JPH0716099A - 改良された安定な単一液体アルファ−アミラーゼ用試薬 - Google Patents
改良された安定な単一液体アルファ−アミラーゼ用試薬Info
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Abstract
(57)【要約】 (修正有)
【目的】 アルファーアミラーゼの血清レベルを測定す
るための試薬に関し、特に、安定な単一液体のアルファ
ーアミラーゼアッセイ用試薬に関する。 【構成】 アルファ−アミラーゼを含む体液と混合した
ときにアルファ−アミラーゼに関する反応によって加水
分解されて直接又は間接的に検出可能な標識を反応混合
物に生成する少なくとも1つの基質の水溶液を含む単一
液体アルファ−アミラーゼ用試薬組成物において、かか
る検出可能な標識の形成速度は試料中に存在するアルフ
ァ−アミラーゼ及びかかる検出可能標識の形成において
アルファ−アミラーゼに協力する少なくとも1つのエキ
ソ酵素の量に比例し、前記の基質は、その加水分解速度
を制限しないだけ十分な濃度で存在する試薬組成物を提
供すること。
るための試薬に関し、特に、安定な単一液体のアルファ
ーアミラーゼアッセイ用試薬に関する。 【構成】 アルファ−アミラーゼを含む体液と混合した
ときにアルファ−アミラーゼに関する反応によって加水
分解されて直接又は間接的に検出可能な標識を反応混合
物に生成する少なくとも1つの基質の水溶液を含む単一
液体アルファ−アミラーゼ用試薬組成物において、かか
る検出可能な標識の形成速度は試料中に存在するアルフ
ァ−アミラーゼ及びかかる検出可能標識の形成において
アルファ−アミラーゼに協力する少なくとも1つのエキ
ソ酵素の量に比例し、前記の基質は、その加水分解速度
を制限しないだけ十分な濃度で存在する試薬組成物を提
供すること。
Description
【0001】
【産業上の利用分野】この発明は、一般に、アルファ−
アミラーゼの血清レベルを測定するための試薬に関し、
特に、安定な単一液体のアルファ−アミラーゼアッセイ
用試薬に関する。
アミラーゼの血清レベルを測定するための試薬に関し、
特に、安定な単一液体のアルファ−アミラーゼアッセイ
用試薬に関する。
【0002】
【発明の背景】アルファ−アミラーゼは、第1に、膵臓
及び唾液腺に見出される。消化管中に放出されると、こ
の酵素は澱粉を加水分解する。アルファ−アミラーゼ測
定は、膵臓及び耳下腺の病気の診断に有用である。高い
血清レベルは、急性膵炎又はその他の膵臓疾患並びにお
たふく風邪及び細菌性耳下腺炎と関連している。低い血
清値は、肝炎及び閉塞性黄疸並びに肝臓の腫瘍又は膿瘍
等の肝臓病に見ることが出来る。
及び唾液腺に見出される。消化管中に放出されると、こ
の酵素は澱粉を加水分解する。アルファ−アミラーゼ測
定は、膵臓及び耳下腺の病気の診断に有用である。高い
血清レベルは、急性膵炎又はその他の膵臓疾患並びにお
たふく風邪及び細菌性耳下腺炎と関連している。低い血
清値は、肝炎及び閉塞性黄疸並びに肝臓の腫瘍又は膿瘍
等の肝臓病に見ることが出来る。
【0003】歴史的に、血清中のアルファ−アミラーゼ
の測定法は、粘度測定、濁度測定、ヨウ素滴定及び還元
測定技術を含んでいる。これらの方法を用いると、反応
時間が長く、内生グルコースが妨害する傾向があり、反
応の色は不安定であり且つ再現性が乏しい。最近、アル
ファ−アミラーゼの測定のためのアッセイ系が開発され
た。
の測定法は、粘度測定、濁度測定、ヨウ素滴定及び還元
測定技術を含んでいる。これらの方法を用いると、反応
時間が長く、内生グルコースが妨害する傾向があり、反
応の色は不安定であり且つ再現性が乏しい。最近、アル
ファ−アミラーゼの測定のためのアッセイ系が開発され
た。
【0004】かかるアルファ−アミラーゼ用のアッセイ
系は、典型的には、標識(例えば、色原体単位)を付着
して有する多糖類又は少糖類基質を含む試薬を含む。こ
の基質は、アルファ−アミラーゼによって加水分解され
て1つ又は2つの一層小さい少糖類を生成する。この試
薬は、更に、一層小さい少糖類を更に遊離の標識単位に
まで加水分解する1つ以上の酵素を含み、次いで該標識
単位を分光測光的に検出する。
系は、典型的には、標識(例えば、色原体単位)を付着
して有する多糖類又は少糖類基質を含む試薬を含む。こ
の基質は、アルファ−アミラーゼによって加水分解され
て1つ又は2つの一層小さい少糖類を生成する。この試
薬は、更に、一層小さい少糖類を更に遊離の標識単位に
まで加水分解する1つ以上の酵素を含み、次いで該標識
単位を分光測光的に検出する。
【0005】
【発明が解決しようとする課題】かかるアッセイ用試薬
は、歴史的方法に匹敵するアルファ−アミラーゼの迅速
且つ鋭敏な測定を可能にする。しかしながら、かかる試
薬の安定性は劣っている。従って、アッセイ用試薬は、
一般に、凍結乾燥状態で保存し、使用前に戻さなければ
ならない。一度戻したら、その貯蔵寿命は一般に1〜1
4日である。その上、かかる試薬は、変化し得る及びま
ずいことにはしばしば高いバックグラウンドレベルを与
え、それはこの系の整合性及び鋭敏さに有害な影響を与
える。
は、歴史的方法に匹敵するアルファ−アミラーゼの迅速
且つ鋭敏な測定を可能にする。しかしながら、かかる試
薬の安定性は劣っている。従って、アッセイ用試薬は、
一般に、凍結乾燥状態で保存し、使用前に戻さなければ
ならない。一度戻したら、その貯蔵寿命は一般に1〜1
4日である。その上、かかる試薬は、変化し得る及びま
ずいことにはしばしば高いバックグラウンドレベルを与
