JPH05304964A - Dnaポリメラーゼ遺伝子 - Google Patents
Dnaポリメラーゼ遺伝子Info
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- JPH05304964A JPH05304964A JP13140092A JP13140092A JPH05304964A JP H05304964 A JPH05304964 A JP H05304964A JP 13140092 A JP13140092 A JP 13140092A JP 13140092 A JP13140092 A JP 13140092A JP H05304964 A JPH05304964 A JP H05304964A
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 新規なDNAポリメラーゼ遺伝子を特定し、
該遺伝子を用いた該新規なDNAポリメラーゼの遺伝子
工学的製造法を提供する。 【構成】 プラスミドpUIF101より単離されるD
NAポリメラーゼ遺伝子。該遺伝子を組込んだプラスミ
ドで形質転換した形質転換体を培養し、該培養物からD
NAポリメラーゼを採取するDNAポリメラーゼの製造
方法。 【効果】 このDNAポリメラーゼは、遺伝子工学研究
用試薬として有用である。
該遺伝子を用いた該新規なDNAポリメラーゼの遺伝子
工学的製造法を提供する。 【構成】 プラスミドpUIF101より単離されるD
NAポリメラーゼ遺伝子。該遺伝子を組込んだプラスミ
ドで形質転換した形質転換体を培養し、該培養物からD
NAポリメラーゼを採取するDNAポリメラーゼの製造
方法。 【効果】 このDNAポリメラーゼは、遺伝子工学研究
用試薬として有用である。
Description
【0001】
【産業上の利用分野】本発明は、DNAポリメラーゼ遺
伝子及び遺伝子工学研究用試薬として有用な酵素である
DNAポリメラーゼの製法に関する。
伝子及び遺伝子工学研究用試薬として有用な酵素である
DNAポリメラーゼの製法に関する。
【0002】
【従来の技術】今まで遺伝子工学研究用試薬として一般
に利用されているDNAポリメラーゼには、大腸菌DN
Aポリメラーゼ、その改変型であるクレノウ断片、T4
ファージ由来DNAポリメラーゼ、T7ファージ由来D
NAポリメラーゼ、サーマスアクアティカス由来耐熱性
DNAポリメラーゼ〔タック( Taq )ポリメラーゼ〕等
がある。これらの酵素は、その有する性質に応じて特定
のDNAの標識化や、DNA塩基配列決定法などにそれ
ぞれ利用されている。一般にDNAポリメラーゼはその
起源による酵素特異性を有しており、その特性を生かし
た利用法がある。例えばバチルス ステアロサーモフィ
ラス(Bacillus Stearothermophilus)は生育至適温度が
約65℃である好熱性細菌である。この細菌由来のDN
Aポリメラーゼの単離・精製についてはジャーナル オ
ブ バクテリオロジー(Journal of Bacteriology)、第
145巻、第21〜26頁(1981)に記載されてい
る。また、該DNAポリメラーゼをプロテアーゼである
ズブチリシン(Subtilisin)で処理して5′→3′エキ
ソヌクレアーゼ活性を有する領域を除去したラージフラ
グメントの調製及びそのジデオキシシークエンス法への
応用について、サイエンティア シニカ(SCIENTIA SIN
ICA)第30巻、第503〜506頁(1987)に記載
されている。また、ジデオキシシークエンス法における
該DNAポリメラーゼと他のDNAポリメラーゼとの比
較についてはバイオテクニクス(Biotechniques)、第1
1巻、第76〜87頁(1991)に記載されている。
上記記載例より該DNAポリメラーゼは大腸菌由来DN
AポリメラーゼI クレノウ断片と同様の性質を高温で
示すことが知られている。
に利用されているDNAポリメラーゼには、大腸菌DN
Aポリメラーゼ、その改変型であるクレノウ断片、T4
ファージ由来DNAポリメラーゼ、T7ファージ由来D
NAポリメラーゼ、サーマスアクアティカス由来耐熱性
DNAポリメラーゼ〔タック( Taq )ポリメラーゼ〕等
がある。これらの酵素は、その有する性質に応じて特定
のDNAの標識化や、DNA塩基配列決定法などにそれ
ぞれ利用されている。一般にDNAポリメラーゼはその
起源による酵素特異性を有しており、その特性を生かし
た利用法がある。例えばバチルス ステアロサーモフィ
ラス(Bacillus Stearothermophilus)は生育至適温度が
約65℃である好熱性細菌である。この細菌由来のDN
Aポリメラーゼの単離・精製についてはジャーナル オ
ブ バクテリオロジー(Journal of Bacteriology)、第
145巻、第21〜26頁(1981)に記載されてい
る。また、該DNAポリメラーゼをプロテアーゼである
ズブチリシン(Subtilisin)で処理して5′→3′エキ
ソヌクレアーゼ活性を有する領域を除去したラージフラ
グメントの調製及びそのジデオキシシークエンス法への
応用について、サイエンティア シニカ(SCIENTIA SIN
ICA)第30巻、第503〜506頁(1987)に記載
されている。また、ジデオキシシークエンス法における
該DNAポリメラーゼと他のDNAポリメラーゼとの比
較についてはバイオテクニクス(Biotechniques)、第1
1巻、第76〜87頁(1991)に記載されている。
上記記載例より該DNAポリメラーゼは大腸菌由来DN
AポリメラーゼI クレノウ断片と同様の性質を高温で
示すことが知られている。
【0003】
【発明が解決しようとする課題】しかしながら、これま
で該DNAポリメラーゼの遺伝子構造やアミノ酸配列に
ついては不明であり、遺伝子の単離及び当該遺伝子をベ
クターに結合して遺伝子工学的に発現させる方法につい
ても明らかにされていない。本発明の目的は、新規なD
NAポリメラーゼ遺伝子を特定し、該DNA断片を含有
させた組換体プラスミドを導入させた形質転換体を用い
た新規なDNAポリメラーゼの遺伝子工学的製造法を提
供することにある。
で該DNAポリメラーゼの遺伝子構造やアミノ酸配列に
ついては不明であり、遺伝子の単離及び当該遺伝子をベ
クターに結合して遺伝子工学的に発現させる方法につい
ても明らかにされていない。本発明の目的は、新規なD
NAポリメラーゼ遺伝子を特定し、該DNA断片を含有
させた組換体プラスミドを導入させた形質転換体を用い
た新規なDNAポリメラーゼの遺伝子工学的製造法を提
供することにある。
【0004】
【課題を解決するための手段】本発明を概説すれば、本
発明の第1の発明はDNAポリメラーゼ遺伝子に関する
発明であって、該遺伝子はプラスミドpUIF101よ
り単離される。また、本発明の第2の発明はDNAポリ
メラーゼの製造方法に関する発明であって、第1の発明
のDNAポリメラーゼ遺伝子を組込んだプラスミドで形
質転換した形質転換体を培養し、該培養物からDNAポ
リメラーゼを採取することを特徴とする。
発明の第1の発明はDNAポリメラーゼ遺伝子に関する
発明であって、該遺伝子はプラスミドpUIF101よ
り単離される。また、本発明の第2の発明はDNAポリ
メラーゼの製造方法に関する発明であって、第1の発明
