JP2543630B2 - 特定タンパク質の糖化割合の測定方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、特定タンパク質の糖化
割合の測定方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】糖尿病晩期に発生する合併症は、患者の
予後を決定的に左右するので、その進展の予防は糖尿病
治療上もっとも重要な課題である。

【０００３】糖尿病患者血液中のタンパク質が非酵素的
糖化を受け、健常人と比較して血中非酵素的糖化タンパ
ク質量が増加すると報告され、非酵素的糖化タンパク質
と疾病との関係が詳細に研究されている。（Biochem.Bi
ophys.Res.Commun.,67,103,(1975),J.Biol.Chem.,254,7
02(1979),Proc.Natl.Acad.Sci.USA,78,2393(1982),Diab
etes,31,283(1982),Proc.Natl.Acad.Sci.USA,75,2918(1
978),J.Clinical Pahtology,37,841(1984),Annals of C
linical Biochemistry,21,2(1984))。

【０００４】血糖コントロールの指標としては、現時点
での糖代謝状態を反映する空腹時血糖と共に、過去１〜
２ケ月間の血糖値状態と良好な相関性を示す非酵素的糖
化ヘモグロビンが臨床的に有用であるとして、糖尿病患
者治療の指標として広く採用されている。しかし、空腹
時血糖は日内変動が激しいこと、非酵素的糖化ヘモグロ
ビンは治療の効果が確認されるのに長期間を要するなど
の問題点がある。

【０００５】また、治療効果をより早く知る目的とし
て、過去１〜２週間の血糖状態を反映する血中非酵素的
糖化タンパク質の還元能力であるフルクトサミンが測定
され、糖尿病治療に活用されているが、共存物質、たと
えば、ビリルビンや、L-アスコルビン酸などの還元性物
質の影響が問題として残されている（臨床検査 機器・
試薬、第１３巻、１号、第８７頁（1990））。また、同
様に短期間の血糖コントロールの指標として、非酵素的
糖化アルブミンが注目され、その簡便な測定法開発の研
究が盛んに行われている。

【０００６】さらに、非酵素的糖化タンパク質には、シ
ッフ塩基型（不安定型）とシッフ塩基がアマドリ転移し
て安定化したアマドリ転移物（安定型）があり（臨床検
査第３３巻、８号、第８９３頁(1989)）、短期間の血糖
値変化に影響を受けず、過去の一定期間の血糖値状態を
良く反映するアマドリ転移物のみを測定することも重要
になりつつある。

【０００７】従来の糖化タンパク質の測定法としては、
等電点分画電気泳動法、陽イオン交換クロマトグラフィ
ー、分光測定法、比色定量法などに加え、ＨＰＬＣ法、
ミニカラム法、アフィニティークロマトグラフィーなど
が挙げられ（Diabetologia,31,627-631(1988),検査と技
術、第１４巻 １１号 第１１５５頁（1986) 参照）、
試料（被検液）中の糖化タンパク質量測定のために広く
臨床に用いられている。

【０００８】しかし、これらの方法は、測定感度、操作
性、検体処理時間などの点を同時に満足する方法とは言
いがたく、実用上改善されなければならない点を有して
いる。よって、多数の検体を短時間のうちに簡便かつ高
精度に測定できる方法の確立が要望されていた。

【０００９】これらの問題点を解決する方法として、免
疫学的測定法の応用が考えられ、糖化タンパク質の糖化
部位の一つであるグリシトールリジン残基に特異的な親
和性を有する抗血清やモノクローナル抗体を取得し、放
射標識免疫測定法（ＲＩＡ）により糖化タンパク質の測
定が可能であると報告されている（J.Clin.Invest.,72,
1427(1983)、臨床病理 第３３巻補冊(1985) 第２２６
頁、糖尿病 第２９巻第５８１頁 (1986) 、Clinica.Ch
imica.Acta.,153,293(1986) 、糖尿病 第２８巻 第６
９５頁 (1985) 参照）。

【００１０】上述の免疫学的測定法は、いずれも糖化タ
ンパク質のアマドリ転移物に対する抗還元型糖化タンパ
ク質抗体を使用しており、糖化タンパク質測定法として
は優れた方法であるが、臨床的に測定意義の高い特定糖
化タンパク質の特異的分離やその総量の測定を別途行う
必要があること、還元反応前に糖とタンパク質を分離す
る前処理が必要となるなどの問題点がある（糖尿病 第
３４巻補冊第９６頁(1986年）参照）。

