具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述,给出的实施例仅为了阐明本发明,而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南,并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法,如无特殊说明,均为常规方法,按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等,如无特殊说明,均可从商业途径得到。
下述实施例中的谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)YPFV1 CGMCCNo.21260是将谷氨酸棒杆菌ATCC15168进行诱变获得,并已于2020年11月30日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC,地址为:北京市朝阳区北辰西路1号院3号,中国科学院微生物研究所),保藏登记号为CGMCC No.21260。谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)YPFV1,又称为谷氨酸棒杆菌CGMCC No.21260。
实施例1构建aspA基因突变体及其重组菌
1、构建包含点突变的aspA基因编码区片段的重组载体
根据NCBI数据库公布的谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)ATCC14067基因组序列,设计并合成两对扩增aspA基因编码区的引物,以等位基因置换的方式在谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)CGMCC No.21260(经测序确认该菌株染色体上保留有野生型的aspA基因)的aspA基因编码区(SEQ ID No.1)中引入点突变,所述点突变为将aspA基因的核苷酸序列(SEQ ID No.1)中的第124位腺嘌呤(A)突变为胸腺嘧啶(T),得到SEQ ID No.3所示的DNA分子(突变的aspA基因,名称为aspAA124T)。
其中,SEQ ID No.1所示的DNA分子编码氨基酸序列为SEQ ID No.2的蛋白质(所述蛋白质名称为蛋白质aspA)。
SEQ ID No.3所示的DNA分子编码氨基酸序列为SEQ ID No.4的突变蛋白质(所述突变蛋白质名称为aspAT42S)。所述突变蛋白质aspAT42S氨基酸序列(SEQ ID No.4)中的第42位丝氨酸(S)由苏氨酸(T)突变而来。
采用重叠PCR(Overlap PCR)技术进行基因定点突变,引物设计如下(上海invitrogen公司合成),加粗字体的碱基为突变位置:
P1:5'CAGTGCCAAGCTTGCATGCCTGCAGGTCGACTCTAG ATTGCGGTTG CACCAAGGTT 3',
P4:5'CAGCTATGACCATGATTACGAATTCGAGCTCGGTACCC ACGTGGGCTT TCCGCTGAGG 3'。
构建方法:以谷氨酸棒杆菌ATCC14067为模板,分别以引物P1和P2,P3和P4,进行PCR扩增,获得两条分别带有突变碱基,大小分别为783bp和761bp的aspA基因编码区的DNA片段(aspA Up和aspA Down)。
PCR扩增反应体系为:10×Ex Taq Buffer 5μL,dNTP Mixture(各2.5mM)4μL,Mg2+(25mM)4μL,引物(10pM)各2μL,Ex Taq(5U/μL)0.25μL,总体积50μL;
PCR扩增反应程序为:94℃预变性5min,(94℃变性30s;52℃退火30s;72℃延伸40s;30个循环),72℃过度延伸10min。
将上述两条DNA片段(aspA Up和aspA Down)经琼脂糖凝胶电泳分离纯化后,采用试剂盒对目的条带进行切胶回收,再以上述两条DNA片段为模板,以P1和P4为引物,通过Overlap PCR扩增,得到大小为1510bp的DNA片段(名称为aspA Up-Down,序列如SEQ IDNo.5所示)。SEQ ID No.5所示的DNA片段中,第37-893位(857bp)为含有突变位点的aspAA124T基因片段(即SEQ ID No.3的1-857位)。
Overlap PCR扩增反应体系为:10×Ex Taq Buffer 5μL,dNTP Mixture(各2.5mM)4μL,Mg2+(25mM)4μL,引物(10pM)各2μL,Ex Taq(5U/μL)0.25μL,总体积50μL;
Overlap PCR扩增反应程序为:94℃预变性5min,(94℃变性30s;52℃退火30s;72℃延伸60s;30个循环),72℃过度延伸10min。
所述DNA片段(aspA Up-Down,SEQ ID No.5)含有突变位点,用于在菌株谷氨酸棒杆菌CGMCC No.21260中野生型aspA基因编码区的第124位引入核酸改造,具体可为将124位的腺嘌呤(A)突变为胸腺嘧啶(T),最终导致编码蛋白的第42位苏氨酸(T)变为丝氨酸(S)。将所述DNA片段(aspA Up-Down)经琼脂糖凝胶电泳分离后进行纯化,与经过酶切(Xbal I/BamH I)后纯化的pK18mobsacB质粒(购自Addgene公司,用Xbal I/BamH I酶切)用NEBuilder酶(购自NEB公司)50℃连接30min,连接产物转化DH5a(购自TAKARA公司)后长出的单克隆采用PCR法鉴定阳性克隆,经PCR鉴定后获得阳性重组载体pK18-aspAA124T,该重组载体上含有卡那霉素抗性(Kanr)标记。将酶切正确的重组载体pK18-aspAA124T送测序公司测序鉴定,并将含有正确点突变(A-T)的重组载体pK18-aspAA124T保存备用。
所述重组载体pK18-aspAA124T是将pK18mobsacB载体的Xbal I和BamH I识别位点间的片段(小片段)替换为序列表中SEQ ID No.5的第37-1472位所示的DNA片段,保持pK18mobsacB载体的其他序列不变,得到的重组载体。
所述重组载体pK18-aspAA124T含有SEQ ID No.3所示的突变的基因aspAA124T的第1-857位所示的DNA分子。
2、构建包含基因aspAA124T的重组菌
构建方法如下:将实施例1中的等位替换质粒(pK18-aspAA124T)通过电击转化入谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)CGMCC No.21260中后,在培养基中进行培养,培养基成分和培养条件参见表1,对培养产生的单菌落分别通过实施例1中的引物P1和通用引物M13R进行鉴定,能扩增出1517bp大小条带的菌株为阳性菌株。将阳性菌株在含15%蔗糖的培养基上培养,对培养产生的单菌落分别在含有卡那霉素和不含卡那霉素的培养基上培养,选择在不含卡那霉素的培养基上生长,而在含卡那霉素的培养基上不生长的菌株进一步采用如下引物(上海invitrogen公司合成)进行PCR鉴定:
P5:5'CGTAATATGC GTGGGATGGG 3',
P6:5'ACAGCACCAT CGTGATTTCC 3'。
将得到的PCR扩增产物(265bp)通过95℃高温变性10min、冰浴5min后进行SSCP(Single-Strand Conformation Polymorphis)电泳(以质粒pK18-aspAA124T扩增片段为阳性对照,谷氨酸棒杆菌ATCC14067扩增片段为阴性对照,水作为空白对照),SSCP电泳的PAGE的制备及电泳条件参见表2,由于扩增片段结构不同,电泳位置不同,因此扩增片段电泳位置与阴性对照位置不一致且与阳性对照位置一致的菌株为等位替换成功的菌株。再次通过引物P5/P6 PCR扩增阳性菌株aspA基因片段,并连接到PMD19-T载体进行测序,通过序列比对,碱基序列发生突变(A-T)的菌株为等位替换成功的阳性菌株,并被命名为YPV-043。
重组菌YPV-043含有SEQ ID No.3所示的突变的基因aspAA124T。
表1培养基的组成和培养条件
表2 SSCP电泳的PAGE的制备及电泳条件
实施例2构建过表达野生型aspA基因或突变型aspAA124T基因的工程菌株
为进一步研究验证在生产菌中过表达野生型aspA基因或其突变基因aspAA124T可以增加L-缬氨酸的产量,分别将外源基因整合到宿主染色体中或由质粒在染色体外表达,构建了基因组上和质粒上过表达aspA基因或aspAA124T基因的工程菌株。
