JPH03505527A - 精製されたユビキチン・ヒドロラーゼ、それをコードするdna配列、およびポリペプチド回収の際のその使用 - Google Patents
精製されたユビキチン・ヒドロラーゼ、それをコードするdna配列、およびポリペプチド回収の際のその使用Info
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
65、ポリペプチドがヒトポリペプチドである請求項64記載の宿主細胞。
66、ポリペプチドがレラキシンもしくはインスリンのA鎖もしくはB鎖、ブロ
レラキシン、プロインスリン、インターフェロン、インターロイキン、成長ホル
モン、神経成長因子、トランスフォーミング成長因子、インスリン様成長因子、
またはDNアーゼである請求項65記載の宿主細胞。
67、請求項13記載のDNA配列にハイブリダイズしないDNAによってコー
ドされている単離された酵母ユビキチン・ヒドロラーゼ。
68、請求項13記載の配列にハイブリダイズせず、少なくとも約10個のヌク
レオチドを含有する核酸配列を含有するユビキチン・ヒドロラーゼをコードして
いる単離された核酸配列。
69、少な(とも約20個のヌクレオチドを含有する請求項68記載の核酸配列
。
70、少なくとも約30個のヌクレオチドを含有する請求項68記載の核酸配列
。
71、少なくとも約40個のヌクレオチドを含有する請求項68記載の核酸配列
。
72、ベクターで形質転換された宿主によって認識されるコントロール配列に機
能的に結合した請求項68記載の核酸配列を含有する発現ベクター。
73、 !I!1求項7求肥72記載ベクターで形質転換された宿主細胞。
74、原核性である請求項73記載の宿主細胞。
75、大腸菌である請求項74記載の宿主細胞。
76、ヒドロラーゼが緩衝液中に存在する請求項1記載の組成物。
77、第1成tとしてユビキチン・ヒドロラーゼを、そして第2成分として固定
化した抗−ユビキチン抗体を含有するキット。
78、第1成分として請求項76記載の組成物を、そして第2成分として固定化
した抗−ユビキチン抗体を含有するキット。
明 細 書
精製されたユビキチン・ヒドロラーゼ、それをコードするDNA配列、およびポ
リペプチド回収の際のその使用本発明は、ユビキチンータンパク質コンジュゲー
トの切断において酵素活性を有するユビキチン・ヒドロラーゼの精製に関する。
また、本発明は、組換え法を用いてユビキチン・ヒドロラーゼを製造する方法、
およびそれを用いてポリペプチドとユビキチンの融合体からポリペプチドを単離
する方法にも関する。
ユビキチンとして知られるポリペプチドは保存性が高(,8,565の分子量を
有し、76のアミノ酸残基を含んでいる。このポリペプチドは、他のタンパク質
と共に、または遺伝子間に全(停止コドンを含まずに繰り返される数の異なるタ
ンパク質の配列を含む遺伝子によってコードされている。ユビキチンは、Rec
hsteiner[Ann。
Rev、 Ce11. Biol、 34 : l−30(1987)]、およ
びRechsteiner、 M、編の” Ubiquitin″’(New
York : Plenum Press、 1988)に概説されている。
ユビキチンは胸腺ペプチドの研究中に初めて精製された。このペプチドのラジオ
イムノアッセイによって、これが植物、動物および酵母に広(見い出されるもの
であることがわかった[Goldstein et4−2218(1975)]
によって決定され、NH,−末端のメチオニンと74キチンの分解された形態で
あり、その生物学的機能において活性ではないことが後に示された。活性な形態
は76アミノ酸の形態であユビキチンは細胞内タンパク質のエネルギー依存性の
分解に関与していることがわかった[Ganoth et al、 、 J、
Biol、Chem、 263 : 12412−12419(1988)]。
真真核物においては、ユビキチンのタンパク質への共有コンジュゲート化がタン
パク質の選択的な分解に必須であるということが証明されている[Finley
and Varshavsky、Trends Biochem、 ScL
10 : 343−346(1985) ;およびFinley et al
、、Ce1l 37 : 43(1984)コ。
真核生物に特有のイソペプチダーゼが同定された。これらはインビトロで、ユビ
キチンのGly−COOH末端と他のポリペプチドのリジンのε−NH2基の間
で形成されるアミド結合を切断することが見い出された。例えば、イソペプチダ
ーゼはユビキチンとリソチームの間の結合を切断して遊離のリソチームを生成さ
せることが確認された[Bershko et al、 、 Proc、 Na
tl、 Acad、 Sci、 USA 81 : 1619−1623(19
84)]。また、未分解のヒストンの放出を伴ってエビキチン−ヒストン2Aコ
ンジユゲートを切断するイソペプチダーゼが網状赤血球抽出物において検出され
た[Andersen et al、 、 Bioct+emistry 20
:1100−1104(1981) ; Kanda et al、 、 B
iochim、 Biophys、^cta 870 : 64|7
およびHaas and Rose[Proc、 Natl、 Acad、 S
ci、 USA 78 : 6845−6848(1981)コをも参照。
イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過、ならびに全ヒストンおよびヒストン
H2Aセファロースのアフィニティークロマトグラフィーによって、イソペプチ
ダーゼがウシ胸腺から175倍に精製された[Kanda et al、、J、
Ce1l Biol、 99 : (4) PA135(1984)]。この精
製されたインペプチダーゼは、構造クロマチンタンパク質A24中のε−(グリ
シル)リジン結合に特異的であることがわかった。
インペプチダーゼが精製されると、これは増殖チャイニーズ・/%ムスター細胞
においては分子量250.000および34,000を有する2つの主な形態で
存在することがわかったが、ヒト赤血球およびウシ胸腺においては分子量250
.000の形態でのみ存在することがわかった。大きい形態の分解によって小さ
い方の形態が出現する結果にはならず、これら2つの形態の酵素は互いに別個の
ものであることがわかった[Matsui、J、Ce1l Biol、 105
: (4Part 2)、187A(1987)]。この著者は、大きい形態
は安定な構成酵素であり、早い回転速度を有する小さい形態は成長関連のユビキ
チンータンパク質コンジュゲートの代謝経路に関与していると示唆している。ま
た、銀染色の5DS−PAGEにおいて30kDaのインペプチダーゼ活性(カ
ルボキシ末端ヒドロラーゼと呼ばれる)がヒト赤血球において同定されている[
Pickart and Rose、 J、 Biol、 Chem、 260
: 7903−7910(1985)]。この同じ酵素が、ユビキチンータン
パク質融合体のプロセッシングに関与していると同様に、切断に関与しているこ
ともある[Pickart and Rose、 J、 Biol、 Chew
、 261 : 10210−10217(1986)]。この酵素は、小さい
チオールのユビキチンエステルを加水分解することがわかっていたので、以前は
ユビキチン力ルボキシ末端エステラーゼと呼ばれていた[Rose and W
arms、 Biochemistry 22 : 4234−4237(19
83)]。
1088102406(1988年4月7日公開)に、人工のユビキチンータン
パク質融合体の使用を導入することに基づいて特定のアミノ末端を得るためにタ
ンパク質または遺伝子レベルでタンパク質構造を設計または修飾するということ
に関連して、プロセッシングプロテアーゼの活性が報告されている。
ユビキチンアルデヒドはほとんどのヒドロラーゼと強固なコンプレックスを形成
することがわかっている;例えば、20QkDa以上の大きいユビキチンータン
パク質ヒドロラーゼ、小さい30kDaカチオン性ヒドロラーゼ、およびユビキ
チンの低分子量コンジュゲートに作用する30kDaの大きいヒドロラーゼ[R
ose et al、 、 Fed、 Pr。
c、 46 : (6)、2087(1987)]。ユビキチンヒドロラーゼは
、小さい求核基による捕捉からユビキチンを守るのに重要であるのに加えて、徐
々にしか分解されないタンパク質コンジュゲートからユビキチンを再生利用する
ために必要であると結論された。
種々の生物由来のユビキチンをコードしている遺伝子の分子遺伝学的方法による
最近の分析によって、ユビキチンは、多数の連続したユビキチン配列を有するポ
リュビキチン前駆体として、あるいはユビキチンがさらに大きなタンパク質のN
−末端ドメインに位置しているタンパク質融合体として合成されることが示され
た[OzkaynChew、 260 : 7609−7613(1985)コ
。ポリュビキチン遺伝子中のユビキチン配列の最後のコピーには、通常、特有の
Arg−Gly−Gly末端の後ろに1つのアミノ酸延長部分が続いている[0
zkaynak et al、 :上記]。
ユビキチンータンパク質コンジュゲートの切断に関する別の発見によって、ユビ
キチンーβ−ガラクトシダーゼ融合タンパク質をコードしているキメラ遺伝子が
酵母中で発現されたときには、ユビキチンはこの融合タンパク質から切断され、
脱ユビキチン化されたβ−ガラクトシダーゼが生成することが明らかになった。
この内タンパク質加水分解は、1つの例外を除いて、ユビキチンーβ−gal連
結点のβ−galのアミノ酸残基の性質によらず起こることがわかった[Bac
ba+air et al、 、 5cience 234 : 179−18
6(1986)loまた、別の残基をその他は同一のβ−ga1タンパク質のア
ミノ末端のところで暴露することもできることがわかった。これらの著者は、そ
の時点で生化学的に特徴付けられていない同一のプロテアーゼが、ポリュビキチ
ンの成熟ユビキチンへの変換、および形成期ユビキチンーβ−galタンパク質
の脱ユビキチン化の両方の原因であると示唆している。
組合せのインビトロ転写/翻訳系を用いたときにポリュビキチンをユビキチンに
変換するタンパク質加水分解活性が異なる研究者によって検出された[Agel
l et al、、J、Ce1l Biol、 105 : (4pt 2)
、82a(1987) :およびAgell et al、 、 Proc、
Natl、 Acad、 Sci、 USA 85 : 3693−R
697(1988)]。]ポリュビキチンプロセッシング活は、ユビキチン・ヒ
ドロラーゼの既知の阻害物質であるユビキチンアルデヒドによって部分的に阻害
された。このタンパク質加水分解活性の精製された調製物は不活性であることが
わかり、次いで推定のプロテアーゼの尚一層の精製が進行中であることが報告さ
れた。
1988年9月26日のAmerican Chemical 5ociety
の会議で、ChironCorp、は、直接発現させることが難しいことがわか
りている遺伝子を酵母ユビキチンの合成遺伝子に融合させると、内生の酵母プロ
テアーゼによってインビボで切断された成熟ポリペプチドとして所望のタンパク
質が高レベルで細胞内生産されることが可能になることを開示した。1988
ACS 人bstract Book、^bs、 No、34. PJ、Bar
r etal、、r酵母Saccharomyces cerevisiaeに
おける組換えDNA誘導の医薬の製造」を参照。
切断などの不可逆的な工程を用いる物質の精製に関して、ある次元での大きさま
たは電荷、次いで第2の次元での可視化のためにタンパク質フラグメントを不可
逆的に変えるのに用いる試薬によってタンパク質フラグメントを分離し得ること
が報告されていた。この研究の目的はタンパク質からアミノ酸配列を得ることで
あった[Bartley et al、、Biochea+、J、 80
: 36(1961)コ。
さらに、「識別」ペプチドを用いて融合産物からタンパク質を回収および精製す
ることが知られている[EP 150.126(1985年7月31日公開):
米国特許N o、 4.703.004と同等コ。この方法では、識別ペプチド
を用い、この識別ペプチドのC−末端に所望の機能的タンパク質を融合させてハ
イブリッドのポリペプチドを合成する。この識別ペプチドの結合部分を、配列特
異的なタンパク質加水分解酵素または化学的試薬を用いて機能的タンパク質に隣
接する特異的なアミノ酸残基のところで切断する。このハイブリッドのポリペプ
チドを、識別ペプチドの抗原部分に特異的な固定化配位子を用いるアフィニティ
ー・クロマトグラフィーによって精製する。次いで、単離したハイブリッドのポ
リペプチドから、適当なタンパク質加水分解試薬を用いてタンパク質を切断し、
成熟した機能的タンパク質を放出させる。
また、識別ペプチドリンカ−または抗体を用いる融合体からの産物の回収も開示
されている[EP 35.384(1981年9月9日公開)、および米国特許
N o、 4.732.852(1988年3月22日発行)]。さらに、荷電
したアミノ酸ポリマーとの融合産物としてのポリペプチドの組換え製造、ポリマ
ーの性質に基づく不純物からの融合産物の分離、およびエキソペプチダーゼを用
いる融合産物からのポリマーの切断も報告されている[米国特許No、 4.5
32.207(1985年7月30日発行)コ。
組換え法によって得られた融合タンパク質を切断する際に付随する主な問題は、
正確かつ一定して生成タンパク質から融合タンパク質部分を除去するための特異
的な切断試薬が存在しないことである。
臭化シアンもしくはヒドロキシアミンなどの化学的試薬、または因子Xaもしく
はコラゲナーゼなどの特異的なプロテアーゼ(通常、これらは切断を行うために
用いられる)は、通常、限定された数のタンパク質融合切断において工業的に有
用であるにすぎない。
例えば、融合タンパク質の切断に必要とされる特異的なアミノ酸(臭化シアンの
ためのメチオニンなど)が所望のタンパク質産物のアミノ酸配列の内部に存在し
ているときには、この産物は融合ポリペプチドから切断されると共に内部でも切
断されるであろう。この理由およびその他の理由により、通常、切断試薬はある
タンパク質産物に対してだけ特異的である。さらに、切断それ自体が生成タンパ
ク質に余分のアミノ酸残基を残すこともある。また、切断試薬のほとんど全てが
、切断後に生成したさらに複雑な混合物を精製するために余分の回収工程を必要
とする。
従って、本発明の目的は、配列決定をすることができる程度に十分精製されたユ
ビキチン・ヒドロラーゼを提供することである。
別の目的は、組換え法を用いてユビキチン・ヒドロラーゼを製造することにより
、供給源タンパク質を含まない工業用に有用な大量のユビキチン・ヒドロラーゼ
を提供することである。
さらに別の目的は、これまで確認されていなかった酵母のユビキチン・ヒドロラ
ーゼを得るための方法を提供することである。
他の目的は、成熟ポリペプチド製造し、精製するための方法であって、特異的か
つ効率的に生成物部分から融合タンパク質部分を除去すること、融合体回収工程
の数および複雑さを減少させること、および余分の不要な末端アミノ酸残基を含
まない正確かつ再現性ある生成物の切断を得ることを特徴とする方法を提供する
ことである。
これらおよびその他の目的は当業者には明らかであろう。
本発明の1つの態様においては、これらの目的は、組成物中の全タンパク質の重
量に基づいて少なくとも70%均質性の純度のユビキチン・ヒドロラーゼを含有
する組成物によって達成される。
別の態様においては、本発明は、ユビキチン・ヒドロラーゼを精製するための方
法であって、
(a)真核細胞発酵ペーストをホモジナイズし、このホモジネートからユビキチ
ン・ヒドロラーゼ活性を含有する部分を回収し;(b)工程(a)で回収したヒ
ドロラーゼ含有部分からユビキチン・ヒドロラーゼ活性を含有する沈澱物を塩沈
澱させ;(c)この沈澱物の溶液をイオン交換樹脂と接触させ、ユビキチン・ヒ
ドロラーゼ活性の分画を回収し:
(d)ユビキチン・ヒドロラーゼ活性の分画を疎水性のアフィニティー樹脂と接
触させ、この樹脂に吸着されたユビキチン・ヒドロラーゼ活性の分画を回収し;
(e)ユビキチン・ヒドロラーゼ活性の分画を吸着クロマトグラフィー樹脂と接
触させ、この樹脂に吸着されたユビキチン・ヒドロラーゼ活性の分画を回収し:
そして
(f)ユビキチン・ヒドロラーゼ活性の分画をイオン交換樹脂と接触させ、ヒド
ロラーゼ活性の分画を回収することを特徴とする方法を提供するものである。
さらに別の態様において、本発明は、ユビキチン・ヒドロラーゼまたはそのフラ
グメントもしくは変異体をコードしている配列を含有する単離された核酸配列、
ベクターで形質転換された宿主によって認識されるコントロール配列に機能的に
結合した該核酸配列を含有する発現ベクター、および該ベクターで形質転換され
た宿主細胞を提供するものである。この核酸はDNAであるのが好ましいが、R
NAまたはRNAベクター(レトロウィルス)であってもよい。
さらに具体的な態様においては、本発明は、ストリンジェントな条件下で第5図
のDNA配列とハイブリダイズする配列であって、少なくとも約10個のヌクレ
オチドを含有する配列を含有する単離されたDNA配列を提供するものである。
このDNA配列は、好ましくは少なくとも約20個のヌクレオチド、さらに好ま
しくは約30個のヌクレオチド、最も好ましくは約40個のヌクレオチドを含有
している。
さらに別の態様においては、本発明は、ユビキチン・ヒドロラーゼのアミノ酸配
列を十分に複製するアミノ酸配列を有する酵素であって、ユビキチンとポリペプ
チドを結合させているアミド結合のところでユビキチンーポリペプチドコンジュ
ゲートを加水分解し、それによってコンジュゲート化されていない成熟N−末端
を有する無傷のポリペプチドを与える酵素をコードしているDNA配列を含有す
る単離されたDNA配列を提供するものである。また、本発明は、適当なコント
ロール配列に機能的に結合したそのようなりNA記列を含有する発現ベクター、
およびそのようなベクターで形質転換された大腸菌(E、coli)などの宿主
をも提供するものである。
他の態様においては、本発明は、ユビキチンーポリベブチドコンジュゲートをイ
ンビトロで切断するための方法であって、(a)組換え宿主細胞培養の不純生成
物を含有する組成物においてユビキチンーポリペブチドコンジュゲートを得(こ
こで、該ポリペプチドはユビキチンのC−末端にコンジュゲートしており、また
、該ポリペプチドはそのN−末端にプロリン以外の任意のアミノ酸を含有してい
る);
(b)この組成物をユビキチンに対して特異的な親和性を有する試薬と接触させ
てコンジュゲートを試薬に吸着させ、試薬とその吸着されたコンジュゲートを組
成物の残りから分離し、試薬からコンジュゲートを回収し:
(C)回収したコンジュゲートをユビキチン・ヒドロラーゼと接触させることに
よってコンジュゲートをユビキチンと成熟ポリペプチドに加水分解し、ユビキチ
ン・ヒドロラーゼを固定化し:そして(d)工程(C)で得られた物質をユビキ
