JP2978001B2 - ポルｉ型ｄｎａポリメラーゼ遺伝子のクローニング方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は遺伝子工学研究用試薬と
して有用なポルＩ型ＤＮＡポリメラーゼをコードする遺
伝子のクローニング方法、及びクローニングされた新規
ポルＩ型ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子に関する。

【０００２】

【従来の技術】ＤＮＡポリメラーゼは、そのアミノ酸配
列から大腸菌ＤＮＡポリメラーゼを代表とするポルＩ型
ＤＮＡポリメラーゼと、ヒトＤＮＡポリメラーゼαを代
表とするα型ＤＮＡポリメラーゼとに大きく分類するこ
とができる。今まで遺伝子工学研究用試薬として一般に
利用されているＤＮＡポリメラーゼには、大腸菌ＤＮＡ
ポリメラーゼＩ、その改変型であるクレノウ断片、Ｔ４
ファージ由来ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ７ファージ由来Ｄ
ＮＡポリメラーゼ、サーマスアクアティカス（ Thermus
aquaticus )由来耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ〔タック
（ Taq )ポリメラーゼ〕等があるが、その多くはポルＩ
型ＤＮＡポリメラーゼである。これらの酵素は、その有
する性質に応じて特定のＤＮＡの標識化や、ＤＮＡ塩基
配列決定法などにそれぞれ利用されている。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】一般にＤＮＡポリメラ
ーゼはその起源による酵素特異性を有しており、その特
性を生かした利用法がある。例えばバチルス・カルドテ
ナックス（ Bacillus caldotenax )は生育至適温度が約
７０℃である好熱性細菌であり、この細菌由来のポルＩ
型ＤＮＡポリメラーゼは高温で安定であることが予想さ
れ、遺伝子工学研究用試薬として有用な用途が期待され
る。しかしながら、これまで該ＤＮＡポリメラーゼにつ
いての詳細は明らかでなく、その製造法も確立されてい
ない。また、この酵素の遺伝子構造やアミノ酸配列につ
いても不明であり、遺伝子の単離及び当該遺伝子をベク
ターに結合して遺伝子工学的に発現させる方法について
も明らかにされていない。本発明の目的は、新規なポル
Ｉ型ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子を特定し、該遺伝子を簡
便に効率よくクローニングする方法、及び該方法により
単離された新規ポルＩ型ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子を提
供することにある。

【０００４】

【課題を解決するための手段】本発明を概説すれば、本
発明の第１の発明はポルＩ型ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子
のクローニング方法に関し、ポルＩ型ＤＮＡポリメラー
ゼ遺伝子をクローニングする方法において、下記の各工
程： （ａ）ポルＩ型ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子を、配列表の
配列番号１又は配列番号２でそれぞれ表されるプライマ
ーを用いて増幅させる工程、 （ｂ）増幅ＤＮＡをプローブとして用い、該プローブに
ハイブリダイズするポルＩ型ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子
をクローニングする工程、を包含することを特徴とす
る。また、本発明の第２の発明は、配列表の配列番号１
７で表されるアミノ酸配列、あるいは該配列に１若しく
は複数個のアミノ酸の欠失、置換、挿入、付加を有する
アミノ酸配列を含有し、かつ、ＤＮＡポリメラーゼ活性
を有するタンパクをコードするポルＩ型ＤＮＡポリメラ
ーゼ遺伝子に関する。更にまた、本発明の第３の発明
は、本発明の第２の発明のポルＩ型ＤＮＡポリメラーゼ
遺伝子にストリンジェントな条件でハイブリダイズ可能
なポルＩ型ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子に関する。本発明
の第４の発明は、配列表の配列番号１７で表されるアミ
ノ酸配列、あるいは該配列に１若しくは複数個のアミノ
酸の欠失、置換、挿入、付加を有するアミノ酸配列を含
有し、かつ、ＤＮＡポリメラーゼ活性を有することを特
徴とするポルＩ型ＤＮＡポリメラーゼに関する。そし
て、本発明の第５の発明は、上記した第２又は第３の発
明のポルＩ型ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子を含有させた組
換えプラスミドを導入した形質転換体を培養し、該培養
物からポルＩ型ＤＮＡポリメラーゼを採取することを特
徴とするポルＩ型ＤＮＡポリメラーゼの製造方法に関す
る。

【０００５】本発明者らは、目的のポルＩ型ＤＮＡポリ
メラーゼの遺伝子構造や、アミノ酸配列を解析すること
なく、短時間に効率よく、ポルＩ型ＤＮＡポリメラーゼ
遺伝子のクローニングを行う方法として、ポルＩ型ＤＮ
Ａポリメラーゼ遺伝子を効率よく増幅することのできる
オリゴヌクレオチドプライマーを創製することに成功
し、該プライマーを用いることによって、遺伝子構造未
知のポルＩ型ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子が増幅できるこ
と、及び該増幅遺伝子をプローブとして用いることによ
って目的のポルＩ型ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子を効率よ
く、簡便にクローニングできること、及び、クローニン
グした遺伝子を用い、ポルＩ型ＤＮＡポリメラーゼを遺
伝子工学的に得ることができることを見出し、本発明を
完成させた。

【０００６】以下、本発明を具体的に説明する。目的の
ＤＮＡ断片を選択する方法としては、まず公知のポルＩ
型ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列を比較し、共通の
アミノ酸配列を示す領域を基にしてオリゴデオキシリボ
ヌクレオチドを合成する。ポルＩ型ＤＮＡポリメラーゼ
のアミノ酸配列については例えばジャーナル オブ バ
イオロジカル ケミストリー( Journal of Biological
Chemistry ) 、第２５７巻、第１９５８〜１９６４頁
（１９８２）、ジャーナル オブ モレキュラー バイ
オロジー（ Journal of Molecular Biology ) 、第１６
６巻、第４７７〜５３５頁（１９８３）、ジャーナルオ
ブ バイオロジカル ケミストリー、第２６４巻、第６
４２７〜６４３７頁（１９８９）、及びジャーナル オ
ブ バイオロジカル ケミストリー、第２６４巻、第４
２５５〜４２６３頁（１９８９）にそれぞれ記載されて
いる、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩ、Ｔ７ファージ由来
ＤＮＡポリメラーゼ、サーマス アクアティカス由来耐
熱性ＤＮＡポリメラーゼ、ストレプトコッカス ニュー
モニエ（Streptococcus pneumoniae )由来ＤＮＡポリメ
ラーゼのアミノ酸配列を参考にすることができる。

【０００７】配列表の配列番号１及び２に本発明者らが
ポルＩ型ＤＮＡポリメラーゼの共通配列を基に作製した
ミックスプライマーの配列を示す。配列番号１で示すミ
ックスプライマーは、本発明者らが見出したポルＩ型Ｄ
ＮＡポリメラーゼの共通配列、すなわち配列表の配列番
号３〜６でそれぞれ表されるアミノ酸配列を基に作製さ
れ、配列番号２で示すミックスプライマーは、ポルＩ型
ＤＮＡポリメラーゼの他の部位の共通配列、すなわち配
列表の配列番号７〜１０でそれぞれ表されるアミノ酸配
列を基に作製される。なお、本発明で使用できるポルＩ
型ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子の増幅用プライマーとして
は該遺伝子の共通配列にハイブリダイズし、該遺伝子を
効率よく増幅できるものであれば良く、上記ミックスプ
ライマーを改変したものでも良く、また、他の共通配列
より構築したものでも良い。

【０００８】また、該プライマーを用い、ポルＩ型ＤＮ
Ａポリメラーゼ遺伝子を増幅する方法としては、該遺伝
子を効率よく増幅できる方法であれば良く、例えばポリ
メラーゼ チェイン リアクション（ＰＣＲ）法又はそ
の改良法を用いれば良い。ＰＣＲ法に使用するプライマ
ー対としては、上記ミックスプライマーを組合せ用いて
も良く、また、該プライマーを、他の遺伝子構造、例え
ばベクター由来のプライマーと組合せ用いても良い。

【０００９】例えば、配列表の配列番号１及び２のプラ
イマー対により、前出の大腸菌、Ｔ７ファージ、サーマ
ス アクアティカス、ストレプトコッカス ニューモニ
エ由来のポルＩ型ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子を、それぞ
れＰＣＲ法により効率よく増幅することができ、更にま
た、バチルス ズブチリス（ Bacillus subtilis )、バ
チルス カルドリティカス（ Bacillus caldolyticus
)、ラクトバチルス ブルガリカス（ Lactobacillus b
ulgaricus ) 、ラクトバチルス ホモヒオチイ（Lactob
acillus homohiochii ) 、ラクトバチルス ヘテロヒオ
チイ（ Lactobacillus heterohiochii ) 、サーマス
サーモフィラス（ Thermus thermophilus) 等のポルＩ
型ＤＮＡポリメラーゼの存在、該ＤＮＡポリメラーゼ遺
伝子構造等の解析が、いまだ不充分な微生物由来のＤＮ
Ａをも増幅し、例えば該プライマー対は、ポルＩ型ＤＮ
Ａポリメラーゼ遺伝子のクローニングに有用なＰＣＲ用
プライマー対として使用することができる。