1、构建基因组上过表达aspA基因或aspAA124T基因的工程菌株
根据NCBI数据库公布的谷氨酸棒杆菌ATCC14067基因组序列,设计并合成三对扩增上下游同源臂片段及aspA或aspAA124T基因编码区及启动子区的引物,以同源重组的方式在谷氨酸棒杆菌CGMCC No.21260中引入aspA或aspAA124T基因。
引物设计如下(上海invitrogen公司合成):
P7:5'CAGTGCCAAGCTTGCATGCCTGCAGGTCGACTCTAG GTAGTGCCGT GCGTACCCCA 3',
P8:5'GGCTCTACTT GGAGAACTAA CCCAACCCCA ATCGCAATGT 3',
P9:5'ACATTGCGAT TGGGGTTGGG TTAGTTCTCC AAGTAGAGCC 3',
P10:5'GTGCGGGTTG GGGTTTTTGA TTTTAACTAC CCCCGAAAAT 3',
P11:5'ATTTTCGGGG GTAGTTAAAA TCAAAAACCC CAACCCGCAC 3',
P12:5'CAGCTATGACCATGATTACGAATTCGAGCTCGGTACCC GTTGGTTTAG CGGAGCTGCA3'。
重组菌(工程菌株)的构建方法如下:
分别以谷氨酸棒杆菌ATCC14067或重组菌YPV-043为模板,分别以引物P7/P8,P9/P10,P11/P12进行PCR扩增,获得上游同源臂片段795bp(对应于谷氨酸棒杆菌CGMCCNo.21260CEY17_RS02570基因及其CEY17_RS02575的间隔区,序列如SEQ ID No.6所示),aspA基因及其启动子片段1731bp(序列如SEQ ID No.7所示)或aspAA124T基因及其启动子片段1731bp(序列如SEQ ID No.8所示)及下游同源臂片段769bp(对应于谷氨酸棒杆菌CGMCCNo.21260CEY17_RS02575基因及其与CEY17_RS02570的间隔区,序列如SEQ ID No.9所示)。PCR反应结束后,对每个模板扩增得到的3个片段采用柱式DNA凝胶回收试剂盒分别进行电泳回收。回收后的3个片段与经过Xbal I/BamH I酶切后纯化的pK18mobsacB质粒(购自Addgene公司)用NEBuilder酶(购自NEB公司)50℃连接30min,连接产物转化DH5a(购自TAKARA公司)后长出的单克隆用M13引物经PCR鉴定获得阳性整合质粒(重组载体),分别为pK18-aspAOE和pK18-aspAA124TOE,该阳性整合质粒上含有卡那霉素抗性标记,可以通过卡那霉素筛选获得质粒整合到基因组上的重组子。
PCR反应体系为:10×Ex Taq Buffer 5μL,dNTP Mixture(各2.5mM)4μL,Mg2+(25mM)4μL,引物(10pM)各2μL,Ex Taq(5U/μL)0.25μL,总体积50μL。
PCR反应程序为:94℃预变性5min,94℃变性30s;52℃退火30s;72℃延伸60s(30个循环),72℃过度延伸10min。
将测序正确的整合质粒(pK18-aspAOE、pK18-aspAA124TOE)分别电转化入谷氨酸棒杆菌CGMCC No.21260,在培养基中进行培养,培养基成分和培养条件参见表1,对培养产生的单菌落通过P13/P14引物进行PCR鉴定,PCR扩增出含有大小1398bp的片段的为阳性菌株,扩增不到片段的为原菌。将阳性菌株在含15%蔗糖的培养基上培养,对培养产生的单菌落进一步采用P15/P16引物进行PCR鉴定,扩增出大小为1399bp的菌为aspA或aspAA124T基因整合到谷氨酸棒杆菌CGMCC No.21260基因组上同源臂CEY17_02570和下同源臂CEY17_02575的间隔区上的阳性菌株,分别命名为YPV-044(不含突变点)和YPV-045(含突变点)。
重组菌YPV-044含有双拷贝的SEQ ID No.1所示的aspA基因;具体地,重组菌YPV-044是将谷氨酸棒杆菌CGMCC No.21260的基因组中上同源臂CEY17_02570和下同源臂CEY17_02575的间隔区替换为aspA基因,保持谷氨酸棒杆菌CGMCC No.21260的基因组中的其它核苷酸不变得到的重组菌。含有双拷贝aspA基因的重组菌可以显著和稳定地提高aspA基因的表达量。重组菌YPV-044为在基因组上过表达野生型aspA基因的工程菌。
重组菌YPV-045含有SEQ ID No.3所示的突变的aspAA124T基因;具体地,重组菌YPV-045是将谷氨酸棒杆菌CGMCC No.21260的基因组中上同源臂CEY17_02570和下同源臂CEY17_02575的间隔区替换为aspAA124T基因,保持谷氨酸棒杆菌CGMCC No.21260的基因组中的其它核苷酸不变得到的重组菌。重组菌YPV-045为在基因组上过表达突变型aspAA124T基因的工程菌。
PCR鉴定引物如下所示:
P13:5'CGGTTAGATT TTTTGGCCCC 3'(对应上同源臂CEY17_RS02570的外侧),
P14:5'CACCGGTGCA TATGTTCATG 3'(对应aspA基因内部),
P15:5'ACCTCGTTGG TGTTCATGTT 3'(对应aspA基因内部),
P16:5'TCTGGACTGG GTGTTGCGCT 3'(对应下同源臂CEY17_RS02575的外侧)。
2、构建质粒上过表达aspA基因或aspAA124T基因的工程菌株
根据NCBI数据库公布的谷氨酸棒杆菌ATCC14067基因组序列,设计并合成一对扩增aspA或aspAA124T基因编码区及启动子区的引物,引物设计如下(上海invitrogen公司合成):
P17:5'GCTTGCATGCCTGCAGGTCGACTCTAGAGGATCCCC TTAGTTCTCC AAGTAGAGCC 3'(带下划线的核苷酸序列为pXMJ19上的序列),
P18:5'ATCAGGCTGAAAATCTTCTCTCATCCGCCAAAAC TTTTAACTAC CCCCGAAAAT 3'(带下划线的核苷酸序列为pXMJ19上的序列)。
重组菌(工程菌株)的构建方法如下:
分别以谷氨酸棒杆菌ATCC14067和重组菌YPV-043为模板,以引物P17/P18进行PCR扩增,获得aspA基因及其启动子片段(序列如SEQ ID No.10所示)和aspAA124T基因及其启动子片段1761bp(序列如SEQ ID No.11所示),对扩增产物进行电泳并采用柱式DNA凝胶回收试剂盒进行纯化回收,回收的DNA片段与经EcoR I酶切回收的穿梭质粒pXMJ19用NEBuilder酶(购自NEB公司)50℃连接30min,连接产物转化后长出的单克隆用M13引物经PCR鉴定获得阳性过表达质粒pXMJ19-aspA(含有aspA基因)和pXMJ19-aspAA124T(含有aspAA124T基因),将该质粒送测序。因质粒上含有氯霉素抗性标记,可以通过氯霉素来筛选质粒是否转化到菌株中。
PCR反应体系为:10×Ex Taq Buffer 5μL,dNTP Mixture(各2.5mM)4μL,Mg2+(25mM)4μL,引物(10pM)各2μL,Ex Taq(5U/μL)0.25μL,总体积50μL。
PCR反应程序为:94℃预变性5min,94℃变性30s;52℃退火30s;72℃延伸60s(30个循环),72℃过度延伸10min。
将测序正确的pXMJ19-aspA和pXMJ19-aspAA124T质粒分别电转化入谷氨酸棒杆菌CGMCC No.21260中,在培养基中进行培养,培养基成分和培养条件参见表1,对培养产生的单菌落通过引物M13R(-48)/P18进行PCR鉴定,PCR扩增出含有大小1800bp片段的为阳性菌株,其被命名为YPV-046(不含突变点)和YPV-047(含突变点)。
重组菌YPV-046含有SEQ ID No.1所示的aspA基因;重组菌YPV-046为在质粒上过表达野生型aspA基因的工程菌,即由质粒pXMJ19-aspA在染色体外进行过表达。
重组菌YPV-047含有SEQ ID No.3所示的突变的aspAA124T基因。重组菌YPV-047为在质粒上过表达突变型aspAA124T基因的工程菌,即由质粒pXMJ19-aspAA124T在染色体外进行过表达。
实施例3构建基因组上缺失aspA基因的工程菌株
根据NCBI数据库公布的谷氨酸棒杆菌ATCC14067的基因组序列,合成两对扩增aspA基因编码区两端片段的引物,作为上下游同源臂片段。引物设计如下(上海invitrogen公司合成):