チンに対して特異的な親和性を有する試薬と接触させて残留コンジュゲートおよ
び遊離ユビキチンの全てを試薬に吸着させ、試薬およびそれに吸着した物質を含
まないポリペプチドを回収すること
を特徴とする方法に関する。
さらに異なる態様においては、本発明は、ユビキチンーポリベブチドコンジュゲ
ートをインビトロで切断するための方法であって、(a)組換え宿主細胞培養の
不純生成物を含有する組成物においてユビキチンーポリベプチドコンジュゲート
を得(ここで、該ポリペプチドはユビキチンのC−末端にコンジュゲートしてお
り、また、該ポリペプチドはそのN−末端にプロリン以外の任意のアミノ酸を含
有している);
<b>この組成物をユビキチンに対して特異的な親和性を有する試薬と接触させ
てコンジュゲートを試薬に吸着させ、試薬とその吸着されたコンジュゲートを組
成物の残りから分離し;(d)コンジュゲートが吸着した試薬をユビキチン・ヒ
ドロラーゼと接触させ;
(e)試薬からヒドロラーゼとポリペプチドを分離し;そして(f)ヒドロラー
ゼからポリペプチドを分離することを特徴とする方法に関する。
別の態様においては、本発明は、ユビキチンーポリペブチドコンジュゲートをイ
ンビボで切断するための方法であって、(a)染色体中に組込まれたユビキチン
・ヒドロラーゼをコードしているDNAを有し、そしてユビキチンーボリペブチ
ドコンジュゲートをコードしているヌクレオチド配列を含有する発現ベクターで
形質転換された原核宿主細胞を培養してコンジュゲートを発現させ(ここで、該
ポリペプチドはユビキチンのC−末端にコンジュゲートしており、また、該ポリ
ペプチドはそのN−末端にプロリン以外の任意のアミノ酸を含有している);そ
して(b)ユビキチン(これにポリペプチドがコンジュゲートしていた)を含ま
ないポリペプチドを培養細胞から回収することを特徴とする方法を提供するもの
である。
さらに別の態様においては、本発明は、染色体中に組込まれたユビキチン・ヒド
ロラーゼをコードしているDNAを有する原核宿主細胞を提供するものである。
これらのうちで最も好ましいのは、ユビキチンーポリペブチドコンジュゲートを
コードしているヌクレオチド配列を含有する発現ベクターによっても形質転換さ
れている宿主細胞である(ここで、該ポリペプチドはユビキチンのC−末端にコ
ンジュゲートしており、また、該ポリペプチドはそのN−末端にプロリン以外の
任意のアミノ酸を含有している)。
また、本発明は、少なくとも約10個のヌクレオチド、好ましくは少なくとも約
20個、より好ましくは少なくとも約30個、最も好ましくは少なくとも約40
個のヌクレオチドを含有し、そして第5図のDNA配列にストリンジェントな条
件下でハイブリダイズするDNA配列にハイブリダイズしないDNAによってコ
ードされている単離された酵母ユビキチン・ヒドロラーゼに関する。同様に、本
発明は、上に規定したD N A配列にハイブリダイズしない核酸配列を含有す
るユビキチン・ヒドロラーゼをコードし7ている単離された核酸配列を提供する
ものである。さらに、本発明は、ベクターで形質転換された宿主によって認識さ
れるコントロール配列に機能的に結合したこの核酸配列を含有する発現ベクター
を提供するものである。最後に、本発明はこの発現ベクターで形質転換された宿
主細胞を提供するものである。
別の態様においては、本発明は、緩衝液中に本発明のユビキチン・ヒドロラーゼ
を含有している酵素組成物、ならびに第1の成分としてユビキチン・ヒドロラー
ゼおよび第2の成分として固定化した抗−ユビキチン抗体を含有するキットを提
供するものである。
本発明は、組換え法によってユビキチン・ヒドロラーゼまたはその誘導体を製造
すること、ならびにそのような製造に関連した産物および方法を提供することを
可能にするものである。さらに、本発明は、別のタンパク質との融合体から成熟
タンパク質およびポリペプチドを回収するための簡単かつ効率的な方法を可能に
するものである。また、本発明は、望ましくない位置での切断または分泌につい
て配慮することな(変異ポリペプチドおよびタンパク質を発現させることを可能
にするものである。
本発明のインビボ切断法は、細胞中で通常は不安定であるか、または分泌される
ことが望ましくない、原核生物からのポリペプチドの細胞内産生を可能にする(
例えば、N−末端メチオニンを有さないヒト成長ホルモンおよびγ−インターフ
ェロンなど)。前者の場合には、N−末端メチオニンは産生中に存在している必
要がなく、タンパク質が培地から回収された後に除去される必要もない。
第1a図は、ユビキチン融合ポリペプチドをコードしているXbaIからHfn
dIIIまで延びる合成遺伝子の配列を示すものである。ここで、ポリペプチド
は、ヘキサペプチドに結合した32アミノ酸のヒト(H2)レラキシンB鎖(N
−末端アミノ酸を欠き、そのN−末端で結合している)である。このヘキサペプ
チドは、次にそのN−末端のところでユビキチンのC−末端に結合している。こ
の6アミノ酸はどのような天然配列をもコードしていない。
第1b図は、ユビキチン融合ポリペプチドをコードしているDraIIIからH
indIII部位まで延びる合成遺伝子の配列を示すものである。ここで、ポリ
ペプチドは33アミノ酸のヒト(H2)レラキシンB鎖である。
第1c図は、T7ボリメラーゼ(Pi□)によって認識されるphilOプロモ
ーターを与える中間プラスミドであるpT7−12TNFの構築を示すものであ
る。
第1d図は、ユビキチン・ヒドロラーゼ活性の検定に用いられるユビキチン融合
ポリペプチドを含有するいくつかのベクターのpT7−12TNFからの構築を
示すものである。pTrpLJbs−X系列のプラスミドは、ユビキチン融合ポ
リペプチドを大量に製造する際に工業的に有用である。
第2図は、ユビキチン・ヒドロラーゼ検定を図式的に示すものである。
第3図は、酵母ユビキチン・ヒドロラーゼ(本明細書中ではYUH−1と呼ぶ)
のヌクレオチド配列および予想のアミノ酸配列を示すものである。タンパク質の
予想アミノ酸はDNA配列の下に示し、タンパク質配列の提案N−末端の第1残
基から数を付した。また、この図には、酵母ゲノムライブラリーをスクリーニン
グして酵母ユビキチン・ヒドロラーゼをコードしているクローンを得るためのP
robe 1を導(のに用いられるポリペプチドのアミノ酸配列も示されている
。
第4図は、酵母ユビキチン・ヒドロラーゼをコードしている遺伝子を配列決定す
るためのM13mp18およびM13mp19中のBanHl−8ailフラグ
メントの配向を示すものである。
第5図は、第3図に示されている酵母ユビキチン・ヒドロラーゼYUH−1のヌ
クレオチド配列および予想アミノ酸配列ならびにそれと境界を接するHfndI
IIからBamHIまでの領域を示すものである。3つの配列決定されたペプチ
ド(14,8および17と数を付した)の位置は星印で示した。53−marの
プローブ配列を正しいDNA配列の下に示した。誤対合は小文字で示した。この
プローブは正しいDNA配列に87%一致している。
第6図は、大腸菌を形質転換してユビキチン・ヒドロラーゼを過産生させるため
に用いるpTRP−UbiA由来の発現プラスミドpTRP−YUHの構築を示
すものである。
第7図は、大腸菌をpTRP−YUHで形質転換し、誘導条件下(レーンa)も
しくは非誘導条件下(レーンb)で増殖させたときに産生されるタンパク質産物
、および均質になるまで精製した産物(レーンC)の5DS−ポリアクリルアミ
ドゲルを示すものである。rHJは、ユビキチン・ヒドロラーゼのバンドの位置
を示す(26kDのところ)。
第8図は、pTRP−YUHから調製され、そして大腸菌株のゲノム中に組込ま
れるラムダgtll TRP−YUHの構築を示すものである。
第9図は、T7ボリメラーゼによって認識されるphilOプロモーターおよび
5TIIシグナルを供給する中間プラスミドであるpT7−12ST2HGHの
構築を示すものである。
第10図は、philOプロモーターの転写支配下にある5TII−tPA遺伝
子を有するpT7−12ST2TPA−1ベクターの組立てにおける最終工程を
示すものである。
第11図は、pAPST2IFN−7ΔNde l −Ava Iの構築を示す
ものである。
第12図は、pT7−12ST2TPA−1およびpAPsT2IFN−7ΔN
de r −Ava Iからの、pT7−3ST2TPAの構築を示すものであ
る。
第13図は、I)T7−3ST2TPAおよびpTRP−UbiAからの、ph
iloプロモーターによって誘導されるユビキチンーレラキシンA融合合成りN
Aフラグメントを含有するpT7−3UbiAPの構築を示すものである。
第14図は、YUH−1遺伝子を発現する、ラムダgtllTRP−YUHをゲ
ノム中に組込んだ大腸菌株において、pT7−3UbiAPおよびpT7−12
UbiBから発現されたユビキチンーレラキシンAおよびユビキチンーレラキシ
ンB融合ポリペプチドのインビボ切断によって得られたタンパク質産物の5DS
−ポリアクリルアミドゲルを示すものである。
第15図は、pCGY379の構築を示すものである。
第16図は、pT7−3ST2TPAおよびpCGY379からの、遮断された
YUH−1遺伝子を含有するpYUH::URA3の構築を示すものである。
第17図は、未遮断および遮断されたYUH−1遺伝子それぞれについての、5
alIからEcoRIまでの0.847および1.95kbフラグメントを示す
ものである。
第18図は、YUH::URA3遺伝子遮断を含有する5ail −EcoRI
フラグメントで形質転換した二倍体および一倍体酵母のサザーン・プロットを示
すものである。
A、定義
本明細書で用いる「ユビキチン・ヒドロシーゼコなる用語は、ユビキチン・ヒド
ロラーゼの生物学的活性を有する酵素を意味し、天然分子の配列を有しているか
、またはその誘導体もしくはアミノ酸配列変異体であるかを問わない。生物学的
活性とは、(a)ユビキチンーポリペブチドコンジュゲートをユビキチンとポリ
ペプチドを結合させているアミド結合のところで加水分解し、それによってコン
ジュゲート化さねていない成熟N−末端を有する無傷のポリペプチドを与える能
力、または(b)第5図のポリペプチドに結合する抗体と交差反応する能力の一
方または両方である。少なくとも2種類の天然の酵母ユビキチン・ヒドロラーゼ
タンパク質が存在する。第5図のアミノ酸配列を有するものに対応するこれらの
うちの一方の完全長の形態は、還元5DS−PAGEゲルで約29.000ダル
トンの分子量を有する。クローンされた遺伝子由来のアミノ酸配列は分子量が2
6.000ダルトンであることを示した。通常、この酵素は真核生物由来である
。
誘導体およびアミノ酸配列変異体は、天然ユビキチン・ヒドロラーゼのアミノ酸
配列またはその他の特徴が共有結合によって、または非共有結合によりて修飾さ
れた分子であると定義される。アミノ酸配列酵母変異体には、第5図の配列のア
レルが含まれるだけでなく、予め決めたその突然変異体も含まれる。通常、アミ
ノ酸配列変異体は、天然のユビキチン・ヒドロラーゼ、例えば第5図に示したも
ののアミノ酸配列に対して少なくとも約80%の相同性、より普通には少なくと
も約90%の相同性を持つアミノ酸配列を有している。以後、他に記すことがな
ければ、「ユビキチン・ヒドロラーゼ」なる用語は、天然配列または変異形態の
ものの全てを意味するものとする。
即ち、本発明の範囲内に含まれるのは、第5図に示されるアミノ酸配列を有する
酵母ユビキチン・ヒドロラーゼ(YUH−1)、他の微生物、を椎動物もしくは
非を椎真核生物種由来の類似のユビキチン・ヒドロラーゼタンパク質(例えば、
昆虫、ヒト、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、イヌ、ネズミ、ネコのユビキチン・ヒ
ドロラーゼなど)、低ストリンジエンシーの条件下であっても第5図に示したヌ
クレオチド配列とハイブリダイズしないDNAによってコー・ドされている酵母
ユビキチン・ヒドロラーゼ(本明細書ではYUH−2と呼ぶ)、ならびにこれら
のユビキチン・ヒドロラーゼの生物学的に活性なアミノ酸配列変異体であり、酵
素活性を示すユビキチン・ヒドロラーゼタンパク質のアレルおよびインビトロ生
成の共有結合変異体を含む。
「ポリペプチド」なる用語は、1以上のペプチド結合を有する産物を指し、ジペ
プチド、トリペプチド、および任意の大きさのタンパク質、またはそれらの突然
変異体もしくはそれらのフラグメントが含まれる。
「ユビキチンーポリペブチドコンジュゲート」なる用語は、ユビキチンのC−末
端のところでユビキチン(76番目のアミノ酸はグリシンである)が上記定義の
ポリペプチドにコンジュゲートしたものを意味する(ここで、該ポリペプチドは
そのN−末端残基としてプロリン以外の任意のアミノ酸を有している)。
「少な(とも70%の均質性」なる表現は、銀染色のS D 5−PAGEゲル
のバンドの相対的な強度について視覚精査を比較することによって測定した、全
タンパク質中のユビキチン・ヒドロラーゼの重量を意味する。
「緩衝液」なる用語は、通常は3〜10近辺の、より好ましくは4〜8の適当な
pH範囲で本発明の酵素を安定化させるその能力によって特徴付けられる緩衝液
を意味する。
本発明のユビキチン・ヒドロラーゼを精製する際に包含される工程を以下に列挙
する。この方法は組換えまたは弁組換え細胞由来のユビキチン・ヒドロラーゼを
精製するのに有用である。
真核細胞、好ましくはSaccharomyces cerevisiaeなど
の酵母または他の酵母株を当分野で既知の標準条件を用いて発酵させ、発酵ペー
ストを得る。このペーストをホモジナイズし、このホモジネート由来のユビキチ
ン・ヒドロラーゼ活性を含有する部分を好ましくは遠心によって回収する。その
活性を実施例に記載したようにして検定することができる。
回収したヒドロラーゼ含有部分からユビキチン・ヒドロラーゼ活性を含む沈澱を
塩析させる。硫酸アンモニウム分別を用いて塩析を行うのが好ましいが、この目
的に適する任意の塩を用いることができる。
沈澱の溶液をイオン交換樹脂と接触させ、ユビキチン・ヒドロラーゼ活性の分画
を回収する。好ましいイオン交換樹脂はDEAEクロマトグラフィーカラムであ
り、このカラムに分画を吸着させ、モしてカラムから回収する。
ユビキチン・ヒドロラーゼ活性の分画を疎水性のアフィニティー樹脂(例えば、
フェニル、オクチル1.またはセチルセファロースのクロマトグラフィーカラム
)と接触させ、この樹脂に吸着したユビキチン・ヒドロラーゼ活性の分画を得、
これを回収する。次の工程を行う前に、この工程で回収した分画を緩衝液に対し
て透析するのが好ましい。
このユビキチン・ヒドロラーゼ活性の分画を吸着クロマトグラフィー樹脂(例え
ば、ヒドロキシアパタイトまたはシリカカラム)と接触させ、この樹脂に吸着し
たユビキチン・ヒドロラーゼ活性の分画を回収する。次の工程を行う前に、この
工程で回収した分画を緩衝液に対して透析するのが好ましい。最も好ましいのは
、ヒドロキシアパタイトカラムクロマトグラフィーで吸着クロマトグラフィーを
行い、活性分画をこのカラムに吸着させ、そしてそれから回収することである。
ユビキチン・ヒドロラーゼ活性の分画を、もう一度、DEAEクロマトグラフィ
ーカラムなどのイオン交換樹脂と接触させ、ヒドロラーゼ活性の分画をこのカラ
ムに吸着させ、そしてそれから回収する。
次いで、通常はこのユビキチン・ヒドロラーゼ活性の分画からユビキチン・ヒド
ロラーゼを少なくとも70%の純度(全タンパク質重量の)で単離する。この単
離工程に液体クロマトグラフィーを用いることもできる。
2、ユビキチン・ヒドロラーゼの修飾
ユビキチン・ヒドロラーゼの誘導体およびアミノ酸配列変異体は、本明細書中の
他の箇所に記載したようなそれらの酵素活性の故に、ならびに抗−二ビキチン・
ヒドロラーゼ抗体に結合するそれらの能力の故に有用である。後者の性質を保持
する誘導体および変異体は、これらの誘導体および変異体が酵素活性を維持して
いるか否かを問わず、抗体の精製に、あるいはラベルされたときにはユビキチン
・ヒドロラーゼの免疫検定における試薬として有用である。
a、共有結合による修飾
ユビキチン・ヒドロラーゼ分子の共有結合修飾が本発明の範囲内に含まれる。約
100までの残基を有する変異ユビキチン・ヒドロラーゼフラグメントは、イン
ビトロ合成によって好都合に製造することができる。このような修飾は、精製ま
たは粗製のタンパク質の標的アミノ酸残基を、選択した側鎖または末端残基と反
応することができる有機誘導体化試薬と反応させることによって分子中に導入す
ることができる。得られた共有結合誘導体は、生物学的活性に重要な残基の識別
に関する計画において有用である。
システイニル残基は、α−ハロアセテートおよび対応するアミン、例えばクロロ
酢酸またはクロロアセトアミドなどと反応させて、カルボキシメチルまたはカル
ボキシアミドメチル誘導体を得るのが最も普通である。また、システイニル残基
は、プロモトリフルオロアセトン、α−ブロモ−β−(5−イミドジイル)プロ
ピオン酸、リン酸クロロアセチル、N−アルキルマレイミド、3−ニトロ−2−
ピリジルジスルフィド、メチル2−ピリジルジスルフィド、p−タロロメルクリ
ベンゾエート、2−クロロヌルクリ−ニトロトロフェノール、またはクロロ−7
−ニドロベンゾー2−オキサ−1,3−ジアゾールとの反応によっても誘導体化
される。
ヒスチジル残基は、ジエチルピロカーボネートとpH5,5〜7゜0で反応させ
ることによって誘導体化されるが、これは、この試薬がヒスチジル側鎖に比較的
特異的であるためである。また、p−ブロモフェナシルプロミドも有用である;
この反応は好ましくは0.1Mカコジル酸ナトリウム中、pH6,0で行われる
。
リジニルおよびアミノ末端残基はコハク酸または他のカルボン酸無水物と反応さ
せる。これら試薬による誘導体化はリジニル残基の電荷を逆にする作用を有して
いる。α−アミノを含有する残基の誘導体化に適するその他の試薬には、ピコリ
ンイミド酸メチルなどのイミドエステルニリン酸ビリドキサル:ビリドキサル;
水素化クロロホウ素;トリニトロベンゼンスルホン酸;0−メチルイソ尿素:2
.4−ペンタンジオン;およびグリオキシレートとのトランスアミナーゼ触媒の
反応が含まれる。
アルギニル残基は、1または数種の通常の試薬、特にフェニルグリオキサル、2
,3−ブタンジオン、1.2−シクロヘキサンジオン、およびニンヒドリンとの
反応によって修飾される。アルギニン残基の誘導体化は、グアニジン官能基の高
いpK、の故にアルカリ条件下で反応を行う必要がある。さらに、これらの試薬
はリジンの基ならびにアルギニンのε−アミノ基とも反応することができる。
チロシル残基自体の特異的な修飾は広く研究されており、特に、芳香族ジアゾニ
ウム化合物またはテトラニトロメタンとの反応によってチロシル残基にスペクト
ルラベルを導入することに興味が持たれている。N−アセチルイミダゾールおよ
びテトラニトロメタンを用いてそれぞれO−アセチルチロシル種および3−ニト
ロ誘導体を得るのが最も普通である。12+1Jまたは1311を用いてチロシ
ル残基をヨウ素してラジオイムノアッセイで用いるためのラベルされたタンパク
質を調製する(上記のクロラミンT法が適している)。
