JPH05123193A - α−アミラーゼ活性の測定法およびα−アミラーゼ活性測定用試薬 - Google Patents
α−アミラーゼ活性の測定法およびα−アミラーゼ活性測定用試薬Info
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- JPH05123193A JPH05123193A JP3319993A JP31999391A JPH05123193A JP H05123193 A JPH05123193 A JP H05123193A JP 3319993 A JP3319993 A JP 3319993A JP 31999391 A JP31999391 A JP 31999391A JP H05123193 A JPH05123193 A JP H05123193A
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- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/195—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from bacteria
- G01N2333/32—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from bacteria from Bacillus (G)
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 効率良く追随でき、感度よく、しかも試薬ブ
ランク反応の少ないα−アミラーゼ測定法を提供する。 【構成】 α−アミラーゼ基質として、少なくとも３個
のグルコース単位で構成されるマルトオリゴ糖であっ
て、その還元性末端グルコースが還元性末端グルコース
の１位の位置において光学的に測定できる標識とα−ま
たはβ−グルコシド結合しており、かつその非還元性末
端グルコースがグルコース以外の置換基で修飾されてい
る基質を用意し、試料を、前記標識と１位の位置におい
てα−グルコシド結合したグルコースおよびグルコース
単位２個から７個までのすべてのマルトオリゴ糖に実質
的に作用するα−グルコシダーゼ、および必要によりβ
−グルコシダーゼと接触させ、遊離した前記標識を光学
的に測定することにより、試料中のα−アミラーゼ活性
を測定することを特徴とするα−アミラーゼ活性の測定
方法。
ランク反応の少ないα−アミラーゼ測定法を提供する。 【構成】 α−アミラーゼ基質として、少なくとも３個
のグルコース単位で構成されるマルトオリゴ糖であっ
て、その還元性末端グルコースが還元性末端グルコース
の１位の位置において光学的に測定できる標識とα−ま
たはβ−グルコシド結合しており、かつその非還元性末
端グルコースがグルコース以外の置換基で修飾されてい
る基質を用意し、試料を、前記標識と１位の位置におい
てα−グルコシド結合したグルコースおよびグルコース
単位２個から７個までのすべてのマルトオリゴ糖に実質
的に作用するα−グルコシダーゼ、および必要によりβ
−グルコシダーゼと接触させ、遊離した前記標識を光学
的に測定することにより、試料中のα−アミラーゼ活性
を測定することを特徴とするα−アミラーゼ活性の測定
方法。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、臨床的に膵疾患や唾液
腺疾患等の診断の指標となっている体液中のα−アミラ
ーゼ活性の測定法およびα−アミラーゼ活性測定用試薬
に関するものである。
腺疾患等の診断の指標となっている体液中のα−アミラ
ーゼ活性の測定法およびα−アミラーゼ活性測定用試薬
に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】α−アミラーゼ活性測定法で現在、自動
分析装置の普及に伴い、広く用いられているのがマルト
オリゴ糖を用いる方法である。従来はマルトオリゴ糖と
して非還元性末端グルコースが修飾されていないマルト
オリゴ糖を用い、α−アミラーゼの追随酵素としてα−
グルコシダーゼ、必要によりβ−グルコシダーゼを使用
し、遊離するグルコースを測定するか、もしくは還元性
末端グルコースより遊離された標識を光学的に測定して
いた。ここでα−グルコシダーゼとしてよく用いられて
いるのは酵母（サッカロマイセス属）起源のα−グルコ
シダーゼである。
分析装置の普及に伴い、広く用いられているのがマルト
オリゴ糖を用いる方法である。従来はマルトオリゴ糖と
して非還元性末端グルコースが修飾されていないマルト
オリゴ糖を用い、α−アミラーゼの追随酵素としてα−
グルコシダーゼ、必要によりβ−グルコシダーゼを使用
し、遊離するグルコースを測定するか、もしくは還元性
末端グルコースより遊離された標識を光学的に測定して
いた。ここでα−グルコシダーゼとしてよく用いられて
いるのは酵母（サッカロマイセス属）起源のα−グルコ
シダーゼである。
【０００３】このα−グルコシダーゼは還元性末端グル
コースに標識が結合しているマルトオリゴ糖にも作用性
を持ち、かつマルトテトラオース（Ｇ４）以上のグルコ
ース鎖長を持つマルトオリゴ糖への作用性がほとんどな
いことから、α−アミラーゼ作用前に非還元性末端グル
コースが修飾されていないＧ４以上のマルトオリゴ糖に
作用する速度が非常に遅いので、α−アミラーゼ活性測
定時には試薬ブランク反応が少なく好適であった。一
方、追随酵素としてのα−グルコシダーゼを考えると、
α−アミラーゼによる生成マルトオリゴ糖を直ちに分解
する必要がある。
コースに標識が結合しているマルトオリゴ糖にも作用性
を持ち、かつマルトテトラオース（Ｇ４）以上のグルコ
ース鎖長を持つマルトオリゴ糖への作用性がほとんどな
いことから、α−アミラーゼ作用前に非還元性末端グル
コースが修飾されていないＧ４以上のマルトオリゴ糖に
作用する速度が非常に遅いので、α−アミラーゼ活性測
定時には試薬ブランク反応が少なく好適であった。一
方、追随酵素としてのα−グルコシダーゼを考えると、
