JPH0640825B2 - 遺伝子操作による因子XIIIaの製造 - Google Patents
遺伝子操作による因子XIIIaの製造Info
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- JPH0640825B2 JPH0640825B2 JP62057902A JP5790287A JPH0640825B2 JP H0640825 B2 JPH0640825 B2 JP H0640825B2 JP 62057902 A JP62057902 A JP 62057902A JP 5790287 A JP5790287 A JP 5790287A JP H0640825 B2 JPH0640825 B2 JP H0640825B2
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/40—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against enzymes
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- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
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Description
【発明の詳細な説明】 本発明は、遺伝子操作による因子XIIIa の製造に関する
ものである。
ものである。
凝固因子XIIIは脊椎動物における天然の血液凝固過程に
おける「凝固カスケード」の最終構成員である。「活性
化フィブリン−安定化因子」、「フィブリノリガーゼ」
或いは「血漿トランスグルタミナーゼ」とも称され、及
び以後「FXIIIa」とも称される因子XIIIの酵素的に活
性な形態、因子XIIIaは、分子内架橋による先在する血
栓におけるフィブリン単位の融合を触媒する〔ローラン
ド等(Lorand et el.)メソッズ・イン・エンザィモロ
ジー(Methods in Enzymology 80(1981), 333-341 ;カ
ーティス等(Curtis et al.)Annals New York Academy
of Sciences 1983,567-576〕。血漿からの第XIII因子
の分子量は約300kDである〔ローウィ等(Loewy et
al.)、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミスト
リー(J.Biol.Chem.)236(1961)2634〕。活性サブユニ
ットFXIIIaの分子量は約80kDである〔ボーン及び
シュウィック(Bohn and Schwick)、Arzneimittelfors
chung 21(1971)14322〕。因子XIIIの活性化に際し、ト
ロンビンは、前駆体から、約4kDの大きさであって、
36個のアミノ酸の公知の配列を有するペプチドを***
する(タカギ及びドゥーリトル(Takagi and DooLittl
e)、バイオケミストリー(Biochemistry)13(1974)750-7
56〕。更に、4個のアミノ酸を有する配列が公知である
〔ホルブルック等(Holbrook et al.)、バイオケミカ
ル・ジャーナル(Biochem.J.)135(1973)901-903 〕。
おける「凝固カスケード」の最終構成員である。「活性
化フィブリン−安定化因子」、「フィブリノリガーゼ」
或いは「血漿トランスグルタミナーゼ」とも称され、及
び以後「FXIIIa」とも称される因子XIIIの酵素的に活
性な形態、因子XIIIaは、分子内架橋による先在する血
栓におけるフィブリン単位の融合を触媒する〔ローラン
ド等(Lorand et el.)メソッズ・イン・エンザィモロ
ジー(Methods in Enzymology 80(1981), 333-341 ;カ
ーティス等(Curtis et al.)Annals New York Academy
of Sciences 1983,567-576〕。血漿からの第XIII因子
の分子量は約300kDである〔ローウィ等(Loewy et
al.)、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミスト
リー(J.Biol.Chem.)236(1961)2634〕。活性サブユニ
ットFXIIIaの分子量は約80kDである〔ボーン及び
シュウィック(Bohn and Schwick)、Arzneimittelfors
chung 21(1971)14322〕。因子XIIIの活性化に際し、ト
ロンビンは、前駆体から、約4kDの大きさであって、
36個のアミノ酸の公知の配列を有するペプチドを***
する(タカギ及びドゥーリトル(Takagi and DooLittl
e)、バイオケミストリー(Biochemistry)13(1974)750-7
56〕。更に、4個のアミノ酸を有する配列が公知である
〔ホルブルック等(Holbrook et al.)、バイオケミカ
ル・ジャーナル(Biochem.J.)135(1973)901-903 〕。
本発明は、遺伝子操作によるFXIIIa の製造に関し、よ
り具体的には本発明は、FXIIIa をコードするDNAに
関するものである。本発明に関連するものとして、後述
するような遺伝子操作によるFXIIIa の製断方法、これ
に必要なmRNA、それから得られるcDNA、このc
DNAの全部或いは一部を含有するDNA構造及びベク
ター、このタイプのDNAで形質転換された細胞及びこ
れらの細胞により発現されたポリペプチドがある。又、
FXIIIa のアミノ酸配列の部分配列、それにより得られ
た特異的抗体、これらの抗体から製造された診断補助
品、及び抗体カラム及びその様なカラムを用いて得られ
たポリペプチドも本発明に関連する。本発明は、FXIII
a をコードするDNA或いはRNAの全部或いは一部を
含有する診断補助品、及びこのタイプの診断補助品を用
いて体液及び組織を検査する診断に利用することもでき
る。更に、本発明の他の側面及びその好ましい実施態様
は以下に詳細に説明され、及び特許請求の範囲に規定さ
れる。
り具体的には本発明は、FXIIIa をコードするDNAに
関するものである。本発明に関連するものとして、後述
するような遺伝子操作によるFXIIIa の製断方法、これ
に必要なmRNA、それから得られるcDNA、このc
DNAの全部或いは一部を含有するDNA構造及びベク
ター、このタイプのDNAで形質転換された細胞及びこ
れらの細胞により発現されたポリペプチドがある。又、
FXIIIa のアミノ酸配列の部分配列、それにより得られ
た特異的抗体、これらの抗体から製造された診断補助
品、及び抗体カラム及びその様なカラムを用いて得られ
たポリペプチドも本発明に関連する。本発明は、FXIII
a をコードするDNA或いはRNAの全部或いは一部を
含有する診断補助品、及びこのタイプの診断補助品を用
いて体液及び組織を検査する診断に利用することもでき
る。更に、本発明の他の側面及びその好ましい実施態様
は以下に詳細に説明され、及び特許請求の範囲に規定さ
れる。
FXIIIa断片のアミノ酸配列は、適当なプローブの構築
のために決定されたものである。対応するペプチド断片
は、臭化シアンを用いた蛋白質分解或いは切断により得
られた。その様な断片のアミノ酸配列についての知識に
基づき、一つの20mer及び一つの66merの二つ
のオリゴヌクレオチドプローブを合成した。
のために決定されたものである。対応するペプチド断片
は、臭化シアンを用いた蛋白質分解或いは切断により得
られた。その様な断片のアミノ酸配列についての知識に
基づき、一つの20mer及び一つの66merの二つ
のオリゴヌクレオチドプローブを合成した。
20merプローブにおいては、次のアミノ酸配列に対
する全ての理論的に可能なコドンを考慮に入れ、 Met−Met−Asp−Ile−Thr−Asp−T
hr 最後のアミノ酸の場合にはコドンの第3番目の位置を省
略した。従って、この20merプローブは48倍の縮
重体、即ち該アミノ酸配列をコードする48個の理論的
に可能なオリゴヌクレオチド全部の混合物である(後記
表1参照)。
する全ての理論的に可能なコドンを考慮に入れ、 Met−Met−Asp−Ile−Thr−Asp−T
hr 最後のアミノ酸の場合にはコドンの第3番目の位置を省
略した。従って、この20merプローブは48倍の縮
重体、即ち該アミノ酸配列をコードする48個の理論的
に可能なオリゴヌクレオチド全部の混合物である(後記
表1参照)。
66merのプローブは、次のアミノ酸配列に基づき、
統計学的データの助けを借りて選んだ〔レイズ(Lath
e)、ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー
(J.Molec.Biol.)183(1985)1-12〕(後記表2参照) Tyr−Gly−Gln−Phe−Glu−Asp−G
ly−lLe−Leu−Asp−Thr−Cys−Le
u−Tyr−Val−Met−Asp−Arg−Ala
−Gln−Met−Asp これらのプローブを用いてcDNAバンクのスクリーニ
ングを行なった。cDNAは、成熟ヒト胎盤からのmR
NAから調製した。なお、このmRNAを胎盤から単離
し、cDNAをそれから調製した。cDNAにEcoR
I末端を付与し、ファージベクターλgt10のEco
RI切断部位に連結した。上記プローブにより同定され
た陽性クローンλgt10−12を更に分析した(第1
図)。それ自体公知の方法による配列決定の結果、FXI
IIaをコードするDNA配列が得られた。
統計学的データの助けを借りて選んだ〔レイズ(Lath
e)、ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー
(J.Molec.Biol.)183(1985)1-12〕(後記表2参照) Tyr−Gly−Gln−Phe−Glu−Asp−G
ly−lLe−Leu−Asp−Thr−Cys−Le
u−Tyr−Val−Met−Asp−Arg−Ala
−Gln−Met−Asp これらのプローブを用いてcDNAバンクのスクリーニ
ングを行なった。cDNAは、成熟ヒト胎盤からのmR
NAから調製した。なお、このmRNAを胎盤から単離
し、cDNAをそれから調製した。cDNAにEcoR
I末端を付与し、ファージベクターλgt10のEco
RI切断部位に連結した。上記プローブにより同定され
た陽性クローンλgt10−12を更に分析した(第1
図)。それ自体公知の方法による配列決定の結果、FXI
IIaをコードするDNA配列が得られた。
このDNA配列を用いたcDNAバンクの再スクリーニ
ングの結果、5′−末端の方向及び3′−末端の両方向
に拡張するクローンを更に単離した。
ングの結果、5′−末端の方向及び3′−末端の両方向
に拡張するクローンを更に単離した。
第1図はFXIIIaをコードするDNA配列の制限地図を
示す。“N”はコード化領域のN−末端を示し及び
“C”はC−末端を示し、及び“A(89)”は89塩
基のポリ(A)配列を示す。この配列はFXIIIaのコー
ド化配列の全部を表わす。後記表3は、判明したDNA
配列(コード鎖)及びそれから演繹されたλgt10−
11及びλgt10−12からのクローン化cDNA断
片からのアミノ酸配列を示す。cDNAの全長さは、3
905塩基対である。タカギ及びドゥーリトル(上掲)
により見出された36個のアミノ酸を有するN−末端配
列はこの判明した配列内に存在する。この配列は表3に
おいてヌクレオチド位置88及び198の間に連続線に
より示されている。タカギ及びドゥーリトルにより見出
された配列に加えて、このcDNAは187−189の
ヌクレオチド位置においてバリンをコードする。この4
個のアミノ酸を有するホルブルック等(上掲)により見
出されたアミノ酸−Gly−Gln−Cys−Trp−
は位置1021−1032におけるcDNAによりコー
ドされている。この配列は同様に連続線により示されて
いる。加えて、20mer及び66merオリゴヌクレ
オチドプローブの位置は破線により示されている。20
merプローブは1507及び1526の位置の間にハ
イブリダイズし、66merプローブは766及び83
1の位置の間にハイブリダイズする。
示す。“N”はコード化領域のN−末端を示し及び
“C”はC−末端を示し、及び“A(89)”は89塩
基のポリ(A)配列を示す。この配列はFXIIIaのコー
ド化配列の全部を表わす。後記表3は、判明したDNA
配列(コード鎖)及びそれから演繹されたλgt10−
11及びλgt10−12からのクローン化cDNA断
片からのアミノ酸配列を示す。cDNAの全長さは、3
905塩基対である。タカギ及びドゥーリトル(上掲)
により見出された36個のアミノ酸を有するN−末端配
列はこの判明した配列内に存在する。この配列は表3に
おいてヌクレオチド位置88及び198の間に連続線に
より示されている。タカギ及びドゥーリトルにより見出
された配列に加えて、このcDNAは187−189の
ヌクレオチド位置においてバリンをコードする。この4
個のアミノ酸を有するホルブルック等(上掲)により見
出されたアミノ酸−Gly−Gln−Cys−Trp−
は位置1021−1032におけるcDNAによりコー
ドされている。この配列は同様に連続線により示されて
いる。加えて、20mer及び66merオリゴヌクレ
オチドプローブの位置は破線により示されている。20
merプローブは1507及び1526の位置の間にハ
イブリダイズし、66merプローブは766及び83
1の位置の間にハイブリダイズする。
本発明に例えば、変更された生物学的特性を有する蛋白
質をコードする変成された遺伝子の製造にこのコード化