カルボキシ側鎖基(アスパルチルまたはグルタミル)は、カルボジイミド(R’
−N−C−N−R’)、例えば1−シクロへキシル−3−(2−モルホリニル)
−(4−エチル)カルボジイミドまたは1−エチル−3−(4−アゾニア−4,
4−ジメチルペンチル)カルボジイミドなどとの反応によって選択的に修飾され
る。さらに、アスパルチルおよびグルタミル残基は、アンモニウムイオンとの反
応によってアスパラギニルおよびグルタミル残基に変換される。
2官能性試薬による誘導体化は、ユビキチン融合ポリペプチドを切断して切断さ
れたポリペプチドを放出させ、そして回収するための方法に用いる水不溶性の支
持マトリックスまたは表面にユビキチン・ヒドロラーゼを架橋させるのに有用で
ある。通常用いられる架橋剤には、例えば1.1−ビス(ジアゾアセチル)−2
−フェニルエタン、グルタルアルデヒド、N−ヒドロキシスクシンイミドエステ
ル(4−アジドサリチル酸とのエステルなど)、ホモ2官能性のイミドエステル
[3,3’−ジチオビス(スクシンイミジルプロピオネート)などのジスクシン
イミジルエステルを含むコ、および2官能性のマレイミド(ビス−N−マレイミ
ド−1,8−オクタン)などが含まれる。メチル−3−[(p−アジドフェニル
)ジチオコプロビオイミデートなどの誘導体化剤は、光の存在下で架橋を形成す
ることができる光活性化しつる中間体を与える。別の方法によれば、臭化シアン
活性化した炭水化物などの反応性の水不溶性マトリックスおよび米国特許No、
3.969゜287 、3.691.016 ; 4.195.128 ;
4.247.642 : 4.229.537 、および4.330゜440に
記載されている反応性基質をタンパク質の固定化に用いる。
グルタミニルおよびアスパラギニル残基は対応するグルタミルおよびアスパルチ
ル残基に脱アミド化されることが多い。別法では、これらの残基は穏やかな酸性
条件下で脱アミド化される。これら残基のいずれの形態も本発明の範囲内に入る
。
他の修飾には、プロリンおよびリジンのヒドロキシ化、セリルまたはトレオニル
残基のヒドロキシ基のホスホリル化、リジン、アル: 5tructure a
nd Mo1ecular Properties、 1.H,Freeman
& Co、 、 5anFrancisco、 pp、79−86(1983
)]、N−末端アミンのアセチル化、ならびにある場合にはC−末端力ルポキシ
基のアミド化が含まれる。
b、DNA中の突然変異
また、ユビキチン・ヒドロラーゼのアミノ酸配列変異体はDNA中の突然変異に
よって調製することができる。このような変異体には、例えば第3図に示したア
ミノ酸配列中の残基の削除、挿入または置換が含まれる。また、最終の構築物が
所望の活性を保持しているなら、任意の組合せの削除、挿入および置換を行って
最終構築物を得ることができる。変異体をコードしているDNA中で行われる突
然変異がこの配列をリーディング・フレーム(読み枠)の外に置くものであって
はならず、また、好ましくは2次的なmRNA構造を与える相補領域を生じない
ものであることは明らかであろう[EP 75゜444Aを参照]。
遺伝子レベルにおいて、通常、これらの変異体はユビキチン・ヒドロラーゼをコ
ードしているDNA中のヌクレオチドの部位指向性の突然変異誘発によって調製
され、これによって変異体をコードしているDNAを得、次いでこのDNAを組
換え細胞培養において発現させる。通常、この変異体は、天然の類似体と同じ性
質の生物学的活性を示す。
アミノ酸配列変異を導入する部位は予め決められるが、突然変異それ自体は予め
決める必要がない。例えば、ある部位での突然変異の実施を最適にするために、
ランダム突然変異誘発を標的コドンまたは領域において行い、発現されたユビキ
チン・ヒドロラーゼ変異体を所望の活性の最適の組合せについてスクリーニング
することができる。既知の配列を有するDNA中の予め決めた部位で置換突然変
異を行う方法は周知である(例えば、部位特異的な突然変異誘発など)。
本発明に従うユビキチン・ヒドロラーゼ変異体の製造は、先に調製したこのタン
パク質の変異または非変異形態をコードしているDNAの部位特異的な突然変異
誘発によって行うのが好ましい。所望の突然変異のDNA配列をコードしている
特異的なオリゴヌクレオチド配列ならびに十分な数の隣接ヌクレオチドを用い、
横断される削除連結点の両側に安定な2重螺旋を形成させるに十分な大きさと配
列の複雑さを有するブライマー配列を得ることによって、部位特異的な突然変異
誘発はユビキチン・ヒドロラーゼ変異体の製造を可能にする。通常は、長さが約
20〜25ヌクレオチドの、配列の連結点の両側の約5〜10残基が変えられた
ブライマーが好ましい。
この部位特異的な突然変異誘発の方法は一般に当分野で周知である[例えば、A
delman et al、 、 DNA g : 183(1983)の開示
によって例示されるコ。
通常、部位特異的な突然変異法は1本鎖および2本鎖の両形態で存在するファー
ジベクターを用いることは理解されよう。部位指向性の突然変異誘発で有用な典
型的なベクターには、例えばMessingるM13ファージなどのベクターが
含まれる。これらのファージは市販品から容易に入手することができ、通常、そ
の使用は当業者に周知である。別法では、1本鎖のファージ複製起点を含有する
プラスミドベクター[Veira et al、、Meth、Enzymol、
153 + 3(1987)]を用いて1本鎖のDNAを得ることができる。
通常、本発明に従う部位指向性の突然変異誘発は、始めに関連タンパク質をコー
ドしているDNA配列をその配列内に含有する1本鎖ベクターを得ることによっ
て行われる。所望の突然変異配列を有するオリゴヌクレオチドブライマーを、通
常は合成によって、例えばCrea等[Proc、 Natl、^cad、 S
ci、 USA75 : 5765(1978)コの方法によって調製する。次
いで、このブライマーを1本鎖のタンパク質配列含有のベクターとアニーリング
させ、大腸菌ポリメラーゼIクレノウフラグメントなどのDNA重合化酵素にさ
らし、突然変異保持の鎖の合成を完結させる。即ち、第1の鎮が元の非突然変異
配列をコードし、第2の鎖が所望の突然変異を保持しているヘテロ2本鎖が形成
される。次いで、このへテロ2本鎖ベクターを用いてJMIOI細胞などの適当
な細胞を形質転換し、突然変異配列を有する組換えベクターを含有するクローン
を選択する。
このようなりローンを選択した後、突然変異したタンパク質領域を取り、タンパ
ク質製造のための適当なベクター(通常、適当な宿主の形質転換に用いることも
できる種類の発現ベクター)中に設置することができる。
(以下、余白)
C0突然変異の種類
通常、アミノ酸配列の削除は約1〜30残基の範囲内、より好ましくは1〜10
残基の範囲内であり、普通は連続している。
アミノ酸配列挿入体には、1個の残基から実質的に制限されない長さのポリペプ
チドまでのアミノ−および/またはカルボキシ−末端融合体、ならびに1個また
は複数のアミノ酸残基の配列内挿入体が含まれる。通常、配列内挿入(即ち、成
熟ユビキチン・ヒドロラーゼ配列内の挿入)は、約1〜10残基の範囲内であり
、より好ましくは1〜5残基である。末端挿入の例には、組換え宿主からの成熟
ユビキチン・ヒドロラーゼの分泌を容易にするための、ユビキチン・ヒドロラー
ゼのN−末端へのシグナル配列(宿主細胞に対して異種であるか、または同種で
あるかを問わない)の融合が含まれる。
第3の群の変異体は、ユビキチン・ヒドロラーゼ分子中の少な(とも1つのアミ
ノ酸残基(好ましくは1つだけ)が除去され、その位置に別の残基が挿入されて
いるものである。そのような置換は、ユビキチン・ヒドロラーゼ分子の性質を微
妙に調節することが所望であるときに以下の第1表に従って行うのが好ましい。
元の残基 置換例Ala
gly ; serArg
1ysAsn gin ; hisG In
asnG lu
aspGly ala ; pr
。
His asn ; ginI le
leu ; valLeu
ile ; valL ys
arg ; gin ; gluMet
leu ; tyr ; 1leP he
met ; leu ; tyrTyr t
rp ; pheVal ile ; le
u第1表のものより保存性が少ない置換を選択することによって、即ち、(a)
置換領域におけるポリペプチド骨格の構造、例えばシートまたは螺旋の立体配座
、(b)標的部位における分子の電荷または疎水性、または(c)側鎖の大きさ
、を維持するその作用がもっと有意に異なりでいる残基を選択することによって
、機能または免疫学的な独自性の実質的な変換が行われる。通常、ユビキチン・
ヒドロラーゼの性質に最大の変化をもたらすと予想される置換は、CB)グリシ
ンおよび/またはプロリンが他のアミノ酸によって置換されたか、または削除も
しくは挿入されているもの:(b)親水性の残基(例えば、セリルまたはトレオ
ニル)が、疎水性の残基(例えば、ロイシル、イソロイシル、フェニルアラニル
、バリルまたはアラニル)に代えて(または、によって)置換されているもの;
(C)システィン残基が他のいずれかの残基に代えて(または、によって)置換
されているもの;(d)電気陽性の側鎖を有する残基(例えば、リジル、アルギ
ニルまたはヒスチジル)が、電気陰性の電荷を有する残基(例えば、グルタミル
またはアスパルチル)に代えて(または、によって)置換されているもの;また
は(e)大きな側鎖を有する残基(例えば、フェニルアラニン)が、そのような
側鎖を有さない残基(例えば、グリシン)に代えて(または、によって)置換さ
れているものであろう。
はとんどの削除および挿入、並びに特に置換は、ユビキチン・ヒドロラーゼ分子
の性質に激変はもたらさないであろう。しかし、置換、削除または挿入の正確な
効果をそれを行う前に予測することが困難であるときには、その効果を通常のス
クリーニング検定によって評価するのは当業者の認識するところであろう。例え
ば、変異体は通常、天然のユビキチン・ヒドロラーゼをコードしている核酸の部
位特異的な突然変異誘発、組換え細胞培養での変異核酸の発現、および所望によ
り、細胞培養物からの精製(例えば、少なくとも1つの残存免疫エピトープに変
異体を結合させることによって変異体を吸着させるためのウサギポリクローナル
抗−ユビキチン・ヒドロラーゼカラムでの免疫アフィニティー吸着による)によ
って調製される。
次いで、細胞溶解液または精製されたユビキチン・ヒドロラーゼ変異体の活性を
、目的の性質に対して適切なスクリーニング検定で調べる。例えば、ある抗体に
対する親和性などのユビキチン・ヒドロラーゼの免疫学的性質の変化は競合型の
免疫検定で測定する。免疫モジュレータ−活性の変化は適切な検定で測定する。
酸化還元もしくは熱安定性、疎水性、タンパク質加水分解に対する感受性、ま
゛たは担体と、もしくはマルチマーに集合する傾向などのタンパク質の
性質の修飾は、当業者に周知の方法によって検定する。
3、組換え発現
所望のユビキチン・ヒドロラーゼ分子は、組換え法を含む任意の方法によって調
製することができる。同様に、本発明において単離されたDNAとは、3′およ
び/または5゛と境界を接する領域を含むと含まないを問わず、化学的に合成さ
れたDNA、cDNA、染色体DNAまたは染色体外DNAを意味するものと理
解される。本発明の所望のユビキチン・ヒドロラーゼは、組換え細胞培養におけ
る合成によって調製するのが好ましい。
このような合成のためには、始めにユビキチン・ヒドロラーゼをコードしている
核酸を確保することが必要である。ユビキチン・ヒドロラーゼ分子をコードして
いるDNAは、酵母または酵母以外の供給源から、(a)適当な株由来のDNA
ライブラリーを入手し、(b)ユビキチン・ヒドロラーゼまたはそのフラグメン
トをコードしているラベルしたDNA(長さが100塩基対まで、またはそれ以
上)を用いてハイブリダイゼーション分析を行って、相同な配列を含んでいるラ
イブラリー中のクローンを検出し、そして(C)制限酵素分析および核酸配列決
定によってクローンを分析して完全長のクローンを同定すること、によって得る
ことができる。ストリンジェントな条件下でユビキチン・ヒドロラーゼをコード
しているDNAにハイブリダイズすることができるDNAは、特定の所望のユビ
キチン・ヒドロラーゼをコードしているDNAを同定する際に有用である。
ストリンジェントな条件は後記で詳しく定義する。完全長のクローンがcDNA
ライブラリー中に存在しないときには、初めて本願で開示した核酸配列情報を用
いて種々のクローンから適当なフラグメントを回収し、クローンに共通する制限
部位のところで連結してユビキチン・ヒドロラーゼをコードしている完全長のク
ローンを組み立てることができる。別法では、ゲノムライブラリーから所望のD
NAを得る。最終的に決定した1つの型の酵母ユビキチン・ヒドロラーゼをコー
ドしている酵母DNAの配列を第5図に示す。
このDNAが同定され、ライブラリーから単離されたら、さらにクローニングす
るためまたは発現させるために複製可能なベクター中に連結する。
組換え発現系の1つの例では、ユビキチン・ヒドロラーゼは、ユビキチン・ヒド
ロラーゼをコードしているDNAを含有する発現ベクターで形質転換することに
よって原核生物中で発現される。宿主細胞の周辺質または培養培地にヒドロラー
ゼが得られるように、プロセッシングを行うことができる宿主細胞を形質転換す
るのが好ましい。
a、有用な宿主細胞およびベクタ一
本明細書に開示したベクターおよび方法は、広範囲の原核および真核生物の宿主
細胞において用いるのに適している。
通常、原核生物がDNA配列の最初のクローニングおよび本発明で有用なベクタ
ーの構築に好ましいのは勿論のことである。例えば、大腸菌に12株MM294
(ATCCNo、31,446)は特に有用である。用いることができる他の微
生物株には、大腸菌Bおよび大腸菌X1776(ATCCNo、31.537)
などの大腸菌株が含まれる。勿論、これらの例示は限定のためのものではなく説
明のためのものである。
また、原核生物は発現のためにも用いることができる。上に挙げた菌株、ならび
に大腸菌株W3110(F−1λ−1原栄養株、ATCCNo、27,325)
、K5772(ATCCNo、53.635)、および5RIOI、バシラス種
、例えばBacillus 5ubtilis、およびその他の腸内細菌、例え
ばS almonella typhimuriumまたはS erratia
marcesans、および種々のシュードモナス種を用いることができる。
通常、宿主細胞に適合する種から導かれるレプリコンおよびコントロール配列を
含有するプラスミドベクターをこれら宿主と組合せて用いる。ベクターは、複製
部位、ならびに形質転換された細胞における表現型選択を可能にするマーカー配
列を担持しているのが普通である。例えば、大腸菌は、大腸菌種から導いたプラ
スミドであるpBR322を用いて形質転換するのが普通である[例えば、Bo
ltvar et al、、 Gerre 2 + 95(1977)を参照コ
。pBR322はアンピシリンおよびテトラサイクリン耐性のための遺伝子を含
有しており、従って形質転換細胞を同定するための容易な手段を与える。また、
pBR322プラスミドまたはその他の微生物プラスミドもしくはファージは、
自身のタンパク質を発現させるために微生物が利用することができるプロモータ
ーを含有しているか、または含有するように修飾しなければならない。
組換えDNA構築において最も普通に用いられるプロモーターには、β−ラクタ
マーゼ(ペニシリナーゼ)およびラクトースプロモーター系[Chang et
al、、 Nature 375 : 615(197g) ; Itaku
ra et al、、 5cience 198 : 1056(1977)
; Goeddel et al、 、 Nature 281 + 544(
1979j]
1eic Ac1ds Res、 8 : 4057(1980) ; E P
O出願公開N o、 0036.776]が含まれる。これらが最も普通に用
いられるものであるが、他の微生物プロモーターが発見され、利用されており、
そしてそれらのヌクレオチド配列に関する詳細が公表されており、当業者はこれ
らをプラスミドベクターに機能的に連結することができる[例えば、5iebe
nlist et al、、、Ce1l 20 : 269(1980)を参照
]。
原核生物に加えて酵母培養物などの真核微生物を用いることもできる。Sacc
haromyces cerevisiaeまたは通常のパン酵母が真核微生物
のなかで最も普通に用いられるが、他の多数の菌株も普通に用いることができる
。S accharomyces中で発現させるためには、通常、例えばプラス
ミドY Rp7 [Stinchcomb et al、 、 ?Jature
2g2.39(1979); Kingsman et al、 、 Gen
eヱ: 141(1979) ; Tschemper et al、 、Ge
ne !Q : 157(1980)]が用いられる。このプラスミドは、トリ
プトファン中で増殖する能力を欠く酵母の突然変異株、例えばATCCNo。
44.076またはP E P 4−1 [Jones、 Genetics
85 : 12(1977)]のための選択マーカーを与える廿p1遺伝子を既
に含有している。次いで、酵母宿主細胞ゲノムの性質としてtrp l欠損が存
在すると、トリプトファンの非存在下での増殖によって形質転換を検出するため
の有効な環境が得られる。
酵母ベクターにおける適当な促進配列には、3−ホスホグリセレートキナーゼの
ためのプロモーター[Hitzeman et al、 、 、 J、 Bio
l、 Chem、 255 : 2073(1980)]、またはその他のグル
コース分解酵素、例えばエノラーゼ、グリセルアルデヒド−3−ホスフェートデ
ヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルベートデカルボキシラーゼ、ホスホフル
クトキナーゼ、グルコース−6−ホスフェートイソメラーゼ、3−ホスホグリセ
レートムターゼ、ピルベートキナーゼ、トリオセホスフェートイソメラーゼ、ホ
スホグルコースイソメラーゼ、およびグルコキナーゼなどのプロモーター[11
ess et al、、 J、 Adv、 Enzyme Reg、 Z :
149(1968) ; Ho1land、 Biochemistry 17
: 4900i1
978)]が含まれる。また、適当な発現プラスミドを構築する際には、これら
の遺伝子と結合した終止配列を、発現ベクター中の発現させることが所望である
配列の3′に連結して、mRNAのボリアデニル化および終止を得る。増殖条件
によってコントロールされる転写の別の利点を有しているその他のプロモーター
は、アルコールデヒドロゲナーゼ2、イソチトクロムC1酸ホスフアターゼ、窒
素代謝に関与する分解酵素、上記のグリセルアルデヒド−3−ホスフェートデヒ
ドロゲナーゼ、ならびにマルトースおよびガラクトース利用に関与する酵素のプ
ロモーター領域である。酵母に適合するプロモーター、複製起点および終止配列