【００１１】温度、ｐＨまたはイオン強度における小さ
な変動に影響を受けにくいフェニルボロン酸のアフィニ
ティークロマトグラフィーは、糖化タンパク質の分離法
として優れた方法であり、アミコン・コーポレーション
やピアス・ケミカル・カンパニーなどが固定化したフェ
ニルボロン酸を含む臨床使用のためのキットを開発して
いる（英国特許出願公開第2,024,829 号および米国特許
第4,269,605 号）。しかしながら、これらの方法も必要
試料量が比較的多く必要であること、特異性に欠けるタ
ンパク質量測定操作が含まれるなどの問題がある。

【００１２】また、固相化したフェニルボロン酸により
糖化タンパク質を分離し、特定のタンパク質に特異的親
和性を有する標識化抗体を用いる方法（特開62-100660
号）が報告されているが、糖化タンパク質の各種類の比
率の変化に影響を受ける点、糖化割合を知るのに特定タ
ンパク質の総量を別途測定する必要がある点など実用上
問題が残されている。

【００１３】また、蛍光標識化したボロン酸誘導体を糖
化アルブミンの検出用試薬とし、蛍光波長の変化より糖
化アルブミンを定量する方法（Clin.Chem.Acta,149,13
(1985) ）が報告されている。この方法は、原理的に検
出用試薬が不特定の糖化タンパク質と反応する点、特定
タンパク質総量を別途測定しなくてはならない点、タン
パク質測定方法の特定タンパク質に対する特異性が低い
点で特定タンパク質の糖化割合を測定する方法としては
適していない。

【００１４】これらの問題を解決する方法として、特開
64-16964号公報には、固相化した抗体により特定タンパ
ク質を分離し、グリシトールリジン、グリシトールバリ
ン残基などの還元型の糖化部分を特異的に認識するモノ
クローナル抗体にて特定糖化タンパク質量、または特定
タンパク質の糖化割合を測定する方法が報告されてい
る。この方法は、特定タンパク質の総量を測定すること
なく糖化割合が測定される点で優れた方法であるが、再
現性や検量線直線性が乏しいこと、認識糖化部位が糖化
部位の一部にすぎないこと、測定時間が５時間以上を要
することなどの問題点を有している。

【００１５】また、蛍光色素で標識化したボロン酸誘導
体を試料中のヘモグロビンと反応させ、担体に固定化し
た抗体でヘモグロビンを捕捉し、ヘモグロビン全量を比
色測定にて測定し、更に糖化ヘモグロビンを蛍光測定に
て測定し、ヘモグロビンの糖化割合を測定する方法が報
告されている（米国特許第4,861,728 号）。しかし、担
体に固定化された抗体量に対して大過剰に存在する試料
中の糖化ヘモグロビン全量以上の蛍光色素で標識化され
たボロン酸誘導体が必要な点で経済的な測定法ではな
く、糖化割合を測定するのに比色測定と蛍光測定の２つ
の測定を必要とする点で、操作性、簡便性、汎用性に問
題がある。

【００１６】

【発明が解決しようとする課題】本発明では、これら従
来法の欠点に鑑み、より簡便な操作で、短時間に精度よ
く特定タンパク質の糖化割合を測定することのできる免
疫学的手法とアフィニティー吸着法を組み合わせた測定
法の提供を目的とする。

【００１７】

【課題を解決するための手段】本発明者等は、特定タン
パク質の糖化割合を簡便に測定すべく鋭意研究を重ねた
結果、まず、測定しようとする特定のタンパク質に特異
的な親和性を有する抗体あるいは抗体の活性フラグメン
ト（抗体の抗原認識部位を含む部分）を固体の担体に固
定化して不溶化した固相に被検液である試料を反応させ
ることによって特定タンパク質を捕らえ、液相（試料）
と固相を分離し、固相に捕らえられた特定タンパク質の
糖化部位に存在するシス・ジオール基と親和性を有する
標識化されたボロン酸誘導体を反応させることにより、
糖化部位に標識物を結合させ、固相に結合したあるいは
結合しなかった標識物量を測定することによって試料中
の特定タンパク質の糖化割合が簡単に測定できることを
見い出し本発明に到達した。