【００１０】ポルＩ型ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子のクロ
ーニング、及び該遺伝子を含む形質転換体、ポルＩ型Ｄ
ＮＡポリメラーゼの取得は次に例示する工程により行う
ことができる。 （１）ポルＩ型ＤＮＡポリメラーゼ産生能を有する細胞
から染色体ＤＮＡを抽出する。 （２）ポルＩ型ＤＮＡポリメラーゼに共通な領域の情報
を基に作製した配列表の配列番号１及び配列番号２に示
すＤＮＡポリメラーゼ遺伝子増幅用オリゴヌクレオチド
プライマーを用い、（１）で得たＤＮＡを鋳型としてＰ
ＣＲを行う。 （３）（１）で得たＤＮＡを適当な制限酵素で切断し、
これに対して（２）で得たＤＮＡ断片をプローブとして
スクリーニングを行い、目的とするＤＮＡ断片を回収す
る。 （４）ベクターを制限酵素で開裂し、この開裂部位に
（３）で得たＤＮＡ断片を結合させる。 （５）ＤＮＡ断片を結合させたベクターを宿主に導入
し、目的のＤＮＡ断片を含む形質転換体を選択する。 （６）（５）で得た形質転換体からプラスミドを取出
し、目的のＤＮＡ断片を切り出して制限酵素地図を基に
必要に応じ目的の遺伝子全体を含む連続した一本の断片
に再編成し、これを（４）と同様の要領で発現ベクター
に結合させる。 （７）（６）で得た目的のＤＮＡ断片を含む発現ベクタ
ーを（５）と同じ要領で宿主に導入し、形質転換体を得
る。 （８）（７）で得た形質転換体を培養し、培養菌体より
ＤＮＡポリメラーゼを生産する。 （９）（６）で得た発現型プラスミドから必要に応じエ
キソヌクレアーゼIII を用いた欠損株作製法によりＤＮ
Ａポリメラーゼ産生情報内の５′→３′エキソヌクレア
ーゼ情報部分を欠失させた変異型ＤＮＡポリメラーゼ発
現ベクターを作製する。 （10）（９）で得た発現ベクターを宿主に導入し、形質
転換体を得る。 （11）（10）で得た形質転換体を培養し、培養菌体より
変異型ＤＮＡポリメラーゼを生産する。

【００１１】本発明に使用する菌株としてはポルＩ型Ｄ
ＮＡポリメラーゼを産生する菌株であれば何でもよく、
例として、バチルス・カルドテナックスＹＴ−Ｇ株〔ド
イッチェ ザムルンク フォン ミクロオルガニスメン
（ Deutsche Sammlung von Mikroorganismen )の保存菌
株：ＤＳＭ４０６〕がある。

【００１２】以下、該菌株を例として説明する。上記Ｄ
ＮＡ供試体であるバチルス カルドテナックスＹＴ−Ｇ
株（ＤＳＭ４０６）由来ＤＮＡは７０℃で振とう培養し
た該培養菌体より抽出する。抽出、精製、制限酵素によ
る切断等は公知の方法を用いることができ、当該方法の
詳細は１９８２年 コールドスプリング ハーバー ラ
ボラトリー発行、Ｔ．マニアティス（Ｔ．Maniastis )
ほか著、モレキュラー クローニング、ア ラボラトリ
ーマニュアル（ Molecular Cloning, Ａ Laboratory Ma
nual )、第７５〜１７８頁に記載されている。

【００１３】本発明者らは共通のアミノ酸配列に基づく
配列表の配列番号１及び配列番号２に示す２種のオリゴ
ヌクレオチドをプライマーとし、バチルス カルドテナ
ックスＤＮＡを鋳型に用いて、ＰＣＲ法により特異的な
ＤＮＡ断片が増幅することを見出し、得られた断片の塩
基配列から推定されるアミノ酸配列が公知の他のＤＮＡ
ポリメラーゼと類似していることを発見した。したがっ
て、該ＤＮＡ断片をプローブに用いてハイブリダイゼー
ションを行うことにより目的のＤＮＡを選択することが
できる。ハイブリダイゼーションによる選択の方法自体
は公知の方法、例えば前記モレキュラー クローニン
グ、ア ラボラトリー マニュアル、第３０９頁に記載
の方法を用いることができる。

【００１４】サザンハイブリダイゼーション法により、
目的のＤＮＡポリメラーゼ遺伝子がバチルス カルドテ
ナックスＤＮＡのどの制限酵素断片上に存在するかを分
析し、次に選択した制限酵素例えばＥｃｏＲＩ、Ｂａｍ
ＨＩ、Ｈinc II、ＨindIII、ＸｈｏＩ、ＰｓｔＩ、Ｐｖ
ｕIIなどを用いて分解したバチルス カルドテナックス
ＤＮＡをプラスミドベクターに組込む。プラスミドベク
ターとしては公知のものが使用でき、例えばｐＵＣ１
８、ｐＵＣ１９、ｐＴＶ１１８Ｎなどが挙げられるがこ
れらに限定されるものではない。また組込ませる手段に
ついても公知の方法が利用でき、ＤＮＡリガーゼを用い
た酵素反応で組込ませればよい。

【００１５】次いで組換えプラスミドを宿主大腸菌に導
入させるが、宿主大腸菌としては、形質転換能を有する
ものであれば野生株、変異株のいずれも使用できるが、
制限系変異株で修飾系野生株（ｒ^- ，ｍ⁺ ）であること
が望ましい。導入の手段自体は公知の方法、例えば前記
モレキュラー クローニング、ア ラボラトリー マニ
ュアル 第２５０頁（１９８２）を用いることができ
る。このようにして目的のＤＮＡ断片を宿主に導入さ
せ、プラスミドベクターの特性、例えばｐＵＣ１８の場
合アンピシリン耐性を有するコロニーを選択することに
よりクローン化されたＤＮＡの集団を調製することがで
きる。次に上記集団の中から目的の断片を有するクロー
ンを選択する。選択の方法はベクターの種類によってコ
ロニーハイブリダイゼーション、プラークハイブリダイ
ゼーションを用いればよく、方法自体は公知のものであ
る。

【００１６】選択した３種類のクローン体よりそれぞれ
が所有するＨinc II断片、ＨindIII断片、ＸｈｏＩ断片
について制限酵素分解により詳細な解析の結果を基に上
記３断片を試験管内で再編成し、一本の連続したＤＮＡ
断片とし、該ＤＮＡ断片を発現ベクターｐＴＶ１１８Ｎ
に組込んで目的のクローンを得た。該プラスミドをｐＵ
Ｉ１０１と命名した。プラスミドｐＵＩ１０１を有する
大腸菌を培養し、菌体の粗抽出液を得た。該抽出液は６
０℃、２０分処理後も十分量のＤＮＡポリメラーゼ活性
を示し、発現ベクターのみを有する大腸菌粗抽出液では
このような活性を有しないことより、ｐＵＩ１０１上に
耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ産生情報が存在し、かつ、大
腸菌内で該情報を有する遺伝子が発現していると結論し
た。

【００１７】プラスミドｐＵＩ１０１の構築工程を図１
に示す。ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子はプラスミドｐＵＩ
１０１の約３．５kbのＮｃｏＩ断片中にコードされてお
り、該ＮｃｏＩ断片の制限酵素地図を図２に、塩基配列
を配列表の配列番号１１に示す。

【００１８】ｐＵＩ１０１で形質転換された大腸菌で最
も増殖能のよかった宿主ＨＢ１０１を選択し、それは E
scherichia coli ＨＢ１０１／ｐＵＩ１０１と表示し
て、工業技術院微生物工業技術研究所に微工研条寄第３
７２１号（ＦＥＲＭ ＢＰ−３７２１）として寄託され
ている。

【００１９】ｐＵＩ１０１を保有する大腸菌を培養し、
耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを大量に発現させた培養菌体
より耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの採取を行うことができ
る。培養菌体より、例えば、超音波処理、熱処理、ジエ
チルアミノエチル（ＤＥＡＥ）セルロースカラムクロマ
トグラフィー、ホスホセルロースカラムクロマトグラフ
ィーの各処理を行い、ＤＮＡポリメラーゼをＳＤＳ−ポ
リアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）で
単一バンドを示すまで精製することができる。

【００２０】得られたＤＮＡポリメラーゼはＳＤＳ−Ｐ
ＡＧＥで約１０万ダルトンの分子量を示すポリペプチド
であり、ＤＮＡ合成活性、３′→５′エキソヌクレアー
ゼ活性のほかに５′→３′エキソヌクレアーゼ活性を有
している。精製タンパク質のアミノ酸分析を行い、その
Ｎ末端のアミノ酸配列を決定することができる。その配
列を配列表の配列番号１２に示す。このアミノ酸配列、
分子量等より前述ＮｃｏＩ断片中の配列表の配列番号１
３に示す翻訳可能領域を、本発明のＤＮＡポリメラーゼ
の構造遺伝子と決定し、該ＤＮＡポリメラーゼの全アミ
ノ酸配列を明らかにした。そのアミノ酸配列を配列表の
配列番号１４に示す。

【００２１】大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩの例よりみ
て、該５′→３′エキソヌクレアーゼ活性はポリペプチ
ド鎖のアミノ末端側の１つのドメインに存在することが
推測されることから、ｐＵＩ１０１上のバチルス カル
ドテナックス由来のＤＮＡ断片から部分的に一定部分を
欠失させたプラスミドを作製し、それらを再度大腸菌に
導入してＤＮＡ合成活性を示し、かつ５′→３′エキソ
ヌクレアーゼ活性を有しないクローンを選択した。欠失
プラスミドの作製法は公知でありジーン( Gene )、第２
８巻、第３５１〜３５９頁（１９８２）に記載されてい
るヘニコフ ( Henicoff ) の方法を用いることができ
る。

【００２２】選択されたプラスミドをｐＵＩ２０５と命
名し、形質転換された大腸菌は、Escherichia coli Ｈ
Ｂ１０１／ｐＵＩ２０５と表示して工業技術院微生物工
業技術研究所に微工研条寄第３７２０号（ＦＥＲＭ Ｂ
Ｐ−３７２０）として寄託されている。