α−アミラーゼによる生成マルトオリゴ糖を直ちに分解
する必要がある。
【０００４】しかしながら、この酵母起源のα−グルコ
シダーゼは、グルコースの鎖長が長くなると作用性が低
下する。つまりマルトトリオース（Ｇ３）になると作用
性が悪くなることから、追随酵素として用いるためには
酵素量を過剰に添加する必要があった。更に試薬の安定
性の問題、つまり酵素を基質に長時間接触させておく
と、徐々に酵素が基質に作用するので、酵素および基質
を含む試薬を調製後、直ちにα−アミラーゼ活性測定に
使用しなければならなかった。
シダーゼは、グルコースの鎖長が長くなると作用性が低
下する。つまりマルトトリオース（Ｇ３）になると作用
性が悪くなることから、追随酵素として用いるためには
酵素量を過剰に添加する必要があった。更に試薬の安定
性の問題、つまり酵素を基質に長時間接触させておく
と、徐々に酵素が基質に作用するので、酵素および基質
を含む試薬を調製後、直ちにα−アミラーゼ活性測定に
使用しなければならなかった。
【０００５】そこで近年、マルトオリゴ糖として非還元
性末端グルコース修飾マルトオリゴ糖を基質として用い
る方法が脚光を浴びている。本法は基質の非還元性末端
グルコースが修飾されているので、α−アミラーゼが作
用する以前に基質が追随酵素により攻撃を受けることが
阻止される。それによって酵素と基質を含む試薬の調製
後、長時間経ても使用可能となり、一液性のα−アミラ
ーゼ測定試薬も可能にした。
性末端グルコース修飾マルトオリゴ糖を基質として用い
る方法が脚光を浴びている。本法は基質の非還元性末端
グルコースが修飾されているので、α−アミラーゼが作
用する以前に基質が追随酵素により攻撃を受けることが
阻止される。それによって酵素と基質を含む試薬の調製
後、長時間経ても使用可能となり、一液性のα−アミラ
ーゼ測定試薬も可能にした。
【０００６】しかしながらやはりここで問題になるのは
α−グルコシダーゼの基質特異性であり、効率的な追随
反応で測定を感度よく行うにはα−グルコシダーゼを大
過剰に添加する必要があった。従って酵素を多量に用い
るため、経済的に不利であり、かつ試薬自体の問題とし
て濁りの生成、更には酵素標品中の混在酵素による試薬
ブランク反応増大の可能性がなお残っていた。また基質
としてグルコース単位７個以上のマルトオリゴ糖を用い
ると、マルトテトラオース（Ｇ４）以上のマルトオリゴ
糖が生成することがあるが、このようなマルトオリゴ糖
は前記α−グルコシダーゼでは極めて分解され難い。従
ってα−アミラーゼ反応に追随して標識が遊離してこな
いため、測定値に化学量論的係数を乗じてα−アミラー
ゼ活性値を算出する必要のある場合も存在した。
α−グルコシダーゼの基質特異性であり、効率的な追随
反応で測定を感度よく行うにはα−グルコシダーゼを大
過剰に添加する必要があった。従って酵素を多量に用い
るため、経済的に不利であり、かつ試薬自体の問題とし
て濁りの生成、更には酵素標品中の混在酵素による試薬
ブランク反応増大の可能性がなお残っていた。また基質
としてグルコース単位７個以上のマルトオリゴ糖を用い
ると、マルトテトラオース（Ｇ４）以上のマルトオリゴ
糖が生成することがあるが、このようなマルトオリゴ糖
は前記α−グルコシダーゼでは極めて分解され難い。従
ってα−アミラーゼ反応に追随して標識が遊離してこな
いため、測定値に化学量論的係数を乗じてα−アミラー
ゼ活性値を算出する必要のある場合も存在した。
【０００７】特公昭６３−６５３１４には以上の様な問
題を解決するためα−グルコシダーゼとグルコアミラー
ゼを併用することが記載されている。すなわち、主にマ
ルトトリオース（Ｇ３）以上のグルコース鎖長のマルト
オリゴ糖の分解をグルコアミラーゼに受け持たせる。こ
の方法によれば基質としてマルトヘプタオース（Ｇ７）
以上のマルトオリゴ糖を用いても、グルコース単位まで
容易に分解されるため前記のような化学量論的係数を乗
じる必要がなくなり、測定系の感度も上昇する。付随的
に全体の酵素量が減るため、経済的にも有利であると同
時に、濁りの生成および試薬ブランク反応も抑えられ
る。
題を解決するためα−グルコシダーゼとグルコアミラー
ゼを併用することが記載されている。すなわち、主にマ
ルトトリオース（Ｇ３）以上のグルコース鎖長のマルト
オリゴ糖の分解をグルコアミラーゼに受け持たせる。こ
の方法によれば基質としてマルトヘプタオース（Ｇ７）
以上のマルトオリゴ糖を用いても、グルコース単位まで
容易に分解されるため前記のような化学量論的係数を乗
じる必要がなくなり、測定系の感度も上昇する。付随的
に全体の酵素量が減るため、経済的にも有利であると同
時に、濁りの生成および試薬ブランク反応も抑えられ
る。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】しかしながらグルコア
ミラーゼはマルトトリオース（Ｇ３）以上のマルトオリ
ゴ糖へはグルコースの鎖長に依存せずよく作用するが、
マルトース（Ｇ２）への作用性は良くない。またグルコ
アミラーゼは還元性末端グルコースに標識が結合したグ
ルコースには作用しないので単独ではアミラーゼ活性測
定の追随酵素として使用できない。
ミラーゼはマルトトリオース（Ｇ３）以上のマルトオリ
ゴ糖へはグルコースの鎖長に依存せずよく作用するが、
マルトース（Ｇ２）への作用性は良くない。またグルコ
アミラーゼは還元性末端グルコースに標識が結合したグ
ルコースには作用しないので単独ではアミラーゼ活性測
定の追随酵素として使用できない。
【０００９】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、鋭意研究
を重ねた結果、非還元性末端グルコース修飾マルゴオリ
ゴ糖を使用するα−アミラーゼ測定法において、１位で
標識とα−グルコシド結合したグルコースおよびグルコ
ース単位２個から７個までのすべてのマルトオリゴ糖に
対して実質的に作用性を有するα−グルコシダーゼを用
いると、グルコアミラーゼの併用なしに、それ単独で効
率的な追随反応が可能であることを見いだして本発明を
完成した。