【００１８】すなわち、本発明は特定タンパク質に特異
的親和性を有する抗体または該抗体の活性フラグメント
が担体上に固定化された固相に、試料を接触させて該特
定タンパク質を選択的に該固相上に捕捉させた後、該試
料と該固相を分離し、次いでタンパク質の糖化部位に親
和性を有する標識化されたボロン酸誘導体を該分離され
た固相に接触させることにより該固相に捕捉されている
特定タンパク質の糖化部位に標識物を結合させ、次いで
この反応混合物の固相と液相を分離し、分離された固相
または液相の標識物量を測定することを特徴とする特定
タンパク質の糖化割合の測定方法に関するものである。

【００１９】また、本発明はボロン酸誘導体がジヒドロ
キシボリル基を含有するボロン酸誘導体である上記に記
載の特定タンパク質の糖化割合の測定方法を提供するも
のである。

【００２０】更に本発明は上記試料が採取された尿、血
液、血漿、血清から選ばれた１種である上記のいずれか
に記載の特定タンパク質の糖化割合の測定方法を提供す
るものである。

【００２１】更にまた、本発明は標識化されたボロン酸
誘導体が、放射性同位元素、酵素、補酵素、蛍光色素、
化学発光物質または特異結合タンパク質のいずれかで標
識化されたボロン酸誘導体である上記のいずれかに記載
の特定タンパク質の糖化割合の測定方法に関するもので
ある。

【００２２】本測定法によれば、ボロン酸誘導体が糖化
タンパク質のうち主にアマドリ転移物（安定型）を捕ら
えるため、試料の前処理によるシッフ塩基型（不安定
型）糖化物の除去を必要としない（Clin.Chem.,28,10,2
088-2094(1982)）。

【００２３】以上のように、本発明では、被検液である
試料の中から、まず目的の特定タンパク質（具体的に
は、例えばアルブミンやヘモグロビンなど）のみを特異
的に分離するために特定タンパク質に対する抗体または
抗体の活性フラグメントによる免疫反応を用い、特定の
抗体ないしは該抗体の活性フラグメントが担体上に固定
化された固相に該特定のタンパク質を捕捉し、次に特定
タンパク質のうち糖化したものを測定するために標識化
されたボロン酸誘導体（ボロン酸誘導体に放射性同位元
素や酵素その他の標識物を付けたもの）を用いている。
このため、糖化タンパク質に対する抗体を調製すること
なく試料中のアマドリ転移物（糖化タンパク質のシッフ
塩基型糖化物がアマドリ転移により安定型となったも
の）を効率よく測定できる。

【００２４】以下、本発明について詳細に述べるが、下
記に挙げる物質および物質群に限定されるものではな
い。

【００２５】本発明で使用する抗体は、その由来を特に
限定されるものではなく、哺乳動物等（たとえばマウ
ス、ラット、ウサギなど）に特定タンパク質またはその
精製物を抗原として投与、免疫して得られた抗血清、腹
水液等をそのままか、あるいは従来公知の方法である塩
析法、ゲル瀘過法、イオン交換クロマトグラフィー、電
気泳動法、アフィニティークロマトグラフィー等で精製
してポリクローナル抗体として用いることができる。あ
るいは、抗原で感作した哺乳動物等の抗体産生細胞（脾
臓細胞、リンパ節細胞など）とミエローマ細胞とから雑
種細胞（ハイブリドーマ）を得て調製したモノクローナ
ル抗体または従来公知の塩析法、各種クロマトグラフィ
ーにより精製したモノクローナル抗体を用いることがで
きる。

【００２６】これらの抗体は抗体分子自体でもよく、ま
た、これらの抗体を酵素処理して得られるＦａｂ、Ｆａ
ｂ´またはＦ（ａｂ´）2 といった抗体の活性フラグメ
ント（抗体の抗原認識部位を含む部分）を使用してもよ
い。

