JPH11151087A - Ｄｎａポリメラーゼ遺伝子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】遺伝子工学の分野に有用で、目的に応じて優れ
た性質を有する新規ＤＮＡポリメラーゼをコードする遺
伝子を提供すること、及び該新規ＤＮＡポリメラーゼを
提供すること。 【解決手段】（１）：配列番号：１又は配列番号：２に
示されるアミノ酸配列からなるポリぺプチドをコードす
るＤＮＡ及び（２）：配列番号：７又は配列番号：８に
示される塩基配列からなるＤＮＡ等から選ばれるＤＮＡ
であって、３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を有する
ＤＮＡポリメラーゼを構成するポリペプチドをコードす
るＤＮＡ、並びに該ＤＮＡがコードするポリペプチドか
ら構成されるＤＮＡポリメラーゼであって、３’→５’
エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼ。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は新規ＤＮＡポリメラ
ーゼ遺伝子及び該遺伝子にコードされる新規ＤＮＡポリ
メラーゼに関する。さらに本発明は該ＤＮＡポリメラー
ゼの製造方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】現在までに知られているＤＮＡポリメラ
ーゼは、アミノ酸配列の共通性から、大きく４つのファ
ミリーに分類することができる。その中で一般的に遺伝
子操作実験用試薬として利用されているのは、大腸菌Ｄ
ＮＡポリメラーゼＩや好熱菌サーマスアクアティカスＤ
ＮＡポリメラーゼに代表されるファミリーＡ（ポルＩ型
酵素）と、Ｔ４ファージＤＮＡポリメラーゼに代表され
るファミリーＢ（α型酵素）に属するものである。詳細
に各ＤＮＡポリメラーゼの生化学的性質を比較すると、
少しずつ異なるものの、一般的に同じファミリーに属す
るＤＮＡポリメラーゼは概ね類似した性質を有する。し
たがって、これまで実験操作に応じてそれぞれ現存する
中で最も適した性質を有するＤＮＡポリメラーゼが選ば
れ利用されている。

【０００３】例えばＷＯ９７／２４４４４号公報には、
ＤＮＡ鎖伸長の校正機能である３’→５’エキソヌクレ
アーゼ活性を有し、かつプライマー伸長活性が強いＤＮ
Ａポリメラーゼに係る技術が開示されている。このよう
な性質を有するＤＮＡポリメラーゼはＰＣＲ法に用いる
ＤＮＡポリメラーゼとして好ましいものであるが、同様
の性質を有するＤＮＡポリメラーゼは知られていない。
そのため、種々の実験操作に対応すべく、かかる性質を
有するＤＮＡポリメラーゼを見出すことが求められてい
る。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、遺伝
子工学の分野に有用で、目的に応じて優れた性質を有す
る新規ＤＮＡポリメラーゼをコードする遺伝子を提供す
ることにある。さらに本発明の目的は該新規ＤＮＡポリ
メラーゼを提供することにある。さらに本発明の目的
は、上記遺伝子を含有してなる発現ベクター、及び該発
現ベクターによって形質転換されてなる形質転換体を提
供することにある。さらに本発明の目的は、かかる形質
転換体を培養する本発明のＤＮＡポリメラーゼの生産方
法を提供することにある。

【０００５】

【課題を解決するための手段】即ち、本発明の要旨は、 〔１〕 （Ａ）配列番号：１に示されるアミノ酸配列
からなるポリぺプチドをコードするＤＮＡ、 （Ｂ）配列番号：１に示されるアミノ酸配列において、
１個以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加された
アミノ酸配列からなるポリぺプチドをコードするＤＮ
Ａ、 （Ｃ）配列番号：７に示される塩基配列からなるＤＮ
Ａ、 （Ｄ）配列番号：７に示される塩基配列において、１個
以上の塩基が欠失、置換、挿入又は付加された塩基配列
からなるＤＮＡ、及び （Ｅ）（Ａ）〜（Ｄ）のいずれかのＤＮＡにストリンジ
ェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ、から選ば
れるＤＮＡであって、３’→５’エキソヌクレアーゼ活
性を有するＤＮＡポリメラーゼを構成するポリペプチド
をコードするＤＮＡ、 〔２〕 （Ｆ）配列番号：２に示されるアミノ酸配列
からなるポリぺプチドをコードするＤＮＡ、 （Ｇ）配列番号：２に示されるアミノ酸配列において、
１個以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加された
アミノ酸配列からなるポリぺプチドをコードするＤＮ
Ａ、 （Ｈ）配列番号：８に示される塩基配列からなるＤＮ
Ａ、 （Ｉ）配列番号：８に示される塩基配列において、１個
以上の塩基が欠失、置換、挿入又は付加された塩基配列
からなるＤＮＡ、及び （Ｊ）（Ｆ）〜（Ｉ）のいずれかのＤＮＡにストリンジ
ェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ、から選ば
れるＤＮＡであって、３’→５’エキソヌクレアーゼ活
性を有するＤＮＡポリメラーゼを構成するポリペプチド
をコードするＤＮＡ、

【０００６】〔３〕 前記〔１〕記載のＤＮＡ及び／
又は前記〔２〕記載のＤＮＡを含有する発現ベクター、 〔４〕 前記〔３〕記載の発現ベクターによって形質
転換された形質転換体、 〔５〕 前記〔４〕記載の形質転換体を、前記〔１〕
記載のＤＮＡ及び／又は前記〔２〕記載のＤＮＡにコー
ドされるポリペプチドの発現可能な条件下で培養するこ
とを特徴とする、ＤＮＡポリメラーゼの生産方法、 〔６〕 前記〔１〕記載のＤＮＡにコードされるポリ
ペプチドであって、３’→５’エキソヌクレアーゼ活性
を有するＤＮＡポリメラーゼを構成するポリペプチド、 〔７〕 前記〔２〕記載のＤＮＡにコードされるポリ
ペプチドであって、３’→５’エキソヌクレアーゼ活性
を有するＤＮＡポリメラーゼを構成するポリペプチド、 〔８〕 前記〔１〕記載のＤＮＡにコードされるポリ
ペプチドから構成されるＤＮＡポリメラーゼであって、
３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリ
メラーゼ、

〔９〕 前記〔２〕記載のＤＮＡにコードされるポリ
ペプチドから構成されるＤＮＡポリメラーゼであって、
３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリ
メラーゼ、 〔１０〕 前記〔６〕記載のポリペプチド及び前記
〔７〕記載のポリペプチドから構成されるＤＮＡポリメ
ラーゼであって、３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を
有するＤＮＡポリメラーゼ、に関するものである。

【０００７】

【発明の実施の形態】以下、本発明を詳細に説明する。

【０００８】１．本発明のＤＮＡ 本発明のＤＮＡとしては、以下のものが挙げられる。例
えば、 １）（Ａ）配列番号：１に示されるアミノ酸配列からな
るポリぺプチドをコードするＤＮＡ、 （Ｂ）配列番号：１に示されるアミノ酸配列において、
１個以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加された
アミノ酸配列からなるポリぺプチドをコードするＤＮ
Ａ、 （Ｃ）配列番号：７に示される塩基配列からなるＤＮ
Ａ、 （Ｄ）配列番号：７に示される塩基配列において、１個
以上の塩基が欠失、置換、挿入又は付加された塩基配列
からなるＤＮＡ、及び （Ｅ）（Ａ）〜（Ｄ）のいずれかのＤＮＡにストリンジ
ェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ、から選ば
れるＤＮＡであって、３’→５’エキソヌクレアーゼ活
性を有するＤＮＡポリメラーゼを構成するポリペプチド
をコードするＤＮＡ、 ２）（Ｆ）配列番号：２に示されるアミノ酸配列からな
るポリぺプチドをコードするＤＮＡ、 （Ｇ）配列番号：２に示されるアミノ酸配列において、
１個以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加された
アミノ酸配列からなるポリぺプチドをコードするＤＮ
Ａ、 （Ｈ）配列番号：８に示される塩基配列からなるＤＮ
Ａ、 （Ｉ）配列番号：８に示される塩基配列において、１個
以上の塩基が欠失、置換、挿入又は付加された塩基配列
からなるＤＮＡ、及び （Ｊ）（Ｆ）〜（Ｉ）のいずれかのＤＮＡにストリンジ
ェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ、から選ば
れるＤＮＡであって、３’→５’エキソヌクレアーゼ活
性を有するＤＮＡポリメラーゼを構成するポリペプチド
をコードするＤＮＡ、等が挙げられる。

【０００９】配列番号：７に示される塩基配列を有する
ＤＮＡ及び配列番号：８に示される塩基配列を有するＤ
ＮＡは、いずれもメタン産生古細菌メタノコッカス・ヤ
ナシ（Methanococcus jannaschii）のゲノムＤＮＡに見
出される。これらのＤＮＡは超好熱性古細菌ピロコッカ
ス・フリオサス（Pyrococcus furiosus ）由来の非−α
型、非−ポルＩ型ＤＮＡポリメラーゼを構成するポリペ
プチドをコードするＤＮＡの塩基配列と相同性を示す配
列である（図１、図２、図３）。

【００１０】また、配列番号：１に示されるアミノ酸配
列及び配列番号：２に示されるアミノ酸配列はそれぞ
れ、配列番号：７に示される塩基配列及び配列番号：８
に示される塩基配列から導かれるアミノ酸配列である。