P19:5'CAGTGCCAAGCTTGCATGCCTGCAGGTCGACTCTAG CAGTGATGCT ACCGTTCCCA 3',
P20:5'CAACTTGTGA GAGGCAGTAC TCCAAGATCT CGTCTGATAC 3',
P21:5'GTATCAGACG AGATCTTGGA GTACTGCCTC TCACAAGTTG 3',
P22:5'CAGCTATGACCATGATTACGAATTCGAGCTCGGTACCC CCCTCGGCTT CGGTTCCTCC3'。
重组菌(工程菌株)的构建方法如下:
以谷氨酸棒杆菌ATCC14067为模板,分别以引物P19/P20和P21/P22进行PCR扩增,获得aspA的上游同源臂片段793bp及aspA的下游同源臂片段764bp。再用引物P19/P22进行Overlap PCR得到整个同源臂片段1517bp(序列如SEQ ID No.12所示)。对扩增的产物进行电泳并采用柱式DNA凝胶回收试剂盒进行纯化,回收的DNA片段与经过Xbal I/BamH I酶切后纯化的pK18mobsacB质粒(购自Addgene公司)用NEBuilder酶(购自NEB公司)50℃连接30min,连接产物转化后长出的单克隆用M13引物经PCR鉴定获得阳性敲除载体pK18-ΔaspA,将该质粒送测序。该质粒上含有卡那霉素抗性作为筛选标记。
Overlap PCR扩增反应体系为:10×Ex Taq Buffer 5μL,dNTP Mixture(各2.5mM)4μL,Mg2+(25mM)4μL,引物(10pM)各2μL,Ex Taq(5U/μL)0.25μL,总体积50μL。
Overlap PCR扩增反应程序为:94℃预变性5min,94℃变性30s;52℃退火30s;72℃延伸90s(30个循环),72℃过度延伸10min。
将测序正确的敲除质粒pK18-ΔaspA电转化入谷氨酸棒杆菌CGMCC No.21260,在培养基中进行培养,培养基成分和培养条件参见表1,对培养产生的单菌落通过如下引物(上海invitrogen公司合成)进行PCR鉴定:
P23:5'CAGTGATGCT ACCGTTCCCA 3'(对应于谷氨酸棒杆菌CGMCC No.21260CEY17_08085基因内部),
P24:5'CCCTCGGCTT CGGTTCCTCC 3'(对应于谷氨酸棒杆菌CGMCC No.21260CEY17_08095基因内部)。
上述PCR同时扩增出大小1443bp及3024bp的条带的菌株为阳性菌株,只扩增出3024bp条带的菌株为原菌。阳性菌株在15%蔗糖培养基上筛选后分别在含有卡那霉素和不含卡那霉素的培养基上培养,选择在不含卡那霉素的培养基上生长,而在含卡那霉素的培养基上不生长的菌株进一步采用P23/P24引物进行PCR鉴定,扩增出大小为1443bp条带的菌株为aspA基因编码区被敲除的阳性菌株aspA。再次通过P23/P24引物PCR扩增阳性菌株aspA片段,并连接到pMD19-T载体进行测序,将测序正确的菌株命名为YPV-048(谷氨酸棒杆菌CGMCC No.21260上的基因组上的aspA基因被敲除)。
实施例4发酵制备L-缬氨酸的方法及aspA基因或aspAA124T基因在L-缬氨酸生产中的作用
将上述实施例构建的菌株和原始菌株谷氨酸棒杆菌CGMCC No.21260在BLBIO-5GC-4-H型号的发酵罐(购自上海百仑生物科技有限公司)中以表3所示的培养基和表4所示的控制工艺进行发酵实验,各个菌株的发酵工艺完全相同。每个菌株重复三次,结果如表5所示。
结果如表5所示,在谷氨酸棒杆菌中对aspA基因编码区进行点突变aspAA124T和/或在生产菌中过表达aspA基因或其突变基因aspAA124T,有助于L-缬氨酸产量及转化率的提高,而对aspA基因进行敲除或弱化,不利于L-缬氨酸的积累。
表3发酵培养基配方(其余为水)
成分 |
配方 |
硫酸铵 |
14g/L |
磷酸二氢钾 |
1g/L |
磷酸氢二钾 |
1g/L |
硫酸镁 |
0.5g/L |
酵母粉 |
2g/L |
硫酸亚铁 |
18mg/L |
硫酸锰 |
4.2mg/L |
生物素 |
0.02mg/L |
维生素B1 |
2mg/L |
antifoam(CB-442)消泡剂) |
0.5mL/L |
70%葡萄糖(底糖) |
40g/L |
表4发酵控制工艺
表5 L-缬氨酸发酵实验结果
菌株 |
OD<sub>610nm</sub> |
L-缬氨酸产量(g/L) |
谷氨酸棒杆菌CGMCC No.21260 |
98.2 |
84.1 |
YPV-043 |
99.3 |
85.2 |
YPV-044 |
98.5 |
84.6 |
YPV-045 |
99.9 |
84.8 |
YPV-046 |
99.5 |
85.2 |
YPV-047 |
99.1 |
85.8 |
YPV-048 |
96.4 |
83.3 |
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说,在不脱离本发明的宗旨和范围,以及无需进行不必要的实验情况下,可在等同参数、浓度和条件下,在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例,应该理解为,可以对本发明作进一步的改进。总之,按本发明的原理,本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进,包括脱离了本申请中已公开范围,而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围,可以进行一些基本特征的应用。
SEQUENCE LISTING
<110> 宁夏伊品生物科技股份有限公司
<120> aspA基因突变体、重组菌及制备L-缬氨酸的方法
<160> 12
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1581
<212> DNA
<213> 谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)
<400> 1
atgtctaaga cgagcaacaa gtcttcagca gactcaaaga atgacgcaaa agccgaagac 60
attgtgaacg gcgagaacca aatcgccacg aatgagtcgc agtcttcaga cagcgctgca 120
gttacggaac gtgtcgtcga accaaaaacc acggttcaga aaaagttccg aatcgaatcg 180
gatctgcttg gtgaacttca gatcccatcc cacgcatatt acggggtgca cacccttcgt 240
gcggtggaca acttccaaat ctcacgaacc accatcaacc acgtcccaga tttcattcgc 300
ggcatggtcc aggtgaaaaa ggccgcagct ttagcaaacc gccgactgca cacacttcca 360
gcacaaaaag cagaagcaat tgtctgggct tgtgatcaga tcctcattga gggacgctgt 420
atggatcagt tccccatcga tgtgttccag ggtggcgcag gtacctcact gaacatgaac 480
accaacgagg ttgttgccaa ccttgcactt gagttcttag gccatgaaaa gggcgagtat 540
cacatcctgc accccatgga tgatgtgaac atgtcccagt ccaccaacga ttcctaccca 600
actggtttcc gcctgggcat ttacgctgga ctgcagaccc tcatcgctga aattgatgag 660
cttcaggttg cgttccgcca caagggcaat gagtttgtcg acatcatcaa gatgggccgc 720
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cttggtgcaa ccgcaatcgg tactggtgtg aacactccag caggctaccg ccaccaggtt 900
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ccagtgatcc cagaagtggt caaccaggtc tgcttcaagg tcttcggtaa cgatctcacc 1200
