JPH05304964A - Ｄｎａポリメラーゼ遺伝子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 新規なＤＮＡポリメラーゼ遺伝子を特定し、
該遺伝子を用いた該新規なＤＮＡポリメラーゼの遺伝子
工学的製造法を提供する。 【構成】 プラスミドｐＵＩＦ１０１より単離されるＤ
ＮＡポリメラーゼ遺伝子。該遺伝子を組込んだプラスミ
ドで形質転換した形質転換体を培養し、該培養物からＤ
ＮＡポリメラーゼを採取するＤＮＡポリメラーゼの製造
方法。 【効果】 このＤＮＡポリメラーゼは、遺伝子工学研究
用試薬として有用である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、ＤＮＡポリメラーゼ遺
伝子及び遺伝子工学研究用試薬として有用な酵素である
ＤＮＡポリメラーゼの製法に関する。

【０００２】

【従来の技術】今まで遺伝子工学研究用試薬として一般
に利用されているＤＮＡポリメラーゼには、大腸菌ＤＮ
Ａポリメラーゼ、その改変型であるクレノウ断片、Ｔ４
ファージ由来ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ７ファージ由来Ｄ
ＮＡポリメラーゼ、サーマスアクアティカス由来耐熱性
ＤＮＡポリメラーゼ〔タック（ Taq )ポリメラーゼ〕等
がある。これらの酵素は、その有する性質に応じて特定
のＤＮＡの標識化や、ＤＮＡ塩基配列決定法などにそれ
ぞれ利用されている。一般にＤＮＡポリメラーゼはその
起源による酵素特異性を有しており、その特性を生かし
た利用法がある。例えばバチルス ステアロサーモフィ
ラス（Bacillus Stearothermophilus)は生育至適温度が
約６５℃である好熱性細菌である。この細菌由来のＤＮ
Ａポリメラーゼの単離・精製についてはジャーナル オ
ブ バクテリオロジー（Journal of Bacteriology)、第
１４５巻、第２１〜２６頁（１９８１）に記載されてい
る。また、該ＤＮＡポリメラーゼをプロテアーゼである
ズブチリシン（Subtilisin）で処理して５′→３′エキ
ソヌクレアーゼ活性を有する領域を除去したラージフラ
グメントの調製及びそのジデオキシシークエンス法への
応用について、サイエンティア シニカ（SCIENTIA SIN
ICA)第３０巻、第５０３〜５０６頁（１９８７）に記載
されている。また、ジデオキシシークエンス法における
該ＤＮＡポリメラーゼと他のＤＮＡポリメラーゼとの比
較についてはバイオテクニクス（Biotechniques)、第１
１巻、第７６〜８７頁（１９９１）に記載されている。
上記記載例より該ＤＮＡポリメラーゼは大腸菌由来ＤＮ
ＡポリメラーゼＩ クレノウ断片と同様の性質を高温で
示すことが知られている。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】しかしながら、これま
で該ＤＮＡポリメラーゼの遺伝子構造やアミノ酸配列に
ついては不明であり、遺伝子の単離及び当該遺伝子をベ
クターに結合して遺伝子工学的に発現させる方法につい
ても明らかにされていない。本発明の目的は、新規なＤ
ＮＡポリメラーゼ遺伝子を特定し、該ＤＮＡ断片を含有
させた組換体プラスミドを導入させた形質転換体を用い
た新規なＤＮＡポリメラーゼの遺伝子工学的製造法を提
供することにある。

【０００４】

【課題を解決するための手段】本発明を概説すれば、本
発明の第１の発明はＤＮＡポリメラーゼ遺伝子に関する
発明であって、該遺伝子はプラスミドｐＵＩＦ１０１よ
り単離される。また、本発明の第２の発明はＤＮＡポリ
メラーゼの製造方法に関する発明であって、第１の発明
のＤＮＡポリメラーゼ遺伝子を組込んだプラスミドで形
質転換した形質転換体を培養し、該培養物からＤＮＡポ
リメラーゼを採取することを特徴とする。

【０００５】以下、本発明を具体的に説明する。本発明
に使用する菌株としてはＤＮＡポリメラーゼを産生する
菌株であれば何でもよく、例として、バチルス ステア
ロサーモフィラス ＩＡＭ １１００１（ＡＴＣＣ８０
０５）がある。

【０００６】本発明に係る形質転換体及びＤＮＡポリメ
ラーゼは次に例示する工程により得ることができる。 （１）バチルス・ステアロサーモフィラスから染色体Ｄ
ＮＡを抽出する。 （２）ＤＮＡポリメラーゼに共通な領域の情報を基に配
列表の配列番号１及び配列番号２に示すＤＮＡポリメラ
ーゼ遺伝子増幅用オリゴヌクレオチドプライマーを作成
し、（１）で得たＤＮＡを鋳型としてポリメラーゼ チ
ェイン リアクション（ＰＣＲ）を行う。 （３）（１）で得たＤＮＡを適当な制限酵素で切断し、
これに対して（２）で得たＤＮＡ断片をプローブとして
スクリーニングを行い、目的とするＤＮＡ断片を回収す
る。 （４）ベクターを制限酵素で開裂し、この開裂部位に
（３）で得たＤＮＡ断片を結合させる。 （５）ＤＮＡ断片を結合させたベクターを宿主に導入
し、目的のＤＮＡ断片を含む形質転換体を選択する。 （６）（５）で得た形質転換体からプラスミドを取出
し、目的のＤＮＡ断片を切り出して制限酵素地図を基に
目的の遺伝子全体を含む連続した一本の断片に再編成
し、これを（４）と同様の要領で発現ベクターに結合さ
せる。 （７）（６）で得た目的のＤＮＡ断片を含む発現ベクタ
ーを（５）と同じ要領で宿主に導入し、形質転換体を得
る。 （８）（７）で得た形質転換体を培養し、培養菌体より
ＤＮＡポリメラーゼを生産する。