【００２３】ｐＵＩ２０５を保有する大腸菌を培養し、
耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを大量に発現させた培養菌体
より耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの採取を行うことができ
る。培養菌体より、例えば前述の方法により精製を行い
ＳＤＳ−ＰＡＧＥで単一バンドを示すまでＤＮＡポリメ
ラーゼを精製することができる。

【００２４】得られたＤＮＡポリメラーゼはＳＤＳ−Ｐ
ＡＧＥで約６万７千ダルトンの分子量を示すポリペプチ
ドであり、ＤＮＡ合成活性、３′→５′エキソヌクレア
ーゼ活性を有するが、５′→３′エキソヌクレアーゼ活
性を有しない変異型ＤＮＡポリメラーゼである。精製タ
ンパク質のアミノ酸分析を行い、そのＮ末端のアミノ酸
配列を決定することができる。その配列を、配列表の配
列番号１５に示す。配列表の配列番号１４に示したアミ
ノ酸配列のうち、アミノ酸番号１のＭｅｔからアミノ酸
番号２８４のＬｙｓまでの２８４アミノ酸が欠失してい
ることを確認し、該変異型ＤＮＡポリメラーゼの遺伝子
配列及び全アミノ酸配列を明らかにした。配列表の配列
番号１６に変異型ＤＮＡポリメラーゼの塩基配列、配列
表の配列番号１７にアミノ酸配列を示す。

【００２５】以上のようにして得られた組換え大腸菌 E
scherichia coli ＨＢ１０１／ｐＵＩ１０１及び Esche
richia coli ＨＢ１０１／ｐＵＩ２０５の培養液１mlか
らそれぞれ１２７単位、２１２単位のＤＮＡポリメラー
ゼが得られ、工業的な製造が可能になった。

【００２６】以上、詳細に説明した様に、本発明によれ
ば、従来のポルＩ型ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子のクロー
ニングに必要であった、被検物ポルＩ型ＤＮＡポリメラ
ーゼ活性の確認、該ポリメラーゼの生産、精製、単離、
部分アミノ酸配列の決定、プローブの作製等の工程が不
要であり、被検物遺伝子より、目的のポルＩ型ＤＮＡポ
リメラーゼ遺伝子を効率よく、簡便に単離することがで
きる。

【００２７】

【実施例】以下に本発明の実施例を挙げるが、本発明は
これら実施例に限定されるものではない。

【００２８】実施例１ 配列表の配列番号１及び配列番号２に示した２種のオリ
ゴデオキシリボヌクレオチドをＤＮＡ合成機で作製し、
精製した。次に、このオリゴデオキシリボヌクレオチド
をそれぞれ１００pmolと、大腸菌、Ｔ７ファージ、サー
マス アクアティカス、サーマス サーモフィラス、ス
トレプトコッカス ニューモニエ、バチルス ズブチリ
ス、バチルス カルドリティカス、ラクトバチルス ブ
ルガリカス、ラクトバチルス ホモヒオチイ、ラクトバ
チルス ヘテロヒオチイからそれぞれ調製したＤＮＡ１
ngを用いて、全量１００μｌで９５℃３０秒、５５℃１
分、７２℃２分のＰＣＲを３０サイクル行った。５μｌ
をとりアガロースゲル電気泳動で分析した結果、いずれ
も約６００塩基対のＤＮＡ断片が特異的に増幅してい
た。このＤＮＡ断片をＳｍａＩで開環したＭ１３ファー
ジｍｐ１８ベクターに組込みジデオキシ法によりそれぞ
れの塩基配列を確認した。

【００２９】実施例２ （１）バチルス カルドテナックス染色体ＤＮＡの調製 バチルス カルドテナックスＹＴ−Ｇ株を１２５mlのＬ
培地（バクトトリプトン１０ｇ／ｌ、酵母エキス５ｇ／
ｌ、ＮａＣｌの５ｇ／ｌ、ｐＨ７．２）で６５℃一夜振
とう培養し、集菌した菌体を４mlの２５％ショ糖、０．
０５Ｍ トリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）に懸濁し、リゾ
チーム（５mg／ml）を８００μｌ加えて２０℃１時間放
置した。ＳＥＴ溶液〔２０mM トリス−ＨＣｌ（ｐＨ
８．０）、１mM ＥＤＴＡ、１５０mM ＮａＣｌ〕を２
４ml加えた後、５％ＳＤＳ溶液を４mlとプロティナーゼ
Ｋ（１０mg／ml）を４００μｌ加えて３７℃、１時間放
置した。フェノール抽出、クロロホルム抽出の後、エタ
ノールを加えて長鎖ＤＮＡを不溶化し、滅菌したつまよ
うじで巻取って回収した。以上の操作により３．１mgの
ＤＮＡが得られた。

【００３０】（２）ＰＣＲを用いた特異的ＤＮＡ断片の
増幅 配列表の配列番号１及び配列番号２に示した２種類のオ
リゴデオキシリボヌクレオチドをそれぞれ１００pmolと
バチルス カルドテナックスＤＮＡ１ngを用いて全量１
００μｌで９５℃３０秒、５５℃１分、７２℃２分のＰ
ＣＲを３０サイクル行った。５μｌをとりアガロースゲ
ル電気泳動で分析した結果、６００塩基対のＤＮＡ断片
が特異的に増幅していた。このＤＮＡ断片をＳｍａＩで
開環したＭ１３ファージｍｐ１８ベクターに組込みジデ
オキシ法により塩基配列を分析した。

【００３１】（３）ゲノミックサザン法による目的の遺
伝子の検索 バチルス カルドテナックスＤＮＡを１つの酵素につき
５μｇ用いてＥｃｏＲＩ、ＢａｍＨＩ、ＨindIII、Ｈin
c II、ＸｈｏＩ、ＰｓｔＩ、ＰｖｕIIで分解し、アガロ
ースゲル電気泳動に供した。ゲル中のＤＮＡをナイロン
膜に移し、上記ＰＣＲにより得た６００塩基対のＤＮＡ
断片をプローブに用いてハイブリダイゼーションを行っ
た。プローブはランダムプライミング法により放射性標
識した。ハイブリダイゼーションは６×ＳＳＣ、１％Ｓ
ＤＳ、５×デンハーツ溶液、１００μｇ／ml子牛胸腺Ｄ
ＮＡ中で６５℃５時間行った。１×ＳＳＣ、０．１％Ｓ
ＤＳ溶液中で１時間洗浄した後、Ｘ線フィルムに感光
し、オートラジオグラムをとった。

【００３２】（４）ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子を含むＤ
ＮＡ断片のクローン化 ゲノミックサザン分析で陽性を示したＨindIII（２．４
０kb）、Ｈinc II（１．４５kb）及びＸｈｏＩ（２．１
kb）ＤＮＡ断片をプラスミドベクター中にクローン化す
るため、バチルス カルドテナックスＤＮＡをそれぞれ
１００μｇずつ、ＨindIII、Ｈinc II、ＸｈｏＩで分解
し、目的の大きさのＤＮＡをアガロースゲルより回収し
た。回収はガラスビーズ吸着法を用いた。ｐＴＶ１１８
Ｎプラスミドをそれぞれ同じ酵素で開環し、アルカリ性
ホスファターゼで末端のリン酸基を除去したベクターを
加えてＤＮＡリガーゼにより結合した後、大腸菌ＪＭ１
０９に導入した。得られた組換体の集団の中からコロニ
ーハイブリダイゼーションによって目的のクローンを選
択した。ナイロン膜上に生育させた組換体のコロニー５
０個〜２００個を０．５Ｎ 水酸化ナトリウム、１．５
Ｍ 塩化ナトリウム溶液で変性させた後、１Ｍ トリス
−ＨＣｌ、１．５Ｍ 塩化ナトリウム（ｐＨ７．０）溶
液で中和し、紫外線照射でファージＤＮＡを膜上に固定
した。プローブ調製及びハイブリダイゼーションの条件
はゲノミックサザン分析に準じた。

【００３３】（５）クローン化断片に制限酵素分析及び
ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子の再編成 得られた３種類のＤＮＡ断片について制限酵素地図を作
製した結果、上記３断片はＨinc II−ＨindIII−Ｘｈｏ
Ｉの順にそれぞれ重なり合い、連続して染色体ＤＮＡ上
に存在することが判明した。必要以外の連結ができるだ
け起こらないように制限酵素切断部位を選択し、図１に
示すように、３種のＤＮＡ断片とベクターｐＴＶ１１８
Ｎを同時に連結させ、ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子を含む
約３．５kbのＤＮＡ断片を組込んだプラスミドを構築
し、ｐＵＩ１０１と命名した。なお、図１はｐＵＩ１０
１の構築を示す工程図である。また図２は、ｐＵＩ１０
１にクローニングされているＤＮＡポリメラーゼ遺伝子
を含むＮｃｏＩ ＤＮＡ断片の制限酵素地図を示す図で
ある。次に該プラスミドで大腸菌ＨＢ１０１株を形質転
換し、形質転換体 Escherichia coli ＨＢ１０１／ｐＵ
Ｉ１０１（ＦＥＲＭ ＢＰ−３７２１）を得た。