を含有するあらゆるプラスミドベクターが適している。
微生物に加えて、多細胞生物由来の細胞培養物を宿主として用いることもできる
。原理的には、を推動物または非を推動物の培養物由来を問わず、そのような任
意の細胞培養物が使用可能である。しかし、を推動物細胞が最も重要であり、培
養におけるを推動物細胞の増殖(組織培養)は最近の数年で常法となった[Ti
5sue Cu1ture、^Cademic Press、 Kruse a
nd Patterson ed、 (1973)コ。そのような有用な宿主セ
ルラインの例は、VEROおよびHeLa細胞、チャイニーズ・ハムスター卵巣
(CHO)セルライン、ならびにW2B5、BHK、CO5−7,293および
MDCKセルラインである。通常、このような細胞のための発現ベクターは、必
要なら、複製起点、発現させようとする遺伝子の前に位置するプロモーターを、
任意の必要なリポソーム結合部位、RNAスプライス部位、ポリアデニル化部位
、および転写終止配列と共に含有している。
哺乳動物細胞において用いるためには、発現ベクター上のコントロール機能はウ
ィルス供給源から得ることが多い。例えば、通常用いられるプロモーターは、ポ
リオーマ、アデノウィルス2から、そして最も多くはサルウィルス40(SV4
’0)から得られる。SV40ウィルスの初期および後期プロモーターは、これ
らがSV40ウィルス複製起点をも含有するフラグメントとしてこのウィルスか
ら容易に得られるので特に有用である[Fiers et al、 、 Nat
ure 273 : 113(1978)]。また、H1ndIII部位からウ
ィルス複製起点中に位置するBglI部位まで伸びる約250bpの配列が含ま
れているなら、もっと小さいか、またはもっと大きいSV40フラグメントを用
いることもできる。さらに、プロモーターまたはコントロール配列が宿主細胞系
に適合するなら、所望の遺伝子配列に通常は結合しているプロモーターまたはコ
ントロール配列を利用することができるし、また、それが望ましいことも多い。
複製起点は、外来の起点を含むようにベクターを構築することによって、例えば
SV40もしくは他のウィルス(例えば、ポリオーマ、アデノウィルス、VSV
、BPV)供給源から導くことによって得ることができるし、また、宿主細胞の
染色体複製機序によって得ることができる。ベクターが宿主細胞染色体に組込ま
れるときには、後者が十分であることが多い。
十分な量のタンパク質が細胞の培養によって得られる;しかじ、第2の暗号配列
を用いる工夫が産生量をさらに増大させるのに有用である。第2の暗号配列の1
つは、メトトレキセート(MTX)などの外部からコントロールされるパラメー
ターによって影響を受けるジヒドロ葉酸還元酵素(D HF R)を含有し、従
ってメトトレキセート濃度をコントロールすることによって発現をコントロール
することを可能にする。
ユビキチン・ヒドロラーゼとDHFRタンパク質の両方をコードしているDNA
配列を含有する本発明のベクターによるトランスフェクション用に好ましい宿主
細胞を選択する際には、使用されるDHFRタンパク質の種類に従うて宿主を選
択するのが適切である。野生型のDHFRタンパク質が使用されるときには、D
HFR欠損であり、従ってヒポキサンチン、グリシン、およびチミジンを欠(選
択培地において成功裏のトランスフェクション用のマーカーとしてDHFR暗号
配列を用いることを可能にする宿主細胞を選択するのが好ましい。この場合の適
当な宿主細胞は、U rlaubおよびChasin[Proc、 Natl、
Acad、 Sci、 US^77 : 4216(1980)]記載のよう
に調製し、増殖させた、DHFR活性を欠(チャイニーズ・)1ムスター卵巣(
CHO)セルラインである。
他方、MTXに対して低い結合親和性を有するDHFRタン/くり質をコントロ
ール配列として用いるときには、DHFR欠損細胞を用いることは必要ではない
。突然変異DHFRはメトトレキセートに対して耐性であるので、宿主細胞それ
自体がメトトレキセート感受性であるという条件のもとで、MTX含有培地を選
択手段として用いることができる。MTXを吸収することができる真核細胞の大
部分は、メトトレキセート感受性のようである。このような有用なセルラインの
1つは、CHOライン、CHO−Kl(ATCCNo。
CCL61)である。
b、使用可能な代表的な方法
所望の暗号配列およびコントロール配列を含有する適当なベクターの構築には通
常の連結法を用いる。単離したプラスミドまたはDNAフラグメントを切断し、
加工し、そして必要なプラスミドを調製するのに望ましい形態で再連結する。
平滑末端が必要であるときには、調製物を15℃で15分間、ポリメシーゼエ(
フレノウ)10単位で処理し、フェノール−クロロホルム抽出し、そしてエタノ
ール沈澱させることができる。
ルを用いて行うことができる。
構築したプラスミド中の正しい配列を確認する分析のために、通常は、この連結
混合物を用いて大腸菌に12株294(ATCC31、446)またはその他の
適切な大腸菌株を形質転換し、適当なところで成功裏の形質転換体をアンピシリ
ンまたはテトラサイクリン耐性によって選択する。形質転換体由来のプラスミド
を調製し、Messing等[Nucleic Ac1ds Res、 旦:
309(1981):lの方法またはMaXal等[Methods of E
nzymology 65 : 499(1980)]の方法により制限マツピ
ングおよび/またはDNA配列決定を行って分析する。
哺乳動物宿主細胞中にDNAを導入し、安定なトランスフェクタントについて培
地で選択を行った後、約20,000〜500. OOOnMの濃度のメトトレ
キセート(DHFR活性の競合型の阻害物質)の存在下で宿主細胞培養物を増殖
させることによってDHFR−タンパク質をコードしている配列の増幅を行う。
勿論、有効な濃度範囲はDHFR遺伝子の性質および宿主の性質に大きく依存し
ている。
一般的に定めた上限および下限を確定することができないのは明らかである。適
切な濃度のDHFRを阻害する他の葉酸類似体または他の化合物を用いることも
できる。しかし、MTXそれ自体が好都合であり、容易に入手することができ、
そして効果的である。
使用可能なその他の方法は、実施例のすぐ前の部に記載する。
4、インビトロで融合ポリペプチドを切断する方法本発明のユビキチン・ヒドロ
ラーゼ分子は、ユビキチンと所望の任意のポリペプチド産物の間の融合ポリペプ
チドをインビトロですぐにプロセッシングするための方法において特に有用であ
る。ユビキチン融合ポリペプチドは、通常、所望のポリペプチドをコードしてい
る遺伝子の5′末端に連結されたユビキチン遺伝子(その3′末端で)を含有す
るキメラ遺伝子構築物によって発現される。このユビキチン遺伝子は、天然供給
源から入手し、適当なベクター中にクローンするか(上記のWO3810240
6に記載のように)、または、例えばE cker等[J、 Biol、 Ch
em、 262 : 3524−3527(1987) ;およびJ、Biol
、Chem、 262 : 14213−14221(1987)]の記載の方
法を用いて化学的に合成する。次いで、所望によりこの融合体にN−末端シグナ
ル配列を含有させて融合ポリペプチドの分泌を容易にする。
所望のポリペプチドのN−末端アミノ酸のコドンは、ユビキチン遺伝子の3′末
端にすぐ隣接して位置しているか、または、任意の数のヌクレオチド・トリプレ
ットによって隔てられている(通常は、1.2または3個のトリブレット;これ
らは、どんな特定の配列をもコードしている必要がないが、所望のポリペプチド
をコードしている遺伝子を正しいリーディング・フレーム内に維持する)。
所望のポリペプチドは任意のポリペプチドであってよく、以下のポリペプチドを
含むがこれらに限定はされない:即ち、哺乳動物ポリペプチド、例えば成長ホル
モン(ヒト成長ホルモン、デス−N−メチオニルヒト成長ホルモン、およびウシ
成長ホルモンを含む):インスリンA鎖、インスリンB鎖;プロインスリン;因
子■:プラスミノーゲン活性化因子、例えばウロキナーゼまたはヒト組織型プラ
スミノーゲン活性化因子(t−PA);腫瘍壊死因子−αおよび−β;エンケフ
ァリナーゼ;血清アルブミン(ヒト血清アルブミンなど);ミュレリアン(a+
ullerian)阻害物賀;リラキシンA鎖;リラキシンB鎖;ブロリラキシ
ン;マウス性腺刺激ホルモン関連のペプチド;微生物タンパク質(β−ラクタマ
ーゼなど);DNアーゼ:組織因子タンパク質;インヒビン;アクチビン;神経
成長因子(NGF−βなど);血小板由来の成長因子;線維芽細胞成長因子ニド
ランスフォーミング成長因子(TGF)、例えばTGF−αおよびTGF−β:
インスリン様成長因子−■および一■;インスリン様成長因子結合タンパクit
;CD−4;エリトロポイエチン:インターフェロン(インターフェロン−α、
−β、および−γなど);コロニー刺激因子(CS F)、例えばM−C3F、
GM−CSFおよびG−C3F、インターロイキン(IL)、例えばIL−1、
I L−2、IL−3、IL−4など;スーパーオキシドジムスターゼ:崩壊促
進因子;ウィルス抗原(例えば、AIDSエンベロープの一部);任意の上記ポ
リペプチドのフラグメントなどである。さらに、ポリペプチド上の1またはそれ
以上の予め決めたアミノ酸残基を、融合体の発現および/またはユビキチン・ヒ
ドロラーゼプロセッシングに悪影響を及ぼすことなく、置換、挿入または削除す
ることもできる。
本発明において好ましいポリペプチドは、レラキシンもしくはインスリンのA鎖
もしくはB鎖、プロレラキシン、プロインスリン、インターフェロン、インター
ロイキン、成長ホルモン、神経成長因子、トランスフォーミング成長因子、イン
スリン様成長因子、またはDNアーゼである。本発明において最も好ましいポリ
ペプチドは、レラキシンもしくはインスリンのA鎖もしくはB鎖、プロレラキシ
ン、プロインスリン、インターフェロン−γ、またはデス−N−メチオニルヒト
成長ホルモンである。また、好ましいポリペプチドは、それが発現される宿主細
胞に対して4異種であるポリペプチド、およびヒトポリペプチドである。
融合体は組換え細胞培養の不純産物を含有する組成物中に得られ、次いでこれを
切断して所望のポリペプチド産物を回収する。ポリペプチドはユビキチンのC−
末端にコンジュゲートしており、そのN−末端には任意のアミノ酸を含有してい
る。融合体を含む宿主細胞培養物を宿主にとって適切な培養培地で増殖させ、融
合体が分泌されているか否かに依存する方法によって集める。通常は、細胞を溶
解し、遠心して細胞の残骸を除き、上清中の融合タンパク質を回収する。次いで
、この上清、または細胞外培地から回収もしくは細胞周辺腔から回収(例えば、
浸透圧ショックによって)した分泌された融合物質を、ユビキチンに対して特異
的な親和性を有する試薬と接触させてコンジュゲートを試薬に吸着させる。この
試薬は、ユビキチンと相互作用する細胞タンパク質または抗−ユビキチン抗体な
どの任意の試薬であってよいが、モノクローナル抗体が好ましい。ユビキチンに
対するモノクローナル抗体を結合させたアフィニティークロマトグラフィーカラ
ムで分離を行うのが最も好ましい。
次の工程において、ユビキチンに特異的な親和性を有する試薬およびその吸着し
たコンジュゲートを宿主細胞培養物の残りから分離し、試薬からコンジュゲート
を回収する。吸着されたコンジュゲートがアフィニティーカラム上に存在してい
るときには、pH勾配4〜5を用いてカラムから溶離することによって抗体に吸
着されたコンジュゲートを回収する。
その次の工程において、回収したコンジュゲートをユビキチン・ヒドロラーゼと
接触させ、それによつてコンジュゲートをユビキチンと成熟ポリペプチドに加水
分解し、ヒドロラーゼを固定化する。
これは、ユビキチン・ヒドロラーゼを結合させたカラムに、溶離したコンジュゲ
ートを通すことによって行うことができる。別の方法では、コンジュゲートをユ
ビキチン・ヒドロラーゼと接触させ、次いで固定化したヒドロラーゼに対する抗
体を用いてコンジュゲートからヒドロラーゼを分離する。
次いで、回収した物質をユビキチンに対して特異的な親和性を有する試薬と接触
させて、すべての残留コンジュゲートおよび遊離のユビキチンを試薬に吸着させ
、試薬およびそれに吸着した物質を含まないポリペプチドを回収する。ここでも
、この試薬はユビキチンに対するモノクローナル抗体であってよく、これをアフ
ィニティーカラムに結合させることもできる。
この方法を成功させるためには、宿主細胞は、この回収方法を妨害する内生のユ
ビキチン・ヒドロラーゼを全く産生しないものであるのが好ましい。これは、ユ
ビキチン・ヒドロラーゼを通常は全く産生しない原核宿主を用いることによって
、あるいは削除もしくはトランスボゾン突然変異誘発を行って宿主細胞(即ち、
真核宿主細胞)から内生のユビキチン・ヒドロラーゼをコードしている全ての遺
伝子を除去することのどちらかによって達成することができる。
また、融合ポリペプチドが細胞内(例えば、原核宿主内)に産生されたときにそ
れを分解することもある内生のプロテアーゼを欠く宿主細胞を選択するのが望ま
しいこともある。
切断したポリペプチドを回収する別の方法においては、コンジュゲートを産生し
ている宿主細胞培養物を上記のようにして集めた後に、この培養物をユビキチン
に対して特異的な親和性を有する試薬と接触させてコンジュゲートを試薬(この
試薬は上に定義されている)に吸着させる。この試薬とその吸着コンジュゲート
を培養物の残りから分離する。次いで、コンジュゲートが吸着した試薬をユビキ
チン・ヒドロラーゼに接触させる。ヒドロラーゼおよびポリペプチドを試薬から
分離し、最後の工程でポリペプチドをヒドロラーゼから分離する。また、第1の
工程に対して挙げたものと同じ好ましい態様がこの方法に当てはまる。
5、ユビキチンに対する抗体
通常、ユビキチンに対する抗体は、ユビキチンとアジュバントの複数の皮下また
は腹腔的注射によって動物に生成させる。2官能性または誘導体化試薬、例えば
マレイミドベンゾイルスルホスクシンイミドエステル(システィン残基を介する
コンジュゲート)、N−ヒドロキシスクシンイミド(リジン残基を介する)、グ
ルタルアルデヒド、無水コハク酸、5OCI2またはR’N=C=NRを用い、
免疫しようとする種に免疫原性であるタンパク質、例えばキーホール・リンペッ
ト(keyhole limpet)ヘモシアニン、血清アルブミン、ウシチロ
グロブリン、または大豆トリプシン阻害物質にユビキチンをコンジュゲートさせ
るのが有用であることもある。また、ミョウバンなどの凝集剤を用いて免疫応答
を増強することもできる。
1mgまたは1μgのコンジュゲート(それぞれ、ウサギまたはマウスに対して
)を3容量倍のフロイント完全アジュバントと混合し、この溶液を皮肉の複数部
位に注射することによって、動物を免疫原性コンジュゲートまたは誘導体に対し
て免疫する。1力月後に、複数部位の皮下注射により、フロイント完全アジュバ
ント中の最初の量の115〜1/10のコンジュゲートで動物をブースター処理
する。7〜14日後に動物から採血し、その血清について抗−ユビキチン力価を
測定する。力価がプラトーに達するまで動物をブースター処理する。同じユビキ
チンポリベプチドであるが、異なるタンパク質に、および/または異なる架橋剤
によってコンジュゲートしたコンジュゲートで動物をブースター処理するのが好
ましい。
免疫した動物から牌細胞を回収し、常法によって細胞を永久化することによって
、例えばミエローマ細胞との融合またはエプスタイン−バーウィルス形質転換お
よび所望の抗体を発現しているクローンのスクリーニングによってモノクローナ
ル抗体を調製する。ユビまた、ユビキチン・ヒドロラーゼは、ユビキチンと所望
の任意のポリペプチド産物の間の融合ポリペプチドをインビボでプロセッシング
するための方法において特に有用である。このコンジュゲート用の遺伝子構築物
は上記セクション4に記載した通りである。
この遺伝子構築物を、ユビキチン・ヒドロラーゼをコードしている遺伝子をゲノ
ム中に組込んだ(好ましくは、染色体中に単一コピーとして)任意の原核宿主細
胞に導入する。このような細胞は、ユビキチン・ヒドロラーゼ遺伝子の5°末端
に結合させたプロモーターを有するDNA構築物をλフアージ中にクローンし、
これを適当な菌株に組込むことによって調製することができる。好ましい宿主細
胞は大腸菌細胞、例えばAmerican Type Cu1ture Co1
1ection[12301Parklawn Drive、 Bethesd
a、 MD、 DNAコにATCC受託番号No。
53、832のもとて1988年11月30日に寄託されている大腸菌株に58
08の性質を有しているものである。この菌株は、大腸菌株に5772のgal
およびbioの間のλ付着部位に組込まれたλgtllファージ中の廿pプロモ
ーターによって作動するYUH−1遺転子構築物を含有している。
菌株に5772(ATCCNo、53,635)は、染色体1acZオペロンに
挿入されたT7 RNAポリメラーゼ遺伝子を含有しており、従って培地にイソ
プロピルチオガラクトシド(IPTG)を加えることによって誘導することがで
きる。T7 RNAポリメラーゼの構成レベルの発現は、このポリメラーゼ構造
遺伝子の5°に位置する非翻訳化ドメインに依存している。大腸菌に5772に
組込まれたT7 RNAポリメラーゼ遺伝子は次の配列を含有している(相補鎖
は示していない):
1nPI
haI
5tI
aluI fspILace−GGGAAGCT
AG AGTAAGTAGT TCGCCAGTTA ATAGTTTGCG
CAACTTTGTT−haeI rsaI mboI
IGCCATCATCT GCGGGTGGCCTGAATAGGTA CGA
TTTACTA ACTGGAAGAG GCACTAAATf−
ポリメラーゼ開始。
このHpaI部位は大腸菌1acZの最初のHpaIである。
得られた形質転換宿主細胞を、ユビキチンーボリベブチドコンジュゲートが発現
されるように培養する。培養は、ヒドロラーゼ遺伝子のプロモーターを誘導する
ことによって行うのが好ましい。即ち、trpがプロモーターとして用いられる
ときには、トリプトファンを含まない最少培地で細胞を培養する。誘導によって
、20分間でユビキチンーレラキシンA鎖融合体が効率的に切断される結果にな
る。
コンジュゲートが発現されるとすぐに、それはゲノム中にコードされているユビ
キチン・ヒドロラーゼによって切断される。
7、キット成分
本発明のユビキチン・ヒドロラーゼの組成物は、安定化のための緩衝液で製剤化
することができる。この緩衝液は無機または有機塩で構成されていてよ(、例え
ば所望のpHに依存してクエン酸塩、リン酸塩、またはトリス緩衝液を含有して
いる。
さらに、ユビキチン・ヒドロラーゼの組成物はキットの1成分であってもよく、
第2の成分としてユビキチン・ヒドロラーゼに対する固定化抗体を含有すること
もできる。この抗体は、ユビキチンの修飾に関連して上に記したようにして固定
化することができる。このようなキットは、所望のタンパク質にコンジュゲート