【００１１】さらに、３’→５’エキソヌクレアーゼ活
性を有するＤＮＡポリメラーゼを構成するポリペプチド
をコードするＤＮＡである限り、（Ｂ）、（Ｄ）、
（Ｇ）及び（Ｉ）で規定されるＤＮＡのような、配列番
号：１に示されるアミノ酸配列及び配列番号：２に示さ
れるアミノ酸配列において、１個以上のアミノ酸が欠
失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列からなるポ
リぺプチドをコードするＤＮＡ、並びに配列番号：７に
示される塩基配列及び配列番号：８に示される塩基配列
において、１個以上の塩基が欠失、置換、挿入又は付加
された塩基配列からなるＤＮＡも本発明のＤＮＡに包含
される。本明細書における、「１個以上」とは、１個又
は数個若しくはそれ以上の個数をいう。

【００１２】塩基配列及びアミノ酸配列において、１個
以上の塩基及びアミノ酸の欠失、置換、挿入又は付加を
行う手法としては、モレキュラー クローニング：ア
ラボラトリー マニュアル第２版（１９８９年、コール
ド スプリング ハーバーラボラトリー発行、Ｔ．マニ
アティスら編集）等に記載されている、種々の遺伝子工
学的手法が挙げられる。

【００１３】さらに、３’→５’エキソヌクレアーゼ活
性を有するＤＮＡポリメラーゼを構成するポリペプチド
をコードするＤＮＡである限り、（Ｅ）及び（Ｊ）で規
定されるＤＮＡも本発明のＤＮＡに包含される。本明細
書において「ストリンジェントな条件下でハイブリダイ
ズするＤＮＡ」とは、プローブとともに０．５％ＳＤ
Ｓ、０．１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、０．１％
ポリビニルピロリドン、０．１％フィコール４００、
０．０１％変性サケ***ＤＮＡを含む６×ＳＳＣ（１×
ＳＳＣは０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．０１５Ｍクエン酸
ナトリウム、ｐＨ７．０を示す。）中、５０℃にて１２
〜２０時間インキュベートした後に、プローブとハイブ
リダイズしているＤＮＡをいう。

【００１４】２．本発明のポリペプチド及びＤＮＡポリ
メラーゼ 本発明のポリペプチドとしては、３’→５’エキソヌク
レアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼを構成するポ
リペプチドであって、１）配列番号：１に示されるアミ
ノ酸配列からなるポリペプチド又は該ポリペプチドの機
能的同等物（「第一のＤＮＡポリメラーゼ構成ポリペプ
チド」とする。）、又は２）配列番号：２に示されるア
ミノ酸配列からなるポリペプチド又は該ポリペプチドの
機能的同等物（「第二のＤＮＡポリメラーゼ構成ポリペ
プチド」とする。）の二種類が挙げられる。

【００１５】第一のＤＮＡポリメラーゼ構成ポリペプチ
ドの具体例としては、上記の（Ａ）〜（Ｅ）から選ばれ
るＤＮＡにコードされるポリペプチドであって、３’→
５’エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラー
ゼを構成するポリペプチドが挙げられる。

【００１６】また、第二のＤＮＡポリメラーゼ構成ポリ
ペプチドの具体例としては、上記の（Ｆ）〜（Ｊ）から
選ばれるＤＮＡにコードされるポリペプチドであって、
３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリ
メラーゼを構成するポリペプチドが挙げられる。

【００１７】本発明の二種類のポリペプチドが共に存在
した状態でＤＮＡポリメラーゼ活性及び３’→５’エキ
ソヌクレアーゼ活性が現れることから、本発明のＤＮＡ
ポリメラーゼは、これら二種類のポリペプチドが非共有
結合的に複合体を形成して構成されているものと推定さ
れる。

【００１８】したがって本発明のＤＮＡポリメラーゼと
しては、例えば以下のようなものが挙げられる。

【００１９】１）二種類のポリペプチドのうち、少なく
とも一種のポリペプチドは第一のＤＮＡポリメラーゼ構
成ポリペプチドであるＤＮＡポリメラーゼであって、
３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリ
メラーゼ。

【００２０】２）二種類のポリペプチドのうち、少なく
とも一種のポリペプチドは第二のＤＮＡポリメラーゼ構
成ポリペプチドであるＤＮＡポリメラーゼであって、
３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリ
メラーゼ。

【００２１】３）第一のＤＮＡポリメラーゼ構成ポリペ
プチド及び第二のＤＮＡポリメラーゼ構成ポリペプチド
から構成されるＤＮＡポリメラーゼであって、３’→
５’エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラー
ゼ。

【００２２】本明細書において、ＤＮＡポリメラーゼの
１単位は、次のようにして決定される。活性を測定しよ
うとする試料を含む反応液〔２０ｍＭトリス−塩酸（ｐ
Ｈ７．７）、１５ｍＭ ＭｇＣｌ₂ 、２ｍＭ ２−メル
カプトエタノール、０．２ｍｇ／ｍＬ活性化ＤＮＡ、４
０μＭ ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ、６
０ｎＭ〔 ³Ｈ〕ｄＴＴＰ（アマシャム社製）〕５０μＬ
を、７５℃で１５分間インキュベートする。そのうちの
４０μＬをＤＥペーパー（ワットマン社製）にスポット
し、５％Ｎａ₂ ＨＰＯ₄ 水溶液で洗浄を５回行った後に
ＤＥペーパー上に残存する放射活性を液体シンチレーシ
ョンカウンターで測定する。３０分間あたりに１０ｎｍ
ｏｌの〔 ³Ｈ〕ｄＴＭＰを基質ＤＮＡに取り込む酵素量
を酵素１単位とする。

【００２３】また、３’→５’エキソヌクレアーゼ活性
は次のようにして検出することができる。ｐＵＣ１１８
プラスミドからヘルパーファージを利用して一本鎖ＤＮ
Ａを調製し、これに相補的な配列を有する４０鎖長のＤ
ＮＡ（ｄ４０ｍｅｒ）を化学合成する。このｄ４０ｍｅ
ｒの５’末端を³²Ｐで標識した後、ｐＵＣ１１８一本鎖
ＤＮＡと混合し、アニールさせて鋳型プライマーを得
る。２ｍＭ ＭｇＣｌ₂、２ｍＭ ２−メルカプトエタ
ノールを含む２０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ８．８）緩衝
液に、測定対象となるタンパク質を含有する溶液とこの
鋳型プライマーを添加し、６５℃でインキュベートす
る。数分後、反応停止液（９５％ホルムアミド）を加え
て８Ｍ尿素を含むポリアクリルアミドゲル電気泳動に付
し、ゲルにおける標識化合物の分布より３’→５’エキ
ソヌクレアーゼ活性を検出する。

【００２４】なお、本明細書に記載の「機能的同等物」
とは、以下のようなものをいう。天然に存在するタンパ
ク質にはそれをコードする遺伝子の多形や変異の他、生
成後のタンパク質の生体内および精製中の修飾反応など
によってそのアミノ酸配列中にアミノ酸の欠失、挿入、
付加、置換等の変異が起こりうるが、それにもかかわら
ず変異を有しないタンパク質と実質的に同等の生理学的
活性、生物学的活性を示すものがあることが知られてい
る。このように構造的に差異があってもその機能や活性
については大きな違いが認められないものを機能的同等
物と呼ぶ。ここで変異したアミノ酸の数は、実質的に同
等の生理学的活性、生物学的活性を示すものであるかぎ
り特に限定されるものではないが、例えば１個以上の変
異（欠失、挿入、付加、置換等）などが例示される。

【００２５】人為的にタンパク質のアミノ酸配列に上記
のような変異を導入した場合も同様であり、この場合に
はさらに多種多様の変異体を作製することが可能であ
る。たとえば、大腸菌で発現されたタンパク質のＮ末端
に存在するメチオニン残基は多くの場合メチオニンアミ
ノペプチダーゼの作用により除去されるとされている
が、タンパク質の種類によってはその除去が完全には行
われず、メチオニン残基を持つもの、持たないものの両
方が生成される。しかしこのメチオニン残基の有無はタ
ンパク質の活性には影響を与えない場合が多い。また、
ヒトインターロイキン２（ＩＬ−２）のアミノ酸配列中
のあるシステイン残基をセリンに置換したポリペプチド
がインターロイキン２活性を保持することが知られてい
る〔サイエンス（Science)、第２２４巻、１４３１頁
（１９８４）〕。

【００２６】さらに、遺伝子工学的にタンパク質の生産
を行う際には融合タンパク質として発現させることがし
ばしば行われる。たとえば目的タンパク質の発現量を増
加させるためにＮ末端に他のタンパク質由来のＮ末端ペ
プチド鎖を付加したり、目的タンパク質のＮ末端、ある
いはＣ末端に適当なペプチド鎖を付加して発現させ、こ
のペプチド鎖に親和性を持つ担体を使用することにより
目的タンパク質の精製を容易にすることなどが行われて
いる。したがって本発明のＤＮＡポリメラーゼとは一部
異なったアミノ酸配列を有するＤＮＡポリメラーゼであ
っても、それが本発明のＤＮＡポリメラーゼと本質的に
同等の活性を示す限りにおいて、該タンパク質は「機能
的同等物」として本発明の範囲内に属するものである。