え、それはこの系の整合性及び鋭敏さに有害な影響を与
える。
【0006】
【課題を解決するための手段】上記の特許出願は、生物
学的液体中のアルファ−アミラーゼの迅速な測定のため
の、安定な、単一液体のアルファ−アミラーゼアッセイ
用試薬を開示する。このアッセイ用試薬は、実質的にア
ルファ−アミラーゼ及び/又はアルファ−アミラーゼ活
性を含まず、アルファ−アミラーゼによって直接又は間
接的に開裂可能な、反応混合物中の検出可能な変化を生
じるための少なくとも1つの基質を含む水溶液を含む。
この検出可能な変化は、検出可能な成分の生成又は除去
であってよい。かかる成分は、光学的、電気化学的及び
熱化学的手段を含む任意の適当な手段によって検出する
ことが出来る。
学的液体中のアルファ−アミラーゼの迅速な測定のため
の、安定な、単一液体のアルファ−アミラーゼアッセイ
用試薬を開示する。このアッセイ用試薬は、実質的にア
ルファ−アミラーゼ及び/又はアルファ−アミラーゼ活
性を含まず、アルファ−アミラーゼによって直接又は間
接的に開裂可能な、反応混合物中の検出可能な変化を生
じるための少なくとも1つの基質を含む水溶液を含む。
この検出可能な変化は、検出可能な成分の生成又は除去
であってよい。かかる成分は、光学的、電気化学的及び
熱化学的手段を含む任意の適当な手段によって検出する
ことが出来る。
【0007】この発明の好適具体例において、この試薬
は、還元末端に標識を付着して有する多糖類又は長鎖少
糖類基質を含む。この基質は、アルファ−アミラーゼに
よって加水分解されて短鎖少糖類(少なくともその1つ
は標識を含む)を生成する。この試薬は、更に、少なく
とも1つのエキソ酵素、好ましくは、一対のエキソ酵素
(市販のマルターゼ及びアルファ−若しくはベータ−グ
ルコシダーゼ)を含み、これらは少糖類を更に加水分解
して遊離の標識にし、次いで、それを分光測光的に検出
することが出来る。遊離の標識が形成される速度は、生
物学的液体中のアルファ−アミラーゼ濃度の直接的指標
を与える。
は、還元末端に標識を付着して有する多糖類又は長鎖少
糖類基質を含む。この基質は、アルファ−アミラーゼに
よって加水分解されて短鎖少糖類(少なくともその1つ
は標識を含む)を生成する。この試薬は、更に、少なく
とも1つのエキソ酵素、好ましくは、一対のエキソ酵素
(市販のマルターゼ及びアルファ−若しくはベータ−グ
ルコシダーゼ)を含み、これらは少糖類を更に加水分解
して遊離の標識にし、次いで、それを分光測光的に検出
することが出来る。遊離の標識が形成される速度は、生
物学的液体中のアルファ−アミラーゼ濃度の直接的指標
を与える。
【0008】このアルファ−アミラーゼ用試薬を、滅菌
水及び純粋試薬を用い且つエキソ酵素及び基質を(別々
に又は一緒に)約0.2ミクロンより大きくない細孔寸
法を有するフィルターを通してアルファ−アミラーゼ産
生細菌を除去することによって実質的にアルファ−アミ
ラーゼを含まずに作成する。試薬からのアルファ−アミ
ラーゼの除去は、貯蔵中の基質の消耗を除き、それ故、
試薬を安定化する。
水及び純粋試薬を用い且つエキソ酵素及び基質を(別々
に又は一緒に)約0.2ミクロンより大きくない細孔寸
法を有するフィルターを通してアルファ−アミラーゼ産
生細菌を除去することによって実質的にアルファ−アミ
ラーゼを含まずに作成する。試薬からのアルファ−アミ
ラーゼの除去は、貯蔵中の基質の消耗を除き、それ故、
試薬を安定化する。
【0009】このアルファ−アミラーゼアッセイ用試薬
は、更に、エキソ酵素の分解を遅らせるポリオールの含
有によって安定化される。
は、更に、エキソ酵素の分解を遅らせるポリオールの含
有によって安定化される。
【0010】市販の試薬の内で、我々は、エキソ酵素と
して、約10U/mlの酵母由来のアルファ−グルコシ
ダーゼ(マルターゼ)及び10U/mlのグルコアミラ
ーゼの適正な高濃度の混合物を用いた。
して、約10U/mlの酵母由来のアルファ−グルコシ
ダーゼ(マルターゼ)及び10U/mlのグルコアミラ
ーゼの適正な高濃度の混合物を用いた。
【0011】
【発明の要約】今や、Bacillus Stearothermophilus 由
来のアルファ−グルコシダーゼ(マルターゼ)が、通
常、低濃度で高い応答を与えるエキソアミラーゼ活性及
びグルコシダーゼ活性の両方を示す効果があり且つ、分
解を遅らせるポリオールの使用を必要としないことが見
出された。その結果、Bacillus Stearothermophilus 由
来のアルファ−グルコシダーゼの形態でのエキソ酵素濃
度を、約1.5U/mlの低濃度で用いることが出来、
そして 直線性、応答時間及び安定性において我々の従
来の組成物の性能と同じか又はそれを上回ることが出
来、そしてポリオールを組成物から除くことが出来る。
好ましい濃度は、約2.2U/mlである。
来のアルファ−グルコシダーゼ(マルターゼ)が、通
常、低濃度で高い応答を与えるエキソアミラーゼ活性及
びグルコシダーゼ活性の両方を示す効果があり且つ、分
解を遅らせるポリオールの使用を必要としないことが見
出された。その結果、Bacillus Stearothermophilus 由
来のアルファ−グルコシダーゼの形態でのエキソ酵素濃
度を、約1.5U/mlの低濃度で用いることが出来、
そして 直線性、応答時間及び安定性において我々の従
来の組成物の性能と同じか又はそれを上回ることが出
来、そしてポリオールを組成物から除くことが出来る。
好ましい濃度は、約2.2U/mlである。
【0012】 〔発明の詳細な説明〕本発明に従って、生物学的液体又
