390 395 400 GTC ACC ATG GCT GCG GAA GCT GGC CAG TTG CAG CTC AAC GTC ATG GAG 1248 Val Thr Met Ala Ala Glu Ala Gly Gln Leu Gln Leu Asn Val Met Glu 405 410 415 CCA GTC ATT GGC GAA TCC CTC TTC CAG TCA CTG CGC ATC CTG GGC AAT 1296 Pro Val Ile Gly Glu Ser Leu Phe Gln Ser Leu Arg Ile Leu Gly Asn 420 425 430 GCA GCC AAG ACT TTG CGT GAG AAG TGC GTC GTA GGA ATC ACC GCC AAC 1344 Ala Ala Lys Thr Leu Arg Glu Lys Cys Val Val Gly Ile Thr Ala Asn 435 440 445 GCT GAT GTT TGC CGT GCT TAC GTT GAT AAC TCC ATT GGC ATT ATC ACT 1392 Ala Asp Val Cys Arg Ala Tyr Val Asp Asn Ser Ile Gly Ile Ile Thr 450 455 460 TAC CTG AAC CCA TTC CTG GGC CAC GAC ATT GGA GAT CAG ATC GGT AAG 1440 Tyr Leu Asn Pro Phe Leu Gly His Asp Ile Gly Asp Gln Ile Gly Lys 465 470 475 480 GAA GCA GCC GAA ACT GGT CGA CCA GTG CGT GAA CTC ATC CTG GAA AAG 1488 Glu Ala Ala Glu Thr Gly Arg Pro Val Arg Glu Leu Ile Leu Glu Lys 485 490 495 AAG CTC ATG GAT GAA AAG ACG CTC GAG GCA GTC CTA TCC AAG GAG AAC 1536 Lys Leu Met Asp Glu Lys Thr Leu Glu Ala Val Leu Ser Lys Glu Asn 500 505 510 CTC ATG CAC CCA ATG TTC CGC GGA AGG CTC TAC TTG GAG AAC TAA 1581 Leu Met His Pro Met Phe Arg Gly Arg Leu Tyr Leu Glu Asn 515 520 525 上記の塩基配列を包含して成る本発明のアスパルター
ゼをコードする遺伝子を含むＤＮＡ断片は、天然のコリ
ネ型細菌染色体ＤＮＡから分離されたもののみならず、
通常用いられるＤＮＡ合成装置、例えばベックマン社製
System−１ Plusを用いて合成されたものであってもよ
い。

【００２３】また、前記の如くブレビハクテリウム・フ
ラバムＭＪ−２３３の染色体ＤＮＡから取得される本発
明のＤＮＡ断片は、アスパルターゼをコードする機能を
実質的に損なうことがない限り、塩基配列の一部の塩基
が他の塩基と置換されていてもよく又は削除されていて
もよく、或いは新たに塩基が挿入されていてもよく、さ
らに塩基配列の一部が転位されているものであってもよ
く、これらの誘導体のいすれもが、本発明のアスパルタ
ーゼをコードする遺伝子を含むＤＮＡ断片に包含される
ものである。

【００２４】以上に詳述した大きさが約２.４ｋｂのＤ
ＮＡ断片の制限酵素による切断点地図を図１に示す。

【００２５】本発明のアスパルターゼをコードする遺伝
子を含むＤＮＡ断片（Ａ断片）は、コリネ型細菌内でプ
ラスミドの複製増殖機能を司る遺伝子を少くとも含むプ
ラスミドベクターに導入することにより、コリネ型細菌
内でアスパルターゼの高発現可能な組換えプラスミドを
得ることができる。

【００２６】また、本発明のアスパルターゼをコードす
る遺伝子を発現させるためのプロモーターは、コリネ型
細菌が保有する該遺伝子自身のプロモーターであること
ができ、またはアスパルターゼ遺伝子の転写を開始させ
るための原核生物由来の塩基配列である限りいかなるプ
ロモーターであってもよい。

【００２７】本発明のＡ断片を導入することができる、
コリネ型細菌内での複製増殖機能を司る遺伝子を少くと
も含むプラスミドベクターとしては、例えば、特願平２
−４２１２号明細書に記載のプラスミドｐＣＲＹ３０；
特開平２−２７６５７５号公報に記載のプラスミドｐＣ
ＲＹ２１、ｐＣＲＹ２ＫＥ、ｐＣＲＹ２ＫＸ、ｐＣＲＹ
３Ｋ７、ｐＣＲＹ３ＫＥ及びｐＣＲＹ３ＫＸ；特開平１
−１９１６８６号公報に記載のプラスミドｐＣＲＹ２及
びｐＣＲＹ３；特開昭５８−６７６７９号公報に記載の
ｐＡＭ３３０；特開昭５８−７７８９５号公報に記載の
ｐＨＭ１５１９；特開昭５８−１９２９００号公報に記
載のｐＡＪ６５５、ｐＡＪ６１１及びｐＡＪ１８４４；
特開昭５７−１３４５００号に記載のｐＣＧ１；特開昭
５８−３５１９７号公報に記載のｐＣＧ２；特開昭５７
−１８３７９９号公報に記載のｐＣＧ４及びｐＣＧ１１
等を挙げることができる。

【００２８】中でもコリネ型細菌の宿主ベクター系で用
いられるプラスミドベクターとしては、コリネ型細菌内
でプラスミドの複製増殖機能を司る遺伝子とコリネ型細
菌内でプラスミドの安定化機能を司る遺伝子とをもつも
のが好ましく、例えばプラスミドｐＣＲＹ３０、ｐＣＲ
Ｙ２１、ｐＣＲＹ２ＫＥ、ｐＣＲＹ２ＫＥ、ｐＣＲＹ２
ＫＸ、ｐＣＲＹ３Ｋ７、ｐＣＲＹ３ＫＥ及びｐＣＲＹ３
ＫＸ等が好適に使用される。

【００２９】上記プラスミドベクターｐＣＲＹ３０を調
製する方法としては、ブレビバクテリウム・スタチオニ
ス(Brevibacterium stationis)ＩＦＯ１２１４４（ＦＥ
ＲＭＢＰ−２５１５）からプラスミドｐＢＹ５０３（こ
のプラスミドの詳細については特開平１−９５７８５号
公報参照）ＤＮＡを抽出し、制限酵素ＸｈｏＩで大きさ
が約４.０ｋｂのプラスミドの複製増殖機能を司る遺伝
子を含むＤＮＡ断片を切り出し、制限酵素ＥｃｏＲＩお
よびＫｐｎＩで大きさが約２.１ｋｂのプラスミドの安
定化機能を司る遺伝子を含むＤＮＡ断片を切り出す。こ
れらの両断片をプラスミドｐＨＳＧ２９８（宝酒造製）
のＥｃｏＲＩ、ＫｐｎＩ部位及びＳａｌＩ部に組み込む
ことにより、プラスミドベクターｐＣＲＹ３０を調製す
ることができる。

【００３０】次に、上記プラスミドベクターへの本発明
のＡ断片の導入は、例えばプラスミドベクター中に１個
所だけ存在する制限酵素部位を、該制限酵素で開裂し、
そこに前記Ａ断片および開裂したプラスミドベクターを
必要に応じてＳ１ヌクレアーゼで処理して平滑末端とす
るか、または適当なアダプターＤＮＡの存在下にＤＮＡ
リガーゼ処理で連結させることにより行うことができ
る。

【００３１】プラスミドｐＣＲＹ３０への本発明のＡ断
片の導入は、プラスミドｐＣＲＹ３０を制限酵素Ｅｃｏ
ＲＩで開裂させ、そこに前記アスパルターゼをコードす
る遺伝子を含むＤＮＡ断片（Ａ断片）をＤＮＡリガーゼ
で連結させることにより行うことができる。