のDNAポリメラーゼ遺伝子を組込んだプラスミドで形
質転換した形質転換体を培養し、該培養物からDNAポ
リメラーゼを採取することを特徴とする。
【0005】以下、本発明を具体的に説明する。本発明
に使用する菌株としてはDNAポリメラーゼを産生する
菌株であれば何でもよく、例として、バチルス ステア
ロサーモフィラス IAM 11001(ATCC80
05)がある。
に使用する菌株としてはDNAポリメラーゼを産生する
菌株であれば何でもよく、例として、バチルス ステア
ロサーモフィラス IAM 11001(ATCC80
05)がある。
【0006】本発明に係る形質転換体及びDNAポリメ
ラーゼは次に例示する工程により得ることができる。 (1)バチルス・ステアロサーモフィラスから染色体D
NAを抽出する。 (2)DNAポリメラーゼに共通な領域の情報を基に配
列表の配列番号1及び配列番号2に示すDNAポリメラ
ーゼ遺伝子増幅用オリゴヌクレオチドプライマーを作成
し、(1)で得たDNAを鋳型としてポリメラーゼ チ
ェイン リアクション(PCR)を行う。 (3)(1)で得たDNAを適当な制限酵素で切断し、
これに対して(2)で得たDNA断片をプローブとして
スクリーニングを行い、目的とするDNA断片を回収す
る。 (4)ベクターを制限酵素で開裂し、この開裂部位に
(3)で得たDNA断片を結合させる。 (5)DNA断片を結合させたベクターを宿主に導入
し、目的のDNA断片を含む形質転換体を選択する。 (6)(5)で得た形質転換体からプラスミドを取出
し、目的のDNA断片を切り出して制限酵素地図を基に
目的の遺伝子全体を含む連続した一本の断片に再編成
し、これを(4)と同様の要領で発現ベクターに結合さ
せる。 (7)(6)で得た目的のDNA断片を含む発現ベクタ
ーを(5)と同じ要領で宿主に導入し、形質転換体を得
る。 (8)(7)で得た形質転換体を培養し、培養菌体より
DNAポリメラーゼを生産する。
ラーゼは次に例示する工程により得ることができる。 (1)バチルス・ステアロサーモフィラスから染色体D
NAを抽出する。 (2)DNAポリメラーゼに共通な領域の情報を基に配
列表の配列番号1及び配列番号2に示すDNAポリメラ
ーゼ遺伝子増幅用オリゴヌクレオチドプライマーを作成
し、(1)で得たDNAを鋳型としてポリメラーゼ チ
ェイン リアクション(PCR)を行う。 (3)(1)で得たDNAを適当な制限酵素で切断し、
これに対して(2)で得たDNA断片をプローブとして
スクリーニングを行い、目的とするDNA断片を回収す
る。 (4)ベクターを制限酵素で開裂し、この開裂部位に
(3)で得たDNA断片を結合させる。 (5)DNA断片を結合させたベクターを宿主に導入
し、目的のDNA断片を含む形質転換体を選択する。 (6)(5)で得た形質転換体からプラスミドを取出
し、目的のDNA断片を切り出して制限酵素地図を基に
目的の遺伝子全体を含む連続した一本の断片に再編成
し、これを(4)と同様の要領で発現ベクターに結合さ
せる。 (7)(6)で得た目的のDNA断片を含む発現ベクタ
ーを(5)と同じ要領で宿主に導入し、形質転換体を得
る。 (8)(7)で得た形質転換体を培養し、培養菌体より
DNAポリメラーゼを生産する。
【0007】上記DNA供与体であるバチルス ステア
ロサーモフィラス IAM 11001(ATCC80
05)由来DNAは55℃で振とう培養した該培養菌体
より抽出する。抽出、精製、制限酵素による切断等は公
知の方法を用いることができ、当該方法の詳細は198
2年 コールドスプリング ハーバー ラボラトリー発
行、T.マニアティス(T.Maniastis ) ほか著、モレ
キュラー クローニング、ア ラボラトリー マニュア
ル( Molecular Cloning, A Laboratory Manual )第7
5〜178頁に記載されている。
ロサーモフィラス IAM 11001(ATCC80
05)由来DNAは55℃で振とう培養した該培養菌体
より抽出する。抽出、精製、制限酵素による切断等は公
知の方法を用いることができ、当該方法の詳細は198
2年 コールドスプリング ハーバー ラボラトリー発
行、T.マニアティス(T.Maniastis ) ほか著、モレ
キュラー クローニング、ア ラボラトリー マニュア
ル( Molecular Cloning, A Laboratory Manual )第7
5〜178頁に記載されている。
【0008】目的のDNA断片を選択する方法として
は、まず公知のDNAポリメラーゼのアミノ酸配列を比
較し、共通のアミノ酸配列を示す領域を基にしてオリゴ
デオキシリボヌクレオチドを合成する。ポリメラーゼの
アミノ酸配列については例えばジャーナル オブ バイ
オロジカル ケミストリー( Journal of BiologicalCh
emistry ) 第264巻、第4255〜4263頁(19
89)に記載されているものを参考にすることができ
る。
は、まず公知のDNAポリメラーゼのアミノ酸配列を比
較し、共通のアミノ酸配列を示す領域を基にしてオリゴ
デオキシリボヌクレオチドを合成する。ポリメラーゼの
アミノ酸配列については例えばジャーナル オブ バイ
オロジカル ケミストリー( Journal of BiologicalCh
emistry ) 第264巻、第4255〜4263頁(19
89)に記載されているものを参考にすることができ
る。
【0009】本発明者らは共通のアミノ酸配列に基づく
配列表の配列番号1及び配列番号2に示す2種のオリゴ
ヌクレオチドをプライマーとし、バチルス ステアロサ
ーモフィラスDNAを鋳型に用いて、PCR法により特
異的なDNA断片を増幅することを見出し、得られた断
片に塩基配列から推定されるアミノ酸配列が公知の他の
DNAポリメラーゼと類似していることを発見した。し
たがって、該DNA断片をプローブに用いてハイブリダ
イゼーションを行うことにより目的のDNAを選択する
ことができる。ハイブリダイゼーションによる選択の方
法自体は公知の方法、例えば前記モレキュラー クロー
ニング、ア ラボラトリー マニュアル、第309頁に
記載の方法を用いることができる。サザンハイブリダイ
ゼーション法により、目的のDNAポリメラーゼ遺伝子
がバチルス ステアロサーモフィラスDNAのどの制限
酵素断片上に存在するかを分析し、次に選択した制限酵
素例えばEcoRI、BamHI、HincII 、HindII
I、XhoI、PstI、PvuIIなどを用いて分解し
たバチルス ステアロサーモフィラスDNAをプラスミ
ドベクターに組込む。プラスミドベクターとしては公知
のものが使用でき、例えばpUC18、pUC19、p
TV118Nなどが挙げられるがこれらに限定されるも
のではない。また組込ませる手段についても公知の方法
が利用でき、DNAリガーゼを用いた酵素反応で組込ま
せればよい。
配列表の配列番号1及び配列番号2に示す2種のオリゴ
ヌクレオチドをプライマーとし、バチルス ステアロサ
ーモフィラスDNAを鋳型に用いて、PCR法により特
異的なDNA断片を増幅することを見出し、得られた断
片に塩基配列から推定されるアミノ酸配列が公知の他の
DNAポリメラーゼと類似していることを発見した。し
たがって、該DNA断片をプローブに用いてハイブリダ