【００３４】（６）形質転換体の培養及び粗抽出液の調
製 上記組換えプラスミドｐＵＩ１０１を有する大腸菌ＨＢ
１０１（ＦＥＲＭ ＢＰ−３７２１）をアンピシリンが
１００μｇ／mlの濃度で存在するＬ培地５mlに植菌し３
７℃で培養した。培養液の濁度が０．６（Ａ₆₀₀ ）のと
き、誘導物質であるイソプロピル−β−Ｄ−チオガラク
トシド（ＩＰＴＧ）を添加し、更に１５時間培養を行っ
た。培養液１mlから集菌し、５０mM トリス−ＨＣｌ
（ｐＨ８．０）、２５％スクロース溶液で洗浄した。同
じ溶液に再溶解した後、同量のリシス溶液〔５０mMトリ
ス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、２５％ショ糖、６０mM ス
ペルミジン・一塩酸、２０mM 塩化ナトリウム、１２mM
ＤＴＴ〕を加え、４℃で４５分間静置した。更に５％
（ｗ／ｖ）トリトンＸ１００( TritonＸ１００）を２０
μｌ加え、３７℃で５分間静置した後、遠心分離により
上清を回収し、６０℃、２０分静置した後再度遠心分離
した上清を回収し、粗抽出液とした。

【００３５】（７）ＤＮＡポリメラーゼ活性測定 反応溶液として６７mM リン酸カリウム（ｐＨ７．
４）、６．７mM 塩化マグネシウム、１mM ２−メルカ
プトエタノール、２０μＭ 活性化ＤＮＡ、３３μＭ
ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ＴＴＰ、６０nM
〔 ³Ｈ〕ＴＴＰを用意し、この溶液１５０μｌに対して
適当量の粗抽出液を加え、６０℃、５分反応させた後、
５０mM ピロリン酸、１０％トリクロロ酢酸を１ml加え
て反応を停止させた。氷中で５分間静置した後、全量を
ガラスフィルター上に移し、吸引ろ過した。１０％ＴＣ
Ａで数回洗浄した後、７０％エタノールで置換し、フィ
ルターを乾燥して液体シンチレーションカウンターでフ
ィルター上の放射活性を測定した。１mlの培養液から１
２７単位のＤＮＡポリメラーゼが得られた。

【００３６】（８）プラスミドｐＵＩ１０１を導入した
大腸菌による耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの生産 大腸菌ＨＢ１０１／ｐＵＩ１０１の菌体２．２ｇより精
製を開始し、実施例２−（６）で示した方法により２０
mlの粗抽出液を得た。これらを６０℃で３０分間インキ
ュベートした後、熱変性したタンパク質を遠心分離した
（１２０００rpm 、１０分）。この上清に硫酸アンモニ
ウムを加えていき、３０〜８０％飽和で沈殿する画分を
とってＤＥ緩衝液〔５０mM トリス−ＨＣｌ ｐＨ７．
０、２mM ２−メルカプトエタノール、１０％グリセロ
ール、４μＭ フェニルメタンスルホニルフルオリド
（ＰＭＳＦ）〕で透析した後、同じ緩衝液で平衡化した
ＤＥ５２（ワットマン社）カラム１５mlに添加し０mM〜
３００mM ＮａＣｌの直線濃度勾配で溶出して分画し、
実施例２−（７）に従ってＤＮＡポリメラーゼ活性を調
べた。次に活性画分を集めてＤＥ緩衝液で透析し、ＤＥ
緩衝液で平衡化したＰ−１１（ワットマン社）カラム１
５mlに添加した。次に０mM〜３００mM ＮａＣｌ直線濃
度勾配で溶出し活性画分を集めた。Ｐ１１画分の酵素標
品をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析したところ、分子量約１０
万ダルトンの単一バンドを与えた。

【００３７】（９）アミノ酸シークエンサーによるＮ末
端アミノ酸配列の決定 実施例２−（８）で得られた酵素標品をアミノ酸シーク
エンサーにかけ、配列表の配列番号１２に示すＮ末端ア
ミノ酸配列を決定した。

【００３８】実施例３ （１）部分欠失プラスミドの作製 ＤＮＡポリメラーゼタンパクのアミノ末端側のドメイン
に存在すると推定される５′→３′エキソヌクレアーゼ
活性を消失させるために、遺伝子の５′側から部分的に
欠失させたプラスミドを作製した。エキソヌクレアーゼ
III を用いた方法を用いるため、まずｐＵＩ１０１に挿
入されている約３．５kbのＮｃｏＩ断片を切り出し、平
滑末端化した後ｐＴＶ１１８ＮのＨinc II部位に組込ん
だプラスミドを作製した。次にベクター中の３′突出型
酵素ＫｐｎＩと５′突出型の酵素ＸｂａＩとで二重切断
し、エキソヌクレアーゼIII を作用させて３′突出側へ
のみ分解反応を行わせ、マングビーン（ Mung Bean）ヌ
クレアーゼで平滑末端とした後ＤＮＡリガーゼで再環状
化した。エキソヌクレアーゼIII の反応時間を制御する
ことによって種々の大きさの欠失変異体が得られた。ま
た再環状化の前にＮｃｏＩリンカーを連結することによ
り開始コドンが必ず適当な位置に入るようになり、欠失
された位置によって翻訳枠が３分の１の確率で合うよう
に構築した。上記のように操作したプラスミドを大腸菌
に導入し、得られた形質転換体から任意に２０クローン
を選択し、粗抽出液を調製して耐熱性ＤＮＡポリメラー
ゼ活性を調べた。６０℃においてＤＮＡ合成活性のある
ものについて塩基配列を解析した。活性のあった５クロ
ーンより１つを選んでその所有する組換えプラスミドを
ｐＵＩ２０５と命名した。ｐＵＩ２０５には図３に示す
約２．２kbのＤＮＡ断片が組込まれていた。次に該プラ
スミドで大腸菌ＨＢ１０１を形質転換し、形質転換体 E
scherichia coli ＨＢ１０１／ｐＵＩ２０５（ＦＥＲＭ
ＢＰ−３７２０）を得た。なお、図３は、ｐＵＩ２０
５にクローニングされているＤＮＡポリメラーゼ遺伝子
の制限酵素地図を示す図である。

【００３９】（２）形質転換体の培養及び粗抽出液の調
製 実施例２−（６）の方法に準じ上記形質転換体（ＦＥＲ
Ｍ ＢＰ−３７２０）を培養し粗抽出液を調製した。

【００４０】（３）ＤＮＡポリメラーゼ活性の測定 実施例２−（７）の方法に準じ上記粗抽出液のＤＮＡポ
リメラーゼ活性を測定した。１mlの培養液から２１２単
位のＤＮＡポリメラーゼが得られた。

【００４１】（４）５′→３′エキソヌクレアーゼ活性
の測定 基質としてプラスミドｐＢＲ３２２をＰｖｕIIで切断し
て得られる３２２塩基対の断片を〔γ−³²Ｐ〕ＡＴＰと
ポリヌクレオチドキナーゼでリン酸化したものを調製し
た。６７mM リン酸カリウム（ｐＨ７．４）、６．７mM
塩化マグネシウム、１mM ２−メルカプトエタノール
を含む溶液中に実施例３−（２）の酵素標品と上記基質
を混合し６０℃で５分反応させた後、エタノールを加え
て基質ＤＮＡを沈殿させた。上清中に存在する放射活性
を液体シンチレーションカウンターで測定することによ
りエキソヌクレアーゼによる分解物の量を求めた。上記
酵素標品には５′→３′エキソヌクレアーゼ活性は認め
られなかった。

【００４２】（５）プラスミドｐＵＩ２０５を導入した
大腸菌による耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの生産 実施例２−（８）方法に準じ、大腸菌ＨＢ１０１／ｐＵ
Ｉ２０５の菌体から酵素標品を得た。本酵素標品をＳＤ
Ｓ−ＰＡＧＥで分析したところ分子量約６万７千ダルト
ンの単一バンドを与えた。

【００４３】（６）アミノ酸シークエンサーによるＮ末
端アミノ酸配列の決定 実施例２−（９）の方法に準じ、配列表の配列番号１５
に示すＮ末端アミノ酸配列を決定した。

【００４４】実施例４ （１）ＤＮＡポリメラーゼの構造遺伝子を含むバチルス
カルドテナックス染色体ＤＮＡ断片の塩基配列の決定 実施例３−（１）で示した方法に従い種々の大きさの欠
失変異体のセットを調製し、それらを鋳型にしてジデオ
キシ法により塩基配列を解読していった。得られたデー
タをつなぎ合せ、最終的に配列表の配列番号１１に示す
ｐＵＩ１０１より切り出されたＮｃｏＩ−ＮｃｏＩ断片
全長の塩基配列を決定した。また、ｐＵＩ２０５には、
配列表の配列番号１１に示すｐＵＩ１０１のＮｃｏＩ断
片のうち、塩基番号１０３２〜３２５２の部分が挿入さ
れていた。実施例２−（９）及び実施例３−（６）で決
定したＮ末端アミノ酸配列と本実施例で決定した塩基配
列より、本発明のＤＮＡポリメラーゼの構造遺伝子及び
アミノ酸配列を明らかにすることができた。

【００４５】

【発明の効果】以上詳細に説明したように本発明により
新規なＤＮＡポリメラーゼ遺伝子の簡便で効率のよいク
ローニング方法、及び該遺伝子が提供される。単離され
た遺伝子を用い、遺伝子工学研究用試薬として有用なＤ
ＮＡポリメラーゼの遺伝子工学的製造法も提供される。

