JPH05192141A - 遺伝子操作による因子XIII aの製造法 - Google Patents
遺伝子操作による因子XIII aの製造法Info
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- JPH05192141A JPH05192141A JP3224813A JP22481391A JPH05192141A JP H05192141 A JPH05192141 A JP H05192141A JP 3224813 A JP3224813 A JP 3224813A JP 22481391 A JP22481391 A JP 22481391A JP H05192141 A JPH05192141 A JP H05192141A
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 遺伝子操作技術を用いて因子XIIIa を製造す
る方法を提供する。 【構成】 因子XIIIa をコ−ドするDNA、好ましくは
例えばヒト胎盤mRNAから得られるcDNAに由来す
るDNAを含有するベクタ−によって細胞を形質転換
し、該形質転換細胞を発現させる。これにより形質転換
細胞によって因子XIIIa が産生される。
る方法を提供する。 【構成】 因子XIIIa をコ−ドするDNA、好ましくは
例えばヒト胎盤mRNAから得られるcDNAに由来す
るDNAを含有するベクタ−によって細胞を形質転換
し、該形質転換細胞を発現させる。これにより形質転換
細胞によって因子XIIIa が産生される。
Description
【0001】本発明は、遺伝子操作による因子XIIIa の
製造方法に関するものである。凝固因子XIIIは脊椎動物
における天然の血液凝固過程における「凝固カスケ―
ド」の最終構成員である。「活性化フィブリン‐安定化
因子」、「フィブリノリガ―ゼ」或いは「血漿トランス
グルタミナ―ゼ」とも称され、及び以後「FXIIIa 」と
も称される因子XIIIの酵素的に活性な形態、因子XIIIa
は、分子内架橋による先在する血栓におけるフィブリン
単位の融合を触媒する〔ロ―ランド等(Lorand et el.)
メソッズ・イン・エンザィモロジ―(Methods inEnzymo
logy 80(1981), 333-341;カ―ティス等(Curtis et a
l.)Annals NewYork Academy of Sciences 1983,567-576
〕。血漿からの第XIII因子の分子量は約300kDで
ある〔ロ―ウィ等(Loewy et al.)、ジャ―ナル・オブ
・バイオロジカル・ケミストリ―(J.Biol.Chem.)236
(1961)2634 〕。活性サブユニットFXIIIa の分子量は
約80kDである〔ボ―ン及びシュウィック(Bohn and
Schwick )、Arzneimit-telforschung 21(1971)1432
2〕。因子XIIIの活性化に際し、トロンビンは、前駆体
から、約4kDの大きさであって、36個のアミノ酸の
公知の配列を有するペプチドを***する(タカギ及びド
ゥ―リトル(Takagiand DooLittle )、バイオケミスト
リ―(Biochemistry)13(1974)750-756〕。更に、4個の
アミノ酸を有する配列が公知である〔ホルブルック等
(Holbrook etal.)、バイオケミカル・ジャ―ナル(Bio
chem.J.)135(1973)901-903 〕。
製造方法に関するものである。凝固因子XIIIは脊椎動物
における天然の血液凝固過程における「凝固カスケ―
ド」の最終構成員である。「活性化フィブリン‐安定化
因子」、「フィブリノリガ―ゼ」或いは「血漿トランス
グルタミナ―ゼ」とも称され、及び以後「FXIIIa 」と
も称される因子XIIIの酵素的に活性な形態、因子XIIIa
は、分子内架橋による先在する血栓におけるフィブリン
単位の融合を触媒する〔ロ―ランド等(Lorand et el.)
メソッズ・イン・エンザィモロジ―(Methods inEnzymo
logy 80(1981), 333-341;カ―ティス等(Curtis et a
l.)Annals NewYork Academy of Sciences 1983,567-576
〕。血漿からの第XIII因子の分子量は約300kDで
ある〔ロ―ウィ等(Loewy et al.)、ジャ―ナル・オブ
・バイオロジカル・ケミストリ―(J.Biol.Chem.)236
(1961)2634 〕。活性サブユニットFXIIIa の分子量は
約80kDである〔ボ―ン及びシュウィック(Bohn and
Schwick )、Arzneimit-telforschung 21(1971)1432
2〕。因子XIIIの活性化に際し、トロンビンは、前駆体
から、約4kDの大きさであって、36個のアミノ酸の
公知の配列を有するペプチドを***する(タカギ及びド
ゥ―リトル(Takagiand DooLittle )、バイオケミスト
リ―(Biochemistry)13(1974)750-756〕。更に、4個の
アミノ酸を有する配列が公知である〔ホルブルック等
(Holbrook etal.)、バイオケミカル・ジャ―ナル(Bio
chem.J.)135(1973)901-903 〕。
【0002】本発明は、遺伝子操作によるFXIIIa の製
造方法に関するものである。本発明に関連するものとし
て、後述するようなこれに必要なmRNA、それから得
られるcDNA、このcDNAの全部或いは一部を含有
するDNA構造及びベクタ―、このタイプのDNAで形
質転換された細胞及びこれらの細胞により発現されたポ
リペプチドがある。又、FXIIIa のアミノ酸配列の部分
配列、それにより得られた特異的抗体、これらの抗体か
ら製造された診断補助品、及び抗体カラム及びその様な
カラムを用いて得られたポリペプチドも本発明に関連す
る。本発明は、FXIIIa をコ―ドするDNA或いはRN
Aの全部或いは一部を含有する診断補助品、及びこのタ
イプの診断補助品を用いて体液及び組織を検査する診断
に利用することもできる。更に、本発明の他の側面及び
その好ましい実施態様は以下に詳細に説明され、及び特
許請求の範囲に規定される。すなわち、本発明によるF
XIIIa の製造法は、FXIIIa をコ−ドするDNAを含有
するベクタ−によって細胞を形質転換し、該形質転換細
胞を発現させることを特徴とするものである。この製造
法の好ましい態様は、上記製造法において、下記で表わ
される因子XIIIa のアミノ酸配列をコードするDNAを
含有するベクターによって細胞を形質転換することを特
徴とするものであり、
造方法に関するものである。本発明に関連するものとし
て、後述するようなこれに必要なmRNA、それから得
られるcDNA、このcDNAの全部或いは一部を含有
するDNA構造及びベクタ―、このタイプのDNAで形
質転換された細胞及びこれらの細胞により発現されたポ
リペプチドがある。又、FXIIIa のアミノ酸配列の部分
配列、それにより得られた特異的抗体、これらの抗体か
ら製造された診断補助品、及び抗体カラム及びその様な
カラムを用いて得られたポリペプチドも本発明に関連す
る。本発明は、FXIIIa をコ―ドするDNA或いはRN
Aの全部或いは一部を含有する診断補助品、及びこのタ
イプの診断補助品を用いて体液及び組織を検査する診断
に利用することもできる。更に、本発明の他の側面及び
その好ましい実施態様は以下に詳細に説明され、及び特
許請求の範囲に規定される。すなわち、本発明によるF
XIIIa の製造法は、FXIIIa をコ−ドするDNAを含有
するベクタ−によって細胞を形質転換し、該形質転換細
胞を発現させることを特徴とするものである。この製造
法の好ましい態様は、上記製造法において、下記で表わ
される因子XIIIa のアミノ酸配列をコードするDNAを
含有するベクターによって細胞を形質転換することを特
徴とするものであり、
【化9】
【化10】
【化11】
【化12】 更に好ましい態様は上記DNAが下記の配列を有するこ
とを特徴とするものである。
とを特徴とするものである。
【化13】
【化14】
【化15】
【化16】
【0003】FXIIIa 断片のアミノ酸配列は、適当なプ
ロ―ブの構築のために決定されたものである。対応する
ペプチド断片は、臭化シアンを用いた蛋白質分解或いは
切断により得られた。その様な断片のアミノ酸配列につ
いての知識に基づき、一つの20mer及び一つの66
merの二つのオリゴヌクレオチドプロ―ブを合成し
た。20merプロ―ブにおいては、次のアミノ酸配列
に対する全ての理論的に可能なコドンを考慮に入れ、 Met‐Met‐Asp‐Ile‐Thr‐Asp‐T
hr 最後のアミノ酸の場合にはコドンの第3番目の位置を省
略した。従って、この20merプロ―ブは48倍の縮
重体、即ち該アミノ酸配列をコ―ドする48個の理論的
に可能なオリゴヌクレオチド全部の混合物である(後記
第1表参照)。66merのプロ―ブは、次のアミノ酸
配列に基づき、統計学的デ―タの助けを借りて選んだ
〔レイズ(Lathe)、ジャ―ナル・オブ・モレキュラ―・
バイオロジ―(J.Molec.Biol.)183(1985) 1-12〕(後記
第2表参照) Tyr‐Gly‐Gln‐Phe‐Glu‐Asp‐G
ly‐lLe‐Leu‐Asp‐Thr‐Cys‐Le
u‐Tyr‐Val‐Met‐Asp‐Arg‐Ala
‐Gln‐Met‐Asp これらのプロ―ブを用いてcDNAバンクのスクリ―ニ
ングを行なった。cDNAは、成熟ヒト胎盤からのmR
NAから調製した。なお、このmRNAを胎盤から単離
し、cDNAをそれから調製した。cDNAにEcoR
I末端を付与し、ファ―ジベクタ―λgt10のEco
RI切断部位に連結した。上記プロ―ブにより同定され
た陽性クロ―ンλgt10−12を更に分析した(図
1)。それ自体公知の方法による配列決定の結果、FXI
IIa をコ―ドするDNA配列が得られた。このDNA配
列を用いたcDNAバンクの再スクリ―ニングの結果、
5′‐末端の方向及び3′‐末端の両方向に拡張するク
ロ―ンを更に単離した。
ロ―ブの構築のために決定されたものである。対応する
ペプチド断片は、臭化シアンを用いた蛋白質分解或いは
切断により得られた。その様な断片のアミノ酸配列につ
いての知識に基づき、一つの20mer及び一つの66
merの二つのオリゴヌクレオチドプロ―ブを合成し
た。20merプロ―ブにおいては、次のアミノ酸配列
に対する全ての理論的に可能なコドンを考慮に入れ、 Met‐Met‐Asp‐Ile‐Thr‐Asp‐T
hr 最後のアミノ酸の場合にはコドンの第3番目の位置を省
略した。従って、この20merプロ―ブは48倍の縮
重体、即ち該アミノ酸配列をコ―ドする48個の理論的
に可能なオリゴヌクレオチド全部の混合物である(後記
第1表参照)。66merのプロ―ブは、次のアミノ酸
配列に基づき、統計学的デ―タの助けを借りて選んだ
〔レイズ(Lathe)、ジャ―ナル・オブ・モレキュラ―・
バイオロジ―(J.Molec.Biol.)183(1985) 1-12〕(後記
第2表参照) Tyr‐Gly‐Gln‐Phe‐Glu‐Asp‐G
ly‐lLe‐Leu‐Asp‐Thr‐Cys‐Le
u‐Tyr‐Val‐Met‐Asp‐Arg‐Ala
‐Gln‐Met‐Asp これらのプロ―ブを用いてcDNAバンクのスクリ―ニ
ングを行なった。cDNAは、成熟ヒト胎盤からのmR
NAから調製した。なお、このmRNAを胎盤から単離
し、cDNAをそれから調製した。cDNAにEcoR
I末端を付与し、ファ―ジベクタ―λgt10のEco
RI切断部位に連結した。上記プロ―ブにより同定され
た陽性クロ―ンλgt10−12を更に分析した(図
1)。それ自体公知の方法による配列決定の結果、FXI
IIa をコ―ドするDNA配列が得られた。このDNA配
列を用いたcDNAバンクの再スクリ―ニングの結果、
5′‐末端の方向及び3′‐末端の両方向に拡張するク
ロ―ンを更に単離した。
【0004】図1はFXIIIa をコ―ドするDNA配列の
制限地図を示す。“N”はコ―ド化領域のN‐末端を示
し及び“C”はC‐末端を示し、及び“A(89)”は
89塩基のポリ(A)配列を示す。この配列はFXIIIa
のコ―ド化配列の全部を表わす。後記第3表は、判明し
たDNA配列(コ―ド鎖)及びそれから演繹されたλg
t10−11及びλgt10−12からのクロ―ン化c
DNA断片からのアミノ酸配列を示す。cDNAの全長
さは、3905塩基対である。タカギ及びドゥ―リトル
(上掲)により見出された36個のアミノ酸を有するN
‐末端配列はこの判明した配列内に存在する。この配列
は第3表においてヌクレオチド位置88及び198の間
に連続線により示されている。タカギ及びドゥ―リトル
により見出された配列に加えて、このcDNAは187
−189のヌクレオチド位置においてバリンをコ―ドす
る。この4個のアミノ酸を有するホルブルック等(上
掲)により見出されたアミノ酸‐Gly‐Gln‐Cy
s‐Trp‐は位置1021−1032におけるcDN
Aによりコ―ドされている。この配列は同様に連続線に
より示されている。加えて、20mer及び66mer
オリゴヌクレオチドプロ―ブの位置は破線により示され
ている。20merプロ―ブは1507及び1526の
位置の間にハイブリダイズし、66merプロ―ブは7
66及び831の位置の間にハイブリダイズする。本発
明に従えば、変更された生物学的特性を有する蛋白質を
コ―ドする変成された遺伝子の製造にこのコ―ド化cD
NAを用いることが可能である。この目的のために、そ
れ自体公知の方法で削除、挿入及び塩基交換を行なうこ
とが可能である。宿主の選択によりFXIIIa への変成の
性質に影響を及ぼすことも可能である。即ち、細菌にお
いてはグリコシル化がないのに対し、酵母細胞において
生ずるそれは高等真核生物におけるそれと異なる。
制限地図を示す。“N”はコ―ド化領域のN‐末端を示
し及び“C”はC‐末端を示し、及び“A(89)”は
89塩基のポリ(A)配列を示す。この配列はFXIIIa
のコ―ド化配列の全部を表わす。後記第3表は、判明し
たDNA配列(コ―ド鎖)及びそれから演繹されたλg
t10−11及びλgt10−12からのクロ―ン化c
DNA断片からのアミノ酸配列を示す。cDNAの全長
さは、3905塩基対である。タカギ及びドゥ―リトル
(上掲)により見出された36個のアミノ酸を有するN
‐末端配列はこの判明した配列内に存在する。この配列
は第3表においてヌクレオチド位置88及び198の間
に連続線により示されている。タカギ及びドゥ―リトル
により見出された配列に加えて、このcDNAは187
−189のヌクレオチド位置においてバリンをコ―ドす
る。この4個のアミノ酸を有するホルブルック等(上
掲)により見出されたアミノ酸‐Gly‐Gln‐Cy
s‐Trp‐は位置1021−1032におけるcDN
Aによりコ―ドされている。この配列は同様に連続線に
より示されている。加えて、20mer及び66mer
オリゴヌクレオチドプロ―ブの位置は破線により示され
ている。20merプロ―ブは1507及び1526の
位置の間にハイブリダイズし、66merプロ―ブは7
66及び831の位置の間にハイブリダイズする。本発
明に従えば、変更された生物学的特性を有する蛋白質を
コ―ドする変成された遺伝子の製造にこのコ―ド化cD