イゼーションを行うことにより目的のDNAを選択する
ことができる。ハイブリダイゼーションによる選択の方
法自体は公知の方法、例えば前記モレキュラー クロー
ニング、ア ラボラトリー マニュアル、第309頁に
記載の方法を用いることができる。サザンハイブリダイ
ゼーション法により、目的のDNAポリメラーゼ遺伝子
がバチルス ステアロサーモフィラスDNAのどの制限
酵素断片上に存在するかを分析し、次に選択した制限酵
素例えばEcoRI、BamHI、HincII 、HindII
I、XhoI、PstI、PvuIIなどを用いて分解し
たバチルス ステアロサーモフィラスDNAをプラスミ
ドベクターに組込む。プラスミドベクターとしては公知
のものが使用でき、例えばpUC18、pUC19、p
TV118Nなどが挙げられるがこれらに限定されるも
のではない。また組込ませる手段についても公知の方法
が利用でき、DNAリガーゼを用いた酵素反応で組込ま
せればよい。
【0010】次いで組換えプラスミドを宿主大腸菌に導
入させるが、宿主大腸菌としては、形質転換能を有する
ものであれば野生株、変異株のいずれも使用できるが、
制限系変異株で修飾系野生株(r- ,m+ )であること
が望ましい。導入の手段自体は公知の方法、例えば前記
モレキュラー クローニング、ア ラボラトリー マニ
ュアル 第250頁(1982)を用いることができ
る。このようにして目的のDNA断片を宿主に導入さ
せ、プラスミドベクターの特性、例えばpUC18の場
合アンピシリン耐性を有するコロニーを選択することに
よりクローン化されたDNAの集団を調製することがで
きる。次に上記集団の中から目的の断片を有するクロー
ンを選択する。選択の方法はベクターの種類によってコ
ロニーハイブリダイゼーション、プラークハイブリダイ
ゼーションを用いればよく、方法自体は公知のものであ
る。
入させるが、宿主大腸菌としては、形質転換能を有する
ものであれば野生株、変異株のいずれも使用できるが、
制限系変異株で修飾系野生株(r- ,m+ )であること
が望ましい。導入の手段自体は公知の方法、例えば前記
モレキュラー クローニング、ア ラボラトリー マニ
ュアル 第250頁(1982)を用いることができ
る。このようにして目的のDNA断片を宿主に導入さ
せ、プラスミドベクターの特性、例えばpUC18の場
合アンピシリン耐性を有するコロニーを選択することに
よりクローン化されたDNAの集団を調製することがで
きる。次に上記集団の中から目的の断片を有するクロー
ンを選択する。選択の方法はベクターの種類によってコ
ロニーハイブリダイゼーション、プラークハイブリダイ
ゼーションを用いればよく、方法自体は公知のものであ
る。
【0011】選択した3種類のクローン体よりそれぞれ
が所有するHincII 断片、HindIII断片、XhoI断片
について制限酵素分解により詳細な解析の結果を基に上
記3断片を試験管内で再編成し、一本の連続したDNA
断片とし、該DNA断片を発現ベクターpTV118N
に組込んで目的のクローンを得た。該プラスミドをpU
IF101と命名した。プラスミドpUIF101を有
する大腸菌を培養し、菌体の粗抽出液を得た。該抽出液
は60℃、20分処理後も十分量のDNAポリメラーゼ
活性を示し、発現ベクターのみを有する大腸菌粗抽出液
ではこのような活性を有しないことより、pUIF10
1上に耐熱性DNAポリメラーゼ産生情報が存在し、か
つ、大腸菌内で該情報を有する遺伝子が発現していると
結論した。
が所有するHincII 断片、HindIII断片、XhoI断片
について制限酵素分解により詳細な解析の結果を基に上
記3断片を試験管内で再編成し、一本の連続したDNA
断片とし、該DNA断片を発現ベクターpTV118N
に組込んで目的のクローンを得た。該プラスミドをpU
IF101と命名した。プラスミドpUIF101を有
する大腸菌を培養し、菌体の粗抽出液を得た。該抽出液
は60℃、20分処理後も十分量のDNAポリメラーゼ
活性を示し、発現ベクターのみを有する大腸菌粗抽出液
ではこのような活性を有しないことより、pUIF10
1上に耐熱性DNAポリメラーゼ産生情報が存在し、か
つ、大腸菌内で該情報を有する遺伝子が発現していると
結論した。
【0012】プラスミドpUIF101の構築工程を図
1に示す。DNAポリメラーゼ遺伝子はプラスミドpU
IF101の約3.5kbのNcoI断片にコードされて
おり、ジデオキシ法にて配列表の配列番号3に示される
該NcoI断片の塩基配列を決定した。その結果、本発
明者らによって発明され平成4年4月6日に特許出願さ
れた「DNAポリメラーゼ遺伝子」明細書に記載されて
いる、バチルス カルドテナックス由来のDNAポリメ
ラーゼ遺伝子の塩基配列と比べて、17箇所の塩基置
換、7塩基の欠失、及び1塩基の挿入が認められた。
1に示す。DNAポリメラーゼ遺伝子はプラスミドpU
IF101の約3.5kbのNcoI断片にコードされて
おり、ジデオキシ法にて配列表の配列番号3に示される
該NcoI断片の塩基配列を決定した。その結果、本発
明者らによって発明され平成4年4月6日に特許出願さ
れた「DNAポリメラーゼ遺伝子」明細書に記載されて
いる、バチルス カルドテナックス由来のDNAポリメ
ラーゼ遺伝子の塩基配列と比べて、17箇所の塩基置
換、7塩基の欠失、及び1塩基の挿入が認められた。
【0013】pUIF101で形質転換された大腸菌で
最も増殖能のよかった宿主HB101を選択し、それは
Escherichia coli HB101/pUIF101と表示
して、工業技術院微生物工業技術研究所に微工研菌寄第
12239号(FERM P−12239)として寄託
されている。
最も増殖能のよかった宿主HB101を選択し、それは
Escherichia coli HB101/pUIF101と表示
して、工業技術院微生物工業技術研究所に微工研菌寄第
12239号(FERM P−12239)として寄託
されている。
【0014】pUIF101を保有する大腸菌を培養
し、耐熱性DNAポリメラーゼを大量に発現させた培養
菌体より耐熱性DNAポリメラーゼの採取を行うことが
できる。培養菌体より、例えば、超音波処理、熱処理、
ジエチルアミノエチル(DEAE)セルロースカラムク
ロマトグラフィー、ホスホセルロースカラムクロマトグ
ラフィーの各処理を行い、DNAポリメラーゼをSDS
−ポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS−PAG
E)で単一バンドを示すまで精製することができる。
し、耐熱性DNAポリメラーゼを大量に発現させた培養
菌体より耐熱性DNAポリメラーゼの採取を行うことが
できる。培養菌体より、例えば、超音波処理、熱処理、
ジエチルアミノエチル(DEAE)セルロースカラムク
ロマトグラフィー、ホスホセルロースカラムクロマトグ
ラフィーの各処理を行い、DNAポリメラーゼをSDS
−ポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS−PAG
E)で単一バンドを示すまで精製することができる。
【0015】得られたDNAポリメラーゼはSDS−P
AGEで約10万ダルトンの分子量を示すポリペプチド
であり、DNA合成活性、3′→5′エキソヌクレアー
ゼ活性のほかに5′→3′エキソヌクレアーゼ活性を有