【００２７】固相の担体形状としては、使用目的に応じ
て適宜の形状を選定すればよく、例えば、ビーズ状、テ
ストプレート状、チューブ状、ディスク状、球状、ステ
ィック状、ラテックス状などが例示できる。また、その
材質としては、通常の酵素免疫測定法（ＥＩＡ）用担体
として用いられるもの、たとえば、ガラス、多糖類（セ
ルロース、デキストラン、デンプン、デキストリン）ま
たはその誘導体、シリカゲル、多孔性セラミックス、金
属酸化物、各種合成樹脂（たとえばプロピレン、塩化ビ
ニル、酢酸ビニル、プロピオン酸ビニル、アクリル酸、
アクリル酸エステル、メタクリル酸、メタクリル酸エス
テル、スチレン、メチルスチレン、ブタジエン、イソプ
レン、アクリルアミド、アクリロニトリル、メタクリロ
ニトリルなどの重合体もしくは共重合体担体）、または
これらに公知の手段によりスルホン基、アミノ基などの
反応性官能基を導入したものなどが挙げられる。

【００２８】担体への抗体の固定化法は、物理的吸着
法、共有結合法、架橋法等の固定化酵素におけると同様
の方法を応用すればよく、たとえば、千畑一郎編「固定
化酵素」（昭和５０年３月２０日、（株）講談社発行）
第９〜７５頁などが応用できる。

【００２９】ボロン酸誘導体としては、ジヒドロキシボ
リル基を構造上もっていればよく、たとえば、（１−ア
ミノ−２−フェニルエチル）ボロン酸、［３−［（アミ
ノカルボニル）アミノ］フェニル］ボロン酸、（３−ア
ミノフェニル）ボロン酸、［３−（ハイドロオキシ）フ
ェニル］ボロン酸塩酸塩、［２−（ハイドロキシアミ
ノ）フェニル］ボロン酸、［４−（ハイドロオキシアミ
ノ）フェニル］ボロン酸塩酸塩等が使用できる。特にア
ミノ基を有するボロン酸誘導体が好ましく使用される。

【００３０】ボロン酸誘導体と標識物を結合させて、標
識化されたボロン酸誘導体とするには、たとえば、架橋
試薬として、グルタルアルデヒド、過ヨーソ酸、マレイ
ミド化合物（Ｎ−スクシニミジル−２−マレイミドアセ
テート、Ｎ−スクシニミジル−４−マレイミドブチレー
ト、Ｎ−スクシニミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチ
ル）−シクロヘキサン−１−カルボキシレート、Ｎ−ス
ルホスクシニミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）−
シクロヘキサン−１−カルボキシレートなど）、ジマレ
イミド化合物（Ｎ，Ｎ´−オキシジメチレンジマレイミ
ド、Ｎ，Ｎ´−ｏ−フェニレンジマレイミドなど）等が
使用できる。

【００３１】ボロン酸誘導体を標識化するための標識物
としては、免疫学的測定法に繁用されているものを用い
ることができる。具体的には、放射性同位元素、酵素
（例えば、β−ガラクトシダーゼ、ペルオキシダーゼ、
アルカリホスファターゼ、グルコースオキシダーゼ、グ
ルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ等）、酵素基
質、蛍光色素（例えば、フルオレセイン誘導体、ローダ
ミン誘導体、ウンベリフェロン等）、化学発光物質（例
えば、ルミノール誘導体、イソルミノール誘導体等）、
ビオチン、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドなど
の補酵素・補欠分子族、特異結合タンパク質（特異結合
とは特定の化合物とのみ結合する性質を有するもので、
例えばアビジン等）など何らかの方法で比較的容易に検
知可能なものを使用すればよい。

【００３２】放射性同位元素を用いる標識化は１９８３
年２月２８日金原出版発行の「臨床病理」 臨時増刊、
特集５３号 第２４〜２５頁(1983)ないしは１９８８年
６月１５日医学書院発行「検査と技術」増刊号Vol 16,N
o.7 第５８１〜５８２頁(1988)に準じた方法が、また、
これ以外の標識化については１９８７年５月１５日医学
書院発行 石川榮治、河上忠、宮井潔編集「酵素免疫測
定法」第３版 第７５〜１５１頁ないしは千畑一郎編
「固定化酵素」（昭和５０年３月２０日、（株）講談社
発行）第９〜７５頁などに準じた方法が応用できる。