【０００７】上記ＤＮＡ供与体であるバチルス ステア
ロサーモフィラス ＩＡＭ １１００１（ＡＴＣＣ８０
０５）由来ＤＮＡは５５℃で振とう培養した該培養菌体
より抽出する。抽出、精製、制限酵素による切断等は公
知の方法を用いることができ、当該方法の詳細は１９８
２年 コールドスプリング ハーバー ラボラトリー発
行、Ｔ．マニアティス（Ｔ．Maniastis ) ほか著、モレ
キュラー クローニング、ア ラボラトリー マニュア
ル（ Molecular Cloning, Ａ Laboratory Manual )第７
５〜１７８頁に記載されている。

【０００８】目的のＤＮＡ断片を選択する方法として
は、まず公知のＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列を比
較し、共通のアミノ酸配列を示す領域を基にしてオリゴ
デオキシリボヌクレオチドを合成する。ポリメラーゼの
アミノ酸配列については例えばジャーナル オブ バイ
オロジカル ケミストリー（ Journal of BiologicalCh
emistry ) 第２６４巻、第４２５５〜４２６３頁（１９
８９）に記載されているものを参考にすることができ
る。

【０００９】本発明者らは共通のアミノ酸配列に基づく
配列表の配列番号１及び配列番号２に示す２種のオリゴ
ヌクレオチドをプライマーとし、バチルス ステアロサ
ーモフィラスＤＮＡを鋳型に用いて、ＰＣＲ法により特
異的なＤＮＡ断片を増幅することを見出し、得られた断
片に塩基配列から推定されるアミノ酸配列が公知の他の
ＤＮＡポリメラーゼと類似していることを発見した。し
たがって、該ＤＮＡ断片をプローブに用いてハイブリダ
イゼーションを行うことにより目的のＤＮＡを選択する
ことができる。ハイブリダイゼーションによる選択の方
法自体は公知の方法、例えば前記モレキュラー クロー
ニング、ア ラボラトリー マニュアル、第３０９頁に
記載の方法を用いることができる。サザンハイブリダイ
ゼーション法により、目的のＤＮＡポリメラーゼ遺伝子
がバチルス ステアロサーモフィラスＤＮＡのどの制限
酵素断片上に存在するかを分析し、次に選択した制限酵
素例えばＥｃｏＲＩ、ＢａｍＨＩ、ＨincII 、ＨindII
I、ＸｈｏＩ、ＰｓｔＩ、ＰｖｕIIなどを用いて分解し
たバチルス ステアロサーモフィラスＤＮＡをプラスミ
ドベクターに組込む。プラスミドベクターとしては公知
のものが使用でき、例えばｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐ
ＴＶ１１８Ｎなどが挙げられるがこれらに限定されるも
のではない。また組込ませる手段についても公知の方法
が利用でき、ＤＮＡリガーゼを用いた酵素反応で組込ま
せればよい。

【００１０】次いで組換えプラスミドを宿主大腸菌に導
入させるが、宿主大腸菌としては、形質転換能を有する
ものであれば野生株、変異株のいずれも使用できるが、
制限系変異株で修飾系野生株（ｒ^- ，ｍ⁺ ）であること
が望ましい。導入の手段自体は公知の方法、例えば前記
モレキュラー クローニング、ア ラボラトリー マニ
ュアル 第２５０頁（１９８２）を用いることができ
る。このようにして目的のＤＮＡ断片を宿主に導入さ
せ、プラスミドベクターの特性、例えばｐＵＣ１８の場
合アンピシリン耐性を有するコロニーを選択することに
よりクローン化されたＤＮＡの集団を調製することがで
きる。次に上記集団の中から目的の断片を有するクロー
ンを選択する。選択の方法はベクターの種類によってコ
ロニーハイブリダイゼーション、プラークハイブリダイ
ゼーションを用いればよく、方法自体は公知のものであ
る。

【００１１】選択した３種類のクローン体よりそれぞれ
が所有するＨincII 断片、ＨindIII断片、ＸｈｏＩ断片
について制限酵素分解により詳細な解析の結果を基に上
記３断片を試験管内で再編成し、一本の連続したＤＮＡ
断片とし、該ＤＮＡ断片を発現ベクターｐＴＶ１１８Ｎ
に組込んで目的のクローンを得た。該プラスミドをｐＵ
ＩＦ１０１と命名した。プラスミドｐＵＩＦ１０１を有
する大腸菌を培養し、菌体の粗抽出液を得た。該抽出液
は６０℃、２０分処理後も十分量のＤＮＡポリメラーゼ
活性を示し、発現ベクターのみを有する大腸菌粗抽出液
ではこのような活性を有しないことより、ｐＵＩＦ１０
１上に耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ産生情報が存在し、か
つ、大腸菌内で該情報を有する遺伝子が発現していると
結論した。

【００１２】プラスミドｐＵＩＦ１０１の構築工程を図
１に示す。ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子はプラスミドｐＵ
ＩＦ１０１の約３．５kbのＮｃｏＩ断片にコードされて
おり、ジデオキシ法にて配列表の配列番号３に示される
該ＮｃｏＩ断片の塩基配列を決定した。その結果、本発
明者らによって発明され平成４年４月６日に特許出願さ
れた「ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子」明細書に記載されて
いる、バチルス カルドテナックス由来のＤＮＡポリメ
ラーゼ遺伝子の塩基配列と比べて、１７箇所の塩基置
換、７塩基の欠失、及び１塩基の挿入が認められた。

【００１３】ｐＵＩＦ１０１で形質転換された大腸菌で
最も増殖能のよかった宿主ＨＢ１０１を選択し、それは
Escherichia coli ＨＢ１０１／ｐＵＩＦ１０１と表示
して、工業技術院微生物工業技術研究所に微工研菌寄第
１２２３９号（ＦＥＲＭ Ｐ−１２２３９）として寄託
されている。

【００１４】ｐＵＩＦ１０１を保有する大腸菌を培養
し、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを大量に発現させた培養
菌体より耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの採取を行うことが
できる。培養菌体より、例えば、超音波処理、熱処理、
ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）セルロースカラムク
ロマトグラフィー、ホスホセルロースカラムクロマトグ
ラフィーの各処理を行い、ＤＮＡポリメラーゼをＳＤＳ
−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧ
Ｅ）で単一バンドを示すまで精製することができる。