は血清中のアルファ−アミラーゼ濃度を測定するため
の、改良された、単一液体のアッセイ用試薬を提供す
る。この作成したアッセイ用試薬は、単一試薬であり、
約2〜10℃で少なくとも6か月間(通常は、少なくと
も18か月間)安定な水溶液である。
は血清中のアルファ−アミラーゼ濃度を測定するため
の、改良された、単一液体のアッセイ用試薬を提供す
る。この作成したアッセイ用試薬は、単一試薬であり、
約2〜10℃で少なくとも6か月間(通常は、少なくと
も18か月間)安定な水溶液である。
【0013】ここで用いる場合、用語「安定な」は、試
薬が少なくとも95%の回復を維持することを意味す
る。例えば、もし試薬が、最初に混合したときに、特定
の試料について100単位のアルファ−アミラーゼを与
えたならば、その試薬は、選択した時間(例えば、6か
月)の後に、同じ試料について少なくとも95%(即
ち、元の分析の95%)の分析を与えるならば「安定」
であると考えられる。
薬が少なくとも95%の回復を維持することを意味す
る。例えば、もし試薬が、最初に混合したときに、特定
の試料について100単位のアルファ−アミラーゼを与
えたならば、その試薬は、選択した時間(例えば、6か
月)の後に、同じ試料について少なくとも95%(即
ち、元の分析の95%)の分析を与えるならば「安定」
であると考えられる。
【0014】この試薬へのアルファ−アミラーゼを含む
生物学的液体の添加が、検出可能な生成物の生成を生じ
る一連の反応を開始し、この検出可能生成物の生成速度
は生物学的液体中のアルファ−アミラーゼの濃度に直接
的に比例する。
生物学的液体の添加が、検出可能な生成物の生成を生じ
る一連の反応を開始し、この検出可能生成物の生成速度
は生物学的液体中のアルファ−アミラーゼの濃度に直接
的に比例する。
【0015】このアッセイ用試薬は、ベンジリデン及び
/又はエチリデンブロックした基質等のアルファ−アミ
ラーゼによって加水分解され得る基質及びを含み、Baci
llusStearothermophilus 由来のエキソ酵素アルファ−
グルコシダーゼを少なくとも1.5U/ml(好ましく
は、約2.2U/ml)の濃度で用いて、アルファアミ
ラーゼ測定における商業的に許容し得る応答時間を達成
する(即ち、37℃のアッセイ温度において10分以
内)。現在の供給元は、東洋紡株式会社(日本、大阪)
である。
/又はエチリデンブロックした基質等のアルファ−アミ
ラーゼによって加水分解され得る基質及びを含み、Baci
llusStearothermophilus 由来のエキソ酵素アルファ−
グルコシダーゼを少なくとも1.5U/ml(好ましく
は、約2.2U/ml)の濃度で用いて、アルファアミ
ラーゼ測定における商業的に許容し得る応答時間を達成
する(即ち、37℃のアッセイ温度において10分以
内)。現在の供給元は、東洋紡株式会社(日本、大阪)
である。
【0016】基質は、多糖類又は一層好ましくはアルフ
ァ−アミラーゼによって加水分解される少糖類である。
この基質は、好ましくは、少なくとも3つのグルコース
単位を含む。この基質の還元末端グルコース単位は、ア
ルファ−グルコシダーゼによって開裂し得る結合によっ
て、その結合の開裂における光学的に測定可能な変化を
示す標識に結合されている。この基質の末端グルコース
単位は、末端グルコース単位と隣接グルコース単位との
間の結合のエキソ酵素による開裂を阻止するブロッキン
グ基に結合されている。
ァ−アミラーゼによって加水分解される少糖類である。
この基質は、好ましくは、少なくとも3つのグルコース
単位を含む。この基質の還元末端グルコース単位は、ア
ルファ−グルコシダーゼによって開裂し得る結合によっ
て、その結合の開裂における光学的に測定可能な変化を
示す標識に結合されている。この基質の末端グルコース
単位は、末端グルコース単位と隣接グルコース単位との
間の結合のエキソ酵素による開裂を阻止するブロッキン
グ基に結合されている。
【0017】標識は、好ましくは、発色団、発蛍光団、
化学発光基質又は生物発光基質である。好ましい標識
は、p−ニトロフェノール、o−ニトロフェノール、ク
マリン誘導体(4−メチルアンベリフェロン等)及びル
シフェリンを含む。好ましくは、基質は、8個以下のグ
ルコース単位(最も好ましくは6又は7個)を有する。
好ましいブロッキング置換基は、アセタール又はケター
ル(例えば、ベンジリデン及び/又はエチリデン)であ
る。目下のところ、約2mg/mlの基質濃度が好まし
い。
化学発光基質又は生物発光基質である。好ましい標識
は、p−ニトロフェノール、o−ニトロフェノール、ク
マリン誘導体(4−メチルアンベリフェロン等)及びル
シフェリンを含む。好ましくは、基質は、8個以下のグ
ルコース単位(最も好ましくは6又は7個)を有する。
好ましいブロッキング置換基は、アセタール又はケター
ル(例えば、ベンジリデン及び/又はエチリデン)であ
る。目下のところ、約2mg/mlの基質濃度が好まし
い。
【0018】微生物起源のBacillus Stearothermophilu
s 由来のアルファ−グルコシダーゼは、酵母由来のアル
ファ−グルコシダーゼ及びグルコアミラーゼの両方の機
能を、慣用手段による検出用標識を含まずに、作動し且
つ遂行する。
s 由来のアルファ−グルコシダーゼは、酵母由来のアル
ファ−グルコシダーゼ及びグルコアミラーゼの両方の機
能を、慣用手段による検出用標識を含まずに、作動し且
つ遂行する。
【0019】一度アルファ−アミラーゼが、1,4−グ
ルコシド結合を開裂させると、エキソ酵素が必要な残り