NAを用いることが可能である。この目的のために、そ
れ自体公知の方法で削除、挿入及び塩基交換を行なうこ
とが可能である。宿主の選択によりFXIIIa への変成の
性質に影響を及ぼすことも可能である。即ち、細菌にお
いてはグリコシル化がないのに対し、酵母細胞において
生ずるそれは高等真核生物におけるそれと異なる。
【0005】FXIIIa のアミノ酸配列を知れば、ポリク
ロ―ナル或いはモノクロ―ナル抗体の製造に抗原として
作用することのできるアミノ酸の部分配列を通常の方法
或いは遺伝子操作により製造することが可能である。そ
の様な抗体は診断目的のみならず、それを用いてこの因
子を他の蛋白質に加えて含有する溶液からFXIIIa を除
去することが可能である抗体カラムの製造にも使用する
ことができる。このcDNA或いはその部分を用いて、
直截的にゲノムバンクからFXIIIa をコ―ドするゲノム
クロ―ンを単離することも可能であり、またそれを用い
てそれを真核生物細胞内に発現することが可能であるの
みならず、更に診断情報を得ことも可能である。FXIII
a 欠陥は、前駆体の酵素の活性形態に転換することがで
きないことに大きく帰せられる各種症候群を生じ得る。
FXIIIa のcDNAについての知識によれば、今やそれ
を用いて遺伝的変成が存在するか否かを直截的に確立す
ることが可能である診断補助品の製造することが可能で
ある。即ち、本発明に従えば例えば、ウィルスその他の
蛋白質による汚染の如何なる危険性もなしに高純度の因
子XIIIa を製造することが可能である。今日まで存在し
ていた原料源としてヒト血漿或いは胎盤への依存はかく
して克服された。加えて、本発明によれば、貴重な診断
補助品及び従って遺伝的FXIIIa 欠陥の分析ができるよ
うになる。
ロ―ナル或いはモノクロ―ナル抗体の製造に抗原として
作用することのできるアミノ酸の部分配列を通常の方法
或いは遺伝子操作により製造することが可能である。そ
の様な抗体は診断目的のみならず、それを用いてこの因
子を他の蛋白質に加えて含有する溶液からFXIIIa を除
去することが可能である抗体カラムの製造にも使用する
ことができる。このcDNA或いはその部分を用いて、
直截的にゲノムバンクからFXIIIa をコ―ドするゲノム
クロ―ンを単離することも可能であり、またそれを用い
てそれを真核生物細胞内に発現することが可能であるの
みならず、更に診断情報を得ことも可能である。FXIII
a 欠陥は、前駆体の酵素の活性形態に転換することがで
きないことに大きく帰せられる各種症候群を生じ得る。
FXIIIa のcDNAについての知識によれば、今やそれ
を用いて遺伝的変成が存在するか否かを直截的に確立す
ることが可能である診断補助品の製造することが可能で
ある。即ち、本発明に従えば例えば、ウィルスその他の
蛋白質による汚染の如何なる危険性もなしに高純度の因
子XIIIa を製造することが可能である。今日まで存在し
ていた原料源としてヒト血漿或いは胎盤への依存はかく
して克服された。加えて、本発明によれば、貴重な診断
補助品及び従って遺伝的FXIIIa 欠陥の分析ができるよ
うになる。
【0006】以下、本発明を具体的により詳細に説明す
る。特に断りのない限り、パ―セントは量に関連しない
場合には重量に関する。本文で説明するものの他、次の
省略を用いた: EDTA=エチレンジアミン四酢酸ナトリウム SDS =ドデシル硫酸ナトリウム DTT =ジチオスレイト―ル BSA =ウシ血清アルブミン。
る。特に断りのない限り、パ―セントは量に関連しない
場合には重量に関する。本文で説明するものの他、次の
省略を用いた: EDTA=エチレンジアミン四酢酸ナトリウム SDS =ドデシル硫酸ナトリウム DTT =ジチオスレイト―ル BSA =ウシ血清アルブミン。
【0007】
例: 1.ヒト胎盤からのRNAの単離 RNAは成熟ヒト胎盤から得られた〔チルギン等(Chir
gwin et al.)、バイオケミストリ―(Biochemistry)18
(1979)5294-5299の方法による〕約10gの胎盤組織を
液体窒素中で粉砕し、0.1Mのメルカプトエタノ―ル
を含有する80mlの4Mグアニジニウムチオシアネ―ト
中に懸濁させ、ホモジナイザ―(Ultraturrax)中で2
0,000rpm にて90秒間処理した。溶解物を700
0rpm で15分間遠心分離し(Sorvall GSA ロ―タ
―)、2mlの1M酢酸及び60mlの無水エタノ―ルを上
澄液に添加し、これを−20℃で一晩沈澱させた。60
00rpm 及び−10℃において10分間沈降後、核酸を
40mlの7.5Mグアニジニウム塩酸塩(pH7.0)
中に完全に溶解し、1mlの1M酢酸及び20mlの無水エ
タノ―ルの混合物で沈澱した。DNAを除去するため
に、この沈澱を半分の容量でもう一度繰返した。RNA
を12mlのH2Oに溶解し、1.2mlの4M酢酸カリウ
ム及び24mlの無水エタノ―ルの混合物で沈澱させ、沈
降させ、及び最終的に10mlの水に再溶解した(g組織
当り1ml)。
gwin et al.)、バイオケミストリ―(Biochemistry)18
(1979)5294-5299の方法による〕約10gの胎盤組織を
液体窒素中で粉砕し、0.1Mのメルカプトエタノ―ル
を含有する80mlの4Mグアニジニウムチオシアネ―ト
中に懸濁させ、ホモジナイザ―(Ultraturrax)中で2
0,000rpm にて90秒間処理した。溶解物を700
0rpm で15分間遠心分離し(Sorvall GSA ロ―タ
―)、2mlの1M酢酸及び60mlの無水エタノ―ルを上
澄液に添加し、これを−20℃で一晩沈澱させた。60
00rpm 及び−10℃において10分間沈降後、核酸を
40mlの7.5Mグアニジニウム塩酸塩(pH7.0)
中に完全に溶解し、1mlの1M酢酸及び20mlの無水エ
タノ―ルの混合物で沈澱した。DNAを除去するため
に、この沈澱を半分の容量でもう一度繰返した。RNA
を12mlのH2Oに溶解し、1.2mlの4M酢酸カリウ
ム及び24mlの無水エタノ―ルの混合物で沈澱させ、沈
降させ、及び最終的に10mlの水に再溶解した(g組織
当り1ml)。
【0008】ポリ(A)を含有する胎盤mRNAの単離 ポリ(A)を含有するmRNAを単離するために、胎盤
RNAをLiCl中の2mlパスツゥ―ルピペット内でオ
リゴ(dT)‐セルロ―スクロマトグラフィにより分別
した〔アビブ及びレ―ダ―(Aviv and Leder)、Proc.N
atl.Acad.Sci.USA 69(1973)1408-1412 〕。約5mgの胎
盤RNAを緩衝液1〔500mMLiCl、20mM
tris(pH7.5)、1mM EDTA、0.1%
SDS〕中においてカラムにかけた。ポリ(A)+ RN
Aはオリゴ(dT)‐セルロ―スに結合したのに対し、
ポリ(A)- RNAは再び溶出することができた。緩衝
液2〔100mM LiCl、29mM tris(p
H7.5)、1mM EDTA、0.1%SDS〕で洗
浄後、ポリ(A)+ RNA(胎盤mRNA)をカラムか
ら緩衝液3〔5mM tris(pH7.5)、1mM
EDTA、0.05%SDS〕で溶出した。更に精製
するために、ポリ(A)+ RNAを緩衝液1に対して調
整し、オリゴ(dT)‐セルロ―ス上で再クロマトグラ
フィを行なった。この第2回目の精製工程の後、胎盤ポ
リ(A)+ RNAの収率は使用RNAの約4%であっ
た。
RNAをLiCl中の2mlパスツゥ―ルピペット内でオ
リゴ(dT)‐セルロ―スクロマトグラフィにより分別
した〔アビブ及びレ―ダ―(Aviv and Leder)、Proc.N
atl.Acad.Sci.USA 69(1973)1408-1412 〕。約5mgの胎
盤RNAを緩衝液1〔500mMLiCl、20mM
tris(pH7.5)、1mM EDTA、0.1%
SDS〕中においてカラムにかけた。ポリ(A)+ RN
Aはオリゴ(dT)‐セルロ―スに結合したのに対し、
ポリ(A)- RNAは再び溶出することができた。緩衝
液2〔100mM LiCl、29mM tris(p
H7.5)、1mM EDTA、0.1%SDS〕で洗
浄後、ポリ(A)+ RNA(胎盤mRNA)をカラムか
ら緩衝液3〔5mM tris(pH7.5)、1mM
EDTA、0.05%SDS〕で溶出した。更に精製
するために、ポリ(A)+ RNAを緩衝液1に対して調
整し、オリゴ(dT)‐セルロ―ス上で再クロマトグラ
フィを行なった。この第2回目の精製工程の後、胎盤ポ
リ(A)+ RNAの収率は使用RNAの約4%であっ
た。
【0009】ヒト胎盤からのcDNA(胎盤cDNA)
及び二本鎖cDNA(dsDNA)の合成 cDNA合成前に、ポリ(A)を含有する胎盤mRNA
が完全であることのチェックを1.5%アガロ―スゲル
内で行なった。次いで4μgの胎盤mRNAを65.5
μlのH2O中に溶解し、70℃で10分間変成し、再
び氷中で冷却した。20μlのRT1緩衝液〔42℃に
おける250mM Tris(pH8.2)、250m
M KCl、30mMMgCl2)、2.5μlの20
mM dNTP(即ち全ての四つのデオキシヌクレオチ
ドトリホスフェ―ト)、1μlの1μg/mlオリゴ(d
T)、1μlの1M DTT、2μlのRNAsin及
び8μlの逆転写酵素(24U/μl)を添加後、cD
NAを100μl混合物中において42℃で90分間合
成した。二本鎖cDNA(dsDNA)は、ガブラ―及
びホフマン(Gubler andHoffmann) の方法〔ジ―ン(Ge
ne)25(1983)263-269〕により合成した。この合成は、c
DNA合成の直後に305.5μlのH2O、80μl
のRT2緩衝液〔100mMtris(pH7.5)、
25mM MgCl2、500mMKCl、50mM
DTT、250μg/mlBSA〕、2μlのRNase
H(2U/μl)、2.5μlのE.coliDNAリ
ガ―ゼ(5U/μl)、5μlの15mM β‐NA
D、及び5μlのDNAポリメラ―ゼI(5U/μl)
を添加し、15℃において5時間インキュベ―ションす
ることにより行なった。この反応を熱不活性化(70
℃、30分)により停止させた。55μlの250μM
dNTP、55μlの10mM tris(pH7.
5)、10mM MgCl2、10μg/mlBSA、3
μlのT4DNAポリメラ―ゼI(1U/μl)、2μ
l RNaseH(2U/μl)及び2μlのRNas
eA(2μg/ml)を添加後、反応液を第2番目のDN
A鎖上におけるポリメラ―ゼIの誤った合成を修正する
ために37℃において更に30分間インキュベ―トした
(「修復反応」)。
及び二本鎖cDNA(dsDNA)の合成 cDNA合成前に、ポリ(A)を含有する胎盤mRNA
が完全であることのチェックを1.5%アガロ―スゲル
内で行なった。次いで4μgの胎盤mRNAを65.5
μlのH2O中に溶解し、70℃で10分間変成し、再
び氷中で冷却した。20μlのRT1緩衝液〔42℃に
おける250mM Tris(pH8.2)、250m
M KCl、30mMMgCl2)、2.5μlの20
mM dNTP(即ち全ての四つのデオキシヌクレオチ
ドトリホスフェ―ト)、1μlの1μg/mlオリゴ(d
T)、1μlの1M DTT、2μlのRNAsin及
び8μlの逆転写酵素(24U/μl)を添加後、cD
NAを100μl混合物中において42℃で90分間合
成した。二本鎖cDNA(dsDNA)は、ガブラ―及
びホフマン(Gubler andHoffmann) の方法〔ジ―ン(Ge
ne)25(1983)263-269〕により合成した。この合成は、c
DNA合成の直後に305.5μlのH2O、80μl
のRT2緩衝液〔100mMtris(pH7.5)、
25mM MgCl2、500mMKCl、50mM
DTT、250μg/mlBSA〕、2μlのRNase
H(2U/μl)、2.5μlのE.coliDNAリ
ガ―ゼ(5U/μl)、5μlの15mM β‐NA
D、及び5μlのDNAポリメラ―ゼI(5U/μl)
を添加し、15℃において5時間インキュベ―ションす
ることにより行なった。この反応を熱不活性化(70
℃、30分)により停止させた。55μlの250μM
dNTP、55μlの10mM tris(pH7.
5)、10mM MgCl2、10μg/mlBSA、3
μlのT4DNAポリメラ―ゼI(1U/μl)、2μ
l RNaseH(2U/μl)及び2μlのRNas
eA(2μg/ml)を添加後、反応液を第2番目のDN
A鎖上におけるポリメラ―ゼIの誤った合成を修正する
ために37℃において更に30分間インキュベ―トした
(「修復反応」)。
【0010】dsDNAへのEcoRIリンカ―の連結
及びリンカ―の開裂 胎盤cDNAバンクを組立てるために、このdsDNA
にファ―ジベクタ―λgt10のEcoRI切断部位に
おいてそれを連結できるようにEcoRI末端を付与し
た〔T.マニアティス等(T.Maniatis et al.).(198
2)、モレキュラ―・クロ―ニング(Molecular Clonin
g)、実験室マニュアル、Cold SpringHarbor〕。この目
的のために、dsDNAを a) dsDNAの内部EcoRI切断部位を保護するた
めにEcoRIメチラ―ゼで処理し、 b) EcoRIリンカ―を付与し、それらを c) 次いでEcoRIで開環させた。a)について: dsDNAのメチラ―ゼ反応は、修復反
応の直後に25μlの500mMEDTA(pH8.
0)60μlのメチラ―ゼ緩衝液〔100 mMNaO
Ac(pH5.2)、2mgのS‐アデノシル‐L‐メチ
オニン〕及び2μlのEcoRIメチラ―ゼ(20U/
μl)を添加し、37℃で30分間インキュベ―トさせ
て行なった。反応液をフェノ―ルで抽出し、dsDNA
を60μlの4M NaOAc及び1300μlのエタ
ノ―ルで沈澱させた。dsDNAを2回70%エタノ―
ルで洗浄し、エ―テルと振盪させて1回抽出し、乾燥さ
せた。b)について: このEcoRI‐メチル化dsDNAを
88μlのH2Oに溶解し、10μlのリガ―ゼ緩衝液
〔500mM tris(pH7.4)、100mM
MgCl2、100mM DTT、10mMスペルミジ
ン、10mM ATP、1mg/mlBSA〕及び1μlの
T4DNAリガ―ゼ(10U/μl)を添加後、1μl
のEcoRIリンカ―(0.5μg/μl)(pGGA
ATTCC及びpAGAATTCT)と15℃において
一晩かけて連結させた。c)について: このリガ―ゼ混合物の容量を6μlのH
2O、12μlの10xEcoRI緩衝液及び2μlの
EcoRI(120U/μl)で120μlに調合し
た。EcoRI消化は、37℃で2時間行なった。
及びリンカ―の開裂 胎盤cDNAバンクを組立てるために、このdsDNA
にファ―ジベクタ―λgt10のEcoRI切断部位に
おいてそれを連結できるようにEcoRI末端を付与し
た〔T.マニアティス等(T.Maniatis et al.).(198
2)、モレキュラ―・クロ―ニング(Molecular Clonin
g)、実験室マニュアル、Cold SpringHarbor〕。この目
的のために、dsDNAを a) dsDNAの内部EcoRI切断部位を保護するた
めにEcoRIメチラ―ゼで処理し、 b) EcoRIリンカ―を付与し、それらを c) 次いでEcoRIで開環させた。a)について: dsDNAのメチラ―ゼ反応は、修復反
応の直後に25μlの500mMEDTA(pH8.