を重ねた結果、非還元性末端グルコース修飾マルゴオリ
ゴ糖を使用するα−アミラーゼ測定法において、１位で
標識とα−グルコシド結合したグルコースおよびグルコ
ース単位２個から７個までのすべてのマルトオリゴ糖に
対して実質的に作用性を有するα−グルコシダーゼを用
いると、グルコアミラーゼの併用なしに、それ単独で効
率的な追随反応が可能であることを見いだして本発明を
完成した。
【００１０】すなわち、本発明の要旨は（１）α−アミ
ラーゼ基質として、少なくとも３個のグルコース単位で
構成されるマルトオリゴ糖であって、その還元性末端グ
ルコースが還元性末端グルコースの１位の位置において
光学的に測定できる標識とα−またはβ−グルコシド結
合しており、かつその非還元性末端グルコースがグルコ
ース以外の置換基で修飾されている基質を用意し、試料
を、前記標識と１位の位置においてα−グルコシド結合
したグルコースおよびグルコース単位２個から７個まで
のすべてのマルトオリゴ糖に実質的に作用するα−グル
コシダーゼ、および必要によりβ−グルコシダーゼと接
触させ、遊離した前記標識を光学的に測定することによ
り、試料中のα−アミラーゼ活性を測定することを特徴
とするα−アミラーゼ活性の測定方法および（２）
（ａ）少なくとも３個のグルコース単位で構成されるマ
ルトオリゴ糖であって、その還元性末端グルコースが還
元性末端グルコースの１位の位置において光学的に測定
できる標識とα−またはβ−グルコシド結合しており、
かつその非還元性末端グルコースがグルコース以外の置
換基で修飾されているα−アミラーゼ基質、（ｂ）光学
的に測定できる標識と１位の位置においてα−グルコシ
ド結合したグルコースおよびグルコース単位２個から７
個までのすべてのマルトオリゴ糖に実質的に作用するα
−グルコシダーゼ、および必要により（ｃ）β−グルコ
シダーゼを含有することを特徴とするα−アミラーゼ活
性測定用試薬に存する。
ラーゼ基質として、少なくとも３個のグルコース単位で
構成されるマルトオリゴ糖であって、その還元性末端グ
ルコースが還元性末端グルコースの１位の位置において
光学的に測定できる標識とα−またはβ−グルコシド結
合しており、かつその非還元性末端グルコースがグルコ
ース以外の置換基で修飾されている基質を用意し、試料
を、前記標識と１位の位置においてα−グルコシド結合
したグルコースおよびグルコース単位２個から７個まで
のすべてのマルトオリゴ糖に実質的に作用するα−グル
コシダーゼ、および必要によりβ−グルコシダーゼと接
触させ、遊離した前記標識を光学的に測定することによ
り、試料中のα−アミラーゼ活性を測定することを特徴
とするα−アミラーゼ活性の測定方法および（２）
（ａ）少なくとも３個のグルコース単位で構成されるマ
ルトオリゴ糖であって、その還元性末端グルコースが還
元性末端グルコースの１位の位置において光学的に測定
できる標識とα−またはβ−グルコシド結合しており、
かつその非還元性末端グルコースがグルコース以外の置
換基で修飾されているα−アミラーゼ基質、（ｂ）光学
的に測定できる標識と１位の位置においてα−グルコシ
ド結合したグルコースおよびグルコース単位２個から７
個までのすべてのマルトオリゴ糖に実質的に作用するα
−グルコシダーゼ、および必要により（ｃ）β−グルコ
シダーゼを含有することを特徴とするα−アミラーゼ活
性測定用試薬に存する。
【００１１】本発明において使用するα−グルコシダー
ゼ、すなわち標識と１位でα−グルコシド結合したグル
コースおよびグルコース単位２個から７個までのすべて
のマルトオリゴ糖に対して実質的に作用するα−グルコ
シダーゼは動物、植物、微生物など如何なる起源のもの
を用いても良い。また、遺伝子組み換え技術によって製
造したものでも良い。一般にα−グルコシダーゼとグル
コアミラーゼは切断によって生じたグルコースのアノマ
ー型で分類される。つまりα−グルコシダーゼではα−
グルコースが生じ、グルコアミラーゼではβ−グルコー
スが生じる。上記α−グルコシダーゼは主に微生物では
バチルス属、植物では穀類の起源のものが報告されてい
る。最も好ましい例はバチルス・ステアロサーモフィラ
ス（Bacillus stearothermophilus）起源のα−グルコ
シダーゼである。本酵素はグルコース単位２個から７個
までのすべてのマルトオリゴ糖への作用性がよく、また
１位で標識がα−グルコシド結合しているグルコースお
よび標識化マルトオリゴ糖にも良く作用し、標識を遊離
する点、および安定性に極めて優れる点で本発明の目的
に適合している。
ゼ、すなわち標識と１位でα−グルコシド結合したグル
コースおよびグルコース単位２個から７個までのすべて
のマルトオリゴ糖に対して実質的に作用するα−グルコ
シダーゼは動物、植物、微生物など如何なる起源のもの
を用いても良い。また、遺伝子組み換え技術によって製
造したものでも良い。一般にα−グルコシダーゼとグル
コアミラーゼは切断によって生じたグルコースのアノマ
ー型で分類される。つまりα−グルコシダーゼではα−
グルコースが生じ、グルコアミラーゼではβ−グルコー
スが生じる。上記α−グルコシダーゼは主に微生物では
バチルス属、植物では穀類の起源のものが報告されてい
る。最も好ましい例はバチルス・ステアロサーモフィラ
ス（Bacillus stearothermophilus）起源のα−グルコ
シダーゼである。本酵素はグルコース単位２個から７個
までのすべてのマルトオリゴ糖への作用性がよく、また
１位で標識がα−グルコシド結合しているグルコースお
よび標識化マルトオリゴ糖にも良く作用し、標識を遊離
する点、および安定性に極めて優れる点で本発明の目的
に適合している。
【００１２】本発明において標識と還元性末端グルコー
ス間との結合がβ結合の場合にはβ−グルコシダーゼを
共存させるが、このβ−グルコシダーゼも如何なる起源
のものを用いても良く、例えばアーモンド起源のものが
使用できる。
ス間との結合がβ結合の場合にはβ−グルコシダーゼを
共存させるが、このβ−グルコシダーゼも如何なる起源
のものを用いても良く、例えばアーモンド起源のものが
使用できる。