【００３３】測定対象となる試料（被検液）としては、
糖化タンパク質の測定を必要とするものであれば特に限
定はなく、例えば、尿、血液、血漿、血清などの糖化タ
ンパク質を含有する生体由来の試料またはタンパク質と
糖質（たとえばグルコースやグルコース−６−リン等）
の混合物等が挙げられる。糖化タンパク質については、
例えば「臨床検査」Vol 33,No.8 第８７９〜８９９頁(1
989)に説明されている。

【００３４】該試料の特定タンパク質の糖化割合を測定
するには、測定の目的とする特定タンパク質に特異的親
和性を有する一定量の抗体または抗体の活性フラグメン
トを担体上に固定化して得られた固相上の抗体または抗
体の活性フラグメントのすべてに特定タンパク質が結合
しうる濃度以上で特定タンパク質を含有しうる試料を用
いることが肝要である。

【００３５】また、標識化されたボロン酸誘導体を糖化
タンパク質の糖化部位に結合させるには、通常ｐＨ８〜
９の範囲の酢酸アンモニウム緩衝液、モルホリン塩酸緩
衝液、または２−アミノ−２−メチルプロパン−１，３
−ジオール塩酸緩衝液などで溶液として使用するのが好
ましい。

【００３６】以下、本発明の理解を容易にするために、
特定タンパク質としてアルブミンを例にとって、反応を
モデル化して図２〜図５に簡略モデル図として示す。

【００３７】図２はアルブミンの分子モデルであり、−
ＮＨ₂ はアルブミンのアミノ基を示している。図３は糖
化アルブミン（図２のアルブミンのアミノ基に糖が結合
し、アマドリ転移した状態）を示している。図４は担体
に固定化された抗アルブミン抗体が、アルブミンを糖
化、非糖化の区別なく捕捉している状態を示したもので
ある。図５は標識化されたボロン酸誘導体が図４におい
て捕捉された糖化アルブミンの糖化部位のみに特異的に
結合している状態を示している。図５において＊は標識
物を示している。

【００３８】

【作用】本発明の方法は、一定量の抗体または抗体の活
性フラグメントを担体上に固定化して得られた固相上の
抗体または抗体の活性フラグメントのすべてに特定タン
パク質が結合しうる濃度以上で特定タンパク質を含有す
る試料を用いることにより、固相に結合される特定タン
パク質量が一定となるため、標識化されたボロン酸誘導
体により特定タンパク質の糖化部位に結合する標識物量
を測定することにより、特定タンパク質の総量を別途に
測定することなく、特定タンパク質の糖化割合を測定す
ることができる。そして、本発明の方法により、試料中
の特定タンパク質の糖化割合を従来法に比べ精度よく、
短時間で、簡便・迅速に測定することができる。

【００３９】

【実施例】以下に本発明の理解を容易にするために、実
施例を挙げて説明するが、本発明はこの実施例のみに限
定されるものではない。

【００４０】実施例１ 非酵素的糖化アルブミンと非糖化アルブミンの調製 ヒト血清アルブミン５０ｍｇ（シグマ社製）とＤ−グル
コース５０ｍｇおよび水素化ホウ素ナトリウム４ｍｇを
１０ｍＭ（Ｍはモル／ｌを示す。）リン酸緩衝液ｐＨ
８．０に溶かし、３７℃で１０日間保持する。このアル
ブミンを“セファデックスＧ−２５”（ファルマシア社
製 ゲルろ過クロマトグラフィー用担体）、溶出液０．
２５Ｍ酢酸アンモニウム緩衝液ｐＨ９．０のゲルろ過ク
ロマトグラフィーにて脱塩後、３−アミノフェニルボロ
ン酸（アルドリッチ社製）を結合させた吸着体を用いた
アフィニティークロマトグラフィーを溶出液０．２５Ｍ
酢酸アンモニウム緩衝液ｐＨ９．０、０．２５Ｍ酢酸緩
衝液ｐＨ４．０として行い、溶出液０．２５Ｍ酢酸アン
モニウム緩衝液ｐＨ９．０にて溶出されるアルブミンを
非糖化アルブミン分画とし、０．２５Ｍ酢酸緩衝液ｐＨ
４．０にて溶出されるアルブミンを非酵素的糖化アルブ
ミン分画として分離・精製する。

