JPH0640825B2 - 遺伝子操作による因子ＸＩＩＩａの製造 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、遺伝子操作による因子XIIIa の製造に関する
ものである。

凝固因子XIIIは脊椎動物における天然の血液凝固過程に
おける「凝固カスケード」の最終構成員である。「活性
化フィブリン−安定化因子」、「フィブリノリガーゼ」
或いは「血漿トランスグルタミナーゼ」とも称され、及
び以後「ＦXIIIａ」とも称される因子XIIIの酵素的に活
性な形態、因子XIIIａは、分子内架橋による先在する血
栓におけるフィブリン単位の融合を触媒する〔ローラン
ド等（Lorand et el.）メソッズ・イン・エンザィモロ
ジー（Methods in Enzymology 80(1981), 333-341 ；カ
ーティス等（Curtis et al.）Annals New York Academy
of Sciences 1983,567-576〕。血漿からの第XIII因子
の分子量は約３００ｋＤである〔ローウィ等（Loewy et
al.）、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミスト
リー（J.Biol.Chem.）236(1961)2634〕。活性サブユニ
ットＦXIIIａの分子量は約８０ｋＤである〔ボーン及び
シュウィック（Bohn and Schwick）、Arzneimittelfors
chung 21(1971)14322〕。因子XIIIの活性化に際し、ト
ロンビンは、前駆体から、約４ｋＤの大きさであって、
３６個のアミノ酸の公知の配列を有するペプチドを***
する（タカギ及びドゥーリトル（Takagi and DooLittl
e）、バイオケミストリー(Biochemistry)13(1974)750-7
56〕。更に、４個のアミノ酸を有する配列が公知である
〔ホルブルック等（Holbrook et al.）、バイオケミカ
ル・ジャーナル(Biochem.J.)135(1973)901-903 〕。

本発明は、遺伝子操作によるＦXIIIa の製造に関し、よ
り具体的には本発明は、ＦXIIIa をコードするＤＮＡに
関するものである。本発明に関連するものとして、後述
するような遺伝子操作によるＦXIIIa の製断方法、これ
に必要なｍＲＮＡ、それから得られるｃＤＮＡ、このｃ
ＤＮＡの全部或いは一部を含有するＤＮＡ構造及びベク
ター、このタイプのＤＮＡで形質転換された細胞及びこ
れらの細胞により発現されたポリペプチドがある。又、
ＦXIIIa のアミノ酸配列の部分配列、それにより得られ
た特異的抗体、これらの抗体から製造された診断補助
品、及び抗体カラム及びその様なカラムを用いて得られ
たポリペプチドも本発明に関連する。本発明は、ＦXIII
a をコードするＤＮＡ或いはＲＮＡの全部或いは一部を
含有する診断補助品、及びこのタイプの診断補助品を用
いて体液及び組織を検査する診断に利用することもでき
る。更に、本発明の他の側面及びその好ましい実施態様
は以下に詳細に説明され、及び特許請求の範囲に規定さ
れる。

ＦXIIIａ断片のアミノ酸配列は、適当なプローブの構築
のために決定されたものである。対応するペプチド断片
は、臭化シアンを用いた蛋白質分解或いは切断により得
られた。その様な断片のアミノ酸配列についての知識に
基づき、一つの２０ｍｅｒ及び一つの６６ｍｅｒの二つ
のオリゴヌクレオチドプローブを合成した。

２０ｍｅｒプローブにおいては、次のアミノ酸配列に対
する全ての理論的に可能なコドンを考慮に入れ、 Ｍｅｔ−Ｍｅｔ−Ａｓｐ−Ｉｌｅ−Ｔｈｒ−Ａｓｐ−Ｔ
ｈｒ 最後のアミノ酸の場合にはコドンの第３番目の位置を省
略した。従って、この２０ｍｅｒプローブは４８倍の縮
重体、即ち該アミノ酸配列をコードする４８個の理論的
に可能なオリゴヌクレオチド全部の混合物である（後記
表１参照）。

６６ｍｅｒのプローブは、次のアミノ酸配列に基づき、
統計学的データの助けを借りて選んだ〔レイズ（Lath
e）、ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー
(J.Molec.Biol.)183(1985)1-12〕（後記表２参照） Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｇ
ｌｙ−ｌＬｅ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｔｈｒ−Ｃｙｓ−Ｌｅ
ｕ−Ｔｙｒ−Ｖａｌ−Ｍｅｔ−Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ａｌａ
−Ｇｌｎ−Ｍｅｔ−Ａｓｐ これらのプローブを用いてｃＤＮＡバンクのスクリーニ
ングを行なった。ｃＤＮＡは、成熟ヒト胎盤からのｍＲ
ＮＡから調製した。なお、このｍＲＮＡを胎盤から単離
し、ｃＤＮＡをそれから調製した。ｃＤＮＡにＥｃｏＲ
Ｉ末端を付与し、ファージベクターλｇｔ１０のＥｃｏ
ＲＩ切断部位に連結した。上記プローブにより同定され
た陽性クローンλｇｔ１０−１２を更に分析した（第１
図）。それ自体公知の方法による配列決定の結果、ＦXI
IIａをコードするＤＮＡ配列が得られた。

このＤＮＡ配列を用いたｃＤＮＡバンクの再スクリーニ
ングの結果、５′−末端の方向及び３′−末端の両方向
に拡張するクローンを更に単離した。

第１図はＦXIIIａをコードするＤＮＡ配列の制限地図を
示す。“Ｎ”はコード化領域のＮ−末端を示し及び
“Ｃ”はＣ−末端を示し、及び“Ａ（８９）”は８９塩
基のポリ（Ａ）配列を示す。この配列はＦXIIIａのコー
ド化配列の全部を表わす。後記表３は、判明したＤＮＡ
配列（コード鎖）及びそれから演繹されたλｇｔ１０−
１１及びλｇｔ１０−１２からのクローン化ｃＤＮＡ断
片からのアミノ酸配列を示す。ｃＤＮＡの全長さは、３
９０５塩基対である。タカギ及びドゥーリトル（上掲）
により見出された３６個のアミノ酸を有するＮ−末端配
列はこの判明した配列内に存在する。この配列は表３に
おいてヌクレオチド位置８８及び１９８の間に連続線に
より示されている。タカギ及びドゥーリトルにより見出
された配列に加えて、このｃＤＮＡは１８７−１８９の
ヌクレオチド位置においてバリンをコードする。この４
個のアミノ酸を有するホルブルック等（上掲）により見
出されたアミノ酸−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ｃｙｓ−Ｔｒｐ−
は位置１０２１−１０３２におけるｃＤＮＡによりコー
ドされている。この配列は同様に連続線により示されて
いる。加えて、２０ｍｅｒ及び６６ｍｅｒオリゴヌクレ
オチドプローブの位置は破線により示されている。２０
ｍｅｒプローブは１５０７及び１５２６の位置の間にハ
イブリダイズし、６６ｍｅｒプローブは７６６及び８３
１の位置の間にハイブリダイズする。

本発明に例えば、変更された生物学的特性を有する蛋白
質をコードする変成された遺伝子の製造にこのコード化
ｃＤＮＡを用いることが可能である。この目的のため
に、それ自体公知の方法で削除、挿入及び塩基交換を行
なうことが可能である。

宿主の選択によりＦXIIIａへの変成の性質に影響を及ぼ
すことも可能である。即ち、細菌においてはグリコシル
化がないのに対し、酵母細胞において生ずるそれは高等
真核生物におけるそれと異なる。

ＦXIIIａのアミノ酸配列を知れば、ポリクローナル或い
はモノクローナル抗体の製造に抗原として作用すること
のできるアミノ酸の部分配列を通常の方法或いは遺伝子
操作により製造することが可能である。その様な抗体は
診断目的のみならず、それを用いてこの因子を他の蛋白
質に加えて含有する溶液からＦXIIIａを除去することが
可能である抗体カラムの製造にも使用することができ
る。

このｃＤＮＡ或いはその部分を用いて、直截的にゲノム
バンクからＦXIIIａをコードするゲノムクローンを単離
することも可能であり、またそれを用いてそれを真核生
物細胞内に発現することが可能であるのみならず、更に
診断情報を得ことも可能である。

ＦXIIIａ欠陥は、前駆体の酵素の活性形態に転換するこ
とができないことに大きく帰せられる各種症候群を生じ
得る。ＦXIIIａのｃＤＮＡについての知識によれば、今
やそれを用いて遺伝的変成が存在するか否かを直截的に
確立することが可能である診断補助品の製造することが
可能である。

即ち、本発明に従えば例えば、ウィルスその他の蛋白質
による汚染の如何なる危険性もなしに高純度の因子XIII
ａを製造することが可能である。今日まで存在していた
原料源としてヒト血漿或いは胎盤への依存はかくして克
服された。加えて、本発明によれば、貴重な診断補助品
及び従って遺伝的ＦXIIIａ欠陥の分析ができるようにな
る。

以下、本発明を具体的により詳細に説明する。特に断り
のない限り、パーセントは量に関連しない場合には重量
に関する。

本文で説明するものの他、次の省略を用いた： ＥＤＴＡ＝エチレンジアミン四酢酸ナトリウム ＳＤＳ ＝ドデシル硫酸ナトリウム ＤＴＴ ＝ジチオスレイトール ＢＳＡ ＝ウシ血清アルブミン。