【００１３】本発明のグルコース単位少なくとも３個で
構成されるマルトオリゴ糖は、具体的にはマルトトリオ
ース、マルトテトラオース、マルトペンタオース、マル
トヘキサオース、マルトヘプタオース、マルトオクタオ
ース等を示す。α−アミラーゼによる主分解生成物がマ
ルトヘプタオース（Ｇ７）以下の基質であればすべて使
用できる。
構成されるマルトオリゴ糖は、具体的にはマルトトリオ
ース、マルトテトラオース、マルトペンタオース、マル
トヘキサオース、マルトヘプタオース、マルトオクタオ
ース等を示す。α−アミラーゼによる主分解生成物がマ
ルトヘプタオース（Ｇ７）以下の基質であればすべて使
用できる。
【００１４】還元性末端グルコースにグルコシド結合さ
れる標識化合物としては、該マルトオリゴ糖の還元性末
端グルコースに対しα結合またはβ結合することができ
ると同時にα−グルコシダーゼまたはβ−グルコシダー
ゼの作用により、容易に遊離し、かつ光学的に測定でき
るものであれば全て利用できる。好ましい例としては置
換および未置換のフェノール残基であり、最も好ましく
は４−ニトロフェノールや２−クロロ−４−ニトロフェ
ノール等が挙げられる。またこれらの標識が還元性末端
グルコースに対しβ結合したものは基質の溶解性が良好
となるので好ましい。
れる標識化合物としては、該マルトオリゴ糖の還元性末
端グルコースに対しα結合またはβ結合することができ
ると同時にα−グルコシダーゼまたはβ−グルコシダー
ゼの作用により、容易に遊離し、かつ光学的に測定でき
るものであれば全て利用できる。好ましい例としては置
換および未置換のフェノール残基であり、最も好ましく
は４−ニトロフェノールや２−クロロ−４−ニトロフェ
ノール等が挙げられる。またこれらの標識が還元性末端
グルコースに対しβ結合したものは基質の溶解性が良好
となるので好ましい。
【００１５】また非還元性末端グルコースを修飾する置
換基としては、該置換基と非還元性末端グルコース間の
結合および非還元性末端グルコースと隣接グルコース間
の結合を、追随酵素による切断から阻止できる置換基で
あれば如何なる置換基でも使用できる。例えば、エトキ
シ基、フェノキシ基、ピリジルオキシ基、エチルカルボ
キシル基、ケトプロピリデン基、ケトブチリデン基、エ
チリデン基、ベンジリデン基、β−Ｄ−ガラクトピラノ
シル基等を挙げることができる。これらのなかで、ケト
ブチリデン基、エチリデン基、ベンジリデン基、β−Ｄ
−ガラクトピラノシル基が好適に使用される。
換基としては、該置換基と非還元性末端グルコース間の
結合および非還元性末端グルコースと隣接グルコース間
の結合を、追随酵素による切断から阻止できる置換基で
あれば如何なる置換基でも使用できる。例えば、エトキ
シ基、フェノキシ基、ピリジルオキシ基、エチルカルボ
キシル基、ケトプロピリデン基、ケトブチリデン基、エ
チリデン基、ベンジリデン基、β−Ｄ−ガラクトピラノ
シル基等を挙げることができる。これらのなかで、ケト
ブチリデン基、エチリデン基、ベンジリデン基、β−Ｄ
−ガラクトピラノシル基が好適に使用される。
【００１６】
【実施例】次に本発明の実施例を説明する。 実施例１および比較例１ 下記成分を水道水６リットルに溶解し、ｐＨを７．０に
調製後、オートクレーブ処理した。 可溶性デンプン １２０ｇ ペプトン １２０ｇ 肉エキス ３ｇ 酵母エキス １２ｇ Ｋ2 ＨＰＯ4 １８ｇ ＫＨ2 ＰＯ4 ６ｇ
調製後、オートクレーブ処理した。 可溶性デンプン １２０ｇ ペプトン １２０ｇ 肉エキス ３ｇ 酵母エキス １２ｇ Ｋ2 ＨＰＯ4 １８ｇ ＫＨ2 ＰＯ4 ６ｇ
【００１７】前記培地の入った１０リットルジャーファ
ーメンターにバチルス・ステアロサーモフィラス（Baci
llus stearothermophilus ）IFO12016を接種し、６０℃
で１０時間通気撹拌培養後、遠心分離して菌体８０ｇを
取得した。この菌体をダイノミルにより破砕し、硫安分
画、イオン交換クロマトラフィー、疎水クロマトグラフ
ィーにより精製し、３５０単位のα−グルコシダーゼ標
品を得た。本標品を用いて、標識として１位に４−ニト
ロフェニル基がα−グルコシド結合したグルコース（Ｐ
ＮＰＧ）、マルトース（ＰＮＰＧ２）、マルトトリオー
ス（ＰＮＰＧ３）、マルトテトラオース（ＰＮＰＧ
４）、マルトペンタオース（ＰＮＰＧ５）、マルトヘキ
サオース（ＰＮＰＧ６）、およびマルトヘプタオース
（ＰＮＰＧ７）への反応性を検討した。また市販の酵母
由来のα−グルコシダーゼ（東洋紡製）についても同様
に反応性を検討した。反応速度は遊離されたグルコース
量を測定することで決定し、ＰＮＰＧに対する活性を１
００とした。その結果は表１に示す通りであった。
ーメンターにバチルス・ステアロサーモフィラス（Baci
llus stearothermophilus ）IFO12016を接種し、６０℃
で１０時間通気撹拌培養後、遠心分離して菌体８０ｇを
取得した。この菌体をダイノミルにより破砕し、硫安分
画、イオン交換クロマトラフィー、疎水クロマトグラフ
ィーにより精製し、３５０単位のα−グルコシダーゼ標
品を得た。本標品を用いて、標識として１位に４−ニト
ロフェニル基がα−グルコシド結合したグルコース（Ｐ
ＮＰＧ）、マルトース（ＰＮＰＧ２）、マルトトリオー
ス（ＰＮＰＧ３）、マルトテトラオース（ＰＮＰＧ
４）、マルトペンタオース（ＰＮＰＧ５）、マルトヘキ
サオース（ＰＮＰＧ６）、およびマルトヘプタオース
（ＰＮＰＧ７）への反応性を検討した。また市販の酵母
由来のα−グルコシダーゼ（東洋紡製）についても同様
に反応性を検討した。反応速度は遊離されたグルコース
量を測定することで決定し、ＰＮＰＧに対する活性を１
００とした。その結果は表１に示す通りであった。
【００１８】なおα−グルコシダーゼの活性測定法は以
下の方法により算出した。２０ｍＭ ４−ニトロフェニ
ル−α−Ｄ−グルコピラノシドを含む基質溶液０．５ｍ
ｌと０．１Ｍ リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）１．０ｍｌ
を混合した後、３７℃で５分間予備加温した。次にこの