gtcaccatgg ctgcggaagc tggccagttg cagctcaacg tcatggagcc agtcattggc 1260
gaatccctct tccagtcact gcgcatcctg ggcaatgcag ccaagacttt gcgtgagaag 1320
tgcgtcgtag gaatcaccgc caacgctgat gtttgccgtg cttacgttga taactccatc 1380
ggaattatca cttacctgaa cccattcctg ggccacgaca ttggagatca gatcggtaag 1440
gaagcagccg aaactggtcg accagtgcgt gaactcatcc tggaaaagaa gctcatggat 1500
gaaaagacgc tcgaggcagt cctatccaag gagaacctca tgcacccaat gttccgcgga 1560
aggctctact tggagaacta a 1581
<210> 2
<211> 526
<212> PRT
<213> 谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)
<400> 2
Met Ser Lys Thr Ser Asn Lys Ser Ser Ala Asp Ser Lys Asn Asp Ala
1 5 10 15
Lys Ala Glu Asp Ile Val Asn Gly Glu Asn Gln Ile Ala Thr Asn Glu
20 25 30
Ser Gln Ser Ser Asp Ser Ala Ala Val Thr Glu Arg Val Val Glu Pro
35 40 45
Lys Thr Thr Val Gln Lys Lys Phe Arg Ile Glu Ser Asp Leu Leu Gly
50 55 60
Glu Leu Gln Ile Pro Ser His Ala Tyr Tyr Gly Val His Thr Leu Arg
65 70 75 80
Ala Val Asp Asn Phe Gln Ile Ser Arg Thr Thr Ile Asn His Val Pro
85 90 95
Asp Phe Ile Arg Gly Met Val Gln Val Lys Lys Ala Ala Ala Leu Ala
100 105 110
Asn Arg Arg Leu His Thr Leu Pro Ala Gln Lys Ala Glu Ala Ile Val
115 120 125
Trp Ala Cys Asp Gln Ile Leu Ile Glu Gly Arg Cys Met Asp Gln Phe
130 135 140
Pro Ile Asp Val Phe Gln Gly Gly Ala Gly Thr Ser Leu Asn Met Asn
145 150 155 160
Thr Asn Glu Val Val Ala Asn Leu Ala Leu Glu Phe Leu Gly His Glu
165 170 175
Lys Gly Glu Tyr His Ile Leu His Pro Met Asp Asp Val Asn Met Ser
180 185 190
Gln Ser Thr Asn Asp Ser Tyr Pro Thr Gly Phe Arg Leu Gly Ile Tyr
195 200 205
Ala Gly Leu Gln Thr Leu Ile Ala Glu Ile Asp Glu Leu Gln Val Ala
210 215 220
Phe Arg His Lys Gly Asn Glu Phe Val Asp Ile Ile Lys Met Gly Arg
225 230 235 240
Thr Gln Leu Gln Asp Ala Val Pro Met Ser Leu Gly Glu Glu Phe Arg
245 250 255
Ala Phe Ala His Asn Leu Ala Glu Glu Gln Thr Val Leu Arg Glu Ala
260 265 270
Ala Asn Arg Leu Leu Glu Val Asn Leu Gly Ala Thr Ala Ile Gly Thr
275 280 285
Gly Val Asn Thr Pro Ala Gly Tyr Arg His Gln Val Val Ala Ala Leu
290 295 300
Ser Glu Val Thr Gly Leu Glu Leu Lys Ser Ala Arg Asp Leu Ile Glu
305 310 315 320
Ala Thr Ser Asp Thr Gly Ala Tyr Val His Ala His Ser Ala Ile Lys
325 330 335
Arg Ala Ala Met Lys Leu Ser Lys Ile Cys Asn Asp Leu Arg Leu Leu
340 345 350
Ser Ser Gly Pro Arg Ala Gly Leu Asn Glu Ile Asn Leu Pro Pro Arg
355 360 365
Gln Ala Gly Ser Ser Ile Met Pro Ala Lys Val Asn Pro Val Ile Pro
370 375 380
Glu Val Val Asn Gln Val Cys Phe Lys Val Phe Gly Asn Asp Leu Thr
385 390 395 400
Val Thr Met Ala Ala Glu Ala Gly Gln Leu Gln Leu Asn Val Met Glu
405 410 415
Pro Val Ile Gly Glu Ser Leu Phe Gln Ser Leu Arg Ile Leu Gly Asn
420 425 430
Ala Ala Lys Thr Leu Arg Glu Lys Cys Val Val Gly Ile Thr Ala Asn
435 440 445
Ala Asp Val Cys Arg Ala Tyr Val Asp Asn Ser Ile Gly Ile Ile Thr
450 455 460
Tyr Leu Asn Pro Phe Leu Gly His Asp Ile Gly Asp Gln Ile Gly Lys
465 470 475 480
Glu Ala Ala Glu Thr Gly Arg Pro Val Arg Glu Leu Ile Leu Glu Lys
485 490 495
Lys Leu Met Asp Glu Lys Thr Leu Glu Ala Val Leu Ser Lys Glu Asn
500 505 510
Leu Met His Pro Met Phe Arg Gly Arg Leu Tyr Leu Glu Asn
515 520 525
<210> 3
<211> 1581
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 3
atgtctaaga cgagcaacaa gtcttcagca gactcaaaga atgacgcaaa agccgaagac 60
attgtgaacg gcgagaacca aatcgccacg aatgagtcgc agtcttcaga cagcgctgca 120
gtttcggaac gtgtcgtcga accaaaaacc acggttcaga aaaagttccg aatcgaatcg 180
gatctgcttg gtgaacttca gatcccatcc cacgcatatt acggggtgca cacccttcgt 240
gcggtggaca acttccaaat ctcacgaacc accatcaacc acgtcccaga tttcattcgc 300
ggcatggtcc aggtgaaaaa ggccgcagct ttagcaaacc gccgactgca cacacttcca 360
gcacaaaaag cagaagcaat tgtctgggct tgtgatcaga tcctcattga gggacgctgt 420
atggatcagt tccccatcga tgtgttccag ggtggcgcag gtacctcact gaacatgaac 480