0)60μlのメチラ―ゼ緩衝液〔100 mMNaO
Ac(pH5.2)、2mgのS‐アデノシル‐L‐メチ
オニン〕及び2μlのEcoRIメチラ―ゼ(20U/
μl)を添加し、37℃で30分間インキュベ―トさせ
て行なった。反応液をフェノ―ルで抽出し、dsDNA
を60μlの4M NaOAc及び1300μlのエタ
ノ―ルで沈澱させた。dsDNAを2回70%エタノ―
ルで洗浄し、エ―テルと振盪させて1回抽出し、乾燥さ
せた。b)について: このEcoRI‐メチル化dsDNAを
88μlのH2Oに溶解し、10μlのリガ―ゼ緩衝液
〔500mM tris(pH7.4)、100mM
MgCl2、100mM DTT、10mMスペルミジ
ン、10mM ATP、1mg/mlBSA〕及び1μlの
T4DNAリガ―ゼ(10U/μl)を添加後、1μl
のEcoRIリンカ―(0.5μg/μl)(pGGA
ATTCC及びpAGAATTCT)と15℃において
一晩かけて連結させた。c)について: このリガ―ゼ混合物の容量を6μlのH
2O、12μlの10xEcoRI緩衝液及び2μlの
EcoRI(120U/μl)で120μlに調合し
た。EcoRI消化は、37℃で2時間行なった。
【0011】酢酸カリウム勾配及びdsDNAの大きさ
選択による未結合リンカ―の除去 dsDNAから全ての未結合EcoRIリンカ―を除去
するために、EcoRI反応混合物を全部酢酸カリウム
勾配(5‐20%KOAc、1mM EDTA、1μl
/mlエチジウムブロマイド)にかけ、それを50,00
0rpm 及び20℃で3時間遠心分離した(Beckman SW 6
5/ロ―タ―)。この勾配を最初の五つの画分の容量が5
00μlで残りの全てが100μlとなるように下から
分別した。これらの画分を0.01容のアクリルアミド
(25mg/ml)及び2.5容のエタノ―ルで沈澱させ、
70%強度のエタノ―ルで1度洗浄し、乾燥し、及びそ
れぞれを5μlのH2O中にとった。dsDNAの大き
さを決定するために、1μlの各画分を1.5%アガロ
―スゲル内で分析した。更にdsDNAの量を1μlの
各画分について求めた。1000bpを越えるdsDN
Aを含有する画分を合体し、この試料を最終濃度が27
μg/mlになるまで濃縮した。
選択による未結合リンカ―の除去 dsDNAから全ての未結合EcoRIリンカ―を除去
するために、EcoRI反応混合物を全部酢酸カリウム
勾配(5‐20%KOAc、1mM EDTA、1μl
/mlエチジウムブロマイド)にかけ、それを50,00
0rpm 及び20℃で3時間遠心分離した(Beckman SW 6
5/ロ―タ―)。この勾配を最初の五つの画分の容量が5
00μlで残りの全てが100μlとなるように下から
分別した。これらの画分を0.01容のアクリルアミド
(25mg/ml)及び2.5容のエタノ―ルで沈澱させ、
70%強度のエタノ―ルで1度洗浄し、乾燥し、及びそ
れぞれを5μlのH2O中にとった。dsDNAの大き
さを決定するために、1μlの各画分を1.5%アガロ
―スゲル内で分析した。更にdsDNAの量を1μlの
各画分について求めた。1000bpを越えるdsDN
Aを含有する画分を合体し、この試料を最終濃度が27
μg/mlになるまで濃縮した。
【0012】dsDNAのファ―ジベクタ―λgt10
中への導入及びin vitroパッケ―ジング反応 dsDNAのファ―ジ―ベクタ―λgt10(Vecter C
loning Systems、カリフォルニア州、サンディェゴ)の
EcoRI切断部位中への導入は、4μlリガ―ゼ混合
物(2μlのdsDNA、1μlのλgt10×Eco
RI(1μg/ml)、0.4μlのリガ―ゼ緩衝液、
0.5μlのH2O及び0.1μlのT4DNAリガ―
ゼ)中において行なった。この混合物は、15℃で4時
間インキュベ―トした。ファ―ジベクタ―λgt10内
で胎盤cDNAバンクを確立するために、このリガ―ゼ
混合物を次いでλ‐溶原性細胞抽出物E.coli N
S428及びNS433とのin vitroパッケ―ジング反
応に室温において2時間付した 〔Vecter Cloning Systems、カリフォルニア州、サンデ
ィェゴ;エンキスト及びスタ―ンバ―グ(Enquist and
Sternberg)、Methods in Enzymology 68(1979)281-298
〕。この反応は、500μlの懸濁媒体〔SM:0.
1M NaCl、8mM MgSO4、50mM tr
is(pH7.5)、0.01%ゼラチン〕及び2滴の
クロロホルムで停止させた。
中への導入及びin vitroパッケ―ジング反応 dsDNAのファ―ジ―ベクタ―λgt10(Vecter C
loning Systems、カリフォルニア州、サンディェゴ)の
EcoRI切断部位中への導入は、4μlリガ―ゼ混合
物(2μlのdsDNA、1μlのλgt10×Eco
RI(1μg/ml)、0.4μlのリガ―ゼ緩衝液、
0.5μlのH2O及び0.1μlのT4DNAリガ―
ゼ)中において行なった。この混合物は、15℃で4時
間インキュベ―トした。ファ―ジベクタ―λgt10内
で胎盤cDNAバンクを確立するために、このリガ―ゼ
混合物を次いでλ‐溶原性細胞抽出物E.coli N
S428及びNS433とのin vitroパッケ―ジング反
応に室温において2時間付した 〔Vecter Cloning Systems、カリフォルニア州、サンデ
ィェゴ;エンキスト及びスタ―ンバ―グ(Enquist and
Sternberg)、Methods in Enzymology 68(1979)281-298
〕。この反応は、500μlの懸濁媒体〔SM:0.
1M NaCl、8mM MgSO4、50mM tr
is(pH7.5)、0.01%ゼラチン〕及び2滴の
クロロホルムで停止させた。
【0013】力価の決定及び胎盤cDNAバンクの分析 胎盤cDNAバンクのプラ―ク形成単位 (PFU)の数はE.coli K12株C600HF
Lのコンピテント細胞を用いて決定した:それは1×1
06PFUであった。約80%のファ―ジが1000塩
基対より大きいDNAインサ―トを含有した。
Lのコンピテント細胞を用いて決定した:それは1×1
06PFUであった。約80%のファ―ジが1000塩
基対より大きいDNAインサ―トを含有した。
【0014】胎盤cDNAバンクをスクリ―ニングする
ためのオリゴヌクレオチドプロ―ブ 二つのオリゴヌクレオチドプロ―ブ(20merプロ―
ブ及び66merプロ―ブ)を胎盤cDNAバンクを分
析するために合成した。それらの配列は、FXIIIa のい
くつかの蛋白質分解及びBrCN断片のアミノ酸初期配
列から演繹した。場合によっては重複する、従ってより
長いアミノ酸配列が見出されたが、これらによって極め
て長いプロ―ブ即ち66merプロ―ブの合成が可能と
なった。20merプロ―ブは、アミノ酸配列Met‐
Met‐Asp‐Ile‐Thr‐Asp‐Thrに対
する全ての理論的に可能なコドンが考慮された通常のD
NAプロ―ブである(末端アミノ酸Thrの場合には
「ゆらぎ」位置と称されるコドンの第3番目は省略され
た;第1表参照)。この20merプロ―ブは従って4
8倍縮重体、即ち該アミノ酸配列に対する全ての48個
の理論的に可能なコ―ド化オリゴヌクレオチドの混合物
である。66merプロ―ブの構成方法及び使用は、レ
イズ(Lathe)、J.Mol.Biol.183(1985)1-12の原則に本質
的に従った。66merプロ―ブを構成するために二つ
の39merプロ―ブを合成した(次の配列を有する3
9merA:5′TATGGCCAGTTTGAGGA
TGGCATCCTGGACACCTGTCTG3′及
び次の配列を有する39merB:5′GTCCATC
TGGGCCCGGTCCATCACATACAGAC
AGGTGTC 3′)。39merA及び39mer
Bは、二つの配列のハイブリダイゼ―ションの結果長い
遊離5′末端が生ずるように12個の塩基よりなる相補
的配列を有する。これらの二つの39merプロ―ブは
(20 merプロ―ブと同様に)5′末端において
(γ‐32P)‐ATP(約1μgのDNA、(γ‐
32P)‐ATP:3000Ci/mmol、10μCi/μ
l、6μl/40μlの反応混合液使用)の存在下にお
いてT4ポリヌクレオチドキナ―ゼで標識した。20m
erプロ―ブは1×108Bq/μg或いは1.5×1
06Bq/pmolの比活性を有した。二つの39merプ
ロ―ブは95℃で5分間加熱し、混合し、及び低温室内
で4℃に徐々に冷却してハイブリダイズさせた。次い
で、約1μgのハイブリダイズされた39 merプロ
―ブをDNAポリメラ―ゼI、クレノウ断片で(α‐32
P)‐dATP(3000Ci/mmol、10μCi/μ
l、4μl/50μl反応混合物)を添加して処理した
〔5′→3′埋填(filling-in)反応〕。この埋填され
た66merプロ―ブは1.5×108Bq/μgの比
活性を有した。これらのDNAプロ―ブは−20℃にお
いて貯蔵した。20merプロ―ブは直ちに分析(スク
リ―ニング)のために用いたのに対し、66merプロ
―ブは予め95℃において5分間加熱し、次いで氷浴内
で迅速に冷却した。66merプロ―ブは二つの39m
erのハイブリダイゼ―ションに引続き5′→3′埋填
反応により生成されたので、各種実験を行なうことが可
能である。一方において、cDNAバンクを変性された
66merDNAプロ―ブとハイブリダイズさせること
が可能であり、他方において、次いで陽性のクロ―ンを
39merA及びBプロ―ブと個々にハイブリダイズさ
せることが可能である。長いプロ―ブ及び二つの短い3
9merプロ―ブA及びBの両者とハイブリダイズする
クロ―ンが所望の配列をもつ確率は極めて高い。即ち、
以上説明した長い、複雑なオリゴヌクレオチドプロ―ブ
を構成し、部分的に相補的な短いDNAプロ―ブを用い
てクロ―ンを「再スクリ―ニングする」方法は特異性の
向上を表わす。加えて、長いオリゴヌクレオチド及びそ
の部分的に相補的な短い部分オリゴヌクレオチドを用い
て向上した特異性を有するゲノムバンクをスクリ―ニン
グすることが可能である。該方法のもう一つの利点は、
より短いオリゴヌクレオチドの合成をより簡単に且つよ
り高い収率及び精度を用いて行なうことができることで
ある。二つの酵素反応、即ち1)(γ‐32P)‐ATP標
識付けのためのT4ポリヌクレオチドキナ―ゼ、及び2)
(α‐32P)‐dNTPの添加によるDNAポリメラ―
ゼ埋填反応、の順序はより高い比活性(少なくとも1×
108Bq/μgDNA)を得ることが可能であること
を意味する。
ためのオリゴヌクレオチドプロ―ブ 二つのオリゴヌクレオチドプロ―ブ(20merプロ―
ブ及び66merプロ―ブ)を胎盤cDNAバンクを分
析するために合成した。それらの配列は、FXIIIa のい
くつかの蛋白質分解及びBrCN断片のアミノ酸初期配
列から演繹した。場合によっては重複する、従ってより
長いアミノ酸配列が見出されたが、これらによって極め
て長いプロ―ブ即ち66merプロ―ブの合成が可能と
なった。20merプロ―ブは、アミノ酸配列Met‐
Met‐Asp‐Ile‐Thr‐Asp‐Thrに対
する全ての理論的に可能なコドンが考慮された通常のD
NAプロ―ブである(末端アミノ酸Thrの場合には
「ゆらぎ」位置と称されるコドンの第3番目は省略され
た;第1表参照)。この20merプロ―ブは従って4
8倍縮重体、即ち該アミノ酸配列に対する全ての48個
の理論的に可能なコ―ド化オリゴヌクレオチドの混合物
である。66merプロ―ブの構成方法及び使用は、レ
イズ(Lathe)、J.Mol.Biol.183(1985)1-12の原則に本質
的に従った。66merプロ―ブを構成するために二つ
の39merプロ―ブを合成した(次の配列を有する3
9merA:5′TATGGCCAGTTTGAGGA
TGGCATCCTGGACACCTGTCTG3′及
び次の配列を有する39merB:5′GTCCATC
TGGGCCCGGTCCATCACATACAGAC
AGGTGTC 3′)。39merA及び39mer
Bは、二つの配列のハイブリダイゼ―ションの結果長い
遊離5′末端が生ずるように12個の塩基よりなる相補
的配列を有する。これらの二つの39merプロ―ブは
(20 merプロ―ブと同様に)5′末端において
(γ‐32P)‐ATP(約1μgのDNA、(γ‐
32P)‐ATP:3000Ci/mmol、10μCi/μ
l、6μl/40μlの反応混合液使用)の存在下にお
いてT4ポリヌクレオチドキナ―ゼで標識した。20m
erプロ―ブは1×108Bq/μg或いは1.5×1
06Bq/pmolの比活性を有した。二つの39merプ
ロ―ブは95℃で5分間加熱し、混合し、及び低温室内
で4℃に徐々に冷却してハイブリダイズさせた。次い
で、約1μgのハイブリダイズされた39 merプロ
―ブをDNAポリメラ―ゼI、クレノウ断片で(α‐32
P)‐dATP(3000Ci/mmol、10μCi/μ
l、4μl/50μl反応混合物)を添加して処理した
〔5′→3′埋填(filling-in)反応〕。この埋填され
た66merプロ―ブは1.5×108Bq/μgの比
活性を有した。これらのDNAプロ―ブは−20℃にお
いて貯蔵した。20merプロ―ブは直ちに分析(スク
リ―ニング)のために用いたのに対し、66merプロ
―ブは予め95℃において5分間加熱し、次いで氷浴内
で迅速に冷却した。66merプロ―ブは二つの39m
erのハイブリダイゼ―ションに引続き5′→3′埋填
反応により生成されたので、各種実験を行なうことが可
能である。一方において、cDNAバンクを変性された
66merDNAプロ―ブとハイブリダイズさせること
が可能であり、他方において、次いで陽性のクロ―ンを
39merA及びBプロ―ブと個々にハイブリダイズさ
せることが可能である。長いプロ―ブ及び二つの短い3
9merプロ―ブA及びBの両者とハイブリダイズする
クロ―ンが所望の配列をもつ確率は極めて高い。即ち、
以上説明した長い、複雑なオリゴヌクレオチドプロ―ブ
を構成し、部分的に相補的な短いDNAプロ―ブを用い
てクロ―ンを「再スクリ―ニングする」方法は特異性の
向上を表わす。加えて、長いオリゴヌクレオチド及びそ
の部分的に相補的な短い部分オリゴヌクレオチドを用い
て向上した特異性を有するゲノムバンクをスクリ―ニン
グすることが可能である。該方法のもう一つの利点は、
より短いオリゴヌクレオチドの合成をより簡単に且つよ
り高い収率及び精度を用いて行なうことができることで
ある。二つの酵素反応、即ち1)(γ‐32P)‐ATP標
識付けのためのT4ポリヌクレオチドキナ―ゼ、及び2)
(α‐32P)‐dNTPの添加によるDNAポリメラ―
ゼ埋填反応、の順序はより高い比活性(少なくとも1×
108Bq/μgDNA)を得ることが可能であること
を意味する。
【0015】FXIIIa ‐特異的オリゴヌクレオチドによ
る胎盤cDNAのスクリ―ニング 20merプロ―ブ及び66merプロ―ブを用いて、
5×105PFUの胎盤cDNAバンクをFXIIIa をコ
―ドするcDNA配列について調べた。これには、1
3.5cmのペトリ皿内の軟寒天中でE.coli K1
2株C600HFLの細胞で培養され、37℃で6時間
インキュベ―トされた3×104PFUを伴った。この
時までに生じた如何なる溶解も尚不完全であった。これ
らのプレ―トを冷蔵庫内で一晩インキュベ―トし、ファ
―ジをニトロセルロ―スフィルタ―に移した〔シュライ
ヒヤ―及びシュル(Schleicher & Schuell)、BA 85.Re
f.No.401124 〕(二重)。これらのニトロセルロ―スフ
ィルタ―及びペトリ皿を引続き割当てを行なうために注
射針で印をつけた。これらのペトリ皿はニトロセルロ―
スフィルタ―の処理の際に低温室に貯蔵した。ニトロセ
ルロ―スフィルタ―上のDNAはフィルタ―を1.5M
NaCl、0.5M NaOHを含浸させた濾紙(Wh
atman M 3)上に5分間置くことにより変性した。これら
のフィルタ―を次いで1.5M NaCl、0.5M
tris(pH8.0)を用いて同一方法で再変成し、
2×SSPE(0.36M NaCl、16mM Na
OH、20mM NaH2PO4、2mM EDTA)
で洗浄した。これらのフィルタ―を次いで80℃で2時
間真空乾燥した。これらのフィルタ―を3×SSC、
0.1%SDS(20×SSC=3MNaCl、0.3
M Naクエン酸塩)で65℃において4時間洗浄し、
65℃において4時間予備ハイブリダイズした(予備ハ
イブリダイゼ―ション溶液;0.6M NaCl、0.