【００２７】次に、本発明のＤＮＡポリメラーゼを生産
する方法を説明する。

【００２８】例えば、本発明のＤＮＡを含有する発現ベ
クターを含有する形質転換体を、本発明のＤＮＡにコー
ドされるポリペプチドの発現可能な条件下で培養するこ
とにより本発明のＤＮＡポリメラーゼを生産することが
できる。

【００２９】形質転換体の培養条件としては特に限定さ
れるものではなく、本発明のＤＮＡの発現可能な条件で
あれば良い。例えばベクターとしてラムダファージベク
ターλＳＣＲＥＥＮ−１とＰｈａｇｅ Ｍａｋｅｒ^TM
Ｓｙｓｔｅｍ ＰｈａｇｅＰａｃｋ Ｅｘｔｒａｃｔ
〔共にノヴァジェン（Ｎｏｖａｇｅｎ）社製〕を用いて
得られる形質転換体の場合、選択圧としてのアンピシリ
ンを含むＬＢ培地で培養し、適当な時期にＩＰＴＧ（イ
ソプロピル−チオ−β−Ｄ−ガラクトシド）による発現
誘導をかければよい。他のベクター及び宿主を用いて得
られた形質転換体においても、適当な選択圧をかけた培
地中でタンパク質の発現に適した条件で培養すればよ
い。このように培養して目的のタンパク質を発現させ
る。

【００３０】発現されたタンパク質は、当該分野で知ら
れる公知のタンパク質の精製方法により回収、精製する
ことができる。

【００３１】本発明のＤＮＡポリメラーゼの発現は、た
とえば上記の形質転換体から調製した粗抽出液を試料と
し、上記の活性化ＤＮＡを基質に用いるＤＮＡポリメラ
ーゼ活性測定を行うことにより、確認することができ
る。

【００３２】本発明のＤＮＡポリメラーゼの生産に使用
できる、上記の発現ベクター、上記の形質転換体も本発
明に包含される。

【００３３】本発明の発現ベクターは、本発明のＤＮＡ
を含有してなる発現ベクターである。このような発現ベ
クターは、本発明のＤＮＡを、大腸菌等の宿主に安定に
保持させることができる。かかる発現ベクターの構築に
用いられるベクターとしては、例えばｐＥＴ２１ａ、ｐ
ＵＣ１１８、ｐＷＨ５、ｐＴＶ１１８、ｐＳＣＲＥＥＮ
−１ｂ等が挙げられるが、本発明のＤＮＡが挿入でき、
発現可能なベクターであれば特に限定されない。ＤＮＡ
をベクターに挿入する方法は特に限定されるものではな
く、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いる方法等の公知の方法を
用いることができる。

【００３４】本発明の形質転換体は、本発明の発現ベク
ターによって形質転換されてなるものである。このよう
な形質転換体は、本発明の発現ベクターを宿主に導入す
ることにより得られる。宿主としては、大腸菌、バチル
ス属等の細菌、サッカロミセス・セレビシエ等の酵母、
アスペルギルス属、ピキア・パストリス等の真菌の他、
昆虫細胞、ＣＯＳ−７、Ｖｅｒｏ細胞等の動物細胞を用
いることができる。発現ベクターを宿主に導入する方法
としては、例えば、リン酸カルシウム法、ＣａＣｌ₂
法、ＤＥＡＥデキストラン法、エレクトロポーレーショ
ン法等の公知の方法が挙げられる。かかる形質転換体
は、例えば用いた発現ベクターの選択マーカーを指標と
することにより選択することができ、また、例えば該形
質転換体より抽出したＤＮＡと本発明のＤＮＡを特異的
に検出可能なプローブを用いたハイブリダイゼーション
により、所望のＤＮＡが導入されていることを確認する
ことができる。

【００３５】本発明の形質転換体の具体例として、配列
番号：７に示される塩基配列からなるＤＮＡを有する発
現ベクターが導入された形質転換体をEscherichia coli
ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＭＪＤＰ１と、及び配列番
号：８に示される塩基配列からなるＤＮＡを有する発現
ベクターが導入された形質転換体をEscherichia coliＢ
Ｌ２１（ＤＥ３）／ｐＭＪＤＰ２とそれぞれ命名、表示
された組み換え大腸菌が挙げられる。かかる組み換え大
腸菌は、日本国茨城県つくば市東１丁目１番３号の通商
産業省工業技術院生命工学工業技術研究所に、１９９７
年１１月１１日より、Escherichia coli ＢＬ２１（Ｄ
Ｅ３）／ｐＭＪＤＰ１がＦＥＲＭ Ｐ−１６５１２とし
て、及びEscherichia coli ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＭ
ＪＤＰ２がＦＥＲＭ Ｐ−１６５１３として寄託されて
いる。

【００３６】上記のように、本発明のＤＮＡポリメラー
ゼを構成するポリペプチドをコードするＤＮＡはクロー
ニングされているので、これらのＤＮＡを導入した形質
転換体を作製して本発明のＤＮＡポリメラーゼを大量生
産することが可能である。この場合、１）第一のＤＮＡ
ポリメラーゼ構成ポリペプチドをコードするＤＮＡと、
第二のＤＮＡポリメラーゼ構成ポリペプチドをコードす
るＤＮＡの両方を含有する形質転換体を培養し、培養物
からＤＮＡポリメラーゼを採取する方法、２）第一のＤ
ＮＡポリメラーゼ構成ポリペプチドをコードするＤＮＡ
を含有する形質転換体と、第二のＤＮＡポリメラーゼ構
成ポリペプチドをコードするＤＮＡを含有する形質転換
体とをそれぞれ個別に培養し、培養物中に含まれるＤＮ
Ａポリメラーゼ構成ポリペプチドを混合することにより
ＤＮＡポリメラーゼを採取する方法等の方法が挙げられ
る。

【００３７】ここで、「第一のＤＮＡポリメラーゼ構成
ポリペプチドをコードするＤＮＡと、第二のＤＮＡポリ
メラーゼ構成ポリペプチドをコードするＤＮＡの両方を
含有する形質転換体」とは、それぞれのＤＮＡを含有す
る二つの発現ベクターで同時形質転換されたものであっ
てもよく、あるいは両方のＤＮＡが一つの発現ベクター
に組み込まれてそれぞれのポリペプチドが発現できるよ
うに調製された形質転換体であってもよい。

【００３８】

【実施例】以下、実施例をもって本発明を更に詳細に説
明するが、本発明はかかる実施例に限定されるものでは
ない。

【００３９】実施例１ （１）メタノコッカス・ヤナシ ゲノムＤＮＡの調製 メタノコッカス・ヤナシＤＳＭ２６６１^T をＤＳＭ（ド
イッチェ ザムルンクフォン ミクロオルガニスメン
ウント ツェルクルチュウレンＧｍｂＨ）の指定する条
件により嫌気的に培養した。５００ｍＬの培養物から得
た菌体約５２ｍｇを、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１００ｍＭ
ＮａＣｌを含む、１０ｍＬの１０ｍＭトリス−塩酸（ｐ
Ｈ８．０）緩衝液に懸濁した後、１０％ＳＤＳを１．５
ｍＬ加えた。さらに２０ｍｇ／ｍＬのプロテイナーゼＫ
を５０μＬ加えて５５℃で６０分間インキュベートし
た。この懸濁液をフェノール抽出処理、クロロホルム抽
出処理に付した後、得られた上清をエタノール沈澱処理
に付し、長鎖ＤＮＡを回収した。ＤＮＡを１ｍＬのＴＥ
バッファー（１０ｍＭトリス−塩酸、１ｍＭ ＥＤＴ
Ａ、ｐＨ８．０）に溶かし、２５０ｍｇ／ｍＬのＲＮａ
ｓｅを５μＬ加え、３７℃で１時間インキュベートし
た。このものをフェノール抽出処理、クロロホルム抽出
処理に付した後、得られた上清をエタノール沈澱処理に
付し、再度ＤＮＡを回収した。以上の操作により６６０
μｇのＤＮＡを得た。

【００４０】（２）ＰＣＲによる目的ＤＮＡ領域の増幅 メタノコッカス・ヤナシのゲノムＤＮＡの全塩基配列は
既に明らかにされており〔サイエンス（Science ）第２
７３巻、１０５８〜１０７８頁（１９９６）〕、各オー
プンリーディングフレームについても名称が付されてい
る。しかしながら、ＤＮＡポリメラーゼについては、α
型ＤＮＡポリメラーゼのオープンリーディングフレーム
が記載されているのみである。

【００４１】メタノコッカス・ヤナシのゲノムＤＮＡを
詳細に調べたところ、ピロコッカス・フリオサスの非−
α型、非−ポルＩ型ＤＮＡポリメラーゼ構成タンパク質
をコードするＤＮＡと配列上の相同性を示すオープンリ
ーディングフレームが見出された。しかしながら、ピロ
コッカス・フリオサスのゲノム上においてはこれら２種
の構成タンパク質をコードするオープンリーディングフ
レームは隣接しているのに対し、メタノコッカス・ヤナ
シではこの２つのオープンリーディングフレームはゲノ
ム上の遠く隔たった位置に存在していた。これらのオー
プンリーディングフレームはＭＪ０７０２とＭＪ１６３
０であった。