している。
AGEで約10万ダルトンの分子量を示すポリペプチド
であり、DNA合成活性、3′→5′エキソヌクレアー
ゼ活性のほかに5′→3′エキソヌクレアーゼ活性を有
している。
【0016】前述のバチルス カルドテナックス由来D
NAポリメラーゼ遺伝子との相同性、また分子量等より
前述NcoI断片中の配列表の配列番号4に示す翻訳可
能領域を、本発明のDNAポリメラーゼの構造遺伝子と
決定し、該DNAポリメラーゼの全アミノ酸配列を明ら
かにした。そのアミノ酸配列を配列表の配列番号5に示
す。その結果、前述のバチルス カルドテナックス由来
のDNAポリメラーゼのアミノ酸配列と比べて2アミノ
酸の置換及び1アミノ酸の欠失が認められた。
NAポリメラーゼ遺伝子との相同性、また分子量等より
前述NcoI断片中の配列表の配列番号4に示す翻訳可
能領域を、本発明のDNAポリメラーゼの構造遺伝子と
決定し、該DNAポリメラーゼの全アミノ酸配列を明ら
かにした。そのアミノ酸配列を配列表の配列番号5に示
す。その結果、前述のバチルス カルドテナックス由来
のDNAポリメラーゼのアミノ酸配列と比べて2アミノ
酸の置換及び1アミノ酸の欠失が認められた。
【0017】以上のようにして得られた形質転換体 Esc
herichia coli HB 101/pUIF101の培養液1
mlから500単位のDNAポリメラーゼが得られ、工業
的な製造が可能になった。
herichia coli HB 101/pUIF101の培養液1
mlから500単位のDNAポリメラーゼが得られ、工業
的な製造が可能になった。
【0018】
【実施例】以下に本発明の実施例を挙げるが、本発明は
これら実施例に限定されるものではない。
これら実施例に限定されるものではない。
【0019】実施例1 (1)バチルス ステアロサーモフィラス染色体DNA
の調製 バチルス ステアロサーモフィラス IAM 1100
1(ATCC8005)を1リットルのL培地(バクト
トリプトン10g/l、酵母エキス5g/l、NaCl
の5g/l、pH7.2)で65℃一夜振とう培養し、
集菌した菌体を4mlの25%ショ糖、0.05M トリ
ス−HCl(pH8.0)に懸濁し、リゾチーム(5mg
/ml)を800μl加えて20℃1時間放置した。SE
T溶液〔20mM トリス−HCl(pH8.0)、1mM
EDTA、150mM NaCl〕を24ml加えた後、
5%SDS溶液を4mlとプロティナーゼK(10mg/m
l)を400μl加えて37℃、1時間放置した。フェ
ノール抽出、クロロホルム抽出の後、エタノールを加え
て長鎖DNAを不溶化し、滅菌したつまようじで巻取っ
て回収した。以上の操作により1.7mgのDNAが得ら
れた。
の調製 バチルス ステアロサーモフィラス IAM 1100
1(ATCC8005)を1リットルのL培地(バクト
トリプトン10g/l、酵母エキス5g/l、NaCl
の5g/l、pH7.2)で65℃一夜振とう培養し、
集菌した菌体を4mlの25%ショ糖、0.05M トリ
ス−HCl(pH8.0)に懸濁し、リゾチーム(5mg
/ml)を800μl加えて20℃1時間放置した。SE
T溶液〔20mM トリス−HCl(pH8.0)、1mM
EDTA、150mM NaCl〕を24ml加えた後、
5%SDS溶液を4mlとプロティナーゼK(10mg/m
l)を400μl加えて37℃、1時間放置した。フェ
ノール抽出、クロロホルム抽出の後、エタノールを加え
て長鎖DNAを不溶化し、滅菌したつまようじで巻取っ
て回収した。以上の操作により1.7mgのDNAが得ら
れた。
【0020】(2)PCRを用いた特異的DNA断片の
増幅 配列表の配列番号1及び配列番号2に示した2種類のオ
リゴデオキシリボヌクレオチドをそれぞれ100pmolと
バチルス ステアロサーモフィラスDNA1ngを用いて
全量100μlで95℃30秒、55℃1分、72℃2
分のPCRを30サイクル行った。5μlをとりアガロ
ースゲル電気泳動で分析した結果、600塩基対のDN
A断片が特異的に増幅していた。このDNA断片をSm
aIで開環したM13ファージmp18ベクターに組込
みジデオキシ法により塩基配列を分析した。
増幅 配列表の配列番号1及び配列番号2に示した2種類のオ
リゴデオキシリボヌクレオチドをそれぞれ100pmolと
バチルス ステアロサーモフィラスDNA1ngを用いて
全量100μlで95℃30秒、55℃1分、72℃2
分のPCRを30サイクル行った。5μlをとりアガロ
ースゲル電気泳動で分析した結果、600塩基対のDN
A断片が特異的に増幅していた。このDNA断片をSm
aIで開環したM13ファージmp18ベクターに組込
みジデオキシ法により塩基配列を分析した。
【0021】(3)ゲノミックサザン法による目的の遺
伝子の検索 バチルス ステアロサーモフィラスDNAを1つの酵素
につき5μg用いてEcoRI、BamHI、HindII
I、HincII 、XhoI、PstI、PvuIIで分解
し、アガロースゲル電気泳動に供した。ゲル中のDNA
をナイロン膜に移し、上記PCRにより得た600塩基
対のDNA断片をプローブに用いてハイブリダイゼーシ
ョンを行った。プローブはランダムプライミング法によ
り放射性標識した。ハイブリダイゼーションは6×SS
C、1%SDS、5×デンハーツ溶液、100μg/ml
子牛胸腺DNA中で65℃5時間行った。1×SSC、
0.1%SDS溶液中で1時間洗浄した後、X線フィル
ムに感光し、オートラジオグラムをとった。
伝子の検索 バチルス ステアロサーモフィラスDNAを1つの酵素
につき5μg用いてEcoRI、BamHI、HindII
I、HincII 、XhoI、PstI、PvuIIで分解
し、アガロースゲル電気泳動に供した。ゲル中のDNA
をナイロン膜に移し、上記PCRにより得た600塩基
対のDNA断片をプローブに用いてハイブリダイゼーシ
ョンを行った。プローブはランダムプライミング法によ
り放射性標識した。ハイブリダイゼーションは6×SS
C、1%SDS、5×デンハーツ溶液、100μg/ml
子牛胸腺DNA中で65℃5時間行った。1×SSC、
0.1%SDS溶液中で1時間洗浄した後、X線フィル
ムに感光し、オートラジオグラムをとった。
【0022】(4)DNAポリメラーゼ遺伝子を含むD
NA断片のクローン化 ゲノミックサザン分析で陽性を示したHindIII(2.4
0kb)、HincII (1.45kb)及びXhoI(2.1
kb)DNA断片をプラスミドベクター中にクローン化す
るため、バチルス ステアロサーモフィラスDNAをそ
れぞれ100μgずつ、HindIII、HincII 、XhoI
で分解し、目的の大きさのDNAをアガロースゲルより
回収した。回収はガラスビーズ吸着法を用いた。pTV
118Nプラスミドをそれぞれ同じ酵素で開環し、アル
カリ性ホスファターゼで末端のリン酸基を除去したベク
ターを加えてDNAリガーゼにより結合した後、大腸菌
JM109に導入した。得られた組換体の集団の中から
コロニーハイブリダイゼーションによって目的のクロー
ンを選択した。ナイロン膜上に生育させた組換体のコロ
ニー50個〜200個を0.5N 水酸化ナトリウム、
1.5M 塩化ナトリウム溶液で変性させた後、1M
トリス−HCl、1.5M 塩化ナトリウム(pH7.