accaacgagg ttgttgccaa ccttgcactt gagttcttag gccatgaaaa gggcgagtat 540
cacatcctgc accccatgga tgatgtgaac atgtcccagt ccaccaacga ttcctaccca 600
actggtttcc gcctgggcat ttacgctgga ctgcagaccc tcatcgctga aattgatgag 660
cttcaggttg cgttccgcca caagggcaat gagtttgtcg acatcatcaa gatgggccgc 720
acccagttgc aggatgctgt tcccatgagc ttgggcgaag agttccgagc attcgcgcac 780
aacctcgcag aagagcagac cgtgctgcgt gaagctgcca accgtctcct cgaggtcaac 840
cttggtgcaa ccgcaatcgg tactggtgtg aacactccag caggctaccg ccaccaggtt 900
gtcgctgctc tgtctgaggt caccggactg gaactaaagt ccgcacgtga tctcattgag 960
gctacctctg acaccggtgc atatgttcat gcgcactccg caatcaagcg tgcagccatg 1020
aaactgtcca agatctgtaa cgatctacgt ctgctgtctt ctggtcctcg tgctggtttg 1080
aacgaaatca acctaccacc acgccaggct ggttcctcca tcatgccagc caaggtcaac 1140
ccagtgatcc cagaagtggt caaccaggtc tgcttcaagg tcttcggtaa cgatctcacc 1200
gtcaccatgg ctgcggaagc tggccagttg cagctcaacg tcatggagcc agtcattggc 1260
gaatccctct tccagtcact gcgcatcctg ggcaatgcag ccaagacttt gcgtgagaag 1320
tgcgtcgtag gaatcaccgc caacgctgat gtttgccgtg cttacgttga taactccatc 1380
ggaattatca cttacctgaa cccattcctg ggccacgaca ttggagatca gatcggtaag 1440
gaagcagccg aaactggtcg accagtgcgt gaactcatcc tggaaaagaa gctcatggat 1500
gaaaagacgc tcgaggcagt cctatccaag gagaacctca tgcacccaat gttccgcgga 1560
aggctctact tggagaacta a 1581
<210> 4
<211> 526
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 4
Met Ser Lys Thr Ser Asn Lys Ser Ser Ala Asp Ser Lys Asn Asp Ala
1 5 10 15
Lys Ala Glu Asp Ile Val Asn Gly Glu Asn Gln Ile Ala Thr Asn Glu
20 25 30
Ser Gln Ser Ser Asp Ser Ala Ala Val Ser Glu Arg Val Val Glu Pro
35 40 45
Lys Thr Thr Val Gln Lys Lys Phe Arg Ile Glu Ser Asp Leu Leu Gly
50 55 60
Glu Leu Gln Ile Pro Ser His Ala Tyr Tyr Gly Val His Thr Leu Arg
65 70 75 80
Ala Val Asp Asn Phe Gln Ile Ser Arg Thr Thr Ile Asn His Val Pro
85 90 95
Asp Phe Ile Arg Gly Met Val Gln Val Lys Lys Ala Ala Ala Leu Ala
100 105 110
Asn Arg Arg Leu His Thr Leu Pro Ala Gln Lys Ala Glu Ala Ile Val
115 120 125
Trp Ala Cys Asp Gln Ile Leu Ile Glu Gly Arg Cys Met Asp Gln Phe
130 135 140
Pro Ile Asp Val Phe Gln Gly Gly Ala Gly Thr Ser Leu Asn Met Asn
145 150 155 160
Thr Asn Glu Val Val Ala Asn Leu Ala Leu Glu Phe Leu Gly His Glu
165 170 175
Lys Gly Glu Tyr His Ile Leu His Pro Met Asp Asp Val Asn Met Ser
180 185 190
Gln Ser Thr Asn Asp Ser Tyr Pro Thr Gly Phe Arg Leu Gly Ile Tyr
195 200 205
Ala Gly Leu Gln Thr Leu Ile Ala Glu Ile Asp Glu Leu Gln Val Ala
210 215 220
Phe Arg His Lys Gly Asn Glu Phe Val Asp Ile Ile Lys Met Gly Arg
225 230 235 240
Thr Gln Leu Gln Asp Ala Val Pro Met Ser Leu Gly Glu Glu Phe Arg
245 250 255
Ala Phe Ala His Asn Leu Ala Glu Glu Gln Thr Val Leu Arg Glu Ala
260 265 270
Ala Asn Arg Leu Leu Glu Val Asn Leu Gly Ala Thr Ala Ile Gly Thr
275 280 285
Gly Val Asn Thr Pro Ala Gly Tyr Arg His Gln Val Val Ala Ala Leu
290 295 300
Ser Glu Val Thr Gly Leu Glu Leu Lys Ser Ala Arg Asp Leu Ile Glu
305 310 315 320
Ala Thr Ser Asp Thr Gly Ala Tyr Val His Ala His Ser Ala Ile Lys
325 330 335
Arg Ala Ala Met Lys Leu Ser Lys Ile Cys Asn Asp Leu Arg Leu Leu
340 345 350
Ser Ser Gly Pro Arg Ala Gly Leu Asn Glu Ile Asn Leu Pro Pro Arg
355 360 365
Gln Ala Gly Ser Ser Ile Met Pro Ala Lys Val Asn Pro Val Ile Pro
370 375 380
Glu Val Val Asn Gln Val Cys Phe Lys Val Phe Gly Asn Asp Leu Thr
385 390 395 400
Val Thr Met Ala Ala Glu Ala Gly Gln Leu Gln Leu Asn Val Met Glu
405 410 415
Pro Val Ile Gly Glu Ser Leu Phe Gln Ser Leu Arg Ile Leu Gly Asn
420 425 430
Ala Ala Lys Thr Leu Arg Glu Lys Cys Val Val Gly Ile Thr Ala Asn
435 440 445
Ala Asp Val Cys Arg Ala Tyr Val Asp Asn Ser Ile Gly Ile Ile Thr
450 455 460
Tyr Leu Asn Pro Phe Leu Gly His Asp Ile Gly Asp Gln Ile Gly Lys
465 470 475 480
Glu Ala Ala Glu Thr Gly Arg Pro Val Arg Glu Leu Ile Leu Glu Lys