【配列表】配列番号：１ 配列の長さ：23 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） アンチセンス：NO 配列の特徴：1-23 S primer 配列： GAYCCHAACY TSCARAAYAT HCC 23 配列番号：２ 配列の長さ：21 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） アンチセンス：YES 配列の特徴：1-21 S primer 配列： KASNAKYTCR TCRTGNACYT G 21 配列番号：３ 配列の長さ：８ 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド フラグメント型：中間部フラグメント 起源： 生物名：エシェリヒア コリ(Escherichia coli) 配列番号：４ 配列の長さ：８ 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド フラグメント型：中間部フラグメント 起源： 生物名：Ｔ７ ファージ(T7 phage) 配列番号：５ 配列の長さ：８ 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド フラグメント型：中間部フラグメント 起源： 生物名：サーマス アクアティカス(Thermus aquaticu
s) 配列番号：６ 配列の長さ：８ 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド フラグメント型：中間部フラグメント 起源： 生物名：ストレプトコッカス ニューモニエ(Streptoco
ccus pneumoniae) 配列番号：７ 配列の長さ：７ 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド フラグメント型：中間部フラグメント 起源： 生物名：エシェリヒア コリ(Escherichia coli) 配列番号：８ 配列の長さ：７ 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド フラグメント型：中間部フラグメント 起源： 生物名：Ｔ７ ファージ(T7 phage) 配列番号：９ 配列の長さ：７ 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド フラグメント型：中間部フラグメント 起源： 生物名：サーマス アクアティカス(Thermus aquaticu
s) 配列番号：10 配列の長さ：７ 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド フラグメント型：中間部フラグメント 起源： 生物名：ストレプトコッカス ニューモニエ(Streptoco
ccus pneumoniae) 配列番号：11 配列の長さ：3252 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：genomic DNA 起源：生物名：バチルス カルドテナックス(Bacillus
caldotenax) 株名：YT-G(DSM406) 配列： CCATGGATAT ATTACCGTAG CGAGCAAAGT GGGGCGCGGC ACCGTGTTCA CGATCCATTT 60 TCCAAAGCCG GGGCGGTAGC CGGCTTCTTT TTATCATCTC CAACTGAGAA GCCTGCCATT 120 TTTCAGCGTG ACGTGAGCAC GGGATGAATC CGCGCCTCCC ATCATGTTGG GAGAGCGTTC 180 AAGGCAAGCC GCAGGCATGG TACAATAGGA CAAGGAAGCA TCCGAGGAGG GATGAGA 237 TTG AAA AAA AAG CTT GTT TTA ATC GAC GGC AGC AGC GTG GCG TAC 282 CGC GCC TTT TTC GCC TTG CCG CTT TTG CAT AAC GAC AAA GGC ATC 327 CAT ACG AAC GCC GTC TAC GGG TTT ACG ATG ATG TTG AAT AAA ATT 372 TTG GCG GAA GAA GAG CCA ACT CAT ATG CTT GTC GCG TTT GAC GCC 417 GGG AAA ACG ACG TTC CGG CAT GAA GCG TTT CAA GAG TAT AAA GGT 462 GGG CGC CAG CAG ACG CCA CCG GAG CTG TCG GAG CAG TTT CCG CTG 507 TTG CGC GAG CTG CTG AGG GCG TAT CGC ATC CCC GCC TAT GAA CTC 552 GAG AAC TAC GAA GCG GAC GAT ATT ATC GGA ACG CTT GCC GCC CGC 597 GCT GAG CAG GAA GGG TTT GAG GTG AAA GTC ATT TCC GGC GAC CGC 642 GAT CTG ACC CAG CTC GCC TCC CCC CAT GTG ACG GTG GAC ATT ACG 687 AAA AAA GGG ATT ACC GAT ATC GAA CCG TAC ACG CCG GAG GCG GTC 732 CGC GAA AAA TAC GGC TTA ACT CCG GAA CAA ATC GTT GAT TTG AAA 777 GGA TTG ATG GGC GAC AAA TCG GAC AAC ATT CCC GGA GTG CCG GGC 822 ATC GGG GAA AAG ACG GCG GTC AAG CTG CTC AGG CAA TTC GGC ACG 867 GTC GAA AAC GTG CTT GCC TCC ATT GAC GAG ATC AAA GGC GAA AAG 912 TTG AAA GAA ACG CTG CGC CAA CAC CGG GAG ATG GCG CTG TTA AGC 957 AAA AAG CTC GCC GCC ATT CGC CGC GAC GCC CCG GTC GAG CTC TCG 1002 CTT GAT GAC ATC GCC TAT CAA GGG GAA GAC CGG GAG AAA GTG GTC 1047 GCT TTA TTT AAA GAG CTT GGG TTT CAA TCG TTT TTA GAG AAA ATG 1092 GAA TCG CCG TCA TCA GAA GAG GAA AAA CCG CTT GCC AAG ATG GCA 1137 TTT ACG CTT GCT GAC CGC GTG ACG GAG GAG ATG CTT GCC GAC AAG 1182 GCG GCG CTT GTC GTT GAA GTG GTC GAG GAA AAT TAT CAT GAT GCG 1227 CCG ATC GTC GGC ATC GCT GTG GTC AAC GAA CAT GGA CGG TTT TTC 1272 CTG CGC CCG GAG ACG GCG CTT GCC GAT CCG CAG TTT GTC GCC TGG 1317 CTT GGT GAT GAA ACG AAG AAA AAA AGC ATG TTT GAC TCA AAG CGC 1362 GCG GCA GTC GCC TTG AAA TGG AAA GGA ATT GAG CTA TGC GGC GTT 1407 TCC TTT GAT TTA TTG CTG GCC GCC TAT TTG CTT GAT CCG GCG CAA 1452 GGT GTT GAT GAT GTG GCT GCC GCA GCA AAA ATG AAG CAA TAC GAA 1497 GCG GTG CGC CCG GAT GAA GCG GTG TAT GGC AAA GGG GCG AAG CGG 1542 GCC GTG CCG GAT GAG CCA GTG CTC GCC GAG CAT TTG GTC CGC AAG 1587 GCG GCG GCG ATT TGG GCG CTC GAA CGG CCG TTT TTG GAT GAG CTG 1632 CGC CGC AAC GAA CAA GAT CGG TTG CTC GTC GAG CTC GAG CAG CCG 1677 TTG TCT TCG ATT TTG GCG GAA ATG GAA TTT GCC GGA GTG AAA GTG 1722 GAT ACG AAG CGG CTC GAA CAG ATG GGC GAA GAG CTC GCC GAG CAG 1767 CTG CGC ACG GTC GAG CAG CGC ATT TAT GAG CTC GCC GGC CAA GAA 1812 TTC AAC ATC AAT TCA CCG AAA CAG CTC GGC GTC ATT TTA TTT GAA 1857 AAA CTG CAG CTG CCC GTC TTG AAA AAA AGC AAA ACC GGC TAC TCC 1902 ACT TCG GCG GAT GTG CTT GAA AAA CTT GCG CCT TAT CAC GAG ATC 1947 GTG GAA AAC ATT TTG CAA CAT TAC CGC CAG CTT GGC AAG TTG CAG 1992 TCG ACG TAT ATT GAA GGA TTG CTG AAA GTC GTG CGA CCC GAT ACA 2037 AAG AAG GTG CAT ACG ATT TTC AAT CAG GCG TTG ACG CAA ACC GGA 2082 CGG CTC AGC TCG ACG GAG CCG AAC TTG CAA AAC ATT CCG ATT CGG 2127 CTT GAG GAA GGA CGG AAA ATC CGC CAA GCG TTC GTG CCG TCG GAG 2172 TCT GAT TGG CTC ATT TTC GCT GCC GAC TAC TCG CAA ATT GAG TTG 2217 CGC GTC CTC GCC CAT ATT GCG GAA GAT GAC AAT TTA ATG GAA GCG 2262 TTC CGC CGC GAT TTG GAT ATC CAT ACG AAA ACA GCG ATG GAC ATT 2307 TTC CAA GTG AGC GAG GAC GAA GTG ACG CCC AAC ATG CGC CGT CAG 2352 GCG AAG GCG GTC AAC TTT GGG ATC GTT TAC GGG ATC AGT GAT TAC 2397 GGC TTG GCG CAA AAC TTA AAT ATT TCA CGC AAA GAG GCC GCT GAA 2442 TTC ATC GAG CGC TAC TTC GAA AGC TTC CCT GGC GTG AAG CGG TAT 2487 ATG GAA AAC ATT GTG CAA GAA GCA AAA CAG AAA GGG TAT GTG ACG 2532 ACG CTG CTG CAT CGG CGC CGC TAT TTG CCG GAT ATT ACG AGC CGC 2577 AAC TTC AAC GTC CGC AGC TTT GCT GAA CGG ATG GCG ATG AAC ACG 2622 CCG ATT CAA GGG AGC GCC GCT GAC ATT ATT AAA AAG GCG ATG ATC 2667 GAT CTG AAC GCC AGA CTG AAG GAA GAG CGG CTG CAA GCG CGC CTT 2712 TTG CTG CAG GTG CAT GAC GAG CTC ATT TTG GAG GCG CCG AAA GAA 2757 GAG ATG GAG CGG CTG TGC CGG CTC GTT CCG GAA GTG ATG GAG CAA 2802 GCG GTC ACA CTT CGC GTG CCG CTC AAA GTC GAT TAC CAT TAC GGC 2847 TCG ACA TGG TAT GAC GCG AAA TAAAAAGGAG TCTTGGTGTG TGGATCGCCG 2898 GCACCCCTAA AAGGCCGGTG ATTTAAGGGG AAATACTGCT CTCCAACAGT GTTTCTCAAA 2958 TTGAAAAACC TTGCAACACC ATCACTTCAT TCCTTGTGAT TTCTCATAAA TCAAGCGAAT 3018 CCATTGTTTT TCATCAGCCT TCTAAGAAGG CCTGTGATGG AATGAAAAAG CAGTTTCACA 3078 ACGACTCTTC TCCAGTTGAG AAGCCTTGGG ACATCGAGTC GTCCTTCTCA ACCAACATGA 3138 CCGATTTTGC GAAAATCAGC GTTTCTCACC GGCCTTCTAG GCAGAATCTT TCGGTGCGAC 3198 GATTCTCGGC TGCAACTCGG ATGAATTGGA GCGAAATCAG CTGCCGCCCC ATGG 3252 配列番号：12 配列の長さ：22 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド フラグメント型：Ｎ末端フラグメント 配列： Met Lys Lys Lys Leu Val Leu Ile Asp Gly Ser Ser Val Ala Tyr 1 5 10 15 Arg Ala Phe Phe Ala Leu Pro 20 配列番号：13 配列の長さ：2631 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：genomic DNA 起源：生物名：バチルス カルドテナックス(Bacillus