【００１５】得られたＤＮＡポリメラーゼはＳＤＳ−Ｐ
ＡＧＥで約１０万ダルトンの分子量を示すポリペプチド
であり、ＤＮＡ合成活性、３′→５′エキソヌクレアー
ゼ活性のほかに５′→３′エキソヌクレアーゼ活性を有
している。

【００１６】前述のバチルス カルドテナックス由来Ｄ
ＮＡポリメラーゼ遺伝子との相同性、また分子量等より
前述ＮｃｏＩ断片中の配列表の配列番号４に示す翻訳可
能領域を、本発明のＤＮＡポリメラーゼの構造遺伝子と
決定し、該ＤＮＡポリメラーゼの全アミノ酸配列を明ら
かにした。そのアミノ酸配列を配列表の配列番号５に示
す。その結果、前述のバチルス カルドテナックス由来
のＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列と比べて２アミノ
酸の置換及び１アミノ酸の欠失が認められた。

【００１７】以上のようにして得られた形質転換体 Esc
herichia coli HB １０１／ｐＵＩＦ１０１の培養液１
mlから５００単位のＤＮＡポリメラーゼが得られ、工業
的な製造が可能になった。

【００１８】

【実施例】以下に本発明の実施例を挙げるが、本発明は
これら実施例に限定されるものではない。

【００１９】実施例１ （１）バチルス ステアロサーモフィラス染色体ＤＮＡ
の調製 バチルス ステアロサーモフィラス ＩＡＭ １１００
１（ＡＴＣＣ８００５）を１リットルのＬ培地（バクト
トリプトン１０ｇ／ｌ、酵母エキス５ｇ／ｌ、ＮａＣｌ
の５ｇ／ｌ、ｐＨ７．２）で６５℃一夜振とう培養し、
集菌した菌体を４mlの２５％ショ糖、０．０５Ｍ トリ
ス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）に懸濁し、リゾチーム（５mg
／ml）を８００μｌ加えて２０℃１時間放置した。ＳＥ
Ｔ溶液〔２０mM トリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１mM
ＥＤＴＡ、１５０mM ＮａＣｌ〕を２４ml加えた後、
５％ＳＤＳ溶液を４mlとプロティナーゼＫ（１０mg／m
l）を４００μｌ加えて３７℃、１時間放置した。フェ
ノール抽出、クロロホルム抽出の後、エタノールを加え
て長鎖ＤＮＡを不溶化し、滅菌したつまようじで巻取っ
て回収した。以上の操作により１．７mgのＤＮＡが得ら
れた。

【００２０】（２）ＰＣＲを用いた特異的ＤＮＡ断片の
増幅 配列表の配列番号１及び配列番号２に示した２種類のオ
リゴデオキシリボヌクレオチドをそれぞれ１００pmolと
バチルス ステアロサーモフィラスＤＮＡ１ngを用いて
全量１００μｌで９５℃３０秒、５５℃１分、７２℃２
分のＰＣＲを３０サイクル行った。５μｌをとりアガロ
ースゲル電気泳動で分析した結果、６００塩基対のＤＮ
Ａ断片が特異的に増幅していた。このＤＮＡ断片をＳｍ
ａＩで開環したＭ１３ファージｍｐ１８ベクターに組込
みジデオキシ法により塩基配列を分析した。

【００２１】（３）ゲノミックサザン法による目的の遺
伝子の検索 バチルス ステアロサーモフィラスＤＮＡを１つの酵素
につき５μｇ用いてＥｃｏＲＩ、ＢａｍＨＩ、ＨindII
I、ＨincII 、ＸｈｏＩ、ＰｓｔＩ、ＰｖｕIIで分解
し、アガロースゲル電気泳動に供した。ゲル中のＤＮＡ
をナイロン膜に移し、上記ＰＣＲにより得た６００塩基
対のＤＮＡ断片をプローブに用いてハイブリダイゼーシ
ョンを行った。プローブはランダムプライミング法によ
り放射性標識した。ハイブリダイゼーションは６×ＳＳ
Ｃ、１％ＳＤＳ、５×デンハーツ溶液、１００μｇ／ml
子牛胸腺ＤＮＡ中で６５℃５時間行った。１×ＳＳＣ、
０．１％ＳＤＳ溶液中で１時間洗浄した後、Ｘ線フィル
ムに感光し、オートラジオグラムをとった。

【００２２】（４）ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子を含むＤ
ＮＡ断片のクローン化 ゲノミックサザン分析で陽性を示したＨindIII（２．４
０kb）、ＨincII （１．４５kb）及びＸｈｏＩ（２．１
kb）ＤＮＡ断片をプラスミドベクター中にクローン化す
るため、バチルス ステアロサーモフィラスＤＮＡをそ
れぞれ１００μｇずつ、ＨindIII、ＨincII 、ＸｈｏＩ
で分解し、目的の大きさのＤＮＡをアガロースゲルより
回収した。回収はガラスビーズ吸着法を用いた。ｐＴＶ
１１８Ｎプラスミドをそれぞれ同じ酵素で開環し、アル
カリ性ホスファターゼで末端のリン酸基を除去したベク
ターを加えてＤＮＡリガーゼにより結合した後、大腸菌
ＪＭ１０９に導入した。得られた組換体の集団の中から
コロニーハイブリダイゼーションによって目的のクロー
ンを選択した。ナイロン膜上に生育させた組換体のコロ
ニー５０個〜２００個を０．５Ｎ 水酸化ナトリウム、
１．５Ｍ 塩化ナトリウム溶液で変性させた後、１Ｍ
トリス−ＨＣｌ、１．５Ｍ 塩化ナトリウム（ｐＨ７．
０）溶液で中和し、紫外線照射でファージＤＮＡを膜上
に固定した。プローブ調製及びハイブリダイゼーション
の条件はゲノミックサザン分析に準じた。