の結合を開裂させて最終的に発色団を遊離させる。発色
団が形成される速度は、アミラーゼ活性に直接に比例す
る。
ルコシド結合を開裂させると、エキソ酵素が必要な残り
の結合を開裂させて最終的に発色団を遊離させる。発色
団が形成される速度は、アミラーゼ活性に直接に比例す
る。
【0020】このエキソ酵素(即ち、Bacillus Stearot
hermophilus 由来のアルファグルコシダーゼ)は、十分
過剰量で存在し、反応の制限因子とならない。約1.5
U/ml以上のアルファグルコシダーゼ濃度が、性能及
び安定性の基準(即ち、全反応時間が10分未満であり
且つ試薬は約2〜10℃で6か月間又は41℃で約1日
間安定であり続ける)を満たすために十分過剰であると
いうことが見出された。試薬が約2〜10℃で少なくと
も12〜18か月間又は41℃で少なくとも約3日間安
定であり続けることは好ましい。
hermophilus 由来のアルファグルコシダーゼ)は、十分
過剰量で存在し、反応の制限因子とならない。約1.5
U/ml以上のアルファグルコシダーゼ濃度が、性能及
び安定性の基準(即ち、全反応時間が10分未満であり
且つ試薬は約2〜10℃で6か月間又は41℃で約1日
間安定であり続ける)を満たすために十分過剰であると
いうことが見出された。試薬が約2〜10℃で少なくと
も12〜18か月間又は41℃で少なくとも約3日間安
定であり続けることは好ましい。
【0021】基質及びアルファ−グルコシダーゼに加え
て、このアッセイ用試薬は、カルシウム源(例えば、塩
化カルシウム)及び更なる塩化物源(例えば、塩化ナト
リウム)を与える緩衝系を含む。カルシウム及び塩化物
イオンは、アルファ−アミラーゼを活性化するために必
要である。塩化カルシウム及び塩化ナトリウムは、カル
シウム濃度も塩化物イオン濃度も速度支配しないだけ十
分な量で存在する。約5mMの塩化カルシウム濃度及び
約50mMのナトリウム濃度が目下適当である。
て、このアッセイ用試薬は、カルシウム源(例えば、塩
化カルシウム)及び更なる塩化物源(例えば、塩化ナト
リウム)を与える緩衝系を含む。カルシウム及び塩化物
イオンは、アルファ−アミラーゼを活性化するために必
要である。塩化カルシウム及び塩化ナトリウムは、カル
シウム濃度も塩化物イオン濃度も速度支配しないだけ十
分な量で存在する。約5mMの塩化カルシウム濃度及び
約50mMのナトリウム濃度が目下適当である。
【0022】この発明の実施において、アッセイ用試薬
は、技術の組合せによって安定化することが出来る。ジ
オールを含む水溶性ポリオールを適宜用いて時間分解を
阻止することが出来る。ポリオールは、エチレングリコ
ール、ポリエチレングリコール、グリセロール、ソルビ
トール及びそれらの混合物を含む。現在好ましいポリオ
ールはソルビトールであり、好適に使用されている。
は、技術の組合せによって安定化することが出来る。ジ
オールを含む水溶性ポリオールを適宜用いて時間分解を
阻止することが出来る。ポリオールは、エチレングリコ
ール、ポリエチレングリコール、グリセロール、ソルビ
トール及びそれらの混合物を含む。現在好ましいポリオ
ールはソルビトールであり、好適に使用されている。
【0023】ポリオールを用いるならば、試薬の有用性
を妨害することなくエキソ酵素の分解を遅らせるのに十
分な濃度で試薬中に維持する。ポリオール濃度は、約0
〜300グラム/リットル(好ましくは、約10〜30
0グラム/リットル、一層好ましくは、約30〜70グ
ラム/リットル)の範囲に維持することが出来る。好ま
しい濃度は、約50グラム/リットルである。約300
グラム/リットルを超えると試薬の粘度が高くなる傾向
があり望ましくない。
を妨害することなくエキソ酵素の分解を遅らせるのに十
分な濃度で試薬中に維持する。ポリオール濃度は、約0
〜300グラム/リットル(好ましくは、約10〜30
0グラム/リットル、一層好ましくは、約30〜70グ
ラム/リットル)の範囲に維持することが出来る。好ま
しい濃度は、約50グラム/リットルである。約300
グラム/リットルを超えると試薬の粘度が高くなる傾向
があり望ましくない。
【0024】アルファ−グルコシダーゼ及び基質は、現
在、試薬をpH約6.5〜7.5に維持し得る緩衝剤の
添加により更に安定化される。好ましい緩衝剤は、3−
N−モルホリンプロパンスルホン酸(MOPS)、N−
2−ヒドロキシエチルピペラジン−N’−2−エタンス
ルホン酸(HEPES)、トリス(ヒドロキシメチル)
メチルアミノプロパンスルホン酸(TAPS)又は3
(N−トリス(ヒドロキシメチル)メチルアミノ)−2
−ヒドロキシプロパンスルホン酸等の両性イオン性緩衝
剤である。MOPSが、現在、好適である。
在、試薬をpH約6.5〜7.5に維持し得る緩衝剤の
添加により更に安定化される。好ましい緩衝剤は、3−
N−モルホリンプロパンスルホン酸(MOPS)、N−
2−ヒドロキシエチルピペラジン−N’−2−エタンス
ルホン酸(HEPES)、トリス(ヒドロキシメチル)
メチルアミノプロパンスルホン酸(TAPS)又は3
(N−トリス(ヒドロキシメチル)メチルアミノ)−2
−ヒドロキシプロパンスルホン酸等の両性イオン性緩衝
剤である。MOPSが、現在、好適である。
【0025】両性イオン性緩衝剤は、好ましくは、約
0.01〜0.1モル/リットルの範囲で存在する(好
ましくは、0.05〜約0.1モル/リットル)。約
0.1モルを超える両性イオン性緩衝剤の濃度は、かか
る濃度は試薬中に高イオン強度を生じる傾向があり、酵
素を不安定化する傾向があるので好ましくない。約0.