caldotenax) 株名：YT-G(DSM406) 配列： TTG AAA AAA AAG CTT GTT TTA ATC GAC GGC AGC AGC GTG GCG TAC 45 CGC GCC TTT TTC GCC TTG CCG CTT TTG CAT AAC GAC AAA GGC ATC 90 CAT ACG AAC GCC GTC TAC GGG TTT ACG ATG ATG TTG AAT AAA ATT 135 TTG GCG GAA GAA GAG CCA ACT CAT ATG CTT GTC GCG TTT GAC GCC 180 GGG AAA ACG ACG TTC CGG CAT GAA GCG TTT CAA GAG TAT AAA GGT 225 GGG CGC CAG CAG ACG CCA CCG GAG CTG TCG GAG CAG TTT CCG CTG 270 TTG CGC GAG CTG CTG AGG GCG TAT CGC ATC CCC GCC TAT GAA CTC 315 GAG AAC TAC GAA GCG GAC GAT ATT ATC GGA ACG CTT GCC GCC CGC 360 GCT GAG CAG GAA GGG TTT GAG GTG AAA GTC ATT TCC GGC GAC CGC 405 GAT CTG ACC CAG CTC GCC TCC CCC CAT GTG ACG GTG GAC ATT ACG 450 AAA AAA GGG ATT ACC GAT ATC GAA CCG TAC ACG CCG GAG GCG GTC 495 CGC GAA AAA TAC GGC TTA ACT CCG GAA CAA ATC GTT GAT TTG AAA 540 GGA TTG ATG GGC GAC AAA TCG GAC AAC ATT CCC GGA GTG CCG GGC 585 ATC GGG GAA AAG ACG GCG GTC AAG CTG CTC AGG CAA TTC GGC ACG 630 GTC GAA AAC GTG CTT GCC TCC ATT GAC GAG ATC AAA GGC GAA AAG 675 TTG AAA GAA ACG CTG CGC CAA CAC CGG GAG ATG GCG CTG TTA AGC 720 AAA AAG CTC GCC GCC ATT CGC CGC GAC GCC CCG GTC GAG CTC TCG 765 CTT GAT GAC ATC GCC TAT CAA GGG GAA GAC CGG GAG AAA GTG GTC 810 GCT TTA TTT AAA GAG CTT GGG TTT CAA TCG TTT TTA GAG AAA ATG 855 GAA TCG CCG TCA TCA GAA GAG GAA AAA CCG CTT GCC AAG ATG GCA 900 TTT ACG CTT GCT GAC CGC GTG ACG GAG GAG ATG CTT GCC GAC AAG 945 GCG GCG CTT GTC GTT GAA GTG GTC GAG GAA AAT TAT CAT GAT GCG 990 CCG ATC GTC GGC ATC GCT GTG GTC AAC GAA CAT GGA CGG TTT TTC 1035 CTG CGC CCG GAG ACG GCG CTT GCC GAT CCG CAG TTT GTC GCC TGG 1080 CTT GGT GAT GAA ACG AAG AAA AAA AGC ATG TTT GAC TCA AAG CGC 1125 GCG GCA GTC GCC TTG AAA TGG AAA GGA ATT GAG CTA TGC GGC GTT 1170 TCC TTT GAT TTA TTG CTG GCC GCC TAT TTG CTT GAT CCG GCG CAA 1215 GGT GTT GAT GAT GTG GCT GCC GCA GCA AAA ATG AAG CAA TAC GAA 1260 GCG GTG CGC CCG GAT GAA GCG GTG TAT GGC AAA GGG GCG AAG CGG 1305 GCC GTG CCG GAT GAG CCA GTG CTC GCC GAG CAT TTG GTC CGC AAG 1350 GCG GCG GCG ATT TGG GCG CTC GAA CGG CCG TTT TTG GAT GAG CTG 1395 CGC CGC AAC GAA CAA GAT CGG TTG CTC GTC GAG CTC GAG CAG CCG 1440 TTG TCT TCG ATT TTG GCG GAA ATG GAA TTT GCC GGA GTG AAA GTG 1485 GAT ACG AAG CGG CTC GAA CAG ATG GGC GAA GAG CTC GCC GAG CAG 1530 CTG CGC ACG GTC GAG CAG CGC ATT TAT GAG CTC GCC GGC CAA GAA 1575 TTC AAC ATC AAT TCA CCG AAA CAG CTC GGC GTC ATT TTA TTT GAA 1620 AAA CTG CAG CTG CCC GTC TTG AAA AAA AGC AAA ACC GGC TAC TCC 1665 ACT TCG GCG GAT GTG CTT GAA AAA CTT GCG CCT TAT CAC GAG ATC 1710 GTG GAA AAC ATT TTG CAA CAT TAC CGC CAG CTT GGC AAG TTG CAG 1755 TCG ACG TAT ATT GAA GGA TTG CTG AAA GTC GTG CGA CCC GAT ACA 1800 AAG AAG GTG CAT ACG ATT TTC AAT CAG GCG TTG ACG CAA ACC GGA 1845 CGG CTC AGC TCG ACG GAG CCG AAC TTG CAA AAC ATT CCG ATT CGG 1890 CTT GAG GAA GGA CGG AAA ATC CGC CAA GCG TTC GTG CCG TCG GAG 1935 TCT GAT TGG CTC ATT TTC GCT GCC GAC TAC TCG CAA ATT GAG TTG 1980 CGC GTC CTC GCC CAT ATT GCG GAA GAT GAC AAT TTA ATG GAA GCG 2025 TTC CGC CGC GAT TTG GAT ATC CAT ACG AAA ACA GCG ATG GAC ATT 2070 TTC CAA GTG AGC GAG GAC GAA GTG ACG CCC AAC ATG CGC CGT CAG 2115 GCG AAG GCG GTC AAC TTT GGG ATC GTT TAC GGG ATC AGT GAT TAC 2160 GGC TTG GCG CAA AAC TTA AAT ATT TCA CGC AAA GAG GCC GCT GAA 2205 TTC ATC GAG CGC TAC TTC GAA AGC TTC CCT GGC GTG AAG CGG TAT 2250 ATG GAA AAC ATT GTG CAA GAA GCA AAA CAG AAA GGG TAT GTG ACG 2295 ACG CTG CTG CAT CGG CGC CGC TAT TTG CCG GAT ATT ACG AGC CGC 2340 AAC TTC AAC GTC CGC AGC TTT GCT GAA CGG ATG GCG ATG AAC ACG 2385 CCG ATT CAA GGG AGC GCC GCT GAC ATT ATT AAA AAG GCG ATG ATC 2430 GAT CTG AAC GCC AGA CTG AAG GAA GAG CGG CTG CAA GCG CGC CTT 2475 TTG CTG CAG GTG CAT GAC GAG CTC ATT TTG GAG GCG CCG AAA GAA 2520 GAG ATG GAG CGG CTG TGC CGG CTC GTT CCG GAA GTG ATG GAG CAA 2565 GCG GTC ACA CTT CGC GTG CCG CTC AAA GTC GAT TAC CAT TAC GGC 2610 TCG ACA TGG TAT GAC GCG AAA 2631 配列番号：14 配列の長さ：877 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列： Met Lys Lys Lys Leu Val Leu Ile Asp Gly Ser Ser Val Ala Tyr 1 5 10 15 Arg Ala Phe Phe Ala Leu Pro Leu Leu His Asn Asp Lys Gly Ile 20 25 30 His Thr Asn Ala Val Tyr Gly Phe Thr Met Met Leu Asn Lys Ile 35 40 45 Leu Ala Glu Glu Glu Pro Thr His Met Leu Val Ala Phe Asp Ala 50 55 60 Gly Lys Thr Thr Phe Arg His Glu Ala Phe Gln Glu Tyr Lys Gly 65 70 75 Gly Arg Gln Gln Thr Pro Pro Glu Leu Ser Glu Gln Phe Pro Leu 80 85 90 Leu Arg Glu Leu Leu Arg Ala Tyr Arg Ile Pro Ala Tyr Glu Leu 95 100 105 Glu Asn Tyr Glu Ala Asp Asp Ile Ile Gly Thr Leu Ala Ala Arg 110 115 120 Ala Glu Gln Glu Gly Phe Glu Val Lys Val Ile Ser Gly Asp Arg 125 130 135 Asp Leu Thr Gln Leu Ala Ser Pro His Val Thr Val Asp Ile Thr 140 145 150 Lys Lys Gly Ile Thr Asp Ile Glu Pro Tyr Thr Pro Glu Ala Val 155 160 165 Arg Glu Lys Tyr Gly Leu Thr Pro Glu Gln Ile Val Asp Leu Lys 170 175 180 Gly Leu Met Gly Asp Lys Ser Asp Asn Ile Pro Gly Val Pro Gly 185 190 195 Ile Gly Glu Lys Thr Ala Val Lys Leu Leu Arg Gln Phe Gly Thr 200 205 210 Val Glu Asn Val Leu Ala Ser Ile Asp Glu Ile Lys Gly Glu Lys 215 220 225 Leu Lys Glu Thr Leu Arg Gln His Arg Glu Met Ala Leu Leu Ser 230 235 240 Lys Lys Leu Ala Ala Ile Arg Arg Asp Ala Pro Val Glu Leu Ser 245 250 255 Leu Asp Asp Ile Ala Tyr Gln Gly Glu Asp Arg Glu Lys Val Val 260 265 270 Ala Leu Phe Lys Glu Leu Gly Phe Gln Ser Phe Leu Glu Lys Met 275 280 285 Glu Ser Pro Ser Ser Glu Glu Glu Lys Pro Leu Ala Lys Met Ala 290 295 300 Phe Thr Leu Ala Asp Arg Val Thr Glu Glu Met Leu Ala Asp Lys 305 310 315 Ala Ala Leu Val Val Glu Val Val Glu Glu Asn Tyr His Asp Ala 320 325 330 Pro Ile Val Gly Ile Ala Val Val Asn Glu His Gly Arg Phe Phe 335 340 345 Leu Arg Pro Glu Thr Ala Leu Ala Asp Pro Gln Phe Val Ala Trp 350 355 360 Leu Gly Asp Glu Thr Lys Lys Lys Ser Met Phe Asp Ser Lys Arg 365 370 375 Ala Ala Val Ala Leu Lys Trp Lys Gly Ile Glu Leu Cys Gly Val 380 385 390 Ser Phe Asp Leu Leu Leu Ala Ala Tyr Leu Leu Asp Pro Ala Gln 395 400 405 Gly Val Asp Asp Val Ala Ala Ala Ala Lys Met Lys Gln Tyr Glu 410 415 420 Ala Val Arg Pro Asp Glu Ala Val Tyr Gly Lys Gly Ala Lys Arg 425 430 435 Ala Val Pro Asp Glu Pro Val Leu Ala Glu His Leu Val Arg Lys 440 445 450 Ala Ala Ala Ile Trp Ala Leu Glu Arg Pro Phe Leu Asp Glu Leu 455 460 465 Arg Arg Asn Glu Gln Asp Arg Leu Leu Val Glu Leu Glu Gln Pro 470 475 480 Leu Ser Ser Ile Leu Ala Glu Met Glu Phe Ala Gly Val Lys Val 485 490 495 Asp Thr Lys Arg Leu Glu Gln Met Gly Glu Glu Leu Ala Glu Gln 500 505 510 Leu Arg Thr Val Glu Gln Arg Ile Tyr Glu Leu Ala Gly Gln Glu 515 520 525 Phe Asn Ile Asn Ser Pro Lys Gln Leu Gly Val Ile Leu Phe Glu 530 535 540 Lys Leu Gln Leu Pro Val Leu Lys Lys Ser Lys Thr Gly Tyr Ser 545 550 555 Thr Ser Ala Asp Val Leu Glu Lys Leu Ala Pro Tyr His Glu Ile 560 565 570 Val Glu Asn Ile Leu Gln His Tyr Arg Gln Leu Gly Lys Leu Gln 575 580 585 Ser Thr Tyr Ile Glu Gly Leu Leu Lys Val Val Arg Pro Asp Thr 590 595 600 Lys Lys Val His Thr Ile Phe Asn Gln Ala Leu Thr Gln Thr Gly 605 610 615 Arg Leu Ser Ser Thr Glu Pro Asn Leu Gln Asn Ile Pro Ile Arg 620 625 630 Leu Glu Glu Gly Arg Lys Ile Arg Gln Ala Phe Val Pro Ser Glu 635 640 645 Ser Asp Trp Leu Ile Phe Ala Ala Asp Tyr Ser Gln Ile Glu Leu 650 655 660 Arg Val Leu Ala His Ile Ala Glu Asp Asp Asn Leu Met