cDNAを用いることが可能である。この目的のため
に、それ自体公知の方法で削除、挿入及び塩基交換を行
なうことが可能である。
質をコードする変成された遺伝子の製造にこのコード化
cDNAを用いることが可能である。この目的のため
に、それ自体公知の方法で削除、挿入及び塩基交換を行
なうことが可能である。
宿主の選択によりFXIIIaへの変成の性質に影響を及ぼ
すことも可能である。即ち、細菌においてはグリコシル
化がないのに対し、酵母細胞において生ずるそれは高等
真核生物におけるそれと異なる。
すことも可能である。即ち、細菌においてはグリコシル
化がないのに対し、酵母細胞において生ずるそれは高等
真核生物におけるそれと異なる。
FXIIIaのアミノ酸配列を知れば、ポリクローナル或い
はモノクローナル抗体の製造に抗原として作用すること
のできるアミノ酸の部分配列を通常の方法或いは遺伝子
操作により製造することが可能である。その様な抗体は
診断目的のみならず、それを用いてこの因子を他の蛋白
質に加えて含有する溶液からFXIIIaを除去することが
可能である抗体カラムの製造にも使用することができ
る。
はモノクローナル抗体の製造に抗原として作用すること
のできるアミノ酸の部分配列を通常の方法或いは遺伝子
操作により製造することが可能である。その様な抗体は
診断目的のみならず、それを用いてこの因子を他の蛋白
質に加えて含有する溶液からFXIIIaを除去することが
可能である抗体カラムの製造にも使用することができ
る。
このcDNA或いはその部分を用いて、直截的にゲノム
バンクからFXIIIaをコードするゲノムクローンを単離
することも可能であり、またそれを用いてそれを真核生
物細胞内に発現することが可能であるのみならず、更に
診断情報を得ことも可能である。
バンクからFXIIIaをコードするゲノムクローンを単離
することも可能であり、またそれを用いてそれを真核生
物細胞内に発現することが可能であるのみならず、更に
診断情報を得ことも可能である。
FXIIIa欠陥は、前駆体の酵素の活性形態に転換するこ
とができないことに大きく帰せられる各種症候群を生じ
得る。FXIIIaのcDNAについての知識によれば、今
やそれを用いて遺伝的変成が存在するか否かを直截的に
確立することが可能である診断補助品の製造することが
可能である。
とができないことに大きく帰せられる各種症候群を生じ
得る。FXIIIaのcDNAについての知識によれば、今
やそれを用いて遺伝的変成が存在するか否かを直截的に
確立することが可能である診断補助品の製造することが
可能である。
即ち、本発明に従えば例えば、ウィルスその他の蛋白質
による汚染の如何なる危険性もなしに高純度の因子XIII
aを製造することが可能である。今日まで存在していた
原料源としてヒト血漿或いは胎盤への依存はかくして克
服された。加えて、本発明によれば、貴重な診断補助品
及び従って遺伝的FXIIIa欠陥の分析ができるようにな
る。
による汚染の如何なる危険性もなしに高純度の因子XIII
aを製造することが可能である。今日まで存在していた
原料源としてヒト血漿或いは胎盤への依存はかくして克
服された。加えて、本発明によれば、貴重な診断補助品
及び従って遺伝的FXIIIa欠陥の分析ができるようにな
る。
以下、本発明を具体的により詳細に説明する。特に断り
のない限り、パーセントは量に関連しない場合には重量
に関する。
のない限り、パーセントは量に関連しない場合には重量
に関する。
本文で説明するものの他、次の省略を用いた: EDTA=エチレンジアミン四酢酸ナトリウム SDS =ドデシル硫酸ナトリウム DTT =ジチオスレイトール BSA =ウシ血清アルブミン。
例: 1.ヒト胎盤からのRNAの単離 RNAは成熟ヒト胎盤から得られた〔チルギン等(Chir
gwin et al.)、バイオケミストリー(Biochemistry)18(1
979)5294-5299の方法による〕約10gの胎盤組織を液
体窒素中で粉砕し、0.1Mのメルカプトエタノールを
含有する80mlの4Mグアニジウムチオシアネート中に
懸濁させ、ホモジナイザー(Ultraturrax)中で20,
000rpm にて90秒間処理した。溶解物を7000rp
m で15分間遠心分離し(Sorvall GSA ローター)、2
mlの1M酢酸及び60mlの無水エタノールを上澄液に添
加し、これを−20℃で一晩沈澱させた。6000rpm
及び−10℃において10分間沈降後、核酸を40mlの
7.5Mグアニジニウム塩酸塩(pH7.0)中に完全
に溶解し、1mlの1M酢酸及び20mlの無水エタノール
の混合物で沈澱した。DNAを除去するために、この沈
澱を半分の容量でもう一度繰返した。RNAを12mlの
H2Oに溶解し、1.2mlの4M酢酸カリウム及び24
mlの無水エタノールの混合物で沈澱させ、沈降させ、及
び最終的に10mlの水に再溶解した(g組織当り1m
l)。
gwin et al.)、バイオケミストリー(Biochemistry)18(1
979)5294-5299の方法による〕約10gの胎盤組織を液
体窒素中で粉砕し、0.1Mのメルカプトエタノールを
含有する80mlの4Mグアニジウムチオシアネート中に
懸濁させ、ホモジナイザー(Ultraturrax)中で20,
000rpm にて90秒間処理した。溶解物を7000rp
m で15分間遠心分離し(Sorvall GSA ローター)、2
mlの1M酢酸及び60mlの無水エタノールを上澄液に添
加し、これを−20℃で一晩沈澱させた。6000rpm
及び−10℃において10分間沈降後、核酸を40mlの
7.5Mグアニジニウム塩酸塩(pH7.0)中に完全
に溶解し、1mlの1M酢酸及び20mlの無水エタノール
の混合物で沈澱した。DNAを除去するために、この沈
澱を半分の容量でもう一度繰返した。RNAを12mlの
H2Oに溶解し、1.2mlの4M酢酸カリウム及び24
mlの無水エタノールの混合物で沈澱させ、沈降させ、及
び最終的に10mlの水に再溶解した(g組織当り1m
l)。
ポリ(A)を含有する胎盤mRNAの単離 ポリ(A)を含有するmRNAを単離するために、胎盤
RNAをLiCl中の2mlパスツェールピペット内でオ
リゴ(dT)−セルロースクロマトグラフィにより分別
した〔アビブ及びレーダー(Aviv and Leder)、Proc.N
atl.Acad.Sci.USA69(1973)1408-1412 〕。約5mgの胎盤
RNAを緩衝液〔500mM LiCl、20mM t
ris(pH7.5)、1mM EDTA、0.1%S
DS〕中においてカラムにかけた。ポリ(A)+RNA
はオリゴ(dT)−セルロースに結合したのに対し、ポ
リ(A)−RNAは再び溶出することができた。緩衝液
2〔100mM LiCl、29mM tris(pH
7.5)、1mM EDTA、0.1%SDS〕で洗浄
後、ポリ(A)+RNA(胎盤mRNA)をカラムから
緩衝液3〔5mM tris(pH7.5)、1mM
EDTA、0.05%SDS〕で溶出した。
RNAをLiCl中の2mlパスツェールピペット内でオ
リゴ(dT)−セルロースクロマトグラフィにより分別
した〔アビブ及びレーダー(Aviv and Leder)、Proc.N
atl.Acad.Sci.USA69(1973)1408-1412 〕。約5mgの胎盤
RNAを緩衝液〔500mM LiCl、20mM t
ris(pH7.5)、1mM EDTA、0.1%S
DS〕中においてカラムにかけた。ポリ(A)+RNA
はオリゴ(dT)−セルロースに結合したのに対し、ポ
リ(A)−RNAは再び溶出することができた。緩衝液
2〔100mM LiCl、29mM tris(pH
7.5)、1mM EDTA、0.1%SDS〕で洗浄
後、ポリ(A)+RNA(胎盤mRNA)をカラムから
緩衝液3〔5mM tris(pH7.5)、1mM
EDTA、0.05%SDS〕で溶出した。
更に精製するために、ポリ(A)+RNAを緩衝液1に
対して調製し、オリゴ(dT)−セルロース上で再クロ
マトグラフィを行なった。この第2回目の精製工程の
後、胎盤ポリ(A)+RNAの収率は使用RNAの約4
%であった。
対して調製し、オリゴ(dT)−セルロース上で再クロ
マトグラフィを行なった。この第2回目の精製工程の
後、胎盤ポリ(A)+RNAの収率は使用RNAの約4
%であった。
ヒト胎盤からのcDNA(胎盤cDNA)及び二本鎖c
DNA(dsDNA)の合成 cDNA合成前に、ポリ(A)を含有する胎盤mRNA
が完全であることのチェックを1.5%アガロースゲル
内で行なった。
DNA(dsDNA)の合成 cDNA合成前に、ポリ(A)を含有する胎盤mRNA
が完全であることのチェックを1.5%アガロースゲル
内で行なった。
次いで4μgの胎盤mRNAを65.5μのH2O中
に溶解し、70℃で10分間変成し、再び氷中で冷却し
た。20μのRT1緩衝液〔42℃における250m
M Tris(pH8.2)、250mM KCl、3
0mM MgCl2)、2.5μの20mM dNT
P(即ち全ての四つのデオキシヌクレオチドトリホスフ
ェート)、1μの1μg/mlオリゴ(dT)、1μ
の1M DTT、2μのRNAsin及び8μの逆
転写酵素(24U/μ)を添加後、cDNAを100
μ混合物中において42℃で90分間合成した。
に溶解し、70℃で10分間変成し、再び氷中で冷却し
た。20μのRT1緩衝液〔42℃における250m
M Tris(pH8.2)、250mM KCl、3
0mM MgCl2)、2.5μの20mM dNT
P(即ち全ての四つのデオキシヌクレオチドトリホスフ
ェート)、1μの1μg/mlオリゴ(dT)、1μ
の1M DTT、2μのRNAsin及び8μの逆
転写酵素(24U/μ)を添加後、cDNAを100
μ混合物中において42℃で90分間合成した。
二本鎖cDNA(dsDNA)は、ガブラー及びホフマ
ン(Gubler and Hoffmann)の方法〔ジーン(Gene)25(19
83)263-269〕により合成した。この合成は、cDNA合
成の直後に305.5μのH2O、80μのRT2
緩衝液〔100mM tris(pH7.5)、25m
M MgCl2、500mM KCl、50mM DT
T、250μg/mlBSA〕、2μのRNaseH
(2U/μ)、2.5μのE.coliDNAリガ
ーゼ(5U/μ)、5μの15mM β−NAD、
及び5μのDNAポリメラーゼI(5U/μ)を添
加し、15℃において5時間インキュベーションするこ
とにより行なった。この反応を熱不活性化(70℃、3
0分)により停止させた。
ン(Gubler and Hoffmann)の方法〔ジーン(Gene)25(19
83)263-269〕により合成した。この合成は、cDNA合
成の直後に305.5μのH2O、80μのRT2
緩衝液〔100mM tris(pH7.5)、25m
M MgCl2、500mM KCl、50mM DT
T、250μg/mlBSA〕、2μのRNaseH
(2U/μ)、2.5μのE.coliDNAリガ
ーゼ(5U/μ)、5μの15mM β−NAD、
及び5μのDNAポリメラーゼI(5U/μ)を添
加し、15℃において5時間インキュベーションするこ
とにより行なった。この反応を熱不活性化(70℃、3
0分)により停止させた。
55μの250μM dNTP、55μの10mM
tris(pH7.5)、10mM MgCl2、1
0μg/mlBSA、3μのT4DNAポリメラーゼI
(1U/μ)、2μNRaseH(2U/μ)及
び2μのRNaseA(2μg/ml)を添加後、反応
液を第2番目のDNA鎖上におけるポリメラーゼIの誤
った合成を修正するために37℃において更に30分間
インキュベートした(「修復反応」)。
tris(pH7.5)、10mM MgCl2、1
0μg/mlBSA、3μのT4DNAポリメラーゼI
(1U/μ)、2μNRaseH(2U/μ)及
び2μのRNaseA(2μg/ml)を添加後、反応
液を第2番目のDNA鎖上におけるポリメラーゼIの誤
った合成を修正するために37℃において更に30分間
インキュベートした(「修復反応」)。
dsDNAへのEcoRIリンカーの連結及びリンカー
の開裂 胎盤cDNAバンクを組立てるために、このdsDNA
にファージベクターλgt10のEcoRI切断部位に
おいてそれを連結できるようにEcoRI末端を付与し
た〔T.マニアティス等(T.Maniatis et a.).(1982)、
モレキュラー・クローニング(Molecular Cloning)、
実験室マニュアル、Cold Spring Harbor〕。この目的の
ために、dsDNAを a)dsDNAの内部EcoRI切断部位を保護するため
にEcoRIメチラーゼで処理し、 b)EcoRIリンカーを付与し、それらを c)次いでEcoRIで開環させた。
の開裂 胎盤cDNAバンクを組立てるために、このdsDNA
にファージベクターλgt10のEcoRI切断部位に
おいてそれを連結できるようにEcoRI末端を付与し
た〔T.マニアティス等(T.Maniatis et a.).(1982)、
モレキュラー・クローニング(Molecular Cloning)、
実験室マニュアル、Cold Spring Harbor〕。この目的の
ために、dsDNAを a)dsDNAの内部EcoRI切断部位を保護するため
にEcoRIメチラーゼで処理し、 b)EcoRIリンカーを付与し、それらを c)次いでEcoRIで開環させた。
a)について: dsDNAのメチラーゼ反応は、修復反応の直後に25
μの500mM EDTA(pH8.0)60μの
メチラーゼ緩衝液〔100mMNaOAc(pH5.
2)、2mgのS−アデノシル−L−メチオニン〕及び2
μのEcoRIメチラーゼ(20U/μ)を添加
し、37℃430分間インキュベートさせて行なった。
μの500mM EDTA(pH8.0)60μの
メチラーゼ緩衝液〔100mMNaOAc(pH5.