【００３２】このようにして造成されるプラスミドｐＣ
ＲＹ３０に本発明の大きさが約２.４ｋｂのＡ断片を導
入した組換えプラスミドは、Ｌ−アスパラギン酸の製造
に好適に用いることができる組換えプラスミドの一つで
あり、本発明者らはこれをプラスミドｐＣＲＹ３０−Ａ
ｓｐＢと命名した。プラスミドｐＣＲＹ３０−ＡｓｐＢ
の作成方法の詳細については、後記実施例４で説明す
る。

【００３３】このプラスミドｐＣＲＹ３０−ＡｓｐＢの
制限酵素切断点地図を図２に示す。このようにして造成
されるアスパルターゼ遺伝子を含むコリネ型細菌内で複
製増殖可能なプラスミドを、宿主微生物に導入し、該微
生物の培養物を用いてＬ−アスパラギン酸を安定に効率
よく生産することが可能となる。

【００３４】本発明によるプラスミドで形質転換しうる
宿主微生物としては、コリネ型細菌、例えばブレビバク
テリウム・フラバムＭＪ−２３３（ＦＥＲＭ ＢＰ−１
４９７）、ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３
−ＡＢ−４１（ＦＥＲＭ ＢＰ−１４９８）、ブレビバ
クテリウム・フラバムＭＪ−２３３−ＡＢＴ−１１（Ｆ
ＥＲＭ ＢＰ−１５００）、ブレビバクテリウム・フラ
バムＭＪ−２３３−ＡＢＤ−２１（ＦＥＲＭ ＢＰ−１
４９９）等が挙げられる。

【００３５】なお、上記のＦＥＲＭ ＢＰ−１４９８の
菌株は、ＦＥＲＭ ＢＰ−１４９７の菌株を親株として
ＤＬ−α−アミノ酪酸耐性を積極的に付与されたエタノ
ール資化性微生物である（特公昭５９−２８３９８号公
報第３〜４欄参照）。また、ＦＥＲＭ ＢＰ−１５００
の菌株は、ＦＥＲＭ ＢＰ−１４９７の菌株を親株とし
たＬ−α−アミノ酪酸トランスアミナーゼ高活性変異株
である（特開昭６２−５１９９８号公報参照）。さら
に、ＦＥＲＭ ＢＰ−１４９９の菌株はＦＥＲＭＢＰ−
１４９７の菌株を親株としたＤ−α−アミノ酪酸デアミ
ナーゼ高活性変異株である（特開昭６１−１７７９９３
号公報参照）。

【００３６】これらの微生物の他に、ブレビバクテリウ
ム・アンモニアゲネス(Brevibacterium ammoniagenes)
ＡＴＣＣ６８７１、同ＡＴＣＣ１３７４５、同ＡＴＣＣ
１３７４６；ブレビバクテリウム・デバリカタム(Brevi
bacterium divaricatum)ＡＴＣＣ14020;ブレビバクテリ
ウム・ラクトファーメンタム(Brevibacterium lactofer
mentum)ＡＴＣＣ１３８６９；コリネバクテリウム・グ
ルタミカム(Corynebacterium glutamicum)ＡＴＣＣ３１
８３１等を宿主微生物として用いることもできる。

【００３７】なお宿主としてブレビバクテリウム・フラ
バムＭＪ−２３３由来の菌株を用いる場合、本菌株が保
有するプラスミドｐＢＹ５０２（特開昭６３−３６７８
７号公報参照）のため、形質転換が困難である場合があ
るので、そのような場合には、本菌株よりプラスミドｐ
ＢＹ５０２を除去することが望ましい。そのようなプラ
スミドｐＢＹ５０２を除去する方法としては、例えば、
継代培養を繰り返すことにより、自然に欠失させること
も可能であるし、人為的に除去することも可能である[B
act. Rev. ３６ｐ．３６１〜４０５（１９７２）参
照］。上記プラスミドｐＢＹ５０２を人為的に除去する
方法の一例を示せば次のとおりである。

【００３８】宿主ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−
２３３の生育を不完全に阻害する濃度のアクリジンオレ
ンジ（濃度：０.２〜５０μｇ／ｍｌ）もしくはエチジ
ウムブロミド（濃度：０.２〜５０μｇ／ｍｌ）等を含
む培地に、１ｍｌ当り約１０細胞になるように植菌し、
生育を不完全に阻害しながら、約２４時間約３５℃で培
養する。培養液を希釈後寒天培地に塗布し、約３５℃で
約２日培養する。出現したコロニーから各々独立にプラ
スミド抽出操作を行い、プラスミドｐＢＹ５０２が除去
されている株を選択する。この操作によりプラスミドｐ
ＢＹ５０２が除去されたブレビバクテリウム・フラバム
ＭＪ−２３３由来菌株が得られる。

【００３９】このようにして得られるブレビバクテリウ
ム・フラバムＭＪ−２３３由来菌株への前記プラスミド
の形質転換法としては、エシエリヒア・コリ及びエルビ
ニア・カロトボラについて知られているように[Calvin,
N.M. and Hanawalt, P. C., Journal of Bacteriolog
y, １７０，２７９６（１９８８）；Ito,K., Nishida,
T. and Izaki. K., Agricultural and Biological Chem
istry, ５２，２９３（１９８８）参照］、ＤＮＡ受容
菌へのパルス波通電[Satoh, Y. et al., Journal of In
dustrial Microbiology, ５，１５９（１９９０）参
照］等によりプラスミドを導入することが可能である。

【００４０】上記の方法で形質転換して得られるアスパ
ルターゼ産生能を有するコリネ型細菌、例えばブレビバ
クテリウム・フラバムＭＪ−２３３由来株の培養方法を
以下に述べる。

【００４１】培養は炭素源、窒素源、無機塩等を含む通
常の栄養培地で行うことができ、炭素源としては、例え
ばグルコース、エタノール、メタノール、廃糖蜜等が、
そして窒素源としては、例えばアンモニア、硫酸アンモ
ニウム、塩化アンモニウム、硝酸アンモニウム、尿素等
がそれぞれ単独もしくは混合して用いられる。また、無
機塩としては、例えばリン酸一水素カリウム、リン酸二
水素カリウム、硫酸マグネシウム等が用いられる。この
他にペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスティー
プリカー、カザミノ酸、ビオチン等の各種ビタミン等の
栄養素を培地に添加することができる。

【００４２】培養は、通常、通気撹拌、振盪等の好気的
条件下に、約２０〜４０℃、好ましくは２５〜３５℃の
温度で行うことができる。培養途中のｐＨは５〜１０、
好ましくは７〜８付近とすることができ、培養中のｐＨ
の調整は酸又はアルカリを添加して行うことができる。

【００４３】培養開始時の炭素源濃度は、好ましくは１
〜５容量％、更に好ましくは２〜３容量％である。ま
た、培養期間は通常１〜７日間とすることができ、最適
期間は３日間である。

【００４４】このようにして得られる培養物から各々菌
体を集めて、水又は適当な緩衝液で洗浄し、Ｌ−アスパ
ラギン酸生成反応に使用することができる。

【００４５】Ｌ−アスパラギン酸生成反応においては、
これらの菌体をそのまま用いることができ、あるいは超
音波処理等を加えた菌体破砕物として、あるいは適当な
担体に固定化して用いることができる。さらに好ましく
は、該菌体もしくはその破砕物または固定化物をあらか
じめＬ−アスパラギン酸及びアンモニウムイオンの存在
下且つｐＨのアルカリ域において約４０〜６０℃の温度
で加熱処理した処理物を用いることもできる。