0)溶液で中和し、紫外線照射でファージDNAを膜上
に固定した。プローブ調製及びハイブリダイゼーション
の条件はゲノミックサザン分析に準じた。
NA断片のクローン化 ゲノミックサザン分析で陽性を示したHindIII(2.4
0kb)、HincII (1.45kb)及びXhoI(2.1
kb)DNA断片をプラスミドベクター中にクローン化す
るため、バチルス ステアロサーモフィラスDNAをそ
れぞれ100μgずつ、HindIII、HincII 、XhoI
で分解し、目的の大きさのDNAをアガロースゲルより
回収した。回収はガラスビーズ吸着法を用いた。pTV
118Nプラスミドをそれぞれ同じ酵素で開環し、アル
カリ性ホスファターゼで末端のリン酸基を除去したベク
ターを加えてDNAリガーゼにより結合した後、大腸菌
JM109に導入した。得られた組換体の集団の中から
コロニーハイブリダイゼーションによって目的のクロー
ンを選択した。ナイロン膜上に生育させた組換体のコロ
ニー50個〜200個を0.5N 水酸化ナトリウム、
1.5M 塩化ナトリウム溶液で変性させた後、1M
トリス−HCl、1.5M 塩化ナトリウム(pH7.
0)溶液で中和し、紫外線照射でファージDNAを膜上
に固定した。プローブ調製及びハイブリダイゼーション
の条件はゲノミックサザン分析に準じた。
【0023】(5)クローン化断片に制限酵素分析及び
DNAポリメラーゼ遺伝子の再編成 得られた3種類のDNA断片について制限酵素地図を作
製した結果、上記3断片はHincII −HindIII−Xho
Iの順にそれぞれ重なり合い、連続して染色体DNA上
に存在することが判明した。必要以外の連結ができるだ
け起こらないように制限酵素切断部位を選択し、図1に
示すように、3種のDNA断片とベクターpTV118
Nを同時に連結させ、DNAポリメラーゼ遺伝子を含む
約3.5kbのDNA断片を組込んだプラスミドを構築
し、pUIF101と命名した。なお、図1はpUIF
101の構築を示す工程図である。次に該プラスミドで
大腸菌HB101株を形質転換し、形質転換体 Escheri
chia coli HB101/pUIF101(FERM P
−12239)を得た。
DNAポリメラーゼ遺伝子の再編成 得られた3種類のDNA断片について制限酵素地図を作
製した結果、上記3断片はHincII −HindIII−Xho
Iの順にそれぞれ重なり合い、連続して染色体DNA上
に存在することが判明した。必要以外の連結ができるだ
け起こらないように制限酵素切断部位を選択し、図1に
示すように、3種のDNA断片とベクターpTV118
Nを同時に連結させ、DNAポリメラーゼ遺伝子を含む
約3.5kbのDNA断片を組込んだプラスミドを構築
し、pUIF101と命名した。なお、図1はpUIF
101の構築を示す工程図である。次に該プラスミドで
大腸菌HB101株を形質転換し、形質転換体 Escheri
chia coli HB101/pUIF101(FERM P
−12239)を得た。
【0024】(6)形質転換体の培養及び粗抽出液の調
製 上記組換えプラスミドpUIF101を有する大腸菌H
B101(FERMP−12239)をアンピシリンが
100μg/mlの濃度で存在するL培地5mlに植菌し3
7℃で培養した。培養液の濁度が0.6(A600 )のと
き、誘導物質であるイソプロピル−β−D−チオガラク
トシド(IPTG)を添加し、更に15時間培養を行っ
た。培養液1mlから集菌し、50mM トリス−HCl
(pH8.0)、25%スクロース溶液で洗浄した。同
じ溶液に再溶解した後、同量のリシス溶液〔50mMトリ
ス−HCl(pH7.5)、25%ショ糖、60mM ス
ペルミジン・一塩酸、20mM 塩化ナトリウム、12mM
DTT〕を加え、4℃で45分間静置した。更に5%
(w/v)トリトンX100( TritonX100)を20
μl加え、37℃で5分間静置した後、遠心分離により
上清を回収し、60℃、20分静置した後再度遠心分離
した上清を回収し、粗抽出液とした。
製 上記組換えプラスミドpUIF101を有する大腸菌H
B101(FERMP−12239)をアンピシリンが
100μg/mlの濃度で存在するL培地5mlに植菌し3
7℃で培養した。培養液の濁度が0.6(A600 )のと
き、誘導物質であるイソプロピル−β−D−チオガラク
トシド(IPTG)を添加し、更に15時間培養を行っ
た。培養液1mlから集菌し、50mM トリス−HCl
(pH8.0)、25%スクロース溶液で洗浄した。同
じ溶液に再溶解した後、同量のリシス溶液〔50mMトリ
ス−HCl(pH7.5)、25%ショ糖、60mM ス
ペルミジン・一塩酸、20mM 塩化ナトリウム、12mM
DTT〕を加え、4℃で45分間静置した。更に5%
(w/v)トリトンX100( TritonX100)を20
μl加え、37℃で5分間静置した後、遠心分離により
上清を回収し、60℃、20分静置した後再度遠心分離
した上清を回収し、粗抽出液とした。
【0025】(7)DNAポリメラーゼ活性測定 反応溶液として67mM リン酸カリウム(pH7.