2)、2mgのS−アデノシル−L−メチオニン〕及び2
μのEcoRIメチラーゼ(20U/μ)を添加
し、37℃430分間インキュベートさせて行なった。
反応液をフェノールで抽出し、dsDNAを60μの
4N NaOAc及び1300μのエタノールで沈澱
させた。dsDNAを2回70%エタノールで洗浄し、
エーテルと振盪させて1回抽出し、乾燥させた。
4N NaOAc及び1300μのエタノールで沈澱
させた。dsDNAを2回70%エタノールで洗浄し、
エーテルと振盪させて1回抽出し、乾燥させた。
b)について: このEcoRI−メチル化dsDNAを88μのH2
Oに溶解し、10μのリガーゼ緩衝液〔500mM
tris(pH7.4)、100mM MgCl2、1
00mM DTT、10mMスペルミジン、10mM
ATP、1mg/mlBSA〕及び1μのT4DNAリガ
ーゼ(10U/μ)を添加後、1μのEcoRIリ
ンカー(0.5μg/μ) (pGGAATTCC及びpAGAATTCT)と15
℃において一晩かけて連結させた。
Oに溶解し、10μのリガーゼ緩衝液〔500mM
tris(pH7.4)、100mM MgCl2、1
00mM DTT、10mMスペルミジン、10mM
ATP、1mg/mlBSA〕及び1μのT4DNAリガ
ーゼ(10U/μ)を添加後、1μのEcoRIリ
ンカー(0.5μg/μ) (pGGAATTCC及びpAGAATTCT)と15
℃において一晩かけて連結させた。
c)について: このリガーゼ混合物の容量を6μのH2O、12μ
の10xEcoRI緩衝液及び2μのEcoRI(1
20U/μ)で120μに調合した。EcoRI消
化は、37℃で2時間行なった。
の10xEcoRI緩衝液及び2μのEcoRI(1
20U/μ)で120μに調合した。EcoRI消
化は、37℃で2時間行なった。
酢酸カリウム勾配及びdsDNAの大きさ選択による未
結合リンカーの除去 dsDNAから全ての未結合EcoRIリンカーを除去
するために、EcoRI反応混合物を全部酢酸カリウム
勾配(5−20%KOAc、1mM EDTA 1μ
/mlエチジウムブロマイド)にかけ、それを50,00
0rpm 及び20℃で3時間遠心分離した(Beckman SW 6
5/ローター)。この勾配を最初の五つの画分の容量が5
00μで残りの全てが100μとなるように下から
分別した。これらの画分を0.01容のアクリルアミド
(25mg/ml)及び2.5容のエタノールで沈澱させ、
70%強度のエタノールで1度洗浄し、乾燥し、及びそ
れぞれを5μのH2O中にとった。
結合リンカーの除去 dsDNAから全ての未結合EcoRIリンカーを除去
するために、EcoRI反応混合物を全部酢酸カリウム
勾配(5−20%KOAc、1mM EDTA 1μ
/mlエチジウムブロマイド)にかけ、それを50,00
0rpm 及び20℃で3時間遠心分離した(Beckman SW 6
5/ローター)。この勾配を最初の五つの画分の容量が5
00μで残りの全てが100μとなるように下から
分別した。これらの画分を0.01容のアクリルアミド
(25mg/ml)及び2.5容のエタノールで沈澱させ、
70%強度のエタノールで1度洗浄し、乾燥し、及びそ
れぞれを5μのH2O中にとった。
dsDNAの大きさを決定するために、1μの各画分
を1.5%アガロースゲル内で分析した。更にdsDN
Aの量を1μの各画分について求めた。
を1.5%アガロースゲル内で分析した。更にdsDN
Aの量を1μの各画分について求めた。
1000bpを越えるdsDNAを含有する画分を合体
し、この試料を最終濃度が27μg/mlになるまで濃縮
した。
し、この試料を最終濃度が27μg/mlになるまで濃縮
した。
dsDNAのファージベクターλgt10中への導入及
びin vitroパッケージング反応 dsDNAのファージーベクターλgt10(Vecter C
loning Systems、カルフォルニア州、サンディェゴ)の
EcoRI切断部位中への導入は、4μリガーゼ混合
物(2μのdsDNA、1μのλgt10×Eco
RI(1μg/ml)、0.4μのリガーゼ緩衝液、
0.5μのH2O及び0.1μのT4DNAリガー
ゼ)中において行なった。この混合物は、15℃で4時
間インキュベートした。
びin vitroパッケージング反応 dsDNAのファージーベクターλgt10(Vecter C
loning Systems、カルフォルニア州、サンディェゴ)の
EcoRI切断部位中への導入は、4μリガーゼ混合
物(2μのdsDNA、1μのλgt10×Eco
RI(1μg/ml)、0.4μのリガーゼ緩衝液、
0.5μのH2O及び0.1μのT4DNAリガー
ゼ)中において行なった。この混合物は、15℃で4時
間インキュベートした。
ファージベクターλgt10内で胎盤cDNAバンクを
確立するために、このリガーゼ混合物を次いでλ−溶原
性細胞抽出物E.coli NS428及びNS433
とのin vitroパッケージング反応に室温において2時間
付した〔Vecter Cloning Systems 、カルフォルニア
州、サンディェゴ;エンキスト及びスターンバーグ(En
quist and Sternberg)、Methods in Enzymology 68(19
79)281-298 〕。この反応は、500μの懸濁媒体
〔SM:0.1M NaCl、8mM MgSO4、5
0mM tris(pH7.5)、0.01%ゼラチ
ン〕及び2滴のクロロホルムで停止させた。
確立するために、このリガーゼ混合物を次いでλ−溶原
性細胞抽出物E.coli NS428及びNS433
とのin vitroパッケージング反応に室温において2時間
付した〔Vecter Cloning Systems 、カルフォルニア
州、サンディェゴ;エンキスト及びスターンバーグ(En
quist and Sternberg)、Methods in Enzymology 68(19
79)281-298 〕。この反応は、500μの懸濁媒体
〔SM:0.1M NaCl、8mM MgSO4、5
0mM tris(pH7.5)、0.01%ゼラチ
ン〕及び2滴のクロロホルムで停止させた。
力価の決定及び胎盤cDNAバンクの分析 胎盤cDNAバンクのプラーク形成単位(PFU)の数
はE.coli K12株C600HFLのコンピテン
ト細胞を用いて決定した:それは1×106PFUであ
った。約80%のファージが1000塩基対より大きい
DNAインサートを含有した。
はE.coli K12株C600HFLのコンピテン
ト細胞を用いて決定した:それは1×106PFUであ
った。約80%のファージが1000塩基対より大きい
DNAインサートを含有した。
胎盤cDNAバンクをスクリーニングするためのオリゴ
ヌクレオチドプローブ 二つのオリゴヌクレオチドプローブ(20merプロー
ブ及び66merプローブ)を胎盤cDNAバンクを分
析するために合成した。それらの配列は、FXIIIaのい
くつかの蛋白質分解及びBrCN断片のアミノ酸初期配
列から演繹した。場合によっては重複する、従ってより
長いアミノ酸配列が見出されたが、これらによって極め
て長いプローブ即ち66merプローブの合成が可能と
なった。
ヌクレオチドプローブ 二つのオリゴヌクレオチドプローブ(20merプロー
ブ及び66merプローブ)を胎盤cDNAバンクを分
析するために合成した。それらの配列は、FXIIIaのい
くつかの蛋白質分解及びBrCN断片のアミノ酸初期配
列から演繹した。場合によっては重複する、従ってより
長いアミノ酸配列が見出されたが、これらによって極め
て長いプローブ即ち66merプローブの合成が可能と
なった。
20merプローブは、アミノ酸配列Met−Met−
Asp−Ile−Thr−Asp−Thrに対する全て
の理論的に可能なコドンが考慮された通常のDNAプロ
ーブである(末端アミノ酸Thrの場合には「ゆらぎ」
位置と称されるコドンの第3番目は省略された;表1参
照)。この20merプローブは従って48倍縮重体、
即ち該アミノ酸配列に対する全ての48個の理論的に可
能なコード化オリゴヌクレオチドの混合物である。
Asp−Ile−Thr−Asp−Thrに対する全て
の理論的に可能なコドンが考慮された通常のDNAプロ
ーブである(末端アミノ酸Thrの場合には「ゆらぎ」
位置と称されるコドンの第3番目は省略された;表1参
照)。この20merプローブは従って48倍縮重体、
即ち該アミノ酸配列に対する全ての48個の理論的に可
能なコード化オリゴヌクレオチドの混合物である。
66merプローブの構成方法及び使用は、レイズ(La
the)、J.Mol.Biol.183(1985)1-12の原則に本質的に従
った。66merプローブを構成するために二つの39
merプローブを含成した(次の配列を有する39me
rA: 5′TATGGCCAGTTTGAGGATGGCAT
CCTGGACACCTGTCTG3′及び次の配列を
有する39merB: 5′GTCCATCTGGGCCCGGTCCATCA
CATACAGACAGGTGTC3′)。39mer
A及び39merBは、二つの配列のハイブリダイゼー
ションの結果長い遊離5′末端が生ずるように12個の
塩基よりなる相補的配列を有する。
the)、J.Mol.Biol.183(1985)1-12の原則に本質的に従
った。66merプローブを構成するために二つの39
merプローブを含成した(次の配列を有する39me
rA: 5′TATGGCCAGTTTGAGGATGGCAT
CCTGGACACCTGTCTG3′及び次の配列を
有する39merB: 5′GTCCATCTGGGCCCGGTCCATCA
CATACAGACAGGTGTC3′)。39mer
A及び39merBは、二つの配列のハイブリダイゼー
ションの結果長い遊離5′末端が生ずるように12個の
塩基よりなる相補的配列を有する。
これらの二つの39merプローブは(20merプロ
ーブと同様に)5′末端において(γ−32P)−ATP
(約1μgのDNA、(γ−32P)−ATP:3000
Ci/mmol、10μCi/μ、6μ/40μの反
応混合液使用)の存在下においてT4ポリヌクレオチド
キナーゼで標識した。20merプローブは1×108
Bq/μg或いは1.5×106Bq/pmolの比活性を
有した。二つの39merプローブは95℃で5分間加
熱し、混合し、及び低温室内で4℃に徐々に冷却してハ
イブリダイズさせた。次いで、約1μgのハイブリダイ
ズされた39merプローブをDNAポリメラーゼI、
クレノウ断片で(α−32P)−dATP(3000Ci
/mmol、10μCi/μ、4μ/50μ反応混合
物)を添加して処理した〔5′−3′埋填(filling-i
n)反応〕。この埋填された66merプローブは1.
5×108Bq/μgの比活性を有した。これらのDN
Aプローブは−20℃において貯蔵した。20merプ
ローブは直ちに分析(スクリーニング)のために用いた
のに対し、66merプローブは予め95℃において5
分間加熱し、次いで氷浴内で迅速に冷却した。
ーブと同様に)5′末端において(γ−32P)−ATP
(約1μgのDNA、(γ−32P)−ATP:3000
Ci/mmol、10μCi/μ、6μ/40μの反
応混合液使用)の存在下においてT4ポリヌクレオチド
キナーゼで標識した。20merプローブは1×108
Bq/μg或いは1.5×106Bq/pmolの比活性を
有した。二つの39merプローブは95℃で5分間加
熱し、混合し、及び低温室内で4℃に徐々に冷却してハ
イブリダイズさせた。次いで、約1μgのハイブリダイ
ズされた39merプローブをDNAポリメラーゼI、
クレノウ断片で(α−32P)−dATP(3000Ci
/mmol、10μCi/μ、4μ/50μ反応混合
物)を添加して処理した〔5′−3′埋填(filling-i
n)反応〕。この埋填された66merプローブは1.
5×108Bq/μgの比活性を有した。これらのDN
Aプローブは−20℃において貯蔵した。20merプ
ローブは直ちに分析(スクリーニング)のために用いた
のに対し、66merプローブは予め95℃において5
分間加熱し、次いで氷浴内で迅速に冷却した。
66merプローブは二つの39merのハイブリダイ
ゼーションに引続き5′→3′埋填反応により生成され
たので、各種実験を行なうことが可能である。一方にお
いて、cDNAバンクを変性された66merDNAプ
ローブとハイブリダイズさせることが可能であり、他方
において、次いで陽性のクローンを39merA及びB
プローブと個々のハイブリダイズさせることが可能であ
る。
ゼーションに引続き5′→3′埋填反応により生成され
たので、各種実験を行なうことが可能である。一方にお
いて、cDNAバンクを変性された66merDNAプ
ローブとハイブリダイズさせることが可能であり、他方
において、次いで陽性のクローンを39merA及びB
プローブと個々のハイブリダイズさせることが可能であ
る。
長いプローブ及び二つの短い39merプローブA及び
Bの両者をハイブリダイズするクローンが所望の配列を
もつ確率は極めて高い。即ち、以上説明した長い、複雑
なオリゴヌクレオチドプローブを構成し、部分的に相補
的な短いDNAプローブを用いてクローンを「再スクリ
ーニングする」方法は特異性の向上を表わす。加えて、
長いオリゴヌクレオチド及びその部分的に相補的な短い
部分オリゴヌクレオチドを用いて向上した特異性を有す
るゲノムバンクをスクリーニングすることが可能であ
る。該方法のもう一つの利点は、より短いオリゴヌクレ
オチドの合成をより簡単に且つより高い収率及び精度を
用いて行なうことができることである。二つの酵素反
応、即ち1)(γ−32P)−ATP標識付けのためのT4
ポリヌクレオチドキナーゼ、及び2)(α−32P)−dN
TPの添加によるDNAポリメラーゼ埋填反応、の順序
はより高い比活性(少なくとも1×108Bq/μgD
NA)を得ることが可能であることを意味する。
Bの両者をハイブリダイズするクローンが所望の配列を
もつ確率は極めて高い。即ち、以上説明した長い、複雑
なオリゴヌクレオチドプローブを構成し、部分的に相補
的な短いDNAプローブを用いてクローンを「再スクリ
ーニングする」方法は特異性の向上を表わす。加えて、
長いオリゴヌクレオチド及びその部分的に相補的な短い
部分オリゴヌクレオチドを用いて向上した特異性を有す
るゲノムバンクをスクリーニングすることが可能であ
る。該方法のもう一つの利点は、より短いオリゴヌクレ
オチドの合成をより簡単に且つより高い収率及び精度を
用いて行なうことができることである。二つの酵素反
応、即ち1)(γ−32P)−ATP標識付けのためのT4
ポリヌクレオチドキナーゼ、及び2)(α−32P)−dN
TPの添加によるDNAポリメラーゼ埋填反応、の順序
はより高い比活性(少なくとも1×108Bq/μgD
NA)を得ることが可能であることを意味する。
FXIIIa−特異的オリゴヌクレオチドによる胎盤cDN
Aのスクリーニング 20merプローブ及び66merプローブを用いて、
5×105PFUの胎盤cDNAバンクをFXIIIaをコ
ードするCDNA配列について調べた。これには、1
3.5cmのペトリ皿内の軟寒天中でE.coli K1
2株C600HFLの細胞で培養され、37℃で6時間
インキュベートされた3×104PFUを伴った。この
時までに生じた如何なる溶解も尚不完全であった。これ
らのプレートを冷蔵庫内で一晩インキュベートし、ファ
ージをニトロセルロースフィルターに移した〔シュライ
ヒヤー及びシュル(Schleicher & Schuell)、BA 85.Re
f.No.401124 〕(二重)。これらのニトロセルロースフ
ィルター及びペトリ皿を引続き割当てを行なうために注
射針で印をつけた。これらのペトリ皿はニトロセルロー
スフィルターの処理の際に低温室に貯蔵した。ニトロセ
ルロースフィルター上のDNAはフィルターを1.5M
NaCl、0.5M NaOHを含浸させた紙(Wh
atman M 3)上に5分間置くことにより変性した。これ
らのフィルターを次いで1.5M NaCl、0.5M
tris(pH8.0)を用いて同一方法で再変成
し、2×SSPE(0.36M NaCl、16mM
NaOH、20mM NaH2PO4、2mM EDT
A)で洗浄した。これらのフィルターを次いで80℃で
2時間真空乾燥した。これらのフィルターを3×SS
C、0.1%SDS(20×SSC=3MNaCl、