したユビキチンを含有する融合タンパク質の切断を行うのに用いることができる
。
実施例および請求の範囲を簡単にするため、一部の頻繁に出て(る方法を簡略し
て表す。
「トランスフェクション」とは、宿主細胞による発現ベクターの取込みを意味し
、任意の暗号配列が実際に発現されると否とを問わない。例えば、Ca P O
I法および電気穿孔法などの多数のトランスフェクション法が当業者に知られて
いる。通常、このベクターの作用のいずれかの指標が宿主細胞内に現れたときに
、トランスフェクションの成功が認められる。
「形質転換」とは、染色体外要素として、または染色体組込みのいずれかによっ
て、複製可能なように生物中にDNAを導入することを意味する。使用される宿
主細胞に依存して、そのような細胞に適した常法を用いて形質転換を行う。原核
生物または強固な細胞壁障壁を有するその他の細胞のためには、通常、Cohe
n、 S、 N、 [Proc、 Natl、 Acad、 Sci、 (tl
sA) 69 : 2110(1972)]およびMande1等[J、 Mo
1. Biol。
53 : 154(1970)]が開示している塩化カルシウム使用のカルシウ
ム処理法が用いられる。そのような細胞壁を持たない哺乳動物細胞のためには、
G raham、 F、およびvan der Eb、 A、 [Virolo
gy 52 : 456−457(197g)]のリン酸カルシウム沈澱法が好
ましい。哺乳動物細胞宿主系の形質転換の全般についてはA xel [米国特
許No、 4.399.216 ; 1983年8月16日発行]が開示してい
る。酵母の形質転換は、通常、VanS olingen、 P、等[J、 B
act、 、 130 : 946(1977)]およびHsiao、 C,L
、等[扛oc、 Natl、 Acad、 Sci、 (USA) 76 :
3829(1979)]の方法に従って行われる。
しかし、細胞中にDNAを導入するための他の方法、例えば核注射による方法ま
たはプロトプラスト融合による方法なども用いることができる。
本明細書で用いる、本発明の範囲内に含まれるある種のDNA配列を記述するた
めの「ストリンジェント(厳格)な条件下でハイブリダイズ」という表現は、洗
浄を高温および低イオン強度の条件下で、例えば50℃の0.15M NaC1
10゜015Mクエン酸ナトリウム10.1%NaDodSO<の条件下で行う
ハイブリダイゼーション、または別法ではホルムアミドなどの変性剤の存在下で
、例えば0゜1%ウシ血清アルブミン10,1%フィコール10.1%ポリビニ
ルピロリドン150mMリン酸ナトリウム緩衝液(pH6,5; 750mM
NaC1,75mMクエン酸ナトリウムを含む)を含む50%(容量/容量)ホ
ルムアミドの存在下、42℃でハイブリダイゼーションを行うことを意味する。
「低ストリンジェントな条件下でハイブリダイズ」とは、20%ホルムアミド、
5xSSPE、42℃の条件下でハイブリダイズさせることを意味する。
「部位指向性の突然変異誘発」はこの分野では普通の方法であり、所望の突然変
異を示す限定された誤対合を除いて突然変異誘発を行おうとする1本鎖ファージ
DNAに相補性の合成オリゴヌクレオチドプライマーを用いて行う。簡単に説明
すると、合成オリゴヌクレオチドをプライマーとして用いてファージに対して相
補性である鎖を直接合成し、得られた2本鎖DNAをファージを維持する宿主細
菌中に導入する。導入した細菌の培養物をトップ寒天で培養すると、ファージを
保持している1個の細胞からプラークが形成される。理論的には、新しいプラー
クの50%が突然変異形を1本鎖として有するファージを含有し、50%は元の
配列を有する。このプラークを、正確な対合とはハイブリダイズさせるが元の鎖
との誤対合がハイブリダイズするのを妨げるには十分な温度で、キナーゼ処理し
た合成ブライマーとハイブリダイズさせる。次いで、ブロー・ブとハイブリダイ
ズするプラークを選択し、培養し、DNAを回収する。
「機能的に結合」とは、構成成分の正常な機能を発揮させることができるように
並べることを指す。即ち、コントロール配列群に「機能的に結合」した暗号配列
とは、この暗号配列がこれらの配列群のコントロールのもとで発現することがで
き、結合されているDNA配列が隣接しており、分泌リーダーの場合には隣接し
てリーディング相内にある立体配置を意味する。例えば、プレ配列または分泌リ
ーダーのDNAは、それがポリペプチドの分泌に関係するプレタンパク質として
発現されるならばポリペプチドのDNAに機能的に結合しており;プロモーター
またはエンハンサ−は、それが配列の転写に影響を及ぼすならば暗号配列に機能
的に結合しており;また、リポソーム結合部位は、それが翻訳を促進するように
設置されているならば暗号配列に機能的に結合している。結合は都合のよい制限
部位での連結によって行う。そのような部位が存在しないときには、常法に従う
て合成オリゴヌクレオチドアダプターまたはリンカ−を用いる。
「コントロール配列」とは、特定の宿主生物における機能的に結合した暗号配列
の発現に必要なりNA配列を指す。原核生物に適したコントロール配列には、例
えば、プロモーター、所望によるオペレーター配列、リポソーム結合部位、そし
て恐ら(は今のところはよくわかっていないその他の配列が含まれる。真核細胞
はプロモーター、ポリアデニル化シグナルおよびエンハンサ−を利用することが
わかっている。
「発現系」とは、所望の暗号配列および機能的に結合したコントロール配列を含
有するDNA配列を指し、これらの配列で形質転換された宿主はコードされてい
るタンパク質を産生ずることができる。
形質転換を行うためには、発現系はベクター上に含まれているであろう;しかじ
、関連のDNAが次いで宿主染色体中に組込まれることもある。
本明細書で用いる「細胞」、「セルライン」および「細胞培養物」は交換可能な
ように用い、これら表示の全てはその子孫を含んでいる。従って、「形質転換体
」または「形質転換細胞」は、転移の数とは無関係に1次対象細胞およびそれか
ら導いた培養物を含んでいる。また、意図的あるいは偶然の突然変異により、全
ての子孫がそのDNA内容において正確に一致していないこともあることは理解
されよう。最初に形質転換された細胞においてスクリーニングを行ったときに同
一の機能を有する突然変異子孫は包含される。別の意味が意図されているときに
は、その文脈から明らかであろう。
「プラスミド」は、小文字p1その前および/またはその後の大文字および/ま
たは数字で表す。本発明の出発プラスミドは、市販品から入手可能であるか、制
限のない状態でだれでも入手可能であるか、またはそのような入手可能なプラス
ミドから公知の方法に従うて構築することができる。さらに、他の等価なプラス
ミドが当分野で知られているが、これらは当業者には明らかであろう。
DNAの「消化」とは、DNA中のある位置にのみ作用する酵素によるDNAの
触媒的切断を意味する。このような酵素は制限酵素と呼ばれ、そのそれぞれが特
異的である部位は制限部位と呼ばれる。
本発明で用いられる多種の制限酵素は市販品から入手可能であり、それらの反応
条件、補助因子、およびその他の必要なものは、酵素供給元が確立したものを用
いた。通常、制限酵素は、それぞれの制限酵素が初めて得られた微生物を表す大
文字とそれに続く他の文字、その後の特定の酵素を表す数字からなる短縮形によ
って表示される。
通常は、約1μgのプラスミドまたはDNAフラグメントを約20μlの緩衝液
中、約1〜2単位の酵素とともに用いる。特定の制限酵素のための適切な緩衝液
および基質量は製造元によって指定されている。通常は37℃で約1時間のイン
キュベート時間を用いたが、供給元の指示に従って変えてもよい。インキュベー
トの後、フェノールおよびクロロホルムによる抽出によってタンパク質を除去し
、エタノール沈澱によって水性分画から消化した核酸を回収する。多いことでは
ないが、制限酵素による消化に続いて末端5”ホスフェートの細菌性アルカリホ
スファターゼ加水分解を行って、DNAフラグメントの2つの制限切断末端が「
環状化」または閉じた環を形成すること(この制限部位における別のDNAフラ
グメントの挿入が妨げられる)を妨げる。特に記すことがなければ、プラスミド
の消化に続いて5°末端の脱ホスホリル化を行うことはない。脱ホスホリル化の
ための方法および試薬は通常のものである[T、 Maniattset a1
11982. Mo1ecular Cloning : A Laborat
ory Manual(New York: Co1d Spring Har
bor Laboratories、 1982)、 I)I)、 133−1
34]。
制限消化物からのあるDNAフラグメントの「回収」または「単離」とは、ポリ
アクリルアミドまたはアガロースゲル電気泳動による消化物の分離、その移動度
と既知分子量のマーカーDNAフラグメントの移動度の比較による目的フラグメ
ントの同定、目的のフラグメントを含有しているゲル切片の取り出し、およびゲ
ルからのDNAの分離を意味する。この方法は広く知られている。例えば、R3
L awn等[Nucleic Ac1ds Res、 9− : 6103−
6114(1981)]およびり、Goedde1等[Nucleic Ac1
ds Res、 8 二4057(1980)]を参照。
「サザーン分析」とは、既知のラベルされたオリゴヌクレオチドまたはDNAフ
ラグメントへのハイブリダイゼーションによって消化物またはDNA含有組成物
中のDNA配列の存在を確認する方法である。本発明のためには、他に記載がな
ければ、サザーン分析は、E 、 S outhernの方法[J、 Mo1.
Bio]、 98 : 503−517(1975)]による11%アガロ−で
の消化物の分離、変性およびニトロセルロースへの移行、ならびにT、 Man
iatis等[Ce1l 15 : 687−701(1978)コが記載して
いるようなハイブリダイゼーションを意味する。
「連結(ライゲート)」とは、2つの2本鎖核酸フラグメントの間でホスホジエ
ステル結合を形成させる過程を指す[Maniatis等(1982)、上記、
p、146]。特に記さなければ連結は、連結しようとするほぼ等しい量のDN
Aフラグメント(0,5μg)に対してT4 DNAリガーゼ(「リガーゼ」)
(10単位)を用い、既知の緩衝液および条件を用いて行うことができる。
形質転換体からのDNAの[調製」とは、微生物培養物からのプラスミドDNA
の単離を意味する。他に記載がなければ、Maniatis等[1,9g2、上
記、p、 90]のアルカリ/SDS法を用いてよい。
「オリゴヌクレオチド」とは、既知の方法[例えば、EP特許公開No、 26
6、032(1988年5月4日公開)に記載されている固相法を用いるホスホ
トリエステル、ホスファイト、もしくはホスホルアミダイトの化学、またはF
roehler等(Nucl、 Ac1ds Res、νj: 5399−54
07(1986))が記載しているデオキシヌクレオシドビーホスホネート中間
体を用いて)によって化学的に合成された短い1本鎖または2本鎖のポリデオキ
シヌクレオチドである。次いで、これらをポリアクリルアミドゲルで精製する。
以下に挙げる実施例は、今わかっている本発明実施の最良の態様を説明するため
のものであり、本発明はこれらに限定されるものではない。
実施例I
このラベル化法は、ラベルしようとするタンパク質基質の遺伝子を含有するプラ
スミドおよび組込まれたバクテリオファージT7RNAポリメラーゼ遺伝子を含
有する大腸菌株中、インビボで行った。タンパク質基質遺伝子の発現は、T7
RNAポリメラーゼのプロモーター(その配列はプラスミドのタンパク質基質遺
伝子の石゛に位置している)の支配下に行った。T7 RNAポリメラーゼ遺伝
子の発現は、大腸菌のlacプロモーターの支配下に行った。
酵母ユビキチン融合ポリペプチドをコードしているDNAフラグメントを、F
roehler等(上記)の方法を用いるDNA合成機で化学的に合成した。3
2アミノ酸のヒト(H2)レラキシンB鎖(レラキシンB鎖のN−末端アミノ酸
を欠いているが、ユビキチンとレラキシン鎖の連結点に6つのアミノ酸を付加し
ている)に対する合成ユビキチン融合遺伝子を第1a図に示す(Xbal接着末
端からHindIIIまで延びる)。第1a図から、ユビキチン遺伝子はヌクレ
オチド211−216に好都合な唯一のDraIII部位を有しており、この部
位を用いて種々のタンパク質をコードしているDNAを結合させ得ることがわか
る(結合させようとするタンパク質をコードしているDNAが、ユビキチン3゛
末端を構築するのに必要なヌクレオチドの残りに結合され、そしてDra111
部位が挿入されているときには)。
このDraIII部位を用いて、N−末端を切除したユビキチンで残りの融合ペ
プチドを合成した。
即ち、33アミノ酸のヒト(H2)レラキシンB鎖に対する、先端切除の合成ユ
ビキチン融合遺伝子を第1b図に示す。これは、ユビキチンの内部DraIII
部位(接着末端)からレラキシン鎖の末端のHindIII(接着末端)部位ま
で延びる。同様に、3゛末端にシスティンジペプチドのための遺伝子を有するユ
ビキチンの先端切除遺伝子を構築した。これは、ユビキチン接着末端DralI
I部位からこのフラグメントの3゛末端の接着末端HindIII部位まで延び
る。また、29アミノ酸のヒト(H2)レラキシンB鎖(3′末端の4アミノ酸
を切除)の遺伝子に融合させたユビキチンの先端切除遺伝子(その3′末端で融
合)を同じ方法で合成した。これは、ユビキチンの内部接着末端DraIII部
位からこのフラグメントの3°末端の接着末端HindIII部位までである。
最後に、24アミノ酸のヒト(H2)レラキシンA鎖の遺伝子に融合させたユビ
キチンの先端切除遺伝子(その3゛末端で融合)を同じ方法で合成した。これは
、ユビキチンの内部接着末端DraIII部位からこのフラグメントの3゛末端
の接着末端H1ndIII部位までである。ヒトレラキシン(H2)A鎖のヌク
レオチド配列は欧州特許公開No、 112.149(1984年6月27日公
開)に見ることができる。
第1c図および第1d図は、種々の合成レラキシン鎖とのユビキチンタンパク質
基質をコードしているベクターの構築を示すものである。始めに、プラスミドp
T7−2をUnited 5tates BiochemicalCorpor
ationから入手した。このプラスミドDNAをpvulで切断し、再連結し
た。このDNAを用いてコンピテントな細菌を形質転換し、PvuIフラグメン
トの逆位についてクローンをスクリーニングした。このような逆位クローンの1
つをpT7−12と命名した。
この構築の目的はβ−ラクタマーゼ遺伝子の高レベルの発現を妨げることであっ
た(他では、philOプロモーターの支配下に転写される)。pT7−12を
HincIIおよびBamI(Iテ切断し、大きイフラクメントを単離した。
第2のプラスミドpTrpXAPTNFをpBR322から調製するが、これは
廿pプロモーターの支配下にある腫瘍壊死因子(TNF)をコードしている遺伝
子を含有している。この遺伝子の構築はEP公開No、 168.214(19
86年1月15日公開)に詳しく記載されている。このプラスミドをHpalお
よびBamHIで切断し、小さいフラグメントを単離した。次いで、この小さい
フラグメントをpT7−12由来の大きいフラグメントに連結し、プラスミドp
T7−127NFを得た。これは、廿pリーダーリポソーム結合部位内にXba
I部位およびTNFをコードしている遺伝子を含有している。I)T7−12T
NFの構築を第1C図に示す。
プラスミドpS RCex 16 [J、 P、 McGrathおよびA、
D、 Levinsonが開示(Nature 巖: 423−425(198
2))コをXbalおよびHindIIIで切断し、大きいフラグメントを単離
した。第1a図に示す合成りNA(UbsR1xnB32)をこの大きいフラグ
メントに連結してプラスミドpTrpUbsR1xnB 32を得た。この構築
を第1d図に示す。このプラスミドをXbaIおよびBamHIで切断し、小さ
いフラグメントを単離した。プラスミドpT7−12TNFをXbaIおよびB
amHI 1’切断し、大きいフラグメントを単離し、pTrpUbsR1xn
B32由来の小さいフラグメントに連結した。得られたプラスミドはpT7−1
2UbsR1xnB 32であり、ここで合成りNAフラグメントはpT7プロ
モーターの支配下にある。
他のプラスミドpT 7−12 Ubs−X(ここで、Xは、cys−cysジ
ペプチド、シラキシンB29鎖、レラキシンB33鎖、またはシラキシンA24
鎖のためのものである)は第1d図に示すように、pTrpUbsRlxnB
32ベクターをDraIIIおよびHindIIIで切断し、大きいフラグメン
トを単離してこれを上記の4種の合成りraIII−HindIIIフラグメン
ト(U bs−Xと呼ぶ)の1つに連結してpTrpUbs−Xプラスミド(こ
こで、Xは上記定義に同じ)を得、これらのプラスミドをXbalおよびBam
HIで切断し、小さいフラグメントを単離し、そしてこれらをXbalおよびB
amHI切断のpT7−12TNFプラスミドから単離した大きいフラグメント
に連結することによって調製した。
別の方法では、酵母ユビキチン遺伝子[0zkaynak et al、 、
The EMBOJ、 6 : 1429−1439(1987)]を、長さが
55〜62ヌクレオチドの範囲の8つのオリゴヌクレオチドフラグメントから組
立てた。この配列および順序を以下に示す。
<−−−−−−−−−−<−−−−−−−一−−<−−−−−−−−−−<−−
−−−−−−−−それぞれのオリゴヌクレオチド(約30ng)をホスホリル化
し、50IIIMトリスーMCI(pH=8.0)、10mM Mgci、、0
.5mMATP、T4ポリヌクレオチドキナーゼ(10単位)、およびT4DN
Aリガーゼ(1000単位)を含む1つの反応混合物中で一緒にして連結した。
得られたDNA2重螺旋を6%ポリアクリルアミドゲルで分画し、240塩基対
のフラグメントに対応するDNAバンドを切り出し、電気溶離した。
溶離したDNAをクロロホルムで抽出し、エタノールで沈澱させ、XbaIおよ
びEcoRI末端を有するようにリンカ−と連結し、そしてXbaIおよびEc
oRI切断したpUC−12ベクター(BoehringerMannheim
Bioehemicals)から単離した大きいフラグメントに連結した。ユ
ビキチンDNA挿入体の配列をジデオキシヌクレオチドDNA配列決定分析によ
って確認した。
同様に、38アミノ酸をコードしている人工のレラキシンB鎖遺伝子に対応する
DNAを、長さが57〜62ヌクレオチドの範囲の4種の合成りNAフラグメン
ト(その配列を以下に示す)から組立て、EcoRIおよびH1ndIIIリン
カ−に連結し、次いでEcoRIおよびHindIII切断したpUC−12か
ら単離した大きいフラグメントに連結し、その配列を確認した。これら2つのD
NA挿入体は、第1のベクターをXbaIおよびEcoRIで切断し、第2のベ
クターをEc。
R1およびHindlIIで切断することによってそれぞれのプラスミド・から