例： １．ヒト胎盤からのＲＮＡの単離 ＲＮＡは成熟ヒト胎盤から得られた〔チルギン等（Chir
gwin et al.)、バイオケミストリー(Biochemistry)18(1
979)5294-5299の方法による〕約１０ｇの胎盤組織を液
体窒素中で粉砕し、０．１Ｍのメルカプトエタノールを
含有する８０mlの４Ｍグアニジウムチオシアネート中に
懸濁させ、ホモジナイザー（Ultraturrax）中で２０，
０００rpm にて９０秒間処理した。溶解物を７０００rp
m で１５分間遠心分離し（Sorvall GSA ローター）、２
mlの１Ｍ酢酸及び６０mlの無水エタノールを上澄液に添
加し、これを−２０℃で一晩沈澱させた。６０００rpm
及び−１０℃において１０分間沈降後、核酸を４０mlの
７．５Ｍグアニジニウム塩酸塩（ｐＨ７．０）中に完全
に溶解し、１mlの１Ｍ酢酸及び２０mlの無水エタノール
の混合物で沈澱した。ＤＮＡを除去するために、この沈
澱を半分の容量でもう一度繰返した。ＲＮＡを１２mlの
Ｈ_２Ｏに溶解し、１．２mlの４Ｍ酢酸カリウム及び２４
mlの無水エタノールの混合物で沈澱させ、沈降させ、及
び最終的に１０mlの水に再溶解した（ｇ組織当り１m
l）。

ポリ（Ａ）を含有する胎盤ｍＲＮＡの単離 ポリ（Ａ）を含有するｍＲＮＡを単離するために、胎盤
ＲＮＡをＬｉＣｌ中の２mlパスツェールピペット内でオ
リゴ（ｄＴ）−セルロースクロマトグラフィにより分別
した〔アビブ及びレーダー（Aviv and Leder）、Proc.N
atl.Acad.Sci.USA69(1973)1408-1412 〕。約５mgの胎盤
ＲＮＡを緩衝液〔５００ｍＭ ＬｉＣｌ、２０ｍＭ ｔ
ｒｉｓ（ｐＨ７．５）、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１％Ｓ
ＤＳ〕中においてカラムにかけた。ポリ（Ａ）^＋ＲＮＡ
はオリゴ（ｄＴ）−セルロースに結合したのに対し、ポ
リ（Ａ）⁻ＲＮＡは再び溶出することができた。緩衝液
２〔１００ｍＭ ＬｉＣｌ、２９ｍＭ ｔｒｉｓ（ｐＨ
７．５）、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１％ＳＤＳ〕で洗浄
後、ポリ（Ａ）^＋ＲＮＡ（胎盤ｍＲＮＡ）をカラムから
緩衝液３〔５ｍＭ ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）、１ｍＭ
ＥＤＴＡ、０．０５％ＳＤＳ〕で溶出した。

更に精製するために、ポリ（Ａ）^＋ＲＮＡを緩衝液１に
対して調製し、オリゴ（ｄＴ）−セルロース上で再クロ
マトグラフィを行なった。この第２回目の精製工程の
後、胎盤ポリ（Ａ）^＋ＲＮＡの収率は使用ＲＮＡの約４
％であった。

ヒト胎盤からのｃＤＮＡ（胎盤ｃＤＮＡ）及び二本鎖ｃ
ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）の合成 ｃＤＮＡ合成前に、ポリ（Ａ）を含有する胎盤ｍＲＮＡ
が完全であることのチェックを１．５％アガロースゲル
内で行なった。

次いで４μｇの胎盤ｍＲＮＡを６５．５μのＨ_２Ｏ中
に溶解し、７０℃で１０分間変成し、再び氷中で冷却し
た。２０μのＲＴ_１緩衝液〔４２℃における２５０ｍ
Ｍ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．２）、２５０ｍＭ ＫＣｌ、３
０ｍＭ ＭｇＣｌ_２）、２．５μの２０ｍＭ ｄＮＴ
Ｐ（即ち全ての四つのデオキシヌクレオチドトリホスフ
ェート）、１μの１μｇ／mlオリゴ（ｄＴ）、１μ
の１Ｍ ＤＴＴ、２μのＲＮＡｓｉｎ及び８μの逆
転写酵素（２４Ｕ／μ）を添加後、ｃＤＮＡを１００
μ混合物中において４２℃で９０分間合成した。

二本鎖ｃＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）は、ガブラー及びホフマ
ン（Gubler and Hoffmann）の方法〔ジーン(Gene)25(19
83)263-269〕により合成した。この合成は、ｃＤＮＡ合
成の直後に３０５．５μのＨ_２Ｏ、８０μのＲＴ_２
緩衝液〔１００ｍＭ ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）、２５ｍ
Ｍ ＭｇＣｌ_２、５００ｍＭ ＫＣｌ、５０ｍＭ ＤＴ
Ｔ、２５０μｇ／mlＢＳＡ〕、２μのＲＮａｓｅＨ
（２Ｕ／μ）、２．５μのＥ．ｃｏｌｉＤＮＡリガ
ーゼ（５Ｕ／μ）、５μの１５ｍＭ β−ＮＡＤ、
及び５μのＤＮＡポリメラーゼＩ（５Ｕ／μ）を添
加し、１５℃において５時間インキュベーションするこ
とにより行なった。この反応を熱不活性化（７０℃、３
０分）により停止させた。

５５μの２５０μＭ ｄＮＴＰ、５５μの１０ｍＭ
ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）、１０ｍＭ ＭｇＣｌ_２、１
０μｇ／mlＢＳＡ、３μのＴ４ＤＮＡポリメラーゼＩ
（１Ｕ／μ）、２μＮＲａｓｅＨ（２Ｕ／μ）及
び２μのＲＮａｓｅＡ（２μｇ／ml）を添加後、反応
液を第２番目のＤＮＡ鎖上におけるポリメラーゼＩの誤
った合成を修正するために３７℃において更に３０分間
インキュベートした（「修復反応」）。

ｄｓＤＮＡへのＥｃｏＲＩリンカーの連結及びリンカー
の開裂 胎盤ｃＤＮＡバンクを組立てるために、このｄｓＤＮＡ
にファージベクターλｇｔ１０のＥｃｏＲＩ切断部位に
おいてそれを連結できるようにＥｃｏＲＩ末端を付与し
た〔Ｔ．マニアティス等(T.Maniatis et a.).(1982)、
モレキュラー・クローニング（Molecular Cloning）、
実験室マニュアル、Cold Spring Harbor〕。この目的の
ために、ｄｓＤＮＡを a)ｄｓＤＮＡの内部ＥｃｏＲＩ切断部位を保護するため
にＥｃｏＲＩメチラーゼで処理し、 b)ＥｃｏＲＩリンカーを付与し、それらを c)次いでＥｃｏＲＩで開環させた。

a)について： ｄｓＤＮＡのメチラーゼ反応は、修復反応の直後に２５
μの５００ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）６０μの
メチラーゼ緩衝液〔１００ｍＭＮａＯＡｃ（ｐＨ５．
２）、２mgのＳ−アデノシル−Ｌ−メチオニン〕及び２
μのＥｃｏＲＩメチラーゼ（２０Ｕ／μ）を添加
し、３７℃４３０分間インキュベートさせて行なった。

反応液をフェノールで抽出し、ｄｓＤＮＡを６０μの
４Ｎ ＮａＯＡｃ及び１３００μのエタノールで沈澱
させた。ｄｓＤＮＡを２回７０％エタノールで洗浄し、
エーテルと振盪させて１回抽出し、乾燥させた。

b)について： このＥｃｏＲＩ−メチル化ｄｓＤＮＡを８８μのＨ_２
Ｏに溶解し、１０μのリガーゼ緩衝液〔５００ｍＭ
ｔｒｉｓ（ｐＨ７．４）、１００ｍＭ ＭｇＣｌ_２、１
００ｍＭ ＤＴＴ、１０ｍＭスペルミジン、１０ｍＭ
ＡＴＰ、１mg／mlＢＳＡ〕及び１μのＴ４ＤＮＡリガ
ーゼ（１０Ｕ／μ）を添加後、１μのＥｃｏＲＩリ
ンカー（０．５μｇ／μ） （ｐＧＧＡＡＴＴＣＣ及びｐＡＧＡＡＴＴＣＴ）と１５
℃において一晩かけて連結させた。

c)について： このリガーゼ混合物の容量を６μのＨ_２Ｏ、１２μ
の１０ｘＥｃｏＲＩ緩衝液及び２μのＥｃｏＲＩ（１
２０Ｕ／μ）で１２０μに調合した。ＥｃｏＲＩ消
化は、３７℃で２時間行なった。

酢酸カリウム勾配及びｄｓＤＮＡの大きさ選択による未
結合リンカーの除去 ｄｓＤＮＡから全ての未結合ＥｃｏＲＩリンカーを除去
するために、ＥｃｏＲＩ反応混合物を全部酢酸カリウム
勾配（５−２０％ＫＯＡｃ、１ｍＭ ＥＤＴＡ １μ
／mlエチジウムブロマイド）にかけ、それを５０，００
０rpm 及び２０℃で３時間遠心分離した（Beckman SW 6
5/ローター）。この勾配を最初の五つの画分の容量が５
００μで残りの全てが１００μとなるように下から
分別した。これらの画分を０．０１容のアクリルアミド
（２５mg／ml）及び２．５容のエタノールで沈澱させ、
７０％強度のエタノールで１度洗浄し、乾燥し、及びそ
れぞれを５μのＨ_２Ｏ中にとった。