0.3M Naクエン酸塩)で65℃において4時間洗
浄し、65℃において4時間予備ハイブリダイズした
(予備ハイブリダイゼーション溶液;0.6M NaC
l、0.06Mtris(pH8.3)、6mM ED
TA、0.2%非−イオン性合成スクロース重合体( R
Ficoll)、0.2%ポリビニルピロリドン40、
0.2%BSA、0.1%SDS、50μg/ml変性に
しん***DNA)。これらのフィルターをおだやかに振
盪しながらビーカー或いは密封ポリエチレンフィルム内
でハイブリダイゼーション溶液(にしん***DNAのな
い予備ハイブリダイゼーション溶液)のml当り100,
000〜200,000Bqの標識オリゴヌクレオチド
を添加して一晩インキュベートした。20mer及び3
9merプローブに対するハイブリダイゼーション温度
は42℃であり、66merプローブに対するそれは4
7℃であった。
Aのスクリーニング 20merプローブ及び66merプローブを用いて、
5×105PFUの胎盤cDNAバンクをFXIIIaをコ
ードするCDNA配列について調べた。これには、1
3.5cmのペトリ皿内の軟寒天中でE.coli K1
2株C600HFLの細胞で培養され、37℃で6時間
インキュベートされた3×104PFUを伴った。この
時までに生じた如何なる溶解も尚不完全であった。これ
らのプレートを冷蔵庫内で一晩インキュベートし、ファ
ージをニトロセルロースフィルターに移した〔シュライ
ヒヤー及びシュル(Schleicher & Schuell)、BA 85.Re
f.No.401124 〕(二重)。これらのニトロセルロースフ
ィルター及びペトリ皿を引続き割当てを行なうために注
射針で印をつけた。これらのペトリ皿はニトロセルロー
スフィルターの処理の際に低温室に貯蔵した。ニトロセ
ルロースフィルター上のDNAはフィルターを1.5M
NaCl、0.5M NaOHを含浸させた紙(Wh
atman M 3)上に5分間置くことにより変性した。これ
らのフィルターを次いで1.5M NaCl、0.5M
tris(pH8.0)を用いて同一方法で再変成
し、2×SSPE(0.36M NaCl、16mM
NaOH、20mM NaH2PO4、2mM EDT
A)で洗浄した。これらのフィルターを次いで80℃で
2時間真空乾燥した。これらのフィルターを3×SS
C、0.1%SDS(20×SSC=3MNaCl、
0.3M Naクエン酸塩)で65℃において4時間洗
浄し、65℃において4時間予備ハイブリダイズした
(予備ハイブリダイゼーション溶液;0.6M NaC
l、0.06Mtris(pH8.3)、6mM ED
TA、0.2%非−イオン性合成スクロース重合体( R
Ficoll)、0.2%ポリビニルピロリドン40、
0.2%BSA、0.1%SDS、50μg/ml変性に
しん***DNA)。これらのフィルターをおだやかに振
盪しながらビーカー或いは密封ポリエチレンフィルム内
でハイブリダイゼーション溶液(にしん***DNAのな
い予備ハイブリダイゼーション溶液)のml当り100,
000〜200,000Bqの標識オリゴヌクレオチド
を添加して一晩インキュベートした。20mer及び3
9merプローブに対するハイブリダイゼーション温度
は42℃であり、66merプローブに対するそれは4
7℃であった。
これらのニトロセルロースフィルターは6×SSC、
0.05Mピロリン酸ナトリウムで室温において1時間
及び特別のハイブリダイゼーション温度において更に1
時間洗浄した。これらのフィルターを乾燥し、一晩オー
トラジオグラフィにかけた。二重のX線フィルムの両者
に生ずる信号をペトリ皿に割当て、その領域(約50プ
ラーク)をパスツールピペットの広い末端に切抜き、フ
ァージを1mlのSM緩衝液に再懸濁した。陽性ファージ
を単一クローンが得られるまで3回に亘めて選抜した。
0.05Mピロリン酸ナトリウムで室温において1時間
及び特別のハイブリダイゼーション温度において更に1
時間洗浄した。これらのフィルターを乾燥し、一晩オー
トラジオグラフィにかけた。二重のX線フィルムの両者
に生ずる信号をペトリ皿に割当て、その領域(約50プ
ラーク)をパスツールピペットの広い末端に切抜き、フ
ァージを1mlのSM緩衝液に再懸濁した。陽性ファージ
を単一クローンが得られるまで3回に亘めて選抜した。
合計5×105PFUの胎盤cDNAバンクを数継代に
おいて調べた。二重フィルター上に17個の信号が確認
された。より緊縮な条件下で更にスクリーニングを行な
ったところ尚陽性である7個の信号を得た。これらの7
個のPFUのうち1個のみが20mer及び66mer
プローブによるハイブリダイゼーション及び39mer
プローブA及びBによるハイブリダイゼーションの後共
に陽性の信号を示した。この以後λgt10−12と称
される−クローンはFXIIIaをコード化し、及び内部E
coRI切断部位を有する1704塩基対の配列を有す
る。サザーンブロット分析は、540塩基対のより小さ
いEcoRI断片は20merDNAプローブとハイブ
リダイズし、1164塩基対のより大きい断片は66m
erDNAプローブとハイブリダイズすることを示して
いる。
おいて調べた。二重フィルター上に17個の信号が確認
された。より緊縮な条件下で更にスクリーニングを行な
ったところ尚陽性である7個の信号を得た。これらの7
個のPFUのうち1個のみが20mer及び66mer
プローブによるハイブリダイゼーション及び39mer
プローブA及びBによるハイブリダイゼーションの後共
に陽性の信号を示した。この以後λgt10−12と称
される−クローンはFXIIIaをコード化し、及び内部E
coRI切断部位を有する1704塩基対の配列を有す
る。サザーンブロット分析は、540塩基対のより小さ
いEcoRI断片は20merDNAプローブとハイブ
リダイズし、1164塩基対のより大きい断片は66m
erDNAプローブとハイブリダイズすることを示して
いる。
再スクリーニング時に、サザーンブロットから39me
rプローブBよりも39merプローブAとより多くの
反応があることが判明した。引続きクローンλgt10
−12の配列分析によって、66merプローブの全長
に亘ってFXIIIaに見出された配列に対して僅かに7個
の不適性塩基対があるに過ぎないことが判った(表
2)。これらの7個の不適性塩基対は次のように分布し
ている。即ち39merAプローブに3個の及び39m
erBプローブに5個の不適性塩基対がある(一つの不
適性塩基対は重複領域にあり、従って両者に共通であ
る)。39merBにおける5個の不適性塩基対は一団
となっており、これがおそらく39merプローブの場
合におけるより弱いハイブリダイゼーション信号の理由
であると思われる。
rプローブBよりも39merプローブAとより多くの
反応があることが判明した。引続きクローンλgt10
−12の配列分析によって、66merプローブの全長
に亘ってFXIIIaに見出された配列に対して僅かに7個
の不適性塩基対があるに過ぎないことが判った(表
2)。これらの7個の不適性塩基対は次のように分布し
ている。即ち39merAプローブに3個の及び39m
erBプローブに5個の不適性塩基対がある(一つの不
適性塩基対は重複領域にあり、従って両者に共通であ
る)。39merBにおける5個の不適性塩基対は一団
となっており、これがおそらく39merプローブの場
合におけるより弱いハイブリダイゼーション信号の理由
であると思われる。
ニック−トランスレートされたEcoRI断片による胎
盤cDNAのスクリーニング 540塩基対及び1164塩基対長さの二つのサブクロ
ーン化EcoRI断片を市販のベクターpUC8(11
64bp=pUC8−12.1及び540bp=pUC
8−12.2)のEcoRI切断部位中にクローン化
し、それから調製的にEcoRIにより単離し、及び
(α−32P)−dNTPの存在下にニック−トランスレ
ートした。両断片の比活性は1×108Bq/μgDN
Aであった。これらの(32P)−標識断片を数継代にお
いて用いて胎盤cDNAバンクの約1×106個の組換
えファージを調べ(ハイブリダイゼーション温度65
℃)、かくして13個のハイブリダイズするファージを
確認した。これらのファージは単一均質ファージ標本が
得られるまで3回に亘って選抜した。各ファージの20
ml溶解物を調製し、DNAを抽出した。このDNAをE
coRIで消化し、1%アガロースゲル上で分別した。
このゲルをサザーンブロット技術に対し、ニトロセルロ
ースフィルータを標識540bpEcoRI断片とハイ
ブリダイズさせた。11個のファージがハイブリダイゼ
ーション信号を示した。このニトロセルロースフィルタ
ーを沸騰させ、ニット−トランスレートされた1164
bpEcoRI断片とハイブリダイズさせた。7個のフ
ァージがハイブリダイゼーション信号を示した。
盤cDNAのスクリーニング 540塩基対及び1164塩基対長さの二つのサブクロ
ーン化EcoRI断片を市販のベクターpUC8(11
64bp=pUC8−12.1及び540bp=pUC
8−12.2)のEcoRI切断部位中にクローン化
し、それから調製的にEcoRIにより単離し、及び
(α−32P)−dNTPの存在下にニック−トランスレ
ートした。両断片の比活性は1×108Bq/μgDN
Aであった。これらの(32P)−標識断片を数継代にお
いて用いて胎盤cDNAバンクの約1×106個の組換
えファージを調べ(ハイブリダイゼーション温度65
℃)、かくして13個のハイブリダイズするファージを
確認した。これらのファージは単一均質ファージ標本が
得られるまで3回に亘って選抜した。各ファージの20
ml溶解物を調製し、DNAを抽出した。このDNAをE
coRIで消化し、1%アガロースゲル上で分別した。
このゲルをサザーンブロット技術に対し、ニトロセルロ
ースフィルータを標識540bpEcoRI断片とハイ
ブリダイズさせた。11個のファージがハイブリダイゼ
ーション信号を示した。このニトロセルロースフィルタ
ーを沸騰させ、ニット−トランスレートされた1164
bpEcoRI断片とハイブリダイズさせた。7個のフ
ァージがハイブリダイゼーション信号を示した。
ハイブリダイズする断片の大きさに基づいて、λgt1
0−12に対比してλgt10−20のように5′末端
方向及びλgt10−11のように3′末端の方向の両
者に拡張するクローンを確認することが可能であった。
これらのクローンを用いて完全なXIIIa cDNA配列
を決定することが可能であった。内部制限部位を用いる
ことにより或いは重複配列のハイブリダイゼーションに
より、存在した部分配列を組合わせることが可能であっ
た。この完全なcDNA配列は発現ベクター中に連結
し、適当な原核或いは真核系内において発現することが
できる。
0−12に対比してλgt10−20のように5′末端
方向及びλgt10−11のように3′末端の方向の両
者に拡張するクローンを確認することが可能であった。
これらのクローンを用いて完全なXIIIa cDNA配列
を決定することが可能であった。内部制限部位を用いる
ことにより或いは重複配列のハイブリダイゼーションに
より、存在した部分配列を組合わせることが可能であっ
た。この完全なcDNA配列は発現ベクター中に連結
し、適当な原核或いは真核系内において発現することが
できる。
DNA配列分析 ファージクローンλgt10−12を増殖し、DNAを
抽出した。二つのEcoRI断片を単離し、プラスミド
ベクターpUC8のEcoRI部位中にクローン化し
た。pUC8−12.1は1164塩基対断片を有し、
pUC8−12.2は540塩基対断片を有する。
抽出した。二つのEcoRI断片を単離し、プラスミド
ベクターpUC8のEcoRI部位中にクローン化し
た。pUC8−12.1は1164塩基対断片を有し、
pUC8−12.2は540塩基対断片を有する。
1704塩基対よりなる全断片を単離するために、λg
t10−12をEcoRIで部分的に消化し、1704
塩基対バンドを単離し、pIC19H〔マーシュ等(Mar
sh et al.)Gene 32(1984)481- 485〕のEcoRI部位
中のクローン化した。得られたプラスミドをpIC19
H−12と称する。
t10−12をEcoRIで部分的に消化し、1704
塩基対バンドを単離し、pIC19H〔マーシュ等(Mar
sh et al.)Gene 32(1984)481- 485〕のEcoRI部位
中のクローン化した。得られたプラスミドをpIC19
H−12と称する。
クローンpUC8−12.1、pUC8−12.2及び
pIC19H−12のSau 3A、AluI及びTa
qI小断片をpUCプラスミド及びM13ファージにク
ローン化した後関連領域をサンガー(Sanger)のジデオ
キシ法及びマクサム及びギルバード(Maxam and Giber
t)の化学的方法を用いて配列決定することにより、1
704bp断片の配列を決定することが可能であった
(表3)。この配列は1個のみの開放読取枠を示し、因
子XIIIa分子の最初の542個のアミノ酸をコードす
る。
pIC19H−12のSau 3A、AluI及びTa
qI小断片をpUCプラスミド及びM13ファージにク
ローン化した後関連領域をサンガー(Sanger)のジデオ
キシ法及びマクサム及びギルバード(Maxam and Giber
t)の化学的方法を用いて配列決定することにより、1
704bp断片の配列を決定することが可能であった
(表3)。この配列は1個のみの開放読取枠を示し、因
子XIIIa分子の最初の542個のアミノ酸をコードす
る。
クローンλgt10−12或いはpIC19H−12及
びクローンλgt10−11及びλgt10−20の制
限分析は、適当な単一及び複数消化及びスミス及びビル
ンスチールの方法〔Smith,H.O.and Birnstiel,M.L.、ヌ
クレイック・アシッズ・リサーチ(Nucleic Acids Res.)
3(1976)2387- 2398〕による(32P)−標識断片の部分
消化の両者により行なった(第1図)。
びクローンλgt10−11及びλgt10−20の制
限分析は、適当な単一及び複数消化及びスミス及びビル
ンスチールの方法〔Smith,H.O.and Birnstiel,M.L.、ヌ
クレイック・アシッズ・リサーチ(Nucleic Acids Res.)
3(1976)2387- 2398〕による(32P)−標識断片の部分
消化の両者により行なった(第1図)。
クローンλgt10−11は2432bpの大きさの内
部EcoRI切断部位を有する断片を有する。この断片
は3′末端における237bpによりλgt10−12
からのcDNA断片と重複し、コード化配列の残りの5
70bpプラス89塩基のポリ(A)配列を含む非−コ
ード化領域の1625bpよりなる。約700bpの大
きさのcDNA断片を有するクローンλgt10−20
は又5′末端にλgt10−12よりも6個多い塩基を
有する(GAG GAA…)。
部EcoRI切断部位を有する断片を有する。この断片
は3′末端における237bpによりλgt10−12
からのcDNA断片と重複し、コード化配列の残りの5
70bpプラス89塩基のポリ(A)配列を含む非−コ
ード化領域の1625bpよりなる。約700bpの大
きさのcDNA断片を有するクローンλgt10−20
は又5′末端にλgt10−12よりも6個多い塩基を
有する(GAG GAA…)。
2.発現されることができ、FXIIIaをコード化する全
cDNAを含有するクローンの調製 出発クローンλgt10−11及びλgt10−12を
用いてFXIIIa cDNAの全コード化領域を含有する
プラスミドを得た。部分EcoRIの消化の助けによ
り、λgt10−12の1704塩基対よりなる挿入物
をpIC19H(マーシュ等上掲)のEcoRI部位に
クローン化した。得られたプラスミドpIC19H−1
2.1を引続き使用した(第2図参照)。このクローン
λgt10−11は2432塩基対の大きさの挿入物を
有し、内部EcoRI切断部位を有する。1224塩基
対の大きさであり、コード化配列のC−末端570塩基
対プラス3′非−コード化領域の654塩基対を有する
左側(「5−末端」)EcoRI断片を同様にpIC1
9HのEcoRI切断部位にクローン化した。得られた
プラスミドpIC19H−11.1を引続き使用した
(第2図)。これらのプラスミドpIC19H−12.