【００４６】以上に述べた如き菌体の破砕物、固定化物
及び加熱処理物等を本明細書ではまとめて「菌体処理
物」という。

【００４７】しかして本発明に従えば、上記培養菌体又
は菌体処理物の存在下に、フマール酸又はその塩とアン
モニア又はアンモニウム塩を反応せしめることからなる
Ｌ−アスパラギン酸の製造法が提供される。

【００４８】フマール酸又はその塩とアンモニア又はア
ンモニウム塩との間の酵素反応は、水性媒体中で、約０
〜６０℃の範囲内で行なうことができるが、アスパルタ
ーゼの安定性を考慮して２０〜５０℃の範囲内で実施す
るのが好ましい。また、フマール酸又はその塩とアンモ
ニア又はアンモニウム塩との使用モル比は通常１：１〜
１：５の範囲内が適当である。

【００４９】

【実施例】以上に本発明を説明してきたが、下記の実施
例によりさらに具体的に説明する。

【００５０】実施例１ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３由来のアス
パルターゼをコードする遺伝子を含むＤＮＡ断片（Ａ断
片）のクローン化 （Ａ）ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３の全
ＤＮＡの抽出 半合成培地Ａ培地［組成：尿素２ｇ、（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄
７ｇ、Ｋ₂ＨＰＯ₄ ０.５ｇ、ＫＨ₂ＰＯ₄ ０.５ｇ、Ｍｇ
ＳＯ₄ ０.５ｇ、ＦｅＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ ６mg、ＭｎＳＯ₄
４〜６Ｈ₂Ｏ ６mg、酵母エキス２.５ｇ、カザミノ酸５
ｇ、ビチオン２００μｇ、塩酸チアミン２００μｇ、グ
ルコース２０ｇ、蒸留水１１］１１に、ブレビバクテリ
ウム・フラバムＭＪ−２３３（ＦＥＲＭ ＢＰ−１４９
７）を対数増殖期後期まで培養し、菌体を集めた。得ら
れた菌体を１０mg／mlの濃度にリゾチームを含む１０ｍ
Ｍ ＮａＣｌ−２０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ８.０）−
１ｍＭ ＥＤＴＡ−２Ｎａ溶液１５mlに懸濁した。次に
プロテナーゼＫを、最終濃度が１００μｇ／mlになるよ
うに添加し、３７℃で１時間保温した。さらにドデシル
硫酸ナトリウムを最終濃度が０.５％になるように添加
し、５０℃で６時間保温して溶菌した。この溶菌液に、
等量のフェノール／クロロホルム溶液を添加し、室温で
１０分間ゆるやかに振盪した後、全量を遠心分離（５,
０００×ｇ、２０分間、１０〜１２℃）し、上清画分を
分取し、酢酸ナトリウムを０.３Ｍとなるように添加し
た後、２倍量のエタノールをゆつくりと加えた。水層と
エタノール層の間に存在するＤＮＡをガラス棒でまきと
り、７０％エタノールで洗浄した後、風乾した。得られ
たＤＮＡに１０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７.５）−１ｍ
Ｍ ＥＤＴＡ・２Ｎａ溶液５mlを加え、４℃で一晩静置
し、以後の実験に用いた。

【００５１】（Ｂ）組換え体の創製 上記（Ａ）項で得たブレビバクテリウム・フラバムＭＪ
−２３３の全ＤＮＡ溶液の９０μｌを制限酵素Ｓau３Ａ
Ｉ １unitを用い、３７℃で２０分間反応させ部分分解
した。この部分分解ＤＮＡにコスミドｐＷＥ１５（スト
ラダジーン社製）を制限酵素ＢａｍＨＩで切断した後、
脱リン酸化処理したものを混合し、５０ｍＭトリス緩衝
液（ｐＨ７.６）、１０ｍＭジチオスレイトール、１ｍ
Ｍ ＡＴＰ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ₂及びＴ４ＤＮＡリガ
ーゼ１unitの各成分を添加し（各成分の濃度は最終濃度
である）、４℃で１５時間反応させ、結合させた。

【００５２】（Ｃ）アスパルターゼをコードする遺伝子
を含むコスミドの選抜上記遺伝子の選抜に用いたアスパ
ルターゼ欠損大腸菌変異株は、エシエリヒア・コリＫ−
１２ＪＲＧ１１１４（ａｓｐＡ２３）である［（）内は
アスパルターゼ遺伝子型（Genotype)を示す、またこの
菌株の詳細および取得方法については、Journal of Gen
eral Microbiology, １３０，１２７１−１２７８（１
９８４）参照］。

【００５３】上記（Ｂ）項で得たコスミド混液を用い、
前記エシェリヒア・コリＪＲＧ１１７４株を形質導入
し、アンピシリン５０mgを含む選択培地［Ｋ₂ＨＰＯ₄
７ｇ、ＫＨ₂ＰＯ₄ ２ｇ、（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄ １ｇ、Ｍｇ
ＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ ０.１ｇ、Ｌ−グルタミン酸ナトリウム
塩３０ｍＭ及び寒天１６ｇを蒸留水１１に溶解］に塗沫
した。なお形質導入には、宝酒造より販売されているλ
ＤＮＡ in vitro Packaging Kitを用いて行った。培地
上の生育株を常法により、液体培養し、培養液よりコス
ミドＤＮＡを抽出し、該コスミドを制限酵素により切断
し、アガロースゲル電気泳動を用いて調べたところ、コ
スミドｐＷＥ１５の長さ８.８ｋｂのＤＮＡ断片に加
え、長さ約３０ｋｂのＤＮＡ断片が認められた。本コス
ミドをｐＷＥ１５−Ａｓｐと命名した。

【００５４】（Ｄ）アスパルターゼをコードする遺伝子
を含むＤＮＡ断片（Ａ、断片）のプラスミドｐＨＳＧ３
９９へのサブクローニング 上記（Ｃ）項で得たコスミドｐＷＥ１５−Ａｓｐに含ま
れるＤＮＡ挿入断片は約３０ｋｂと大きく、実用的でな
いので、得られた断片のうち必要な部分だけに小型化す
るために、プラスミドｐＨＳＧ３９９（宝酒造より市
販）へアスパルターゼをコードする遺伝子を含むＤＮＡ
断片を下記のとおりサブクローニングした。

【００５５】上記（Ｃ）項で得たコスミドｐＷＥ１５−
Ａｓｐを制限酵素ＥｃｏＲＩで切断したものと、プラス
ミドｐＨＳＧ３９９を制限酵素ＥｃｏＲＩで切断したも
のを混合し、５０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７.６）、１
０ｍＭジチオスレイトール、１ｍＭ ＡＴＰ、１０ｍＭ
ＭｇＣｌ₂及びＴ₄ＤＮＡリガーゼ１unitの各成分を添加
し（各成分の濃度は最終濃度である）、１２℃で１５時
間反応させ、結合させた。

【００５６】得られたプラスミド混液を用い、塩化カル
シウム法(Journal of Molecular Biology, ５３，１５
９，１９７０）によりエシエリヒア・コリＫ−１２ＪＲ
Ｇ１１１４（ａｓｐＡ２３）株を形質転換し、クロラム
フェニコール５０ｍｇを含む選択培地［Ｋ₂ＨＰＯ₄ ７
ｇ、ＫＨ₂ＰＯ₄ ２ｇ、（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄ １ｇ、ＭｇＳ
Ｏ₄・７Ｈ₂Ｏ ０.１ｇ、Ｌ−グルタミン酸ナトリウム３
０ｍＭ及び寒天１６ｇを蒸留水１ｌに溶解］に塗沫し
た。