ｄｓＤＮＡの大きさを決定するために、１μの各画分
を１．５％アガロースゲル内で分析した。更にｄｓＤＮ
Ａの量を１μの各画分について求めた。

１０００ｂｐを越えるｄｓＤＮＡを含有する画分を合体
し、この試料を最終濃度が２７μｇ／mlになるまで濃縮
した。

ｄｓＤＮＡのファージベクターλｇｔ１０中への導入及
びin vitroパッケージング反応 ｄｓＤＮＡのファージーベクターλｇｔ１０（Vecter C
loning Systems、カルフォルニア州、サンディェゴ）の
ＥｃｏＲＩ切断部位中への導入は、４μリガーゼ混合
物（２μのｄｓＤＮＡ、１μのλｇｔ１０×Ｅｃｏ
ＲＩ（１μｇ／ml）、０．４μのリガーゼ緩衝液、
０．５μのＨ_２Ｏ及び０．１μのＴ４ＤＮＡリガー
ゼ）中において行なった。この混合物は、１５℃で４時
間インキュベートした。

ファージベクターλｇｔ１０内で胎盤ｃＤＮＡバンクを
確立するために、このリガーゼ混合物を次いでλ−溶原
性細胞抽出物Ｅ．ｃｏｌｉ ＮＳ４２８及びＮＳ４３３
とのin vitroパッケージング反応に室温において２時間
付した〔Vecter Cloning Systems 、カルフォルニア
州、サンディェゴ；エンキスト及びスターンバーグ（En
quist and Sternberg）、Methods in Enzymology 68(19
79)281-298 〕。この反応は、５００μの懸濁媒体
〔ＳＭ：０．１Ｍ ＮａＣｌ、８ｍＭ ＭｇＳＯ_４、５
０ｍＭ ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）、０．０１％ゼラチ
ン〕及び２滴のクロロホルムで停止させた。

力価の決定及び胎盤ｃＤＮＡバンクの分析 胎盤ｃＤＮＡバンクのプラーク形成単位（ＰＦＵ）の数
はＥ．ｃｏｌｉ Ｋ１２株Ｃ６００ＨＦＬのコンピテン
ト細胞を用いて決定した：それは１×１０^６ＰＦＵであ
った。約８０％のファージが１０００塩基対より大きい
ＤＮＡインサートを含有した。

胎盤ｃＤＮＡバンクをスクリーニングするためのオリゴ
ヌクレオチドプローブ 二つのオリゴヌクレオチドプローブ（２０ｍｅｒプロー
ブ及び６６ｍｅｒプローブ）を胎盤ｃＤＮＡバンクを分
析するために合成した。それらの配列は、ＦXIIIａのい
くつかの蛋白質分解及びＢｒＣＮ断片のアミノ酸初期配
列から演繹した。場合によっては重複する、従ってより
長いアミノ酸配列が見出されたが、これらによって極め
て長いプローブ即ち６６ｍｅｒプローブの合成が可能と
なった。

２０ｍｅｒプローブは、アミノ酸配列Ｍｅｔ−Ｍｅｔ−
Ａｓｐ−Ｉｌｅ−Ｔｈｒ−Ａｓｐ−Ｔｈｒに対する全て
の理論的に可能なコドンが考慮された通常のＤＮＡプロ
ーブである（末端アミノ酸Ｔｈｒの場合には「ゆらぎ」
位置と称されるコドンの第３番目は省略された；表１参
照）。この２０ｍｅｒプローブは従って４８倍縮重体、
即ち該アミノ酸配列に対する全ての４８個の理論的に可
能なコード化オリゴヌクレオチドの混合物である。

６６ｍｅｒプローブの構成方法及び使用は、レイズ（La
the）、J.Mol.Biol.183(1985)1-12の原則に本質的に従
った。６６ｍｅｒプローブを構成するために二つの３９
ｍｅｒプローブを含成した（次の配列を有する３９ｍｅ
ｒＡ： ５′ＴＡＴＧＧＣＣＡＧＴＴＴＧＡＧＧＡＴＧＧＣＡＴ
ＣＣＴＧＧＡＣＡＣＣＴＧＴＣＴＧ３′及び次の配列を
有する３９ｍｅｒＢ： ５′ＧＴＣＣＡＴＣＴＧＧＧＣＣＣＧＧＴＣＣＡＴＣＡ
ＣＡＴＡＣＡＧＡＣＡＧＧＴＧＴＣ３′）。３９ｍｅｒ
Ａ及び３９ｍｅｒＢは、二つの配列のハイブリダイゼー
ションの結果長い遊離５′末端が生ずるように１２個の
塩基よりなる相補的配列を有する。

これらの二つの３９ｍｅｒプローブは（２０ｍｅｒプロ
ーブと同様に）５′末端において（γ−³²Ｐ）−ＡＴＰ
（約１μｇのＤＮＡ、（γ−³²Ｐ）−ＡＴＰ：３０００
Ｃｉ／mmol、１０μＣｉ／μ、６μ／４０μの反
応混合液使用）の存在下においてＴ４ポリヌクレオチド
キナーゼで標識した。２０ｍｅｒプローブは１×１０^８
Ｂｑ／μｇ或いは１．５×１０^６Ｂｑ／pmolの比活性を
有した。二つの３９ｍｅｒプローブは９５℃で５分間加
熱し、混合し、及び低温室内で４℃に徐々に冷却してハ
イブリダイズさせた。次いで、約１μｇのハイブリダイ
ズされた３９ｍｅｒプローブをＤＮＡポリメラーゼＩ、
クレノウ断片で（α−³²Ｐ）−ｄＡＴＰ（３０００Ｃｉ
／mmol、１０μＣｉ／μ、４μ／５０μ反応混合
物）を添加して処理した〔５′−３′埋填（filling-i
n）反応〕。この埋填された６６ｍｅｒプローブは１．
５×１０^８Ｂｑ／μｇの比活性を有した。これらのＤＮ
Ａプローブは−２０℃において貯蔵した。２０ｍｅｒプ
ローブは直ちに分析（スクリーニング）のために用いた
のに対し、６６ｍｅｒプローブは予め９５℃において５
分間加熱し、次いで氷浴内で迅速に冷却した。

６６ｍｅｒプローブは二つの３９ｍｅｒのハイブリダイ
ゼーションに引続き５′→３′埋填反応により生成され
たので、各種実験を行なうことが可能である。一方にお
いて、ｃＤＮＡバンクを変性された６６ｍｅｒＤＮＡプ
ローブとハイブリダイズさせることが可能であり、他方
において、次いで陽性のクローンを３９ｍｅｒＡ及びＢ
プローブと個々のハイブリダイズさせることが可能であ
る。

長いプローブ及び二つの短い３９ｍｅｒプローブＡ及び
Ｂの両者をハイブリダイズするクローンが所望の配列を
もつ確率は極めて高い。即ち、以上説明した長い、複雑
なオリゴヌクレオチドプローブを構成し、部分的に相補
的な短いＤＮＡプローブを用いてクローンを「再スクリ
ーニングする」方法は特異性の向上を表わす。加えて、
長いオリゴヌクレオチド及びその部分的に相補的な短い
部分オリゴヌクレオチドを用いて向上した特異性を有す
るゲノムバンクをスクリーニングすることが可能であ
る。該方法のもう一つの利点は、より短いオリゴヌクレ
オチドの合成をより簡単に且つより高い収率及び精度を
用いて行なうことができることである。二つの酵素反
応、即ち1)（γ−³²Ｐ）−ＡＴＰ標識付けのためのＴ４
ポリヌクレオチドキナーゼ、及び2)（α−³²Ｐ）−ｄＮ
ＴＰの添加によるＤＮＡポリメラーゼ埋填反応、の順序
はより高い比活性（少なくとも１×１０^８Ｂｑ／μｇＤ
ＮＡ）を得ることが可能であることを意味する。