【００４２】図１、図２及び図３に、ピロコッカス・フ
リオサス由来の非−α型、非−ポルＩ型ＤＮＡポリメラ
ーゼを構成する２種のタンパク質（ＰｆｕＤＰ１、Ｐｆ
ｕＤＰ２）のアミノ酸配列と、該タンパク質と相同性を
示す、メタノコッカス・ヤナシ由来のオープンリーディ
ングフレーム（ＭＪ０７０２とＭＪ１６３０）にコード
されるポリペプチドのアミノ酸配列とを比較した結果を
示す図を示す。

【００４３】図１、図２及び図３から、約６９ｋＤａの
ＰｆｕＤＰ１のアミノ酸配列と、ＭＪ０７０２にコード
されるポリペプチドのアミノ酸配列とは約４０％共通し
ており、約１４３ｋＤａのＰｆｕＤＰ２のアミノ酸配列
と、ＭＪ１６３０にコードされるポリペプチドのアミノ
酸配列とは約６０％共通していることが分かる。しかし
ながら、その機能は全く不明である。

【００４４】そこでこの２つのオープンリーディングフ
レームにおける遺伝子をクローニングするために、配列
表の配列番号：３、配列番号：４、配列番号：５及び配
列番号：６に示される４種類のオリゴヌクレオチドを合
成した。これらのうち、配列番号：３に示されるオリゴ
ヌクレオチドと配列番号：４に示されるオリゴヌクレオ
チドとの組み合わせ、そして配列番号：５に示されるオ
リゴヌクレオチドと配列番号：６に示されるオリゴヌク
レオチドとの組み合わせをそれぞれプライマーのセット
とした。オリゴヌクレオチドを２０ｐｍｏｌずつ、即ち
プライマー１セットで計４０ｐｍｏｌ用い、上記の
（１）で調製したゲノムＤＮＡ１ｍｇを鋳型として全量
５０μＬの反応系でＰＣＲを行った。

【００４５】具体的には、９８℃で２分間インキュベー
トした後、ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼ（ＴＯＹＯＢ
Ｏ）を２．５単位加えた後、９４℃で０．５分間、５５
℃で０．５分間、そして７２℃で０．５分間のインキュ
ベートを４０サイクル行った。ＰＣＲ終了後の反応液５
μＬをアガロースゲル電気泳動に付したところ、それぞ
れ目的の鎖長（約１８００塩基対、３４５０塩基対）の
ＤＮＡバンドが検出された。約１８００塩基対のＤＮＡ
がオープンリーディングフレームＭＪ０７０２であり、
約３４５０塩基対のＤＮＡがオープンリーディングフレ
ームＭＪ１６３０である。

【００４６】（３）目的の遺伝子のベクターへの組込み 上記の（２）のＰＣＲ反応液を限外ろ過フィルターＳｕ
ｐｒｅｃ−０２（ＴＡＫＡＲＡ）を用いて精製した後、
制限酵素ＮｄｅＩ及びＢａｍＨＩを添加してＤＮＡを切
断した。こうして得られた、５’末端にＮｄｅＩ配列、
３’末端にＢａｍＨＩ配列を有する断片をベクターｐＥ
Ｔ２１ａ（ＴＡＫＡＲＡ）のＮｄｅＩ−ＢａｍＨＩ部位
へ挿入して発現ベクターを得た。該発現ベクターを含む
ライゲーション反応液を大腸菌ＪＭ１０９コンピテント
セル（ＴＡＫＡＲＡ）に加え、氷上に静置して宿主の形
質転換を行った。得られた形質転換体からプラスミドを
回収し、その塩基配列を確認することによって、目的の
クローンを選択した。

【００４７】（４）形質転換体の培養及び粗抽出液の調
製 上記の（３）で単離した、オープンリーディングフレー
ムＭＪ０７０２を含むプラスミドをｐＭＪＤＰ１と、オ
ープンリーディングフレームＭＪ１６３０を含むプラス
ミドをｐＭＪＤＰ２と命名し、両者をそれぞれ発現用大
腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）に導入した。ｐＭＪＤＰ１を導
入した形質転換体である大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐ
ＭＪＤＰ１、及びｐＭＪＤＰ２を導入した形質転換体で
ある大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＭＪＤＰ２につい
て、それぞれを１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含む
ＬＢ培地５ｍＬに植菌し、３７℃で培養した。培養液の
濁度が０．６（Ａ₆₀₀ ）のとき、発現誘導物質であるイ
ソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴ
Ｇ）を１ｍＭの濃度で添加し、さらに５時間培養を行っ
た。

【００４８】培養終了後に集菌し、集菌後、１５０μＬ
のバッファーＡ（５０ｍＭトリス−塩酸、ｐＨ８．０、
２ｍＭ ２−メルカプトエタノール、１０％グリセロー
ル）に得られた菌体を懸濁し、超音波処理により菌体破
砕を行った。菌体破砕物の遠心分離により上清を回収
し、得られた上清を８０℃で１５分間の熱処理に付すこ
とにより、大腸菌宿主の所有するＤＮＡポリメラーゼを
失活させた。再び遠心分離を行い、上清を回収して粗抽
出液とした。対照として、目的の遺伝子を含まないベク
ターｐＥＴ２１ａを導入した大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）
からも同様の抽出液を調製した。

【００４９】（５）ＤＮＡポリメラーゼの活性測定 反応溶液として、２ｍＭ ＭｇＣｌ₂ 、２ｍＭ ２−メ
ルカプトエタノール、０．２ｍｇ／ｍＬ仔牛胸腺ＤＮＡ
（活性化したもの）、４０μＭ ｄＮＴＰ（３ｎＭの
〔α³²Ｐ〕ｄＣＴＰまたは６０ｎＭの〔ｍｅｔｈｙｌ ³
Ｈ〕ｄＴＴＰを含む）を含む２０ｍＭトリス−塩酸（ｐ
Ｈ８．８）緩衝液を用意した。この反応溶液４５μＬ
に、上記の（４）で得られた粗抽出液５μＬを加え、６
５℃で１０分間インキュベートした。インキュベーショ
ン後の反応溶液の一部をＤＥ８１ペーパーフィルターに
スポットし、次いでこのフィルターを５％Ｎａ₂ ＨＰＯ
₄ 水溶液で５回洗浄した。そして、フィルター上に残存
する放射活性をオートラジオグラフィー及び液体シンチ
レーションカウンターで測定した。結果を図４及び図５
に示す。

【００５０】図４及び図５より、オープンリーディング
フレームＭＪ０７０２及びＭＪ１６３０にコードされる
ポリペプチドの両者が混合された時にＤＮＡポリメラー
ゼ活性が現れることが分かる。

【００５１】（６）３’→５’エキソヌクレアーゼ活性
の測定 ｐＵＣ１１８プラスミドからヘルパーファージを利用し
て一本鎖ＤＮＡを調製し、これに相補的な配列を有する
４０鎖長のＤＮＡ（ｄ４０ｍｅｒ）を化学合成した。ｄ
４０ｍｅｒの５’末端を³²Ｐで標識した後、ｐＵＣ１１
８一本鎖ＤＮＡと混合し、アニールさせて鋳型プライマ
ーとした。２ｍＭ ＭｇＣｌ₂ 、２ｍＭ２−メルカプト
エタノールを含む２０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ８．８）
緩衝液に、上記の（４）で得られた粗抽出液とこの鋳型
プライマーを添加し、６５℃でインキュベートした。２
分後、５分後、１０分後、１５分後にそれぞれ等量ずつ
サンプリングし、反応停止液（９５％ホルムアミド）を
加えた後、８Ｍ尿素を含むポリアクリルアミドゲル電気
泳動にかけた。泳動終了後、ゲルを乾燥させ、オートラ
ジオグラフィーにより反応産物を検出した。結果を図６
に示す。

【００５２】図６より、メタノコッカス・ヤナシのオー
プンリーディングフレームＭＪ０７０２及びＭＪ１６３
０にコードされるポリペプチドの両者が混合された時
に、ＤＮＡ合成活性と共に校正機能として有用な３’→
５’エキソヌクレアーゼ活性も検出されたことが分か
る。

【００５３】このように、本発明のＤＮＡポリメラーゼ
は、現存するＤＮＡポリメラーゼとは大きく性質の異な
るピロコッカス・フリオサス由来の非−α型、非−ポル
Ｉ型ＤＮＡポリメラーゼと高い相同性を有するものであ
り、３’→５’エキソヌクレアーゼ活性も有するもので
ある。本発明のＤＮＡポリメラーゼ及びピロコッカス・
フリオサス由来の非−α型、非−ポルＩ型ＤＮＡポリメ
ラーゼは、従来のどのファミリーにも属さない、新規な
ファミリーを形成するものと思われる。

【００５４】

【発明の効果】本発明のＤＮＡポリメラーゼ遺伝子は、
３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を有するタンパク質
をコードするものであり、遺伝子工学の分野に有用で、
目的に応じて優れた性質を有するＤＮＡポリメラーゼを
コードする遺伝子である。さらに本発明のＤＮＡポリメ
ラーゼは、現存するＤＮＡポリメラーゼとは大きく性質
の異なるピロコッカス・フリオサス由来の非−α型、非
−ポルＩ型ＤＮＡポリメラーゼと高い相同性を有するも
のであり、新たなＤＮＡポリメラーゼファミリーを提案
し得るものである。