485 490 495
Lys Leu Met Asp Glu Lys Thr Leu Glu Ala Val Leu Ser Lys Glu Asn
500 505 510
Leu Met His Pro Met Phe Arg Gly Arg Leu Tyr Leu Glu Asn
515 520 525
<210> 5
<211> 1510
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 5
cagtgccaag cttgcatgcc tgcaggtcga ctctagattg cggttgcacc aaggttgacc 60
tcgaggagac ggttggcagc ttcacgcagc acggtctgct cttctgcgag gttgtgcgcg 120
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atcttgatga tgtcgacaaa ctcattgccc ttgtggcgga acgcaacctg aagctcatca 240
atttcagcga tgagggtctg cagtccagcg taaatgccca ggcggaaacc agttgggtag 300
gaatcgttgg tggactggga catgttcaca tcatccatgg ggtgcaggat gtgatactcg 360
cccttttcat ggcctaagaa ctcaagtgca aggttggcaa caacctcgtt ggtgttcatg 420
ttcagtgagg tacctgcgcc accctggaac acatcgatgg ggaactgatc catacagcgt 480
ccctcaatga ggatctgatc acaagcccag acaattgctt ctgctttttg tgctggaagt 540
gtgtgcagtc ggcggtttgc taaagctgcg gcctttttca cctggaccat gccgcgaatg 600
aaatctggga cgtggttgat ggtggttcgt gagatttgga agttgtccac cgcacgaagg 660
gtgtgcaccc cgtaatatgc gtgggatggg atctgaagtt caccaagcag atccgattcg 720
attcggaact ttttctgaac cgtggttttt ggttcgacga cacgttccga aactgcagcg 780
ctgtctgaag actgcgactc attcgtggcg atttggttct cgccgttcac aatgtcttcg 840
gcttttgcgt cattctttga gtctgctgaa gacttgttgc tcgtcttaga catgtactgc 900
ctctcacaag ttgaaggaaa tcacgatggt gctgtggatt atcctacgta cttgtaagag 960
gcagtgtggg actaccccac tacattttcg ggggtagtta aaactagatg cgggcgatgc 1020
ggatttcaga agccaggatg gcttcagcgc cgagtccagc aagcttatcc atgatggcgt 1080
tagctgacct gcgtggcacc atggcgcgta cagcaaccca gttgtcgcgt gccagtgggg 1140
ataccgttgg gccggatagg cctggggtta ctgcagtggc agcgtccagg ttgtcgcggt 1200
cgacgttgta atccagcatg aggaagttct gcgcgtgcaa aattccctgg atgcggcgaa 1260
gcaggatctg ctgctctggg gtgacctttt catccttgcg gccaacaatg acagcctcag 1320
aggtacacag aacctcgccg aaaggtgcaa gaccttgctg acgcagcgtg cggccggtgg 1380
atacaacatc ggcgatggca tctgcgacac caagcttgat ggatacctct actgcaccgt 1440
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gtcatagctg 1510
<210> 6
<211> 795
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 6
cagtgccaag cttgcatgcc tgcaggtcga ctctaggtag tgccgtgcgt accccattag 60
aaagtgaaaa ttcactgatt ctagccagtc acgctgggaa tcattacatg ggccttcttc 120
gatcattcca tgatcgacaa gaaaagcctc acgttcatca ggttgtaaat aggggacagt 180
agacattaat tacacctaaa aagaaaaggg cccccatgag gcgcatcgtt gagaggcgtt 240
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gtcactttca cttgtcgtct gaagtttcga tgtttctgca ccataaacgg tgtttatgaa 360
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gggctggaca cgtacgcgga gatggcgacg cgttctgtca cgaatcgtgc gttgcgtgct 480
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aagttaacat catgctgcca ccgcccaagc gggaaacatt gcgattgggg ttgggttagt 780
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<210> 7
<211> 1731
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 7
acattgcgat tggggttggg ttagttctcc aagtagagcc ttccgcggaa cattgggtgc 60
atgaggttct ccttggatag gactgcctcg agcgtctttt catccatgag cttcttttcc 120
aggatgagtt cacgcactgg tcgaccagtt tcggctgctt ccttaccgat ctgatctcca 180
atgtcgtggc ccaggaatgg gttcaggtaa gtgataattc cgatggagtt atcaacgtaa 240
gcacggcaaa catcagcgtt ggcggtgatt cctacgacgc acttctcacg caaagtcttg 300
gctgcattgc ccaggatgcg cagtgactgg aagagggatt cgccaatgac tggctccatg 360
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gaagacagca gacgtagatc gttacagatc ttggacagtt tcatggctgc acgcttgatt 600
gcggagtgcg catgaacata tgcaccggtg tcagaggtag cctcaatgag atcacgtgcg 660
gactttagtt ccagtccggt gacctcagac agagcagcga caacctggtg gcggtagcct 720
gctggagtgt tcacaccagt accgattgcg gttgcaccaa ggttgacctc gaggagacgg 780
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tcttcgccca agctcatggg aacagcatcc tgcaactggg tgcggcccat cttgatgatg 900