1及びpIC19H−11.1はベクター中の同一配向
においてFXIIIaに対するコード化領域を有し、237
塩基対よりなる重複領域を有する。この重複領域を用い
て部分クローンpIC19H−12.1及びpIC19
H−11.1から全コード化領域を有するクローンを構
成した。これは上記二つのプラスミドからのin vitroで
のハイブリダイゼーション(第2図)による部分的一本
鎖ヘテロ二重鎖分子の調製及び反応混合物物のE.co
li中への形質転換を伴うものであった。細菌の修復機
構(酵素DNAポリメラーゼIの3′→5′エキソヌク
レアーゼ活性、5′→3′重合活性)を利用して、全コ
ード化領域を有するプラスミドを得た。具体的には、こ
れはプラスミドpIC19H−12.1(ClaI−消
化)及びpIC19H−11.1(BamHI−消化)
の各々の1μgのDNAを混合し、エタノールで沈澱す
るものであった。DNAを真空乾燥し、20μのH2
O中にとり、5μの1NNaOHを添加後、室温にお
いて10分間インキュベートした。次いで次のものを示
される順序に従って添加した:200μのH2O、2
5μの1M tris.HCl(pH8.0)及び
50μの0.1N HCl。反応混合物を65℃で3
時間インキュベートし、エタノールで沈澱させ、乾燥し
た。DNAを20μのH2O中に再懸濁し、公知の方
法によりE.coli中に形質転換し、細胞をLB−a
mpプレート上に乗せて一晩インキュベートした。合計
96個のアンピシリン−耐性クローンのうち、24個の
クローンをアルカリ法〔バーンボイム及びドリー(Birn
b-oim and Doly)、ヌクレイック・アシッゾ・リサーチ
(Nucl.Acid Res.)7(1979)1513-1523 〕により処理し、
プラスミドをHindIII、EcoRI、BamHI及
びPvuIIによる制限酵素分解により特性決定した。6
個のプラスミドが期待された制限パターンを示した。こ
れらのプラスミドのうちの一つpFXIII−13(第2
図)を詳細に特性決定した。これは配列決定された23
7個の塩基対重複領域を有する。StuI(位置122
5)−PvuII(位置1870)を伴い、このDNA配
列は正確であることが確認された。プラスミドpFXIII
−13は78bpが5′非−翻訳領域のものであり21
96bpが全コード領域であり、及び419bpが3′
非−翻訳領域のものであるFXIIIacDNAの2693
塩基対よりなる。pFXIII−13は全ての引続く発現実
験のための出発プラスミドであった。
cDNAを含有するクローンの調製 出発クローンλgt10−11及びλgt10−12を
用いてFXIIIa cDNAの全コード化領域を含有する
プラスミドを得た。部分EcoRIの消化の助けによ
り、λgt10−12の1704塩基対よりなる挿入物
をpIC19H(マーシュ等上掲)のEcoRI部位に
クローン化した。得られたプラスミドpIC19H−1
2.1を引続き使用した(第2図参照)。このクローン
λgt10−11は2432塩基対の大きさの挿入物を
有し、内部EcoRI切断部位を有する。1224塩基
対の大きさであり、コード化配列のC−末端570塩基
対プラス3′非−コード化領域の654塩基対を有する
左側(「5−末端」)EcoRI断片を同様にpIC1
9HのEcoRI切断部位にクローン化した。得られた
プラスミドpIC19H−11.1を引続き使用した
(第2図)。これらのプラスミドpIC19H−12.
1及びpIC19H−11.1はベクター中の同一配向
においてFXIIIaに対するコード化領域を有し、237
塩基対よりなる重複領域を有する。この重複領域を用い
て部分クローンpIC19H−12.1及びpIC19
H−11.1から全コード化領域を有するクローンを構
成した。これは上記二つのプラスミドからのin vitroで
のハイブリダイゼーション(第2図)による部分的一本
鎖ヘテロ二重鎖分子の調製及び反応混合物物のE.co
li中への形質転換を伴うものであった。細菌の修復機
構(酵素DNAポリメラーゼIの3′→5′エキソヌク
レアーゼ活性、5′→3′重合活性)を利用して、全コ
ード化領域を有するプラスミドを得た。具体的には、こ
れはプラスミドpIC19H−12.1(ClaI−消
化)及びpIC19H−11.1(BamHI−消化)
の各々の1μgのDNAを混合し、エタノールで沈澱す
るものであった。DNAを真空乾燥し、20μのH2
O中にとり、5μの1NNaOHを添加後、室温にお
いて10分間インキュベートした。次いで次のものを示
される順序に従って添加した:200μのH2O、2
5μの1M tris.HCl(pH8.0)及び
50μの0.1N HCl。反応混合物を65℃で3
時間インキュベートし、エタノールで沈澱させ、乾燥し
た。DNAを20μのH2O中に再懸濁し、公知の方
法によりE.coli中に形質転換し、細胞をLB−a
mpプレート上に乗せて一晩インキュベートした。合計
96個のアンピシリン−耐性クローンのうち、24個の
クローンをアルカリ法〔バーンボイム及びドリー(Birn
b-oim and Doly)、ヌクレイック・アシッゾ・リサーチ
(Nucl.Acid Res.)7(1979)1513-1523 〕により処理し、
プラスミドをHindIII、EcoRI、BamHI及
びPvuIIによる制限酵素分解により特性決定した。6
個のプラスミドが期待された制限パターンを示した。こ
れらのプラスミドのうちの一つpFXIII−13(第2
図)を詳細に特性決定した。これは配列決定された23
7個の塩基対重複領域を有する。StuI(位置122
5)−PvuII(位置1870)を伴い、このDNA配
列は正確であることが確認された。プラスミドpFXIII
−13は78bpが5′非−翻訳領域のものであり21
96bpが全コード領域であり、及び419bpが3′
非−翻訳領域のものであるFXIIIacDNAの2693
塩基対よりなる。pFXIII−13は全ての引続く発現実
験のための出発プラスミドであった。
3.生物学的に活性な因子XIIIaのE.coliにおけ
る発現 a)FXIIIa発現プラスミドの構成 FXIII−13はlacプロモータに関して正しい配向に
おいて、及びlacZα−ペプチドに対して正しい読取
枠内にFXIIIacDNA挿入を有する。従って、pFXI
II−13はE.coliにおけるFXIIIa融合蛋白質の
合成を誘発することができる。この蛋白質の分子量は、
天然FXIIIaの732個のアミノ酸と共に16個のベク
ターコード化アミノ酸プラス5′非−コード化領域によ
り特定される28個のアミノ酸よりなる。これらの44
個の追加のアミノ酸は融合蛋白質のN−末端に位置す
る。この蛋白質の予想される分子量は85,250D
(表4)である。
る発現 a)FXIIIa発現プラスミドの構成 FXIII−13はlacプロモータに関して正しい配向に
おいて、及びlacZα−ペプチドに対して正しい読取
枠内にFXIIIacDNA挿入を有する。従って、pFXI
II−13はE.coliにおけるFXIIIa融合蛋白質の
合成を誘発することができる。この蛋白質の分子量は、
天然FXIIIaの732個のアミノ酸と共に16個のベク
ターコード化アミノ酸プラス5′非−コード化領域によ
り特定される28個のアミノ酸よりなる。これらの44
個の追加のアミノ酸は融合蛋白質のN−末端に位置す
る。この蛋白質の予想される分子量は85,250D
(表4)である。
lacプロモータの代りにより効率的なtrp/lac
ハイブリッドプロモータを用いる発現プラスミドを引続
き構成した。このために、pKK233−2〔アマン及
びブロシュウス(Amann and Brosius)、ジーン(Gene)4
0(1985).183-190 〕をEcoRIで切断し、Ba131
で処理した(第3図)。このDNAを次いでPveIIで
切断し、2800塩基対の大きさの断片をPAAゲル上
で精製した。この断片をBg1IIリンカー(5′−CA
GATCTG)の存在下において再連結した。得られた
プラスミドpTrc89−1(第3図)をNcoI及び
HindIIIで切断し、合成リンカー 5′CATGGAATTCGA3′ 3′CTTAAGCTTCGA5′ をリガーゼ混合物中において2800塩基対の断片と共
にインキュベートした。得られたプラスミドpTrc9
6A(第3図)をEcoRI及びHindIIIで切断
し、2800塩基対の大きさの断片をゲル精製し、pU
C18からの55塩基対の大きさのEcoRI−Hin
dIIIリンカーと連結した。得られたプラスミドはPT
c97A(第3図)である。pKK233−2に対照的
に、pTrc97Aはプラスミド内で一度だけ存在する
NcoI部位の下流にpUC18からのポリリンカーを
有し、従って数多くのクローニング部位を有する。
ハイブリッドプロモータを用いる発現プラスミドを引続
き構成した。このために、pKK233−2〔アマン及
びブロシュウス(Amann and Brosius)、ジーン(Gene)4
0(1985).183-190 〕をEcoRIで切断し、Ba131
で処理した(第3図)。このDNAを次いでPveIIで
切断し、2800塩基対の大きさの断片をPAAゲル上
で精製した。この断片をBg1IIリンカー(5′−CA
GATCTG)の存在下において再連結した。得られた
プラスミドpTrc89−1(第3図)をNcoI及び
HindIIIで切断し、合成リンカー 5′CATGGAATTCGA3′ 3′CTTAAGCTTCGA5′ をリガーゼ混合物中において2800塩基対の断片と共
にインキュベートした。得られたプラスミドpTrc9
6A(第3図)をEcoRI及びHindIIIで切断
し、2800塩基対の大きさの断片をゲル精製し、pU
C18からの55塩基対の大きさのEcoRI−Hin
dIIIリンカーと連結した。得られたプラスミドはPT
c97A(第3図)である。pKK233−2に対照的
に、pTrc97Aはプラスミド内で一度だけ存在する
NcoI部位の下流にpUC18からのポリリンカーを
有し、従って数多くのクローニング部位を有する。
pFXIII−13中にクローン化されたFXIIIa cDNA
は、ATG開始コドンから5′側に21塩基対離れた所
(位置61)にPstI部位を有する。次のPstI部
位は3′未翻訳領域(位置2398)に位置する。23
37塩基対長のPstI断片がpFXIII−13から単離
され、pTrc97AのSstI部位に連結された。P
stI断片を所望配向に有する得られたプラスミドはp
FXIII−C4(第3a図)である。pFXIII−C4によ
り特性される期待されるFXIII分子は22個の追加のN
−末端アミノ酸を有し、それらの15個はベクター−コ
ード化され及び7個はFXIIIcDNAの5′非−コード
化領域により特定される。この蛋白質の予想される分子
量は82,380D(表4)である。
は、ATG開始コドンから5′側に21塩基対離れた所
(位置61)にPstI部位を有する。次のPstI部
位は3′未翻訳領域(位置2398)に位置する。23
37塩基対長のPstI断片がpFXIII−13から単離
され、pTrc97AのSstI部位に連結された。P
stI断片を所望配向に有する得られたプラスミドはp
FXIII−C4(第3a図)である。pFXIII−C4によ
り特性される期待されるFXIII分子は22個の追加のN
−末端アミノ酸を有し、それらの15個はベクター−コ
ード化され及び7個はFXIIIcDNAの5′非−コード
化領域により特定される。この蛋白質の予想される分子
量は82,380D(表4)である。
トロンビンを用いて37個のアミノ−末端アミノ酸を切
断するとFXIIIaを活性形態に転換させる。既に活性化
されたその様なFXIIIa分子は治療上の興味があるの
で、トロンビン切断により短くすることのできるFXIII
aをE.coli中において発現する試みがなされた。
高い収率を得るために、クローニングは短くされたFXI
IIaがE.coliβ−ガラクトシダーゼ断片に融合し
たハイブリッド蛋白質の形態で発現されるように行なわ
れた。pFXIII−13からの約2700bpの大きさの
SmaI−HindIII断片を単離し、SmaI及びH
indIIIで加水分解されたpBD21C20H中に連
結した。新たなプラスミドpMB259(第3b図)に
おいて、アミノ酸Pro37からMet732 のFXIIIaに
対するcDNAはβ−ガラクトシダーゼの375のアミ
ノ末端アミノ酸に該当する読取枠内に位置し、それは合
成された融合蛋白質からトロンビン切断により活性FXI
IIaを得ることが可能であるようにトロンビン切断部位
Arg38/Gly39を有する。
断するとFXIIIaを活性形態に転換させる。既に活性化
されたその様なFXIIIa分子は治療上の興味があるの
で、トロンビン切断により短くすることのできるFXIII
aをE.coli中において発現する試みがなされた。
高い収率を得るために、クローニングは短くされたFXI
IIaがE.coliβ−ガラクトシダーゼ断片に融合し
たハイブリッド蛋白質の形態で発現されるように行なわ
れた。pFXIII−13からの約2700bpの大きさの
SmaI−HindIII断片を単離し、SmaI及びH
indIIIで加水分解されたpBD21C20H中に連
結した。新たなプラスミドpMB259(第3b図)に
おいて、アミノ酸Pro37からMet732 のFXIIIaに
対するcDNAはβ−ガラクトシダーゼの375のアミ
ノ末端アミノ酸に該当する読取枠内に位置し、それは合
成された融合蛋白質からトロンビン切断により活性FXI
IIaを得ることが可能であるようにトロンビン切断部位
Arg38/Gly39を有する。
発現ベクターpBD2IC20Hはlacプロモーター