【００２３】（５）クローン化断片に制限酵素分析及び
ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子の再編成 得られた３種類のＤＮＡ断片について制限酵素地図を作
製した結果、上記３断片はＨincII −ＨindIII−Ｘｈｏ
Ｉの順にそれぞれ重なり合い、連続して染色体ＤＮＡ上
に存在することが判明した。必要以外の連結ができるだ
け起こらないように制限酵素切断部位を選択し、図１に
示すように、３種のＤＮＡ断片とベクターｐＴＶ１１８
Ｎを同時に連結させ、ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子を含む
約３．５kbのＤＮＡ断片を組込んだプラスミドを構築
し、ｐＵＩＦ１０１と命名した。なお、図１はｐＵＩＦ
１０１の構築を示す工程図である。次に該プラスミドで
大腸菌ＨＢ１０１株を形質転換し、形質転換体 Escheri
chia coli ＨＢ１０１／ｐＵＩＦ１０１（ＦＥＲＭ Ｐ
−１２２３９）を得た。

【００２４】（６）形質転換体の培養及び粗抽出液の調
製 上記組換えプラスミドｐＵＩＦ１０１を有する大腸菌Ｈ
Ｂ１０１（ＦＥＲＭＰ−１２２３９）をアンピシリンが
１００μｇ／mlの濃度で存在するＬ培地５mlに植菌し３
７℃で培養した。培養液の濁度が０．６（Ａ₆₀₀ ）のと
き、誘導物質であるイソプロピル−β−Ｄ−チオガラク
トシド（ＩＰＴＧ）を添加し、更に１５時間培養を行っ
た。培養液１mlから集菌し、５０mM トリス−ＨＣｌ
（ｐＨ８．０）、２５％スクロース溶液で洗浄した。同
じ溶液に再溶解した後、同量のリシス溶液〔５０mMトリ
ス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、２５％ショ糖、６０mM ス
ペルミジン・一塩酸、２０mM 塩化ナトリウム、１２mM
ＤＴＴ〕を加え、４℃で４５分間静置した。更に５％
（ｗ／ｖ）トリトンＸ１００( TritonＸ１００）を２０
μｌ加え、３７℃で５分間静置した後、遠心分離により
上清を回収し、６０℃、２０分静置した後再度遠心分離
した上清を回収し、粗抽出液とした。

【００２５】（７）ＤＮＡポリメラーゼ活性測定 反応溶液として６７mM リン酸カリウム（ｐＨ７．
４）、６．７mM 塩化マグネシウム、１mM ２−メルカ
プトエタノール、２０μＭ 活性化ＤＮＡ、３３μＭ
ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ＴＴＰ、６０nM
〔 ³Ｈ〕ＴＴＰを用意し、この溶液１５０μｌに対して
適当量の粗抽出液を加え、６０℃、５分反応させた後、
５０mM ピロリン酸、１０％トリクロロ酢酸を１ml加え
て反応を停止させた。氷中で５分間静置した後、全量を
グラスフィルター上に移し、吸引ろ過した。１０％ＴＣ
Ａで数回洗浄した後、７０％エタノールで置換し、フィ
ルターを乾燥して液体シンチレーションカウンターでフ
ィルター上の放射活性を測定した。１mlの培養液から５
００単位のＤＮＡポリメラーゼが得られた。

【００２６】（８）プラスミドｐＵＩＦ１０１を導入し
た大腸菌による耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの生産 大腸菌ＨＢ１０１／ｐＵＩＦ１０１の菌体３．０ｇより
精製を開始し、実施例１−（６）で示した方法により２
０mlの粗抽出液を得た。これらを６０℃で３０分間イン
キュベートした後、熱変性したタンパク質を遠心分離し
た（１２０００rpm 、１０分）。この上清に硫酸アンモ
ニウムを加えていき、３０〜８０％飽和で沈殿する画分
をとってＤＥ緩衝液〔５０mM トリス−ＨＣｌ ｐＨ
７．０、２mM ２−メルカプトエタノール、１０％グリ
セロール、４μＭ フェニルメタンスルホニルフルオリ
ド（ＰＭＳＦ）〕で透析した後、同じ緩衝液で平衡化し
たＤＥ５２（ワットマン社）カラム１５mlに添加し０mM
〜３００mM ＮａＣｌの直線濃度勾配で溶出して分画
し、実施例１−（７）に従ってＤＮＡポリメラーゼ活性
を調べた。次に活性画分を集めてＤＥ緩衝液で透析し、
ＤＥ緩衝液で平衡化したＰ−１１（ワットマン社）カラ
ム１５mlに添加した。次に０mM〜３００mM ＮａＣｌ直
線濃度勾配で溶出し活性画分を集めた。Ｐ１１画分の酵
素標品をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析したところ、分子量約
１０万ダルトンの単一バンドを与えた。

【００２７】実施例２ （１）ＤＮＡポリメラーゼの構造遺伝子を含むバチルス
ステアロサーモフィラス染色体ＤＮＡ塩基配列の決定 ジデオキシ法により、配列表の配列番号３に示すｐＵＩ
Ｆ１０１のＮｃｏＩ−ＮｃｏＩ断片の塩基配列を決定し
た。決定した塩基配列を前述のバチルス カルドテナッ
クス由来ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子の塩基配列と比較し
構造遺伝子を推定することにより、バチルス ステアロ
サーモフィラスＤＮＡポリメラーゼの全アミノ酸配列を
推定した。

【００２８】

【発明の効果】以上詳細に説明したように本発明により
新規なＤＮＡポリメラーゼの遺伝子構造が明らかとな
り、遺伝子工学研究用試薬として有用なＤＮＡポリメラ
ーゼの遺伝子工学的製造法が提供された。