【００５５】

【配列表】

配列番号：１ 配列の長さ：５９４ 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列： Met Glu Ile Ile Asn Lys Phe Leu Asp Leu Glu Ala Leu Leu Ser 5 10 15 Pro Thr Val Tyr Glu Lys Leu Lys Asn Phe Asp Glu Glu Lys Leu 20 25 30 Lys Arg Leu Ile Gln Lys Ile Arg Glu Phe Lys Lys Tyr Asn Asn 35 40 45 Ala Phe Ile Leu Leu Asp Glu Lys Phe Leu Asp Ile Phe Leu Gln 50 55 60 Lys Asp Leu Asp Glu Ile Ile Asn Glu Tyr Lys Asp Phe Asp Phe 65 70 75 Ile Phe Tyr Tyr Thr Gly Glu Glu Glu Lys Glu Lys Pro Lys Glu 80 85 90 Val Lys Lys Glu Ile Lys Lys Glu Thr Glu Glu Lys Ile Glu Lys 95 100 105 Glu Lys Ile Glu Phe Val Lys Lys Glu Glu Lys Glu Gln Phe Ile 110 115 120 Lys Lys Ser Asp Glu Asp Val Glu Glu Lys Leu Lys Gln Leu Ile 125 130 135 Ser Lys Glu Glu Lys Lys Glu Asp Phe Asp Ala Glu Arg Ala Lys 140 145 150 Arg Tyr Glu His Ile Thr Lys Ile Lys Glu Ser Val Asn Ser Arg 155 160 165 Ile Lys Trp Ile Ala Lys Asp Ile Asp Ala Val Ile Glu Ile Tyr 170 175 180 Glu Asp Ser Asp Val Ser Gly Lys Ser Thr Cys Thr Gly Thr Ile 185 190 195 Glu Asp Phe Val Lys Tyr Phe Arg Asp Arg Phe Glu Arg Leu Lys 200 205 210 Val Phe Ile Glu Arg Lys Ala Gln Arg Lys Gly Tyr Pro Leu Lys 215 220 225 Asp Ile Lys Lys Met Lys Gly Gln Lys Asp Ile Phe Val Val Gly 230 235 240 Ile Val Ser Asp Val Asp Ser Thr Arg Asn Gly Asn Leu Ile Val 245 250 255 Arg Ile Glu Asp Thr Glu Asp Glu Ala Thr Leu Ile Leu Pro Lys 260 265 270 Glu Lys Ile Glu Ala Gly Lys Ile Pro Asp Asp Ile Leu Leu Asp 275 280 285 Glu Val Ile Gly Ala Ile Gly Thr Val Ser Lys Ser Gly Ser Ser 290 295 300 Ile Tyr Val Asp Glu Ile Ile Arg Pro Ala Leu Pro Pro Lys Glu 305 310 315 Pro Lys Arg Ile Asp Glu Glu Ile Tyr Met Ala Phe Leu Ser Asp 320 325 330 Ile His Val Gly Ser Lys Glu Phe Leu His Lys Glu Phe Glu Lys 335 340 345 Phe Ile Arg Phe Leu Asn Gly Asp Val Asp Asn Glu Leu Glu Glu 350 355 360 Lys Val Val Ser Arg Leu Lys Tyr Ile Cys Ile Ala Gly Asp Leu 365 370 375 Val Asp Gly Val Gly Val Tyr Pro Gly Gln Glu Glu Asp Leu Tyr 380 385 390 Glu Val Asp Ile Ile Glu Gln Tyr Arg Glu Ile Ala Met Tyr Leu 395 400 405 Asp Gln Ile Pro Glu His Ile Ser Ile Ile Ile Ser Pro Gly Asn 410 415 420 His Asp Ala Val Arg Pro Ala Glu Pro Gln Pro Lys Leu Pro Glu 425 430 435 Lys Ile Thr Lys Leu Phe Asn Arg Asp Asn Ile Tyr Phe Val Gly 440 445 450 Asn Pro Cys Thr Leu Asn Ile His Gly Phe Asp Thr Leu Leu Tyr 455 460 465 His Gly Arg Ser Phe Asp Asp Leu Val Gly Gln Ile Arg Ala Ala 470 475 480 Ser Tyr Glu Asn Pro Val Thr Ile Met Lys Glu Leu Ile Lys Arg 485 490 495 Arg Leu Leu Cys Pro Thr Tyr Gly Gly Arg Cys Pro Ile Ala Pro 500 505 510 Glu His Lys Asp Tyr Leu Val Ile Asp Arg Asp Ile Asp Ile Leu 515 520 525 His Thr Gly His Ile His Ile Asn Gly Tyr Gly Ile Tyr Arg Gly 530 535 540 Val Val Met Val Asn Ser Gly Thr Phe Gln Glu Gln Thr Asp Phe 545 550 555 Gln Lys Arg Met Gly Ile Ser Pro Thr Pro Ala Ile Val Pro Ile 560 565 570 Ile Asn Met Ala Lys Val Gly Glu Lys Gly His Tyr Leu Glu Trp 575 580 585 Asp Arg Gly Val Leu Glu Val Arg Tyr 590