を有するpBD2〔ブローカー(Broker)ジーン・アナ
リティカル・テクノロジー(Gene Anal.Techn.)3(1986)5
3-57〕中にBamHi−HindIII断片としてプラス
ミドpIC20H(マーシュ等、上掲)の58bpより
なるポリリンカー領域を連結することにより構成され
た。
を有するpBD2〔ブローカー(Broker)ジーン・アナ
リティカル・テクノロジー(Gene Anal.Techn.)3(1986)5
3-57〕中にBamHi−HindIII断片としてプラス
ミドpIC20H(マーシュ等、上掲)の58bpより
なるポリリンカー領域を連結することにより構成され
た。
b)発 現 pFXIII−13、pFXIII−C4或いはpMB259で
形成転換された菌株D29A1のE.coli細胞は期
待されたFXIIIa蛋白質を合成する能力があることが判
明した。プラスミドpFXIII−13、pMB259及び
pFXIII−C4によるFXIIIの発現はIPTGを用いて
誘発することができる。クーマシーブルー(Coomassie
blue)で染色されたPAAゲル上のE.coli D2
9A1(pFXIII−13)及びD29A1(pFXIII−
C4)のIPTG誘発後の蛋白質抽出物の比較はFXIII
融合蛋白質の期待された分子量を示した。「44aaF
XIII融合蛋白質」の推定発現率は「22aaFXIII融合
蛋白質」のそれの約5倍である。
形成転換された菌株D29A1のE.coli細胞は期
待されたFXIIIa蛋白質を合成する能力があることが判
明した。プラスミドpFXIII−13、pMB259及び
pFXIII−C4によるFXIIIの発現はIPTGを用いて
誘発することができる。クーマシーブルー(Coomassie
blue)で染色されたPAAゲル上のE.coli D2
9A1(pFXIII−13)及びD29A1(pFXIII−
C4)のIPTG誘発後の蛋白質抽出物の比較はFXIII
融合蛋白質の期待された分子量を示した。「44aaF
XIII融合蛋白質」の推定発現率は「22aaFXIII融合
蛋白質」のそれの約5倍である。
又、pFXIII−13及びpFXIII−C4により特定され
るFXIIIa分子は生物学的活性を有することが判明し
た。これに対して、E.coli D29A1対照例の
抽出物中にはFXIII活性は見出されなかった。クロット
安定性アッセイ〔カルギス、ベルクマイヤーの酵素分析
法第5巻酵素3:ペプチダーゼ、プロティナーゼ及びそ
れらの阻害剤、400−410頁(Karges,in Bergmeie
r,Methods of Enzymatic Analysis,Volume 5,,Enzymes
3:Peptidases,Proteinase and their Inhibitors,page
400-410)所収〕において見出された活性はE.col
i D29A1(pFXIII−13)に対してはE.co
li培養液(OD250 =1.5)に基づいて5μg/
であり、D29A1(pFXIII−C4)に対しては15
μg/である。
るFXIIIa分子は生物学的活性を有することが判明し
た。これに対して、E.coli D29A1対照例の
抽出物中にはFXIII活性は見出されなかった。クロット
安定性アッセイ〔カルギス、ベルクマイヤーの酵素分析
法第5巻酵素3:ペプチダーゼ、プロティナーゼ及びそ
れらの阻害剤、400−410頁(Karges,in Bergmeie
r,Methods of Enzymatic Analysis,Volume 5,,Enzymes
3:Peptidases,Proteinase and their Inhibitors,page
400-410)所収〕において見出された活性はE.col
i D29A1(pFXIII−13)に対してはE.co
li培養液(OD250 =1.5)に基づいて5μg/
であり、D29A1(pFXIII−C4)に対しては15
μg/である。
FXIIIa−特異的ELISAにおいて見出された因子XI
IIの量はpFXIII−13に対してはE.coli培養液
に基づいて1.5mg/であり、pFXIII−C4に対し
ては35mg/である。生物学的アッセイ及びELIS
Aにおいて測定されたFXIIIの量の間の食い違いは、
B.coli細胞中のFXIIIの主たる部分(>90%)
が生物学的に不活性であり7M尿素のみに溶解する不溶
性沈澱の形態であるという事実に由来するものである。
E.coli抽出液中に存在するFXIII分子の可溶性画
分はオークタロニー試験〔Ouchterlony 、プログレス・
イン・アラージー(Progr.Allergy)5(1958)1〕において
胎盤から単離されたFXIIIのそれに実質的に同一である
沈澱曲線を示す。
IIの量はpFXIII−13に対してはE.coli培養液
に基づいて1.5mg/であり、pFXIII−C4に対し
ては35mg/である。生物学的アッセイ及びELIS
Aにおいて測定されたFXIIIの量の間の食い違いは、
B.coli細胞中のFXIIIの主たる部分(>90%)
が生物学的に不活性であり7M尿素のみに溶解する不溶
性沈澱の形態であるという事実に由来するものである。
E.coli抽出液中に存在するFXIII分子の可溶性画
分はオークタロニー試験〔Ouchterlony 、プログレス・
イン・アラージー(Progr.Allergy)5(1958)1〕において
胎盤から単離されたFXIIIのそれに実質的に同一である
沈澱曲線を示す。
不溶性蛋白質凝集物の形態でのE.coli内の真核生
物蛋白質の発現は数個の蛋白質について既に説明されて
いる。これらの蛋白質はその様な凝集物からカオトロピ
ック剤を用いて溶出することができ、適当再変成条件に
よりそれらの生物学的に活性形態に転換することができ
る。
物蛋白質の発現は数個の蛋白質について既に説明されて
いる。これらの蛋白質はその様な凝集物からカオトロピ
ック剤を用いて溶出することができ、適当再変成条件に
よりそれらの生物学的に活性形態に転換することができ
る。
4.FXIIIの酵母における発現 酵母から遺伝子操作により得られる生物学的に活性なF
XIIIの合成はFXIIIをコードするcDNAを酵母内にお
いて自律的に複製する能力を有する発現ベクター中に導
入することにより達成された。組換えクローンの抽出物
からFXIII−活性蛋白質を単離することが可能であっ
た。
XIIIの合成はFXIIIをコードするcDNAを酵母内にお
いて自律的に複製する能力を有する発現ベクター中に導
入することにより達成された。組換えクローンの抽出物
からFXIII−活性蛋白質を単離することが可能であっ
た。
酵母を生育する条件及び分子生物学的方法は、ディロン
等〔Dillon et al.「組換えDNA方法」(Recombinan
t DNA Methodolgy). John Wiley & Sons,New York(198
5)〕及びマニアティス等(Maniatis et al.上掲)に
説明されている。
等〔Dillon et al.「組換えDNA方法」(Recombinan
t DNA Methodolgy). John Wiley & Sons,New York(198
5)〕及びマニアティス等(Maniatis et al.上掲)に
説明されている。
FXIIIcDNAは約2700bpの大きさのHindII
I断片としてベクターpFXIII−13から単離され、ベ
クターpAAH5〔アメラー(Ammerer)、メソッド・オ
ブ・エンザイモロジー(Meth.Enzymol.)101(1983)192-2
01〕のHindIII部位中にクローン化された。即ち、
得られたプラスミドpHB240(第4図)中のFXIII
cDNAはアルコールデヒドロゲナーゼの遺伝子発現信
号を含有する強ADHIプロモータの制御下にある。こ
のプラスミドpMB240をパン酵母、サッカロミセス
・セレビシエ(Saaccharomyces cerevisias)、株Leu
2−3、Pep4−3中にイトウ等〔Itoh et al.ジヤ
ーナル・オブ・バクテリオロジー(J.Bacteriol.)153(19
83). 163-168 〕の方法により形質転換し、及びLeu
+形質転換体をYNB最小培地上で選択した。形質酵母
細胞の一つのコロニーを用いてYNB培地を有する液体
培養液に接種した。30℃で2日間生育後複合YPB培
地中への転移を行ない、及び更に3日後細胞を遠心分離
により取出し、100mMクエン酸ナトリウムを含有す
る等張塩溶液(pH7.2)中でガラスビーズミルによ
り破壊した。細胞抽出物をSorvall 高速遠心分離器内の
SS34ローター内で20,000rpm において4℃で
1時間高速遠心分離にかけた。
I断片としてベクターpFXIII−13から単離され、ベ
クターpAAH5〔アメラー(Ammerer)、メソッド・オ
ブ・エンザイモロジー(Meth.Enzymol.)101(1983)192-2
01〕のHindIII部位中にクローン化された。即ち、
得られたプラスミドpHB240(第4図)中のFXIII
cDNAはアルコールデヒドロゲナーゼの遺伝子発現信
号を含有する強ADHIプロモータの制御下にある。こ
のプラスミドpMB240をパン酵母、サッカロミセス
・セレビシエ(Saaccharomyces cerevisias)、株Leu
2−3、Pep4−3中にイトウ等〔Itoh et al.ジヤ
ーナル・オブ・バクテリオロジー(J.Bacteriol.)153(19
83). 163-168 〕の方法により形質転換し、及びLeu
+形質転換体をYNB最小培地上で選択した。形質酵母
細胞の一つのコロニーを用いてYNB培地を有する液体
培養液に接種した。30℃で2日間生育後複合YPB培
地中への転移を行ない、及び更に3日後細胞を遠心分離
により取出し、100mMクエン酸ナトリウムを含有す
る等張塩溶液(pH7.2)中でガラスビーズミルによ
り破壊した。細胞抽出物をSorvall 高速遠心分離器内の
SS34ローター内で20,000rpm において4℃で
1時間高速遠心分離にかけた。
S.セレビシエ(pMB240)の細胞を除去した上澄
液をウェスタンブロット法により分析した。胎盤からの
FXIIIと同一位置に検出することのできるバンドに加え
て、約116,000Dの蛋白質が用いられた抗−FXI
II血清と特異的に反応した。これか酵母中に形成された
FXIIIの一部がグリゴシル化されたことを証明する。蛋
白質のグリコシル化はしばしば蛋白質、特に血漿蛋白
質、の半減期を延長する因子である。加えて、蛋白質の
側鎖は血漿蛋白質例えばアンチトロンビンIIIの活性を
増大するか或いは作用の期間を延長することがある。酵
母において発現され、且つ胎盤から得られたFXIIIとは
対照的にグリコシル化されているか或いはその他の何等
かの形で翻訳後修飾を行なったFXIIIは、増大した活性
のため胎盤からのFXIIIに対して利点を有し得る。
液をウェスタンブロット法により分析した。胎盤からの
FXIIIと同一位置に検出することのできるバンドに加え
て、約116,000Dの蛋白質が用いられた抗−FXI
II血清と特異的に反応した。これか酵母中に形成された
FXIIIの一部がグリゴシル化されたことを証明する。蛋
白質のグリコシル化はしばしば蛋白質、特に血漿蛋白
質、の半減期を延長する因子である。加えて、蛋白質の
側鎖は血漿蛋白質例えばアンチトロンビンIIIの活性を
増大するか或いは作用の期間を延長することがある。酵
母において発現され、且つ胎盤から得られたFXIIIとは
対照的にグリコシル化されているか或いはその他の何等
かの形で翻訳後修飾を行なったFXIIIは、増大した活性
のため胎盤からのFXIIIに対して利点を有し得る。
細胞を除去した上澄液をELISAによりFXIIIについ
て調べ、FXIII濃度が酵母培養液に基づき150ng/
mlであることが判明した。FXIIIの生物学的活性は上掲
のカルゲスの方法により求められ、ELISAにおいて
測定された濃度を確認した。パン酵母から得られたFXI
IIの生物学的活性は抗−FXIII抗体により特異的に阻害
することができたので、非−特異的FXIII様活性を酵母
蛋白質により除外することが可能であった。
て調べ、FXIII濃度が酵母培養液に基づき150ng/
mlであることが判明した。FXIIIの生物学的活性は上掲
のカルゲスの方法により求められ、ELISAにおいて
測定された濃度を確認した。パン酵母から得られたFXI
IIの生物学的活性は抗−FXIII抗体により特異的に阻害
することができたので、非−特異的FXIII様活性を酵母
蛋白質により除外することが可能であった。
5.FXIIIaの動物細胞における発現 a)動物細胞のための発現ベクターの構成 発現ベクターpSVA STOP1は***特許出願P3
6 24 453・8(このベクターの合成に関するこ
の出願の実施例1は抜粋して付表に再現した)に提案さ
れている。このプラスミドの他に動物細胞におけるFXI
IIaの発現のためにベクターpZET4(下記参照)及
びドロソフィラ(Drosophila)熱衝撃蛋白質70プロモ
ータ〔ウルム等(Wurm et al.)、 Proc.Natl.Acad. Sci.
USA 83(1986)5414-5418〕を有するpSP6HS9を用
いた。
6 24 453・8(このベクターの合成に関するこ
の出願の実施例1は抜粋して付表に再現した)に提案さ
れている。このプラスミドの他に動物細胞におけるFXI
IIaの発現のためにベクターpZET4(下記参照)及
びドロソフィラ(Drosophila)熱衝撃蛋白質70プロモ
ータ〔ウルム等(Wurm et al.)、 Proc.Natl.Acad. Sci.