【配列表】

配列番号：１ 配列の長さ：23 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） アンチセンス：NO 配列の特徴：1-23 S primer 配列： GAYCCHAACY TSCARAAYAT HCC 23 配列番号：2 配列の長さ：21 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） アンチセンス：YES 配列の特徴：1-21 S primer 配列： KASNAKYTCR TCRTGNACYT G 21 配列番号：３ 配列の長さ：3246 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：genomic DNA 起源：生物名：バチルス ステアロサーモフィラス (Bacillus stearothermophilus) 株名：IAM11001 (ATCC8005) 配列： CCATGGATAT ATTACCGTAG CGAGCAAAGT GGGGCGCGGC ACCGTGTTCA CGATCCATTT 60 TCCAAAGCCG GGGCGGTAGC CGGCTTCTTT TTATCATCTC CAACTGAGAA GCCTGCCATT 120 TTTCAGCGTG AGCGTAAGCA CGGGATGAAT CGGCGCCTCC CATCATGGTG GGAGAGCGTT 180 CAAGGCAAGC CGCAGGCATG GTACAATAGG ACAAGGAAGC ATCCGAGGAG GGATGAGA 238 TTG AAA AAA AAG CTT GTT TTA ATC GAC GGC AGC AGC GTG GCG TAC 283 CGC GCC TTT TTC GCC TTG CCG CTT TTG CAT AAC GAC AAA GGC ATC 328 CAT ACG AAC GCC GTC TAC GGG TTT ACG ATG ATG TTG AAT AAA ATT 373 TTG GCG GAA GAA GAG CCA ACT CAT ATG CTT GTC GCG TTT GAC GCC 418 GGG AAA ACG ACG TTC CGG CAT GAA GCG TTT CAA GAG TAT AAA GGT 463 GGG CGC CAG CAG ACG CCA CCG GAG CTG TCG GAG CAG TTT CCG CTG 508 TTG CGC GAG CTG CTG AGG GCG TAT CGC ATC CCC GCC TAT GAA CTC 553 GAG AAC TAC GAA GCG GAC GAT ATT ATC GGA ACG CTT GCC GCC CGC 598 GCT GAG CAG GAA GGG TTT GAG GTG AAA GTC ATT TCC GGC GAC CGC 643 GAT CTG ACC CAG CTC GCC TCC CCC CAT GTG ACG GTG GAC ATT ACG 688 AAA AAA GGG ATT ACC GAT ATC GAA CCG TAC ACG CCG GAG ACG GTC 733 CGC GAA AAA TAC GGC TTA ACT CCG GAA CAA ATC GTT GAT TTG AAA 778 GGA TTG ATG GGC GAC AAA TCG GAC AAC ATC CCC GGA GTG CCG GGC 823 ATC GGG GAA AAG ACG GCG GTC AAG CTG CTC AGG CAA TTC GGC ACG 868 GTC GAA AAC GTG CTT GCC TCC ATT GAC GAG ATC AAA GGC GAA AAG 913 TTG AAA GAA ACG TTG CGC CAA CAC CGG GAG ATG GCG CTG TTA AGC 958 AAA AAG CTC GCC GCC ATT CGC CGC GAC GCC CCG GTC GAG CTC TCG 1003 CTT GAT GAC ATC GCC TAT CAA GGG GAA GAC CGG GAG AAA GTG GTC 1048 GCT TTA TTT AAA GAG CTT GGG TTT CAA TCG TTT TTA GAG AAA ATG 1093 GAA TCG CCG TCA TCA GAA GAG GAA AAA CCG CTT GCC AAG ATG GCA 1138 TTT ACG CTT GCT GAC CGC GTG ACG GAG GAG ATG CTT GCC GAC AAG 1183 GCG GCG CTT GTC GTT GAA GTG GTC GAG GAA AAT TAT CAT GAT GCG 1228 CCG ATC GTC GGC ATC GCT GTG GTC AAC GAA CAT GGA CGG TTT TTC 1273 CTG CGC CCG GAG ACG GCG CTT GCC GAT CCG CAG TTT GTC GCC TGG 1318 CTT GGT GAT GAA ACG AAG AAA AAA AGC ATG TTT GAC TCA AAG CGC 1363 GCG GCA GTC GCC TTG AAA TGG AAA GGA ATT GAG CTA TGC GGC GTT 1408 TCC TTT GAT TTA TTG CTG GCC GCC TAT TTG CTT GAT CCG GCG CAA 1453 GGT GTT GAT GAT GTG GCT GCC GCA GCA AAA ATG AAG CAA TAC GAA 1498 GCG GTG CGC TCG GAT GAA GCG GTG TAT GGC AAA GGG GCG AAG CGG 1543 GCC GTG CCG GAT GAG CCA GTG CTC GCC GAG CAT CTC GTC CGC AAG 1588 GCG GCG GCG ATT TGG GCG CTC GAA CGT CCG TTT TTG GAT GAG CTG 1633 CGC CGC AAC GAA CAA GAT AGG TTG CTC GTC GAG CTC GAG CAG CCG 1678 TTG TCT TCG ATT TTG GCG GAA ATG GAA TTT GCC GGA GTG AAA GTG 1723 GAT ACG AAG CGG CTC GAA CAG ATG GGC GAA GAG CTC GCC GAG CAG 1768 CTG CGC ACG GTC GAG CAG CGC ATT TAT GAG CTC GCC GGC CAA GAA 1813 TTC AAC ATC AAT TCA CCG AAA CAG CTC GGC GTC ATT TTA TTT GAA 1858 AAA CTG CAG CTG CCC GTC TTG AAA AAA AGC AAA ACC GGC TAC TCC 1903 ACT TCG GCG GAT GTG CTT GAA AAA CTT GCG CCT TAT CAC GAG ATC 1948 GTG GAA AAC ATT TTG CAT TAC CGC CAG CTT GGC AAG TTG CAG TCG 1993 ACG TAT ATT GAA GGA TTG CTG AAA GTC GTG CGA CCC GAT ACA AAG 2038 AAG GTG CAT ACG ATT TTC AAT CAG GCG TTG ACG CAA ACC GGA CGG 2083 CTC