混液に酵素溶液０．５ｍｌを 加え、３７℃で５分間反
応を行い、４００ｎｍにおける１分間あたりの吸光度変
化を測定した。前記条件で１分間に１μｍｏｌの４−ニ
トロフェノールを生成する酵素活性を１単位とした。
下の方法により算出した。２０ｍＭ ４−ニトロフェニ
ル−α−Ｄ−グルコピラノシドを含む基質溶液０．５ｍ
ｌと０．１Ｍ リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）１．０ｍｌ
を混合した後、３７℃で５分間予備加温した。次にこの
混液に酵素溶液０．５ｍｌを 加え、３７℃で５分間反
応を行い、４００ｎｍにおける１分間あたりの吸光度変
化を測定した。前記条件で１分間に１μｍｏｌの４−ニ
トロフェノールを生成する酵素活性を１単位とした。
【００１９】
【表１】
【００２０】バチルス・ステアロサーモフィラスのα−
グルコシダーゼは用いた基質の中でＰＮＰＧ３につい
て、反応速度が最も速く、他の基質についても十分な反
応速度を有していた。一方、酵母のα−グルコシダーゼ
はＧ３以上のグルコース鎖長のマルトオリゴ糖に対して
作用性が悪くなり、Ｇ４以上になればほとんど作用しな
かった。
グルコシダーゼは用いた基質の中でＰＮＰＧ３につい
て、反応速度が最も速く、他の基質についても十分な反
応速度を有していた。一方、酵母のα−グルコシダーゼ
はＧ３以上のグルコース鎖長のマルトオリゴ糖に対して
作用性が悪くなり、Ｇ４以上になればほとんど作用しな
かった。
【００２１】実施例２ （１）α−アミラーゼ測定試薬として下記の溶液を作製
した。 （Ａ）１ｍＭ 塩化カルシウムを含む０．０５Ｍ ＰＩ
ＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解した４ｍＭ ３−ケ
トブチリデン β−２−クロロ−４−ニトロフェニルマ
ルトペンタオサイド （Ｂ）０．０５Ｍ ＰＩＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．０）に
溶解したバチルス・ステアロサーモフィラス起源α−グ
ルコシダーゼ：各種濃度（０〜２単位／ｍｌ）およびβ
−グルコシダーゼ：２０単位／ｍｌ （２）α−アミラーゼ活性測定は以下の方法に従った。
（Ａ）液１．４ｍｌと（Ｂ）液１．４ｍｌを混合後、α
−アミラーゼ標準液（１３０ソモギー単位／ｌ、ミドリ
十字製）０．２ｍｌを添加し、３７℃で３分間反応さ
せ、４００ｎｍにおける吸光度の増加を測定した。α−
グルコシダーゼ濃度と１分間の吸光度変化量の関係を図
１に示した。α−グルコシダーゼ添加量０．８単位／ｍ
ｌ以上では吸光度変化量には差が見られず、従って本α
−アミラーゼ測定試薬でのα−グルコシダーゼの使用量
は０．８単位／ｍｌ以上であれば完全に追随していた。
した。 （Ａ）１ｍＭ 塩化カルシウムを含む０．０５Ｍ ＰＩ
ＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解した４ｍＭ ３−ケ
トブチリデン β−２−クロロ−４−ニトロフェニルマ
ルトペンタオサイド （Ｂ）０．０５Ｍ ＰＩＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．０）に
溶解したバチルス・ステアロサーモフィラス起源α−グ
ルコシダーゼ：各種濃度（０〜２単位／ｍｌ）およびβ
−グルコシダーゼ：２０単位／ｍｌ （２）α−アミラーゼ活性測定は以下の方法に従った。
（Ａ）液１．４ｍｌと（Ｂ）液１．４ｍｌを混合後、α
−アミラーゼ標準液（１３０ソモギー単位／ｌ、ミドリ
十字製）０．２ｍｌを添加し、３７℃で３分間反応さ
せ、４００ｎｍにおける吸光度の増加を測定した。α−
グルコシダーゼ濃度と１分間の吸光度変化量の関係を図
１に示した。α−グルコシダーゼ添加量０．８単位／ｍ
ｌ以上では吸光度変化量には差が見られず、従って本α
−アミラーゼ測定試薬でのα−グルコシダーゼの使用量
は０．８単位／ｍｌ以上であれば完全に追随していた。
【００２２】比較例２ 実施例２のα−アミラーゼ測定試薬について、α−グル
コシダーゼを市販の酵母起源のα−グルコシダーゼ（０
〜１８０単位／ｍｌ、東洋紡製）に変更し、実施例２と
同様にα−グルコシダーゼの必要量を検討した（図
２）。酵母α−グルコシダーゼを１８０単位／ｍｌ添加
しても実施例２で得られた吸光度変化量には及ばなかっ
た。
コシダーゼを市販の酵母起源のα−グルコシダーゼ（０
〜１８０単位／ｍｌ、東洋紡製）に変更し、実施例２と
同様にα−グルコシダーゼの必要量を検討した（図
２）。酵母α−グルコシダーゼを１８０単位／ｍｌ添加
しても実施例２で得られた吸光度変化量には及ばなかっ
た。
【００２３】実施例３ （１）α−アミラーゼ測定試薬として下記の溶液を作製
した。 （Ａ）１ｍＭ 塩化カルシウムを含む０．０５Ｍ ＰＩ
ＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解した４ｍＭ ３−ケ
トブチリデン β−２−クロロ−４−ニトロフェニルマ
ルトペンタオサイド （Ｂ）０．０５Ｍ ＰＩＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．０）に
溶解したバチルス・ステアロサーモフィラス起源α−グ
ルコシダーゼ：４単位／ｍｌおよびβ−グルコシダー
ゼ：２０単位／ｍｌ （２）α−アミラーゼ活性測定は以下の方法に従った。
（Ａ）液１．４ｍｌと（Ｂ）液１．４ｍｌを混合後、各
種濃度（０〜１２００ソモギー単位／ｌ）に希釈したα
−アミラーゼ溶液０．２ｍｌを添加した。３７℃で３分
間反応させ、４００ｎｍにおける吸光度の増加を測定し
た。各測定における１分間の吸光度変化を図３にグラフ
化した。α−アミラーゼ濃度と吸光度変化の間には直線
的関係が存在した。
した。 （Ａ）１ｍＭ 塩化カルシウムを含む０．０５Ｍ ＰＩ
ＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解した４ｍＭ ３−ケ
トブチリデン β−２−クロロ−４−ニトロフェニルマ