USA 83(1986)5414-5418〕を有するpSP6HS9を用
いた。
pZET4(第5図):プラスミドpSVA STOP
1をBamHIで切断し、2.6kbの大きさでSV4
0初期プロモーターを有するベクター断片を単離した。
pSV2dhfr(リー等(Lee et al.)、ネーチャー
(Nature)294(1981)228-232 〕からの0.85kbの大
きさのBglII−BamHI断片をこの様にして予備処
理されたベクター中に連結し、その結果プラスミドpZ
ET4が得られた。pSV2dhfrからの0.85k
b断片上にはエキソン−イントロン連結からのmRNA
スプライス部位及びSV40DNAからのt抗原に対す
る遺伝子のポリアデニル化部位が位置している。
1をBamHIで切断し、2.6kbの大きさでSV4
0初期プロモーターを有するベクター断片を単離した。
pSV2dhfr(リー等(Lee et al.)、ネーチャー
(Nature)294(1981)228-232 〕からの0.85kbの大
きさのBglII−BamHI断片をこの様にして予備処
理されたベクター中に連結し、その結果プラスミドpZ
ET4が得られた。pSV2dhfrからの0.85k
b断片上にはエキソン−イントロン連結からのmRNA
スプライス部位及びSV40DNAからのt抗原に対す
る遺伝子のポリアデニル化部位が位置している。
b)動物細胞のためのFXIIIa発現ベクターの構築 pSVF13(第5a図):発現ベクターpSVA S
TOP1をHindIII及びXbaIで切断した。約
2.7kbの大きさのFXIIIacDNAを有するpFXI
II−13からのHindIII−XbaI断片をこの様に
して処理されたベクター中に連結した。pSVF13上
にFXIIIa転写単位はmRNAスプライス部位を有しな
い。
TOP1をHindIII及びXbaIで切断した。約
2.7kbの大きさのFXIIIacDNAを有するpFXI
II−13からのHindIII−XbaI断片をこの様に
して処理されたベクター中に連結した。pSVF13上
にFXIIIa転写単位はmRNAスプライス部位を有しな
い。
pZF13(第5b図):約2.7kbの大きさのFXI
IIacDNAを有するHindIII断片をプラスミドp
FXIII−13から単離した。得られた5′突出末端を相
補鎖内にDNAポリメラーゼI(クレノウ断片)で埋填
することにより除去した。発現ベクターpZET4を独
特のXbaI部位において切断することにより線型化し
た。得られた5′突出末端を同様に相補鎖内においてD
NAポリメラーゼI(クレノウ断片)により埋填するこ
とにより除去した。この埋填ベクターと内充填FXIIIa
cDNA断片の連結の結果、FXIIIa発現プラスミドp
ZF13が得られた。pSVF13におけると同様に、
FXIIIacDNAはSV40初期プロモータの転写制御
下にあるが、しかし、mRNAスプライス部位を備えて
いる。
IIacDNAを有するHindIII断片をプラスミドp
FXIII−13から単離した。得られた5′突出末端を相
補鎖内にDNAポリメラーゼI(クレノウ断片)で埋填
することにより除去した。発現ベクターpZET4を独
特のXbaI部位において切断することにより線型化し
た。得られた5′突出末端を同様に相補鎖内においてD
NAポリメラーゼI(クレノウ断片)により埋填するこ
とにより除去した。この埋填ベクターと内充填FXIIIa
cDNA断片の連結の結果、FXIIIa発現プラスミドp
ZF13が得られた。pSVF13におけると同様に、
FXIIIacDNAはSV40初期プロモータの転写制御
下にあるが、しかし、mRNAスプライス部位を備えて
いる。
pHSF13(第5c図):プラスミドpPVF13を
EcoRIにより部分的に消化し、約2.9kbの大き
さのFXIIIacDNAに引続き初期転写のためのSV4
0ポリアデニル化部位を有する断片を単離した。この断
片を熱衝撃蛋白質70プロモータの下流のプラスミドp
SP6HS9の独特のEcoRI部位中に連結した。
EcoRIにより部分的に消化し、約2.9kbの大き
さのFXIIIacDNAに引続き初期転写のためのSV4
0ポリアデニル化部位を有する断片を単離した。この断
片を熱衝撃蛋白質70プロモータの下流のプラスミドp
SP6HS9の独特のEcoRI部位中に連結した。
c)CHO(支那ハムスター卵巣)dhfr−細胞の共ト
ランスフェクションのためのDHFR発現ベクター DHFRベクターpSV2dhfr(リー等、上掲)或
いはプロモータのないDHFRプラスミドpSVOAd
hfr(***特許出願P36 24 453.8、参考
例参照)をCHO dhfr−細胞における説明された
FXIIIa発現ベクターによる共トランスフェクションに
用いた。両ベクター共、マウスからのDHFRcDNA
を有する。
ランスフェクションのためのDHFR発現ベクター DHFRベクターpSV2dhfr(リー等、上掲)或
いはプロモータのないDHFRプラスミドpSVOAd
hfr(***特許出願P36 24 453.8、参考
例参照)をCHO dhfr−細胞における説明された
FXIIIa発現ベクターによる共トランスフェクションに
用いた。両ベクター共、マウスからのDHFRcDNA
を有する。
d)BHK(ベビーハムスター腎臓)細胞の共トランスフ
ェクションのためのG418耐性を与えるベクター 説明されたFXIIIa発現ベクターをBHK細胞内でベク
ターpRMH140〔フジャック等(Hudziak et al.)ce
ll 31(1982).137-146〕で共トランスフェクションを行
なった。
ェクションのためのG418耐性を与えるベクター 説明されたFXIIIa発現ベクターをBHK細胞内でベク
ターpRMH140〔フジャック等(Hudziak et al.)ce
ll 31(1982).137-146〕で共トランスフェクションを行
なった。
e)CHO細胞内におけるFXIIIaの発現 プラスミドpZF13とDHFRベクターpSV2dh
frの組み合わせ及び発現プラスミドpSVF 13と
DHFRベクターpSVOAdhfrの組み合わせによ
る共トランスフェクションを、リン酸カルシウム沈澱法
〔グレアム及びファンデルEb(Graham andvan der Eb
)、ウイロロジー(Virology)52(1973 ) 456-467 〕を
用いてCHO dhfr−細胞で行なった。これは5μ
gのDHFRベクター(pSV2dhfr或いはpSV
OAdhfr)を混合され、及び共沈された20μgの
特定のFXIIIa発現プラスミド(pZF13或いはpS
VF13)を伴うものであった。この共沈澱物を上記ト
ランスフェクションに用いた(25cm2培養瓶中0.5
×106細胞)。3日後、細胞をトリプシン化し、3個
の60mmのペトリ皿に移し、選択培地(グリシン、ヒポ
キサンチン或いはチミジンを含有しない)と混合した。
これらの条件下に生残る細胞はDHFR遺伝子と安定な
トランスフェクションを行なったもののみである。トラ
ンスフェクトされた細胞のコロニーは1−3週間後にペ
トリ皿上に目に見えるようになる。この方法により次の
トランスフェクション速度が達成された: pSV2dhfr 5×10−5/プレート pSVOAdhfr 1×10-5/プレート。
frの組み合わせ及び発現プラスミドpSVF 13と
DHFRベクターpSVOAdhfrの組み合わせによ
る共トランスフェクションを、リン酸カルシウム沈澱法
〔グレアム及びファンデルEb(Graham andvan der Eb
)、ウイロロジー(Virology)52(1973 ) 456-467 〕を
用いてCHO dhfr−細胞で行なった。これは5μ
gのDHFRベクター(pSV2dhfr或いはpSV
OAdhfr)を混合され、及び共沈された20μgの
特定のFXIIIa発現プラスミド(pZF13或いはpS
VF13)を伴うものであった。この共沈澱物を上記ト
ランスフェクションに用いた(25cm2培養瓶中0.5
×106細胞)。3日後、細胞をトリプシン化し、3個
の60mmのペトリ皿に移し、選択培地(グリシン、ヒポ
キサンチン或いはチミジンを含有しない)と混合した。
これらの条件下に生残る細胞はDHFR遺伝子と安定な
トランスフェクションを行なったもののみである。トラ
ンスフェクトされた細胞のコロニーは1−3週間後にペ
トリ皿上に目に見えるようになる。この方法により次の
トランスフェクション速度が達成された: pSV2dhfr 5×10−5/プレート pSVOAdhfr 1×10-5/プレート。
個々のクローンを単離し、グリシン、ヒポキサンチン或
いはチミジンを含有しない培地内で増殖した。
いはチミジンを含有しない培地内で増殖した。
約3ng/mlの検出下限を有する特別のELISAを
用いて個々のクローンの培養上澄液及び細胞溶解物中の
FXIIIaを検出した。培養上澄液はELISAにおいて
そのまま使用した。細胞溶解物は次のようにして調製し
た: 25cm2培養瓶中の集密細胞を40mM tris H
Cl(pH7.4)、1mM EDTA、150mM
NaCl中で2回洗浄し、150μの0.25M t
ris・HCl(pH7.8)、5mM DTT、2%
グリセロール、0.2%洗剤(Triton x 100)中にと
り、及び3回冷凍及び解凍することにより溶解した。
用いて個々のクローンの培養上澄液及び細胞溶解物中の
FXIIIaを検出した。培養上澄液はELISAにおいて
そのまま使用した。細胞溶解物は次のようにして調製し
た: 25cm2培養瓶中の集密細胞を40mM tris H
Cl(pH7.4)、1mM EDTA、150mM
NaCl中で2回洗浄し、150μの0.25M t
ris・HCl(pH7.8)、5mM DTT、2%
グリセロール、0.2%洗剤(Triton x 100)中にと
り、及び3回冷凍及び解凍することにより溶解した。
細胞の不溶性成分は遠心分離により除去した。この溶解
物をELISAに使用するために1:2.5に稀釈し
た。説明された検出方法をプラスミドpZF13/pS
V2dhfrの組合わせに対して17クローンに適用し
て、FXIIIaを発現する一つのクローン(CHO59−
5−C7)が見出された。プラスミドpSVF13/p
SVOAdhfrで共トランスフェクション及び12ク
ローンの分析後、更にFXIIIa−発現クローン(CHO
60−3−C1)が検出された。これらの両者の陽性ク
ローンを用いて培地内及び溶解物中において同一の相対
的量でFXIIIaを検出することが可能であった。FXIII
aを生成する系統の発現速度を定量的に求めるために次
の標準的操作を行なった: 0.5×106個の細胞を25cm2培養瓶内の5mlの培
地中で培養した。この培地は24時間後交換した(5m
l)。更に24時間後培地を除去し、細胞カウント数を
求め溶解物を調製した。以後に述べる全ての発現速度
(ng/106細胞/24時間)に対して試験の終りに
おける25cm2瓶当りの細胞カウント数は1+0.25
×106細胞数であった。次の表は、説明された方法で
試験された基本クローンの発現速度を示す: SDS電気泳動に続いてクローンCHO59−5−C7
及びクローンCHO60−3−C1の溶解物及び上澄液
のFXIIIa−特異的免疫ブロッティングを行なったとこ
ろ、いずれの場合にもヒト胎盤から単離された蛋白質の
分子量を有する一つのバンドが反応を示した。
物をELISAに使用するために1:2.5に稀釈し
た。説明された検出方法をプラスミドpZF13/pS
V2dhfrの組合わせに対して17クローンに適用し
て、FXIIIaを発現する一つのクローン(CHO59−
5−C7)が見出された。プラスミドpSVF13/p
SVOAdhfrで共トランスフェクション及び12ク
ローンの分析後、更にFXIIIa−発現クローン(CHO
60−3−C1)が検出された。これらの両者の陽性ク
ローンを用いて培地内及び溶解物中において同一の相対
的量でFXIIIaを検出することが可能であった。FXIII
aを生成する系統の発現速度を定量的に求めるために次
の標準的操作を行なった: 0.5×106個の細胞を25cm2培養瓶内の5mlの培
地中で培養した。この培地は24時間後交換した(5m
l)。更に24時間後培地を除去し、細胞カウント数を
求め溶解物を調製した。以後に述べる全ての発現速度
(ng/106細胞/24時間)に対して試験の終りに
おける25cm2瓶当りの細胞カウント数は1+0.25
×106細胞数であった。次の表は、説明された方法で
試験された基本クローンの発現速度を示す: SDS電気泳動に続いてクローンCHO59−5−C7
及びクローンCHO60−3−C1の溶解物及び上澄液
のFXIIIa−特異的免疫ブロッティングを行なったとこ
ろ、いずれの場合にもヒト胎盤から単離された蛋白質の
分子量を有する一つのバンドが反応を示した。
クローンCHO59−5−C7を遺伝子増幅のためにメ
トトレキセート(Mtx)の増大する濃度に曝した。1
0nM Mtxの濃度及び4移動適応時間で出発し、培
地中のMtx濃度を50nMに増大した。次の発現速度
が標準的操作において求められた: f)BHK細胞におけるFXIIIaの発現 各々20μgのFXIIIa発現プラスミドpZF13、p
SVF13及びpHSF13をBHK細胞内において例
5e)において説明されるリン酸カルシウム沈澱法により
5μgのG418耐性をコードするプラスミドpRMH
140で共トランスフェクションを行なった。3日後、
細胞をトリプシン化し、3個の60mmペトリ皿に移し、
及び400μg/mlのG418を含有する選択培地と混
合した。12日後約200−300のG418耐性コロ
ニーが各ペトリ皿に生育していた。全部のクローンをト
リプシン化し、25cm2培養瓶中の合一したクローン
(CC)(5mlの培地)として転移させた。
トトレキセート(Mtx)の増大する濃度に曝した。1
0nM Mtxの濃度及び4移動適応時間で出発し、培
地中のMtx濃度を50nMに増大した。次の発現速度
が標準的操作において求められた: f)BHK細胞におけるFXIIIaの発現 各々20μgのFXIIIa発現プラスミドpZF13、p
SVF13及びpHSF13をBHK細胞内において例
5e)において説明されるリン酸カルシウム沈澱法により
5μgのG418耐性をコードするプラスミドpRMH
140で共トランスフェクションを行なった。3日後、
細胞をトリプシン化し、3個の60mmペトリ皿に移し、
及び400μg/mlのG418を含有する選択培地と混
合した。12日後約200−300のG418耐性コロ
ニーが各ペトリ皿に生育していた。全部のクローンをト
リプシン化し、25cm2培養瓶中の合一したクローン
(CC)(5mlの培地)として転移させた。
pZF13及びpSVF13でトランスフェクションさ
れた細胞の場合には、80−100%の集密度に到達し
た際にFXIIIaを特異的ELISAを用いて培地中及び
関連溶解物中で決定した(例5e)参照)。pHSF13
でトランスフェクションされ同様に80−100%の集
密度に到達した合一したクローンを42℃に予備加熱し
た新たな培地と混合し、42℃で1時間インキュベート
した。培地をもう1回37℃で平衡化された新鮮な培地
と交換した後、細胞を37℃で24時間維持した。これ
らの培地及び溶解物を次いで上記の如くそれらのFXIII
aの含量について調べた。下記表は各種合一クローンに
対するFXIIIaの細胞分布をまとめて示すものである。
れた細胞の場合には、80−100%の集密度に到達し
た際にFXIIIaを特異的ELISAを用いて培地中及び
関連溶解物中で決定した(例5e)参照)。pHSF13
でトランスフェクションされ同様に80−100%の集
密度に到達した合一したクローンを42℃に予備加熱し
た新たな培地と混合し、42℃で1時間インキュベート
した。培地をもう1回37℃で平衡化された新鮮な培地
と交換した後、細胞を37℃で24時間維持した。これ
らの培地及び溶解物を次いで上記の如くそれらのFXIII
aの含量について調べた。下記表は各種合一クローンに
対するFXIIIaの細胞分布をまとめて示すものである。
培地内に存在するFXIIIaに関する発現速度は例5e)に
おいて説明した標準的操作により個々の合一クローンに
対して求めた。以下に述べる全ての発現速度(ng/1
06細胞/24時間)に対して試験の終りにおける25
cm2瓶当りの細胞カウント数は4.5±0.5×106
細胞であった。
おいて説明した標準的操作により個々の合一クローンに
対して求めた。以下に述べる全ての発現速度(ng/1
06細胞/24時間)に対して試験の終りにおける25
cm2瓶当りの細胞カウント数は4.5±0.5×106
細胞であった。
これまでに説明されたトランスフェクションされたBH
K系統は生産しない或いはそれらの発現速度が異なる細
胞を含む混合物であったので、引続いてクローンを単離
することにより高発現速度を有する遺伝的に均一な細胞
系統を単離する試みがなされた。この目的のためには、
特別の合一されたクローンからの細胞を1細胞/ウェ
ル、2細胞/ウェル又は4細胞/ウェルの濃度でマイク
ロタイタープレート上に置いた。1個のみのクローンが
生育したウェルからの上澄液をFXIIIa−特異的ELI
SAにより分析した。最高発現速度のクローンを25cm
2培養瓶内で増殖させ、それらの発現速度を上記一般的
操作により検討した。以下の表はBHK−MK1(pZ
F13)を上記方法により単離することにより得られた
クローンの発現速度を示す。
K系統は生産しない或いはそれらの発現速度が異なる細
胞を含む混合物であったので、引続いてクローンを単離
することにより高発現速度を有する遺伝的に均一な細胞
系統を単離する試みがなされた。この目的のためには、
特別の合一されたクローンからの細胞を1細胞/ウェ
ル、2細胞/ウェル又は4細胞/ウェルの濃度でマイク
ロタイタープレート上に置いた。1個のみのクローンが
生育したウェルからの上澄液をFXIIIa−特異的ELI
SAにより分析した。最高発現速度のクローンを25cm
2培養瓶内で増殖させ、それらの発現速度を上記一般的
操作により検討した。以下の表はBHK−MK1(pZ
F13)を上記方法により単離することにより得られた
クローンの発現速度を示す。
BHK細胞系統MK1−E2を例にとり、これらの細胞
により合成されたFXIIIa分子が生物学的活性を有する
ことも示された。用いられたBHK MK1−E2系統
及び非−トランスフェクテッドBHK系統(陰性対照
例)を1.5mlの2%グリセロールを含有する0.25
M tris.HCl(pH7.8)にとった。これら
の細胞を3回冷凍及び解凍することにより溶解した後、
Dounceホモジナイザー内で処理した。不溶性構成
成分を遠心分離により除去後、溶解物を生物学的活性に
用いた(例3参照)。次のFXIIIa活性が見出された: BHK MK1−E2 0.06単位/108 細胞 BH中(トランスフェ 0単位/108細胞 クションされない) 参考例 独国特許出願P36 24・453.8からの例1 a)動物細胞のための発現ベクターの構成 プラスミドpVS2dhfr(リー等、上掲)をHin
dIII及びEcoRIで切断し、SV40初期プロモー
タを有する2.65kbベクター断片を単離した。pU
C12STOP〔ブローカー及びアマン(Broker and A
mann)、アプライド・マイクロバイオロジカル・バイオ
テクノロジー(Appl.Microbiol.Biotechnol.)23(1986)2
49-296〕からの67bp HindIII−EcoRI断
片をこの様にして予備処理されたベクター中に連結し、
その結果プラスミドpSV2STOPを得た。pUC1
2STOPからの67dp断片上には全ての三つの読取
枠内に翻訳停止コドンがある。pSV2STOPをSa
cIで線型化し、得られた3′突出末端をDNAポリメ
ラーゼIの3′→5′エキソヌクレアーゼ活性を用いて
除去した。次いでEcoRIによる消化を行なった。初
期のトランスクリプトに対するSV40ポリアデニル化
信号を有するpBB3〔B.ブラショト等(B.Bouracho
t et al.)、エンボ・ジャーナル(EMBO J.)1(1982)895-
900〕からの133bpの大きさのEcoRI−Hpa
I断片と連結後、発現ベクターpSVA STOP1を
得ることが可能であった。
により合成されたFXIIIa分子が生物学的活性を有する
ことも示された。用いられたBHK MK1−E2系統