AGC TCG ACG GAG CCG AAC TTG CAA AAC ATT CCG ATT CGG CTT 2128 GAG GAA GGA CGG AAA ATC CGC CAA GCG TTC GTG CCG TCG GAG TCT 2173 GAT TGG CTC ATT TTC GCA GCC GAC TAC TCG CAA ATT GAG TTG CGC 2218 GTC CTC GCC CAT ATT GCG GAA GAT GAC AAT TTA ATG GAA GCG TTC 2263 CGC CGC GAT TTG GAT ATC CAT ACG AAA ACA GCG ATG GAC ATT TTC 2308 CAA GTG AGC GAG GAC GAA GTG ACG CCC AAC ATG CGC CGT CAG GCG 2353 AAG GCG GTC AAC TTT GGG ATC GTT TAC GGG ATC AGT GAT TAC GGC 2398 TTG GCG CAA AAC TTA AAT ATT TCA CGC AAA GAG GCC GCT GAA TTC 2443 ATC GAG CGC TAC TTC GAA AGC TTC CCT GGC GTG AAG CGG TAT ATG 2487 GAA AAC ATT GTG CAA GAA GCA AAA CAG AAA GGG TAT GTG ACG ACG 2532 CTG CTG CAT CGG CGC CGC TAT TTG CCG GAT ATC ACG AGC CGC AAC 2578 TTC AAC GTC CGC AGC TTT GCT GAA CGG ATG GCG ATG AAC ACG CCG 2623 ATT CAA GGG AGC GCC GCT GAC ATT ATT AAA AAG GCG ATG ATC GAT 2668 CTG AAC GCT AGA CTG AAG GAA GAG CGG CTG CAA GCG CGC CTT TTG 2713 CTA CAG GTG CAT GAC GAG CTC ATT TTG GAG GCG CCG AAA GAA GAG 2758 ATG GAG CGG CTG TGC CGG CTC GTT CCG GAA GTG ATG GAG CAA GCG 2803 GTC ACA CTT CGC GTG CCG CTC AAA GTC GAT TAC CAT TAT GGC TCG 2848 ACG TGG TAT GAC GCG AAA TAAAAAGGAG TCTTGGTGTG GATCGCCGGC 2896 ACCCCTAAAA GGCCGGTGAT TTAAGGGGAA ATACTGCTCT CCAACAGTGT TTCTCAAATT 2956 GAAAAACCTT GCAACACCAT CACTTCATTC CTTGTGATTT CTCATAAATC AAGCGAATCC 3016 ATTGTTTTTC ATCAGCCTTC TAAGAAGGCC TGTGATGGAA TGAAAAAGCA GTTTCACAAC 3076 GACTCTTCTC CAGTTGAGAA GCCTTGGGAC ATCGAGTCGT CCTTCTCAAC CAACATGACC 3136 GATTTTGCGA AAATCAGCGT TTCTCACCGG CCTTCTAGGC AGAATCTTTC GGTGCGACGA 3196 TTCTCGGCTG CAACTCGATG AATTGGAGCG AAACAGCTGC CGCCCCATGG 3246 配列番号：４ 配列の長さ：2628 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：genomic DNA 起源：生物名：バチルス ステアロサーモフィラス (Bacillus stearothermophilus) 株名：IAM11001 (ATCC8005) 配列： TTG AAA AAA AAG CTT GTT TTA ATC GAC GGC AGC AGC GTG GCG TAC 45 CGC GCC TTT TTC GCC TTG CCG CTT TTG CAT AAC GAC AAA GGC ATC 90 CAT ACG AAC GCC GTC TAC GGG TTT ACG ATG ATG TTG AAT AAA ATT 135 TTG GCG GAA GAA GAG CCA ACT CAT ATG CTT GTC GCG TTT GAC GCC 180 GGG AAA ACG ACG TTC CGG CAT GAA GCG TTT CAA GAG TAT AAA GGT 225 GGG CGC CAG CAG ACG CCA CCG GAG CTG TCG GAG CAG TTT CCG CTG 270 TTG CGC GAG CTG CTG AGG GCG TAT CGC ATC CCC GCC TAT GAA CTC 315 GAG AAC TAC GAA GCG GAC GAT ATT ATC GGA ACG CTT GCC GCC CGC 360 GCT GAG CAG GAA GGG TTT GAG GTG AAA GTC ATT TCC GGC GAC CGC 405 GAT CTG ACC CAG CTC GCC TCC CCC CAT GTG ACG GTG GAC ATT ACG 450 AAA AAA GGG ATT ACC GAT ATC GAA CCG TAC ACG CCG GAG ACG GTC 495 CGC GAA AAA TAC GGC TTA ACT CCG GAA CAA ATC GTT GAT TTG AAA 540 GGA TTG ATG GGC GAC AAA TCG GAC AAC ATC CCC GGA GTG CCG GGC 585 ATC GGG GAA AAG ACG GCG GTC AAG CTG CTC AGG CAA TTC GGC ACG 630 GTC GAA AAC GTG CTT GCC TCC ATT GAC GAG ATC AAA GGC GAA AAG 675 TTG AAA GAA ACG TTG CGC CAA CAC CGG GAG ATG GCG CTG TTA AGC 720 AAA AAG CTC GCC GCC ATT CGC CGC GAC GCC CCG GTC GAG CTC TCG 765 CTT GAT GAC ATC GCC TAT CAA GGG GAA GAC CGG GAG AAA GTG GTC 810 GCT TTA TTT AAA GAG CTT GGG TTT CAA TCG TTT TTA GAG AAA ATG 855 GAA TCG CCG TCA TCA GAA GAG GAA AAA CCG CTT GCC AAG ATG GCA 900 TTT ACG CTT GCT GAC CGC GTG ACG GAG GAG ATG CTT GCC GAC AAG 945 GCG GCG CTT GTC GTT GAA GTG GTC GAG GAA AAT TAT CAT GAT GCG 990 CCG ATC GTC GGC ATC GCT GTG GTC AAC GAA CAT GGA CGG TTT TTC 1035 CTG CGC CCG GAG ACG GCG CTT GCC GAT CCG CAG TTT GTC GCC TGG 1080 CTT GGT GAT GAA ACG AAG AAA AAA AGC ATG TTT GAC TCA AAG CGC 1125 GCG GCA GTC GCC TTG AAA TGG AAA GGA ATT GAG CTA TGC GGC GTT 1170 TCC TTT GAT TTA TTG CTG GCC GCC TAT TTG CTT GAT CCG GCG CAA 1215 GGT GTT GAT GAT GTG GCT GCC GCA GCA AAA ATG AAG CAA TAC GAA 1260 GCG GTG CGC TCG GAT GAA GCG GTG TAT GGC AAA GGG GCG AAG CGG 1305 GCC GTG CCG GAT GAG CCA GTG CTC GCC GAG CAT CTC GTC CGC AAG 1350