ＦXIIIａ−特異的オリゴヌクレオチドによる胎盤ｃＤＮ
Ａのスクリーニング ２０ｍｅｒプローブ及び６６ｍｅｒプローブを用いて、
５×１０^５ＰＦＵの胎盤ｃＤＮＡバンクをＦXIIIａをコ
ードするＣＤＮＡ配列について調べた。これには、１
３．５cmのペトリ皿内の軟寒天中でＥ．ｃｏｌｉ Ｋ１
２株Ｃ６００ＨＦＬの細胞で培養され、３７℃で６時間
インキュベートされた３×１０^４ＰＦＵを伴った。この
時までに生じた如何なる溶解も尚不完全であった。これ
らのプレートを冷蔵庫内で一晩インキュベートし、ファ
ージをニトロセルロースフィルターに移した〔シュライ
ヒヤー及びシュル（Schleicher & Schuell）、BA 85.Re
f.No.401124 〕（二重）。これらのニトロセルロースフ
ィルター及びペトリ皿を引続き割当てを行なうために注
射針で印をつけた。これらのペトリ皿はニトロセルロー
スフィルターの処理の際に低温室に貯蔵した。ニトロセ
ルロースフィルター上のＤＮＡはフィルターを１．５Ｍ
ＮａＣｌ、０．５Ｍ ＮａＯＨを含浸させた紙（Wh
atman M 3）上に５分間置くことにより変性した。これ
らのフィルターを次いで１．５Ｍ ＮａＣｌ、０．５Ｍ
ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）を用いて同一方法で再変成
し、２×ＳＳＰＥ（０．３６Ｍ ＮａＣｌ、１６ｍＭ
ＮａＯＨ、２０ｍＭ ＮａＨ_２ＰＯ_４、２ｍＭ ＥＤＴ
Ａ）で洗浄した。これらのフィルターを次いで８０℃で
２時間真空乾燥した。これらのフィルターを３×ＳＳ
Ｃ、０．１％ＳＤＳ（２０×ＳＳＣ＝３ＭＮａＣｌ、
０．３Ｍ Ｎａクエン酸塩）で６５℃において４時間洗
浄し、６５℃において４時間予備ハイブリダイズした
（予備ハイブリダイゼーション溶液；０．６Ｍ ＮａＣ
ｌ、０．０６Ｍｔｒｉｓ（ｐＨ８．３）、６ｍＭ ＥＤ
ＴＡ、０．２％非−イオン性合成スクロース重合体（ ^R
Ｆｉｃｏｌｌ）、０．２％ポリビニルピロリドン４０、
０．２％ＢＳＡ、０．１％ＳＤＳ、５０μｇ／ml変性に
しん***ＤＮＡ）。これらのフィルターをおだやかに振
盪しながらビーカー或いは密封ポリエチレンフィルム内
でハイブリダイゼーション溶液（にしん***ＤＮＡのな
い予備ハイブリダイゼーション溶液）のml当り１００，
０００〜２００，０００Ｂｑの標識オリゴヌクレオチド
を添加して一晩インキュベートした。２０ｍｅｒ及び３
９ｍｅｒプローブに対するハイブリダイゼーション温度
は４２℃であり、６６ｍｅｒプローブに対するそれは４
７℃であった。

これらのニトロセルロースフィルターは６×ＳＳＣ、
０．０５Ｍピロリン酸ナトリウムで室温において１時間
及び特別のハイブリダイゼーション温度において更に１
時間洗浄した。これらのフィルターを乾燥し、一晩オー
トラジオグラフィにかけた。二重のＸ線フィルムの両者
に生ずる信号をペトリ皿に割当て、その領域（約５０プ
ラーク）をパスツールピペットの広い末端に切抜き、フ
ァージを１mlのＳＭ緩衝液に再懸濁した。陽性ファージ
を単一クローンが得られるまで３回に亘めて選抜した。

合計５×１０^５ＰＦＵの胎盤ｃＤＮＡバンクを数継代に
おいて調べた。二重フィルター上に１７個の信号が確認
された。より緊縮な条件下で更にスクリーニングを行な
ったところ尚陽性である７個の信号を得た。これらの７
個のＰＦＵのうち１個のみが２０ｍｅｒ及び６６ｍｅｒ
プローブによるハイブリダイゼーション及び３９ｍｅｒ
プローブＡ及びＢによるハイブリダイゼーションの後共
に陽性の信号を示した。この以後λｇｔ１０−１２と称
される−クローンはＦXIIIａをコード化し、及び内部Ｅ
ｃｏＲＩ切断部位を有する１７０４塩基対の配列を有す
る。サザーンブロット分析は、５４０塩基対のより小さ
いＥｃｏＲＩ断片は２０ｍｅｒＤＮＡプローブとハイブ
リダイズし、１１６４塩基対のより大きい断片は６６ｍ
ｅｒＤＮＡプローブとハイブリダイズすることを示して
いる。

再スクリーニング時に、サザーンブロットから３９ｍｅ
ｒプローブＢよりも３９ｍｅｒプローブＡとより多くの
反応があることが判明した。引続きクローンλｇｔ１０
−１２の配列分析によって、６６ｍｅｒプローブの全長
に亘ってＦXIIIａに見出された配列に対して僅かに７個
の不適性塩基対があるに過ぎないことが判った（表
２）。これらの７個の不適性塩基対は次のように分布し
ている。即ち３９ｍｅｒＡプローブに３個の及び３９ｍ
ｅｒＢプローブに５個の不適性塩基対がある（一つの不
適性塩基対は重複領域にあり、従って両者に共通であ
る）。３９ｍｅｒＢにおける５個の不適性塩基対は一団
となっており、これがおそらく３９ｍｅｒプローブの場
合におけるより弱いハイブリダイゼーション信号の理由
であると思われる。

ニック−トランスレートされたＥｃｏＲＩ断片による胎
盤ｃＤＮＡのスクリーニング ５４０塩基対及び１１６４塩基対長さの二つのサブクロ
ーン化ＥｃｏＲＩ断片を市販のベクターｐＵＣ８（１１
６４ｂｐ＝ｐＵＣ８−１２．１及び５４０ｂｐ＝ｐＵＣ
８−１２．２）のＥｃｏＲＩ切断部位中にクローン化
し、それから調製的にＥｃｏＲＩにより単離し、及び
（α−³²Ｐ）−ｄＮＴＰの存在下にニック−トランスレ
ートした。両断片の比活性は１×１０^８Ｂｑ／μｇＤＮ
Ａであった。これらの（³²Ｐ）−標識断片を数継代にお
いて用いて胎盤ｃＤＮＡバンクの約１×１０^６個の組換
えファージを調べ（ハイブリダイゼーション温度６５
℃）、かくして１３個のハイブリダイズするファージを
確認した。これらのファージは単一均質ファージ標本が
得られるまで３回に亘って選抜した。各ファージの２０
ml溶解物を調製し、ＤＮＡを抽出した。このＤＮＡをＥ
ｃｏＲＩで消化し、１％アガロースゲル上で分別した。
このゲルをサザーンブロット技術に対し、ニトロセルロ
ースフィルータを標識５４０ｂｐＥｃｏＲＩ断片とハイ
ブリダイズさせた。１１個のファージがハイブリダイゼ
ーション信号を示した。このニトロセルロースフィルタ
ーを沸騰させ、ニット−トランスレートされた１１６４
ｂｐＥｃｏＲＩ断片とハイブリダイズさせた。７個のフ
ァージがハイブリダイゼーション信号を示した。

ハイブリダイズする断片の大きさに基づいて、λｇｔ１
０−１２に対比してλｇｔ１０−２０のように５′末端
方向及びλｇｔ１０−１１のように３′末端の方向の両
者に拡張するクローンを確認することが可能であった。
これらのクローンを用いて完全なXIIIａ ｃＤＮＡ配列
を決定することが可能であった。内部制限部位を用いる
ことにより或いは重複配列のハイブリダイゼーションに
より、存在した部分配列を組合わせることが可能であっ
た。この完全なｃＤＮＡ配列は発現ベクター中に連結
し、適当な原核或いは真核系内において発現することが
できる。

ＤＮＡ配列分析 ファージクローンλｇｔ１０−１２を増殖し、ＤＮＡを
抽出した。二つのＥｃｏＲＩ断片を単離し、プラスミド
ベクターｐＵＣ８のＥｃｏＲＩ部位中にクローン化し
た。ｐＵＣ８−１２．１は１１６４塩基対断片を有し、
ｐＵＣ８−１２．２は５４０塩基対断片を有する。

１７０４塩基対よりなる全断片を単離するために、λｇ
ｔ１０−１２をＥｃｏＲＩで部分的に消化し、１７０４
塩基対バンドを単離し、ｐＩＣ１９Ｈ〔マーシュ等(Mar
sh et al.)Gene 32(1984)481- 485〕のＥｃｏＲＩ部位
中のクローン化した。得られたプラスミドをｐＩＣ１９
Ｈ−１２と称する。

クローンｐＵＣ８−１２．１、ｐＵＣ８−１２．２及び
ｐＩＣ１９Ｈ−１２のＳａｕ ３Ａ、ＡｌｕＩ及びＴａ
ｑＩ小断片をｐＵＣプラスミド及びＭ１３ファージにク
ローン化した後関連領域をサンガー（Sanger）のジデオ
キシ法及びマクサム及びギルバード（Maxam and Giber
t）の化学的方法を用いて配列決定することにより、１
７０４ｂｐ断片の配列を決定することが可能であった
（表３）。この配列は１個のみの開放読取枠を示し、因
子XIIIａ分子の最初の５４２個のアミノ酸をコードす
る。

クローンλｇｔ１０−１２或いはｐＩＣ１９Ｈ−１２及
びクローンλｇｔ１０−１１及びλｇｔ１０−２０の制
限分析は、適当な単一及び複数消化及びスミス及びビル
ンスチールの方法〔Smith,H.O.and Birnstiel,M.L.、ヌ
クレイック・アシッズ・リサーチ(Nucleic Acids Res.)
3(1976)2387- 2398〕による（³²Ｐ）−標識断片の部分
消化の両者により行なった（第１図）。