【００５６】配列番号：２ 配列の長さ：１１３９ 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列： Met Ile Val Met Val His Val Ala Cys Ser Glu Asn Met Lys Lys 5 10 15 Tyr Phe Glu Asn Ile Val Asp Glu Val Lys Lys Ile Tyr Arg Ile 20 25 30 Ala Glu Glu Cys Arg Lys Lys Gly Phe Asp Pro Thr Asp Glu Val 35 40 45 Glu Ile Pro Leu Ala Ala Asp Met Ala Asp Arg Val Glu Gly Leu 50 55 60 Val Gly Pro Lys Gly Val Ala Glu Arg Ile Arg Glu Leu Val Lys 65 70 75 Glu Leu Gly Lys Glu Pro Ala Ala Leu Glu Ile Ala Lys Glu Ile 80 85 90 Val Glu Gly Lys Phe Gly Asn Phe Asp Lys Glu Lys Lys Ala Glu 95 100 105 Gln Ala Val Arg Thr Ala Leu Ala Val Leu Thr Glu Gly Ile Val 110 115 120 Ala Ala Pro Leu Glu Gly Ile Ala Asp Val Lys Ile Lys Lys Asn 125 130 135 Pro Asp Gly Thr Glu Tyr Leu Ala Ile Tyr Tyr Ala Gly Pro Ile 140 145 150 Arg Ser Ala Gly Gly Thr Ala Gln Ala Leu Ser Val Leu Val Gly 155 160 165 Asp Phe Val Arg Lys Ala Met Gly Leu Asp Arg Tyr Lys Pro Thr 170 175 180 Glu Asp Glu Ile Glu Arg Tyr Val Glu Glu Val Glu Leu Tyr Gln 185 190 195 Ser Glu Val Gly Ser Phe Gln Tyr Asn Pro Thr Ala Asp Glu Ile 200 205 210 Arg Thr Ala Ile Arg Asn Ile Pro Ile Glu Ile Thr Gly Glu Ala 215 220 225 Thr Asp Asp Val Glu Val Ser Gly His Arg Asp Leu Pro Arg Val 230 235 240 Glu Thr Asn Gln Leu Arg Gly Gly Ala Leu Leu Val Leu Val Glu 245 250 255 Gly Val Leu Leu Lys Ala Pro Lys Ile Leu Arg His Val Asp Lys 260 265 270 Leu Gly Ile Glu Gly Trp Asp Trp Leu Lys Asp Leu Met Ser Lys 275 280 285 Lys Glu Glu Lys Glu Glu Glu Lys Asp Glu Lys Val Asp Asp Glu 290 295 300 Glu Ile Asp Glu Glu Glu Glu Glu Ile Ser Gly Tyr Trp Arg Asp 305 310 315 Val Lys Ile Glu Ala Asn Lys Lys Phe Ile Ser Glu Val Ile Ala 320 325 330 Gly Arg Pro Val Phe Ala His Pro Ser Lys Val Gly Gly Phe Arg 335 340 345 Leu Arg Tyr Gly Arg Ser Arg Asn Thr Gly Phe Ala Thr Gln Gly 350 355 360 Phe His Pro Ala Leu Met Tyr Leu Val Asp Glu Phe Met Ala Val 365 370 375 Gly Thr Gln Leu Lys Thr Glu Arg Pro Gly Lys Ala Thr Cys Val 380 385 390 Val Pro Val Asp Ser Ile Glu Pro Pro Ile Val Lys Leu Lys Asn 395 400 405 Gly Asp Val Ile Arg Val Asp Thr Ile Glu Lys Ala Met Asp Val 410 415 420 Arg Asn Arg Val Glu Glu Ile Leu Phe Leu Gly Asp Val Leu Val 425 430 435 Asn Tyr Gly Asp Phe Leu Glu Asn Asn His Pro Leu Leu Pro Ser 440 445 450 Cys Trp Cys Glu Glu Trp Tyr Glu Lys Ile Leu Ile Ala Asn Asn 455 460 465 Ile Glu Tyr Asp Lys Asp Phe Ile Lys Asn Pro Lys Pro Glu Glu 470 475 480 Ala Val Lys Phe Ala Leu Glu Thr Lys Thr Pro Leu His Pro Arg 485 490 495 Phe Thr Tyr His Trp His Asp Val Ser Lys Glu Asp Ile Ile Leu 500 505 510 Leu Arg Asn Trp Leu Leu Lys Gly Lys Glu Asp Ser Leu Glu Gly 515 520 525 Lys Lys Val Trp Ile Val Asp Leu Glu Ile Glu Glu Asp Lys Lys 530 535 540 Ala Lys Arg Ile Leu Glu Leu Ile Gly Cys Cys His Leu Val Arg 545 550 555 Asn Lys Lys Val Ile Ile Glu Glu Tyr Tyr Pro Leu Leu Tyr Ser 560 565 570 Leu Gly Phe Asp Val Glu Asn Lys Lys Asp Leu Val Glu Asn Ile 575 580 585 Glu Lys Ile Leu Glu Ser Ala Lys Asn Ser Met His Leu Ile Asn 590 595 600 Leu Leu Ala Pro Phe Glu Val Arg Arg Asn Thr Tyr Val Tyr Val 605 610 615 Gly Ala Arg Met Gly Arg Pro Glu Lys Ala Ala Pro Arg Lys Met 620 625 630 Lys Pro Pro Val Asn Gly Leu Phe Pro Ile Gly Asn Ala Gly Gly 635 640 645 Gln Val Arg Leu Ile Asn Lys Ala Val Glu Glu Asn Asn Thr Asp 650 655 660 Asp Val Asp Val Ser Tyr Thr Arg Cys Pro Asn Cys Gly Lys Ile 665 670 675 Ser Leu Tyr Arg Val Cys Pro Phe Cys Gly Thr Lys Val Glu Leu 680 685 690 Asp Asn Phe Gly Arg Ile Lys Ala Pro Leu Lys Asp Tyr Trp Tyr 695 700 705 Ala Ala Leu Lys Arg Leu Gly Ile Asn Lys Pro Gly Asp Val Lys 710 715 720 Cys Ile Lys Gly Met Thr Ser Lys Gln Lys Ile Val Glu Pro Leu 725 730 735 Glu Lys Ala Ile Leu Arg Ala Ile Asn Glu Val Tyr Val Phe Lys 740 745 750 Asp Gly Thr Thr Arg Phe Asp Cys Thr Asp Val Pro Val Thr His 755 760 765 Phe Lys Pro Asn Glu Ile Asn Val Thr Val Glu Lys Leu Arg Glu 770 775 780 Leu Gly Tyr Asp Lys Asp Ile Tyr Gly Asn Glu Leu Val Asp Gly 785 790 795 Glu Gln Val Val Glu Leu Lys Pro Gln Asp Val Ile Ile Pro Glu 800 805 810 Ser Cys Ala Glu Tyr Phe Val Lys Val Ala Asn Phe Ile Asp Asp 815 820 825 Leu Leu Glu Lys Phe Tyr Lys Val Glu Arg Phe Tyr Asn Val Lys 830 835 840 Lys Lys Glu Asp Leu Ile Gly His Leu Val Ile Gly Met Ala Pro 845 850 855 His Thr Ser Ala Gly Met Val Gly Arg Ile Ile Gly Tyr Thr Lys 860 865 870 Ala Asn Val Gly Tyr Ala His Pro Tyr Phe His Ala Ala Lys Arg 875 880 885 Arg Asn Cys Asp Gly Asp Glu Asp Ser Phe Phe Leu Leu Leu Asp 890 895 900 Ala Phe Leu Asn Phe Ser Lys Lys Phe Leu Pro Asp Lys Arg Gly 905 910 915 Gly Gln Met Asp Ala Pro Leu Val Leu Thr Thr Ile Leu Asp Pro 920 925 930 Lys Glu Val Asp Gly Glu Val His Asn Met Asp Thr Met Trp Ser 935 940 945 Tyr Pro Leu Glu Phe Tyr Glu Lys Thr Leu Glu Met Pro Ser Pro 950 955 960 Lys Glu Val Lys Glu Phe Met Glu Thr Val Glu Asp Arg Leu Gly 965 970 975 Lys Pro Glu Gln Tyr Glu Gly Ile Gly Tyr Thr His Glu Thr Ser 980 985 990 Arg Ile Asp Leu Gly Pro Lys Val Cys Ala Tyr Lys Thr Leu Gly 995 1000 1005 Ser Met Leu Glu Lys Thr Thr Ser Gln Leu Ser Val Ala Lys Lys 1010 1015 1020 Ile Arg Ala Thr Asp Glu Arg Asp Val Ala Glu Lys Val Ile Gln 1025 1030 1035 Ser His Phe Ile Pro Asp Leu Ile Gly Asn Leu Arg Ala Phe Ser 1040 1045 1050 Arg Gln Ala Val Arg Cys Lys Cys Gly Ala Lys Tyr Arg Arg Ile 1055 1060 1065 Pro Leu Lys Gly Lys Cys Pro Lys Cys Gly Ser Asn Leu Ile Leu 1070 1075 1080 Thr Val Ser Lys Gly Ala Val Glu Lys Tyr Met Asp Val Ala Glu 1085 1090 1095 Lys Met Ala Glu Glu Tyr Asn Val Asn Asp Tyr Ile Lys Gln Arg 1100 1105 1110 Leu Lys Ile Ile Lys Glu Gly Ile Asn Ser Ile Phe Glu Asn Glu 1115 1120 1125 Lys Ser Arg Gln Val Lys Leu Ser Asp Phe Phe Lys Ile Gly 1130 1135

【００５７】配列番号：３ 配列の長さ：４０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 配列： GAAGGAGGAT ACATATGGAG ATAATAAATA AATTCTTAGA 40

【００５８】配列番号：４ 配列の長さ：４０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 配列： CTCTAAATTG GATCCTATTA ATATCTAACC TCTAAAACTC 40

【００５９】配列番号：５ 配列の長さ：４０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 配列： GCCGATTTAA GCATATGATT GTTATGGTTC ATGTTGCATG 40

【００６０】配列番号：６ 配列の長さ：４０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 配列： GACTGCAATG GATCCTATTA TCCTATCTTA AAGAAGTCAC 40

【００６１】配列番号：７ 配列の長さ：１７８２ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ 配列： ATGGAGATAA TAAATAAATT CTTAGATTTA GAGGCTTTAT TATCACCAAC TGTTTATGAA 60 AAGTTAAAAA ATTTTGATGA AGAAAAATTA AAAAGACTAA TTCAAAAAAT TAGAGAATTT 120 AAAAAATATA ACAACGCTTT TATTTTGTTA GATGAGAAGT TTTTAGACAT CTTTTTACAA 180 AAAGATTTGG ATGAAATAAT AAATGAATAT AAGGATTTTG ACTTTATATT TTACTACACT 240 GGAGAAGAAG AAAAAGAAAA ACCTAAAGAA GTAAAAAAAG AGATTAAAAA AGAAACTGAA 300 GAGAAAATAG AAAAAGAAAA AATAGAATTT GTTAAGAAAG AAGAAAAAGA ACAATTTATA 360 AAAAAATCTG ATGAAGATGT TGAAGAGAAA TTAAAACAAC TAATTTCCAA AGAAGAGAAA 420 AAAGAAGATT TCGATGCTGA GAGGGCTAAA AGATATGAAC ACATAACAAA AATAAAAGAG 480 AGTGTAAATA GTAGAATAAA ATGGATAGCT AAAGACATCG ATGCCGTGAT TGAGATATAT 540 GAAGATTCAG ACGTGTCTGG AAAATCCACA TGCACTGGAA CTATTGAGGA CTTCGTTAAA 600 TACTTTAGAG ACAGATTTGA AAGATTAAAG GTTTTTATTG AGAGAAAAGC TCAAAGAAAG 660 GGATATCCTC TAAAAGATAT AAAGAAAATG AAAGGACAGA AGGATATTTT TGTCGTAGGA 720 ATCGTTAGTG ATGTTGATAG TACAAGAAAT GGGAACTTGA TAGTTAGGAT TGAAGACACC 780 GAAGATGAAG CAACGTTAAT TCTGCCAAAA GAAAAAATCG AAGCTGGAAA AATACCTGAC 840 GATATTTTGT TAGATGAAGT TATTGGAGCT ATTGGGACTG TTAGCAAATC TGGAAGTTCA 900 ATATACGTTG ATGAAATTAT ACGTCCAGCA TTACCACCAA AAGAACCAAA GAGAATTGAT 960 GAAGAGATAT ATATGGCATT TTTATCTGAT ATTCACGTTG GAAGTAAGGA GTTTTTGCAT 1020 AAAGAGTTTG AAAAATTCAT CAGATTTTTA AATGGAGATG TTGATAATGA ATTAGAGGAA 1080 AAGGTCGTTA GCAGATTAAA ATACATCTGC ATAGCTGGGG ATTTAGTTGA TGGGGTTGGT 1140 GTCTATCCAG GGCAGGAAGA GGATTTGTAT GAGGTAGATA TTATTGAGCA GTATAGAGAA 1200 ATAGCAATGT ATTTAGATCA GATTCCAGAG CATATAAGCA TAATCATCTC CCCAGGAAAC 1260 CACGATGCTG TTAGACCAGC AGAACCTCAA CCAAAACTGC CAGAGAAAAT AACTAAGCTA 1320 TTTAATAGAG ATAACATCTA CTTCGTTGGA AACCCATGCA CTCTCAACAT CCATGGCTTT 1380 GATACTCTAT TATATCACGG CAGAAGCTTT GACGACTTAG TTGGACAAAT AAGGGCTGCA 1440 AGTTATGAAA ATCCAGTAAC TATTATGAAG GAGTTGATAA AAAGAAGGCT ATTATGTCCA 1500 ACTTATGGAG GAAGATGTCC TATAGCTCCA GAACATAAAG ATTACTTGGT TATAGATAGG 1560 GATATTGATA TTTTACACAC TGGGCATATA CACATCAACG GTTATGGAAT TTATAGAGGA 1620 GTTGTTATGG TTAATAGCGG GACATTCCAA GAGCAAACAG ATTTCCAGAA GAGGATGGGT 1680 ATTAGCCCAA CACCTGCAAT AGTTCCAATA ATAAACATGG CTAAGGTTGG GGAGAAGGGG 1740 CATTATTTAG AATGGGATAG GGGAGTTTTA GAGGTTAGAT AT 1782