4)、6.7mM 塩化マグネシウム、1mM 2−メルカ
プトエタノール、20μM 活性化DNA、33μM
dATP、dCTP、dGTP、TTP、60nM
〔 3H〕TTPを用意し、この溶液150μlに対して
適当量の粗抽出液を加え、60℃、5分反応させた後、
50mM ピロリン酸、10%トリクロロ酢酸を1ml加え
て反応を停止させた。氷中で5分間静置した後、全量を
グラスフィルター上に移し、吸引ろ過した。10%TC
Aで数回洗浄した後、70%エタノールで置換し、フィ
ルターを乾燥して液体シンチレーションカウンターでフ
ィルター上の放射活性を測定した。1mlの培養液から5
00単位のDNAポリメラーゼが得られた。
4)、6.7mM 塩化マグネシウム、1mM 2−メルカ
プトエタノール、20μM 活性化DNA、33μM
dATP、dCTP、dGTP、TTP、60nM
〔 3H〕TTPを用意し、この溶液150μlに対して
適当量の粗抽出液を加え、60℃、5分反応させた後、
50mM ピロリン酸、10%トリクロロ酢酸を1ml加え
て反応を停止させた。氷中で5分間静置した後、全量を
グラスフィルター上に移し、吸引ろ過した。10%TC
Aで数回洗浄した後、70%エタノールで置換し、フィ
ルターを乾燥して液体シンチレーションカウンターでフ
ィルター上の放射活性を測定した。1mlの培養液から5
00単位のDNAポリメラーゼが得られた。
【0026】(8)プラスミドpUIF101を導入し
た大腸菌による耐熱性DNAポリメラーゼの生産 大腸菌HB101/pUIF101の菌体3.0gより
精製を開始し、実施例1−(6)で示した方法により2
0mlの粗抽出液を得た。これらを60℃で30分間イン
キュベートした後、熱変性したタンパク質を遠心分離し
た(12000rpm 、10分)。この上清に硫酸アンモ
ニウムを加えていき、30〜80%飽和で沈殿する画分
をとってDE緩衝液〔50mM トリス−HCl pH
7.0、2mM 2−メルカプトエタノール、10%グリ
セロール、4μM フェニルメタンスルホニルフルオリ
ド(PMSF)〕で透析した後、同じ緩衝液で平衡化し
たDE52(ワットマン社)カラム15mlに添加し0mM
〜300mM NaClの直線濃度勾配で溶出して分画
し、実施例1−(7)に従ってDNAポリメラーゼ活性
を調べた。次に活性画分を集めてDE緩衝液で透析し、
DE緩衝液で平衡化したP−11(ワットマン社)カラ
ム15mlに添加した。次に0mM〜300mM NaCl直
線濃度勾配で溶出し活性画分を集めた。P11画分の酵
素標品をSDS−PAGEで分析したところ、分子量約
10万ダルトンの単一バンドを与えた。
た大腸菌による耐熱性DNAポリメラーゼの生産 大腸菌HB101/pUIF101の菌体3.0gより
精製を開始し、実施例1−(6)で示した方法により2
0mlの粗抽出液を得た。これらを60℃で30分間イン
キュベートした後、熱変性したタンパク質を遠心分離し
た(12000rpm 、10分)。この上清に硫酸アンモ
ニウムを加えていき、30〜80%飽和で沈殿する画分
をとってDE緩衝液〔50mM トリス−HCl pH
7.0、2mM 2−メルカプトエタノール、10%グリ
セロール、4μM フェニルメタンスルホニルフルオリ
ド(PMSF)〕で透析した後、同じ緩衝液で平衡化し
たDE52(ワットマン社)カラム15mlに添加し0mM
〜300mM NaClの直線濃度勾配で溶出して分画
し、実施例1−(7)に従ってDNAポリメラーゼ活性
を調べた。次に活性画分を集めてDE緩衝液で透析し、
DE緩衝液で平衡化したP−11(ワットマン社)カラ
ム15mlに添加した。次に0mM〜300mM NaCl直
線濃度勾配で溶出し活性画分を集めた。P11画分の酵
素標品をSDS−PAGEで分析したところ、分子量約
10万ダルトンの単一バンドを与えた。
【0027】実施例2 (1)DNAポリメラーゼの構造遺伝子を含むバチルス
ステアロサーモフィラス染色体DNA塩基配列の決定 ジデオキシ法により、配列表の配列番号3に示すpUI
F101のNcoI−NcoI断片の塩基配列を決定し
た。決定した塩基配列を前述のバチルス カルドテナッ
クス由来DNAポリメラーゼ遺伝子の塩基配列と比較し
構造遺伝子を推定することにより、バチルス ステアロ
サーモフィラスDNAポリメラーゼの全アミノ酸配列を
推定した。
ステアロサーモフィラス染色体DNA塩基配列の決定 ジデオキシ法により、配列表の配列番号3に示すpUI
F101のNcoI−NcoI断片の塩基配列を決定し
た。決定した塩基配列を前述のバチルス カルドテナッ
クス由来DNAポリメラーゼ遺伝子の塩基配列と比較し
構造遺伝子を推定することにより、バチルス ステアロ
サーモフィラスDNAポリメラーゼの全アミノ酸配列を
推定した。
【0028】
【発明の効果】以上詳細に説明したように本発明により
新規なDNAポリメラーゼの遺伝子構造が明らかとな
り、遺伝子工学研究用試薬として有用なDNAポリメラ
ーゼの遺伝子工学的製造法が提供された。
新規なDNAポリメラーゼの遺伝子構造が明らかとな
り、遺伝子工学研究用試薬として有用なDNAポリメラ
ーゼの遺伝子工学的製造法が提供された。
配列番号:1 配列の長さ:23 配列の型:核酸 鎖の数:一本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:他の核酸(合成DNA) アンチセンス:NO 配列の特徴:1-23 S primer 配列: GAYCCHAACY TSCARAAYAT HCC 23 配列番号:2 配列の長さ:21 配列の型:核酸 鎖の数:一本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:他の核酸(合成DNA) アンチセンス:YES 配列の特徴:1-21 S primer 配列: KASNAKYTCR TCRTGNACYT G 21 配列番号:3 配列の長さ:3246 配列の型:核酸 鎖の数:二本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:genomic DNA 起源:生物名:バチルス ステアロサーモフィラス (Bacillus stearothermophilus) 株名:IAM11001 (ATCC8005) 配列: CCATGGATAT ATTACCGTAG CGAGCAAAGT GGGGCGCGGC ACCGTGTTCA CGATCCATTT 60 TCCAAAGCCG GGGCGGTAGC CGGCTTCTTT TTATCATCTC CAACTGAGAA GCCTGCCATT 120 TTTCAGCGTG AGCGTAAGCA CGGGATGAAT CGGCGCCTCC CATCATGGTG GGAGAGCGTT 180 CAAGGCAAGC CGCAGGCATG GTACAATAGG ACAAGGAAGC ATCCGAGGAG GGATGAGA 238 TTG AAA AAA AAG CTT GTT TTA ATC GAC GGC AGC AGC GTG GCG TAC 283 CGC GCC TTT TTC GCC TTG CCG CTT TTG CAT AAC GAC AAA GGC ATC 328 CAT ACG AAC GCC GTC TAC GGG TTT ACG ATG ATG TTG AAT AAA ATT 373 TTG GCG GAA GAA GAG CCA ACT CAT ATG CTT GTC GCG TTT GAC GCC 418 GGG AAA ACG ACG TTC CGG CAT GAA GCG TTT CAA GAG TAT AAA GGT 463 GGG CGC CAG CAG ACG CCA CCG GAG CTG TCG GAG CAG TTT CCG CTG 508 TTG CGC GAG CTG CTG AGG GCG TAT CGC ATC CCC GCC TAT GAA CTC 553 GAG AAC TAC GAA GCG GAC GAT ATT ATC GGA ACG CTT GCC GCC CGC 598 GCT GAG CAG GAA GGG TTT GAG GTG AAA GTC ATT TCC GGC GAC CGC 643 GAT CTG ACC CAG CTC GCC TCC CCC CAT GTG ACG GTG GAC ATT ACG 688 AAA AAA GGG ATT ACC GAT ATC GAA CCG TAC ACG CCG GAG ACG GTC 733 CGC GAA AAA TAC GGC TTA ACT CCG GAA CAA ATC GTT GAT TTG AAA 778 GGA TTG ATG GGC GAC AAA TCG GAC AAC ATC CCC GGA GTG CCG GGC 823 ATC GGG GAA AAG ACG GCG GTC AAG CTG CTC AGG CAA TTC GGC ACG 