GCG GCG GCG ATT TGG GCG CTC GAA CGT CCG TTT TTG GAT GAG CTG 1395 CGC CGC AAC GAA CAA GAT AGG TTG CTC GTC GAG CTC GAG CAG CCG 1440 TTG TCT TCG ATT TTG GCG GAA ATG GAA TTT GCC GGA GTG AAA GTG 1485 GAT ACG AAG CGG CTC GAA CAG ATG GGC GAA GAG CTC GCC GAG CAG 1530 CTG CGC ACG GTC GAG CAG CGC ATT TAT GAG CTC GCC GGC CAA GAA 1575 TTC AAC ATC AAT TCA CCG AAA CAG CTC GGC GTC ATT TTA TTT GAA 1620 AAA CTG CAG CTG CCC GTC TTG AAA AAA AGC AAA ACC GGC TAC TCC 1665 ACT TCG GCG GAT GTG CTT GAA AAA CTT GCG CCT TAT CAC GAG ATC 1710 GTG GAA AAC ATT TTG CAT TAC CGC CAG CTT GGC AAG TTG CAG TCG 1755 ACG TAT ATT GAA GGA TTG CTG AAA GTC GTG CGA CCC GAT ACA AAG 1800 AAG GTG CAT ACG ATT TTC AAT CAG GCG TTG ACG CAA ACC GGA CGG 1845 CTC AGC TCG ACG GAG CCG AAC TTG CAA AAC ATT CCG ATT CGG CTT 1890 GAG GAA GGA CGG AAA ATC CGC CAA GCG TTC GTG CCG TCG GAG TCT 1935 GAT TGG CTC ATT TTC GCA GCC GAC TAC TCG CAA ATT GAG TTG CGC 1980 GTC CTC GCC CAT ATT GCG GAA GAT GAC AAT TTA ATG GAA GCG TTC 2025 CGC CGC GAT TTG GAT ATC CAT ACG AAA ACA GCG ATG GAC ATT TTC 2070 CAA GTG AGC GAG GAC GAA GTG ACG CCC AAC ATG CGC CGT CAG GCG 2115 AAG GCG GTC AAC TTT GGG ATC GTT TAC GGG ATC AGT GAT TAC GGC 2160 TTG GCG CAA AAC TTA AAT ATT TCA CGC AAA GAG GCC GCT GAA TTC 2205 ATC GAG CGC TAC TTC GAA AGC TTC CCT GGC GTG AAG CGG TAT ATG 2250 GAA AAC ATT GTG CAA GAA GCA AAA CAG AAA GGG TAT GTG ACG ACG 2295 CTG CTG CAT CGG CGC CGC TAT TTG CCG GAT ATC ACG AGC CGC AAC 2340 TTC AAC GTC CGC AGC TTT GCT GAA CGG ATG GCG ATG AAC ACG CCG 2385 ATT CAA GGG AGC GCC GCT GAC ATT ATT AAA AAG GCG ATG ATC GAT 2430 CTG AAC GCT AGA CTG AAG GAA GAG CGG CTG CAA GCG CGC CTT TTG 2475 CTA CAG GTG CAT GAC GAG CTC ATT TTG GAG GCG CCG AAA GAA GAG 2520 ATG GAG CGG CTG TGC CGG CTC GTT CCG GAA GTG ATG GAG CAA GCG 2565 GTC ACA CTT CGC GTG CCG CTC AAA GTC GAT TAC CAT TAT GGC TCG 2610 ACG TGG TAT GAC GCG AAA 2628 配列番号：５ 配列の長さ：876 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列： Met Lys Lys Lys Leu Val Leu Ile Asp Gly Ser Ser Val Ala Tyr 1 5 10 15 Arg Ala Phe Phe Ala Leu Pro Leu Leu His Asn Asp Lys Gly Ile 20 25 30 His Thr Asn Ala Val Tyr Gly Phe Thr Met Met Leu Asn Lys Ile 35 40 45 Leu Ala Glu Glu Glu Pro Thr His Met Leu Val Ala Phe Asp Ala 50 55 60 Gly Lys Thr Thr Phe Arg His Glu Ala Phe Gln Glu Tyr Lys Gly 65 70 75 Gly Arg Gln Gln Thr Pro Pro Glu Leu Ser Glu Gln Phe Pro Leu 80 85 90 Leu Arg Glu Leu Leu Arg Ala Tyr Arg Ile Pro Ala Tyr Glu Leu 95 100 105 Glu Asn Tyr Glu Ala Asp Asp Ile Ile Gly Thr Leu Ala Ala Arg 110 115 120 Ala Glu Gln Glu Gly Phe Glu Val Lys Val Ile Ser Gly Asp Arg 125 130 135 Asp Leu Thr Gln Leu Ala Ser Pro His Val Thr Val Asp Ile Thr 140 145 150 Lys Lys Gly Ile Thr Asp Ile Glu Pro Tyr Thr Pro Glu Thr Val 155 160 165 Arg Glu Lys Tyr Gly Leu Thr Pro Glu Gln Ile Val Asp Leu Lys 170 175 180 Gly Leu Met Gly Asp Lys Ser Asp Asn Ile Pro Gly Val Pro Gly 185 190 195 Ile Gly Glu Lys Thr Ala Val Lys Leu Leu Arg Gln Phe Gly Thr 200 205 210 Val Glu Asn Val Leu Ala Ser Ile Asp Glu Ile Lys Gly Glu Lys 215 220 225 Leu Lys Glu Thr Leu Arg Gln His Arg Glu Met Ala Leu Leu Ser 230 235 240 Lys Lys Leu