【００５７】この培地上の生育株を常法により液体培養
し、培養液よりプラスミドＤＮＡを抽出し、該プラスミ
ドを制限酵素により切断し、アガロースゲル電気泳動を
用いて調べたところ、プラスミドｐＨＳＧ３９９の長さ
２.２ｋｂのＤＮＡ断片に加え、長さ約２.４ｋｂの挿入
ＤＮＡ断片が認められた。各種の制限で切断したとき
の、長さ約２.４ｋｂのＤＮＡ断片の制限酵素認識部位
数および切断断片の大きさは前記表１に示したとおりで
あった。このＤＮＡ断片の制限酵素切断点地図を図１に
示す。

【００５８】また上記で得たプラスミドを各種制限酵素
で切断して、切断断片の大きさを測定した。その結果を
下記の表２に示す。

【００５９】

【表２】 表 ２ プラスミドｐＨＳＧ３９９‐Ａｓｐ 制限酵素 認識部位数 切断断片の大きさ（ｋｂ) ＡｖａＩ ２ ３.６、 １.０ ＣｌａＩ １ ４.６ ＥｃｏＲＩ ２ ２.４、 ２.２ 上記の制限酵素により特徴づけられるプラスミドをｐＨ
ＳＧ３９９‐Ａｓｐと命名した。

【００６０】以上により、アスパルターゼをコードする
遺伝子を含む大きさが約２.４ｋｂのＤＮＡ断片（Ｅｃ
ｏＲＩ断片）を得ることができた。

【００６１】実施例２アスパルターゼをコードする遺伝子の塩基配列の決定 実施例１の（Ｄ）項で得られたアスパルターゼをコード
する遺伝子を含む長さが約２.４ｋｂのＤＮＡ断片につ
いて、その塩基配列をプラスミドｐＵＣ１８またはｐＵ
Ｃ１９を用いるジデオキシヌクレオチド酵素法（dideox
y chain termination法)(Ｓanger，Ｆ．et al.，Ｐro
c．Ｎat．Ａcad．Ｓci．ＵＳＡ７４、５４６３、１９７
７）により図２に示した戦略図に従って決定した。その
塩基配列中のオープンリーデングフレームの存在から、
アスパルターゼをコードする遺伝子は、後記配列表に示
した塩基配列を有する５２６のアミノ酸をコードする１
５７８の塩基対より構成されていることが判明した。

【００６２】実施例３ コリネ型細菌内で複製し安定なプラスミドベクターｐＣ
ＲＹ３０の作成 （Ａ）プラスミドｐＢＹ５０３の調製 プラスミドｐＢＹ５０３は、ブレビバクテリウム・スタ
チオニスＩＦＯ１２１４４（ＦＥＲＭ ＢＰ‐２５１
５）から分離された分子量約１０メガダルトンのプラス
ミドであり、特開平１‐９５７８５号公報に記載のよう
にして調製した。半合成培地Ａ培地［尿素２ｇ、（ＮＨ
₄)₂ＳＯ₄ ７ｇ、Ｋ₂ＨＰＯ₄ ０.５ｇ、ＫＨ₂ＰＯ₄ ０.
５ｇ、ＭｇＳＯ₄ ０.５ｇ、ＦｅＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ ６ｍ
ｇ、ＭｎＳＯ₄・４〜６Ｈ₂Ｏ ６ｍｇ、酵母エキス２.５
ｇ、カザミノ酸５ｇ、ビチオン２００μｇ、塩酸チアミ
ン２００μｇ、グルコース２０ｇ及び蒸留水１ｌ］１ｌ
に、ブレビバクテリウム・スタアチオニスＩＦＯ１２１
４４を対数増殖期後期まで培養し、菌体を集めた。得ら
れた菌体を１０ｍｇ／ｍｌの濃度にリゾチームを含む緩
衝液［２５ｍＭトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタ
ン、１０ｍＭのＥＤＴＡ、５０ｍＭグルコース］２０ｍ
ｌに懸濁し、３７℃で１時間反応させた。反応液にアル
カリ‐ＳＤＳ液［０.２Ｎ ＮａＯＨ、１％（ｗ／ｖ）
ＳＤＳ］４０ｍｌを添加し、緩やかに混和して室温にて
１５分間静置した。次に、この反応液に酢酸カリウム溶
液［５Ｍ酢酸カリウム‐溶液６０ｍｌ、酢酸１１.５ｍ
ｌ、蒸留水２８.５ｍｌの混合液］３０ｍｌを添加し、
充分混和してから氷水中に１５分間静置した。

【００６３】溶菌物全量を遠心管に移し、４℃で１０分
間、１５,０００×ｇの遠心分離にかけ、上澄液を得
た。

【００６４】これに等量のフェノール‐クロロホルム液
（フェノール：クロロホルム＝１：１混和液）を加え懸
濁した後、遠心管に移し、室温下で５分間１５,０００
×ｇの遠心分離にかけ、水層を回収した。水層に２倍量
のエタノールを加え、−２０℃で１時間静置後、４℃で
１０分間、１５,０００×ｇの遠心分離にかけ、沈殿を
回収した。

【００６５】沈殿を減圧乾燥後、ＴＥ緩衝液［トリス１
０ｍＭ、ＥＤＴＡ １ｍＭ；ＨＣｌにてｐＨ８.０に調
整］２ｍｌに溶解した。溶解液に塩化セシウム溶液［５
倍濃度のＴＥ緩衝液１００ｍｌに塩化セシウム１７０ｇ
を溶解させた液］１５ｍｌと１０ｍｇ／ｍｌエチジウム
ブロマイド溶液１ｍｌを加えて、密度を１.３９２ｇ／
ｍｌに合わせた。この溶液を１２℃で４２時間、１１
６,０００×ｇの遠心分離を行った。

【００６６】プラスミドｐＢＹ５０３は紫外線照射によ
り遠心管内で下方のバンドとして見い出される。このバ
ンドを注射器で遠心管の側面から抜きとることにより、
プラスミドｐＢＹ５０３を含む分画液を得た。

【００６７】次いでこの分画液を等量のイソアミルアル
コールで４回処理してエチジウムブロマイドを抽出除去
し、その後にＴＥ緩衝液に体して透析を行った。このよ
うにして得られたブラスミドｐＢＹ５０３を含む透析液
に３Ｍ酢酸ナトリウム溶液を最終濃度３０ｍＭに添加し
た後、２倍量エタノールを加え、−２０℃１時間静置し
た。この溶液を１５,０００×ｇの遠心分離にかけてＤ
ＮＡを沈降させ、プラスミドｐＢＹ５０３を５０μｇ得
た。

【００６８】（Ｂ）プラスミドベクター‐ｐＣＲＹ３０
の作成 プラスミドｐＨＳＧ２９８（宝酒造製）０.５μｇに制
限酵素Ｓａ１Ｉ（５units）を３７℃１時間反応させ、
プラスミドＤＮＡを完全に分解した。

【００６９】前記（Ａ）項で調製したプラスミドｐＢＹ
５０３の２μｇに制限酵素ＸｈｏＩ（１unit）を３７℃
で３０分間反応させ、プラスミドＤＮＡを部分分解し
た。

【００７０】両者のプラスミドＤＮＡ分解物を混合し、
制限酵素を不活性化するために６５℃で１０分間加熱処
理した後、該失活溶液中の成分が最終濃度として各々５
０ｍＭトリス緩衝液ｐＨ７.６、１０ｍＭ ＭｇＣｌ₂、
１０ｍＭジチオスレイトール、１ｍＭ ＡＴＰ及びＴ４
ＤＮＡリガーゼ１unitになるように各成分を強化し、１
６℃で１５時間保温した。この溶液を用いてエシェリヒ
ア・コリＪＭ１０９コンピテントセル（宝酒造）を形質
転換した。