06Mtris(pH8.3)、6mM EDTA、
0.2%非‐イオン性合成スクロ―ス重合体( RFic
oll)、0.2%ポリビニルピロリドン40、0.2
%BSA、0.1%SDS、50μg/ml変性にしん精
子DNA)。これらのフィルタ―をおだやかに振盪しな
がらビ―カ―或いは密封ポリエチレンフィルム内でハイ
ブリダイゼ―ション溶液(にしん***DNAのない予備
ハイブリダイゼ―ション溶液)のml当り100,000
〜200,000Bqの標識オリゴヌクレオチドを添加
して一晩インキュベ―トした。20mer及び39me
rプロ―ブに対するハイブリダイゼ―ション温度は42
℃であり、66merプロ―ブに対するそれは47℃で
あった。これらのニトロセルロ―スフィルタ―は6×S
SC、0.05Mピロリン酸ナトリウムで室温において
1時間及び特別のハイブリダイゼ―ション温度において
更に1時間洗浄した。これらのフィルタ―を乾燥し、一
晩オ―トラジオグラフィにかけた。二重のX線フィルム
の両者に生ずる信号をペトリ皿に割当て、その領域(約
50プラ―ク)をパスツ―ルピペットの広い末端で切抜
き、ファ―ジを1mlのSM緩衝液に再懸濁した。陽性フ
ァ―ジを単一クロ―ンが得られるまで3回に亘って選抜
した。合計5×105PFUの胎盤cDNAバンクを数
継代において調べた。二重フィルタ―上に17個の信号
が確認された。より緊縮な条件下で更にスクリ―ニング
を行なったところ尚陽性である7個の信号を得た。これ
らの7個のPFUのうち1個のPFUのみが20mer
及び66merプロ―ブによるハイブリダイゼ―ション
及び39merプロ―ブA及びBによるハイブリダイゼ
―ションの後共に陽性の信号を示した。この以後λgt
10−12と称される―クロ―ンはFXIIIa をコ―ド化
し、及び内部EcoRI切断部位を有する1704塩基
対の配列を有する。サザ―ンブロット分析は、540塩
基対のより小さいEcoRI断片は20merDNAプ
ロ―ブとハイブリダイズし、1164塩基対のより大き
い断片は66merDNAプロ―ブとハイブリダイズす
ることを示している。再スクリ―ニング時に、サザ―ン
ブロットから39merプロ―ブBよりも39merプ
ロ―ブAとより多くの反応があることが判明した。引続
きクロ―ンλgt10−12の配列分析によって、66
merプロ―ブの全長に亘ってFXIIIa に見出された配
列に対して僅かに7個の不適性塩基対があるに過ぎない
ことが判った(第2表(表1))。これらの7個の不適
性塩基対は次のように分布している。即ち39merA
プロ―ブに3個の及び39merBプロ―ブに5個の不
適性塩基対がある(一つの不適性塩基対は重複領域にあ
り、従って両者に共通である)。39merBにおける
5個の不適性塩基対は一団となっており、これがおそら
く39merBプロ―ブの場合におけるより弱いハイブ
リダイゼ―ション信号の理由であると思われる。
る胎盤cDNAのスクリ―ニング 20merプロ―ブ及び66merプロ―ブを用いて、
5×105PFUの胎盤cDNAバンクをFXIIIa をコ
―ドするcDNA配列について調べた。これには、1
3.5cmのペトリ皿内の軟寒天中でE.coli K1
2株C600HFLの細胞で培養され、37℃で6時間
インキュベ―トされた3×104PFUを伴った。この
時までに生じた如何なる溶解も尚不完全であった。これ
らのプレ―トを冷蔵庫内で一晩インキュベ―トし、ファ
―ジをニトロセルロ―スフィルタ―に移した〔シュライ
ヒヤ―及びシュル(Schleicher & Schuell)、BA 85.Re
f.No.401124 〕(二重)。これらのニトロセルロ―スフ
ィルタ―及びペトリ皿を引続き割当てを行なうために注
射針で印をつけた。これらのペトリ皿はニトロセルロ―
スフィルタ―の処理の際に低温室に貯蔵した。ニトロセ
ルロ―スフィルタ―上のDNAはフィルタ―を1.5M
NaCl、0.5M NaOHを含浸させた濾紙(Wh
atman M 3)上に5分間置くことにより変性した。これら
のフィルタ―を次いで1.5M NaCl、0.5M
tris(pH8.0)を用いて同一方法で再変成し、
2×SSPE(0.36M NaCl、16mM Na
OH、20mM NaH2PO4、2mM EDTA)
で洗浄した。これらのフィルタ―を次いで80℃で2時
間真空乾燥した。これらのフィルタ―を3×SSC、
0.1%SDS(20×SSC=3MNaCl、0.3
M Naクエン酸塩)で65℃において4時間洗浄し、
65℃において4時間予備ハイブリダイズした(予備ハ
イブリダイゼ―ション溶液;0.6M NaCl、0.
06Mtris(pH8.3)、6mM EDTA、
0.2%非‐イオン性合成スクロ―ス重合体( RFic
oll)、0.2%ポリビニルピロリドン40、0.2
%BSA、0.1%SDS、50μg/ml変性にしん精
子DNA)。これらのフィルタ―をおだやかに振盪しな
がらビ―カ―或いは密封ポリエチレンフィルム内でハイ
ブリダイゼ―ション溶液(にしん***DNAのない予備
ハイブリダイゼ―ション溶液)のml当り100,000
〜200,000Bqの標識オリゴヌクレオチドを添加
して一晩インキュベ―トした。20mer及び39me
rプロ―ブに対するハイブリダイゼ―ション温度は42
℃であり、66merプロ―ブに対するそれは47℃で
あった。これらのニトロセルロ―スフィルタ―は6×S
SC、0.05Mピロリン酸ナトリウムで室温において
1時間及び特別のハイブリダイゼ―ション温度において
更に1時間洗浄した。これらのフィルタ―を乾燥し、一
晩オ―トラジオグラフィにかけた。二重のX線フィルム
の両者に生ずる信号をペトリ皿に割当て、その領域(約
50プラ―ク)をパスツ―ルピペットの広い末端で切抜
き、ファ―ジを1mlのSM緩衝液に再懸濁した。陽性フ
ァ―ジを単一クロ―ンが得られるまで3回に亘って選抜
した。合計5×105PFUの胎盤cDNAバンクを数
継代において調べた。二重フィルタ―上に17個の信号
が確認された。より緊縮な条件下で更にスクリ―ニング
を行なったところ尚陽性である7個の信号を得た。これ
らの7個のPFUのうち1個のPFUのみが20mer
及び66merプロ―ブによるハイブリダイゼ―ション
及び39merプロ―ブA及びBによるハイブリダイゼ
―ションの後共に陽性の信号を示した。この以後λgt
10−12と称される―クロ―ンはFXIIIa をコ―ド化
し、及び内部EcoRI切断部位を有する1704塩基
対の配列を有する。サザ―ンブロット分析は、540塩
基対のより小さいEcoRI断片は20merDNAプ
ロ―ブとハイブリダイズし、1164塩基対のより大き
い断片は66merDNAプロ―ブとハイブリダイズす
ることを示している。再スクリ―ニング時に、サザ―ン
ブロットから39merプロ―ブBよりも39merプ
ロ―ブAとより多くの反応があることが判明した。引続
きクロ―ンλgt10−12の配列分析によって、66
merプロ―ブの全長に亘ってFXIIIa に見出された配
列に対して僅かに7個の不適性塩基対があるに過ぎない
ことが判った(第2表(表1))。これらの7個の不適
性塩基対は次のように分布している。即ち39merA
プロ―ブに3個の及び39merBプロ―ブに5個の不
適性塩基対がある(一つの不適性塩基対は重複領域にあ
り、従って両者に共通である)。39merBにおける
5個の不適性塩基対は一団となっており、これがおそら
く39merBプロ―ブの場合におけるより弱いハイブ
リダイゼ―ション信号の理由であると思われる。
【0016】ニック‐トランスレ―トされたEcoRI
断片による胎盤cDNAのスクリ―ニング 540塩基対及び1164塩基対長さの二つのサブクロ
―ン化EcoRI断片を市販のベクタ―pUC8(11
64bp=pUC8−12.1及び540bp=pUC
8−12.2)のEcoRI切断部位中にクロ―ン化
し、それから調製的にEcoRIにより単離し、及び
(α‐32P)‐dNTPの存在下にニック‐トランスレ
―トした。両断片の比活性は1×108Bq/μgDN
Aであった。これらの(32P)‐標識断片を数継代にお
いて用いて胎盤cDNAバンクの約1×106個の組換
えファ―ジを調べ(ハイブリダイゼ―ション温度65
℃)、かくして13個のハイブリダイズするファ―ジを
確認した。これらのファ―ジは単一均質ファ―ジ標本が
得られるまで3回に亘って選抜した。各ファ―ジの20
ml溶解物を調製し、DNAを抽出した。このDNAをE
coRIで消化し、1%アガロ―スゲル上で分別した。
このゲルをサザ―ンブロット技術に対し、ニトロセルロ
―スフィル―タを標識540bpEcoRI断片とハイ
ブリダイズさせた。11個のファ―ジがハイブリダイゼ
―ション信号を示した。このニトロセルロ―スフィルタ
―を沸騰させ、ニット‐トランスレ―トされた1164
bpEcoRI断片とハイブリダイズさせた。7個のフ
ァ―ジがハイブリダイゼ―ション信号を示した。ハイブ
リダイズする断片の大きさに基づいて、λgt10−1
2に対比してλgt10−20のように5′末端方向及
びλgt10−11のように3′末端の方向の両者に拡
張するクロ―ンを確認することが可能であった。これら
のクロ―ンを用いて完全なXIIIa cDNA配列を決定
することが可能であった。内部制限部位を用いることに
より或いは重複配列のハイブリダイゼ―ションにより、
存在した部分配列を組合わせることが可能であった。こ
の完全なcDNA配列は発現ベクタ―中に連結し、適当
な原核或いは真核系内において発現することができる。
断片による胎盤cDNAのスクリ―ニング 540塩基対及び1164塩基対長さの二つのサブクロ
―ン化EcoRI断片を市販のベクタ―pUC8(11
64bp=pUC8−12.1及び540bp=pUC
8−12.2)のEcoRI切断部位中にクロ―ン化
し、それから調製的にEcoRIにより単離し、及び
(α‐32P)‐dNTPの存在下にニック‐トランスレ
―トした。両断片の比活性は1×108Bq/μgDN
Aであった。これらの(32P)‐標識断片を数継代にお
いて用いて胎盤cDNAバンクの約1×106個の組換
えファ―ジを調べ(ハイブリダイゼ―ション温度65
℃)、かくして13個のハイブリダイズするファ―ジを
確認した。これらのファ―ジは単一均質ファ―ジ標本が
得られるまで3回に亘って選抜した。各ファ―ジの20
ml溶解物を調製し、DNAを抽出した。このDNAをE
coRIで消化し、1%アガロ―スゲル上で分別した。
このゲルをサザ―ンブロット技術に対し、ニトロセルロ
―スフィル―タを標識540bpEcoRI断片とハイ
ブリダイズさせた。11個のファ―ジがハイブリダイゼ
―ション信号を示した。このニトロセルロ―スフィルタ
―を沸騰させ、ニット‐トランスレ―トされた1164
bpEcoRI断片とハイブリダイズさせた。7個のフ
ァ―ジがハイブリダイゼ―ション信号を示した。ハイブ
リダイズする断片の大きさに基づいて、λgt10−1
2に対比してλgt10−20のように5′末端方向及
びλgt10−11のように3′末端の方向の両者に拡
張するクロ―ンを確認することが可能であった。これら
のクロ―ンを用いて完全なXIIIa cDNA配列を決定
することが可能であった。内部制限部位を用いることに
より或いは重複配列のハイブリダイゼ―ションにより、
存在した部分配列を組合わせることが可能であった。こ
の完全なcDNA配列は発現ベクタ―中に連結し、適当
な原核或いは真核系内において発現することができる。
【0017】DNA配列分析 ファ―ジクロ―ンλgt10−12を増殖し、DNAを
抽出した。二つのEcoRI断片を単離し、プラスミド
ベクタ―pUC8のEcoRI部位中にクロ―ン化し
た。pUC8−12.1は1164塩基対断片を有し、
pUC8−12.2は540塩基対断片を有する。17
04塩基対よりなる全断片を単離するために、λgt1
0−12をEcoRIで部分的に消化し、1704塩基
対バンドを単離し、pIC19H〔マ―シュ等(Marsh
et al.)Gene 32(1984)481-485 〕のEcoRI部位中に
クロ―ン化した。得られたプラスミドをpIC19H−
12と称する。クロ―ンpUC8−12.1、pUC8
−12.2及びpIC19H−12のSau 3A、A
luI及びTaqI小断片をpUCプラスミド及びM1
3ファ―ジにクロ―ン化した後関連領域をサンガ―(Sa
nger)のジデオキシ法及びマクサム及びギルバ―ト(Ma
xam and Gilbert)の化学的方法を用いて配列決定するこ
とにより、1704bp断片の配列を決定することが可
能であった(第3表(表2〜6))。この配列は1個の
みの開放読取枠を示し、因子XIIIa 分子の最初の542
個のアミノ酸をコ―ドする。クロ―ンλgt10−12
或いはpIC19H−12及びクロ―ンλgt10−1
1及びλgt10−20の制限分析は、適当な単一及び
複数消化及びスミス及びビルンスチ―ルの方法〔Smith,
H.O.and Birnstiel,M.L.、ヌクレイック・アシッズ・リ
サ―サ(Nucleic Acids Res.)3(1976)2387- 2398〕によ
る(32P)‐標識断片の部分消化の両者により行なった
(図1)。クロ―ンλgt10−11は2432bpの
大きさの内部EcoRI切断部位を有する断片を有す
る。この断片は3′末端における237bpによりλg
t10−12からのcDNA断片と重複し、コ―ド化配
列の残りの570bpプラス89塩基のポリ(A)配列
を含む非‐コ―ド化領域の1625bpよりなる。約7
00bpの大きさのcDNA断片を有するクロ―ンλg
t10−20は又5′末端にλgt10−12よりも6
個多い塩基を有する(GAG GAA…)。
抽出した。二つのEcoRI断片を単離し、プラスミド
ベクタ―pUC8のEcoRI部位中にクロ―ン化し
た。pUC8−12.1は1164塩基対断片を有し、
pUC8−12.2は540塩基対断片を有する。17
04塩基対よりなる全断片を単離するために、λgt1
0−12をEcoRIで部分的に消化し、1704塩基
対バンドを単離し、pIC19H〔マ―シュ等(Marsh
et al.)Gene 32(1984)481-485 〕のEcoRI部位中に
クロ―ン化した。得られたプラスミドをpIC19H−
12と称する。クロ―ンpUC8−12.1、pUC8
−12.2及びpIC19H−12のSau 3A、A
luI及びTaqI小断片をpUCプラスミド及びM1
3ファ―ジにクロ―ン化した後関連領域をサンガ―(Sa
nger)のジデオキシ法及びマクサム及びギルバ―ト(Ma
xam and Gilbert)の化学的方法を用いて配列決定するこ
とにより、1704bp断片の配列を決定することが可
能であった(第3表(表2〜6))。この配列は1個の
みの開放読取枠を示し、因子XIIIa 分子の最初の542
個のアミノ酸をコ―ドする。クロ―ンλgt10−12
或いはpIC19H−12及びクロ―ンλgt10−1
1及びλgt10−20の制限分析は、適当な単一及び
複数消化及びスミス及びビルンスチ―ルの方法〔Smith,
H.O.and Birnstiel,M.L.、ヌクレイック・アシッズ・リ
サ―サ(Nucleic Acids Res.)3(1976)2387- 2398〕によ
る(32P)‐標識断片の部分消化の両者により行なった
(図1)。クロ―ンλgt10−11は2432bpの
大きさの内部EcoRI切断部位を有する断片を有す
る。この断片は3′末端における237bpによりλg
t10−12からのcDNA断片と重複し、コ―ド化配
列の残りの570bpプラス89塩基のポリ(A)配列
を含む非‐コ―ド化領域の1625bpよりなる。約7
00bpの大きさのcDNA断片を有するクロ―ンλg
t10−20は又5′末端にλgt10−12よりも6
個多い塩基を有する(GAG GAA…)。
【0018】2.発現されることができ、FXIIIa をコ
―ド化する全cDNAを含有するクロ―ンの調製 出発クロ―ンλgt10−11及びλgt10−12を
用いてFXIIIacDNAの全コ―ド化領域を含有するプ
ラスミドを得た。部分EcoRIの消化の助けにより、
λgt10−12の1704塩基対よりなる挿入物をp
IC19H(マ―シュ等上掲)のEcoRI部位にクロ
―ン化した。得られたプラスミドpIC19H−12.