クローンλｇｔ１０−１１は２４３２ｂｐの大きさの内
部ＥｃｏＲＩ切断部位を有する断片を有する。この断片
は３′末端における２３７ｂｐによりλｇｔ１０−１２
からのｃＤＮＡ断片と重複し、コード化配列の残りの５
７０ｂｐプラス８９塩基のポリ（Ａ）配列を含む非−コ
ード化領域の１６２５ｂｐよりなる。約７００ｂｐの大
きさのｃＤＮＡ断片を有するクローンλｇｔ１０−２０
は又５′末端にλｇｔ１０−１２よりも６個多い塩基を
有する（ＧＡＧ ＧＡＡ…）。

２．発現されることができ、ＦXIIIａをコード化する全
ｃＤＮＡを含有するクローンの調製 出発クローンλｇｔ１０−１１及びλｇｔ１０−１２を
用いてＦXIIIａ ｃＤＮＡの全コード化領域を含有する
プラスミドを得た。部分ＥｃｏＲＩの消化の助けによ
り、λｇｔ１０−１２の１７０４塩基対よりなる挿入物
をｐＩＣ１９Ｈ（マーシュ等上掲）のＥｃｏＲＩ部位に
クローン化した。得られたプラスミドｐＩＣ１９Ｈ−１
２．１を引続き使用した（第２図参照）。このクローン
λｇｔ１０−１１は２４３２塩基対の大きさの挿入物を
有し、内部ＥｃｏＲＩ切断部位を有する。１２２４塩基
対の大きさであり、コード化配列のＣ−末端５７０塩基
対プラス３′非−コード化領域の６５４塩基対を有する
左側（「５−末端」）ＥｃｏＲＩ断片を同様にｐＩＣ１
９ＨのＥｃｏＲＩ切断部位にクローン化した。得られた
プラスミドｐＩＣ１９Ｈ−１１．１を引続き使用した
（第２図）。これらのプラスミドｐＩＣ１９Ｈ−１２．
１及びｐＩＣ１９Ｈ−１１．１はベクター中の同一配向
においてＦXIIIａに対するコード化領域を有し、２３７
塩基対よりなる重複領域を有する。この重複領域を用い
て部分クローンｐＩＣ１９Ｈ−１２．１及びｐＩＣ１９
Ｈ−１１．１から全コード化領域を有するクローンを構
成した。これは上記二つのプラスミドからのin vitroで
のハイブリダイゼーション（第２図）による部分的一本
鎖ヘテロ二重鎖分子の調製及び反応混合物物のＥ．ｃｏ
ｌｉ中への形質転換を伴うものであった。細菌の修復機
構（酵素ＤＮＡポリメラーゼＩの３′→５′エキソヌク
レアーゼ活性、５′→３′重合活性）を利用して、全コ
ード化領域を有するプラスミドを得た。具体的には、こ
れはプラスミドｐＩＣ１９Ｈ−１２．１（ＣｌａＩ−消
化）及びｐＩＣ１９Ｈ−１１．１（ＢａｍＨＩ−消化）
の各々の１μｇのＤＮＡを混合し、エタノールで沈澱す
るものであった。ＤＮＡを真空乾燥し、２０μのＨ_２
Ｏ中にとり、５μの１ＮＮａＯＨを添加後、室温にお
いて１０分間インキュベートした。次いで次のものを示
される順序に従って添加した：２００μのＨ_２Ｏ、２
５μの１Ｍ ｔｒｉｓ．ＨＣｌ（ｐＨ８．０）及び
５０μの０．１Ｎ ＨＣｌ。反応混合物を６５℃で３
時間インキュベートし、エタノールで沈澱させ、乾燥し
た。ＤＮＡを２０μのＨ_２Ｏ中に再懸濁し、公知の方
法によりＥ．ｃｏｌｉ中に形質転換し、細胞をＬＢ−ａ
ｍｐプレート上に乗せて一晩インキュベートした。合計
９６個のアンピシリン−耐性クローンのうち、２４個の
クローンをアルカリ法〔バーンボイム及びドリー（Birn
b-oim and Doly）、ヌクレイック・アシッゾ・リサーチ
(Nucl.Acid Res.)7(1979)1513-1523 〕により処理し、
プラスミドをＨｉｎｄIII、ＥｃｏＲＩ、ＢａｍＨＩ及
びＰｖｕIIによる制限酵素分解により特性決定した。６
個のプラスミドが期待された制限パターンを示した。こ
れらのプラスミドのうちの一つｐＦXIII−１３（第２
図）を詳細に特性決定した。これは配列決定された２３
７個の塩基対重複領域を有する。ＳｔｕＩ（位置１２２
５）−ＰｖｕII（位置１８７０）を伴い、このＤＮＡ配
列は正確であることが確認された。プラスミドｐＦXIII
−１３は７８ｂｐが５′非−翻訳領域のものであり２１
９６ｂｐが全コード領域であり、及び４１９ｂｐが３′
非−翻訳領域のものであるＦXIIIａｃＤＮＡの２６９３
塩基対よりなる。ｐＦXIII−１３は全ての引続く発現実
験のための出発プラスミドであった。

３．生物学的に活性な因子XIIIａのＥ．ｃｏｌｉにおけ
る発現 a)ＦXIIIａ発現プラスミドの構成 ＦXIII−１３はｌａｃプロモータに関して正しい配向に
おいて、及びｌａｃＺα−ペプチドに対して正しい読取
枠内にＦXIIIａｃＤＮＡ挿入を有する。従って、ｐＦXI
II−１３はＥ．ｃｏｌｉにおけるＦXIIIａ融合蛋白質の
合成を誘発することができる。この蛋白質の分子量は、
天然ＦXIIIａの７３２個のアミノ酸と共に１６個のベク
ターコード化アミノ酸プラス５′非−コード化領域によ
り特定される２８個のアミノ酸よりなる。これらの４４
個の追加のアミノ酸は融合蛋白質のＮ−末端に位置す
る。この蛋白質の予想される分子量は８５，２５０Ｄ
（表４）である。

ｌａｃプロモータの代りにより効率的なｔｒｐ／ｌａｃ
ハイブリッドプロモータを用いる発現プラスミドを引続
き構成した。このために、ｐＫＫ２３３−２〔アマン及
びブロシュウス（Amann and Brosius）、ジーン(Gene)4
0(1985).183-190 〕をＥｃｏＲＩで切断し、Ｂａ１３１
で処理した（第３図）。このＤＮＡを次いでＰｖｅIIで
切断し、２８００塩基対の大きさの断片をＰＡＡゲル上
で精製した。この断片をＢｇ１IIリンカー（５′−ＣＡ
ＧＡＴＣＴＧ）の存在下において再連結した。得られた
プラスミドｐＴｒｃ８９−１（第３図）をＮｃｏＩ及び
ＨｉｎｄIIIで切断し、合成リンカー ５′ＣＡＴＧＧＡＡＴＴＣＧＡ３′ ３′ＣＴＴＡＡＧＣＴＴＣＧＡ５′ をリガーゼ混合物中において２８００塩基対の断片と共
にインキュベートした。得られたプラスミドｐＴｒｃ９
６Ａ（第３図）をＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄIIIで切断
し、２８００塩基対の大きさの断片をゲル精製し、ｐＵ
Ｃ１８からの５５塩基対の大きさのＥｃｏＲＩ−Ｈｉｎ
ｄIIIリンカーと連結した。得られたプラスミドはＰＴ
ｃ９７Ａ（第３図）である。ｐＫＫ２３３−２に対照的
に、ｐＴｒｃ９７Ａはプラスミド内で一度だけ存在する
ＮｃｏＩ部位の下流にｐＵＣ１８からのポリリンカーを
有し、従って数多くのクローニング部位を有する。

ｐＦXIII−１３中にクローン化されたＦXIIIa ｃＤＮＡ
は、ＡＴＧ開始コドンから５′側に２１塩基対離れた所
（位置６１）にＰｓｔＩ部位を有する。次のＰｓｔＩ部
位は３′未翻訳領域（位置２３９８）に位置する。２３
３７塩基対長のＰｓｔＩ断片がｐＦXIII−１３から単離
され、ｐＴｒｃ９７ＡのＳｓｔＩ部位に連結された。Ｐ
ｓｔＩ断片を所望配向に有する得られたプラスミドはｐ
ＦXIII−Ｃ４（第３ａ図）である。ｐＦXIII−Ｃ４によ
り特性される期待されるＦXIII分子は２２個の追加のＮ
−末端アミノ酸を有し、それらの１５個はベクター−コ
ード化され及び７個はＦXIIIｃＤＮＡの５′非−コード
化領域により特定される。この蛋白質の予想される分子
量は８２，３８０Ｄ（表４）である。

トロンビンを用いて３７個のアミノ−末端アミノ酸を切
断するとＦXIIIａを活性形態に転換させる。既に活性化
されたその様なＦXIIIａ分子は治療上の興味があるの
で、トロンビン切断により短くすることのできるＦXIII
ａをＥ．ｃｏｌｉ中において発現する試みがなされた。
高い収率を得るために、クローニングは短くされたＦXI
IIａがＥ．ｃｏｌｉβ−ガラクトシダーゼ断片に融合し
たハイブリッド蛋白質の形態で発現されるように行なわ
れた。ｐＦXIII−１３からの約２７００ｂｐの大きさの
ＳｍａＩ−ＨｉｎｄIII断片を単離し、ＳｍａＩ及びＨ
ｉｎｄIIIで加水分解されたｐＢＤ２１Ｃ２０Ｈ中に連
結した。新たなプラスミドｐＭＢ２５９（第３ｂ図）に
おいて、アミノ酸Ｐｒｏ₃₇からＭｅｔ₇₃₂ のＦXIIIａに
対するｃＤＮＡはβ−ガラクトシダーゼの３７５のアミ
ノ末端アミノ酸に該当する読取枠内に位置し、それは合
成された融合蛋白質からトロンビン切断により活性ＦXI
IIａを得ることが可能であるようにトロンビン切断部位
Ａｒｇ₃₈／Ｇｌｙ₃₉を有する。