Glu Ala 665 670 675 Phe Arg Arg Asp Leu Asp Ile His Thr Lys Thr Ala Met Asp Ile 680 685 690 Phe Gln Val Ser Glu Asp Glu Val Thr Pro Asn Met Arg Arg Gln 695 700 705 Ala Lys Ala Val Asn Phe Gly Ile Val Tyr Gly Ile Ser Asp Tyr 710 715 720 Gly Leu Ala Gln Asn Leu Asn Ile Ser Arg Lys Glu Ala Ala Glu 725 730 735 Phe Ile Glu Arg Tyr Phe Glu Ser Phe Pro Gly Val Lys Arg Tyr 740 745 750 Met Glu Asn Ile Val Gln Glu Ala Lys Gln Lys Gly Tyr Val Thr 755 760 765 Thr Leu Leu His Arg Arg Arg Tyr Leu Pro Asp Ile Thr Ser Arg 770 775 780 Asn Phe Asn Val Arg Ser Phe Ala Glu Arg Met Ala Met Asn Thr 785 790 795 Pro Ile Gln Gly Ser Ala Ala Asp Ile Ile Lys Lys Ala Met Ile 800 805 810 Asp Leu Asn Ala Arg Leu Lys Glu Glu Arg Leu Gln Ala Arg Leu 815 820 825 Leu Leu Gln Val His Asp Glu Leu Ile Leu Glu Ala Pro Lys Glu 830 835 840 Glu Met Glu Arg Leu Cys Arg Leu Val Pro Glu Val Met Glu Gln 845 850 855 Ala Val Thr Leu Arg Val Pro Leu Lys Val Asp Tyr His Tyr Gly 860 865 870 Ser Thr Trp Tyr Asp Ala Lys 875 配列番号：15 配列の長さ：10 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド フラグメント型：Ｎ末端フラグメント 配列番号：16 配列の長さ：1779 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：genomic DNA 起源：生物名:バチルス カルドテナックス(Bacillus c
aldotenax) 株名：YT-G(DSM406) 配列： ATG GAA TCG CCG TCA TCA GAA GAG GAA AAA CCG CTT GCC AAG ATG 45 GCA TTT ACG CTT GCT GAC CGC GTG ACG GAG GAG ATG CTT GCC GAC 90 AAG GCG GCG CTT GTC GTT GAA GTG GTC GAG GAA AAT TAT CAT GAT 135 GCG CCG ATC GTC GGC ATC GCT GTG GTC AAC GAA CAT GGA CGG TTT 180 TTC CTG CGC CCG GAG ACG GCG CTT GCC GAT CCG CAG TTT GTC GCC 225 TGG CTT GGT GAT GAA ACG AAG AAA AAA AGC ATG TTT GAC TCA AAG 270 CGC GCG GCA GTC GCC TTG AAA TGG AAA GGA ATT GAG CTA TGC GGC 315 GTT TCC TTT GAT TTA TTG CTG GCC GCC TAT TTG CTT GAT CCG GCG 360 CAA GGT GTT GAT GAT GTG GCT GCC GCA GCA AAA ATG AAG CAA TAC 405 GAA GCG GTG CGC CCG GAT GAA GCG GTG TAT GGC AAA GGG GCG AAG 450 CGG GCC GTG CCG GAT GAG CCA GTG CTC GCC GAG CAT TTG GTC CGC 495 AAG GCG GCG GCG ATT TGG GCG CTC GAA CGG CCG TTT TTG GAT GAG 540 CTG CGC CGC AAC GAA CAA GAT CGG TTG CTC GTC GAG CTC GAG CAG 585 CCG TTG TCT TCG ATT TTG GCG GAA ATG GAA TTT GCC GGA GTG AAA 630 GTG GAT ACG AAG CGG CTC GAA CAG ATG GGC GAA GAG CTC GCC GAG 675 CAG CTG CGC ACG GTC GAG CAG CGC ATT TAT GAG CTC GCC GGC CAA 720 GAA TTC AAC ATC AAT TCA CCG AAA CAG CTC GGC GTC ATT TTA TTT 765 GAA AAA CTG CAG CTG CCC GTC TTG AAA AAA AGC AAA ACC GGC TAC 810 TCC ACT TCG GCG GAT GTG CTT GAA AAA CTT GCG CCT TAT CAC GAG 855 ATC GTG GAA AAC ATT TTG CAA CAT TAC CGC CAG CTT GGC AAG TTG 900 CAG TCG ACG TAT ATT GAA GGA TTG CTG AAA GTC GTG CGA CCC GAT 945 ACA AAG AAG GTG CAT ACG ATT TTC AAT CAG GCG TTG ACG CAA ACC 990 GGA CGG CTC AGC TCG ACG GAG CCG AAC TTG CAA AAC ATT CCG ATT 1035 CGG CTT GAG GAA GGA CGG AAA ATC CGC CAA GCG TTC GTG CCG TCG 1080 GAG TCT GAT TGG CTC ATT TTC GCT GCC GAC TAC TCG CAA ATT GAG 1125 TTG CGC GTC CTC GCC CAT ATT GCG GAA GAT GAC AAT TTA ATG GAA 1170 GCG TTC CGC CGC GAT TTG GAT ATC CAT ACG AAA ACA GCG ATG GAC 1215 ATT TTC CAA GTG AGC GAG GAC GAA GTG ACG CCC AAC ATG CGC CGT 1260 CAG GCG AAG GCG GTC AAC TTT GGG ATC GTT TAC GGG ATC AGT GAT 1305 TAC GGC TTG GCG CAA AAC TTA AAT ATT TCA CGC AAA GAG GCC GCT 1350 GAA TTC ATC GAG CGC TAC TTC GAA AGC TTC CCT GGC GTG AAG CGG 1395 TAT ATG GAA AAC ATT GTG CAA GAA GCA AAA CAG AAA GGG TAT GTG 1440 ACG ACG CTG CTG CAT CGG CGC CGC TAT TTG CCG GAT ATT ACG AGC 1485 CGC AAC TTC AAC GTC CGC AGC TTT GCT GAA CGG ATG GCG ATG AAC 1530 ACG CCG ATT CAA GGG AGC GCC GCT GAC ATT ATT AAA AAG GCG ATG 1575 ATC GAT CTG AAC GCC AGA CTG AAG GAA GAG CGG CTG CAA GCG CGC 1620 CTT TTG CTG CAG GTG CAT GAC GAG CTC ATT TTG GAG GCG CCG AAA 1665 GAA GAG ATG GAG CGG CTG TGC CGG CTC GTT CCG GAA GTG ATG GAG 1710 CAA GCG GTC ACA CTT CGC GTG CCG CTC AAA GTC GAT TAC CAT TAC 1755 GGC TCG ACA TGG TAT GAC GCG AAA 1779 配列番号：17 配列の長さ：593 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列： Met Glu Ser Pro Ser Ser Glu Glu Glu Lys Pro Leu Ala Lys Met 1 5 10 15 Ala Phe Thr Leu Ala Asp Arg Val Thr Glu Glu Met Leu Ala Asp 20 25 30 Lys Ala Ala Leu Val Val Glu Val Val Glu Glu Asn Tyr His Asp 35 40 45 Ala Pro Ile Val Gly Ile Ala Val Val Asn Glu His Gly Arg Phe 50 55 60 Phe Leu Arg Pro Glu Thr Ala Leu Ala Asp Pro Gln Phe Val Ala 65 70 75 Trp Leu Gly Asp Glu Thr Lys Lys Lys Ser Met Phe Asp Ser Lys 80 85 90 Arg Ala Ala Val Ala Leu Lys Trp Lys Gly Ile Glu Leu Cys Gly 95 100 105 Val Ser Phe Asp Leu Leu Leu Ala Ala Tyr Leu Leu Asp Pro Ala 110 115 120 Gln Gly Val Asp Asp Val Ala Ala Ala Ala Lys Met Lys Gln Tyr 125 130 135 Glu Ala Val Arg Pro Asp Glu Ala Val Tyr Gly Lys Gly Ala Lys 140 145 150 Arg Ala Val Pro Asp Glu Pro Val Leu Ala Glu His Leu Val Arg 155 160 165 Lys Ala Ala Ala Ile Trp Ala Leu Glu Arg Pro Phe Leu Asp Glu 170 175 180 Leu Arg Arg Asn Glu Gln Asp Arg Leu Leu Val Glu Leu Glu Gln 185 190 195 Pro Leu Ser Ser Ile Leu Ala Glu Met Glu Phe Ala Gly Val Lys 200 205 210 Val Asp Thr Lys Arg Leu Glu Gln Met Gly Glu Glu Leu Ala Glu 215 220 225 Gln Leu Arg Thr Val Glu Gln Arg Ile Tyr Glu Leu Ala Gly Gln 230 235 240 Glu Phe Asn Ile Asn Ser Pro Lys Gln Leu Gly Val Ile Leu Phe 245 250 255 Glu Lys Leu Gln Leu Pro Val Leu Lys Lys Ser Lys Thr Gly Tyr 260 265 270 Ser Thr Ser Ala Asp Val Leu Glu Lys Leu Ala Pro Tyr His Glu 275 280 285 Ile Val Glu Asn Ile Leu Gln His Tyr Arg Gln Leu Gly Lys Leu 290 295 300 Gln Ser Thr Tyr Ile Glu Gly Leu Leu Lys Val Val Arg Pro Asp 305 310 315 Thr Lys Lys Val His Thr Ile Phe Asn Gln Ala Leu Thr Gln Thr 320 325 330 Gly Arg Leu Ser Ser Thr Glu Pro Asn Leu Gln Asn Ile Pro Ile 335 340 345 Arg Leu Glu Glu Gly Arg Lys Ile Arg Gln Ala Phe Val Pro Ser 350 355 360 Glu Ser Asp Trp Leu Ile Phe Ala Ala Asp Tyr Ser Gln Ile Glu 365 370 375 Leu Arg Val Leu Ala His Ile Ala Glu Asp Asp Asn Leu Met Glu 380 385 390 Ala Phe Arg Arg Asp Leu Asp Ile His Thr Lys Thr Ala Met Asp 395 400 405 Ile Phe Gln Val Ser Glu Asp Glu Val Thr Pro Asn Met Arg Arg 410 415 420 Gln Ala Lys Ala Val Asn Phe Gly Ile Val Tyr Gly Ile Ser Asp 425 430 435 Tyr Gly Leu Ala Gln Asn Leu Asn Ile Ser Arg Lys Glu Ala Ala 440 445 450 Glu Phe Ile Glu Arg Tyr Phe Glu Ser Phe Pro Gly Val Lys Arg 455 460 465 Tyr Met Glu Asn Ile Val Gln Glu Ala Lys Gln Lys Gly Tyr Val 470 475 480 Thr Thr Leu Leu His Arg Arg Arg Tyr Leu Pro Asp Ile Thr Ser 485 490 495 Arg Asn Phe Asn Val Arg Ser Phe Ala Glu Arg Met Ala Met Asn 500 505 510 Thr Pro Ile Gln Gly Ser Ala Ala Asp Ile Ile Lys Lys Ala Met 515 520 525 Ile Asp Leu Asn Ala Arg Leu Lys Glu Glu Arg Leu Gln Ala Arg 530 535 540 Leu Leu Leu Gln Val His Asp Glu Leu Ile Leu Glu Ala Pro Lys 545 550 555 Glu Glu Met Glu Arg Leu Cys Arg Leu Val Pro Glu Val Met Glu 560 565 570 Gln Ala Val Thr Leu Arg Val Pro Leu Lys Val Asp Tyr His Tyr 575 580 585 Gly Ser Thr Trp Tyr Asp Ala Lys 590