1を引続き使用した(第2図参照)。このクロ―ンλg
t10−11は2432塩基対の大きさの挿入物を有
し、内部EcoRI切断部位を有する。1224塩基対
の大きさであり、コ―ド化配列のC‐末端570塩基対
プラス3′非‐コ―ド化領域の654塩基対を有する左
側(「5‐末端」)EcoRI断片を同様にpIC19
HのEcoRI切断部位にクロ―ン化した。得られたプ
ラスミドpIC19H−11.1を引続き使用した(図
2)。これらのプラスミドpIC19H−12.1及び
pIC19H−11.1はベクタ―中の同一配向におい
てFXIIIa に対するコ―ド化領域を有し、237塩基対
よりなる重複領域を有する。この重複領域を用いて部分
クロ―ンpIC19H−12.1及びpIC19H−1
1.1から全コ―ド化領域を有するクロ―ンを構成し
た。これは上記二つのプラスミドからのin vitroでのハ
イブリダイゼ―ション(図2)による部分的一本鎖ヘテ
ロ二重鎖分子の調製及び反応混合物のE.coli中へ
の形質転換を伴うものであった。細菌の修復機構(酵素
DNAポリメラ―ゼIの3′→5′エキソヌクレア―ゼ
活性、5′→3′重合活性)を利用して、全コ―ド化領
域を有するプラスミドを得た。具体的には、これはプラ
スミドpIC19H−12.1(ClaI‐消化)及び
pIC19H−11.1(BamHI‐消化)の各々の
1μgのDNAを混合し、エタノ―ルで沈澱するもので
あった。DNAを真空乾燥し、20μlのH2O中にと
り、5μlの1NNaOHを添加後、室温において10
分間インキュベ―トした。次いで次のものを示される順
序に従って添加した:200μlのH2O、25μlの
1Mtris.HCl(pH8.0)及び50μlの
0.1N HCl。反応混合物を65℃で3時間イキン
ュベ―トし、エタノ―ルで沈澱させ、乾燥した。DNA
を20μlのH2O中に再懸濁し、公知の方法により
E.coli中に形質転換し、細胞をLB‐ampプレ
―ト上に乗せて一晩インキュベ―トした。合計96個の
アンピシリン‐耐性クロ―ンのうち、24個のクロ―ン
をアルカリ法〔バーンボイム及びドリ―(Birnb-oim an
d Doly)、ヌクレイック・アシッヅ・リサ―チ(Nucl.A
cid Res.)7(1979)1513-1523 〕により処理し、プラスミ
ドをHindIII 、EcoRI、BamHI及びPvu
IIによる制限酵素分解により特性決定した。6個のプラ
スミドが期待された制限パタ―ンを示した。これらのプ
ラスミドのうちの一つpFXIII−13(図2)を詳細に
特性決定した。これは配列決定された237個の塩基対
重複領域を有する。StuI(位置1225)‐Pvu
II(位置1870)を伴い、このDNA配列は正確であ
ることが確認された。プラスミドpFXIII−13は78
bpが5′非‐翻訳領域のものであり2196bpが全
コ―ド領域であり、及び419bpが3′非‐翻訳領域
のものであるFXIIIa cDNAの2693塩基対よりな
る。pFXIII−13は全ての引続く発現実験のための出
発プラスミドであった。
―ド化する全cDNAを含有するクロ―ンの調製 出発クロ―ンλgt10−11及びλgt10−12を
用いてFXIIIacDNAの全コ―ド化領域を含有するプ
ラスミドを得た。部分EcoRIの消化の助けにより、
λgt10−12の1704塩基対よりなる挿入物をp
IC19H(マ―シュ等上掲)のEcoRI部位にクロ
―ン化した。得られたプラスミドpIC19H−12.
1を引続き使用した(第2図参照)。このクロ―ンλg
t10−11は2432塩基対の大きさの挿入物を有
し、内部EcoRI切断部位を有する。1224塩基対
の大きさであり、コ―ド化配列のC‐末端570塩基対
プラス3′非‐コ―ド化領域の654塩基対を有する左
側(「5‐末端」)EcoRI断片を同様にpIC19
HのEcoRI切断部位にクロ―ン化した。得られたプ
ラスミドpIC19H−11.1を引続き使用した(図
2)。これらのプラスミドpIC19H−12.1及び
pIC19H−11.1はベクタ―中の同一配向におい
てFXIIIa に対するコ―ド化領域を有し、237塩基対
よりなる重複領域を有する。この重複領域を用いて部分
クロ―ンpIC19H−12.1及びpIC19H−1
1.1から全コ―ド化領域を有するクロ―ンを構成し
た。これは上記二つのプラスミドからのin vitroでのハ
イブリダイゼ―ション(図2)による部分的一本鎖ヘテ
ロ二重鎖分子の調製及び反応混合物のE.coli中へ
の形質転換を伴うものであった。細菌の修復機構(酵素
DNAポリメラ―ゼIの3′→5′エキソヌクレア―ゼ
活性、5′→3′重合活性)を利用して、全コ―ド化領
域を有するプラスミドを得た。具体的には、これはプラ
スミドpIC19H−12.1(ClaI‐消化)及び
pIC19H−11.1(BamHI‐消化)の各々の
1μgのDNAを混合し、エタノ―ルで沈澱するもので
あった。DNAを真空乾燥し、20μlのH2O中にと
り、5μlの1NNaOHを添加後、室温において10
分間インキュベ―トした。次いで次のものを示される順
序に従って添加した:200μlのH2O、25μlの
1Mtris.HCl(pH8.0)及び50μlの
0.1N HCl。反応混合物を65℃で3時間イキン
ュベ―トし、エタノ―ルで沈澱させ、乾燥した。DNA
を20μlのH2O中に再懸濁し、公知の方法により
E.coli中に形質転換し、細胞をLB‐ampプレ
―ト上に乗せて一晩インキュベ―トした。合計96個の
アンピシリン‐耐性クロ―ンのうち、24個のクロ―ン
をアルカリ法〔バーンボイム及びドリ―(Birnb-oim an
d Doly)、ヌクレイック・アシッヅ・リサ―チ(Nucl.A
cid Res.)7(1979)1513-1523 〕により処理し、プラスミ
ドをHindIII 、EcoRI、BamHI及びPvu
IIによる制限酵素分解により特性決定した。6個のプラ
スミドが期待された制限パタ―ンを示した。これらのプ
ラスミドのうちの一つpFXIII−13(図2)を詳細に
特性決定した。これは配列決定された237個の塩基対
重複領域を有する。StuI(位置1225)‐Pvu
II(位置1870)を伴い、このDNA配列は正確であ
ることが確認された。プラスミドpFXIII−13は78
bpが5′非‐翻訳領域のものであり2196bpが全
コ―ド領域であり、及び419bpが3′非‐翻訳領域
のものであるFXIIIa cDNAの2693塩基対よりな
る。pFXIII−13は全ての引続く発現実験のための出
発プラスミドであった。
【0019】3.生物学的に活性な因子XIIIa のE.c
oliにおける発現 a)FXIIIa 発現プラスミドの構成 FXIII−13はlacプロモ―タに関して正しい配向に
おいて、及びlacZα‐ペプチドに対して正しい読取
枠内にFXIIIa cDNA挿入を有する。従って、pF
XIII−13はE.coliにおけるFXIIIa 融合蛋白質
の合成を誘発することができる。この蛋白質の分子量
は、天然FXIIIa の732個のアミノ酸と共に16個の
ベクタ―コ―ド化アミノ酸プラス5′非‐コ―ド化領域
により特定される28個のアミノ酸よりなる。これらの
44個の追加のアミノ酸は融合蛋白質のN‐末端に位置
する。この蛋白質の予想される分子量は85,250D
(第4表(表7))である。lacプロモ―タの代りに
より効率的なtrp/lacハイブリッドプロモ―タを
用いる発現プラスミドを引続き構成した。このために、
pKK233−2〔アマン及びブロシュウス(Amann an
d Brosius)、ジ―ン(Gene)40(1985).183-190 〕をEc
oRIで切断し、Bal31で処理した(図3)。この
DNAを次いでPvuIIで切断し、2800塩基対の大
きさの断片をPAAゲル上で精製した。この断片をBg
lIIリンカ―(5′‐CAGATCTG)の存在下にお
いて再連結した。得られたプラスミドpTrc89−1
(図3)をNcoI及びHindIII で切断し、合成リ
ンカ― 5′CATGGAATTCGA3′ 3′CTTAAGCTTCGA5′ をリガ―ゼ混合物中において2800塩基対の断片と共
にインキュベ―トした。得られたプラスミドpTrc9
6A(図3)をEcoRI及び HindIII で切断
し、2800塩基対の大きさの断片をゲル精製し、pU
C18からの55塩基対の大きさのEcoRI‐Hin
dIII リンカ―と連結した。得られたプラスミドはpT
rc97A(図3)である。pKK233‐2に対照的
に、pTrc97Aはプラスミド内で一度だけ存在する
NcoI部位の下流にpUC18からのポリリンカ―を
有し、従って数多くのクロ―ニング部位を有する。pF
XIII−13中にクロ―ン化されたFXIIIa cDNA
は、ATG開始コドンから5´側に21塩基対離れた所
(位置61)にPstI部位を有する。次のPstI部
位は3′未翻訳領域(位置2398)に位置する。23
37塩基対長のPstI断片がpFXIII−13から単離
され、pTrc97AのSstI部位に連結された。P
stI断片を所望配向に有する得られたプラスミドはp
FXIII−C4(図4)である。pFXIII−C4により特
性される期待されるFXIII分子は22個の追加のN‐末
端アミノ酸を有し、それらの15個はベクタ―‐コ―ド
化され及び7個はFXIIIcDNAの5′非‐コ―ド化領
域により特定される。この蛋白質の予想される分子量は
82,380D(第4表)である。トロンビンを用いて
37個のアミノ‐末端アミノ酸を切断するとFXIIIa を
活性形態に転換させる。既に活性化されたその様なFXI
IIa 分子は治療上の興味があるので、トロンビン切断に
より短くすることのできるFXIIIa をE.coli中に
おいて発現する試みがなされた。高い収率を得るため
に、クロ―ニングは短くされたFXIIIa がE.coli
β‐ガラクトシダ―ゼ断片に融合したハイブリッド蛋白
質の形態で発現されるように行なわれた。pFXIII−1
3からの約2700bpの大きさのSmaI‐Hind
III 断片を単離し、SmaI及びHindIII で加水分
解されたpBD2IC20H中に連結した。新たなプラ
スミドpMB259(図5)において、アミノ酸Pro
37からMet732 のFXIIIa に対するcDNAはβ‐ガ
ラクトシダ―ゼの375のアミノ末端アミノ酸に該当す
る読取枠内に位置し、それは合成された融合蛋白質から
トロンビン切断により活性FXIIIa を得ることが可能で
あるようにトロンビン切断部位Arg38/Gly39を有
する。発現ベクタ―pBD2IC2OHはlacプロモ
―タ―を有するpBD2〔ブロ―カ―(Broker)ジ―ン
・アナリティカル・テクノロジ―(Gene Anal.Techn.)3
(1986)53-57 〕中にBamHI‐HindIII 断片とし
てプラスミドpIC20H(マ―シュ等、上掲)の58
bpよりなるポリリンカ―領域を連結することにより構
成された。 b)発 現 pFXIII−13、pFXIII−C4或いはpMB259で
形質転換された菌株D29A1のE.coli細胞は期
待されたFXIIIa 蛋白質を合成する能力があることが判
明した。プラスミドpFXIII−13、pMB259及び
pFXIII−C4によるFXIIIの発現はIPTGを用いて
誘発することができる。ク―マシ―ブル―(Coomassie
blue)で染色されたPAAゲル上のE.coli D2
9A1(pFXIII−13)及びD29A1(pFXIII−
C4)のIPTG誘発後の蛋白質抽出物の比較はFXIII
融合蛋白質の期待された分子量を示した。「44aaF
XIII融合蛋白質」の推定発現率は「22aaFXIII融合
蛋白質」のそれの約5倍である。又、pFXIII−13及
びpFXIII−C4により特定されるFXIIIa 分子は生物
学的活性を有することが判明した。これに対して、E.