【００６２】配列番号：８ 配列の長さ：３４１７ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ 配列： GTGATTGTTA TGGTTCATGT TGCATGCTCC GAAAATATGA AAAAGTATTT TGAAAACATT 60 GTTGATGAAG TTAAAAAAAT TTACAGAATA GCTGAAGAGT GTAGAAAAAA AGGTTTTGAC 120 CCAACTGATG AAGTTGAGAT TCCTTTAGCT GCTGATATGG CTGATAGAGT TGAGGGATTG 180 GTTGGGCCGA AAGGAGTAGC AGAGAGAATT AGAGAATTGG TTAAAGAGTT AGGTAAAGAA 240 CCAGCTGCAT TGGAGATAGC TAAAGAAATT GTTGAAGGAA AATTTGGAAA CTTTGATAAG 300 GAAAAAAAGG CAGAACAGGC AGTTAGAACT GCATTAGCTG TATTAACTGA AGGAATTGTT 360 GCTGCTCCAT TAGAGGGAAT TGCAGATGTT AAAATCAAAA AAAACCCAGA CGGAACTGAA 420 TATTTAGCTA TCTATTATGC AGGACCTATA AGAAGTGCTG GGGGAACTGC TCAAGCTCTA 480 TCTGTCTTAG TTGGAGATTT CGTAAGAAAG GCAATGGGTT TAGATAGATA CAAACCAACA 540 GAGGATGAGA TTGAGAGATA TGTTGAGGAG GTTGAGCTTT ACCAATCAGA AGTTGGGAGT 600 TTTCAATACA ACCCAACAGC AGATGAGATT AGAACAGCTA TAAGAAACAT CCCTATAGAG 660 ATTACTGGAG AAGCTACAGA TGATGTGGAA GTTTCAGGGC ATAGGGATTT GCCAAGGGTA 720 GAGACAAACC AACTGAGGGG AGGGGCTTTA TTAGTTTTGG TTGAGGGAGT TTTATTAAAA 780 GCTCCTAAAA TATTGAGGCA CGTTGATAAA TTAGGAATAG AGGGATGGGA CTGGCTTAAA 840 GATTTGATGA GTAAAAAAGA AGAAAAAGAG GAGGAAAAGG ATGAAAAAGT AGATGATGAA 900 GAAATAGATG AAGAGGAAGA AGAAATTAGC GGATACTGGA GAGATGTTAA AATAGAGGCA 960 AACAAAAAGT TTATAAGCGA AGTTATTGCT GGAAGGCCTG TTTTTGCCCA TCCATCAAAG 1020 GTTGGTGGAT TTAGGTTGAG ATATGGAAGG AGTAGAAACA CTGGTTTTGC TACTCAAGGA 1080 TTTCATCCTG CCTTAATGTA TTTGGTAGAT GAGTTTATGG CTGTTGGAAC CCAGCTAAAA 1140 ACTGAAAGGC CGGGAAAAGC TACATGTGTT GTGCCGGTTG ATAGCATTGA ACCACCAATT 1200 GTCAAGCTAA AAAATGGAGA TGTTATTAGA GTTGATACAA TAGAGAAAGC TATGGATGTT 1260 AGAAATAGGG TTGAGGAAAT TTTATTCTTA GGAGATGTTT TGGTTAATTA TGGGGATTTC 1320 TTAGAGAATA ATCACCCATT ATTGCCAAGT TGTTGGTGTG AGGAGTGGTA TGAGAAGATA 1380 TTGATAGCTA ATAATATAGA GTATGATAAG GATTTTATAA AGAACCCAAA GCCAGAGGAA 1440 GCTGTTAAGT TTGCTTTAGA AACAAAAACT CCACTACATC CAAGATTCAC CTATCACTGG 1500 CATGATGTTA GTAAGGAAGA TATAATCCTA TTAAGAAATT GGTTGTTGAA AGGAAAAGAA 1560 GATAGCCTTG AAGGAAAAAA AGTTTGGATT GTTGATTTAG AGATAGAGGA AGATAAAAAA 1620 GCTAAAAGAA TCTTAGAATT AATTGGCTGC TGCCACTTAG TTAGAAATAA AAAGGTTATA 1680 ATTGAGGAGT ATTACCCTCT ACTCTACTCA CTGGGCTTTG ATGTTGAAAA TAAAAAGGAT 1740 TTAGTTGAAA ATATAGAGAA AATCTTAGAG TCAGCCAAAA ATAGTATGCA TCTTATAAAC 1800 TTATTAGCTC CGTTTGAAGT TAGAAGAAAC ACTTATGTAT ATGTTGGAGC AAGGATGGGA 1860 AGGCCAGAGA AAGCAGCACC AAGAAAGATG AAACCTCCAG TTAATGGTTT ATTCCCAATA 1920 GGTAATGCTG GAGGGCAAGT GAGATTGATA AACAAGGCAG TTGAGGAAAA CAATACAGAT 1980 GATGTTGATG TTTCTTACAC AAGATGTCCA AATTGTGGAA AAATTTCATT ATATAGAGTT 2040 TGCCCATTCT GTGGAACTAA GGTAGAGTTA GATAACTTTG GAAGAATTAA AGCTCCATTA 2100 AAAGATTATT GGTATGCCGC TTTAAAGAGA TTGGGTATAA ACAAGCCAGG AGATGTTAAG 2160 TGTATTAAAG GGATGACATC CAAGCAGAAG ATTGTTGAAC CATTAGAAAA AGCTATATTG 2220 AGGGCGATAA ATGAGGTTTA TGTCTTTAAA GACGGAACTA CAAGGTTTGA TTGCACAGAT 2280 GTGCCAGTAA CCCACTTTAA ACCAAATGAG ATAAACGTTA CTGTTGAAAA ATTGAGAGAG 2340 CTTGGCTATG ATAAAGATAT TTATGGCAAT GAGTTAGTTG ATGGGGAGCA GGTCGTTGAG 2400 CTAAAACCAC AAGATGTTAT CATCCCAGAG AGTTGTGCAG AGTATTTTGT TAAGGTAGCT 2460 AATTTTATAG ATGATTTATT GGAGAAGTTT TATAAAGTTG AAAGGTTTTA CAACGTAAAG 2520 AAAAAAGAGG ATTTAATTGG GCATTTAGTC ATTGGAATGG CTCCCCACAC ATCTGCTGGA 2580 ATGGTTGGAA GAATAATTGG TTATACAAAA GCAAATGTTG GTTATGCTCA TCCTTATTTC 2640 CATGCTGCAA AGAGAAGAAA CTGTGACGGG GACGAAGATT CTTTCTTTTT GCTATTAGAC 2700 GCGTTTTTGA ACTTCTCCAA AAAATTCCTA CCAGATAAGA GAGGAGGACA GATGGATGCC 2760 CCATTAGTCT TAACAACCAT ATTAGACCCA AAGGAAGTTG ATGGAGAAGT TCATAATATG 2820 GATACAATGT GGAGCTATCC ATTAGAGTTT TATGAAAAAA CCTTAGAAAT GCCTTCACCG 2880 AAAGAAGTTA AGGAGTTTAT GGAGACAGTT GAAGATAGAT TAGGAAAGCC AGAGCAGTAT 2940 GAAGGTATTG GCTATACTCA CGAAACATCA AGAATTGACT TAGGGCCGAA GGTTTGTGCT 3000 TATAAAACAT TAGGTTCAAT GTTAGAAAAA ACCACTTCCC AATTATCAGT TGCTAAGAAA 3060 ATTAGGGCTA CAGATGAAAG AGATGTTGCT GAGAAGGTTA TTCAATCCCA CTTCATCCCA 3120 GATTTAATTG GGAATTTAAG GGCTTTCTCA AGGCAGGCAG TTAGATGTAA ATGTGGAGCT 3180 AAGTATAGAA GAATACCTTT GAAAGGGAAG TGTCCAAAAT GTGGCTCTAA TTTAATATTA 3240 ACTGTCTCAA AGGGAGCTGT TGAGAAGTAT ATGGATGTTG CAGAGAAGAT GGCTGAGGAA 3300 TATAATGTAA ATGATTATAT AAAACAAAGA TTAAAGATTA TTAAAGAGGG GATTAATTCA 3360 ATATTTGAAA ATGAAAAAAG CAGACAGGTT AAGTTGAGTG ACTTCTTTAA GATAGGA 3417