tcgacaaact cattgccctt gtggcggaac gcaacctgaa gctcatcaat ttcagcgatg 960
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gactgggaca tgttcacatc atccatgggg tgcaggatgt gatactcgcc cttttcatgg 1080
cctaagaact caagtgcaag gttggcaaca acctcgttgg tgttcatgtt cagtgaggta 1140
cctgcgccac cctggaacac atcgatgggg aactgatcca tacagcgtcc ctcaatgagg 1200
atctgatcac aagcccagac aattgcttct gctttttgtg ctggaagtgt gtgcagtcgg 1260
cggtttgcta aagctgcggc ctttttcacc tggaccatgc cgcgaatgaa atctgggacg 1320
tggttgatgg tggttcgtga gatttggaag ttgtccaccg cacgaagggt gtgcaccccg 1380
taatatgcgt gggatgggat ctgaagttca ccaagcagat ccgattcgat tcggaacttt 1440
ttctgaaccg tggtttttgg ttcgacgaca cgttccgtaa ctgcagcgct gtctgaagac 1500
tgcgactcat tcgtggcgat ttggttctcg ccgttcacaa tgtcttcggc ttttgcgtca 1560
ttctttgagt ctgctgaaga cttgttgctc gtcttagaca tgtactgcct ctcacaagtt 1620
gaaggaaatc acgatggtgc tgtggattat cctacgtact tgtaagaggc agtgtgggac 1680
taccccacta cattttcggg ggtagttaaa atcaaaaacc ccaacccgca c 1731
<210> 8
<211> 1731
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 8
acattgcgat tggggttggg ttagttctcc aagtagagcc ttccgcggaa cattgggtgc 60
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gctgcattgc ccaggatgcg cagtgactgg aagagggatt cgccaatgac tggctccatg 360
acgttgagct gcaactggcc agcttccgca gccatggtga cggtgagatc gttaccgaag 420
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gaagacagca gacgtagatc gttacagatc ttggacagtt tcatggctgc acgcttgatt 600
gcggagtgcg catgaacata tgcaccggtg tcagaggtag cctcaatgag atcacgtgcg 660
gactttagtt ccagtccggt gacctcagac agagcagcga caacctggtg gcggtagcct 720
gctggagtgt tcacaccagt accgattgcg gttgcaccaa ggttgacctc gaggagacgg 780
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tcttcgccca agctcatggg aacagcatcc tgcaactggg tgcggcccat cttgatgatg 900
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gactgggaca tgttcacatc atccatgggg tgcaggatgt gatactcgcc cttttcatgg 1080
cctaagaact caagtgcaag gttggcaaca acctcgttgg tgttcatgtt cagtgaggta 1140
cctgcgccac cctggaacac atcgatgggg aactgatcca tacagcgtcc ctcaatgagg 1200
atctgatcac aagcccagac aattgcttct gctttttgtg ctggaagtgt gtgcagtcgg 1260
cggtttgcta aagctgcggc ctttttcacc tggaccatgc cgcgaatgaa atctgggacg 1320
tggttgatgg tggttcgtga gatttggaag ttgtccaccg cacgaagggt gtgcaccccg 1380
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tgcgactcat tcgtggcgat ttggttctcg ccgttcacaa tgtcttcggc ttttgcgtca 1560
ttctttgagt ctgctgaaga cttgttgctc gtcttagaca tgtactgcct ctcacaagtt 1620
gaaggaaatc acgatggtgc tgtggattat cctacgtact tgtaagaggc agtgtgggac 1680
taccccacta cattttcggg ggtagttaaa atcaaaaacc ccaacccgca c 1731
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<211> 769
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 9
attttcgggg gtagttaaaa tcaaaaaccc caacccgcac atttttagat ttctattttg 60
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acatgtttga agtggagcaa accgaaaacc agttttcccc aacggcagcc gccccccacg 180
ttgaaccttc gaaatagtag gcaacaccat caagcggatc ttcatcaagc gaaatagtga 240
ttgactcttc accgttccgc ttacaaactg cgttagtgtc gctattttcc acccacttgt 300
cacactcgta cccgttttca tttagccatt tttcggcatg tcctattttc tcgaaccggg 360
caggagcgtc agggcttccg cagcccgcta gtagtagtcc ggctgcaatg atgcttaatg 420
tttttttcat gaattaaaca tagtactttg ctggtaaaaa tattggagaa ccccactggc 480
ctacatggtc agtgggggca tttttgcgtt tcacccctca aaaatcatca ccacacttgc 540
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tggacacatt aaacacattg cgaccaggta aaacgtcatg accaggtatc gtcaatgttc 660
ttgatgaatt tccgcaccgc aggattatca ttcgaggtgg aataaatagc ctgcagctcc 720
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<210> 10
<211> 1761
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
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ggagttatca acgtaagcac ggcaaacatc agcgttggcg gtgattccta cgacgcactt 300