【００４１】ペルオキシダーゼ標識化フェニルボロン
酸誘導体の調製 西洋わさび由来ペルオキシダーゼ４ｍｇ（シグマ社製）
と３−アミノフェニルボロン酸１６ｍｇ、０．０５％グ
ルタルアルデヒドを混合し、室温、４８時間反応後、水
素化ホウ素ナトリウム２ｍｇ添加し、室温、３時間放置
する。“セファデックスＧ−２５”、溶出液０．２５Ｍ
酢酸アンモニウム緩衝液ｐＨ９．０のゲルろ過クロマト
グラフィーにて脱塩後、で調製した非酵素的糖化アル
ブミンを結合した吸着体でアフィニティークロマトグラ
フィーを溶出液０．２５Ｍ酢酸アンモニウム緩衝液ｐＨ
９．０、０．２５Ｍ酢酸緩衝液ｐＨ４．０として行い、
０．２５Ｍ酢酸緩衝液ｐＨ４．０にて溶出してくるペル
オキシダーゼ標識化フェニルボロン酸誘導体を分離・精
製する。

【００４２】抗ヒト血清アルブミン抗体固定化担体の
調製 抗ヒト血清アルブミン抗体をポリスチレンビーズに固定
化し不溶化して固相とするため、抗ヒト血清アルブミン
抗体溶液（１００〜２００μｇ／ｍｌ，１０ｍＭリン酸
緩衝液ｐＨ７．３）にポリスチレンビーズ（φ６．３５
ｍｍ）を浸し、４℃にて一夜放置後、０．１％牛血清ア
ルブミン（ＢＳＡ）に浸し、４℃一夜放置することによ
り抗ヒト血清アルブミン抗体固定化担体（固相）を調製
する。

【００４３】ヒト血清アルブミンの糖化割合の測定 非糖化アルブミンと非酵素的糖化アルブミンを混合し、
ヒト血清アルブミン濃度を正常人血清中アルブミン濃度
である３ｇ／ｄｌとし、糖化アルブミンの割合が１０，
２０，４０，６０，８０，１００％である試料を調製し
た。

【００４４】この試料２０μｌを生理食塩水にて１００
倍に希釈し、希釈試料を調製した。

【００４５】希釈試料５００μｌを試験管に分注し、３
７℃の水浴中で５分間加温した。引き続き、抗ヒト血清
アルブミン抗体固定化担体を試験管内に入れ、５分間反
応させた。担体と液相を分離した後、担体を生理食塩水
にて洗浄し、ペルオキシダーゼ標識化フェニルボロン酸
誘導体溶液（０．２５Ｍ酢酸アンモニウム緩衝液ｐＨ
９．０）４００μｌを添加し、３７℃、３０分間反応さ
せた。引き続き、０．２５Ｍ酢酸アンモニウム緩衝液ｐ
Ｈ９．０にて洗浄後、１ｍｇ／ｍｌο−フェニレンジア
ミン溶液（０．１Ｍリン酸クエン酸緩衝液ｐＨ６．０、
５ｍＭ過酸化水素含有）５００μｌを添加し、３７℃、
１０分間反応後、１Ｎ硫酸２．０ｍｌで反応を停止し、
４９２ｎｍの吸光度を測定した。

【００４６】測定の結果を図１に示す。縦軸の△Ａはブ
ランクで補正済みの値であることを示す。図１に示した
とおり、糖化タンパク質の割合と吸光度の間で検量線を
作成することができ、さらに、吸光度は糖化タンパク質
の割合が増加するのに正比例して直線的に増加してお
り、本発明の測定方法によれば、精度よく測定が行える
ことが明かとなった。また測定に必要な時間は約１時間
であり、必要試料量は２０μｌであることより、短時間
にて多量の検体を処理でき、検体必要量も微量でよいこ
とが明かとなった。

【００４７】実施例２ 血清試料中アルブミンと電気泳動分離・抽出したアルブ
ミンの糖化割合の測定 電気泳動によるアルブミンの分離 血清試料は、標準管理血清“モニトロールII・Ｘ”（米
国デイド社製）１０ｍｌにＤ−グルコース５ｇを添加
し、３７℃、２日間保持したものを用いた。血清試料の
一部は、１０（Ｗ／Ｗ％）アクリルアミドゲル電気泳動
した後、ゲルを３０（Ｗ／Ｖ％）トリクロロ酢酸水溶液
に約１時間浸し、アルブミンに相当する部分を切り出し
た。切り出したゲルは、試験管に入れ、０．１Ｍリン酸
緩衝液ｐＨ７．３で中性になるまで洗浄し、ゲルの破砕
と遠心分離により、アルブミンを抽出した。