ルトペンタオサイド （Ｂ）０．０５Ｍ ＰＩＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．０）に
溶解したバチルス・ステアロサーモフィラス起源α−グ
ルコシダーゼ：４単位／ｍｌおよびβ−グルコシダー
ゼ：２０単位／ｍｌ （２）α−アミラーゼ活性測定は以下の方法に従った。
（Ａ）液１．４ｍｌと（Ｂ）液１．４ｍｌを混合後、各
種濃度（０〜１２００ソモギー単位／ｌ）に希釈したα
−アミラーゼ溶液０．２ｍｌを添加した。３７℃で３分
間反応させ、４００ｎｍにおける吸光度の増加を測定し
た。各測定における１分間の吸光度変化を図３にグラフ
化した。α−アミラーゼ濃度と吸光度変化の間には直線
的関係が存在した。
【００２４】実施例４ （１）α−アミラーゼ測定試薬として下記の溶液を作製
した。 （Ａ）１ｍＭ 塩化カルシウムを含む０．１Ｍ ＰＩＰ
ＥＳ緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解した６ｍＭ エチリデ
ン−α−４−ニトロフェニルマルトヘプタオシド （Ｂ）０．１Ｍ ＰＩＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．０）に溶
解したバチルス・ステアロサーモフィラス起源α−グル
コシダーゼ：各種濃度（０〜８単位／ｍｌ）
した。 （Ａ）１ｍＭ 塩化カルシウムを含む０．１Ｍ ＰＩＰ
ＥＳ緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解した６ｍＭ エチリデ
ン−α−４−ニトロフェニルマルトヘプタオシド （Ｂ）０．１Ｍ ＰＩＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．０）に溶
解したバチルス・ステアロサーモフィラス起源α−グル
コシダーゼ：各種濃度（０〜８単位／ｍｌ）
【００２５】（２）α−アミラーゼ活性測定は以下の方
法に従った。（Ａ）液１．４ｍｌと（Ｂ）液１．４ｍｌ
を混合し、α−アミラーゼ標準液（１３０ソモギー単位
／ｌ、ミドリ十字製）０．２ｍｌを添加し、３７℃で３
分間反応させ、４０５ｎｍにおける吸光度の増加を測定
した。α−グルコシダーゼ濃度と１分間の吸光度変化量
の関係を図４に示した。α−グルコシダーゼ添加量２単
位／ｍｌ以上では吸光度変化量には差が見られず、従っ
て本α−アミラーゼ測定試薬でのα−グルコシダーゼ使
用量は２単位／ｍｌであれば完全に追随していた。
法に従った。（Ａ）液１．４ｍｌと（Ｂ）液１．４ｍｌ
を混合し、α−アミラーゼ標準液（１３０ソモギー単位
／ｌ、ミドリ十字製）０．２ｍｌを添加し、３７℃で３
分間反応させ、４０５ｎｍにおける吸光度の増加を測定
した。α−グルコシダーゼ濃度と１分間の吸光度変化量
の関係を図４に示した。α−グルコシダーゼ添加量２単
位／ｍｌ以上では吸光度変化量には差が見られず、従っ
て本α−アミラーゼ測定試薬でのα−グルコシダーゼ使
用量は２単位／ｍｌであれば完全に追随していた。
【００２６】
【発明の効果】本発明ではα−アミラーゼ活性測定にお
いて、追随酵素の実際の基質である１位に標識がα−グ
ルコシド結合したグルコースやグルコース単位２個から
７個までのすべてのマルトオリゴ糖に対して作用性の高
いα−グルコシダーゼを使用することにより、効率良く
追随でき、感度よく、しかも試薬ブランク反応の少ない
α−アミラーゼ測定法を提供する。
いて、追随酵素の実際の基質である１位に標識がα−グ
ルコシド結合したグルコースやグルコース単位２個から
７個までのすべてのマルトオリゴ糖に対して作用性の高
いα−グルコシダーゼを使用することにより、効率良く
追随でき、感度よく、しかも試薬ブランク反応の少ない
α−アミラーゼ測定法を提供する。
【図１】試薬に添加した本発明のα−グルコシダーゼ量
と３−ケトブチリデン β−２−クロロ−４−ニトロフ
ェニルマルトペンタオシドを使用した時に得られる吸光
度変化量との関係を示したグラフである。
と３−ケトブチリデン β−２−クロロ−４−ニトロフ
ェニルマルトペンタオシドを使用した時に得られる吸光
度変化量との関係を示したグラフである。
【図２】同様の方法で、酵母起源のα−グルコシダーゼ
を用いた時に得られるグラフである。
を用いた時に得られるグラフである。
【図３】同じ基質を用いた時、α−アミラーゼ濃度と吸
光度変化に直線的関係があることを示すグラフである。
光度変化に直線的関係があることを示すグラフである。
【図４】本発明のα−グルコシダーゼ量とエチリデン−
α−４−ニトロフェニルマルトヘプタオシドを使用した
時に得られる吸光度変化との関係を示したものである。
α−４−ニトロフェニルマルトヘプタオシドを使用した
時に得られる吸光度変化との関係を示したものである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 愛水 重典 福井県敦賀市東洋町10番24号 東洋紡績株 式会社敦賀酵素工場内
Claims (8)
- 【請求項１】 α−アミラーゼ基質として、少なくとも
３個のグルコース単位で構成されるマルトオリゴ糖であ
って、その還元性末端グルコースが還元性末端グルコー
スの１位の位置において光学的に測定できる標識とα−
またはβ−グルコシド結合しており、かつその非還元性
末端グルコースがグルコース以外の置換基で修飾されて
いる基質を用意し、試料を、前記標識と１位の位置にお
いてα−グルコシド結合したグルコースおよびグルコー
ス単位２個から７個までのすべてのマルトオリゴ糖に実
質的に作用するα−グルコシダーゼ、および必要により
β−グルコシダーゼと接触させ、遊離した前記標識を光
学的に測定することにより、試料中のα−アミラーゼ活
性を測定することを特徴とするα−アミラーゼ活性の測
定方法。 - 【請求項２】 α−グルコシダーゼがバチルス属に属す
る菌株由来のα−グルコシダーゼである請求項１記載の
方法。 - 【請求項３】 α−グルコシダーゼがバチルス・ステア
ロサーモフィラス種に属する菌株由来のα−グルコシダ
ーゼである請求項２記載の方法。 - 【請求項４】 標識が置換または未置換のフェノール残