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、ピロコッカス・フリオサス由来の非−
α型、非−ポルＩ型ＤＮＡポリメラーゼを構成する２種
のタンパク質のうちの約６９ｋＤａのもの（ＰｆｕＤＰ
１）のアミノ酸配列と、該タンパク質と相同性を示す、
メタノコッカス・ヤナシ由来のオープンリーディングフ
レーム（ＭＪ０７０２）にコードされるポリペプチドの
アミノ酸配列とを比較したものである。

【図２】図２は、ピロコッカス・フリオサス由来の非−
α型、非−ポルＩ型ＤＮＡポリメラーゼを構成する２種
のタンパク質のうちの約１４３ｋＤａのもの（ＰｆｕＤ
Ｐ２）のアミノ酸配列と、該タンパク質と相同性を示
す、メタノコッカス・ヤナシ由来のオープンリーディン
グフレーム（ＭＪ１６３０）にコードされるポリペプチ
ドのアミノ酸配列とを比較したものである。

【図３】図３は、ピロコッカス・フリオサス由来の非−
α型、非−ポルＩ型ＤＮＡポリメラーゼを構成する２種
のタンパク質のうちの約１４３ｋＤａのもの（ＰｆｕＤ
Ｐ２）のアミノ酸配列と、該タンパク質と相同性を示
す、メタノコッカス・ヤナシ由来のオープンリーディン
グフレーム（ＭＪ１６３０）にコードされるポリペプチ
ドのアミノ酸配列とを比較したものである。

【図４】図４はメタノコッカス・ヤナシのオープンリー
ディングフレームＭＪ０７０２及びＭＪ１６３０にコー
ドされるポリペプチドの両者が混合された時にＤＮＡポ
リメラーゼ活性が現れることを示す図である。基質とし
て〔α³²Ｐ〕ｄＣＴＰを用いて、³²ＰがＤＮＡ合成鎖に
とり込まれていることをオートラジオグラフィーで検出
した結果である。レーン１はＴａｑポリメラーゼ（０．
２５ユニット）を用いた場合のスポット、レーン２はｐ
ＭＪＤＰ１を導入した大腸菌の粗抽出液（ＨＥ１とす
る。）３．５μｇとｐＥＴ２１ｄベクターのみを導入し
た大腸菌の粗抽出液（ＨＥ３）３．５μｇとを混合した
ものを用いた場合のスポット、レーン３はｐＭＪＤＰ２
を導入した大腸菌の粗抽出液（ＨＥ２とする。）３．５
μｇと３．５μｇのＨＥ３とを混合したものを用いた場
合のスポット、レーン４はＨＥ１とＨＥ２とを３．５μ
ｇずつ混合たものを用いた場合のスポット、レーン５は
ＨＥ３（７．０μｇ）を用いた場合のスポットである。

【図５】図５は、〔ｍｅｔｈｙｌ³ Ｈ〕ｄＴＴＰを基質
として用いての³ ＨのＤＮＡ鎖への取込みを液体シンチ
レーションカウンターで測定した結果を示す図である。
レーン１及びレーン５は反応溶液の代わりにＨ₂ Ｏを用
いた場合のデータ、レーン２はＨＥ３（１４μｇ）を用
いた場合のデータ、レーン３はＨＥ１（７．０μｇ）と
ＨＥ３（７．０μｇ）を混合したものを用いた場合のデ
ータ、レーン４はＨＥ２（７．０μｇ）とＨＥ３（７．
０μｇ）を混合したものを用いた場合のデータ、レーン
６はＨＥ１（１．７５μｇ）とＨＥ２（１．７５μｇ）
を混合したものを用いた場合のデータ、レーン７はＨＥ
１（３．５μｇ）とＨＥ２（３．５μｇ）を混合したも
のを用いた場合のデータ、レーン８はＨＥ１（５．２５
μｇ）とＨＥ２（５．２５μｇ）を混合したものを用い
た場合のデータ、レーン９はＨＥ１（７．０μｇ）とＨ
Ｅ２（７．０μｇ）を混合したものを用いた場合のデー
タ、レーン１０はＨＥ１（７．０μｇ）を用いた場合の
データ、レーン１１はＨＥ１（７．０μｇ）とＨＥ２
（１．７５μｇ）を混合したものを用いた場合のデー
タ、レーン１２はＨＥ１（７．０μｇ）とＨＥ２（３．
５μｇ）を混合したものを用いた場合のデータ、レーン
１３はＨＥ１（７．０μｇ）とＨＥ２（５．２５μｇ）
を混合したものを用いた場合のデータ、レーン１４はＨ
Ｅ１（７．０μｇ）とＨＥ２（７．０μｇ）を混合した
ものを用いた場合のデータをそれぞれ示す。

【図６】図６は、メタノコッカス・ヤナシのオープンリ
ーディングフレームＭＪ０７０２及びＭＪ１６３０の発
現産物の３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を検出した
結果を示す図である。レーン１〜４のサンプルはＨＥ１
（７．０μｇ）とＨＥ３（７．０μｇ）の混合物であ
り、レーン５〜８のサンプルはＨＥ２（７．０μｇ）と
ＨＥ３（７．０μｇ）の混合物であり、レーン９〜１２
のサンプルはＨＥ１（７．０μｇ）とＨＥ２（７．０μ
ｇ）の混合物である。レーン１３は発現産物の代わりに
Ｈ₂ Ｏを用いた場合である。レーン１、５、９はインキ
ュベート時間が２分間の場合であり、レーン２、６、１
０はインキュベート時間が５分間の場合であり、レーン
３、７、１１はインキュベート時間が１０分間の場合で
あり、レーン４、８、１２はインキュベート時間が１５
分間の場合である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 9/12 Ｃ１２Ｒ 1:19）

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 （Ａ）配列番号：１に示されるアミノ酸
   配列からなるポリぺプチドをコードするＤＮＡ、 （Ｂ）配列番号：１に示されるアミノ酸配列において、
   １個以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加された
   アミノ酸配列からなるポリぺプチドをコードするＤＮ
   Ａ、 （Ｃ）配列番号：７に示される塩基配列からなるＤＮ
   Ａ、 （Ｄ）配列番号：７に示される塩基配列において、１個
   以上の塩基が欠失、置換、挿入又は付加された塩基配列
   からなるＤＮＡ、及び （Ｅ）（Ａ）〜（Ｄ）のいずれかのＤＮＡにストリンジ
   ェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ、から選ば
   れるＤＮＡであって、３’→５’エキソヌクレアーゼ活
   性を有するＤＮＡポリメラーゼを構成するポリペプチド
   をコードするＤＮＡ。
2. 【請求項２】 （Ｆ）配列番号：２に示されるアミノ酸
   配列からなるポリぺプチドをコードするＤＮＡ、 （Ｇ）配列番号：２に示されるアミノ酸配列において、
   １個以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加された
   アミノ酸配列からなるポリぺプチドをコードするＤＮ
   Ａ、 （Ｈ）配列番号：８に示される塩基配列からなるＤＮ
   Ａ、 （Ｉ）配列番号：８に示される塩基配列において、１個
   以上の塩基が欠失、置換、挿入又は付加された塩基配列
   からなるＤＮＡ、及び （Ｊ）（Ｆ）〜（Ｉ）のいずれかのＤＮＡにストリンジ
   ェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ、から選ば
   れるＤＮＡであって、３’→５’エキソヌクレアーゼ活
   性を有するＤＮＡポリメラーゼを構成するポリペプチド
   をコードするＤＮＡ。
3. 【請求項３】 請求項１記載のＤＮＡ及び／又は請求項
   ２記載のＤＮＡを含有する発現ベクター。
4. 【請求項４】 請求項３記載の発現ベクターによって形
   質転換された形質転換体。
5. 【請求項５】 請求項４記載の形質転換体を、請求項１
   記載のＤＮＡ及び／又は請求項２記載のＤＮＡにコード
   されるポリペプチドの発現可能な条件下で培養すること
   を特徴とする、ＤＮＡポリメラーゼの生産方法。
6. 【請求項６】 請求項１記載のＤＮＡにコードされるポ
   リペプチドであって、３’→５’エキソヌクレアーゼ活
   性を有するＤＮＡポリメラーゼを構成するポリペプチ
   ド。
7. 【請求項７】 請求項２記載のＤＮＡにコードされるポ
   リペプチドであって、３’→５’エキソヌクレアーゼ活
   性を有するＤＮＡポリメラーゼを構成するポリペプチ
   ド。
8. 【請求項８】 請求項１記載のＤＮＡにコードされるポ
   リペプチドから構成されるＤＮＡポリメラーゼであっ
   て、３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡ
   ポリメラーゼ。
9. 【請求項９】 請求項２記載のＤＮＡにコードされるポ
   リペプチドから構成されるＤＮＡポリメラーゼであっ
   て、３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡ
   ポリメラーゼ。
10. 【請求項１０】 請求項６記載のポリペプチド及び請求
    項７記載のポリペプチドから構成されるＤＮＡポリメラ
    ーゼであって、３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を有
    するＤＮＡポリメラーゼ。