発現ベクターｐＢＤ２ＩＣ２０Ｈはｌａｃプロモーター
を有するｐＢＤ２〔ブローカー（Broker）ジーン・アナ
リティカル・テクノロジー(Gene Anal.Techn.)3(1986)5
3-57〕中にＢａｍＨｉ−ＨｉｎｄIII断片としてプラス
ミドｐＩＣ２０Ｈ（マーシュ等、上掲）の５８ｂｐより
なるポリリンカー領域を連結することにより構成され
た。

b)発 現 ｐＦXIII−１３、ｐＦXIII−Ｃ４或いはｐＭＢ２５９で
形成転換された菌株Ｄ２９Ａ１のＥ．ｃｏｌｉ細胞は期
待されたＦXIIIａ蛋白質を合成する能力があることが判
明した。プラスミドｐＦXIII−１３、ｐＭＢ２５９及び
ｐＦXIII−Ｃ４によるＦXIIIの発現はＩＰＴＧを用いて
誘発することができる。クーマシーブルー（Coomassie
blue）で染色されたＰＡＡゲル上のＥ．ｃｏｌｉ Ｄ２
９Ａ１（ｐＦXIII−１３）及びＤ２９Ａ１（ｐＦXIII−
Ｃ４）のＩＰＴＧ誘発後の蛋白質抽出物の比較はＦXIII
融合蛋白質の期待された分子量を示した。「４４ａａＦ
XIII融合蛋白質」の推定発現率は「２２ａａＦXIII融合
蛋白質」のそれの約５倍である。

又、ｐＦXIII−１３及びｐＦXIII−Ｃ４により特定され
るＦXIIIａ分子は生物学的活性を有することが判明し
た。これに対して、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｄ２９Ａ１対照例の
抽出物中にはＦXIII活性は見出されなかった。クロット
安定性アッセイ〔カルギス、ベルクマイヤーの酵素分析
法第５巻酵素３：ペプチダーゼ、プロティナーゼ及びそ
れらの阻害剤、４００−４１０頁（Karges,in Bergmeie
r,Methods of Enzymatic Analysis,Volume 5,,Enzymes
3:Peptidases,Proteinase and their Inhibitors,page
400-410）所収〕において見出された活性はＥ．ｃｏｌ
ｉ Ｄ２９Ａ１（ｐＦXIII−１３）に対してはＥ．ｃｏ
ｌｉ培養液（ＯＤ₂₅₀ ＝１．５）に基づいて５μｇ／
であり、Ｄ２９Ａ１（ｐＦXIII−Ｃ４）に対しては１５
μｇ／である。

ＦXIIIａ−特異的ＥＬＩＳＡにおいて見出された因子XI
IIの量はｐＦXIII−１３に対してはＥ．ｃｏｌｉ培養液
に基づいて１．５mg／であり、ｐＦXIII−Ｃ４に対し
ては３５mg／である。生物学的アッセイ及びＥＬＩＳ
Ａにおいて測定されたＦXIIIの量の間の食い違いは、
Ｂ．ｃｏｌｉ細胞中のＦXIIIの主たる部分（＞９０％）
が生物学的に不活性であり７Ｍ尿素のみに溶解する不溶
性沈澱の形態であるという事実に由来するものである。
Ｅ．ｃｏｌｉ抽出液中に存在するＦXIII分子の可溶性画
分はオークタロニー試験〔Ouchterlony 、プログレス・
イン・アラージー(Progr.Allergy)5(1958)1〕において
胎盤から単離されたＦXIIIのそれに実質的に同一である
沈澱曲線を示す。

不溶性蛋白質凝集物の形態でのＥ．ｃｏｌｉ内の真核生
物蛋白質の発現は数個の蛋白質について既に説明されて
いる。これらの蛋白質はその様な凝集物からカオトロピ
ック剤を用いて溶出することができ、適当再変成条件に
よりそれらの生物学的に活性形態に転換することができ
る。

４．ＦXIIIの酵母における発現 酵母から遺伝子操作により得られる生物学的に活性なＦ
XIIIの合成はＦXIIIをコードするｃＤＮＡを酵母内にお
いて自律的に複製する能力を有する発現ベクター中に導
入することにより達成された。組換えクローンの抽出物
からＦXIII−活性蛋白質を単離することが可能であっ
た。

酵母を生育する条件及び分子生物学的方法は、ディロン
等〔Dillon et al．「組換えＤＮＡ方法」（Recombinan
t DNA Methodolgy). John Wiley & Sons,New York(198
5）〕及びマニアティス等（Maniatis et al．上掲）に
説明されている。

ＦXIIIｃＤＮＡは約２７００ｂｐの大きさのＨｉｎｄII
I断片としてベクターｐＦXIII−１３から単離され、ベ
クターｐＡＡＨ５〔アメラー(Ammerer)、メソッド・オ
ブ・エンザイモロジー（Meth.Enzymol.)101(1983)192-2
01〕のＨｉｎｄIII部位中にクローン化された。即ち、
得られたプラスミドｐＨＢ２４０（第４図）中のＦXIII
ｃＤＮＡはアルコールデヒドロゲナーゼの遺伝子発現信
号を含有する強ＡＤＨＩプロモータの制御下にある。こ
のプラスミドｐＭＢ２４０をパン酵母、サッカロミセス
・セレビシエ（Saaccharomyces cerevisias)、株Ｌｅｕ
２−３、Ｐｅｐ４−３中にイトウ等〔Itoh et al．ジヤ
ーナル・オブ・バクテリオロジー(J.Bacteriol.)153(19
83). 163-168 〕の方法により形質転換し、及びＬｅｕ
^＋形質転換体をＹＮＢ最小培地上で選択した。形質酵母
細胞の一つのコロニーを用いてＹＮＢ培地を有する液体
培養液に接種した。３０℃で２日間生育後複合ＹＰＢ培
地中への転移を行ない、及び更に３日後細胞を遠心分離
により取出し、１００ｍＭクエン酸ナトリウムを含有す
る等張塩溶液（ｐＨ７．２）中でガラスビーズミルによ
り破壊した。細胞抽出物をSorvall 高速遠心分離器内の
ＳＳ３４ローター内で２０，０００rpm において４℃で
１時間高速遠心分離にかけた。

Ｓ．セレビシエ（ｐＭＢ２４０）の細胞を除去した上澄
液をウェスタンブロット法により分析した。胎盤からの
ＦXIIIと同一位置に検出することのできるバンドに加え
て、約１１６，０００Ｄの蛋白質が用いられた抗−ＦXI
II血清と特異的に反応した。これか酵母中に形成された
ＦXIIIの一部がグリゴシル化されたことを証明する。蛋
白質のグリコシル化はしばしば蛋白質、特に血漿蛋白
質、の半減期を延長する因子である。加えて、蛋白質の
側鎖は血漿蛋白質例えばアンチトロンビンIIIの活性を
増大するか或いは作用の期間を延長することがある。酵
母において発現され、且つ胎盤から得られたＦXIIIとは
対照的にグリコシル化されているか或いはその他の何等
かの形で翻訳後修飾を行なったＦXIIIは、増大した活性
のため胎盤からのＦXIIIに対して利点を有し得る。

細胞を除去した上澄液をＥＬＩＳＡによりＦXIIIについ
て調べ、ＦXIII濃度が酵母培養液に基づき１５０ｎｇ／
mlであることが判明した。ＦXIIIの生物学的活性は上掲
のカルゲスの方法により求められ、ＥＬＩＳＡにおいて
測定された濃度を確認した。パン酵母から得られたＦXI
IIの生物学的活性は抗−ＦXIII抗体により特異的に阻害
することができたので、非−特異的ＦXIII様活性を酵母
蛋白質により除外することが可能であった。

５．ＦXIIIａの動物細胞における発現 a)動物細胞のための発現ベクターの構成 発現ベクターｐＳＶＡ ＳＴＯＰ１は***特許出願Ｐ３
６ ２４ ４５３・８（このベクターの合成に関するこ
の出願の実施例１は抜粋して付表に再現した）に提案さ
れている。このプラスミドの他に動物細胞におけるＦXI
IIａの発現のためにベクターｐＺＥＴ４（下記参照）及
びドロソフィラ（Drosophila）熱衝撃蛋白質７０プロモ
ータ〔ウルム等(Wurm et al.)、 Proc.Natl.Acad. Sci.
USA 83(1986)5414-5418〕を有するｐＳＰ６ＨＳ９を用
いた。