ctcacgcaaa gtcttggctg cattgcccag gatgcgcagt gactggaaga gggattcgcc 360
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gagatcgtta ccgaagacct tgaagcagac ctggttgacc acttctggga tcactgggtt 480
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ctggtggcgg tagcctgctg gagtgttcac accagtaccg attgcggttg caccaaggtt 780
gacctcgagg agacggttgg cagcttcacg cagcacggtc tgctcttctg cgaggttgtg 840
cgcgaatgct cggaactctt cgcccaagct catgggaaca gcatcctgca actgggtgcg 900
gcccatcttg atgatgtcga caaactcatt gcccttgtgg cggaacgcaa cctgaagctc 960
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catgttcagt gaggtacctg cgccaccctg gaacacatcg atggggaact gatccataca 1200
gcgtccctca atgaggatct gatcacaagc ccagacaatt gcttctgctt tttgtgctgg 1260
aagtgtgtgc agtcggcggt ttgctaaagc tgcggccttt ttcacctgga ccatgccgcg 1320
aatgaaatct gggacgtggt tgatggtggt tcgtgagatt tggaagttgt ccaccgcacg 1380
aagggtgtgc accccgtaat atgcgtggga tgggatctga agttcaccaa gcagatccga 1440
ttcgattcgg aactttttct gaaccgtggt ttttggttcg acgacacgtt ccgtaactgc 1500
agcgctgtct gaagactgcg actcattcgt ggcgatttgg ttctcgccgt tcacaatgtc 1560
ttcggctttt gcgtcattct ttgagtctgc tgaagacttg ttgctcgtct tagacatgta 1620
ctgcctctca caagttgaag gaaatcacga tggtgctgtg gattatccta cgtacttgta 1680
agaggcagtg tgggactacc ccactacatt ttcgggggta gttaaaagtt ttggcggatg 1740
agagaagatt ttcagcctga t 1761
<210> 11
<211> 1761
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 11
gcttgcatgc ctgcaggtcg actctagagg atccccttag ttctccaagt agagccttcc 60
gcggaacatt gggtgcatga ggttctcctt ggataggact gcctcgagcg tcttttcatc 120
catgagcttc ttttccagga tgagttcacg cactggtcga ccagtttcgg ctgcttcctt 180
accgatctga tctccaatgt cgtggcccag gaatgggttc aggtaagtga taattccgat 240
ggagttatca acgtaagcac ggcaaacatc agcgttggcg gtgattccta cgacgcactt 300
ctcacgcaaa gtcttggctg cattgcccag gatgcgcagt gactggaaga gggattcgcc 360
aatgactggc tccatgacgt tgagctgcaa ctggccagct tccgcagcca tggtgacggt 420
gagatcgtta ccgaagacct tgaagcagac ctggttgacc acttctggga tcactgggtt 480
gaccttggct ggcatgatgg aggaaccagc ctggcgtggt ggtaggttga tttcgttcaa 540
accagcacga ggaccagaag acagcagacg tagatcgtta cagatcttgg acagtttcat 600
ggctgcacgc ttgattgcgg agtgcgcatg aacatatgca ccggtgtcag aggtagcctc 660
aatgagatca cgtgcggact ttagttccag tccggtgacc tcagacagag cagcgacaac 720
ctggtggcgg tagcctgctg gagtgttcac accagtaccg attgcggttg caccaaggtt 780
gacctcgagg agacggttgg cagcttcacg cagcacggtc tgctcttctg cgaggttgtg 840
cgcgaatgct cggaactctt cgcccaagct catgggaaca gcatcctgca actgggtgcg 900
gcccatcttg atgatgtcga caaactcatt gcccttgtgg cggaacgcaa cctgaagctc 960
atcaatttca gcgatgaggg tctgcagtcc agcgtaaatg cccaggcgga aaccagttgg 1020
gtaggaatcg ttggtggact gggacatgtt cacatcatcc atggggtgca ggatgtgata 1080
ctcgcccttt tcatggccta agaactcaag tgcaaggttg gcaacaacct cgttggtgtt 1140
catgttcagt gaggtacctg cgccaccctg gaacacatcg atggggaact gatccataca 1200
gcgtccctca atgaggatct gatcacaagc ccagacaatt gcttctgctt tttgtgctgg 1260
aagtgtgtgc agtcggcggt ttgctaaagc tgcggccttt ttcacctgga ccatgccgcg 1320
aatgaaatct gggacgtggt tgatggtggt tcgtgagatt tggaagttgt ccaccgcacg 1380
aagggtgtgc accccgtaat atgcgtggga tgggatctga agttcaccaa gcagatccga 1440
ttcgattcgg aactttttct gaaccgtggt ttttggttcg acgacacgtt ccgaaactgc 1500
agcgctgtct gaagactgcg actcattcgt ggcgatttgg ttctcgccgt tcacaatgtc 1560
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agagaagatt ttcagcctga t 1761
<210> 12
<211> 1517
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 12
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ctctcacaag ttgaaggaaa tcacgatggt gctgtggatt atcctacgta cttgtaagag 840
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aggtacacag aacctcgccg aaaggtgcaa gaccttgctg acgcagcgtg cggccggtgg 1260
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