【００７１】形質転換株は３０μｇ／ｍｌ（最終濃度）
のカナマイシン、１００μｇ／ｍｌ（最終濃度）のＩＰ
ＴＧ（イソイプロピル‐β‐Ｄ‐チオガラクトピラノシ
ド）１００μｇ／ｍｌ（最終濃度）のＸ‐ｇａｌ（５‐
ブロモ‐４‐クロロ‐３‐インドリル‐β‐‐ガラクト
ピラノシド）を含むＬ培地（トリプトン１０ｇ、酵母エ
キス５ｇ、ＮａＣｌ ５ｇ及び純水１ｌ、ｐＨ７.２）
で３７℃にて２４時間培養し、生育株として得られた。
これらの生育株のうち、白いコロニーで生育してきたも
のを選択し、各々プラスミドをアルカリ‐ＳＤＳ法
［Ｔ．ＭaniatisＥ．Ｆ．Ｆritsch，Ｊ．Ｓambrook，
“Ｍolecular cloning”（１９８２）ｐ９０〜９１参
照］により抽出した。

【００７２】その結果、プラスミドｐＨＳＧ２９８のＳ
ａｌＩ部位にプラスミドｐＢＹ５０３由来の約４.０ｋ
ｂの断片が挿入されたプラスミドｐＨＳＧ２９８‐ｏｒ
ｉが得られた。

【００７３】次に同様の方法を用い、前記（Ａ）項で得
られたプラスミドｐＢＹ５０３ＤＮＡを制限酵素Ｋｐｎ
Ｉ及びＥｃｏＲＩにて処理して得られる約２.１ｋｂの
ＤＮＡ断片を上記プラスミドｐＨＳＧ２９８‐ｏｒｉの
ＫｐｎＩ及びＥｃｉＲＩ部位にクローニングし、プラス
ミドベクター‐ｐＣＲＹ３０を調製した。

【００７４】実施例４ プラスミドｐＣＲＹ３０‐ＡｓｐＢの作成及びコリネ型
細菌への導入 実施例１の（Ｄ）項で得られたプラスミドｐＨＳＧ３９
９‐Ａｓｐ５μｇを制限酵素ＥｃｏＲＩを５unit用い、
３７℃で１時間反応させ分解したものと、実施例３の
（Ｂ）項で得られたプラスミドｐＣＲＹ３０１μｇを制
限酵素ＥｃｏＲＩ１unitを用い、３７℃で１時間反応さ
せ分解したものを混合し、５０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ
７.６）、１０ｍＭジチオスレイトール、１ｍＭ ＡＴ
Ｐ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ₂およびＴ４ ＤＮＡリガーゼ
１unitの各成分を添加し(各成分の濃度は最終濃度であ
る)、１２℃で１５時間反応させ結合させた。このプラ
スミドを用いて、前記方法に従いエシェリヒア・コリＫ
‐１２ＪＲＧ１１１４（ａｓｐＡ₂₃）株を形質転換し、
カナマイシン５０μｇ／ｍｌを含む選択培地［Ｋ₂ＨＰ
Ｏ₄ ７ｇ、ＫＨ₂ＰＯ₄ ２ｇ、（ＮＨ₄)₂ＳＯ₄ １ｇ、Ｍ
ｇＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ １ｇ、Ｌ‐グルタミン酸＋ナトリウ
ム３０ｍＭ及び寒天１６ｇを蒸留水１ｌに溶解］に塗抹
した。

【００７５】この培地上の生育株を常法により液体培養
し、培養液よりプラスミドＤＮＡを抽出し、該プラスミ
ドを制限酵素により切断し、アガロ−スゲル電気泳動を
用いて調べたところ、プラスミドｐＣＲＹ３０の長さ
８.６ｋｂのＤＮＡ断片に加え、大きさ２.４ｋｂの挿入
ＤＮＡ断片が認められた。

【００７６】上記の如く調製されたプラスミドＤＮＡ
を、コリネ型細菌へ形質転換した。

【００７７】形質転換は、電気パルス法を用いて次のと
おり行った。

【００７８】ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３
３（ＦＥＲＭ ＢＰ−１４９７）プラスミドｐＢＹ５０
２除去株を１００ｍｌの前記Ａ培地で対数増殖初期まで
培養し、ペニシリンＧを１ユニット／ｍｌになるように
添加して、さらに２時間振盪培養し、遠心分離により菌
体を集め、菌体を２０ｍｌのパルス用溶液（２７２ｍＭ
Ｓucrose、７ｍＭ ＫＨ₂ＰＯ₄、１ｍＭ ＭgＣl₂；ｐ
Ｈ７.４）にて洗浄した。さらに菌体を遠心分離して集
め、５ｍｌのパルス用溶液に懸濁し、０.７５ｍｌの細
胞と、前記で得られたプラスミドＤＮＡ溶液５０μｌと
を混合し、水中にて２０分間静置した。ジーンパルサー
（バイオラド社製）を用いて、２５００ボルト、２５μ
ＦＤに設定し、パルスを印加後氷中に２０分間静置し
た。全量を３ｍｌの前記Ａ培地に移し３０℃にて１時間
培養後、カナマイシン１５μｇ／ｍｌ（最終濃度）を含
む前記Ａ寒天培地に植菌し３０℃で２〜３日間培養し
た。出現したカナマイシン耐性株より、前記実施例３
（Ａ）項に記載の方法を用いてプラスミドを得た。この
プラスミドを各種制限酵素で切断して、切断断片の大き
さを測定した。その結果を下記の表３に示す。

【００７９】

【表３】 表３ プラスミドｐＣＲＹ３０−ＡspＢ 制限酵素 認識部位数 切断断片の大きさ(kb) ＥcoＲＩ ２ ８.６、２.４ ＢamＨ１ １ １１.０ 上記制限酵素により特徴づけられるプラスミドをｐＣＲ
Ｙ３０−ＡspＢと命名した。このプラスミドｐＣＲＹ３
０−ＡspＢの制限酵素地図を図３に示す。

【００８０】なお、プラスミドｐＣＲＹ３０−ＡspＢに
より形質転換されたブレビバクテリウム・フラバムＭＪ
−２３３−ＡspＢにより形質転換されたブレビバクテリ
ウム・フラバムＭＪ−２３３−ＡspＢは、茨城県つくば
市東１丁目１番３号の工業技術院微生物工業技術研究所
に、平成３年５月９日付で：微工研寄第１２２２８号
（ＦＥＲＭ Ｐ−１２２２８）として寄託されている。

【００８１】実施例５ プラスミドｐＣＲＹ３０−ＡspＢの安定性 前記のＡ培地１００ｍｌを５００ｍｌ容三角フラスコに
分注し、１２０℃で１５分間滅菌処理したものに、実施
例４で得た形質転換株ブレビバクテリウム・フラバムＭ
Ｊ−２３３−ＡspＢを植菌し、３０℃にて２４時間振盪
培養を行った後、同様にして調製したＡ培地１００ｍｌ
を５００ｍｌ容三角フラスコに分注し、１２０℃で１５
分間滅菌したものに、１ｍｌ当り５０cellsの割合にな
るように植継し、同じく３０℃にて２４時間振盪培養を
行った。次に遠心分離して集菌し、菌体を洗浄後、カナ
マイシンを１５μｇ／ｍｌの割合で添加したＡ培地及び
無添加のＡ培地を用いて調製した平板培地に一定量塗沫
し、３０℃にて１日培養後生育コロニーをカウントし
た。