ｐＺＥＴ４（第５図）：プラスミドｐＳＶＡ ＳＴＯＰ
１をＢａｍＨＩで切断し、２．６ｋｂの大きさでＳＶ４
０初期プロモーターを有するベクター断片を単離した。
ｐＳＶ２ｄｈｆｒ（リー等（Lee et al.）、ネーチャー
(Nature)294(1981)228-232 〕からの０．８５ｋｂの大
きさのＢｇｌII−ＢａｍＨＩ断片をこの様にして予備処
理されたベクター中に連結し、その結果プラスミドｐＺ
ＥＴ４が得られた。ｐＳＶ２ｄｈｆｒからの０．８５ｋ
ｂ断片上にはエキソン−イントロン連結からのｍＲＮＡ
スプライス部位及びＳＶ４０ＤＮＡからのｔ抗原に対す
る遺伝子のポリアデニル化部位が位置している。

b)動物細胞のためのＦXIIIａ発現ベクターの構築 ｐＳＶＦ１３（第５ａ図）：発現ベクターｐＳＶＡ Ｓ
ＴＯＰ１をＨｉｎｄIII及びＸｂａＩで切断した。約
２．７ｋｂの大きさのＦXIIIａｃＤＮＡを有するｐＦXI
II−１３からのＨｉｎｄIII−ＸｂａＩ断片をこの様に
して処理されたベクター中に連結した。ｐＳＶＦ１３上
にＦXIIIａ転写単位はｍＲＮＡスプライス部位を有しな
い。

ｐＺＦ１３（第５ｂ図）：約２．７ｋｂの大きさのＦXI
IIａｃＤＮＡを有するＨｉｎｄIII断片をプラスミドｐ
ＦXIII−１３から単離した。得られた５′突出末端を相
補鎖内にＤＮＡポリメラーゼＩ（クレノウ断片）で埋填
することにより除去した。発現ベクターｐＺＥＴ４を独
特のＸｂａＩ部位において切断することにより線型化し
た。得られた５′突出末端を同様に相補鎖内においてＤ
ＮＡポリメラーゼＩ（クレノウ断片）により埋填するこ
とにより除去した。この埋填ベクターと内充填ＦXIIIａ
ｃＤＮＡ断片の連結の結果、ＦXIIIａ発現プラスミドｐ
ＺＦ１３が得られた。ｐＳＶＦ１３におけると同様に、
ＦXIIIａｃＤＮＡはＳＶ４０初期プロモータの転写制御
下にあるが、しかし、ｍＲＮＡスプライス部位を備えて
いる。

ｐＨＳＦ１３（第５ｃ図）：プラスミドｐＰＶＦ１３を
ＥｃｏＲＩにより部分的に消化し、約２．９ｋｂの大き
さのＦXIIIａｃＤＮＡに引続き初期転写のためのＳＶ４
０ポリアデニル化部位を有する断片を単離した。この断
片を熱衝撃蛋白質７０プロモータの下流のプラスミドｐ
ＳＰ６ＨＳ９の独特のＥｃｏＲＩ部位中に連結した。

c)ＣＨＯ（支那ハムスター卵巣）ｄｈｆｒ⁻細胞の共ト
ランスフェクションのためのＤＨＦＲ発現ベクター ＤＨＦＲベクターｐＳＶ２ｄｈｆｒ（リー等、上掲）或
いはプロモータのないＤＨＦＲプラスミドｐＳＶＯＡｄ
ｈｆｒ（***特許出願Ｐ３６ ２４ ４５３．８、参考
例参照）をＣＨＯ ｄｈｆｒ⁻細胞における説明された
ＦXIIIａ発現ベクターによる共トランスフェクションに
用いた。両ベクター共、マウスからのＤＨＦＲｃＤＮＡ
を有する。

d)ＢＨＫ（ベビーハムスター腎臓）細胞の共トランスフ
ェクションのためのＧ４１８耐性を与えるベクター 説明されたＦXIIIａ発現ベクターをＢＨＫ細胞内でベク
ターｐＲＭＨ１４０〔フジャック等(Hudziak et al.)ce
ll 31(1982).137-146〕で共トランスフェクションを行
なった。

e)ＣＨＯ細胞内におけるＦXIIIａの発現 プラスミドｐＺＦ１３とＤＨＦＲベクターｐＳＶ２ｄｈ
ｆｒの組み合わせ及び発現プラスミドｐＳＶＦ １３と
ＤＨＦＲベクターｐＳＶＯＡｄｈｆｒの組み合わせによ
る共トランスフェクションを、リン酸カルシウム沈澱法
〔グレアム及びファンデルＥｂ（Graham andvan der Eb
）、ウイロロジー(Virology)52(1973 ) 456-467 〕を
用いてＣＨＯ ｄｈｆｒ⁻細胞で行なった。これは５μ
ｇのＤＨＦＲベクター（ｐＳＶ２ｄｈｆｒ或いはｐＳＶ
ＯＡｄｈｆｒ）を混合され、及び共沈された２０μｇの
特定のＦXIIIａ発現プラスミド（ｐＺＦ１３或いはｐＳ
ＶＦ１３）を伴うものであった。この共沈澱物を上記ト
ランスフェクションに用いた（２５cm²培養瓶中０．５
×１０^６細胞）。３日後、細胞をトリプシン化し、３個
の６０mmのペトリ皿に移し、選択培地（グリシン、ヒポ
キサンチン或いはチミジンを含有しない）と混合した。
これらの条件下に生残る細胞はＤＨＦＲ遺伝子と安定な
トランスフェクションを行なったもののみである。トラ
ンスフェクトされた細胞のコロニーは１−３週間後にペ
トリ皿上に目に見えるようになる。この方法により次の
トランスフェクション速度が達成された： ｐＳＶ２ｄｈｆｒ ５×１０^−５／プレート ｐＳＶＯＡｄｈｆｒ １×１０^-5／プレート。

個々のクローンを単離し、グリシン、ヒポキサンチン或
いはチミジンを含有しない培地内で増殖した。

約３ｎｇ／ｍｌの検出下限を有する特別のＥＬＩＳＡを
用いて個々のクローンの培養上澄液及び細胞溶解物中の
ＦXIIIａを検出した。培養上澄液はＥＬＩＳＡにおいて
そのまま使用した。細胞溶解物は次のようにして調製し
た： ２５cm^２培養瓶中の集密細胞を４０ｍＭ ｔｒｉｓ Ｈ
Ｃｌ（ｐＨ７．４）、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１５０ｍＭ
ＮａＣｌ中で２回洗浄し、１５０μの０．２５Ｍ ｔ
ｒｉｓ・ＨＣｌ（ｐＨ７．８）、５ｍＭ ＤＴＴ、２％
グリセロール、０．２％洗剤（Triton x 100）中にと
り、及び３回冷凍及び解凍することにより溶解した。

細胞の不溶性成分は遠心分離により除去した。この溶解
物をＥＬＩＳＡに使用するために１：２．５に稀釈し
た。説明された検出方法をプラスミドｐＺＦ１３／ｐＳ
Ｖ２ｄｈｆｒの組合わせに対して１７クローンに適用し
て、ＦXIIIａを発現する一つのクローン（ＣＨＯ５９−
５−Ｃ７）が見出された。プラスミドｐＳＶＦ１３／ｐ
ＳＶＯＡｄｈｆｒで共トランスフェクション及び１２ク
ローンの分析後、更にＦXIIIａ−発現クローン（ＣＨＯ
６０−３−Ｃ１）が検出された。これらの両者の陽性ク
ローンを用いて培地内及び溶解物中において同一の相対
的量でＦXIIIａを検出することが可能であった。ＦXIII
ａを生成する系統の発現速度を定量的に求めるために次
の標準的操作を行なった： ０．５×１０^６個の細胞を２５cm^２培養瓶内の５mlの培
地中で培養した。この培地は２４時間後交換した（５m
l）。更に２４時間後培地を除去し、細胞カウント数を
求め溶解物を調製した。以後に述べる全ての発現速度
（ｎｇ／１０^６細胞／２４時間）に対して試験の終りに
おける２５cm^２瓶当りの細胞カウント数は１＋０．２５
×１０^６細胞数であった。次の表は、説明された方法で
試験された基本クローンの発現速度を示す： ＳＤＳ電気泳動に続いてクローンＣＨＯ５９−５−Ｃ７
及びクローンＣＨＯ６０−３−Ｃ１の溶解物及び上澄液
のＦXIIIａ−特異的免疫ブロッティングを行なったとこ
ろ、いずれの場合にもヒト胎盤から単離された蛋白質の
分子量を有する一つのバンドが反応を示した。

クローンＣＨＯ５９−５−Ｃ７を遺伝子増幅のためにメ
トトレキセート（Ｍｔｘ）の増大する濃度に曝した。１
０ｎＭ Ｍｔｘの濃度及び４移動適応時間で出発し、培
地中のＭｔｘ濃度を５０ｎＭに増大した。次の発現速度
が標準的操作において求められた： f)ＢＨＫ細胞におけるＦXIIIａの発現 各々２０μｇのＦXIIIａ発現プラスミドｐＺＦ１３、ｐ
ＳＶＦ１３及びｐＨＳＦ１３をＢＨＫ細胞内において例
５e)において説明されるリン酸カルシウム沈澱法により
５μｇのＧ４１８耐性をコードするプラスミドｐＲＭＨ
１４０で共トランスフェクションを行なった。３日後、
細胞をトリプシン化し、３個の６０mmペトリ皿に移し、
及び４００μｇ／mlのＧ４１８を含有する選択培地と混
合した。１２日後約２００−３００のＧ４１８耐性コロ
ニーが各ペトリ皿に生育していた。全部のクローンをト
リプシン化し、２５cm²培養瓶中の合一したクローン
（ＣＣ）（５mlの培地）として転移させた。