868 GTC GAA AAC GTG CTT GCC TCC ATT GAC GAG ATC AAA GGC GAA AAG 913 TTG AAA GAA ACG TTG CGC CAA CAC CGG GAG ATG GCG CTG TTA AGC 958 AAA AAG CTC GCC GCC ATT CGC CGC GAC GCC CCG GTC GAG CTC TCG 1003 CTT GAT GAC ATC GCC TAT CAA GGG GAA GAC CGG GAG AAA GTG GTC 1048 GCT TTA TTT AAA GAG CTT GGG TTT CAA TCG TTT TTA GAG AAA ATG 1093 GAA TCG CCG TCA TCA GAA GAG GAA AAA CCG CTT GCC AAG ATG GCA 1138 TTT ACG CTT GCT GAC CGC GTG ACG GAG GAG ATG CTT GCC GAC AAG 1183 GCG GCG CTT GTC GTT GAA GTG GTC GAG GAA AAT TAT CAT GAT GCG 1228 CCG ATC GTC GGC ATC GCT GTG GTC AAC GAA CAT GGA CGG TTT TTC 1273 CTG CGC CCG GAG ACG GCG CTT GCC GAT CCG CAG TTT GTC GCC TGG 1318 CTT GGT GAT GAA ACG AAG AAA AAA AGC ATG TTT GAC TCA AAG CGC 1363 GCG GCA GTC GCC TTG AAA TGG AAA GGA ATT GAG CTA TGC GGC GTT 1408 TCC TTT GAT TTA TTG CTG GCC GCC TAT TTG CTT GAT CCG GCG CAA 1453 GGT GTT GAT GAT GTG GCT GCC GCA GCA AAA ATG AAG CAA TAC GAA 1498 GCG GTG CGC TCG GAT GAA GCG GTG TAT GGC AAA GGG GCG AAG CGG 1543 GCC GTG CCG GAT GAG CCA GTG CTC GCC GAG CAT CTC GTC CGC AAG 1588 GCG GCG GCG ATT TGG GCG CTC GAA CGT CCG TTT TTG GAT GAG CTG 1633 CGC CGC AAC GAA CAA GAT AGG TTG CTC GTC GAG CTC GAG CAG CCG 1678 TTG TCT TCG ATT TTG GCG GAA ATG GAA TTT GCC GGA GTG AAA GTG 1723 GAT ACG AAG CGG CTC GAA CAG ATG GGC GAA GAG CTC GCC GAG CAG 1768 CTG CGC ACG GTC GAG CAG CGC ATT TAT GAG CTC GCC GGC CAA GAA 1813 TTC AAC ATC AAT TCA CCG AAA CAG CTC GGC GTC ATT TTA TTT GAA 1858 AAA CTG CAG CTG CCC GTC TTG AAA AAA AGC AAA ACC GGC TAC TCC 1903 ACT TCG GCG GAT GTG CTT GAA AAA CTT GCG CCT TAT CAC GAG ATC 1948 GTG GAA AAC ATT TTG CAT TAC CGC CAG CTT GGC AAG TTG CAG TCG 1993 ACG TAT ATT GAA GGA TTG CTG AAA GTC GTG CGA CCC GAT ACA AAG 2038 AAG GTG CAT ACG ATT TTC AAT CAG GCG TTG ACG CAA ACC GGA CGG 2083 CTC AGC TCG ACG GAG CCG AAC TTG CAA AAC ATT CCG ATT CGG CTT 2128 GAG GAA GGA CGG AAA ATC CGC CAA GCG TTC GTG CCG TCG GAG TCT 2173 GAT TGG CTC ATT TTC GCA GCC GAC TAC TCG CAA ATT GAG TTG CGC 2218 GTC CTC GCC CAT ATT GCG GAA GAT GAC AAT TTA ATG GAA GCG TTC 2263 CGC CGC GAT TTG GAT ATC CAT ACG AAA ACA GCG ATG GAC ATT TTC 2308 CAA GTG AGC GAG GAC GAA GTG ACG CCC AAC ATG CGC CGT CAG GCG 2353 AAG GCG GTC AAC TTT GGG ATC GTT TAC GGG ATC AGT GAT TAC GGC 2398 TTG GCG CAA AAC TTA AAT ATT TCA CGC AAA GAG GCC GCT GAA TTC 2443 ATC GAG CGC TAC TTC GAA AGC TTC CCT GGC GTG AAG CGG TAT ATG 2487 GAA AAC ATT GTG CAA GAA GCA AAA CAG AAA GGG TAT GTG ACG ACG 2532 CTG CTG CAT CGG CGC CGC TAT TTG CCG GAT ATC ACG AGC CGC AAC 2578 TTC AAC GTC CGC AGC TTT GCT GAA CGG ATG GCG ATG AAC ACG CCG 2623 ATT CAA GGG AGC GCC GCT GAC ATT ATT AAA AAG GCG ATG ATC GAT 2668 CTG AAC GCT AGA CTG AAG GAA GAG CGG CTG CAA GCG CGC CTT TTG 2713 CTA CAG GTG CAT GAC GAG CTC ATT TTG GAG GCG CCG AAA GAA GAG 2758 ATG GAG CGG CTG TGC CGG CTC GTT CCG GAA GTG ATG GAG CAA GCG 2803 GTC ACA CTT CGC GTG CCG CTC AAA GTC GAT TAC CAT TAT GGC TCG 2848 ACG TGG TAT GAC GCG AAA TAAAAAGGAG TCTTGGTGTG GATCGCCGGC 2896 ACCCCTAAAA GGCCGGTGAT TTAAGGGGAA ATACTGCTCT CCAACAGTGT TTCTCAAATT 2956 GAAAAACCTT GCAACACCAT CACTTCATTC CTTGTGATTT CTCATAAATC AAGCGAATCC 3016 ATTGTTTTTC ATCAGCCTTC TAAGAAGGCC TGTGATGGAA TGAAAAAGCA GTTTCACAAC 3076 GACTCTTCTC CAGTTGAGAA GCCTTGGGAC ATCGAGTCGT CCTTCTCAAC CAACATGACC 3136 GATTTTGCGA AAATCAGCGT TTCTCACCGG CCTTCTAGGC AGAATCTTTC GGTGCGACGA 3196 TTCTCGGCTG CAACTCGATG AATTGGAGCG AAACAGCTGC CGCCCCATGG 3246 配列番号:4 配列の長さ:2628 配列の型:核酸 鎖の数:二本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:genomic DNA 起源:生物名:バチルス ステアロサーモフィラス (Bacillus stearothermophilus) 株名:IAM11001 (ATCC8005) 配列: TTG AAA AAA AAG CTT GTT TTA ATC GAC GGC AGC AGC GTG GCG TAC 45 CGC GCC TTT TTC GCC TTG CCG CTT TTG CAT AAC GAC AAA GGC ATC 90 CAT ACG AAC GCC GTC TAC GGG TTT ACG ATG ATG TTG AAT AAA ATT 135 TTG GCG GAA GAA GAG CCA ACT CAT ATG CTT GTC GCG TTT GAC GCC 180 GGG AAA ACG ACG TTC CGG CAT GAA GCG TTT CAA GAG TAT AAA GGT 225 GGG CGC CAG CAG ACG CCA CCG GAG CTG TCG GAG CAG TTT CCG CTG 270 TTG CGC GAG CTG CTG AGG GCG TAT