【００８２】この結果、カナマイシン添加および無添加
培地に生育したコロニーは同数であること、さらにＡ培
地生育コロニーは全てカナマイシン添加培地に生育する
こと、すなわち該プラスミドの高度の安定性を確認し
た。

【００８３】実施例６ Ｌ−アスパラギン酸の生産 前記Ａ培地１００ｍｌを５００ｍｌ容三角フラスコに分
注し、滅菌（滅菌後ｐＨ７.０）した後、ブレビバクテ
リウム・フラバム（Ｂrevibacterium fravum）ＭＪ−２
３３−ＡspＢを植菌し、無菌的にグルコースを５ｇ／ｌ
の濃度になるように加え、３３℃にて２日間振盪培養を
行った。

【００８４】次に、本培養培地（グルコース５％、硫酸
アンモニウム２.３％、ＫＨ₂ＰＯ₄０.０５％、Ｋ₂ＨＰ
Ｏ₄０.０５％、ＭｇＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ０.０５％、ＦｅＳ
Ｏ₄・７Ｈ₂Ｏ２０ｐｐｍ、ＭｎＳＯ₄・ｎＨ₂Ｏ２０ｐｐ
ｍ、ビチオン２００μｇ／ｌ、チアミン・ＨＣｌ １０
０μｇ／ｌ、カザミノ酸０.３％、酵母エキス０.３％）
の１０００ｍｌを２ ｌ容通気撹拌槽に仕込み、滅菌
（１２０℃、２０分間）後、前記培養物の２０ｍｌを添
加して、回転数１０００ｒｐｍ、通気量１ｖｖｍ、温度
３３℃、ｐＨ７.６にて２４時間培養を行った。

【００８５】培養終了後、これらの培養液を遠心分離
（４０００ｒｐｍ、１５分間）したのち集菌体を蒸留水
に懸濁し、Ｏ.Ｄ.（光学密度、波長６１０ｎｍでの吸光
度）値５０の菌体懸濁液を調製し、該菌体懸濁液を供試
液とした。

【００８６】Ｌ−アスパラギン酸の生成は、下記表４に
示す反応液の５０ｍｌにて４５℃５時間反応を行い該反
応終了液を遠心分離（４０００ｒｐｍ、１５分間）し、
その上清液中のアスパラギン酸生成量をロイコノストッ
ク・メセンテロイデスＡＴＣＣ８０４２による微生物定
量法により生成アスパラギン酸量を求めた。

【００８７】その結果をＦＥＲＭ ＢＰ−１４９７株に
よる生成量を１とする相対値として表５に示す。

【００８８】

【表４】 表 ４ フマル酸 ５ｇ ＭｇＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ ０.１ｇ ポリオキシエチレン（２０）ソルビタン モノラウレート ０.０５ｍｌ アンモニア（２８％濃度） １４ｍｌ 供試液 １０ｍｌ 全 量 ５０ｍｌ（ｐＨ９.４）

【００８９】

【表５】 表５に示した結果から明らかなように、本発明の微生物
を用いることにより、フマル酸又はその塩とアンモニア
又はアンモニウム塩から効率よくＬ−アスパラギン酸を
生成せしめることができた。

【００９０】

【発明の効果】本発明の新規な遺伝子ＤＮＡは、コリネ
型細菌由来のアスパルターゼをコードする遺伝子ＤＮＡ
であり、該遺伝子ＤＮＡを含む本発明のプラスミドを導
入したコリネ型細菌を用い、効率的にフマル酸とアンモ
ニアからＬ−アスパラギン酸を製造することが可能とな
る。