coli D29A1対照例の抽出物中にはFXIII活性
は見出されなかった。クロット安定性アッセイ〔カルギ
ス、ベルクマイヤ―の酵素分析法第5巻酵素3:ペプチ
ダ―ゼ、プロティナ―ゼ及びそれらの阻害剤、400−
410頁(Karges,in Bergmeier,Methods of Enzymatic
Analysis,Volume 5, Enzymes 3:Peptidases,Proteinas
eand their Inhibitors,page 400-410)所収〕において
見出された活性はE.coli D29A1(pFXIII
−13)に対してはE.coli培養液(OD250 =
1.5)に基づいて5μg/lであり、D29A1(p
FXIII−C4)に対しては15μg/lである。FXIII
a ‐特異的ELISAにおいて見出された因子XIIIの量
はpFXIII−13に対してはE.coli培養液に基づ
いて1.5mg/lであり、pFXIII−C4に対しては3
5mg/lである。生物学的アッセイ及びELISAにお
いて測定されたFXIIIの量の間の食い違いは、E.co
li細胞中のFXIIIの主たる部分(>90%)が生物学
的に不活性であり7M尿素のみに溶解する不溶性沈澱の
形態であるという事実に由来するものである。E.co
li抽出液中に存在するFXIII分子の可溶性画分はオ―
クタロニ―試験〔Ouchterlony 、プログレス・イン・ア
ラ―ジ―(Progr.Allergy)5(1958)1〕において胎盤から
単離されたFXIIIのそれに実質的に同一である沈澱曲線
を示す。不溶性蛋白質凝集物の形態でのE.coli内
の真核生物蛋白質の発現は数個の蛋白質について既に説
明されている。これらの蛋白質はその様な凝集物からカ
オトロピック剤を用いて溶出することができ、適当再変
成条件によりそれらの生物学的に活性形態に転換するこ
とができる。
oliにおける発現 a)FXIIIa 発現プラスミドの構成 FXIII−13はlacプロモ―タに関して正しい配向に
おいて、及びlacZα‐ペプチドに対して正しい読取
枠内にFXIIIa cDNA挿入を有する。従って、pF
XIII−13はE.coliにおけるFXIIIa 融合蛋白質
の合成を誘発することができる。この蛋白質の分子量
は、天然FXIIIa の732個のアミノ酸と共に16個の
ベクタ―コ―ド化アミノ酸プラス5′非‐コ―ド化領域
により特定される28個のアミノ酸よりなる。これらの
44個の追加のアミノ酸は融合蛋白質のN‐末端に位置
する。この蛋白質の予想される分子量は85,250D
(第4表(表7))である。lacプロモ―タの代りに
より効率的なtrp/lacハイブリッドプロモ―タを
用いる発現プラスミドを引続き構成した。このために、
pKK233−2〔アマン及びブロシュウス(Amann an
d Brosius)、ジ―ン(Gene)40(1985).183-190 〕をEc
oRIで切断し、Bal31で処理した(図3)。この
DNAを次いでPvuIIで切断し、2800塩基対の大
きさの断片をPAAゲル上で精製した。この断片をBg
lIIリンカ―(5′‐CAGATCTG)の存在下にお
いて再連結した。得られたプラスミドpTrc89−1
(図3)をNcoI及びHindIII で切断し、合成リ
ンカ― 5′CATGGAATTCGA3′ 3′CTTAAGCTTCGA5′ をリガ―ゼ混合物中において2800塩基対の断片と共
にインキュベ―トした。得られたプラスミドpTrc9
6A(図3)をEcoRI及び HindIII で切断
し、2800塩基対の大きさの断片をゲル精製し、pU
C18からの55塩基対の大きさのEcoRI‐Hin
dIII リンカ―と連結した。得られたプラスミドはpT
rc97A(図3)である。pKK233‐2に対照的
に、pTrc97Aはプラスミド内で一度だけ存在する
NcoI部位の下流にpUC18からのポリリンカ―を
有し、従って数多くのクロ―ニング部位を有する。pF
XIII−13中にクロ―ン化されたFXIIIa cDNA
は、ATG開始コドンから5´側に21塩基対離れた所
(位置61)にPstI部位を有する。次のPstI部
位は3′未翻訳領域(位置2398)に位置する。23
37塩基対長のPstI断片がpFXIII−13から単離
され、pTrc97AのSstI部位に連結された。P
stI断片を所望配向に有する得られたプラスミドはp
FXIII−C4(図4)である。pFXIII−C4により特
性される期待されるFXIII分子は22個の追加のN‐末
端アミノ酸を有し、それらの15個はベクタ―‐コ―ド
化され及び7個はFXIIIcDNAの5′非‐コ―ド化領
域により特定される。この蛋白質の予想される分子量は
82,380D(第4表)である。トロンビンを用いて
37個のアミノ‐末端アミノ酸を切断するとFXIIIa を
活性形態に転換させる。既に活性化されたその様なFXI
IIa 分子は治療上の興味があるので、トロンビン切断に
より短くすることのできるFXIIIa をE.coli中に
おいて発現する試みがなされた。高い収率を得るため
に、クロ―ニングは短くされたFXIIIa がE.coli
β‐ガラクトシダ―ゼ断片に融合したハイブリッド蛋白
質の形態で発現されるように行なわれた。pFXIII−1
3からの約2700bpの大きさのSmaI‐Hind
III 断片を単離し、SmaI及びHindIII で加水分
解されたpBD2IC20H中に連結した。新たなプラ
スミドpMB259(図5)において、アミノ酸Pro
37からMet732 のFXIIIa に対するcDNAはβ‐ガ
ラクトシダ―ゼの375のアミノ末端アミノ酸に該当す
る読取枠内に位置し、それは合成された融合蛋白質から
トロンビン切断により活性FXIIIa を得ることが可能で
あるようにトロンビン切断部位Arg38/Gly39を有
する。発現ベクタ―pBD2IC2OHはlacプロモ
―タ―を有するpBD2〔ブロ―カ―(Broker)ジ―ン
・アナリティカル・テクノロジ―(Gene Anal.Techn.)3
(1986)53-57 〕中にBamHI‐HindIII 断片とし
てプラスミドpIC20H(マ―シュ等、上掲)の58
bpよりなるポリリンカ―領域を連結することにより構
成された。 b)発 現 pFXIII−13、pFXIII−C4或いはpMB259で
形質転換された菌株D29A1のE.coli細胞は期
待されたFXIIIa 蛋白質を合成する能力があることが判
明した。プラスミドpFXIII−13、pMB259及び
pFXIII−C4によるFXIIIの発現はIPTGを用いて
誘発することができる。ク―マシ―ブル―(Coomassie
blue)で染色されたPAAゲル上のE.coli D2
9A1(pFXIII−13)及びD29A1(pFXIII−
C4)のIPTG誘発後の蛋白質抽出物の比較はFXIII
融合蛋白質の期待された分子量を示した。「44aaF
XIII融合蛋白質」の推定発現率は「22aaFXIII融合
蛋白質」のそれの約5倍である。又、pFXIII−13及
びpFXIII−C4により特定されるFXIIIa 分子は生物
学的活性を有することが判明した。これに対して、E.
coli D29A1対照例の抽出物中にはFXIII活性
は見出されなかった。クロット安定性アッセイ〔カルギ
ス、ベルクマイヤ―の酵素分析法第5巻酵素3:ペプチ
ダ―ゼ、プロティナ―ゼ及びそれらの阻害剤、400−
410頁(Karges,in Bergmeier,Methods of Enzymatic
Analysis,Volume 5, Enzymes 3:Peptidases,Proteinas
eand their Inhibitors,page 400-410)所収〕において
見出された活性はE.coli D29A1(pFXIII
−13)に対してはE.coli培養液(OD250 =
1.5)に基づいて5μg/lであり、D29A1(p
FXIII−C4)に対しては15μg/lである。FXIII
a ‐特異的ELISAにおいて見出された因子XIIIの量
はpFXIII−13に対してはE.coli培養液に基づ
いて1.5mg/lであり、pFXIII−C4に対しては3
5mg/lである。生物学的アッセイ及びELISAにお
いて測定されたFXIIIの量の間の食い違いは、E.co
li細胞中のFXIIIの主たる部分(>90%)が生物学
的に不活性であり7M尿素のみに溶解する不溶性沈澱の
形態であるという事実に由来するものである。E.co
li抽出液中に存在するFXIII分子の可溶性画分はオ―
クタロニ―試験〔Ouchterlony 、プログレス・イン・ア
ラ―ジ―(Progr.Allergy)5(1958)1〕において胎盤から
単離されたFXIIIのそれに実質的に同一である沈澱曲線
を示す。不溶性蛋白質凝集物の形態でのE.coli内
の真核生物蛋白質の発現は数個の蛋白質について既に説
明されている。これらの蛋白質はその様な凝集物からカ
オトロピック剤を用いて溶出することができ、適当再変
成条件によりそれらの生物学的に活性形態に転換するこ
とができる。
【0020】4.FXIIIの酵母における発現 酵母から遺伝子操作により得られる生物学的に活性なF
XIIIの合成はFXIIIをコ―ドするcDNAを酵母内にお
いて自律的に複製する能力を有する発現ベクタ―中に導
入することにより達成された。組換えクロ―ンの抽出物
からFXIII‐活性蛋白質を単離することが可能であっ
た。酵母を生育する条件及び分子生物学的方法は、ディ
ロン等〔Dillon et al.「組換えDNA方法」(Recombi
nant DNA Methodology). John Wiley &Sons,NewYork(19
85)〕及びマニアティス等(Maniatis et al. 上掲)に
説明されている。FXIIIcDNAは約2700bpの大
きさの HindIII 断片としてベクタ―pFXIII−1
3から単離され、ベクタ―pAAH5〔アメラ―(Amme
rer)、メソッド・オブ・エンザイモロジ―(Meth.Enzym
ol.)101(1983)192-201〕のHindIII 部位中にクロ―
ン化された。即ち、得られたプラスミドpHB240
(図6)中のFXIIIcDNAはアルコ―ルデヒドロゲナ
―ゼの遺伝子発現信号を含有する強ADHIプロモ―タ
の制御下にある。このプラスミドpMB240をパン酵
母、サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cere
visiae) 、株Leu2−3、Pep4−3中にイトウ等
〔Itoh et al. ジャ―ナル・オブ・バクテリオロジ―
(J.Bacteriol.)153(1983). 163-168 〕の方法により形
質転換し、及びLeu+ 形質転換体をYNB最小培地上
で選択した。形質酵母細胞の一つのコロニ―を用いてY
NB培地を有する液体培養液に接種した。30℃で2日
間生育後複合YPB培地中への転移を行ない、及び更に
3日後細胞を遠心分離により取出し、100mMクエン
酸ナトリウムを含有する等張塩溶液(pH7.2)中で
ガラスビ―ズミルにより破壊した。細胞抽出物をSorval
l 高速遠心分離器内のSS34ロ―タ―内で20,00
0rpm において4℃で1時間高速遠心分離にかけた。
S.セレビシエ(pMB240)の細胞を除去した上澄
液をウェスタンブロット法により分析した。胎盤からの
FXIIIと同一位置に検出することのできるバンドに加え
て、約116,000Dの蛋白質が用いられた抗‐FXI
II血清と特異的に反応した。これは酵母中に形成された
FXIIIの一部がグリゴシル化されたことを証明する。蛋
白質のグリコシル化はしばしば蛋白質、特に血漿蛋白
質、の半減期を延長する因子である。加えて、蛋白質の
側鎖は血漿蛋白質例えばアンチトロンビンIII の活性を
増大するか或いは作用の期間を延長することがある。酵
母において発現され、且つ胎盤から得られたFXIIIとは
対照的にグリコシル化されているか或いはその他の何等
かの形で翻訳後修飾を行なったFXIIIは、増大した活性
のために胎盤からのFXIIIに対して利点を有し得る。細
胞を除去した上澄液をELISAによりFXIIIについて
調べ、FXIII濃度が酵母培養液に基づき150ng/ml
であることが判明した。FXIIIの生物学的活性は上掲の
カルゲスの方法により求められ、ELISAにおいて測
定された濃度を確認した。パン酵母から得られたFXIII
の生物学的活性は抗‐FXIII抗体により特異的に阻害す
ることができたので、非‐特異的FXIII様活性を酵母蛋
白質により除外することが可能であった。
XIIIの合成はFXIIIをコ―ドするcDNAを酵母内にお
いて自律的に複製する能力を有する発現ベクタ―中に導
入することにより達成された。組換えクロ―ンの抽出物
からFXIII‐活性蛋白質を単離することが可能であっ
た。酵母を生育する条件及び分子生物学的方法は、ディ
ロン等〔Dillon et al.「組換えDNA方法」(Recombi
nant DNA Methodology). John Wiley &Sons,NewYork(19
85)〕及びマニアティス等(Maniatis et al. 上掲)に
説明されている。FXIIIcDNAは約2700bpの大
きさの HindIII 断片としてベクタ―pFXIII−1
3から単離され、ベクタ―pAAH5〔アメラ―(Amme
rer)、メソッド・オブ・エンザイモロジ―(Meth.Enzym
ol.)101(1983)192-201〕のHindIII 部位中にクロ―
ン化された。即ち、得られたプラスミドpHB240
(図6)中のFXIIIcDNAはアルコ―ルデヒドロゲナ
―ゼの遺伝子発現信号を含有する強ADHIプロモ―タ
の制御下にある。このプラスミドpMB240をパン酵
母、サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cere
visiae) 、株Leu2−3、Pep4−3中にイトウ等
〔Itoh et al. ジャ―ナル・オブ・バクテリオロジ―
(J.Bacteriol.)153(1983). 163-168 〕の方法により形
質転換し、及びLeu+ 形質転換体をYNB最小培地上
で選択した。形質酵母細胞の一つのコロニ―を用いてY
NB培地を有する液体培養液に接種した。30℃で2日
間生育後複合YPB培地中への転移を行ない、及び更に
3日後細胞を遠心分離により取出し、100mMクエン
酸ナトリウムを含有する等張塩溶液(pH7.2)中で
ガラスビ―ズミルにより破壊した。細胞抽出物をSorval
l 高速遠心分離器内のSS34ロ―タ―内で20,00
0rpm において4℃で1時間高速遠心分離にかけた。
S.セレビシエ(pMB240)の細胞を除去した上澄
液をウェスタンブロット法により分析した。胎盤からの
FXIIIと同一位置に検出することのできるバンドに加え
て、約116,000Dの蛋白質が用いられた抗‐FXI
II血清と特異的に反応した。これは酵母中に形成された
FXIIIの一部がグリゴシル化されたことを証明する。蛋
白質のグリコシル化はしばしば蛋白質、特に血漿蛋白
質、の半減期を延長する因子である。加えて、蛋白質の
側鎖は血漿蛋白質例えばアンチトロンビンIII の活性を
増大するか或いは作用の期間を延長することがある。酵
母において発現され、且つ胎盤から得られたFXIIIとは
対照的にグリコシル化されているか或いはその他の何等
かの形で翻訳後修飾を行なったFXIIIは、増大した活性
のために胎盤からのFXIIIに対して利点を有し得る。細
胞を除去した上澄液をELISAによりFXIIIについて
調べ、FXIII濃度が酵母培養液に基づき150ng/ml
であることが判明した。FXIIIの生物学的活性は上掲の
カルゲスの方法により求められ、ELISAにおいて測
定された濃度を確認した。パン酵母から得られたFXIII
の生物学的活性は抗‐FXIII抗体により特異的に阻害す
ることができたので、非‐特異的FXIII様活性を酵母蛋
白質により除外することが可能であった。
【0021】5.FXIIIa の動物細胞における発現 a)動物細胞のための発現ベクタ―の構成 発現ベクタ―pSVA STOP1は***特許出願P3
6 24 453・8(このベクタ―の合成に関するこ
の出願の実施例1は抜粋して付表に再現した)に提案さ
れている。このプラスミドの他に動物細胞におけるFXI
IIa の発現のためにベクタ―pZET4(下記参照)及
びドロソフィラ(Drosophila)熱衝撃蛋白質70プロモ
―タ〔ウルム等(Wurm et al.)、Proc.Natl.Acad. Sci.