及び非−トランスフェクテッドBHK系統(陰性対照
例)を1.5mlの2%グリセロールを含有する0.25
M tris.HCl(pH7.8)にとった。これら
の細胞を3回冷凍及び解凍することにより溶解した後、
Dounceホモジナイザー内で処理した。不溶性構成
成分を遠心分離により除去後、溶解物を生物学的活性に
用いた(例3参照)。次のFXIIIa活性が見出された: BHK MK1−E2 0.06単位/108 細胞 BH中(トランスフェ 0単位/108細胞 クションされない) 参考例 独国特許出願P36 24・453.8からの例1 a)動物細胞のための発現ベクターの構成 プラスミドpVS2dhfr(リー等、上掲)をHin
dIII及びEcoRIで切断し、SV40初期プロモー
タを有する2.65kbベクター断片を単離した。pU
C12STOP〔ブローカー及びアマン(Broker and A
mann)、アプライド・マイクロバイオロジカル・バイオ
テクノロジー(Appl.Microbiol.Biotechnol.)23(1986)2
49-296〕からの67bp HindIII−EcoRI断
片をこの様にして予備処理されたベクター中に連結し、
その結果プラスミドpSV2STOPを得た。pUC1
2STOPからの67dp断片上には全ての三つの読取
枠内に翻訳停止コドンがある。pSV2STOPをSa
cIで線型化し、得られた3′突出末端をDNAポリメ
ラーゼIの3′→5′エキソヌクレアーゼ活性を用いて
除去した。次いでEcoRIによる消化を行なった。初
期のトランスクリプトに対するSV40ポリアデニル化
信号を有するpBB3〔B.ブラショト等(B.Bouracho
t et al.)、エンボ・ジャーナル(EMBO J.)1(1982)895-
900〕からの133bpの大きさのEcoRI−Hpa
I断片と連結後、発現ベクターpSVA STOP1を
得ることが可能であった。
このポリアデニル化部位は又ベクターpIG6(ブラコ
ット等、上掲)からも単離することができる。全く同一
の方法によりSV40遺伝子から133bpBamHI
−HpaI断片を単離し、BamHI切断部位に埋填
し、及びEcoRIリンカーを付着することが可能であ
る。
ット等、上掲)からも単離することができる。全く同一
の方法によりSV40遺伝子から133bpBamHI
−HpaI断片を単離し、BamHI切断部位に埋填
し、及びEcoRIリンカーを付着することが可能であ
る。
pSVA STOP1はこの様にSV40初期プロモー
タと初期のトランスクリプトに対してSV40ポリアデ
ニル化信号の間に3個の独特の制限部位(HindIII
−SalI−XbaI)を有するクローニングポリリン
カー及び全ての三つの読取枠内に翻訳停止を有する配列
を有する。
タと初期のトランスクリプトに対してSV40ポリアデ
ニル化信号の間に3個の独特の制限部位(HindIII
−SalI−XbaI)を有するクローニングポリリン
カー及び全ての三つの読取枠内に翻訳停止を有する配列
を有する。
c)共トランスフェクションのためのDHFR発現ベクタ
ーの構成 共トランスフェクションに用いられるDHFRベクター
の出発点はプラスミドpMTVdhfrであった(リー
等、上掲)。pMTVdhfrはBglIIで切断し、D
NAの突出5′末端をDNAポリメラーゼI(クレノウ
断片)を用いて埋填した。EcoRIで消化後、4.4
7kbの大きさの断片を単離し、pBB3(ブラコット
等、上掲)からの133bpEcoRI−HpaI断片
と連結させた。この新しいプラスミドpMTVAdhf
rはMMTV−LTR及び初期のトランスクリプトのた
めのSV40ポリアデニル化部位を側面に配置されたマ
ウスDHFRcDNAを有する。
ーの構成 共トランスフェクションに用いられるDHFRベクター
の出発点はプラスミドpMTVdhfrであった(リー
等、上掲)。pMTVdhfrはBglIIで切断し、D
NAの突出5′末端をDNAポリメラーゼI(クレノウ
断片)を用いて埋填した。EcoRIで消化後、4.4
7kbの大きさの断片を単離し、pBB3(ブラコット
等、上掲)からの133bpEcoRI−HpaI断片
と連結させた。この新しいプラスミドpMTVAdhf
rはMMTV−LTR及び初期のトランスクリプトのた
めのSV40ポリアデニル化部位を側面に配置されたマ
ウスDHFRcDNAを有する。
pSVOAdhfrは大きさが1450bpでMMTV
−LTRを有するHindIII断片を削除することによ
りpMTVAdhfrから得られた。
−LTRを有するHindIII断片を削除することによ
りpMTVAdhfrから得られた。
pMTVAdhfr或いはpSVOAdhfrはいづれ
もmRNAスプライス部位を有しない。
もmRNAスプライス部位を有しない。
第1図はFXIIIaをコードするcDNA(コード化領域
を斜線で示す)及びこの下に単離及び特性付けられたク
ローンのDNA領域を示す説明図である。 第2図は発現プラスミドpFXIII−13の構成を示す説
明図である。明らかにするために、この図においては出
発プラスミドpIC19H−12.1及びpIC19H
−11.1並びにそれらの直下に位置するDNA断片は
一本鎖断片から構成された生成物pFXIII−13と同様
に二重線で表わされる。 第3図はプラスミドpTrc97Aの構築を示し、第3
a図はpTrc97A及びpFXIII−13からのpFXI
II−C4の構築を示し、第3b図はpFXIII−13及び
公知のプラスミドpIC20H及びpBD2からのpM
B259の構築を示す説明図である。 第4図はpFXIII−13及び公知のプラスミドpAAH
5からのプラスミドpMB240の構築を示す説明図で
ある。 第5図は公知のプラスミドpSV2dhfr及びプラス
ミドpSVA STOP1からのpZET4の構築を示
し、第5a図はpSVA STOP1及びpFXIII−1
3からのpSVF13の構築を示し、第5b図はpZE
T4及びpFXIII−13からのpZF13の構築を示
し、第5c図はpSVF13及び公知のプラスミドpS
P6H69からのpHSF13の構築を示す説明図であ
る。
を斜線で示す)及びこの下に単離及び特性付けられたク
ローンのDNA領域を示す説明図である。 第2図は発現プラスミドpFXIII−13の構成を示す説
明図である。明らかにするために、この図においては出
発プラスミドpIC19H−12.1及びpIC19H
−11.1並びにそれらの直下に位置するDNA断片は
一本鎖断片から構成された生成物pFXIII−13と同様
に二重線で表わされる。 第3図はプラスミドpTrc97Aの構築を示し、第3
a図はpTrc97A及びpFXIII−13からのpFXI
II−C4の構築を示し、第3b図はpFXIII−13及び
公知のプラスミドpIC20H及びpBD2からのpM
B259の構築を示す説明図である。 第4図はpFXIII−13及び公知のプラスミドpAAH
5からのプラスミドpMB240の構築を示す説明図で
ある。 第5図は公知のプラスミドpSV2dhfr及びプラス
ミドpSVA STOP1からのpZET4の構築を示
し、第5a図はpSVA STOP1及びpFXIII−1
3からのpSVF13の構築を示し、第5b図はpZE
T4及びpFXIII−13からのpZF13の構築を示
し、第5c図はpSVF13及び公知のプラスミドpS
P6H69からのpHSF13の構築を示す説明図であ
る。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 FI 技術表示箇所 (C12P 21/02 C12R 1:19) (C12P 21/02 C12R 1:865) (C12P 21/02 C12R 1:91)
Claims (2)
- 【請求項1】下記で表されるヒト血液凝固因子XIIIa の
アミノ酸配列をコードするDNA。 - 【請求項2】下記のコード鎖を有する、特許請求の範囲
第1項記載のDNA。
Applications Claiming Priority (4)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
DE3608280 | 1986-03-12 | ||
DE3608280.5 | 1986-06-26 | ||
DE19863621371 DE3621371A1 (de) | 1986-03-12 | 1986-06-26 | Gentechnische herstellung von faktor xiiia |
DE3621371.3 | 1986-06-26 |
Related Child Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
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JP3224813A Division JPH0761262B2 (ja) | 1986-03-12 | 1991-08-09 | 遺伝子操作による因子XIII aの製造法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPS6339585A JPS6339585A (ja) | 1988-02-20 |
JPH0640825B2 true JPH0640825B2 (ja) | 1994-06-01 |
Family
ID=25841904
Family Applications (2)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP62057902A Expired - Lifetime JPH0640825B2 (ja) | 1986-03-12 | 1987-03-12 | 遺伝子操作による因子XIIIaの製造 |
JP3224813A Expired - Lifetime JPH0761262B2 (ja) | 1986-03-12 | 1991-08-09 | 遺伝子操作による因子XIII aの製造法 |
Family Applications After (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP3224813A Expired - Lifetime JPH0761262B2 (ja) | 1986-03-12 | 1991-08-09 | 遺伝子操作による因子XIII aの製造法 |
Country Status (7)
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JP (2) | JPH0640825B2 (ja) |
AT (2) | ATE185604T1 (ja) |
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CA (1) | CA1341516C (ja) |
DE (3) | DE3621371A1 (ja) |
ES (2) | ES2140398T3 (ja) |
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DE3808048A1 (de) * | 1988-03-11 | 1989-09-21 | Behringwerke Ag | Verfahren zum affinitaetschromatografischen reinigen von faktor xiii |
DE3819463A1 (de) * | 1988-06-08 | 1989-12-14 | Behringwerke Ag | Expressionsvektoren zur herstellung unfusionierter proteine in mikroorganismen |
US5612456A (en) * | 1988-11-14 | 1997-03-18 | Zymogenetics, Inc. | Factor XIII compositions |
US5204447A (en) * | 1988-11-14 | 1993-04-20 | Zymogenetics, Inc. | Purification of factor xiii |
DE3905674A1 (de) * | 1989-02-24 | 1990-08-30 | Bosch Gmbh Robert | Leuchte insbesondere fuer kraftfahrzeuge |
CS136091A3 (en) * | 1990-05-10 | 1992-04-15 | Zymo Genetics | Agents for determining thrombi and their application |
AU3428493A (en) * | 1991-12-31 | 1993-07-28 | Zymogenetics Inc. | Novel human transglutaminases |
GB9424823D0 (en) * | 1994-12-08 | 1995-02-08 | Univ Leeds | Genetic basis of factor XIII activity |
AU4648096A (en) * | 1994-12-30 | 1996-07-24 | Zymogenetics Inc. | Bovine factor xiii |
US6207877B1 (en) | 1998-09-23 | 2001-03-27 | Aventis Behring Gmbh | Transgenic coagulation factor XIII defective animal and its use for testing wound healing and bleeding |
EP0989184B1 (en) * | 1998-09-23 | 2008-11-19 | CSL Behring GmbH | A transgenic coagulation factor XIII defective animal and its use for testing wound healing and bleeding |
EP1045026A1 (en) * | 1999-04-16 | 2000-10-18 | Aventis Behring Gesellschaft mit beschränkter Haftung | A transgenic coagulation factor XIII defective animal and its use for testing wound healing and bleeding |
CA2463530A1 (en) | 2001-10-09 | 2003-05-08 | Zymogenetics, Inc. | Method for inhibiting the formation of seromas using factor xiii |
EP1515142A1 (en) * | 2003-09-12 | 2005-03-16 | BioVisioN AG | Mass spectrometry methods for direct phenotyping of factor XIIIA polymorphisms |
JP5086093B2 (ja) | 2004-11-23 | 2012-11-28 | ジモジェネティクス、インコーポレイテッド | 組換え型ヒトxiii因子の精製 |
Family Cites Families (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
DE2916711A1 (de) * | 1979-04-25 | 1980-11-06 | Behringwerke Ag | Blutgerinnungsfaktoren und verfahren zu ihrer herstellung |
GB2125409B (en) * | 1982-08-04 | 1985-11-13 | Nat Res Dev | Genetic engineering |
DE3419581A1 (de) * | 1984-05-25 | 1985-11-28 | Behringwerke Ag, 3550 Marburg | Verfahren zur gewinnung einer faktor xiii-praeparation sowie ihre verwendung |
EP0268772B1 (en) * | 1986-09-19 | 1995-04-26 | ZymoGenetics, Inc. | Expression of biologically active factor XIII |
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- 1986-06-26 DE DE19863621371 patent/DE3621371A1/de not_active Ceased
-
1987
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- 1987-03-06 EP EP92105735A patent/EP0494702B1/de not_active Expired - Lifetime
- 1987-03-06 DE DE3752298T patent/DE3752298D1/de not_active Expired - Lifetime
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- 1987-03-06 DE DE3751368T patent/DE3751368D1/de not_active Expired - Lifetime
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- 1987-03-06 ES ES87103222T patent/ES2076926T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1987-03-11 CA CA000531727A patent/CA1341516C/en not_active Expired - Lifetime
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- 1987-03-12 JP JP62057902A patent/JPH0640825B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
1991
- 1991-08-09 JP JP3224813A patent/JPH0761262B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
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AU605757B2 (en) | 1991-01-24 |
EP0494702A3 (en) | 1992-11-19 |
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ES2140398T3 (es) | 2000-03-01 |
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EP0236978A3 (en) | 1988-12-21 |
DE3621371A1 (de) | 1987-09-17 |
JPH05192141A (ja) | 1993-08-03 |
DE3752298D1 (de) | 1999-11-18 |
EP0494702A2 (de) | 1992-07-15 |
CA1341516C (en) | 2006-11-28 |
EP0236978B1 (de) | 1995-06-28 |
ES2076926T3 (es) | 1995-11-16 |
DE3751368D1 (de) | 1995-08-03 |
EP0236978A2 (de) | 1987-09-16 |
ATE185604T1 (de) | 1999-10-15 |
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