【００９１】

【配列表】配列番号：1 配列の長さ：1581 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA 起源 生物名：ブレビバクテリウム フラバム 株名：MJ-233 配列の特徴 特徴を表す記号：peptide 存在位置：1-1581 特徴を決定した方法：P 配列 ATG TCT AAG ACG AGC AAC AAG TCT TCA GCA GAC TCA AAG AAT GAC GCA 48 Met Ser Lys Thr Ser Asn Lys Ser Ser Ala Asp Ser Lys Asn Asp Ala 1 5 10 15 AAA GCC GAA GAC ATT GTG AAC GGC GAG AAC CAA ATC GCC ACG AAT GAG 96 Lys Ala Glu Asp Ile Val Asn Gly Glu Asn Gln Ile Ala Thr Asn Glu 20 25 30 TCG CAG TCT TCA GAC AGC GCT GCA GTT TCG GAA CGT GTC GTC GAA CCA 144 Ser Gln Ser Ser Asp Ser Ala Ala Val Ser Glu Arg Val Val Glu Pro 35 40 45 AAA ACC ACG GTT CAG AAA AAG TTC CGA ATC GAA TCG GAT CTG CTT GGT 192 Lys Thr Thr Val Gln Lys Lys Phe Arg Ile Glu Ser Asp Leu Leu Gly 50 55 60 GAA CTT CAG ATC CCA TCC CAC GCA TAT TAC GGC GTG CAC ACC CTT CGT 240 Glu Leu Gln Ile Pro Ser His Ala Tyr Tyr Gly Val His Thr Leu Arg 65 70 75 80 GCG GTG GAC AAC TTC CAA ATC TCA CGA ACC ACC ATC AAC CAC GTC CCA 288 Ala Val Asp Asn Phe Gln Ile Ser Arg Thr Thr Ile Asn His Val Pro 85 90 95 GAT TTC ATT CGC GGC ATG GTC CAG GTG AAA AAG GCC GCA GCT TTA GCA 336 Asp Phe Ile Arg Gly Met Val Gln Val Lys Lys Ala Ala Ala Leu Ala 100 105 110 AAC CGC CGA CTA CAC ACA CTT CCA GCA CAA AAA GCA GAA GCA ATT GTC 384 Asn Arg Arg Leu His Thr Leu Pro Ala Gln Lys Ala Glu Ala Ile Val 115 120 125 TGG GCT TGT GAT CAG ATC CTC ATT GAG GGA CGC TGT ATG GAT CAG TTC 432 Trp Ala Cys Asp Gln Ile Leu Ile Glu Gly Arg Cys Met Asp Gln Phe 130 135 140 CCC ATC GAT GTG TTC CAG GGT GGC GCA GGT ACC TCA CTG AAC ATG AAC 480 Pro Ile Asp Val Phe Gln Gly Gly Ala Gly Thr Ser Leu Asn Met Asn 145 150 155 160 ACC AAC GAA GTT GTT GCC AAC CTT GCA CTT GAG TTC TTA GGC CAT GAA 528 Thr Asn Glu Val Val Ala Asn Leu Ala Leu Glu Phe Leu Gly His Glu 165 170 175 AAG GGC GAG TAC CAC ATC CTG CAC CCC ATG GAT GAT GTG AAC ATG TCC 576 Lys Gly Glu Tyr His Ile Leu His Pro Met Asp Asp Val Asn Met Ser 180 185 190 CAG TCC ACC AAC GAT TCC TAC CCA ACT GGT TTC CGC CTG GGC ATT TAC 624 Gln Ser Thr Asn Asp Ser Tyr Pro Thr Gly Phe Arg Leu Gly Ile Tyr 195 200 205 GCT GGA CTG CAG ACC CTC ATC GCT GAA ATT GAT GAG CTT CAG GTT GCG 672 Ala Gly Leu Gln Thr Leu Ile Ala Glu Ile Asp Glu Leu Gln Val Ala 210 215 220 TTC CGC CAC AAG GGC AAT GAG TTT GTC GAC ATC ATC AAG ATG GGC CGC 720 Phe Arg His Lys Gly Asn Glu Phe Val Asp Ile Ile Lys Met Gly Arg 225 230 235 240 ACC CAG TTG CAG GAT GCT GTT CCC ATG AGC TTG GGC GAA GAG TTC CGA 768 Thr Gln Leu Gln Asp Ala Val Pro Met Ser Leu Gly Glu Glu Phe Arg 245 250 255 GCA TTC GCG CAC AAC CTC GCA GAA GAG CAG ACC GTG CTG CGT GAA GCT 816 Ala Phe Ala His Asn Leu Ala Glu Glu Gln Thr Val Leu Arg Glu Ala 260 265 270 GCC AAC CGT CTC CTC GAG GTC AAC CTT GGT GCA ACC GCA ATC GGT ACT 864 Ala Asn Arg Leu Leu Glu Val Asn Leu Gly Ala Thr Ala Ile Gly Thr 275 280 285 GGT GTG AAC ACT CCA GCA GGC TAC CGC CAC CAG GTT GTC GCT GCT CTG 912 Gly Val Asn Thr Pro Ala Gly Tyr Arg His Gln Val Val Ala Ala Leu 290 295 300 TCT GAG GTC ACC GGA CTG GAA CTA AAG TCC GCA CGT GAT CTC ATT GAG 960 Ser Glu Val Thr Gly Leu Glu Leu Lys Ser Ala Arg Asp Leu Ile Glu 305 310 315 320 GCT ACC TCT GAC ACC GGT GCA TAT GTT CAT GCG CAC TCC GCA ATC AAG 1008 Ala Thr Ser Asp Thr Gly Ala Tyr Val His Ala His Ser Ala Ile Lys 325 330 335 CGT GCA GCC ATG AAA CTG TCC AAG ATC TGT AAC GAT CTA CGT CTG CTG 1056 Arg Ala Ala Met Lys Leu Ser Lys Ile Cys Asn Asp Leu Arg Leu Leu 340 345 350 TCT TCT GGT CCT CGT GCT GGC TTG AAC GAA ATC AAT CTG CCA CCA CGC 1104 Ser Ser Gly Pro Arg Ala Gly Leu Asn Glu Ile Asn Leu Pro Pro Arg 355 360 365 CAG GCT GGT TCC TCC ATC ATG CCA GCC AAG GTC AAC CCA GTG ATC CCA 1152 Gln Ala Gly Ser Ser Ile Met Pro Ala Lys Val Asn Pro Val Ile Pro 370 375 380 GAA GTG GTC AAC CAG GTC TGC TTC AAG GTC TTC GGT AAC GAT CTC ACC 1200 Glu Val Val Asn Gln Val Cys Phe Lys Val Phe Gly Asn Asp Leu Thr 385 390 395 400 GTC ACC ATG GCT GCG GAA GCT GGC CAG TTG CAG CTC AAC GTC ATG GAG 1248 Val Thr Met Ala Ala Glu Ala Gly Gln Leu Gln Leu Asn Val Met Glu 405 410 415 CCA GTC ATT GGC GAA TCC CTC TTC CAG TCA CTG CGC ATC CTG GGC AAT 1296 Pro Val Ile Gly Glu Ser Leu Phe Gln Ser Leu Arg Ile Leu Gly Asn 420 425 430 GCA GCC AAG ACT TTG CGT GAG AAG TGC GTC GTA GGA ATC ACC GCC AAC 1344 Ala Ala Lys Thr Leu Arg Glu Lys Cys Val Val Gly Ile Thr Ala Asn 435 440 445 GCT GAT GTT TGC CGT GCT TAC GTT GAT AAC TCC ATT GGC ATT ATC ACT 1392 Ala Asp Val Cys Arg Ala Tyr Val Asp Asn Ser Ile Gly Ile Ile Thr 450 455 460 TAC CTG AAC CCA TTC CTG GGC CAC GAC ATT GGA GAT CAG ATC GGT AAG 1440 Tyr Leu Asn Pro Phe Leu Gly His Asp Ile Gly Asp Gln Ile Gly Lys 465 470 475 480 GAA GCA GCC GAA ACT GGT CGA CCA GTG CGT GAA CTC ATC CTG GAA AAG 1488 Glu Ala Ala Glu Thr Gly Arg Pro Val Arg Glu Leu Ile Leu Glu Lys 485 490 495 AAG CTC ATG GAT GAA AAG ACG CTC GAG GCA GTC CTA TCC AAG GAG AAC 1536 Lys Leu Met Asp Glu Lys Thr Leu Glu Ala Val Leu Ser Lys Glu Asn 500 505 510 CTC ATG CAC CCA ATG TTC CGC GGA AGG CTC TAC TTG GAG AAC TAA 1581 Leu Met His Pro Met Phe Arg Gly Arg Leu Tyr Leu Glu Asn 515 520 525

【図面の簡単な説明】

【図１】 本発明のアスパルターゼをコードする遺伝子
を含むＤＮＡ断片の制限酵素による切断点地図。

【図２】 大きさが約２.４ｋｂの本発明ＤＮＡ断片の
塩基配列決定のための戦略図。

【図３】 本発明のプラスミドｐＣＲＹ３０−ＡspＢの
制限酵素切断点地図。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 (Ｃ１２Ｎ 15/60 Ｃ１２Ｒ 1:13） (Ｃ１２Ｎ 1/20 Ｃ１２Ｒ 1:13） (Ｃ１２Ｐ 13/20 Ｃ１２Ｒ 1:13） (72)発明者 湯川 英明 茨城県稲敷郡阿見町中央８丁目３番１号三 菱油化株式会社筑波総合研究所内