ｐＺＦ１３及びｐＳＶＦ１３でトランスフェクションさ
れた細胞の場合には、８０−１００％の集密度に到達し
た際にＦXIIIａを特異的ＥＬＩＳＡを用いて培地中及び
関連溶解物中で決定した（例５e)参照）。ｐＨＳＦ１３
でトランスフェクションされ同様に８０−１００％の集
密度に到達した合一したクローンを４２℃に予備加熱し
た新たな培地と混合し、４２℃で１時間インキュベート
した。培地をもう１回３７℃で平衡化された新鮮な培地
と交換した後、細胞を３７℃で２４時間維持した。これ
らの培地及び溶解物を次いで上記の如くそれらのＦXIII
ａの含量について調べた。下記表は各種合一クローンに
対するＦXIIIａの細胞分布をまとめて示すものである。

培地内に存在するＦXIIIａに関する発現速度は例５e)に
おいて説明した標準的操作により個々の合一クローンに
対して求めた。以下に述べる全ての発現速度（ｎｇ／１
０^６細胞／２４時間）に対して試験の終りにおける２５
cm^２瓶当りの細胞カウント数は４．５±０．５×１０^６
細胞であった。

これまでに説明されたトランスフェクションされたＢＨ
Ｋ系統は生産しない或いはそれらの発現速度が異なる細
胞を含む混合物であったので、引続いてクローンを単離
することにより高発現速度を有する遺伝的に均一な細胞
系統を単離する試みがなされた。この目的のためには、
特別の合一されたクローンからの細胞を１細胞／ウェ
ル、２細胞／ウェル又は４細胞／ウェルの濃度でマイク
ロタイタープレート上に置いた。１個のみのクローンが
生育したウェルからの上澄液をＦXIIIａ−特異的ＥＬＩ
ＳＡにより分析した。最高発現速度のクローンを２５cm
^２培養瓶内で増殖させ、それらの発現速度を上記一般的
操作により検討した。以下の表はＢＨＫ−ＭＫ１（ｐＺ
Ｆ１３）を上記方法により単離することにより得られた
クローンの発現速度を示す。

ＢＨＫ細胞系統ＭＫ１−Ｅ２を例にとり、これらの細胞
により合成されたＦXIIIａ分子が生物学的活性を有する
ことも示された。用いられたＢＨＫ ＭＫ１−Ｅ２系統
及び非−トランスフェクテッドＢＨＫ系統（陰性対照
例）を１．５mlの２％グリセロールを含有する０．２５
Ｍ ｔｒｉｓ．ＨＣｌ（ｐＨ７．８）にとった。これら
の細胞を３回冷凍及び解凍することにより溶解した後、
Ｄｏｕｎｃｅホモジナイザー内で処理した。不溶性構成
成分を遠心分離により除去後、溶解物を生物学的活性に
用いた（例３参照）。次のＦXIIIａ活性が見出された： ＢＨＫ ＭＫ１−Ｅ２ ０．０６単位／１０^８ 細胞 ＢＨ中（トランスフェ ０単位／１０^８細胞 クションされない） 参考例 独国特許出願Ｐ３６ ２４・４５３．８からの例１ a)動物細胞のための発現ベクターの構成 プラスミドｐＶＳ２ｄｈｆｒ（リー等、上掲）をＨｉｎ
ｄIII及びＥｃｏＲＩで切断し、ＳＶ４０初期プロモー
タを有する２．６５ｋｂベクター断片を単離した。ｐＵ
Ｃ１２ＳＴＯＰ〔ブローカー及びアマン（Broker and A
mann）、アプライド・マイクロバイオロジカル・バイオ
テクノロジー（Appl.Microbiol.Biotechnol.)23(1986)2
49-296〕からの６７ｂｐ ＨｉｎｄIII−ＥｃｏＲＩ断
片をこの様にして予備処理されたベクター中に連結し、
その結果プラスミドｐＳＶ２ＳＴＯＰを得た。ｐＵＣ１
２ＳＴＯＰからの６７ｄｐ断片上には全ての三つの読取
枠内に翻訳停止コドンがある。ｐＳＶ２ＳＴＯＰをＳａ
ｃＩで線型化し、得られた３′突出末端をＤＮＡポリメ
ラーゼＩの３′→５′エキソヌクレアーゼ活性を用いて
除去した。次いでＥｃｏＲＩによる消化を行なった。初
期のトランスクリプトに対するＳＶ４０ポリアデニル化
信号を有するｐＢＢ３〔Ｂ．ブラショト等（B.Bouracho
t et al.）、エンボ・ジャーナル(EMBO J.)1(1982)895-
900〕からの１３３ｂｐの大きさのＥｃｏＲＩ−Ｈｐａ
Ｉ断片と連結後、発現ベクターｐＳＶＡ ＳＴＯＰ１を
得ることが可能であった。

このポリアデニル化部位は又ベクターｐＩＧ６（ブラコ
ット等、上掲）からも単離することができる。全く同一
の方法によりＳＶ４０遺伝子から１３３ｂｐＢａｍＨＩ
−ＨｐａＩ断片を単離し、ＢａｍＨＩ切断部位に埋填
し、及びＥｃｏＲＩリンカーを付着することが可能であ
る。

ｐＳＶＡ ＳＴＯＰ１はこの様にＳＶ４０初期プロモー
タと初期のトランスクリプトに対してＳＶ４０ポリアデ
ニル化信号の間に３個の独特の制限部位（ＨｉｎｄIII
−ＳａｌＩ−ＸｂａＩ）を有するクローニングポリリン
カー及び全ての三つの読取枠内に翻訳停止を有する配列
を有する。

c)共トランスフェクションのためのＤＨＦＲ発現ベクタ
ーの構成 共トランスフェクションに用いられるＤＨＦＲベクター
の出発点はプラスミドｐＭＴＶｄｈｆｒであった（リー
等、上掲）。ｐＭＴＶｄｈｆｒはＢｇｌIIで切断し、Ｄ
ＮＡの突出５′末端をＤＮＡポリメラーゼＩ（クレノウ
断片）を用いて埋填した。ＥｃｏＲＩで消化後、４．４
７ｋｂの大きさの断片を単離し、ｐＢＢ３（ブラコット
等、上掲）からの１３３ｂｐＥｃｏＲＩ−ＨｐａＩ断片
と連結させた。この新しいプラスミドｐＭＴＶＡｄｈｆ
ｒはＭＭＴＶ−ＬＴＲ及び初期のトランスクリプトのた
めのＳＶ４０ポリアデニル化部位を側面に配置されたマ
ウスＤＨＦＲｃＤＮＡを有する。

ｐＳＶＯＡｄｈｆｒは大きさが１４５０ｂｐでＭＭＴＶ
−ＬＴＲを有するＨｉｎｄIII断片を削除することによ
りｐＭＴＶＡｄｈｆｒから得られた。

ｐＭＴＶＡｄｈｆｒ或いはｐＳＶＯＡｄｈｆｒはいづれ
もｍＲＮＡスプライス部位を有しない。

【図面の簡単な説明】

第１図はＦXIIIａをコードするｃＤＮＡ（コード化領域
を斜線で示す）及びこの下に単離及び特性付けられたク
ローンのＤＮＡ領域を示す説明図である。 第２図は発現プラスミドｐＦXIII−１３の構成を示す説
明図である。明らかにするために、この図においては出
発プラスミドｐＩＣ１９Ｈ−１２．１及びｐＩＣ１９Ｈ
−１１．１並びにそれらの直下に位置するＤＮＡ断片は
一本鎖断片から構成された生成物ｐＦXIII−１３と同様
に二重線で表わされる。 第３図はプラスミドｐＴｒｃ９７Ａの構築を示し、第３
ａ図はｐＴｒｃ９７Ａ及びｐＦXIII−１３からのｐＦXI
II−Ｃ４の構築を示し、第３ｂ図はｐＦXIII−１３及び
公知のプラスミドｐＩＣ２０Ｈ及びｐＢＤ２からのｐＭ
Ｂ２５９の構築を示す説明図である。 第４図はｐＦXIII−１３及び公知のプラスミドｐＡＡＨ
５からのプラスミドｐＭＢ２４０の構築を示す説明図で
ある。 第５図は公知のプラスミドｐＳＶ２ｄｈｆｒ及びプラス
ミドｐＳＶＡ ＳＴＯＰ１からのｐＺＥＴ４の構築を示
し、第５ａ図はｐＳＶＡ ＳＴＯＰ１及びｐＦXIII−１
３からのｐＳＶＦ１３の構築を示し、第５ｂ図はｐＺＥ
Ｔ４及びｐＦXIII−１３からのｐＺＦ１３の構築を示
し、第５ｃ図はｐＳＶＦ１３及び公知のプラスミドｐＳ
Ｐ６Ｈ６９からのｐＨＳＦ１３の構築を示す説明図であ
る。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:865） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91）

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】下記で表されるヒト血液凝固因子XIIIa の
   アミノ酸配列をコードするＤＮＡ。
2. 【請求項２】下記のコード鎖を有する、特許請求の範囲
   第１項記載のＤＮＡ。