【００４８】 アルブミンの糖化割合の測定 血清試料中アルブミンおよび電気泳動ゲルより抽出した
アルブミンの糖化割合の測定は、実施例１に従った。測
定結果を表１に示す。

【００４９】

【表１】 血清試料中アルブミンとゲルより抽出したアルブミンの
糖化割合は、ほぼ同値であった。つまり、血清試料中ア
ルブミンの糖化割合の測定は、共存物質の影響を受け
ず、アルブミンを電気泳動にて単離した場合と同様に測
定できた。

【００５０】実施例３ アビジン標識化フェニルボロン酸誘導体とペルオキシダ
ーゼ標識化ビオチンを用いたヒト血清アルブミンの糖化
割合の測定 アビジン標識化フェニルボロン酸誘導体の調製 卵白由来アビジン２ｍｇおよび３−アミノフェニルボロ
ン酸８ｍｇを２ｍｌの０．５Ｍ硼酸緩衝液ｐＨ１０．５
に溶解し、２５（Ｗ／Ｗ％）グルタルアルデヒド１μｌ
を添加して、室温で１０分間放置した。１０分後、５０
０μｌの０．２５Ｍトリス塩酸緩衝液ｐＨ８．５を添加
して、反応を停止し、室温で１時間静置した。アビジン
標識化フェニルボロン酸誘導体は、実施例１と同様の方
法で精製した後、４Ｎ−水酸化ナトリウムでｐＨ９．０
とした。

【００５１】 ヒト血清アルブミンの糖化割合の測定 実施例１と同様の調製法にて、糖化割合が０、５０、１
００％であるヒト血清アルブミンの試料を調製し、測定
操作において、ペルオキシダーゼ標識化フェニルボロン
酸誘導体の代わりに、アビジン標識化フェニルボロン酸
誘導体を用い、糖化アルブミンの糖化部位にアビジンを
結合した。担体は、生理食塩水［０．０５（Ｖ／Ｖ％）
ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート含有］に
て洗浄後、ペルオキシダーゼ標識化ビオチン（シグマ社
製）溶液［０．２５Ｍ酢酸アンモニウム緩衝液ｐＨ９．
０（２．７Ｕ／ｍｌ）］を添加し、３７℃、１０分間反
応させた後、実施例１と同様に操作して、酵素活性を測
定した。測定結果を表２に示す。

【００５２】

【表２】 測定値は、糖化割合（％）の増大に比例して増大した。
以上の様に、特異結合タンパク質であるアビジンのビオ
チンとの特異的選択的結合性を利用して、アビジン標識
化フェニルボロン酸誘導体とペルオキシダーゼ標識化ビ
オチンを用いたヒト血清アルブミンの糖化割合の測定が
可能であった。

【００５３】実施例４ ヒトヘモグロビンの糖化割合の測定 実施例１と同様にして、非酵素的糖化ヒトヘモグロビン
と非糖化ヒトヘモグロビンを調製し、分離・精製した。
糖化割合の測定は、実施例１の測定操作において、抗ヒ
トヘモグロビン抗体固定化担体とペルオキシダーゼ標識
化フェニルボロン酸誘導体溶液（２Ｕ／ｍｌ）を用いた
以外は実施例１と同様に行った。実験結果を表３に示
す。

【００５４】

【表３】 実験の結果、ヘモグロビンもまた、アルブミンの場合と
同様、実施例−１と同様の測定操作にて、糖化割合の測
定が可能であった。

【００５５】実施例５ 尿中微量アルブミンの糖化割合の測定 標準尿試料の調製 尿は、限外瀘過膜（東洋瀘紙社製）を通して除蛋白し
た。標準尿試料は、実施例１で得た非酵素的糖化アルブ
ミンと非糖化アルブミンを除蛋白した尿に添加して調製
した。