基である請求項１ないし３記載の方法。 - 【請求項５】 （ａ）少なくとも３個のグルコース単位
で構成されるマルトオリゴ糖であって、その還元性末端
グルコースが還元性末端グルコースの１位の位置におい
て光学的に測定できる標識とα−またはβ−グルコシド
結合しており、かつその非還元性末端グルコースがグル
コース以外の置換基で修飾されているα−アミラーゼ基
質、（ｂ）光学的に測定できる標識と１位の位置におい
てα−グルコシド結合したグルコースおよびグルコース
単位２個から７個までのすべてのマルトオリゴ糖に実質
的に作用するα−グルコシダーゼ、および必要により
（ｃ）β−グルコシダーゼを含有することを特徴とする
α−アミラーゼ活性測定用試薬。 - 【請求項６】 α−グルコシダーゼがバチルス属に属す
る菌株由来のα−グルコシダーゼである請求項５記載の
α−アミラーゼ活性測定用試薬。 - 【請求項７】 α−グルコシダーゼがバチルス・ステア
ロサーモフィラス種に属する菌株由来のα−グルコシダ
ーゼである請求項６記載のα−アミラーゼ活性測定用試
薬。 - 【請求項８】 標識が置換または未置換のフェノール残
基である請求項５ないし７記載のα−アミラーゼ活性測
定用試薬。
Priority Applications (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP03319993A JP3075377B2 (ja) | 1991-11-06 | 1991-11-06 | α−アミラーゼ活性の測定法およびα−アミラーゼ活性測定用試薬 |
| EP92118961A EP0541083B1 (en) | 1991-11-06 | 1992-11-05 | Method for determination of alpha-amylase activity |
| DE69219855T DE69219855T2 (de) | 1991-11-06 | 1992-11-05 | Verfahren zur Bestimmung der alpha-Amylase-Aktivität |
| US08/249,074 US5607838A (en) | 1991-11-06 | 1994-05-25 | Method for determination of α-amylase activity |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP03319993A JP3075377B2 (ja) | 1991-11-06 | 1991-11-06 | α−アミラーゼ活性の測定法およびα−アミラーゼ活性測定用試薬 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH05123193A true JPH05123193A (ja) | 1993-05-21 |
| JP3075377B2 JP3075377B2 (ja) | 2000-08-14 |
Family
ID=18116553
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP03319993A Expired - Lifetime JP3075377B2 (ja) | 1991-11-06 | 1991-11-06 | α−アミラーゼ活性の測定法およびα−アミラーゼ活性測定用試薬 |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5607838A (ja) |
| EP (1) | EP0541083B1 (ja) |
| JP (1) | JP3075377B2 (ja) |
| DE (1) | DE69219855T2 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH0716099A (ja) * | 1992-05-04 | 1995-01-20 | Modrovich Ivan E | 改良された安定な単一液体アルファ−アミラーゼ用試薬 |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2807949B2 (ja) * | 1992-11-10 | 1998-10-08 | 東洋紡績株式会社 | α−アミラーゼ活性測定用試薬および測定方法 |
| JP2002199898A (ja) * | 2000-12-28 | 2002-07-16 | Japan Science & Technology Corp | 糖加水分解酵素の酵素活性測定法 |
| US20080050451A1 (en) * | 2006-06-16 | 2008-02-28 | Mabry Helen C | Methods for assessing dehydration and shock, assays and kits for the methods |
| CA2787021A1 (en) * | 2009-02-05 | 2010-08-12 | Hydradx, Inc. | Diagnostic device and method |
| US10900909B2 (en) | 2016-05-31 | 2021-01-26 | Indian Institute Of Technology, Guwahati | Transmittance based system/kit for point-of-care quantification of biomarkers sample and use thereof |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4000042A (en) * | 1973-09-06 | 1976-12-28 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | Diagnostic reagent for the determination of amylase |