Ala Ala Ile Arg Arg Asp Ala Pro Val Glu Leu Ser 245 250 255 Leu Asp Asp Ile Ala Tyr Gln Gly Glu Asp Arg Glu Lys Val Val 260 265 270 Ala Leu Phe Lys Glu Leu Gly Phe Gln Ser Phe Leu Glu Lys Met 275 280 285 Glu Ser Pro Ser Ser Glu Glu Glu Lys Pro Leu Ala Lys Met Ala 290 295 300 Phe Thr Leu Ala Asp Arg Val Thr Glu Glu Met Leu Ala Asp Lys 305 310 315 Ala Ala Leu Val Val Glu Val Val Glu Glu Asn Tyr His Asp Ala 320 325 330 Pro Ile Val Gly Ile Ala Val Val Asn Glu His Gly Arg Phe Phe 335 340 345 Leu Arg Pro Glu Thr Ala Leu Ala Asp Pro Gln Phe Val Ala Trp 350 355 360 Leu Gly Asp Glu Thr Lys Lys Lys Ser Met Phe Asp Ser Lys Arg 365 370 375 Ala Ala Val Ala Leu Lys Trp Lys Gly Ile Glu Leu Cys Gly Val 380 385 390 Ser Phe Asp Leu Leu Leu Ala Ala Tyr Leu Leu Asp Pro Ala Gln 395 400 405 Gly Val Asp Asp Val Ala Ala Ala Ala Lys Met Lys Gln Tyr Glu 410 415 420 Ala Val Arg Ser Asp Glu Ala Val Tyr Gly Lys Gly Ala Lys Arg 425 430 435 Ala Val Pro Asp Glu Pro Val Leu Ala Glu His Leu Val Arg Lys 440 445 450 Ala Ala Ala Ile Trp Ala Leu Glu Arg Pro Phe Leu Asp Glu Leu 455 460 465 Arg Arg Asn Glu Gln Asp Arg Leu Leu Val Glu Leu Glu Gln Pro 470 475 480 Leu Ser Ser Ile Leu Ala Glu Met Glu Phe Ala Gly Val Lys Val 485 490 495 Asp Thr Lys Arg Leu Glu Gln Met Gly Glu Glu Leu Ala Glu Gln 500 505 510 Leu Arg Thr Val Glu Gln Arg Ile Tyr Glu Leu Ala Gly Gln Glu 515 520 525 Phe Asn Ile Asn Ser Pro Lys Gln Leu Gly Val Ile Leu Phe Glu 530 535 540 Lys Leu Gln Leu Pro Val Leu Lys Lys Ser Lys Thr Gly Tyr Ser 545 550 555 Thr Ser Ala Asp Val Leu Glu Lys Leu Ala Pro Tyr His Glu Ile 560 565 570 Val Glu Asn Ile Leu His Tyr Arg Gln Leu Gly Lys Leu Gln Ser 575 580 585 Thr Tyr Ile Glu Gly Leu Leu Lys Val Val Arg Pro Asp Thr Lys 590 595 600 Lys Val His Thr Ile Phe Asn Gln Ala Leu Thr Gln Thr Gly Arg 605 610 615 Leu Ser Ser Thr Glu Pro Asn Leu Gln Asn Ile Pro Ile Arg Leu 620 625 630 Glu Glu Gly Arg Lys Ile Arg Gln Ala Phe Val Pro Ser Glu Ser 635 640 645 Asp Trp Leu Ile Phe Ala Ala Asp Tyr Ser Gln Ile Glu Leu Arg 650 655 660 Val Leu Ala His Ile Ala Glu Asp Asp Asn Leu Met Glu Ala Phe 665 670 675 Arg Arg Asp Leu Asp Ile His Thr Lys Thr Ala Met Asp Ile Phe 680 685 690 Gln Val Ser Glu Asp Glu Val Thr Pro Asn Met Arg Arg Gln Ala 695 700 705 Lys Ala Val Asn Phe Gly Ile Val Tyr Gly Ile Ser Asp Tyr Gly 710 715 720 Leu Ala Gln Asn Leu Asn Ile Ser Arg Lys Glu Ala Ala Glu Phe 725 730 735 Ile Glu Arg Tyr Phe Glu Ser Phe Pro Gly Val Lys Arg Tyr Met 740 745 750 Glu Asn Ile Val Gln Glu Ala Lys Gln Lys Gly Tyr Val Thr Thr 755 760 765 Leu Leu His Arg Arg Arg Tyr Leu Pro Asp Ile Thr Ser Arg Asn 770 775 780 Phe Asn Val Arg Ser Phe Ala Glu Arg Met Ala Met Asn Thr Pro 785 790 795 Ile Gln Gly Ser Ala Ala Asp Ile Ile Lys Lys Ala Met Ile Asp 800 805 810 Leu Asn Ala Arg Leu Lys Glu Glu Arg Leu Gln Ala Arg Leu Leu 815 820 825 Leu Gln Val His Asp Glu Leu Ile Leu Glu Ala Pro Lys Glu Glu 830 835 840 Met Glu Arg Leu Cys Arg Leu Val Pro Glu Val Met Glu Gln Ala 845 850 855 Val Thr Leu Arg Val Pro Leu Lys Val Asp Tyr His Tyr Gly Ser 860 865 870 Thr Trp Tyr Asp Ala Lys 875

【図面の簡単な説明】

【図１】ｐＵＩＦ１０１の構築を示す工程図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 加藤 郁之進 滋賀県大津市瀬田３丁目４番１号 寳酒造 株式会社中央研究所内

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 プラスミドｐＵＩＦ１０１より単離され
   るＤＮＡポリメラーゼ遺伝子。
2. 【請求項２】 請求項１に記載のＤＮＡポリメラーゼ遺
   伝子を組込んだプラスミドで形質転換した形質転換体を
   培養し、該培養物からＤＮＡポリメラーゼを採取するこ
   とを特徴とするＤＮＡポリメラーゼの製造方法。