【００５６】アルブミン濃度は、健常者尿中アルブミン
濃度である５μｇ／ｍｌとした。 尿中アルブミンの糖化割合の測定 測定試料は、尿試料の４００μｌを試験管に取り、０．
２５Ｍ酢酸アンモニウム緩衝液ｐＨ９．０［２．５（Ｗ
／Ｖ％）塩化ナトリウム、２．０（Ｖ／Ｖ％）ポリオキ
シエチレンソルビタンモノラウレート含有］１００μｌ
を添加して用いた。測定操作は、実施例１の操作におい
て、抗原抗体反応時間を５分間から２時間に、酵素反応
時間を１０分間から３０分間に変更し、他は実施例１と
同様に行った。実験結果を表４に示す。

【００５７】

【表４】 糖化割合（％） 検体１ 検体２ 25％ 50％ ΔＡ492nm 0.298 0.529 0.021 0.043 糖化割合(%) − − 1.9 3.8 検量線は、糖化割合を０、２５、５０％とした標準尿試
料により作成することができた。また、健常者尿の検体
１および検体２の糖化割合を測定した結果、糖化割合
は、２から４％程度であった。

【００５８】

【発明の効果】このように、本発明の方法により、試料
中の特定タンパク質の糖化割合を従来法に比べ精度よ
く、短時間で、簡便・迅速に測定することができる。

【００５９】また、本発明の方法は、一定量の抗体また
は抗体の活性フラグメントを担体上に固定化して得られ
た固相上の抗体または抗体の活性フラグメントのすべて
に特定タンパク質が結合しうる濃度以上で特定タンパク
質を含有する試料を用いることにより、固相に捕捉され
る特定タンパク質量が一定となるため、標識化されたボ
ロン酸誘導体により特定タンパク質の糖化部位に結合し
た標識物量、あるいは結合しなかった標識物量を測定す
ることにより、特定タンパク質の総量を別途に測定する
ことなく、特定タンパク質の糖化割合を測定することが
できる。

【００６０】加えて、測定に必要な標識化されたボロン
酸誘導体は、固相に結合した特定タンパク質の量以上に
存在すればよく、不必要に多量の標識化されたボロン酸
誘導体を必要としない点、経済性にも優れている。

【００６１】以上のように、本発明によってはじめて、
特定タンパク質の糖化割合を実用上の問題なく、簡便か
つ高精度に測定できる方法が提供されるのである。

【図面の簡単な説明】

【図１】ヒト血清アルブミンの糖化割合と標識物量測定
による吸光度との関係を表した標準曲線を示す。

【図２】アルブミンの分子の簡略モデル図を示す。

【図３】糖化アルブミンの分子の簡略モデル図を示す。

【図４】担体に固定化された抗アルブミン抗体が、アル
ブミンを糖化、非糖化の区別なく捕捉している状態を示
す簡略モデル図を示す。

【図５】標識化されたボロン酸誘導体が図４において捕
捉された糖化アルブミンの糖化部位のみに特異的に結合
している状態を示す簡略モデル図を示す。

Claims (4)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 特定タンパク質に特異的親和性を有する
   抗体または該抗体の活性フラグメントが担体上に固定化
   された固相に、試料を接触させて該特定タンパク質を選
   択的に該固相上に捕捉させた後、該試料と該固相を分離
   し、次いでタンパク質の糖化部位に親和性を有する標識
   化されたボロン酸誘導体を該分離された固相に接触させ
   ることにより該固相に捕捉されている特定タンパク質の
   糖化部位に標識物を結合させ、次いでこの反応混合物の
   固相と液相を分離し、分離された固相または液相の標識
   物量を測定することを特徴とする特定タンパク質の糖化
   割合の測定方法。
2. 【請求項２】 ボロン酸誘導体がジヒドロキシボリル基
   を含有するボロン酸誘導体である請求項１に記載の特定
   タンパク質の糖化割合の測定方法。
3. 【請求項３】 試料が採取された尿、血液、血漿、血清
   から選ばれた１種である請求項１または２に記載の特定
   タンパク質の糖化割合の測定方法。
4. 【請求項４】 標識化されたボロン酸誘導体が、放射性
   同位元素、酵素、補酵素、蛍光色素、化学発光物質また
   は特異結合タンパク質のいずれかで標識化されたボロン
   酸誘導体である請求項１または２に記載の特定タンパク
   質の糖化割合の測定方法。