USA 83(1986)5414-5418 〕を有するpSP6HS9を
用いた。pZET4(図7):プラスミドpSVA S
TOP1をBamHIで切断し、2.6kbの大きさで
SV40初期プロモ―タ―を有するベクタ―断片を単離
した。pSV2dhfr(リ―等(Lee et al.) 、ネ―
チャ―(Nature)294(1981)228-232 〕からの0.85k
bの大きさのBglII‐BamHI断片をこの様にして
予備処理されたベクタ―中に連結し、その結果プラスミ
ドpZET4が得られた。pSV2dhfrからの0.
85kb断片上にはエキソン‐イントロン連結からのm
RNAスプライス部位及びSV40 DNAからのt抗
原に対する遺伝子のポリアデニル化部位が位置してい
る。 b)動物細胞のためのFXIIIa 発現ベクタ―の構築 pSVF13(図8):発現ベクタ―pSVA STO
P1をHindIII 及びXbaIで切断した。約2.7
kbの大きさのFXIIIa cDNAを有するpFXIII−1
3からのHindIII ‐XbaI断片をこの様にして処
理されたベクタ―中に連結した。pSVF13上のFXI
IIa 転写単位はmRNAスプライス部位を有しない。p
ZF13(図9):約2.7kbの大きさのFXIIIa c
DNAを有するHindIII 断片をプラスミドpFXIII
−13から単離した。得られた5′突出末端を相補鎖内
にDNAポリメラ―ゼI(クレノウ断片)で埋填するこ
とにより除去した。発現ベクタ―pZET4を独特のX
baI部位において切断することにより線型化した。得
られた5′突出末端を同様に相補鎖内においてDNAポ
リメラ―ゼI(クレノウ断片)により埋填することによ
り除去した。この埋填ベクタ―と内充填FXIIIa cDN
A断片の連結の結果、FXIIIa 発現プラスミドpZF1
3が得られた。pSVF13におけると同様に、FXIII
a cDNAはSV40初期プロモ―タの転写制御下にあ
るが、しかし、mRNAスプライス部位を備えている。
pHSF13(図10):プラスミドpSVF13をE
coRIにより部分的に消化し、約2.9kbの大きさ
のFXIIIa cDNAに引続き初期転写のためのSV40
ポリアデニル化部位を有する断片を単離した。この断片
を熱衝撃蛋白質70プロモ―タの下流のプラスミドpS
P6HS9の独特のEcoRI部位中に連結した。c)CHO(支那ハムスタ―卵巣)dhfr -
細胞の共トランスフェクションのた
めのDHFR発現ベクタ― DHFRベクタ―pSV2dhfr(リ―等、上掲)或
いはプロモ―タのないDHFRプラスミドpSVOAd
hfr(***特許出願P36 24453.8、参考例
参照)をCHO dhfr- 細胞における説明されたF
XIIIa 発現ベクタ―による共トランスフェクションに用
いた。両ベクタ―共、マウスからのDHFRcDNAを
有する。 d)BHK(ベビ―ハムスタ―腎臓)細胞の共トランスフ
ェクションのためのG418耐性を与えるベクタ― 説明されたFXIIIa 発現ベクタ―をBHK細胞内でベク
タ―pRMH140〔フジャック等(Hudziak et al.)c
ell 31(1982).137-146〕で共トランスフェクションを行
なった。 e)CHO細胞内におけるFXIIIa の発現 プラスミドpZF13とDHFRベクタ―pSV2dh
frの組み合わせ及び発現プラスミドpSVF13とD
HFRベクタ―pSVOAdhfrの組み合わせによる
共トランスフェクションを、リン酸カルシウム沈澱法
〔グレアム及びファンデルEb(Grahamandvan der Eb
)、ウイロロジ―(Virology)52 (1973 )456-467 〕
を用いてCHO dhfr- 細胞で行なった。これは5
μgのDHFRベクタ―(pSV2dhfr或いはpS
VOAdhfr)と混合され、及び共沈された20μg
の特定の FXIIIa 発現プラスミド(pZF13或いは
pSVF13)を伴うものであった。この共沈澱物を上
記トランスフェクションに用いた(25cm2 培養瓶中
0.5×106細胞)。3日後、細胞をトリプシン化
し、3個の60mmのペトリ皿に移し、選択培地(グリシ
ン、ヒポキサンチン或いはチミジンを含有しない)と混
合した。これらの条件下に生残る細胞はDHFR遺伝子
と安定なトランスフェクションを行なったもののみであ
る。トランスフェクトされた細胞のコロニ―は1−3週
間後にペトリ皿上に目に見えるようになる。この方法に
より次のトランスフェクション速度が達成された: pSV2dhfr 5×10-5/プレ―ト pSVOAdhfr 1×10-5/プレ―ト。 個々のクロ―ンを単離し、グリシン、ヒポキサンチン或
いはチミジンを含有しない培地内で増殖した。約3ng
/mlの検出下限を有する特別のELISAを用いて個々
のクロ―ンの培養上澄液及び細胞溶解物中のFXIIIa を
検出した。培養上澄液はELISAにおいてそのまま使
用した。細胞溶解物は次のようにして調製した:25cm
2 培養瓶中の集密細胞を40mM tris HCl
(pH7.4)、1mM EDTA、150mM Na
Cl中で2回洗浄し、150μlの0.25M tri
s・HCl(pH7.8)、5mM DTT、2%グリ
セロ―ル、0.2%洗剤(Triton x 100) 中にとり、及
び3回冷凍及び解凍することにより溶解した。細胞の不
溶性成分は遠心分離により除去した。この溶解物をEL
ISAに使用するために1:2.5に稀釈した。説明さ
れた検出方法をプラスミドpZF13/pSV2dhf
rの組合わせに対して17クロ―ンに適用して、FXIII
a を発現する一つのクロ―ン(CHO59−5−C7)
が見出された。プラスミドpSVF13/pSVOAd
hfrで共トランスフェクション及び12クロ―ンの分
析後、更にFXIIIa ‐発現クロ―ン(CHO60−3−
C1)が検出された。これらの両者の陽性クロ―ンを用
いて培地内及び溶解物中において同一の相対的量でFXI
IIa を検出することが可能であった。FXIIIa を生成す
る系統の発現速度を定量的に求めるために次の標準的操
作を行なった:0.5×106個の細胞を25cm2 培養
瓶内の5mlの培地中で培養した。この培地は24時間後
交換した(5ml)。更に24時間後培地を除去し、細胞
カウント数を求め溶解物を調製した。以後に述べる全て
の発現速度(ng/106細胞/24時間)に対して試
験の終りにおける25cm2 瓶当りの細胞カウント数は1
±0.25×106細胞数であった。次の表は、説明さ
れた方法で試験された基本クロ―ンの発現速度を示す: 細 胞 外 細 胞 内 (ng/106 細胞/24時間) (ng/106 細胞/24時間) CHO59-5-C7 12 9 CHO60-3-C1 17 13 SDS電気泳動に続いてクロ―ンCHO59−5−C7
及びクロ―ンCHO60−3−C1の溶解物及び上澄液
のFXIIIa ‐特異的免疫ブロッティングを行なったとこ
ろ、いずれの場合にもヒト胎盤から単離された蛋白質の
分子量を有する一つのバンドが反応を示した。クロ―ン
CHO59−5−C7を遺伝子増幅のためにメトトレキ
セ―ト(Mtx)の増大する濃度に曝した。10nM
Mtxの濃度及び4移動適応時間で出発し、培地中のM
tx濃度を50nMに増大した。次の発現速度が標準的
操作において求められた: Mtx(nM) 細 胞 外 細 胞 内 (ng/106 細胞/24時間) (ng/106 細胞/24時間) 0 12 9 10 19 16 50 38 66 f)BHK細胞におけるFXIIIa の発現 各々20μgのFXIIIa 発現プラスミドpZF13、p
SVF13及びpHSF13をBHK細胞内において例
5e)において説明されるリン酸カルシウム沈澱法により
5μgのG418耐性をコ―ドするプラスミドpRMH
140で共トランスフェクションを行なった。3日後、
細胞をトリプシン化し、3個の60mmペトリ皿に移し、
及び400μg/mlのG418を含有する選択培地と混
合した。12日後約200−300のG418耐性コロ
ニ―が各ペトリ皿に生育していた。全部のクロ―ンをト
リプシン化し、25cm2 培養瓶中の合一したクロ―ン
(CC)(5mlの培地)として転移させた。pZF13
及びpSVF13でトランスフェクションされた細胞の
場合には、80−100%の集密度に到達した際にFXI
IIa を特異的ELISAを用いて培地中及び関連溶解物
中で決定した(例5e)参照)。pHSF13でトランス
フェクションされ同様に80−100%の集密度に到達
した合一したクロ―ンを42℃に予備加熱した新たな培
地と混合し、42℃で1時間インキュベ―トした。培地
をもう1回37℃で平衡化された新鮮な培地と交換した
後、細胞を37℃で24時間維持した。これらの培地及
び溶解物を次いで上記の如くそれらのFXIIIa の含量に
ついて調べた。下記表は各種合一クロ―ンに対するFXI
IIa の細胞分布をまとめて示すものである。 培地内に存在するFXIIIa に関する発現速度は例5e)に
おいて説明した標準的操作により個々の合一クロ―ンに
対して求めた。以下に述べる全ての発現速度(ng/1
06細胞/24時間)に対して試験の終りにおける25
cm2 瓶当りの細胞カウント数は4.5±0.5×106
細胞であった。 これまでに説明されたトランスフェクションされたBH
K系統は生産しない或いはそれらの発現速度が異なる細
胞を含む混合物であったので、引続いてクロ―ンを単離
することにより高発現速度を有する遺伝的に均一な細胞
系統を単離する試みがなされた。この目的のためには、
特別の合一されたクロ―ンからの細胞を1細胞/ウェ
ル、2細胞/ウェル又は4細胞/ウェルの濃度でマイク
ロタイタ―プレ―ト上に置いた。1個のみのクロ―ンが
生育したウェルからの上澄液をFXIIIa ‐特異的ELI
SAにより分析した。最高発現速度のクロ―ンを25cm
2 培養瓶内で増殖させ、それらの発現速度を上記一般的
操作により検討した。以下の表はBHK−MK1(pZ
F13)を上記方法により単離することにより得られた
クロ―ンの発現速度を示す。 BHK細胞系統MK1−E2を例にとり、これらの細胞
により合成されたFXIIIa 分子が生物学的活性を有する
ことも示された。用いられたBHKMK1−E2系統及
び非‐トランスフェクテッドBHK系統(陰性対照例)
を1.5mlの2%グリセロ―ルを含有する0.25M
tris.HCl(pH7.8)にとった。これらの細
胞を3回冷凍及び解凍することにより溶解した後、Do
unceホモジナイザ―内で処理した。不溶性構成成分
を遠心分離により除去後、溶解物を生物学的活性に用い
た(例3参照)。次のFXIIIa 活性が見出された: BHK MK1−E2 0.06単位/108細胞 BHK(トランスフェ 0単位/108細胞クションさ
れない) 第2表
6 24 453・8(このベクタ―の合成に関するこ
の出願の実施例1は抜粋して付表に再現した)に提案さ
れている。このプラスミドの他に動物細胞におけるFXI
IIa の発現のためにベクタ―pZET4(下記参照)及
びドロソフィラ(Drosophila)熱衝撃蛋白質70プロモ
―タ〔ウルム等(Wurm et al.)、Proc.Natl.Acad. Sci.
USA 83(1986)5414-5418 〕を有するpSP6HS9を
用いた。pZET4(図7):プラスミドpSVA S
TOP1をBamHIで切断し、2.6kbの大きさで
SV40初期プロモ―タ―を有するベクタ―断片を単離
した。pSV2dhfr(リ―等(Lee et al.) 、ネ―
チャ―(Nature)294(1981)228-232 〕からの0.85k
bの大きさのBglII‐BamHI断片をこの様にして
予備処理されたベクタ―中に連結し、その結果プラスミ
ドpZET4が得られた。pSV2dhfrからの0.