切り出した。次いで、これら2つの挿入体を共通のEcoR1部位で連結してX
bal−HindIIIフラグメントを得た。このフラグメントを、XbaIお
よびH1ndIIIで切断したpsRcex16から単離した大きいフラグメン
トに連結した。用いた合成りNA配列を以下CGTGAAC−3゜
CTGTAG−3’
Rlx 1−3 5−7
++++−+++> + +++++>psRcex16のDraII
IおよびH1ndIII部位の間に存在する合成りNA配列を、ユビキチンをコ
ードしている遺伝子がポリペプチドの遺伝子の5゛にあるように関連の合成りN
Aフラグメントで置換することによって、ユビキチンとレラキシンB鎖の融合タ
ンパク質を調製した。得られたハイブリッドの遺伝子を、XbalおよびBaa
HIで消化することによってpsRcex16由来のプラスミドから切り出し、
単離し、そしてXbaIおよびBamHI切断のpT7−12TNFから単離し
た大きいフラグメントに挿入した。
大腸菌に5772細菌[American Type Cu1ture Co1
1ectionに受託番号53,635のもとで寄託されている;大腸菌1ac
Z遺伝子中にT7 RNAポリメラーゼを含有している]をコンピテントにし
、pT7−12UbsR1xnB32プラスミド、またはpT7−12Ubs−
Xプラスミドのいずれかを用いて別々に形質転換した。カルベニシリンに対する
耐性について細胞を選択した。
それぞれの大腸菌形質転換体を、システィンおよびメチオニンを除く全てのアミ
ノ酸(それぞれ50Mg/ml)を追加したM9最少培地(5ml)で飽和にな
るまで37℃で一晩増殖させた(インビボでのシスティンとメチオニンの間の早
い相互変換の故に、外部添加のメチオニンの非存在下でラベルを行うとタンパク
質中のメチオニン残基がラベルされる結果になる:この相互変換の故に、外部添
加のメチオニンの存在下でラベルを行うとメチオニン残基中にほとんど検出不能
に835が導入される結果になる)。グルコースの存在はT7 RNAポリメラ
ーゼの転写を支配するlacプロモーターの代謝産物抑制を確実なものにした。
また、50Mg/mlのカルベニシリンを含有させてプラスミドの安定性を維持
した。
この−晩培養物を、システィンおよびメチオニンを除(アミノ酸(それぞれ10
Mg/+1)とカルベニシリン(50Mg/ml)を追加したM9最少培地(1
ml)で50倍に希釈した。
37℃で3時間振盪した後、イソプロピルチオ−β−D−ガラクトシド(IPT
G)を1+Mの最終濃度が得られるまで培養物に加えてT7 RNAポリメラー
ゼの合成を誘導した。さらに30分後に、20mg/mlのリファンピシンを2
00μg/mlの最終濃度が得られるまで加えて宿主のRNAポリメラーゼ活性
を阻害した。さらに30分後に、35Sシステイン(600Ci/mモル)を培
養物1mlあたり0.25mC1の割合で培養物に加えてタンパク質またはcy
s−cysジペプチドをラベルした。
最終濃度50μg/mlのシスティンで培養物を失活させることによってラベル
化を停止させ、細菌ペレットを遠心して集めた。
細胞の溶解は、使用しようとする細胞溶解液の目的に応じて異なる方法で行うこ
とができる。以下の方法を用いて、さらに処理することなく水性条件下で、試験
しようとしているほとんど全ての酵素法に適合しつる溶液中に全可溶性大腸菌タ
ンパク質(可溶性であるときにはラベルされたタンパク質を含有している)を含
有している溶解液を調製した。種々試薬の培養物容量に対する比率は111のラ
ベル培養物に基づいた。
集めた細菌ベレットに、50mM)リス−HCI(pH8)、25%(W/v)
スクロースを含有する溶液(80μm)を加えて細胞を再懸濁した。この工程な
らびに以下の工程の全ては室温で行った。
この細胞懸濁液に、0.25Mトリス−C1(pH8,0)に新たに溶解した5
mg/ml卵白リソチーム(20μm)を加え、5分間インキュベートした。次
いで、0.25M EDTA(pH8040μm)をこの懸濁液に加えた。
さらに5分間インキュベートした後、50mM)リス−C1(pH8)、50m
M EDTA(pH8)、0.2%(v/v)N P 40を含有する溶解混合
物(60μm)を加えることによって細胞を溶解した。完全な細胞の溶解を得る
には5〜10分間必要であった。この溶解液を遠心して透明にし、すぐに用いる
か、または−20℃で長期間保存することもできる。
全ての検定はエッペンドルフ管中、25μmの最終容量で行い、インキュベート
は37℃で1時間行った。反応混合物は次の成分を含有していた:
59mM)リス−CI(pH7,5)
1mM EDTA(pH8,0)
lQmM ジチオトレイトール
1μI 5−35 (y5ラベルしたユビキチンーレラキシンB鎖基質2.5μ
mユビキチン・ヒドロラーゼ溶液。
インキュベートの後、反応混合物を等容量のSDS試料緩衝液と混合し、90℃
に5分間加熱した。次いで、この試料を直接、15%5DS−PAGEゲルにか
け、電気泳動によってモニターして、未切断の基質から切断産物を分割した。W
hatman No、 1紙片でゲルを乾燥し、これをX−線フィルムに一晩さ
らすことによって、種々のラベルしたタンパク質種の検出を行った。この検定の
原理を示す概略図を第2図に挙げるにこで、RGGはユビキチンのカルボキシ末
端のarg−gly−glyであり、Cはシスティンである]。
ラベルした基質はインビボでのラベル化によって得られるので、その量に制限が
あり、決められない特異的な活性によって制限される。酵素量を定量する最も良
い方法は、連続希釈酵素溶液を用い、同じバッチの基質を用いて上記反応を行う
ことである。希釈の倍率(酵素活性が減少する)を、特定の酵素溶液の相対活性
の指標として用いることができる。この目的に用いた希釈緩衝液は、酵素および
基質を含まない50μg/mlウシ血清アルブミンを含む反応力クチこの検定は
、別の基質であるユビキチンーcys−cysを用いたことを除き、原則的にタ
ンパク質切断検定と同じである。切断産物、即ちユビキチンとcys−cysは
5DS−PAGEの代わりに酸沈澱によって分離したが、これはcys−cys
が酸に可溶性であり、それより大きいユビキチンが不溶性であるためである。
全ての検定はエツベンドルフ管中、25μlの最終容量で行い、インキュベート
は37℃で20分間行った。反応混合物は次の成分を含有していた:
50mM トリス−C1(pH7,5)1mM EDTA(pH8,
0)
10mM ジチオトレイトール
50μg7/mlウシ血清アルブミン
l u I 5−35 Cysラベルしたユビキチンー〇 ys−Cys基
質2.5μm ユビキチン・ヒドロラーゼ溶液。
インキュベートの後、反応混合物(20μm)をGF/Cフィルターディスク(
2,1cm)にスポットし、直ちに氷上のビーカー中に入っている10%(W/
V))リクロロ酢酸(TCA)中に浸漬した。個々のフィルターディスクを、洗
浄工程の後、同定用の墨汁で予めラベルした。このビーカーを5分間の間に時々
かき混ぜた。このTCA溶液をデカントし、フィルターをさらに5%TCA溶液
で洗浄した。
時々かき混ぜながらさらに5分間の後、TCA溶液をもう一度デカントした。フ
ィルターディスクを95%アルコールですすいでTCAを除去し、加熱ランプで
乾燥した。個々のフィルターディスクを計数バイアル中に入れ、計数液(5ml
)で満たし、シンチレーショ計数器で計数した。不溶性のユビキチンはフィルタ
ーディスク上に保持されているので、フィルターディスクによって保持されてい
る放射活性の減少によってヒドロラーゼ活性を測定した。
ラベルした基質はインビボでのラベル化によって得られるので、その量に制限が
あり、決められない特異的な活性によって制限される。また、ヒドロラーゼの特
異的な活性は現時点では未知である。
従って、酵素量を定量する最も良い方法は、連続希釈酵素溶液を用い、同じバッ
チの基質を用いて上記反応を行うことである。希釈の倍率(酵素活性が最初の放
射活性量の60%を保持する結果を与える)を、特定の酵素溶液の相対活性の指
標として用いることができる。この目的に用いた希釈緩衝液は、酵素基質および
酵素それ自体を含まない反応カクテルである。
タンパク質融合体の切断検定およびシスティン放出検定の両者は同じ酵素を検出
するようなので、システィン放出検定において基質の約50%加水分解を与える
ように酵素溶液を希釈することによって活性を定量するのが最も簡単である。次
いで、酵素溶液の相対活性を、標準検定条件下で50%加水分解を得るのに必要
な希釈倍率として定義した。
■、酵酵母ユビキノンヒドロラーゼの精製および検定全ての精製工程は、−晩の
透析、および貯蔵(4℃で行う)を除き、室温で行った。
A0発酵
酵母株Saccharomyces cerevisiaeを、101の発酵器
中、2.6%酵母窒素ベースおよび1%グルコース中、A6110が3〜4にな
るまで30℃で増殖させた。次いで、A66゜が50〜100に達するまで、グ
ルコースを用いて細胞をゆっくりと培養した。
B、細胞のホモジナイズ
この酵母株の発酵ペースト(約1 kg)を緩衝液A[50mM)リス−C1(
pH,8)、1mMEDTA、10%(V/V)グリセロール、および10mM
2−メルカプトエタノール]中にIg/+1で再懸濁した。得られた懸濁液を0
.25g/mlのガラスピーズ(Sigma G−8893; 106ミクロン
およびそれより微細)と混合した。この細胞−ガラスビーズ懸濁液を、Wari
ng混合器中、最高速度で数回の2〜3分のパルスで合計10分間混合した(こ
の操作の間に温度が上昇しないように注意いなければならない)。細胞破壊の効
率は、懸濁液の短時間の遠心の後に上清のタンパク質濃度を測定することによっ
てモニターすることができる。
ホモジナイズの後に、この懸濁液を5orvall G S Aローター中、1
2、00 Orpmで約30分間遠心した。ベレットを集め、緩衝液Aに再懸濁
しく最初のIg/mlの比で)、そしてさらに約5分間混合した(ここでも2分
のパルスで)。上記のように遠心した後、上溝を集め、最初の上清と合わせた。
合計した上清を、5orvall S S−340−ター中、18.000rp
mで30分間遠心することによってさらは20mg/g(元の生酵母ペースト)
であった。
C1硫酸アンモニウム分画化
ユビキチン・ヒドロラーゼ活性を33%〜63%飽和の硫酸アンモニウムで回収
した。硫酸アンモニウムを粗製の透明にした上清に直接加えて最初の33%飽和
を得、添加した固体の硫酸アンモニウム1gに対してIMトリス塩基約lμlを
加えることによって懸濁液のpHを維持した。次いで、33%飽和の上清を63
%飽和にした。
約半分のタンパク質が除去された。
D、DEAEクロマトグラフィー
63%硫酸アンモニウム飽和後のタンパク質沈澱を、GSAS−ローター中2.
000rpmで30分間、上記の懸濁液を遠心することによって集めた。タンパ
ク質沈澱物を緩衝液A(350m+1)中に再懸濁し、80mMNaC1含有の
緩衝液A(41)に対して24時間透析した(72時間で1回の緩衝液交換)。
この透析したタンパク質溶液を、1時間あたり40011の流速で80mM N
aC1含有の緩衝液Aで平衡化したDEAEセファセル(Sephacel)カ
ラム(5x 21cm)にかけた(流速は1時間あたり約80m1に落とした)
。このカラムを、80mMNaC1,170mM NaC1,230mM Na
C1、および300mMNaC1含有の緩衝液Aで順番に洗浄した。それぞれの
洗浄の緩衝液容量は約11であった。はとんど全ての活性が300mMNaC1
洗浄液で溶出し、この時点ではまだ変色の大きいカラムマトリックスを捨てた。
活性な分画を集め(約450101)、次のカラム分画にかけた。
E、フェニル−セファロースクロマトグラフィー固体の硫酸アンモニウムをプー
ルしたDEAE分画に、タンパク質溶液100m1あたり10gの割合で加え、
1時間あたり約50m1の流速で10%(W/V)硫酸アンモニウム含有の緩衝
液Aで予め平衡化したフェニル−セファロースカラム(2,5x 17cm)に
直接かけた。
次に、このカラムを10%(W/V)、次いで5%硫酸アンモニウムを含有する
緩衝液A(それぞれ100m1)で洗浄した。次いで、5%硫酸アンモニウムを
含む緩衝液Aと緩衝液Aで構成される直線減少の勾配液(350IIl)で酵素
を溶離した。初期の20%の直線勾配に位置する活性分画をプールしく合計容量
は約84m1である)、Am1conメンプランによる限外濾過によって濃縮し
た。この濃縮した酵素溶液(約40m1)を11の緩衝液B[50mM)リス−
C1(pH8)、10%(V/V)グリセロール、10IIIM2−メルカプト
エタノール]に対して一晩透析した。
F、ヒドロキシアパタイト クロマトグラフィー透析した酵素溶液を、緩衝液B
で平衡化したヒドロキシアバタイトカラム(1,Ox7cm)にかけた。このカ
ラムを緩衝液B(10ml)で洗浄し、次いで緩衝液BとQ、5M硫酸アンモニ
ウム含有の緩衝液Bの間の直線勾配液(50mM)で溶離した。これを0.5M
硫酸アンモニウム、次いで1M硫酸アンモニウム含有の緩衝液B(それぞれ10
m1)でさらに洗浄した。酵素活性は勾配液中に存在し、次いでこれをプールし
く合計容量は約81111である)、そして0.1MNaC1を加えた緩衝液A
に対して一晩透析した。
この時点での全体収率は、粗製の溶解液中に存在していた元の活性の約20%で
あり、全体の精製は約15,000倍であった。
G、DEAEセファセルでの再クロマトグラフィー透析した酵素をDEAEセフ
ァセルカラム(0,7x 7cm)にかけ、このカラムを0.1MNaC1含有
の緩衝液Aで平衡化し、次いで同じ緩衝液(5ml)で洗浄した。酵素活性を緩
衝液A中の0.1MNaC1と1.0MNaC1の間の直線勾配液(30ml)
で溶離した。
活性は予想の通り0.3MNaC1のあたりに位置し、この時点での全体の収率
は、粗製の溶解液中に存在していた元の活性の少な(とも15%であった。
H,5DS−PAGE
回収した活性の還元5DS−PAGEゲルを調製し、銀染色した。
ゲルの目視による観察およびバンドの相対密度の比較によって、得られたユビキ
チン・ヒドロラーゼが組成物中の全タンパク質の重量に基づいて約70%の純度
であることがわかった。フェニルセファロース、ヒドロキシアパタイトおよび最
後のDEAEカラムを通じてヒドロラーゼ活性と共に移動した、分子量約30.
000ダルトンを有する主要なタンパク質種を、遺伝子のクローニングによって
ユビキチン・ヒドロラーゼタンパク質であると確認した。
1、HPLCおよび配列決定
DEAEカラムから回収した活性を、1040ダイオード配列検出器を備えたH
ewlett Packard C4RP−HPLC190M中の、S ync
hrom、 I nc、からの4000人広孔人力孔ム(100mmx2win
直径)に入れた。100%の溶液Aから60%の溶液Bまでの直線勾配液を60
分間で用いた。ここで、溶液Aは0.1%トリフルオロ酢酸(TFA)の水溶液
であり、溶液Bは0.07%TFAの1−ブロバノール溶液である。流速は室温
で1分間あたり200μmであり、ピークを214および280nmでモニター
した。214nmでの吸収を有する全てのピークを、ヒドロラーゼ活性の特定の
検定に用いる緩衝液中に集めた。
還元5DS−PAGEゲルで30kDaの分子量を有する収集ピーク由来の1つ
のポジティブな検定が存在した。30kDaタンノ(り質を90%豊富化したD
EAEカラムからの1つの分画を、その溶離緩衝液中の分画に約5%のLyct
ne C(llako)を加えることによって消化した。この消化は37℃で2
4時間行った。消化によって得られたペプチドを、上記と同じ条件を用いて上記
のC4−HPLCカラムで分離した。この分離したペプチドを、エドマン分解を
用しするApplied Biosystems 47 Q A気相配列決定機
で配列決定した。
次のアミノ酸配列が得られた:
1.5DPTATDLIEQELVRVRVA2、ENVQTFSTGQSEA
PEATADTNLHYI3、NEWAYFDIY
4、NRFDDVTTQ 。
■、ヒドロラーゼ遺伝子のクローニングおよび発現F roehler等(上記
)の方法を用い、DNA合成機で合成りNAプローブを合成した。このプローブ
(プローブ1 ; 53mar)は次の配列を有していた二
5°−GACCCAACTGCTACTGACTTGATCGAACAAGA
ATTGGTTAGAGTTAGAGTTGC−3’全ゲノムDNAを、Sm1
th等[11ethod Enzymol、 12 : 538−541(19
67)]の方法により、Saccharomyces cerevisiae[
Yeast Genetic St。
ck Center、 Berkeley、 CAコの酵母株51799D(α
廿p5 his4 ade6ga12)から単離した。酵母DNA(370ug
)を21111ノ反応混合物中、2.5単位の5au3 A I (New E
ngland Bi、olabs)で部分消化した。その一部を10.20およ
び30分の時点で取り、冷却し、20mM EDTAで不活性化した。集めてフ
ェノール抽出したDNAを、IMNaCl、201M)リス−HCI(pH8,
0)および10mM EDTA中の10〜50%スクロース勾配液中で遠心する
ことによって分画した。5au3A1 10〜15kbフラグメント(アガロー
スゲル電気泳動で測定)を単離し、BamHI単離したアームで切断したバクテ
リオファージλ Charon 30に連結した[Maniatis等;上記コ
。
次いで、得られた連結DNAを用いてプレート上で大腸菌DP50株(市販品か
ら入手可能)を感染させた。10,000のプラークが非滅菌のニトロセルロー
スフィルター[5chleicher and 5chuell。
BA85.132nm直径コに現れた。このフィルターを、0.5M NaOH
11MNaC1の溶液と接触させることによって変性した。次いで、これをトリ
ス、pH7,5,3MNaC1の溶液中で復元し、2xSSCで洗浄した。復元
後、このフィルターを真空オーブン中、80℃で1時間加熱した。次に、このフ
ィルターを、5xSSPE[20xSSPEは、水(800ml)にNaC1(
174g)、NaH2PO4−HzO(27,6g)およびEDTA(7,4g
)を溶解し、pHを7.4に調節し、容量を11に調節することによって調製す
る;あるいは、5SPEは0.18M NaC1,10μM NaPO4,1m
M NaE DTASpH7であるコ、5 x Denhardt溶液[1x
Denhardt溶液=0゜1%フィコール、0.1%ポリビニルピロリドン、
0,1%BSA]、Q、liM ATP、0.2μg/ml超音波処理サケ***
DNA、20%ホルムアミド、および0.1%SDSからなるプレハイブリダイ
ゼーション緩衝液中、42℃で5分間処理した。次いで、プローブ1(下記のよ
うに放射活性なリンでその5°末端をラベルした)を、このプレハイブリダイゼ
ーション混合物に2xlO’cp〜/mlの濃度で加えた。
0.05Mトリス−HCI(pH7,6)、0 、 OI M MgCb、0.