Claims (8)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 コリネ型細菌由来のアスパルターゼ（Ｅ
   Ｃ.４.３.１.１）をコードする遺伝子ＤＮＡ。
2. 【請求項２】 コリネ型細菌がブレビバクテリウム・フ
   ラバム（Ｂrevibacterium flavum）ＭＪ−２３３である
   請求項１記載の遺伝子ＤＮＡ。
3. 【請求項３】 次のＤＮＡ塩基配列で表されるアスパル
   ターゼを（ＥＣ.４.３.１.１）コードする遺伝子ＤＮ
   Ａ。 ATGTCTAAGA CGAGCAACAA GTCTTCAGCA GACTCAAAGA ATGACGCAAA AGCCGAAGAC 60 ATTGTGAACG GCGAGAACCA AATCGCCACG AATGAGTCGC AGTCTTCAGA CAGCGCTGCA 120 GTTTCGGAAC GTGTCGTCGA ACCAAAAACC ACGGTTCAGA AAAAGTTCCG AATCGAATCG 180 GATCTGCTTG GTGAACTTCA GATCCCATCC CACGCATATT ACGGCGTGCA CACCCTTCGT 240 GCGGTGGACA ACTTCCAAAT CTCACGAACC ACCATCAACC ACGTCCCAGA TTTCATTCGC 300 GGCATGGTCC AGGTGAAAAA GGCCGCAGCT TTAGCAAACC GCCGACTACA CACACTTCCA 360 GCACAAAAAG CAGAAGCAAT TGTCTGGGCT TGTGATCAGA TCCTCATTGA GGGACGCTGT 420 ATGGATCAGT TCCCCATCGA TGTGTTCCAG GGTGGCGCAG GTACCTCACT GAACATGAAC 480 ACCAACGAAG TTGTTGCCAA CCTTGCACTT GAGTTCTTAG GCCATGAAAA GGGCGAGTAC 540 CACATCCTGC ACCCCATGGA TGATGTGAAC ATGTCCCAGT CCACCAACGA TTCCTACCCA 600 ACTGGTTTCC GCCTGGGCAT TTACGCTGGA CTGCAGACCC TCATCGCTGA AATTGATGAG 660 CTTCAGGTTG CGTTCCGCCA CAAGGGCAAT GAGTTTGTCG ACATCATCAA GATGGGCCGC 720 ACCCAGTTGC AGGATGCTGT TCCCATGAGC TTGGGCGAAG AGTTCCGAGC ATTCGCGCAC 780 AACCTCGCAG AAGAGCAGAC CGTGCTGCGT GAAGCTGCCA ACCGTCTCCT CGAGGTCAAC 840 CTTGGTGCAA CCGCAATCGG TACTGGTGTG AACACTCCAG CAGGCTACCG CCACCAGGTT 900 GTCGCTGCTC TGTCTGAGGT CACCGGACTG GAACTAAAGT CCGCACGTGA TCTCATTGAG 960 GCTACCTCTG ACACCGGTGC ATATGTTCAT GCGCACTCCG CAATCAAGCG TGCAGCCATG 1120 AAACTGTCCA AGATCTGTAA CGATCTACGT CTGCTGTCTT CTGGTCCTCG TGCTGGCTTG 1180 AACGAAATCA ATCTGCCACC ACGCCAGGCT GGTTCCTCCA TCATGCCAGC CAAGGTCAAC 1240 CCAGTGATCC CAGAAGTGGT CAACCAGGTC TGCTTCAAGG TCTTCGGTAA CGATCTCACC 1300 GTCACCATGG CTGCGGAAGC TGGCCAGTTG CAGCTCAACG TCATGGAGCC AGTCATTGGC 1360 GAATCCCTCT TCCAGTCACT GCGCATCCTG GGCAATGCAG CCAAGACTTT GCGTGAGAAG 1420 TGCGTCGTAG GAATCACCGC CAACGCTGAT GTTTGCCGTG CTTACGTTGA TAACTCCATT 1480 GGCATTATCA CTTACCTGAA CCCATTCCTG GGCCACGACA TTGGAGATCA GATCGGTAAG 1540 GAAGCAGCCG AAACTGGTCG ACCAGTGCGT GAACTCATCC TGGAAAAGAA GCTCATGGAT 1600 GAAAAGACGC TCGAGGCAGT CCTATCCAAG GAGAACCTCA TGCACCCAAT GTTCCGCGGA 1660 AGGCTCTACT TGGAGAACTA A 1681 //
4. 【請求項４】 次のアミノ酸配列で表されるアスパルタ
   ーゼを（ＥＣ.４.３.１.１）コードする遺伝子ＤＮＡ。 Met Ser Lys Thr Ser Asn Lys Ser Ser Ala Asp Ser Lys Asn Asp Ala 1 5 10 15 Lys Ala Glu Asp Ile Val Asn Gly Glu Asn Gln Ile Ala Thr Asn Glu 20 25 30 Ser Gln Ser Ser Asp Ser Ala Ala Val Ser Glu Arg Val Val Glu Pro 35 40 45 Lys Thr Thr Val Gln Lys Lys Phe Arg Ile Glu Ser Asp Leu Leu Gly 50 55 60 Glu Leu Gln Ile Pro Ser His Ala Tyr Tyr Gly Val His Thr Leu Arg 65 70 75 80 Ala Val Asp Asn Phe Gln Ile Ser Arg Thr Thr Ile Asn His Val Pro 85 90 95 Asp Phe Ile Arg Gly Met Val Gln Val Lys Lys Ala Ala Ala Leu Ala 100 105 110 Asn Arg Arg Leu His Thr Leu Pro Ala Gln Lys Ala Glu Ala Ile Val 115 120 125 Trp Ala Cys Asp Gln Ile Leu Ile Glu Gly Arg Cys Met Asp Gln Phe 130 135 140 Pro Ile Asp Val Phe Gln Gly Gly Ala Gly Thr Ser Leu Asn Met Asn 145 150 155 160 Thr Asn Glu Val Val Ala Asn Leu Ala Leu Glu Phe Leu Gly His Glu 165 170 175 Lys Gly Glu Tyr His Ile Leu His Pro Met Asp Asp Val Asn Met Ser 180 185 190 Gln Ser Thr Asn Asp Ser Tyr Pro Thr Gly Phe Arg Leu Gly Ile Tyr 195 200 205 Ala Gly Leu Gln Thr Leu Ile Ala Glu Ile Asp Glu Leu Gln Val Ala 210 215 220 Phe Arg His Lys Gly Asn Glu Phe Val Asp Ile Ile Lys Met Gly Arg 225 230 235 240 Thr Gln Leu Gln Asp Ala Val Pro Met Ser Leu Gly Glu Glu Phe Arg 245 250 255 Ala Phe Ala His Asn Leu Ala Glu Glu Gln Thr Val Leu Arg Glu Ala 260 265 270 Ala Asn Arg Leu Leu Glu Val Asn Leu Gly Ala Thr Ala Ile Gly Thr 275 280 285 Gly Val Asn Thr Pro Ala Gly Tyr Arg His Gln Val Val Ala Ala Leu 290 295 300 Ser Glu Val Thr Gly Leu Glu Leu Lys Ser Ala Arg Asp Leu Ile Glu 305 310 315 320 Ala Thr Ser Asp Thr Gly Ala Tyr Val His Ala His Ser Ala Ile Lys 325 330 335 Arg Ala Ala Met Lys Leu Ser Lys Ile Cys Asn Asp Leu Arg Leu Leu 340 345 350 Ser Ser Gly Pro Arg Ala Gly Leu Asn Glu Ile Asn Leu Pro Pro Arg 355 360 365 Gln Ala Gly Ser Ser Ile Met Pro Ala Lys Val Asn Pro Val Ile Pro 370 375 380 Glu Val Val Asn Gln Val Cys Phe Lys Val Phe Gly Asn Asp Leu Thr 385 390 395 400 Val Thr Met Ala Ala Glu Ala Gly Gln Leu Gln Leu Asn Val Met Glu 405 410 415 Pro Val Ile Gly Glu Ser Leu Phe Gln Ser Leu Arg Ile Leu Gly Asn 420 425 430 Ala Ala Lys Thr Leu Arg Glu Lys Cys Val Val Gly Ile Thr Ala Asn 435 440 445 Ala Asp Val Cys Arg Ala Tyr Val Asp Asn Ser Ile Gly Ile Ile Thr 450 455 460 Tyr Leu Asn Pro Phe Leu Gly His Asp Ile Gly Asp Gln Ile Gly Lys 465 470 475 480 Glu Ala Ala Glu Thr Gly Arg Pro Val Arg Glu Leu Ile Leu Glu Lys 485 490 495 Lys Leu Met Asp Glu Lys Thr Leu Glu Ala Val Leu Ser Lys Glu Asn 500 505 510 Leu Met His Pro Met Phe Arg Gly Arg Leu Tyr Leu Glu Asn 515 520 525
5. 【請求項５】 請求項１〜４のいずれかに記載の遺伝子
   ＤＮＡが導入された組換えプラスミド。
6. 【請求項６】 請求項１〜４のいずれかに記載の遺伝子
   ＤＮＡと、コリネ型細菌内で複製増殖機能を司る遺伝子
   を含むＤＮＡを保有する組換えプラスミド。
7. 【請求項７】 請求項６〜７のいずれかに記載の組換え
   プラスミドで形質転換されたコリネ型細菌。
8. 【請求項８】 請求項７記載のコリネ型細菌の培養菌体
   又は菌体処理物の存在下に、フマール酸またはその塩
   と、アンモニアまたはアンモニウム塩を反応せしめるこ
   とを特徴とするＬ−アスパラギン酸の製造法。