05モル未満の濃度は、両性イオン性緩衝剤の有益な効
果が減少するので好ましくない。
0.01〜0.1モル/リットルの範囲で存在する(好
ましくは、0.05〜約0.1モル/リットル)。約
0.1モルを超える両性イオン性緩衝剤の濃度は、かか
る濃度は試薬中に高イオン強度を生じる傾向があり、酵
素を不安定化する傾向があるので好ましくない。約0.
05モル未満の濃度は、両性イオン性緩衝剤の有益な効
果が減少するので好ましくない。
【0026】ポリオール(用いるならば)及び両性イオ
ン性緩衝剤は、酵素に結合し、それにより、酵素に有害
に作用する他の化合物の結合を阻止することによって分
解を遅らせると思われる。ポリオール及び/又は両性イ
オン性緩衝剤は又、酵素の有効な3次元的構成を維持す
ることにより酵素の不活性化を防ぐとも思われる。
ン性緩衝剤は、酵素に結合し、それにより、酵素に有害
に作用する他の化合物の結合を阻止することによって分
解を遅らせると思われる。ポリオール及び/又は両性イ
オン性緩衝剤は又、酵素の有効な3次元的構成を維持す
ることにより酵素の不活性化を防ぐとも思われる。
【0027】Bacillus Stearothermophilus 由来のアル
ファ−グルコシダーゼは、通常、純粋であり、アルファ
−アミラーゼを生成する夾雑菌を含まないので濾過の必
要がないが、好ましくは、アルファ−アミラーゼ産生菌
を除去するのに十分なだけ細かいフィルターを通しての
濾過を行って、アルファ−アミラーゼ産生微生物の不在
を確実にする。濾過は、好ましくは、約0.2ミクロン
より大きくない細孔寸法を有するフィルターを通して行
なう。
ファ−グルコシダーゼは、通常、純粋であり、アルファ
−アミラーゼを生成する夾雑菌を含まないので濾過の必
要がないが、好ましくは、アルファ−アミラーゼ産生菌
を除去するのに十分なだけ細かいフィルターを通しての
濾過を行って、アルファ−アミラーゼ産生微生物の不在
を確実にする。濾過は、好ましくは、約0.2ミクロン
より大きくない細孔寸法を有するフィルターを通して行
なう。
【0028】酵素及び基質を濾過する事に加えて、試薬
の調製に用いる水又は装置等の他の起源からのアルファ
−アミラーゼ産生細菌の夾雑がないことが重要であるこ
とは理解される。それ故、用いる装置は、滅菌しなけれ
ばならず(例えば、オートクレーブにかける)、試薬に
用いる水は、蒸留水又は沸騰させた水でなければならな
い。
の調製に用いる水又は装置等の他の起源からのアルファ
−アミラーゼ産生細菌の夾雑がないことが重要であるこ
とは理解される。それ故、用いる装置は、滅菌しなけれ
ばならず(例えば、オートクレーブにかける)、試薬に
用いる水は、蒸留水又は沸騰させた水でなければならな
い。
【0029】1種類以上の抗菌剤(即ち、夾雑微生物に
対して毒性の又は少なくとも微生物の増殖を阻止若しく
は遅延させ得る薬剤)をこの試薬中に加えることもやは
り好ましい。かかる薬剤は、セチルトリメチルアンモニ
ウム(CTMA)ブロミド、コバルト錯体([Co(N
H3 )−4 (H2 O)Cl]SO4 及び[Co((O
H)Co(NH3 )4 )3 ](SO4 )3 4H2 O
等)、カキグリコーゲン、マクロデキストリン、バクト
リム、アジ化ナトリウム、トリメロサル及びドデシル硫
酸ナトリウムを含む。現在好ましい抗生物質剤は、約
0.001%の濃度のセチルトリメチルアンモニウム
(CTMA)ブロミド、約0.075mg/mlの量の
細菌及び1グラム/リットルの量のアジ化ナトリウムを
含む。
対して毒性の又は少なくとも微生物の増殖を阻止若しく
は遅延させ得る薬剤)をこの試薬中に加えることもやは
り好ましい。かかる薬剤は、セチルトリメチルアンモニ
ウム(CTMA)ブロミド、コバルト錯体([Co(N
H3 )−4 (H2 O)Cl]SO4 及び[Co((O
H)Co(NH3 )4 )3 ](SO4 )3 4H2 O
等)、カキグリコーゲン、マクロデキストリン、バクト
リム、アジ化ナトリウム、トリメロサル及びドデシル硫
酸ナトリウムを含む。現在好ましい抗生物質剤は、約
0.001%の濃度のセチルトリメチルアンモニウム
(CTMA)ブロミド、約0.075mg/mlの量の
細菌及び1グラム/リットルの量のアジ化ナトリウムを
含む。
【0030】試薬の調製において、すべての成分をバッ
チ式混合工程で一緒に混合することが出来る。しかしな
がら、酵素及び基質が高価である故に、最初に、緩衝液
の貯蔵溶液、酵素濃縮液及び基質を調製するのが好まし
い。
チ式混合工程で一緒に混合することが出来る。しかしな
がら、酵素及び基質が高価である故に、最初に、緩衝液
の貯蔵溶液、酵素濃縮液及び基質を調製するのが好まし
い。
【0031】
【実施例】現在好ましい組成は、脱イオン水1リットル
当たりに下記を含む。 MOPS 10.46g NaOH(4モル) 5.8ml CaCl2 ・2H2 O 1.03g NaCl2 2.92g ソルビトール 50g アジ化ナトリウム 1g Brij−35(6%溶液) 5ml エチリデンブロックした基質 2mg/ml アルファ−グルコシダーゼ 2.2U/ml (Bacillus Stearothermophilus 由来) pH 7.0
当たりに下記を含む。 MOPS 10.46g NaOH(4モル) 5.8ml CaCl2 ・2H2 O 1.03g NaCl2 2.92g ソルビトール 50g アジ化ナトリウム 1g Brij−35(6%溶液) 5ml エチリデンブロックした基質 2mg/ml アルファ−グルコシダーゼ 2.2U/ml (Bacillus Stearothermophilus 由来) pH 7.0