CGC ATC CCC GCC TAT GAA CTC 315 GAG AAC TAC GAA GCG GAC GAT ATT ATC GGA ACG CTT GCC GCC CGC 360 GCT GAG CAG GAA GGG TTT GAG GTG AAA GTC ATT TCC GGC GAC CGC 405 GAT CTG ACC CAG CTC GCC TCC CCC CAT GTG ACG GTG GAC ATT ACG 450 AAA AAA GGG ATT ACC GAT ATC GAA CCG TAC ACG CCG GAG ACG GTC 495 CGC GAA AAA TAC GGC TTA ACT CCG GAA CAA ATC GTT GAT TTG AAA 540 GGA TTG ATG GGC GAC AAA TCG GAC AAC ATC CCC GGA GTG CCG GGC 585 ATC GGG GAA AAG ACG GCG GTC AAG CTG CTC AGG CAA TTC GGC ACG 630 GTC GAA AAC GTG CTT GCC TCC ATT GAC GAG ATC AAA GGC GAA AAG 675 TTG AAA GAA ACG TTG CGC CAA CAC CGG GAG ATG GCG CTG TTA AGC 720 AAA AAG CTC GCC GCC ATT CGC CGC GAC GCC CCG GTC GAG CTC TCG 765 CTT GAT GAC ATC GCC TAT CAA GGG GAA GAC CGG GAG AAA GTG GTC 810 GCT TTA TTT AAA GAG CTT GGG TTT CAA TCG TTT TTA GAG AAA ATG 855 GAA TCG CCG TCA TCA GAA GAG GAA AAA CCG CTT GCC AAG ATG GCA 900 TTT ACG CTT GCT GAC CGC GTG ACG GAG GAG ATG CTT GCC GAC AAG 945 GCG GCG CTT GTC GTT GAA GTG GTC GAG GAA AAT TAT CAT GAT GCG 990 CCG ATC GTC GGC ATC GCT GTG GTC AAC GAA CAT GGA CGG TTT TTC 1035 CTG CGC CCG GAG ACG GCG CTT GCC GAT CCG CAG TTT GTC GCC TGG 1080 CTT GGT GAT GAA ACG AAG AAA AAA AGC ATG TTT GAC TCA AAG CGC 1125 GCG GCA GTC GCC TTG AAA TGG AAA GGA ATT GAG CTA TGC GGC GTT 1170 TCC TTT GAT TTA TTG CTG GCC GCC TAT TTG CTT GAT CCG GCG CAA 1215 GGT GTT GAT GAT GTG GCT GCC GCA GCA AAA ATG AAG CAA TAC GAA 1260 GCG GTG CGC TCG GAT GAA GCG GTG TAT GGC AAA GGG GCG AAG CGG 1305 GCC GTG CCG GAT GAG CCA GTG CTC GCC GAG CAT CTC GTC CGC AAG 1350
GCG GCG GCG ATT TGG GCG CTC GAA CGT CCG TTT TTG GAT GAG CTG 1395 CGC CGC AAC GAA CAA GAT AGG TTG CTC GTC GAG CTC GAG CAG CCG 1440 TTG TCT TCG ATT TTG GCG GAA ATG GAA TTT GCC GGA GTG AAA GTG 1485 GAT ACG AAG CGG CTC GAA CAG ATG GGC GAA GAG CTC GCC GAG CAG 1530 CTG CGC ACG GTC GAG CAG CGC ATT TAT GAG CTC GCC GGC CAA GAA 1575 TTC AAC ATC AAT TCA CCG AAA CAG CTC GGC GTC ATT TTA TTT GAA 1620 AAA CTG CAG CTG CCC GTC TTG AAA AAA AGC AAA ACC GGC TAC TCC 1665 ACT TCG GCG GAT GTG CTT GAA AAA CTT GCG CCT TAT CAC GAG ATC 1710 GTG GAA AAC ATT TTG CAT TAC CGC CAG CTT GGC AAG TTG CAG TCG 1755 ACG TAT ATT GAA GGA TTG CTG AAA GTC GTG CGA CCC GAT ACA AAG 1800 AAG GTG CAT ACG ATT TTC AAT CAG GCG TTG ACG CAA ACC GGA CGG 1845 CTC AGC TCG ACG GAG CCG AAC TTG CAA AAC ATT CCG ATT CGG CTT 1890 GAG GAA GGA CGG AAA ATC CGC CAA GCG TTC GTG CCG TCG GAG TCT 1935 GAT TGG CTC ATT TTC GCA GCC GAC TAC TCG CAA ATT GAG TTG CGC 1980 GTC CTC GCC CAT ATT GCG GAA GAT GAC AAT TTA ATG GAA GCG TTC 2025 CGC CGC GAT TTG GAT ATC CAT ACG AAA ACA GCG ATG GAC ATT TTC 2070 CAA GTG AGC GAG GAC GAA GTG ACG CCC AAC ATG CGC CGT CAG GCG 2115 AAG GCG GTC AAC TTT GGG ATC GTT TAC GGG ATC AGT GAT TAC GGC 2160 TTG GCG CAA AAC TTA AAT ATT TCA CGC AAA GAG GCC GCT GAA TTC 2205 ATC GAG CGC TAC TTC GAA AGC TTC CCT GGC GTG AAG CGG TAT ATG 2250 GAA AAC ATT GTG CAA GAA GCA AAA CAG AAA GGG TAT GTG ACG ACG 2295 CTG CTG CAT CGG CGC CGC TAT TTG CCG GAT ATC ACG AGC CGC AAC 2340 TTC AAC GTC CGC AGC TTT GCT GAA CGG ATG GCG ATG AAC ACG CCG 2385 ATT CAA GGG AGC GCC GCT GAC ATT ATT AAA AAG GCG ATG ATC GAT 2430 CTG AAC GCT AGA CTG AAG GAA GAG CGG CTG CAA GCG CGC CTT TTG 2475 CTA CAG GTG CAT GAC GAG CTC ATT TTG GAG GCG CCG AAA GAA GAG 2520 ATG GAG CGG CTG TGC CGG CTC GTT CCG GAA GTG ATG GAG CAA GCG 2565 GTC ACA CTT CGC GTG CCG CTC AAA GTC GAT TAC CAT TAT GGC TCG 2610 ACG TGG TAT GAC GCG AAA 2628 配列番号:5 配列の長さ:876 配列の型:アミノ酸 鎖の数:一本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:ペプチド 配列: Met Lys Lys Lys Leu Val Leu Ile Asp Gly Ser Ser Val Ala Tyr 1 5 10 15 Arg Ala Phe Phe Ala 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【図面の簡単な説明】
【図1】pUIF101の構築を示す工程図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 加藤 郁之進 滋賀県大津市瀬田3丁目4番1号 寳酒造 株式会社中央研究所内
Claims (2)
- 【請求項1】 プラスミドpUIF101より単離され
るDNAポリメラーゼ遺伝子。 - 【請求項2】 請求項1に記載のDNAポリメラーゼ遺
伝子を組込んだプラスミドで形質転換した形質転換体を
培養し、該培養物からDNAポリメラーゼを採取するこ
とを特徴とするDNAポリメラーゼの製造方法。
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