【図面の簡単な説明】

【図１】ｐＵＩ１０１の構築を示す工程図である。

【図２】ｐＵＩ１０１にクローニングされているＤＮＡ
ポリメラーゼ遺伝子の制限酵素地図を示す図である。

【図３】ｐＵＩ２０５にクローニングされているＤＮＡ
ポリメラーゼ遺伝子の制限酵素地図を示す図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 加藤 郁之進 滋賀県大津市瀬田３丁目４番１号 寳酒 造株式会社中央研究所内 (56)参考文献 特表 平３−502165（ＪＰ，Ａ) 特表 平５−504887（ＪＰ，Ａ) Ａｂｓｔｒａｃｔｓ ｏｆ ｔｈｅ Ａｎｎｕａｌ Ｍｅｅｔｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅ ｔｙ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇ ｙ，90 Ｍｅｅｔ．（1990）ｐ．214 Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉ ｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒ ｙ，264［11］，（15 Ａｐｒ．1989）, ｐ．6427−6437 (58)調査した分野(Int.Cl.⁶，ＤＢ名) C12N 15/09 ZNA C12N 9/12 C12Q 1/68 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims (9)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ポルＩ型ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子をク
   ローニングする方法において、下記の各工程： （ａ）ポルＩ型ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子を、配列表の
   配列番号１又は配列番号２でそれぞれ表されるプライマ
   ーを用いて増幅させる工程、 （ｂ）増幅ＤＮＡをプローブとして用い、該プローブに
   ハイブリダイズするポルＩ型ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子
   をクローニングする工程、を包含することを特徴とする
   ポルＩ型ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子のクローニング方
   法。
2. 【請求項２】 配列表の配列番号１７で表されるアミノ
   酸配列、あるいは該配列に１若しくは複数個のアミノ酸
   の欠失、置換、挿入、付加を有するアミノ酸配列を含有
   し、かつ、ＤＮＡポリメラーゼ活性を有するタンパクを
   コードするポルＩ型ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子。
3. 【請求項３】 配列表の配列番号１３、又は配列番号１
   ６で表される塩基配列であることを特徴とする請求項２
   に記載のポルＩ型ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子。
4. 【請求項４】 プラスミドｐＵＩ１０１又はプラスミド
   ｐＵＩ２０５に含有されることを特徴とする請求項２に
   記載のポルＩ型ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子。
5. 【請求項５】 請求項２、請求項３、又は請求項４に記
   載のポルＩ型ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子にストリンジェ
   ントな条件でハイブリダイズ可能なポルＩ型ＤＮＡポリ
   メラーゼ遺伝子。
6. 【請求項６】 配列表の配列番号１７で表されるアミノ
   酸配列、あるいは該配列に１若しくは複数個のアミノ酸
   の欠失、置換、挿入、付加を有するアミノ酸配列を含有
   し、かつ、ＤＮＡポリメラーゼ活性を有することを特徴
   とするポルＩ型ＤＮＡポリメラーゼ。
7. 【請求項７】 ５′→３′エキソヌクレアーゼ活性を欠
   失していることを特徴とする請求項６に記載のポルＩ型
   ＤＮＡポリメラーゼ。
8. 【請求項８】 配列表の配列番号１４で表されるアミノ
   酸配列であることを特徴とする請求項６に記載のポルＩ
   型ＤＮＡポリメラーゼ。
9. 【請求項９】 請求項２、又は請求項５に記載のポルＩ
   型ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子を含有させた組換えプラス
   ミドを導入した形質転換体を培養し、該培養 物からポル
   Ｉ型ＤＮＡポリメラーゼを採取することを特徴とするポ
   ルＩ型ＤＮＡポリメラーゼの製造方法。