【0032】Brij−35は、ポリオキシエチレン
(23)ラウリルエーテル(16.9のHLB値を有す
る非イオン性デタージェント)である。
(23)ラウリルエーテル(16.9のHLB値を有す
る非イオン性デタージェント)である。
【0033】下記の手順を用いて、アッセイ用組成物中
のBacillus Stearothermophilus のアルファグルコシダ
ーゼの有用性を測定した。
のBacillus Stearothermophilus のアルファグルコシダ
ーゼの有用性を測定した。
【0034】異なる配合間の性能特性(特に、患者の試
料の回復)の確かな比較を可能にするために、共役酵素
及びブロックした基質を加えずに緩衝剤のみを調合し
た。それらは別々に加えた。従って、pHの差は最小化
された。
料の回復)の確かな比較を可能にするために、共役酵素
及びブロックした基質を加えずに緩衝剤のみを調合し
た。それらは別々に加えた。従って、pHの差は最小化
された。
【0035】1リットルの脱イオン水に下記を加えて緩
衝溶液を調製した。 10.46g・・・・・・・・・・・・・・MOPS 5.8ml・・・・・・・・・・・・・・・NaOH,4M 0.74g・・・・・・・・・・・・・・・EDTA,Na2 1.03g・・・・・・・・・・・・・・・CaCl2 2.92g・・・・・・・・・・・・・・・NaCl(H2 O)2 50g・・・・・・・・・・・・・・・・・ソルビトール 1g・・・・・・・・・・・・・・・・・・アジ化ナトリウム(NaN3 ) 5ml・・・・・・・・・・・・・・・・・6%Brij−35 pH 7.0にする 緩衝液は、上首尾に作ったが、無菌的に満たさなかっ
た。
衝溶液を調製した。 10.46g・・・・・・・・・・・・・・MOPS 5.8ml・・・・・・・・・・・・・・・NaOH,4M 0.74g・・・・・・・・・・・・・・・EDTA,Na2 1.03g・・・・・・・・・・・・・・・CaCl2 2.92g・・・・・・・・・・・・・・・NaCl(H2 O)2 50g・・・・・・・・・・・・・・・・・ソルビトール 1g・・・・・・・・・・・・・・・・・・アジ化ナトリウム(NaN3 ) 5ml・・・・・・・・・・・・・・・・・6%Brij−35 pH 7.0にする 緩衝液は、上首尾に作ったが、無菌的に満たさなかっ
た。
【0036】3つの配合物を調製した。それらは、下記
の通りである。 パイロット=緩衝液+2mg/mlエチリデンブロック
した基質(Boehringer Mannheim )+2.2U/mlBa
cillus Stearothermophilus 由来のアルファ−グルコシ
ダーゼ(日本国、大阪在、東洋紡株式会社) 対照1=緩衝液+2mg/mlベンジリデンブロックし
た基質(Genzyme )+10U/mlアルファ−グルコシ
ダーゼ(酵母マルターゼ)+10U/mlグルコアミラ
ーゼ 対照2=緩衝液+2mg/mlエチリデンブロックした
基質+10U/mlアルファ−グルコシダーゼ(酵母マ
ルターゼ)+10U/mlグルコアミラーゼ
の通りである。 パイロット=緩衝液+2mg/mlエチリデンブロック
した基質(Boehringer Mannheim )+2.2U/mlBa
cillus Stearothermophilus 由来のアルファ−グルコシ
ダーゼ(日本国、大阪在、東洋紡株式会社) 対照1=緩衝液+2mg/mlベンジリデンブロックし
た基質(Genzyme )+10U/mlアルファ−グルコシ
ダーゼ(酵母マルターゼ)+10U/mlグルコアミラ
ーゼ 対照2=緩衝液+2mg/mlエチリデンブロックした
基質+10U/mlアルファ−グルコシダーゼ(酵母マ
ルターゼ)+10U/mlグルコアミラーゼ
【0037】すべての評価を、手動で、Beckman DU70又
はMiraにて、下記の条件下で行なった。 試料/試薬 比 = 1:40 温度 = 37℃ 高い対照 = チャレンジアミラー
ゼ対照(2500U/l) アミラーゼ対照 = チャレンジ(アミラ
ーゼ現行比2500U/l〜2000〜2500U/
l) 患者試料 = 正常試料
はMiraにて、下記の条件下で行なった。 試料/試薬 比 = 1:40 温度 = 37℃ 高い対照 = チャレンジアミラー
ゼ対照(2500U/l) アミラーゼ対照 = チャレンジ(アミラ
ーゼ現行比2500U/l〜2000〜2500U/
l) 患者試料 = 正常試料
【0038】遅れ測定:2500U/lの高い対照を用
いて、対照1及びパイロットの両者は、30秒未満の遅
れ及び少なくとも5分間の直線的アッセイ時間を示し
た。比較のための添付の図1を参照されたい。パイロッ
トは、対照1(現在市販されているアミラーゼ単一試
薬)と類似した優れた直線性及び遅滞期を示した。
いて、対照1及びパイロットの両者は、30秒未満の遅
れ及び少なくとも5分間の直線的アッセイ時間を示し
た。比較のための添付の図1を参照されたい。パイロッ
トは、対照1(現在市販されているアミラーゼ単一試
薬)と類似した優れた直線性及び遅滞期を示した。
【0039】回復 表1は、種々のアミラーゼ濃度のチャレンジ及び10種
類のヒトの血清試料に対する回復の比較を示す。
類のヒトの血清試料に対する回復の比較を示す。
【表1】 表1 試料 パイロット 対照1 対照2 チャレンジ、0% 0 0 0 チャレンジ、20% 508 500 514 チャレンジ、40% 987 994 1001 チャレンジ、50% 1259 1231 1246 チャレンジ、60% 1485 1595 1480 チャレンジ、80% 1960 1916 1944 チャレンジ、100% 2390 2378 2427 ヒト#1 55 51 ヒト#2 82 76 ヒト#3 40 39 ヒト#4 49 45 ヒト#5 29 30 ヒト#6 29 28 ヒト#7 42 39 ヒト#8 84 78 ヒト#9 66 63 ヒト#10 46 42