005Mジチオトレイトール、0.1mMスペルミジン、0.1mMEDTA、
35μg/m1合成プローブ1.4mC1/ml 732P ATP(約500
0Ci/mモル)およびIOUポリヌクレオチドキナーゼを含有する溶液中、3
7℃で30分間、プローブ1を32Pで5′末端ラベルした。このラベルしたD
NAをフェノール/CHCl3抽出し、エタノール沈澱させ、水に再懸濁させた
。導入された32Pは、プローブ溶液の一部をDEAEフィルターディスクにス
ポットし、0.5Nギ酸アンモニウムで徹底的に洗浄し、次いで液体シンチレー
ション計数することによって測定した。
このフィルターをプローブ1と共に42℃で1時間インキュベートした。次いで
、フィルターをプローブ溶液から取り出し、2xSSC+0,1%SDS中で3
回、37℃で15分間洗浄した。このフィルターを一70℃で3時間、X線フィ
ルムに暴露した。ポジティブなプラークを選択し、DNA用の液体培地で増殖さ
せた。
ファージDNAを増殖させた後、数種の制限酵素でこのファージを切断した。得
られたフラグメントをニトロセルロースフィルター上に置き、上記のようにプレ
ハイブリダイゼーション混合物およびプローブ1で処理した。このプローブはフ
ァージλ7の1,2kbSBII−BamHIフラグメントにハイブリダイズす
ることがわかった。
5alIおよびBamHIで切断することによってこのフラグメントをλ7から
単離した。
M13mp18およびM13ip19バクテリオファージ(New Engla
nd Biolabsから入手可能)を5alTおよびBaa+HIで切断し、
太きいフラグメントを単離した。λ7由来のフラグメントを、このフラグメント
がlacプロモーターの支配下に入るようにM13mp18およびM13mp1
9由来の大きいフラグメントに連結した。得られた構築物をX−Ga1プレート
上のJMIOIに蒔いた[Messing and Viera、 Gene
19 : 269−276(1982)]。無色のプラークを取り、M13mp
18バクテリオフバクテリオファージ中トを含有している1本鎖のDNA鋳型に
ついて、S anger等(上記)のジデオキシ鎖終止法によって5alI部位
からBamHI部位までを、そして合成のファージ特異的なブライマーを用いて
逆に配列決定した。
それぞれの方向で約500bpを決定した後、決定した配列に基づいて新しいブ
ライマーを設計し、配列をさらに500bp延長した。
制限マツピングによってSail−BamHIフラグメントに隣接していること
が示された2kbの5alI −EcoRIフラグメントをM13mp18中に
クローンし、約500bpについてDNA配列を決定した。
5%ポリアクリルアミド/8M尿素の[薄層]ゲルでの電気泳動によって試料を
分離した。ゲルをWhatian 3MM紙上で乾燥し、時間を変えてコダック
X線フィルムに暴露した。
第3図は、このフラグメントに対して決定された5ail末端からBai+HI
末端の約300塩基以内までのヌクレオチド配列、ならびに26kbの酵母ユビ
キチン・ヒドロラーゼYUH−1の帰属させたアミノ酸配列および種々の制限部
位の位置およびプローブ1の位置を示すものである。第4図は配列決定の方向を
示すものである。
第5図は、YUH−1の予想アミノ酸配列を示すだけでな(、HindIIIか
らBamHIまでのその境界配列をも示している(λおよび酵母DNAを含有す
るSatI−BamHIフラグメントと境界を接する2kbのEcoRI −S
al Iフラグメントの部分的配列に基づ()。3つの配列決定したペプチドの
位置を星印で示す。53−marのプローブ配列を正しいDNA配列の下に示す
。誤対合は小文字で示す。このプローブは正しいDNA配列と87%一致してい
る。
Sal I −BamHIのヒドロラーゼをコードしている挿入体を含有するM
13mp19バクテリオファージを用いて大腸菌株5RIOI(市販品から入手
可能)を形質転換し、LBブロスを培養培地とじて用いて増殖させた。培養培地
に1mMのIPTGを加えることによってタンパク質の産生を誘導した。
5RIOI細胞の溶解は、K5772由来のユビキチン・ヒドロラーゼ用のラベ
ル化タンパク質基質の調製について本明細書中のタンパク質検定の項で説明した
溶解法を用いて行った。
細胞溶解液を遠心して透明にし、次いで上記の融合ポリペプチド検定によって活
性を調べた。この検定は両検定による検出可能なユビキチン・ヒドロラーゼ活性
を示し、クローンしたDNA配列がヒドロラーゼタンパク質をコードしており、
I PTGによって誘導されることを示した。
実施例■
酵母ユビキチンをコードしているDNAフラグメントを、メトキシホスホルアミ
ダイトを用いるDNA合成機で化学的に合成した。
酵母ユビキチン遺伝子を32アミノ酸のヒト(H2)レラキシンB鎖をコードし
ている遺伝子に結合させて合成して第1a図に示す配列を得、24アミノ酸のヒ
ト(H2)レラキシンA鎖に、プロレラキシンに、モして33アミノ酸のヒト(
H2)レラキシンB鎖に結合させて第1b図に示す配列を得た。それぞれのフラ
グメントは、その末端に接着末端XbalおよびBamHI部位を有するように
設計した。
プロレラキシンの構築は欧州特許公開No、 260.149(1988年3月
16日公開)に記載されている。A鎖しラキシンのDNA配列はEP公開No、
112.149(上記)に挙げられている。
この合成遺伝子を、欧州特許公開No、 260.149に詳細に記載されてい
るプラスミドtrp 20 ?−1本tetxapのXbalおよびBamHI
消化の後の大きいフラグメントに別々にクローンした。ユビキチン融合ポリペプ
チド遺伝子がtrp 207−1 *tetxapプラスミドのtrpプロモー
ターの支配下にくるようにこのユビキチン融合ポリペプチド遺伝子を連結した。
得られたプラスミドで大腸菌株MM294(市販品から入手可能)を形質転換し
、培養培地にインドールアクリル酸を加えることによって融合タンパク質の合成
を誘導した。還元条件下で銀染色を用いる5DS−PAGE分析によって顕著な
タンパク質バンドが明らかになった。ウェスタン・プロット分析を行うと、この
バンドは適当なレラキシン部分に指向性である抗体と反応した。
このバンドはそれぞれの場合の正しい分子量に一致することがわかった。
次いで、それぞれの形質転換体の培養物を発酵させ、収穫し、抗−ユビキチンモ
ノクローナル抗体を固定化したアフィニティークロマトグラフィーカラムに通し
た。カラムに結合した物質を溶離し、上記のように精製したユビキチン・ヒドロ
ラーゼを吸着させたカラムに通した。カラムからの溶出液を、抗−ユビキチンモ
ノクローナル抗体を固定化したアフィニティークロマトグラフィーカラムに通し
た。種々のレラキシンポリベブチドを別々に含有している第1の分画を、切断さ
れたユビキチン、ユビキチン融合ポリペプチドおよび全ての細胞残骸を含まない
ように得、これをプールした。
(以下、余白)
実施例■
ユビキチンーレラキシンA鎖の合成りNAがXbalおよびBJ1mH1消化の
廿p 207−1 *tetxapの大きいフラグメントに挿入された実施例■
のプラスミドをpTRP−UbiAと命名した。pTRP−UbiAをXbaI
およびBamHIで消化し、大きいフラグメントを単離した。Charon 3
0クローン由来の1.2kb Sal I −BamHIフラグメント(実施例
工)を単離し、唯一のBan1部位で切断した。大腸菌リポソーム結合部位配列
およびその5°末端にXbaI部位をコードしている合成りNA(その配列を第
6図に示す)をBanI部位ζ二連結して、クローンしたユビキチン・ヒドロラ
ーゼ遺伝子の5’、IIL翻訳化末端を結合部位に置き換えた。得られたXba
I −BrmHIフラグメントをpTRP−UbiAの大きいフラグメント中
にクローンして、この遺伝子をこのプラスミドのtrpプロモーターの支配下(
装置(Aた。
pTRP−YUHと命名したこのプラスミドの構築を第6図(こ示す。
p’r RP −Y U Hを大腸菌株MM294に導入し、37℃で飽和1こ
なるまでLB培地またはM9最少カザミノ酸培地(トリプトファンを欠く)で増
殖させた。試料を本明細書中に記載したようなSDS試料緩衝液中、90℃で溶
解し、10%SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動を行い、次いでクーマツシ
ー・ブリリアント・ブルーで染色した。この結果を第7図に示す。レーン(a)
はM9最少カザミノ酸培地(トリプトファンを欠く)での大腸菌株の増殖であり
、レーン(b)はLB培地での増殖である。
M9培地においてpTRP−YUHで形質転換した大腸菌は、第7図に示した5
DS−PAGEゲル上の顕著なバンドから測定すると、26kdのユビキチン・
ヒドロラーゼを過生産した。LB培地での同じプラスミドは26kdのユビキチ
ン・ヒドロラーゼのバンドを生じなかった。
ユビキチン・ヒドロラーゼを単離し、次のようにして精製した。
大腸菌細胞(約60g)を緩衝液A(120IIll)に再懸濁した。この細胞
懸濁液をソニケーター中で3.5分間超音波処理し、遠心して透明にした。この
透明上清を、0.1M NaC1含有の緩衝液Aで平衡化したDEAEセファセ
ルカラム(2,5x 16cm)に直接かけた。
このカラムを0,1MNaC1含有の緩衝液Aで洗浄し、次いで緩衝液A中、0
.1M NaC1〜0.5M NaC1の直線勾配液で展開し、次に9.5MN
aC1含有の緩衝液Aで洗浄した。活性をシスティン放出検定で位置決めし、プ
ールした(60ml)。このプールした酵素溶液に十分量の硫酸アンモニウムを
加えて10%(W/V)の最終濃度を得た。
次に、この酵素溶液を、緩衝液Aおよび10%(W/V)硫酸アンモニウムで平
衡化したフェニル−セファロースカラム(2,5X 12cm)にかけた。緩衝
液Aおよび10%(W/V)硫酸アンモニウムで洗浄した後、緩衝液A中、10
%から0%(V/ V)硫酸アンモニウムの減少勾配液で展開した。ヒドロラー
ゼ活性は主タンパク質ピークで同時溶離し、第7図のレーン3に示すように5D
S−PAGE分析で測定すると、この工程後は実質的に純粋であった。全ての活
性分画をプールし、保存用に50%グリセロールおよび緩衝液Aに対して透析し
た。
この精製したタンパク質はユビキチンタンパク質融合体を切断することができ、
実施例Iに記載した検定を用いるシスティン放出検定において活性であった。
実施例■
本実施例は、大腸菌中インビボでタンパク質を切断するユビキチン・ヒドロラー
ゼの能力を例示するものである。
第6図に示すプラスミドpTRP−YUH由来の廿pプロモーターおよびYUH
−1遺伝子を含有するDNAフラグメントをλgtllファージにクローンした
。λgtll TRP−YUHの構築を第8図に示す。この組換えファージを用
いてT7 RNAポリメラーゼ含有の菌株に5772を溶原化した。得られた菌
株(大腸菌株に5808と命名;そのゲノム中にユビキチン・ヒドロラーゼをコ
ードしている遺伝子を含有する)は、American Type Cu1tu
re Co11ectionにATCCNo、53.832のもとで寄託されて
いる(1988年11月30日寄託)。
ユビキチンーレラキシンA融合タンパク質を含有しているプラスミドpT7−3
UbiAPを、pT7−12およびptrpST2HGHから始め、第9〜13
図に記したようにして調製した。
pT7−12ST2HGHの構築(第9図)プラスミドpT7−12(実施例I
に記載)をH1ncIIおよびBamHlで消化し、大きいベクターフラグメン
トを単離した。プラスミドptrp S T 2 HG H(EP 177、3
43)をHpalおよびBamH11’消化し、小さいhGH暗号フラグメント
を単離した。これら2つのフラグメントを連結してpT7−12ST2HGHを
得た。
pT7−12ST2TPA−1の構築(第10図)プラスミドpT7−12ST
2HGHをXbaIおよびBamHIで消化し、大きいベクターフラグメントを
単離した。プラスミドpΔRI P Ao(EP 93.619 ;大腸菌tr
pブ0モーター/オヘレーターオヨヒヒトt−PA遺伝子を含有する)をBst
XIおよびBamHIで消化し、小さいフラグメント(t−PA遺伝子)を単離
した。また、同じプラスミドをBstXIおよびPstIで切断し、383bp
のフラグメントを単離した。これら3種のフラグメントを、以下の2種類の2本
鎖合成りNAフラグメントA(STIIシグナルのN−末端をコードしている)
およびB(t−PAのN−末端セリル残基に融合した5TIIシグナルのC−末
端をコードしている)と連結してpT7−12ST2TPA−1を得た。
XbaI M
luICTAGAATTATGAAAAAGAATATCGCAmCTTCTT
GCATCGATGTTCGTTrTTTCTATTGCTACA`A
MluI PstIA1aTyrAlaSer丁yrG1n
Va111eCysフラグメントB
■で部分的に消化した。このベクターをDNAポリメラーシーのフレノウ・フラ
グメントで処理して接着末端を修復し、次いで単離し、自己に連結させてpTe
traSerΔANを得た。プラスミドpAPH−1[P、 Gray et
al、 、 Gene 39 : 247(1985)コをEcoRIおよびX
baIで消化し、400塩基対のEcoRI −Xba Iフラグメントを単離
し、EcoRIおよびXbal消化のpTetraserΔANに連結してプラ
スミドpA P tetra S erを得た。プラスミドpAPtetraS
erをXbaIおよびNdeIで消化し、ベクターを単離した。第11図に示す
配列の合成オリゴヌクレオチドフラグメントをキナーゼ処理し、アニーリングし
、プラスミドpA P tetra S erから得たXbal−Ndelベク
ターに連結して、プラスミドpAPS721 FN−7ΔNde I −Ava
Iを得た。このプラスミドは、アルカリホスファターゼ遺伝子由来のプロモー
ター[Y、 Kikuchi et al、 、 Nucleic Ac1ds
Res、 9 : 5671(1981)コ、および大腸菌の熱シグナルエン
テロトキシン■の分泌シグナル[R,N、 Picken et al、 、
Infection and Ia+munity 42 : 269(198
3)]を含有している。
pT7−3ST2TPAの構築(第12図)pT7−12ST2TPA−1をX
baIおよびBamHIで消化し、小さいフラグメントを単離した。同じプラス
ミドを)(barおよびPvuIIで消化し、96bpのフラグメントを単離し
た。
pAPST2IFN−7ΔNde l −Ava IをHindIIIで切断し
、フレノウDNAポリメラーゼIで処理して接着末端を充填し、BamHIで切
断し、そして大きいフラグメントを単離した。
XbaI−BamHIの小さいフラグメント、96bpのフラグメント、および
pAPST2 IFN−7ΔNde I −Ava l由来の大きいフラグメン
トを連結してプラスミドpT7−3ST2TPAを得た。
T7−3UbiAPの構築(第13図)pT7−3ST2TPAをXbalおよ
びBamHIで消化し、大きいフラグメントを単離した。pTRP−UbiAを
XbalおよびBamHIで消化し、小さいフラグメントを単離した。この小さ
いフラグメントをpT7−3ST2TPA由来の大きいフラグメントに連結した
。
得られたプラスミドpT 7−3 UbiAをDraIIIおよびPvuIIで
消化し、第13図に示す合成りNAフラグメントに連結してpT7−3UbiA
Pを得た。
pT7−12UbiBの構築
pT7−12ST2TPA−1をXbaIおよびBamHIで消化して大きいフ
ラグメントを単離し、ユビキチンーレラキシンB−29融合タンパク質をコード
しそしてXbalおよびBamHI接着末端を有する合成りNAフラグメントに
連結してpT7−12UbiBを得た。
形質転換および切断
菌株に5808をpT 7−3 UbiA PまたはpT7−3UbiBで形質
転換した。さらに、対照としてレラキシンA鎖だけをコードしているプラスミド
(pT7プロモーターの支配下にある)で菌株に5772を形質転換し、細胞上
清を5DS−PAGEゲルで分析した。また、実施例■の大腸菌から精製したユ
ビキチン・ヒドロラーゼで処理したレラキシンA鎖融合体の上清も分析した。
K5772およびに5808株を、メチオニン、システィンおよびトリプトファ
ンを除くそれぞれ50μg/mlの共通のアミノ酸を含有するM9最少塩培地で
、および適当なプラスミドを維持するための50μg/mlのアンピシリン下で
培養した。インキュベートは、K5772誘導体については37℃であり、K5
808誘導体については32℃であった。ODが0.4になるまで培養物を増殖
させ、この時点でIPTOを1mMの濃度になるまで加え、そして30分間イン
キュベートを続けた。リファンピシンを200μg/mlまで加え、培養物をさ
らに30分間インキュベートした。35S−システィンを加え(10u Ci/
ml、600Ci/mモル)、培養物を表示した時間パルスラベルした。試料を
、直ちにSDS試料緩衝液[10%グリセロール、5%β−メルカプトエタノー
ル、2.3%SDS、0.0625トリスーHCI(pH5,8)、0.04%
ブロムフェノール・ブルー]中、90℃で5分間溶解し、次いで氷上に置くか、
または、ラベルした細胞を素早くエッペンドルフ管中でペレット化し、エタノー
ル/ドライアイス中で凍結させた。パルス−チェース実験を行ったときにはパル
ス後すぐにクロラムフェニコール(100μg/ml)を加え、インキュベート
を続け、10.20および30分でパルス−チェース試料を採取した。即ち、T
7 RNAポリメラーゼによってインビボでラベルしたポリペプチドは続いてパ
ルス−チェースを行い、そして還元5DS−PAGEゲルで分析した。
5DS−PAGEの結果を第14図に示す。ここで、レーン(a)は大腸菌株に
5772におけるラベル化しラキシンA融合の細胞上清であり、(b)は大腸菌
由来の精製ユビキチン・ヒドロラーゼによりインビトロで処理したラベル化しラ
キシンA融合の上清であり、(C)〜(f)はユビキチン・ヒドロラーゼ遺伝子
を含有する菌株に5808においてラベルしたレラキシンA融合体であり[(d
)〜(f)はそれぞれ10,20および30分間チェースした]、(g)〜(j
)は菌株に5808においてラベルしたレラキシンB融合体である[(h)〜(
j)はそれぞれ10.20および30分間チェースした]。ユビキチン単量体と
レラキシンAポリペプチドの位置が示されている。
YUH−1遺伝子ならびに組込みλファージを欠く菌株に5772は融合タンパ
ク質だけを産生じた。しかし、YUH−1遺伝子を含有するに5808株は、ユ
ビキチンの大きさのポリペプチドにチェースされる融合タンパク質を産生した。
カルボキシ末端延長ポリベブチドレラキシンA鎖は、レラキシンB鎖のように、
減成されることが明らかであった。
実施例V
本実施例は、ユビキチンの76位のアミノ酸またはユビキチンに融合させたポリ
ペプチドのN−末端のアミノ酸(77位)を変えたときの作用を示すものである
。
ユビキチン遺伝子は、融合タンパク質をコードしているDNAを結合させるのに
用いた唯一のDraIII部位の5′に好都合な唯一の5a11部位を有してい
る。以下に示すDNAフラグメントを、エビキチン3′末端を再構成するのに必
要なヌクレオチドの残りに連結し、S ac11部位を挿入した。この末端に、
レラキシンAに融合したユビキチンをコードしているDNAを含有するpT7−
12UbiAPを5allおよびBamHTで切断し、5′末端に5all接着
末端および最上の配列の3゛末端にBamHI接着末端を有する以下の合成りN
Aフラグメントの1つと連結した(ポリペプチドの残りをコードしているベクタ
ー提供のヌクレオチドには下線を引いた)。pT7−12UbiAPは、pT7
−12ST2TPA−1をXbaIおよびBamHIで切断して大きいフラグメ
ントを単離し、pT 7−3 UbiA PをXbaIおよびBamHIで切断
して小さいフラグメントを単離し、そしてこれら2つのフラグメントを連結する
ことによって調製した。
pT 7−3 UbiA PをDraIIIおよびBamHIで切断し、大きい
フラグメントを単離し、そしてこれを以下のポリペプチドの1つをコードしてい
る合成りNAフラグメントに連結することによって別の組の構築物を調製する:
(Asp 77)ユビキチンーAsp−レラキシンB鎖のアミノ酸2−29(G
in 77) ユビキチンー〇in−レラキシンA鎖のアミノ酸2−24また、
(Glu 77) [ユビキチンーGlu−ペンタペブチドーレラキシンB鎖の
アミノ酸2−33]を上記のようにして調製した(第1b図および実施例工)。
さらに、pT7プロモーターによって誘導される、融合ポリペプチドの合成りN
Aが77位(融合ポリペプチドのN−末端)にメチオニンまたはシスティン残基
をコードするようにプラスミドを構築した。
菌株に5772を上記プラスミドのそれぞれで形質転換し、タンパク質基質をラ
ベルし、そして融合タンパク質のインビトロ切断検定を実施例工の記載のように
行った。
G1u77、Asp77、G1n77、Cys77、Gly77、およびMet
77構築物で効果的な切断が達成された。しかし、プロリンがこの77位に挿入
されると、切断は観察されず、B achmair等[5cience 234
: 179−186(1986)コのインビボでの結果と一致した。
さらに、ユビキチンの76位(C末端)のバリンまたはシスティン置換によって
切断がブロックされ、76位のグリシン残基が重要であることがわかった。
実施例■
)’ 1nley等[Ce1l 48 : 1035−1046(1987)]
は、酵母のペンターユビキチン遺伝子を削除するとこの細胞が環境ストレスに対
して感受性になることを見い出した。従って、YUH−1遺伝子を除去すると同
一かまたはさらに重度の表現型を生じるはずである。これは、この細胞がユビキ
チン単量体を生成する方法を有しておらず、従ってユビキチンマイナスであるた