85kb断片上にはエキソン‐イントロン連結からのm
RNAスプライス部位及びSV40 DNAからのt抗
原に対する遺伝子のポリアデニル化部位が位置してい
る。 b)動物細胞のためのFXIIIa 発現ベクタ―の構築 pSVF13(図8):発現ベクタ―pSVA STO
P1をHindIII 及びXbaIで切断した。約2.7
kbの大きさのFXIIIa cDNAを有するpFXIII−1
3からのHindIII ‐XbaI断片をこの様にして処
理されたベクタ―中に連結した。pSVF13上のFXI
IIa 転写単位はmRNAスプライス部位を有しない。p
ZF13(図9):約2.7kbの大きさのFXIIIa c
DNAを有するHindIII 断片をプラスミドpFXIII
−13から単離した。得られた5′突出末端を相補鎖内
にDNAポリメラ―ゼI(クレノウ断片)で埋填するこ
とにより除去した。発現ベクタ―pZET4を独特のX
baI部位において切断することにより線型化した。得
られた5′突出末端を同様に相補鎖内においてDNAポ
リメラ―ゼI(クレノウ断片)により埋填することによ
り除去した。この埋填ベクタ―と内充填FXIIIa cDN
A断片の連結の結果、FXIIIa 発現プラスミドpZF1
3が得られた。pSVF13におけると同様に、FXIII
a cDNAはSV40初期プロモ―タの転写制御下にあ
るが、しかし、mRNAスプライス部位を備えている。
pHSF13(図10):プラスミドpSVF13をE
coRIにより部分的に消化し、約2.9kbの大きさ
のFXIIIa cDNAに引続き初期転写のためのSV40
ポリアデニル化部位を有する断片を単離した。この断片
を熱衝撃蛋白質70プロモ―タの下流のプラスミドpS
P6HS9の独特のEcoRI部位中に連結した。c)CHO(支那ハムスタ―卵巣)dhfr -
細胞の共トランスフェクションのた
めのDHFR発現ベクタ― DHFRベクタ―pSV2dhfr(リ―等、上掲)或
いはプロモ―タのないDHFRプラスミドpSVOAd
hfr(***特許出願P36 24453.8、参考例
参照)をCHO dhfr- 細胞における説明されたF
XIIIa 発現ベクタ―による共トランスフェクションに用
いた。両ベクタ―共、マウスからのDHFRcDNAを
有する。 d)BHK(ベビ―ハムスタ―腎臓)細胞の共トランスフ
ェクションのためのG418耐性を与えるベクタ― 説明されたFXIIIa 発現ベクタ―をBHK細胞内でベク
タ―pRMH140〔フジャック等(Hudziak et al.)c
ell 31(1982).137-146〕で共トランスフェクションを行
なった。 e)CHO細胞内におけるFXIIIa の発現 プラスミドpZF13とDHFRベクタ―pSV2dh
frの組み合わせ及び発現プラスミドpSVF13とD
HFRベクタ―pSVOAdhfrの組み合わせによる
共トランスフェクションを、リン酸カルシウム沈澱法
〔グレアム及びファンデルEb(Grahamandvan der Eb
)、ウイロロジ―(Virology)52 (1973 )456-467 〕
を用いてCHO dhfr- 細胞で行なった。これは5
μgのDHFRベクタ―(pSV2dhfr或いはpS
VOAdhfr)と混合され、及び共沈された20μg
の特定の FXIIIa 発現プラスミド(pZF13或いは
pSVF13)を伴うものであった。この共沈澱物を上
記トランスフェクションに用いた(25cm2 培養瓶中
0.5×106細胞)。3日後、細胞をトリプシン化
し、3個の60mmのペトリ皿に移し、選択培地(グリシ
ン、ヒポキサンチン或いはチミジンを含有しない)と混
合した。これらの条件下に生残る細胞はDHFR遺伝子
と安定なトランスフェクションを行なったもののみであ
る。トランスフェクトされた細胞のコロニ―は1−3週
間後にペトリ皿上に目に見えるようになる。この方法に
より次のトランスフェクション速度が達成された: pSV2dhfr 5×10-5/プレ―ト pSVOAdhfr 1×10-5/プレ―ト。 個々のクロ―ンを単離し、グリシン、ヒポキサンチン或
いはチミジンを含有しない培地内で増殖した。約3ng
/mlの検出下限を有する特別のELISAを用いて個々
のクロ―ンの培養上澄液及び細胞溶解物中のFXIIIa を
検出した。培養上澄液はELISAにおいてそのまま使
用した。細胞溶解物は次のようにして調製した:25cm
2 培養瓶中の集密細胞を40mM tris HCl
(pH7.4)、1mM EDTA、150mM Na
Cl中で2回洗浄し、150μlの0.25M tri
s・HCl(pH7.8)、5mM DTT、2%グリ
セロ―ル、0.2%洗剤(Triton x 100) 中にとり、及
び3回冷凍及び解凍することにより溶解した。細胞の不
溶性成分は遠心分離により除去した。この溶解物をEL
ISAに使用するために1:2.5に稀釈した。説明さ
れた検出方法をプラスミドpZF13/pSV2dhf
rの組合わせに対して17クロ―ンに適用して、FXIII
a を発現する一つのクロ―ン(CHO59−5−C7)
が見出された。プラスミドpSVF13/pSVOAd
hfrで共トランスフェクション及び12クロ―ンの分
析後、更にFXIIIa ‐発現クロ―ン(CHO60−3−
C1)が検出された。これらの両者の陽性クロ―ンを用
いて培地内及び溶解物中において同一の相対的量でFXI
IIa を検出することが可能であった。FXIIIa を生成す
る系統の発現速度を定量的に求めるために次の標準的操
作を行なった:0.5×106個の細胞を25cm2 培養
瓶内の5mlの培地中で培養した。この培地は24時間後
交換した(5ml)。更に24時間後培地を除去し、細胞
カウント数を求め溶解物を調製した。以後に述べる全て
の発現速度(ng/106細胞/24時間)に対して試
験の終りにおける25cm2 瓶当りの細胞カウント数は1
±0.25×106細胞数であった。次の表は、説明さ
れた方法で試験された基本クロ―ンの発現速度を示す: 細 胞 外 細 胞 内 (ng/106 細胞/24時間) (ng/106 細胞/24時間) CHO59-5-C7 12 9 CHO60-3-C1 17 13 SDS電気泳動に続いてクロ―ンCHO59−5−C7
及びクロ―ンCHO60−3−C1の溶解物及び上澄液
のFXIIIa ‐特異的免疫ブロッティングを行なったとこ
ろ、いずれの場合にもヒト胎盤から単離された蛋白質の
分子量を有する一つのバンドが反応を示した。クロ―ン
CHO59−5−C7を遺伝子増幅のためにメトトレキ
セ―ト(Mtx)の増大する濃度に曝した。10nM
Mtxの濃度及び4移動適応時間で出発し、培地中のM
tx濃度を50nMに増大した。次の発現速度が標準的
操作において求められた: Mtx(nM) 細 胞 外 細 胞 内 (ng/106 細胞/24時間) (ng/106 細胞/24時間) 0 12 9 10 19 16 50 38 66 f)BHK細胞におけるFXIIIa の発現 各々20μgのFXIIIa 発現プラスミドpZF13、p
SVF13及びpHSF13をBHK細胞内において例
5e)において説明されるリン酸カルシウム沈澱法により
5μgのG418耐性をコ―ドするプラスミドpRMH
140で共トランスフェクションを行なった。3日後、
細胞をトリプシン化し、3個の60mmペトリ皿に移し、
及び400μg/mlのG418を含有する選択培地と混
合した。12日後約200−300のG418耐性コロ
ニ―が各ペトリ皿に生育していた。全部のクロ―ンをト
リプシン化し、25cm2 培養瓶中の合一したクロ―ン
(CC)(5mlの培地)として転移させた。pZF13
及びpSVF13でトランスフェクションされた細胞の
場合には、80−100%の集密度に到達した際にFXI
IIa を特異的ELISAを用いて培地中及び関連溶解物
中で決定した(例5e)参照)。pHSF13でトランス
フェクションされ同様に80−100%の集密度に到達
した合一したクロ―ンを42℃に予備加熱した新たな培
地と混合し、42℃で1時間インキュベ―トした。培地
をもう1回37℃で平衡化された新鮮な培地と交換した
後、細胞を37℃で24時間維持した。これらの培地及
び溶解物を次いで上記の如くそれらのFXIIIa の含量に
ついて調べた。下記表は各種合一クロ―ンに対するFXI
IIa の細胞分布をまとめて示すものである。 培地内に存在するFXIIIa に関する発現速度は例5e)に
おいて説明した標準的操作により個々の合一クロ―ンに
対して求めた。以下に述べる全ての発現速度(ng/1
06細胞/24時間)に対して試験の終りにおける25
cm2 瓶当りの細胞カウント数は4.5±0.5×106
細胞であった。 これまでに説明されたトランスフェクションされたBH
K系統は生産しない或いはそれらの発現速度が異なる細
胞を含む混合物であったので、引続いてクロ―ンを単離
することにより高発現速度を有する遺伝的に均一な細胞
系統を単離する試みがなされた。この目的のためには、
特別の合一されたクロ―ンからの細胞を1細胞/ウェ
ル、2細胞/ウェル又は4細胞/ウェルの濃度でマイク
ロタイタ―プレ―ト上に置いた。1個のみのクロ―ンが
生育したウェルからの上澄液をFXIIIa ‐特異的ELI
SAにより分析した。最高発現速度のクロ―ンを25cm
2 培養瓶内で増殖させ、それらの発現速度を上記一般的
操作により検討した。以下の表はBHK−MK1(pZ
F13)を上記方法により単離することにより得られた
クロ―ンの発現速度を示す。 BHK細胞系統MK1−E2を例にとり、これらの細胞
により合成されたFXIIIa 分子が生物学的活性を有する
ことも示された。用いられたBHKMK1−E2系統及
び非‐トランスフェクテッドBHK系統(陰性対照例)
を1.5mlの2%グリセロ―ルを含有する0.25M
tris.HCl(pH7.8)にとった。これらの細
胞を3回冷凍及び解凍することにより溶解した後、Do
unceホモジナイザ―内で処理した。不溶性構成成分
を遠心分離により除去後、溶解物を生物学的活性に用い
た(例3参照)。次のFXIIIa 活性が見出された: BHK MK1−E2 0.06単位/108細胞 BHK(トランスフェ 0単位/108細胞クションさ
れない) 第2表
【表1】 第3表
【表2】
【表3】
【表4】
【表5】
【表6】 第4表
【表7】
【0022】参考例 独国特許出願P36 24・453.8からの例1 a)動物細胞のための発現ベクタ―の構成 プラスミドpSV2dhfr(リ―等、上掲)をHin
dIII 及びEcoRIで切断し、SV40初期プロモ―
タを有する2.65kbベクタ―断片を単離した。pU
C12STOP〔ブロ―カ―及びアマン(Broker and A
mann)、アプライド・マイクロバイオロジカル・バイオ
テクノロジ―(Appl.Microbiol.Biotechnol.)23(1986)2
49-296〕からの67bp HindIII ‐EcoRI断
片をこの様にして予備処理されたベクタ―中に連結し、
その結果プラスミドpSV2STOPを得た。pUC1
2STOPからの67bp断片上には全ての三つの読取
枠内に翻訳停止コドンがある。pSV2STOPをSa
cIで線型化し、得られた3′突出末端をDNAポリメ
ラ―ゼIの3′→5′エキソヌクレア―ゼ活性を用いて
除去した。次いでEcoRIによる消化を行なった。初
期のトランスクリプトに対するSV40ポリアデニル化
信号を有するpBB3〔B.ブラショト等(B.Bouracho
t et al.)、エンボ・ジャ―ナル(EMBO J.)1(1982)895
-900〕からの133bpの大きさのEcoRI‐Hpa
I断片と連結後、発現ベクタ―pSVA STOP1を
得ることが可能であった。このポリアデニル化部位は又
ベクタ―pIG6(ブラコット等、上掲)からも単離す
ることができる。全く同一の方法によりSV40遺伝子
から133bpBamHI‐HpaI断片を単離し、B
amHI切断部位に埋填し、及びEcoRIリンカ―を
付着することが可能である。pSVA STOP1はこ
の様にSV40初期プロモ―タと初期のトランスクリプ
トに対してSV40ポリアデニル化信号の間に3個の独
特の制限部位(HindIII ‐SalI‐XbaI)を
有するクロ―ニングポリリンカ―及び全ての三つの読取
枠内に翻訳停止を有する配列を有する。 c)共トランスフェクションのためのDHFR発現ベクタ
―の構成 共トランスフェクションに用いられるDHFRベクタ―
の出発点はプラスミドpMTVdhfrであった(リ―
等、上掲)。pMTVdhfrはBglIIで切断し、D
NAの突出5′末端をDNAポリメラ―ゼI(クレノウ
断片)を用いて埋填した。EcoRIで消化後、4.4
7kbの大きさの断片を単離し、pBB3(ブラコット
等、上掲)からの133bpEcoRI‐HpaI断片
と連結させた。この新しいプラスミドpMTVAdhf
rはMMTV‐LTR及び初期のトランスクリプトのた
めのSV40ポリアデニル化部位を側面に配置されたマ
ウスDHFRcDNAを有する。pSVOAdhfrは
大きさが1450bpでMMTV‐LTRを有するHi
ndIII 断片を削除することによりpMTVAdhfr
から得られた。pMTVAdhfr或いはpSVOAd
hfrはいづれもmRNAスプライス部位を有しない。
dIII 及びEcoRIで切断し、SV40初期プロモ―
タを有する2.65kbベクタ―断片を単離した。pU
C12STOP〔ブロ―カ―及びアマン(Broker and A
mann)、アプライド・マイクロバイオロジカル・バイオ
テクノロジ―(Appl.Microbiol.Biotechnol.)23(1986)2
49-296〕からの67bp HindIII ‐EcoRI断
片をこの様にして予備処理されたベクタ―中に連結し、
その結果プラスミドpSV2STOPを得た。pUC1
2STOPからの67bp断片上には全ての三つの読取
枠内に翻訳停止コドンがある。pSV2STOPをSa
cIで線型化し、得られた3′突出末端をDNAポリメ
ラ―ゼIの3′→5′エキソヌクレア―ゼ活性を用いて
除去した。次いでEcoRIによる消化を行なった。初
期のトランスクリプトに対するSV40ポリアデニル化
信号を有するpBB3〔B.ブラショト等(B.Bouracho
t et al.)、エンボ・ジャ―ナル(EMBO J.)1(1982)895
-900〕からの133bpの大きさのEcoRI‐Hpa
I断片と連結後、発現ベクタ―pSVA STOP1を
得ることが可能であった。このポリアデニル化部位は又
ベクタ―pIG6(ブラコット等、上掲)からも単離す
ることができる。全く同一の方法によりSV40遺伝子
から133bpBamHI‐HpaI断片を単離し、B
amHI切断部位に埋填し、及びEcoRIリンカ―を
付着することが可能である。pSVA STOP1はこ
の様にSV40初期プロモ―タと初期のトランスクリプ
トに対してSV40ポリアデニル化信号の間に3個の独
特の制限部位(HindIII ‐SalI‐XbaI)を
有するクロ―ニングポリリンカ―及び全ての三つの読取
枠内に翻訳停止を有する配列を有する。 c)共トランスフェクションのためのDHFR発現ベクタ
―の構成 共トランスフェクションに用いられるDHFRベクタ―
の出発点はプラスミドpMTVdhfrであった(リ―
等、上掲)。pMTVdhfrはBglIIで切断し、D
NAの突出5′末端をDNAポリメラ―ゼI(クレノウ
断片)を用いて埋填した。EcoRIで消化後、4.4
7kbの大きさの断片を単離し、pBB3(ブラコット
等、上掲)からの133bpEcoRI‐HpaI断片
と連結させた。この新しいプラスミドpMTVAdhf
rはMMTV‐LTR及び初期のトランスクリプトのた
めのSV40ポリアデニル化部位を側面に配置されたマ
ウスDHFRcDNAを有する。pSVOAdhfrは
大きさが1450bpでMMTV‐LTRを有するHi
ndIII 断片を削除することによりpMTVAdhfr
から得られた。pMTVAdhfr或いはpSVOAd
hfrはいづれもmRNAスプライス部位を有しない。
【図1】FXIIIa をコ―ドするcDNA(コ―ド化領域
を斜線で示す)及びこの下に単離及び特性付けられたク
ロ―ンのDNA領域を示す説明図である。
を斜線で示す)及びこの下に単離及び特性付けられたク
ロ―ンのDNA領域を示す説明図である。
【図2】発現プラスミドpFXIII−13の構成を示す説
明図である。明らかにするために、この図においては出
発プラスミドpIC19H−12.1及びpIC19H
−11.1並びにそれらの直下に位置するDNA断片は
一本鎖断片から構成された生成物pFXIII−13と同様
に二重線で表わされる。
明図である。明らかにするために、この図においては出
発プラスミドpIC19H−12.1及びpIC19H
−11.1並びにそれらの直下に位置するDNA断片は
一本鎖断片から構成された生成物pFXIII−13と同様
に二重線で表わされる。
【図3】プラスミドpTrc97Aの構築を示す説明図
である。
である。
【図4】pTrc97A及びpFXIII−13からのpF
XIII−C4の構築を示す説明図である。
XIII−C4の構築を示す説明図である。
【図5】pFXIII−13及び公知のプラスミドpIC2
0H及びpBD2からのpMB259の構築を示す説明
図である。
0H及びpBD2からのpMB259の構築を示す説明
図である。
【図6】pFXIII−13及び公知のプラスミドpAAH
5からのプラスミドpMB240の構築を示す説明図で
ある。
5からのプラスミドpMB240の構築を示す説明図で
ある。
【図7】公知のプラスミドpSV2dhfr及びプラス
ミドpSVA STOP1からのpZET4の構築を示
す説明図である。
ミドpSVA STOP1からのpZET4の構築を示
す説明図である。
【図8】pSVASTOP1及びpFXIII−13からの
pSVF13の構築を示す説明図である。
pSVF13の構築を示す説明図である。
【図9】pZET4及びpFXIII−13からのpZF1
3の構築を示す説明図である。
3の構築を示す説明図である。
【図10】pSVF13及び公知のプラスミドSP6H
69からのpHSF13の構築を示す説明図である。
69からのpHSF13の構築を示す説明図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 FI 技術表示箇所 C12N 1/21 7236−4B 5/10 15/54 ZNA G01N 33/53 L 8310−2J // G01N 33/577 B 9015−2J (C12N 9/10 C12R 1:19) (C12N 9/10 C12R 1:865) (C12N 9/10 C12R 1:91) (72)発明者 ゲルト、ツェットルマイスル ドイツ連邦共和国ラーンタール、アム、ホ ーフアッカー、15
Claims (3)
- 【請求項1】因子XIIIa をコ−ドするDNAを含有する
ベクタ−によって細胞を形質転換し、該形質転換細胞を
発現させることを特徴とする、因子XIIIa の製造法。 - 【請求項2】下記で表わされる因子XIIIa のアミノ酸配
列をコードするDNAを含有するベクターによって細胞
を形質転換することを特徴とする、請求項1記載の製造
法。 【化1】 【化2】 【化3】 【化4】 - 【請求項3】DNAが下記の配列を有することを特徴と
する、請求項2記載の製造法。 【化5】 【化6】 【化7】 【化8】
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