【0040】パイロット及び対照は、すべて同一の直線
性を示した。チャレンジ希釈によるそれらの回復は、本
質的に同一である。パイロットは、ヒト試料について、
対照1と比較して僅かに高い回復を有した。Bacillus S
tearothermophilus 由来のアルファ−グルコシダーゼ
は、低酵素濃度(2.2U/l)で、酵母由来のアルフ
ァ−グルコシダーゼ及びグルコアミラーゼと同じ2つの
機能を遂行した。
性を示した。チャレンジ希釈によるそれらの回復は、本
質的に同一である。パイロットは、ヒト試料について、
対照1と比較して僅かに高い回復を有した。Bacillus S
tearothermophilus 由来のアルファ−グルコシダーゼ
は、低酵素濃度(2.2U/l)で、酵母由来のアルフ
ァ−グルコシダーゼ及びグルコアミラーゼと同じ2つの
機能を遂行した。
【0041】安定性 表2は、41℃で3日間のストレス(これは、4℃で配
合して4〜8℃で18か月間貯蔵することに等しい)の
後における、405nmでの吸光度の変化を示す。
合して4〜8℃で18か月間貯蔵することに等しい)の
後における、405nmでの吸光度の変化を示す。
【表2】表2 A405、 4℃で3日間 = 0.061 A405、41℃で3日間 = 0.1225
【0042】パイロットをガラス器具及びピペットをオ
ートクレーブしないで調合した場合でさえ、吸光度の変
化は、41℃で3日間のストレスの後に顕著に低かっ
た。これは、東洋紡のアルファ−グルコシダーゼがきわ
めて清浄である(即ち、アミラーゼ混入が非常に低い)
ことを反映している。
ートクレーブしないで調合した場合でさえ、吸光度の変
化は、41℃で3日間のストレスの後に顕著に低かっ
た。これは、東洋紡のアルファ−グルコシダーゼがきわ
めて清浄である(即ち、アミラーゼ混入が非常に低い)
ことを反映している。
【0043】パイロットについて、41℃で3日間の後
のストレス回復を、4℃で3日間と比較して、表3に示
す。
のストレス回復を、4℃で3日間と比較して、表3に示
す。
【表3】 表3 試料(アミラーゼ%) 温度 4℃ 41℃ チャレンジ、0% 0 0 チャレンジ、20% 511 508 チャレンジ、40% 1001 987 チャレンジ、50% 1235 1271 チャレンジ、60% 1518 1510 チャレンジ、80% 1923 1933 チャレンジ、100% 2441 2349 ヒト#1 58 57 ヒト#2 84 83 ヒト#3 45 44 ヒト#4 48 49 ヒト#5 29 29 ヒト#6 34 31 ヒト#7 43 39 ヒト#8 87 85 ヒト#9 71 71 ヒト#10 48 47
【0044】41℃で3日間のストレスをかけたパイロ
ットは、すべてのチャレンジ及び患者試料の希釈につい
て回復した(4℃試薬と同一)。このパイロットは、極
めて安定であり且つストレス分解に抵抗性である。
ットは、すべてのチャレンジ及び患者試料の希釈につい
て回復した(4℃試薬と同一)。このパイロットは、極
めて安定であり且つストレス分解に抵抗性である。
【0045】遅滞 新鮮な試薬及びストレスをかけた試薬の遅滞期及び直線
性を、高いチャレンジ試料を用いて、Beckman DU70にて
評価した。結果を図2に示すが、遅滞期は短く且つ直線
性が優れている。
性を、高いチャレンジ試料を用いて、Beckman DU70にて
評価した。結果を図2に示すが、遅滞期は短く且つ直線
性が優れている。
【0046】引き出される結論は下記の通りである。 1.Bacillus Stearothermophilus のアルファ−グルコ
シダーゼは、二重エキソ酵素として、アルファ−グルコ
シダーゼ及びグルコアミラーゼに等しい。 2.アミラーゼ用単一試薬は、この単一の共役酵素と共
にエチリデン基質を用いて容易に調合することが出来
る。 3.かかるアミラーゼ用試薬は、直線性、回復、安定
性、遅滞期及び動的範囲について、我々の現在の市販の
試薬と同一に作用する。 4.この試薬は、一層少ない共役酵素しか試薬マトリッ
クス中に導入されないので、一層優れた試薬である。
シダーゼは、二重エキソ酵素として、アルファ−グルコ
シダーゼ及びグルコアミラーゼに等しい。 2.アミラーゼ用単一試薬は、この単一の共役酵素と共
にエチリデン基質を用いて容易に調合することが出来
る。 3.かかるアミラーゼ用試薬は、直線性、回復、安定
性、遅滞期及び動的範囲について、我々の現在の市販の
試薬と同一に作用する。 4.この試薬は、一層少ない共役酵素しか試薬マトリッ
クス中に導入されないので、一層優れた試薬である。
【図1】臨床化学における最悪の場合のシナリオを表す
高い対照を用いた吸光度の時間に対するプロットであ
る。それは、対照1(2つのエキソ酵素を含む市販の組
成物)と同じに作用する本発明の組成物(パイロット)
を確立する。パイロットの直線性は、対照1と同様に確
立されている。
高い対照を用いた吸光度の時間に対するプロットであ
る。それは、対照1(2つのエキソ酵素を含む市販の組
成物)と同じに作用する本発明の組成物(パイロット)
を確立する。パイロットの直線性は、対照1と同様に確
立されている。
【図2】高い対照を用いた吸光度の時間に対するプロッ
トである。それは、4℃で3日間冷蔵したときの本発明
の組成物(パイロット)を、41℃で3日間ストレスを
かけたパイロットの他の試料と比較する。その結果は、