| US4036697A (en) * | 1976-02-13 | 1977-07-19 | Beckman Instruments, Inc. | Kinetic assay for alpha-amylase |
| US4102747A (en) * | 1977-07-28 | 1978-07-25 | American Hospital Supply Corporation | Amylase determination |
| AT362526B (de) * | 1977-09-13 | 1981-05-25 | Boehringer Mannheim Gmbh | Verfahren und reagens zur bestimmung von alpha- -amylase |
| US4337309A (en) * | 1978-02-28 | 1982-06-29 | Pharmacia Diagnostics Ab | Method of deterining the concentration of pancreatic and salivary α-amylase in body fluids |
| US4505756A (en) * | 1980-07-01 | 1985-03-19 | Cooperbiomedical, Inc. | Alpha-amylase assay and substrates for use therein |
| JPS5768798A (en) * | 1980-10-14 | 1982-04-27 | Toyo Jozo Co Ltd | Novel measurement of amylase activity |
| DE3323245A1 (de) * | 1983-06-28 | 1985-01-10 | Merck Patent Gmbh, 6100 Darmstadt | Verfahren und reagenz zur bestimmung von (alpha)-amylase |
| US4794078A (en) * | 1984-07-26 | 1988-12-27 | Genzyme Corporation | Alpha amylase assay |
| US4649108A (en) * | 1984-07-26 | 1987-03-10 | Genzyme Corporation | Alpha amylase assay |
| JPH07112440B2 (ja) * | 1986-08-01 | 1995-12-06 | 和光純薬工業株式会社 | α−アミラ−ゼアイソザイムの分別測定法 |
| US5043436A (en) * | 1986-11-20 | 1991-08-27 | Kurita Water Ind., Ltd. | Substrate for measurement of alpha-amylase activity |
| JP2592260B2 (ja) * | 1987-07-30 | 1997-03-19 | オリエンタル酵母工業株式会社 | α−アミラーゼアイソザイムの分別定量法 |
| US4932871A (en) * | 1987-11-20 | 1990-06-12 | Miles Inc. | Rapid method for preparing chromogenic alpha-amylase substrate compounds at high preparative yields |
| JPH0631293B2 (ja) * | 1987-12-11 | 1994-04-27 | 東洋紡績株式会社 | マルトオリゴ糖誘導体およびアミラーゼ活性測定用試薬 |
| DE3743908A1 (de) * | 1987-12-23 | 1989-07-06 | Boehringer Mannheim Gmbh | Neue oligoglucoside |
| US4990445A (en) * | 1988-01-20 | 1991-02-05 | Beckman Instruments, Inc. | Stable reagent and kinetic assay for alpha-amylase |
-
1991
- 1991-11-06 JP JP03319993A patent/JP3075377B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
1992
- 1992-11-05 EP EP92118961A patent/EP0541083B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1992-11-05 DE DE69219855T patent/DE69219855T2/de not_active Expired - Lifetime
-
1994
- 1994-05-25 US US08/249,074 patent/US5607838A/en not_active Expired - Lifetime
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|---|---|---|---|---|
| JPH0716099A (ja) * | 1992-05-04 | 1995-01-20 | Modrovich Ivan E | 改良された安定な単一液体アルファ−アミラーゼ用試薬 |
Also Published As
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|---|---|
| DE69219855T2 (de) | 1997-09-11 |
| EP0541083A1 (en) | 1993-05-12 |
| US5607838A (en) | 1997-03-04 |
| DE69219855D1 (de) | 1997-06-26 |
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