めである。
即ち、以下に記載するようにしてYUH−1遺伝子をUra3遺伝子で遮断した
。最終のプラスミドpYUH::URA3をpcGY379(この構築は以下に
示す)および上記のpT7−3ST2TPAから調製した。
pCGY379は、Y E p 24 (New England Biola
bs)をHindIIIで消化し、1166bpのフラグメントを単離すること
によって調製した。このフラグメントを第15図に記した合成リンカ−と連結し
た。pUc119(市販品から入手可能)を5alIで切断し、リンカ−を有す
る1166bl)フラグメントに連結した。得られたプラスミドがpCGY37
9であり、その構築を第15図に図示した。
pYUH::URA3は次のように調製した。pTRP−YUH(上記)を5a
ilおよびEcoRIで切断し、YUH−1遺伝子を含有する小さいフラグメン
トを単離した。pT7−3ST2TPAをEcoRIおよび5alIで切断し、
大きいベクターフラグメントを単離した。これら2つのフラグメントを連結して
プラスミドpYUH1を得た。pYUHlをEcoRVで切断した。pCGY3
79をSmaIで切断し、酵母URA3遺伝子を含有する小さいフラグメント(
1,1kb)を単離した。このSmaIフラグメントと切断したpYUH1プラ
スミドを連結し、連結産物をEcoRVで切断し、YUH−1遺伝子内にURA
3遺伝子を含有するpYUH::URA3を得た。この構築を第16図に示す。
pYUH::URA3プラスミドを5ailおよびEcoRI テ切断した。こ
の小さいフラグメント(1,95kbフラグメント)を、ハイブリダイゼーショ
ンプローブとして用いた未遮断のYUH−1遺伝子を含有する5ail−Eco
RI 847bpフラグメントと共に第17図に示す。
倍数ura3/ura3酵母栄養要求変異種(a/αura3−52)を、通常
の交配法により、半数DBY747(MAT a ura3−52)およびDB
Y746(MAT a ura3−52)を交配することによッテ調製すること
ができる。これらの半数体はYeast Genetic 5tockCent
er[Berkeley、 CA]から入手することができる。得られた倍数体
を、Rothstein[Meth、Enzymol、 101 : 202−
211(1983)]の記載のようにして1.95kbのフラグメントで形質転
換することができる。
URA′″の倍数体を選択し、胞子形成させる[Rothstein ;上記]
。この胞子を分析し、増殖およびU、RA表現型について試験する。URA“あ
るいはURA−にかかわらず全ての胞子が生存性であり、半数体酵母コロニーに
増殖した。親の倍数体株、URA”倍数体、URA+倍数体由来のURA”半数
体胞子およびURA+倍数体由来のura−半数体胞子からDNAを調製し、5
ailおよびEcoRIで切断し、下記のようにラベルしたYUH−1遺伝子由
来の847bpの5alI−EcoRIフラグメントをプローブとして用いてサ
ザーン・プロットを行い、YUH−1遺伝子中へのURA3遺伝子の挿入につい
てスクリーニングした。
847bpの5alI−EcoRI DNAフラグメントは、ランダムプライ
ムしたDNA合成でラベルした。10mMトリス−HCI(pH7,4)、10
mM MgCl□、1100u dATP、dGTPおよびTTP、4mC1/
ml a32P dCTP、および40 μl/mlウシ胸腺プライマー中に8
μg/mlのDNAを含む混合物を2分間、100℃に加熱し、次いで氷上で冷
却した。フレノウ酵素(400U/ml)を加え、インキュベートを室温で1時
間行った。混合物をフェノール/CHCl、抽出し、エタノール沈澱させた。導
入された放射活性を実施例■の記載のようにして測定した。ラベルしたプローブ
を100℃で5分間加熱し、氷上で冷却し、次いでハイブリダイゼーション反応
液に加えた。プローブのハイブリダイゼーションは実施例工の記載のようにして
行った。
得られたサザーン・プロットを第18図に示す。ここで、レーン(a)は親の菌
株(ura−倍数体)、(b)はURA”倍数体、(c)はURA”半数体、お
よび(d)はura−半数体である。
847bpの親のSal I −EcoRI 7ラグメントは、親の倍数体、U
RA+倍数体、およびura−半数体で観察された。2kbの挿入フラグメント
はURA+半数体およびURA+倍数体にのみ存在した。これらの実験によって
、倍数体の親の形質転換体の1つの染色体中、ならびに半数体胞子中のURA3
遮断YUH−1遺伝子の存在が確かめられた。
YUH−1ネガテイブなURA”倍数体および半数体クローンの抽出物について
、実施例Iの記載のようにして、ユビキチンータンパク質のインビトロ切断活性
を調べた。この結果は、YUH−1ネガテイブなりローンがほぼ野生型の酵素レ
ベルを有していることを示した。URA3遺伝子が35番目のアミノ酸のところ
でYUH−1遺伝子を遮断し、AUG翻訳開始コドンがYUH−1遺伝子中に見
い出されないので、この分離したYUH−1遺伝子から活性なタンパク質を産生
ずることができない。従って、第2の酵母ユビキチン・ヒドロラーゼをコードし
ている少なくとも第2の遺伝子YUH−2が存在する。この遺伝子はDNA配列
レベルではYUH−1に関連していない。何故なら、低ストリンジエンシーでY
UH−1遺伝子をプローブとして用いたときに、第2のハイブリダイゼーション
バンドが第18図のYUH−1ネガテイブなURA+半数体由来のDNAのサザ
ーン・プロットにおいて観察されないためである。従って、この遺伝子YUH−
2は第2の酵母ユビキチン・ヒドロラーゼをコードしている。
実施例Iのセクション■に記載されている方法を用いて、初めにURA”半数体
[そのサザーン・プロットがレーン(C)に示されている]を発酵させ、精製し
、それに含まれているヒドロラーゼを部分的に配列決定する(プローブを設計す
る目的で)ことによって、この第2の酵母ユビキチン・ヒドロラーゼタンパク質
をクローンし、発現させた。少なくとも一部の配列が得られると、これを用いて
合成プローブを調製することができ、このプローブを用いて実施例工のセクショ
ン■の記載のようにして酵母ライブラリーをスクリーニングする。プローブとハ
イブリダイズするDNAフラグメントを関連のファージから単離し、M13mp
19および/またはM13mp18バクテリオファージにクローンし、そして実
施例Iの記載のように配列決定する。次いで、ヒドロラーゼをコードしているフ
ラグメントを、trpなどの適当なプロモーターに、およびリポソーム結合部位
に連結し、大腸菌株に導入し、例えば実施例■でYUH−1について記載したよ
うにして発現を誘導する。
まとめると、ユビキチンータンパク質融合体をプロセッシングする触媒活性をコ
ードしている遺伝子(YUH−1)を、酵母S acchar。
myces cerevisiaeからクローンした。この遺伝子は26kdの
タンパク質をコードしており、はとんどの酵母遺伝子と同様、イントロンを含ん
でいない。このYUH−1遺伝子を大腸菌において活性形で過発現させ、均質に
なるまで精製することができ、この酵素は大腸菌の細胞内でユビキチン融合体を
切断することができる。
酵母から単離されたときに、ユビキチン・ヒドロラーゼは少なくとも2つの他の
タンパク質を含有する複合体として精製される。
YUH−1遺伝子の遺伝子遮断は半数体酵母にとって致死性ではない。実際のと
ころ、システィン放出検定で測定したときのユビキチン・ヒドロラーゼのレベル
は、そのような菌株においては正常に近い。この酵母細胞は第2のユビキチン・
ヒドロラーゼ遺伝子YUH−2を含有しているようである。
酵母ユビキチン・ヒドロラーゼは、ユビキチン融合タンパク質のgly76の次
のペプチド結合の切断に特異的である。ユビキチン部分中の76位の1個のアミ
ノ酸を変えると切断が阻害されるようである。しかし、この酵素は、C−末端延
長の大きさ、または切断部位に続くプロリン以外の残基には比較的非感受性のよ
うである。
インビトロで精製およびプロセッシングされるユビキチン融合タンパク質のイン
ビボ合成は、特定のアミノ末端を有するタンパク質の合成を可能にする。この方
法は、その大きさの故に細胞内で急速に分解される小さいペプチドを調製する際
に特に有用であろう。また、ユビキチン・ヒドロラーゼはユビキチンータンパク
質コンジュゲートからユビキチンを切断するのにも活性であるので、精製された
ヒドロラーゼは、活性検定および/または配列決定を行う前にインビトロで真核
性タンパク質を脱ユビキチン化するのに極めて有用である(ユビキチンの存在が
これらの過程を妨げるので)。
HIndIII /ρvuII
847bp
1.95kb
−一1−−m1^帥皺吟−一・ p−〒/Ill: QO/nつl:’
、1国際調査報告
Claims (78)
- 1.組成物中の全タンパク質重量に基づいて少なくとも70%均質である純度の ユビキチン・ヒドロラーゼを含有する組成物。
- 2.ヒドロラーゼが酵母ユビキチン・ヒドロラーゼである請求項1記載の組成物 。
- 3.(a)真核細胞発酵ペーストをホモジナイズし、このホモジネートからユビ キチン・ヒドロラーゼ活性を含有する部分を回収し;(b)工程(a)で回収し たヒドロラーゼ含有部分からユビキチン・ヒドロラーゼ活性を含有する沈澱物を 塩沈澱させ;(c)この沈澱物の溶液をイオン交換樹脂と接触させ、ユビキチン ・ヒドロラーゼ活性の分画を回収し: (d)ユピキチン・ヒドロラーゼ活性の分画を疎水性のアフィニティ−樹脂と接 触させ、この樹脂に吸着されたユピキチン・ヒドロラーゼ活性の分画を回収し′ (e)ユビキチン・ヒドロラーゼ活性の分画を吸着クロマトグラフィ−樹脂と接 触させ、この樹脂に吸着されたユピキチン・ヒドロラーゼ活性の分画を回収し: そして (f)ユビキチン・ヒドロラーゼ活性の分画をイオン交換樹脂と接触させ、ヒド ロラーゼ活性の分画を回収することを特徴とする方法。
- 4.ヒドロラーゼ活性分画中の全タンパク質重量に基づいて少なくとも70%の 純度でユビキチン・ヒドロラーゼ活性分画からユピキチン・ヒドロラーゼを単離 する工程をさらに含有する請求項3記載の方法。
- 5.工程(a)の回収を遠心によって行い、工程(d)および(e)から回収し た分画を次の工程を行う前に緩衝液に対して透析し、そして真核生物が酵母であ る請求項3記載の方法。
- 6.工程(b)を硫酸アンモニウム分画化によって行う請求項3記載の方法。
- 7.工程(c)および(f)をDEAEカラムクロマトグラフィーによって行い 、活性分画をこのカラムに吸着させ、そしてそれから回収する請求項3記載の方 法。
- 8.工程(d)をフェニル、オクチル、またはセチルセファロースクロマトグラ フィーによって行う請求項3記載の方法。
- 9.工程(e)をヒドロキシアパタイトカラムクロマトグラフィーによって行い 、活性分画をこのカラムに吸着させ、そしてそれから回収する請求項3記載の方 法。
- 10.ユビキチン・ヒドロラーゼをコードしている配列を含有する単離した核酸 配列。
- 11.ユピキチン・ヒドロラーゼが酵母ユピキチン・ヒドロラーゼである請求項 10記載の配列。
- 12.DNA配列である請求項11記載の配列。
- 13.ストリンジェントな条件下で第5図のDNA配列とハイブリダイズし、少 なくとも約10個のヌクレオチドを含有する配列からなる単離したDNA配列。
- 14.少なくとも約20個のヌクレオチドを含有する請求項13記載のDNA配 列。
- 15.少なくとも約30個のヌクレオチドを含有する請求項13記載のDNA配 列。
- 16.少なくとも約40個のヌクレオチドを含有する請求項13記載のDNA配 列。
- 17.核酸配列に機能的に結合したプロモーターをさらに含有する請求項10記 載の核酸配列。
- 18.単細胞生物中で機能する複製起点をさらに含有する請求項10記載の核酸 配列。
- 19.ベクターで形質転換された宿主によって認識されるコントロール配列に機 能的に結合した請求項10記載の核酸配列を含有する発現ベクター。
- 20.請求項19記載の発現ベクターで形質転換された宿主細胞。
- 21.細胞が原核性であり、ベクターがヒドロラーゼ分泌のためのシグナル配列 を含有している請求項20記載の宿主細胞。
- 22.大腸菌である請求項21記載の宿主細胞。
- 23.真核性である請求項20記載の宿主細胞。
- 24.ユビキチン・ヒドロラーゼのアミノ酸配列を十分に複製するアミノ酸配列 を有する酵素であって、ユビキチンとポリペプチドを結合させているアミド結合 のところでユビキチン−ポリペプチドコンジュゲートを加水分解し、それによっ て非コンジュゲートの成熟N−末端を有する無傷のポリペプチドを生成させる酵 素をコードしているDNA配列を含有する単離したDNA配列。
- 25.cDNA配列である請求項24記載の配列。
- 26.酵素をコードしている配列のN−末端にシグナル配列をコードしている領 域をさらに含有している請求項24記載の配列。
- 27.シグナル配列が原核宿主細胞または酵母宿主細胞によって認。 識されるものである請求項26記載の配列。
- 28.ゲノム配列である請求項24記載の配列。
- 29.検出可能な部分に共有結合している請求項24記載の配列。
- 30.ベクターで形質転換された宿主によって認識されるコントロール配列に機 能的に結合した請求項24記載のDNA配列を含有する発現ベクター。
- 31.プラスミドである請求項30記載のベクター。
- 32.請求項30記載の発現ベクターで形質転換された宿主細胞。
- 33.請求項30記載のベクターで形質転換された大腸菌。
- 34.請求項32記載の細胞を培養して宿主細胞培養物中にヒドロラーゼを発現 させることを特徴とするユピキチン・ヒドロラーゼの製造方法。
- 35.請求項33記載の大腸菌を培養して大腸菌培養物中にヒドロラーゼを発現 させることを特徴とするユビキチン・ヒドロラーゼの製造方法。
- 36.宿主細胞培養物からヒドロラーゼを回収する工程をさらに含有する請求項 34記載の方法。
- 37.(a)組換え宿主細胞培養の不純生成物を含有する組成物においてユビキ チン−ポリペプチドコンジユゲートを得(ここで、該ポリペプチドはユピキチン のC−末端にコンジュゲートしており、また、核ポリペプチドはそのN−末端に プロリン以外の任意のアミノ酸を含有している); (b)この組成物をユビキチンに対して特異的な親和性を有する試薬と接触させ てコンジュゲートを試薬に吸着させ、試薬とその吸着されたコンジュゲートを組 成物の残りから分離し、試薬からコンジュゲートを回収し; (c)回収したコンジュゲートをユビキチン・ヒドロラーゼと接触させ、それに よってコンジュゲートをユビキチンと成熟ポリペプチドに加水分解し、ユビキチ ン・ヒドロラーゼを固定化し;(d)工程(c)で得られた物質をユビキチンに 対して特異的な親和性を有する試薬と接触させて残留コンジュゲートおよび遊離 ユビキチンの全てを試薬に吸着させ;そして (e)試薬およびそれに吸着した物質を含まないポリペプチドを回収すること を特徴とする方法。
- 38.宿主細胞が内生のユビキチン・ヒドロラーゼを産生しないものである請求 項37記載の方法。
- 39.宿主細胞培養物が原核細胞培養物である請求項37記載の方法。
- 40.ポリペプチドがレラキシンもしくはインスリンのA鎖もしくはB鎖、プロ レラキシン、プロインスリン、インターフェロン、インターロイキン、成長ホル モン、神経成長因子、トランスフォーミング成長因子、インスリン様成長因子、 またはDNアーゼである請求項37記載の方法。
- 41.ポリペプチドがレラキシンもしくはインスリンのA鎖もしくはB鎖、プロ レラキシン、プロインスリン、インターフェロン−7、またはデス−N−メチオ ニルヒト成長ホルモンである請求項40記載の方法。
- 42.ポリペプチドが宿主細胞に対して異種のものである請求項37記載の方法 。
- 43.ポリペプチドがヒトポリペプチドである請求項42記載の方法。
- 44.工程(a)において、コンジュゲートを組換え宿主細胞培養で発現させ、 この宿主細胞培養物を工程(b)の前に収穫し、そして工程(c)において、回 収したコンジュゲートを初めに固定化ユビキチン・ヒドロラーゼと接触させる請 求項37記載の方法。
- 45.工程(b)および(d)の試薬が抗ーユビキチン抗体である請求項37記 載の方法。
- 46.工程(b)において、抗体に吸着させたコンジュゲートを溶離する請求項 45記載の方法。
- 47.抗体がモノクローナル抗体であり、溶離がアフィニティークロマトグラフ ィーカラムからである請求項46記載の方法。
- 48.(a)組換え宿主細胞培養の不純生成物を含有する組成物においてユピキ チン−ポリペプチドコンジュゲートを得(ここで、該ポリペプチドはユビキチン のC−末端にコンジュゲートしており、また、該ポリペプチドはそのN−末端に プロリン以外の任意のアミノ酸を含有している): (b)この組成物をユビキチンに対して特異的な親和性を有する試薬と接触させ てコンジュゲートを試薬に吸着させ、試薬とその吸着されたコンジュゲートを組 成物の残りから分離し;(d)コンジュゲートが吸着した試薬をユビキチン・ヒ ドロラーゼと接触させ; (e)試薬からヒドロラーゼとポリペプチドを分離し;そして(f)ヒドロラー ゼからポリペプチドを分離することを特徴とする方法。
- 49.宿主細胞培養物が原核細胞培養物であり、ポリペプチドが宿主細胞に対し て異種のものである請求項48記載の方法。
- 50.工程(a)において、コンジュゲートが組換え宿主細胞培養で発現され、 工程(b)の前に宿主細胞培養物が収穫される請求項48記載の方法。
- 51.ポリペプチドがレラキシンもしくはインスリンのA鎖もしくはB鎖、プロ レラキシン、プロインスリン、インターフェロン、インターロイキン、成長ホル モン、神経成長因子、トランスフォーミング成長因子、インスリン様成長因子、 またはDNアーゼである請求項48記載の方法。
- 52.工程(b)で用いる試薬が抗ーユビキチン抗体である請求項48記載の方 法。
- 53.(a)染色体中に組込まれたユビキチン・ヒドロラーゼをコードしている DNAを有し、そしてユビキチン−ポリペプチドコンジュゲートをコードしてい るヌクレオチド配列を含有する発現ベクターで形質転換された原核宿主細胞を培 養してコンジュゲートを発現させ(ここで、該ポリペプチドはユピキチンのC− 末端にコンジュゲートしており、また、該ポリペプチドはそのN−末端にプロリ ン以外の任意のアミノ酸を含有している);そして(b)ユピキチン(これにポ リペプチドがコンジュゲートしていた)を含まないポリペプチドを培養細胞から 回収することを特徴とする方法。
- 54.宿主細胞が大腸菌である請求項53記載の方法。
- 55.ポリペプチドが宿主細胞に対して異種のものである請求項53記載の方法 。
- 56.ポリペプチドがヒトポリペプチドである請求項55記載の方法。
- 57.ポリペプチドがレラキシンもしくはインスリンのA鎖もしくはB鎖、プロ レラキシン、プロインスリン、インターフェロン、インターロイキン、成長ホル モン、神経成長因子、トランスフォーミング成長因子、インスリン様成長因子、 またはDNアーゼである請求項53記載の方法。
- 58.ユピキチン・ヒドロラーゼが酵母ユビキチン・ヒドロラーゼである請求項 53記載の方法。
- 59.染色体中に組込まれたユビキチン・ヒドロラーゼをコードしているDNA を有する原核宿主細胞。
- 60.大腸菌である請求項59記載の宿主細胞。
- 61.ユピキチン・ヒドロラーゼが酵母ユビキチン・ヒドロラーゼである請求項 60記載の宿主細胞。
- 62.ATCCNo.53,832のもとで寄託されている菌株K5808の性 質を有する請求項61記載の宿主細胞。
- 63.ユピキチン−ポリペプチドコンジュゲートをコードしているヌクレオチド 配列を含有する発現ベクターで形質転換された請求項59記載の宿主細胞(ここ で、該ポリペプチドはユビキチンのC−末端にコンジュゲートしており、また、 該ポリペプチドはそのN−末端にプロリン以外の任意のアミノ酸を含有している )。
- 64.ポリペプチドが宿主細胞に対して異種のものである請求項63記載の宿主 細胞。
- 65.ポリペプチドがヒトポリペプチドである請求項64記載の宿主細胞。
- 66.ポリペプチドがレラキシンもしくはインスリンのA鎖もしくはB鎖、プロ レラキシン、プロインスリン、インターフェロン、インターロイキン、成長ホル モン、神経成長因子、トランスフォーミング成長因子、インスリン様成長因子、 またはDNアーゼである請求項65記載の宿主細胞。
- 67.請求項13記載のDNA配列にハイプリダイズしないDNAによってコー ドされている単離された酵母ユビキチン・ヒドロラーゼ。
- 68.請求項13記載の配列にハイプリダイズせず、少なくとも約10個のヌク レオチドを含有する核酸配列を含有するユピキチン・ヒドロラーゼをコードして いる単離された核酸配列。
- 69.少なくとも約20個のヌクレオチドを含有する請求項68記載の核酸配列 。
- 70.少なくとも約30個のヌクレオチドを含有する請求項68記載の核酸配列 。
- 71.少なくとも約40個のヌクレオチドを含有する請求項68記載の核酸配列 。
- 72.ベクターで形質転換された宿主によって認識されるコントロール配列に機 能的に結合した請求項68記載の核酸配列を含有する発現ベクター。
- 73.請求項72記載の発現ベクターで形質転換された宿主細胞。
- 74.原核性である請求項73記載の宿主細胞。
- 75.大腸菌である請求項74記載の宿主細胞。
- 76.ヒドロラーゼが緩衝液中に存在する請求項1記載の組成物。
- 77.第1成分としてユビキチン.ヒドロラーゼを、そして第2成分として固定 化した抗ーユビキチン抗体を含有するキット。
- 78.第1成分として請求項76記載の組成物を、そして第2成分として固定化 した抗ーユビキチン抗体を含有するキット。
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