直線的性能に殆ど変化を与えない。
トである。それは、4℃で3日間冷蔵したときの本発明
の組成物(パイロット)を、41℃で3日間ストレスを
かけたパイロットの他の試料と比較する。その結果は、
直線的性能に殆ど変化を与えない。
─────────────────────────────────────────────────────
【手続補正書】
【提出日】平成5年6月30日
【手続補正1】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正内容】
【特許請求の範囲】
Claims (18)
- 【請求項1】 アルファ−アミラーゼを含む体液と混合
したときにアルファ−アミラーゼに関する反応によって
加水分解されて直接又は間接的に検出可能な標識を反応
混合物に生成する少なくとも1つの基質の水溶液を含む
単一液体アルファ−アミラーゼ用試薬組成物(かかる検
出可能な標識の形成速度は試料中に存在するアルファ−
アミラーゼ及びかかる検出可能標識の形成においてアル
ファ−アミラーゼに協力する少なくとも1つのエキソ酵
素の量に比例し、前記の基質は、その加水分解速度を制
限しないだけ十分な濃度で存在し、前記の試薬組成物
は、2〜10℃で少なくとも6か月間にわたって基質及
び酵素の分解に対して安定である)における、エキソ酵
素としてBacillus Stearothermophilus 由来のアルファ
−グルコシダーゼを、37℃のアッセイ温度で10分以
内でアッセイを達成するのに十分な量で利用することを
含む改良。 - 【請求項2】 下記を含み、実質的にアルファ−アミラ
ーゼを含まない水溶液を含む、請求項1に記載の、安定
な、単一液体のアルファ−アミラーゼ用試薬: (a) 少なくとも約1.5U/mlの且つ37℃のアッセ
イ温度で10分以内でアミラーゼアッセイを達成するの
に十分な濃度で存在するBacillus Stearothermophilus
由来のアルファ−グルコシダーゼ; (b) 前記のアルファ−グルコシダーゼにより開裂され得
る結合によって基質の還元末端グルコースに結合した光
学的に検出可能な標識及び基質の末端グルコースに結合
したブロッキング基を有するアルファ−アミラーゼ用多
糖類又は少糖類基質(前記のブロッキング基は、エチリ
デン、ベンジリデン及びそれらの混合物よりなる群より
選択する);及び (c) 0〜約300g/リットルのポリオール溶液。 - 【請求項3】 水溶液が実質的にアルファ−アミラーゼ
産生微生物を含まず且つ下記を含む、請求項1に記載
の、安定な、単一液体のアルファ−アミラーゼ用試薬: (a) 少なくとも約1.5U/mlの且つ37℃のアッセ
イ温度以内でアミラーゼアッセイを達成するのに十分な
濃度で存在するBacillus Stearothermophilus由来のア
ルファ−グルコシダーゼ; (b) アルファ−アミラーゼによって加水分解可能であり
且つアルファ−グルコシダーゼにより開裂可能な結合に
よって基質の還元末端グルコースに結合した光学的に検
出可能な標識及び基質の末端グルコースに結合したブロ
ッキング基を有する多糖類又は少糖類基質(前記の基質
は、少なくとも2mg/mlの濃度で存在し且つアルフ
ァグルコシダーゼによって加水分解されて生物学的液体
中のアルファ−アミラーゼ濃度に比例した速度で標識を
生じる); (c) 0〜300グラム/リットルのポリオール; (d) 約5mMの濃度の塩化カルシウム; (e) 約50mMの濃度の塩化ナトリウム;及び (f) pHを約6.5〜7.5に維持するのに十分な両性
イオン性緩衝剤(前記の試薬は、2〜8℃で少なくとも
6か月間安定である)。 - 【請求項4】 基質を、ベンジリデン、エチリデン及び
それらの混合物からなる群より選択するブロッキング基
によってブロックし且つ、試薬組成物中のアルファ−グ
ルコシダーゼ濃度が少なくとも約1.5U/mlであ
る、請求項1、2又は3に記載の、安定な、単一液体の
アルファ−アミラーゼ用試薬。 - 【請求項5】 基質を、ベンジリデン、エチリデン及び
それらの混合物からなる群より選択するブロッキング基
によってブロックし且つ、試薬組成物中のアルファ−グ
ルコシダーゼ濃度が約2.2U/mlである、請求項
1、2又は3に記載の、安定な、単一液体のアルファ−
アミラーゼ用試薬。 - 【請求項6】 ポリオールが存在する、請求項1〜5に
記載の、安定な、単一液体のアルファ−アミラーゼ用試
薬。 - 【請求項7】 ポリオールを、ソルビトール、エチレン
グリコール、ポリエチレングリコール、グリセロール及
びそれらの混合物からなる群より選択する、請求項6に
記載の、安定な、単一液体のアルファ−アミラーゼ用試
薬。 - 【請求項8】 ポリオールが、試薬1リットル当たり約
10〜300グラムの量で存在する、請求項6又は7の
何れか1つに記載のアルファ−アミラーゼアッセイ用試
薬。 - 【請求項9】 ポリオールが、試薬組成物中に、約30
〜70グラムの量で存在する、請求項6又は7の何れか
1つに記載のアルファ−アミラーゼアッセイ用試薬。 - 【請求項10】 緩衝剤を供給して、試薬を約6.5〜
7.5のpHに維持する、請求項1、2及び4〜9の何
れか1つに記載のアルファ−アミラーゼアッセイ用試
薬。 - 【請求項11】 緩衝剤が両性イオン性緩衝剤である、
請求項10に記載のアルファ−アミラーゼアッセイ用試
薬。 - 【請求項12】 両性イオン性緩衝剤が、約0.01〜
1.0モル/リットルの濃度で存在する、請求項1、3
及び11の何れか1つに記載のアルファ−アミラーゼア
ッセイ用試薬。 - 【請求項13】 両性イオン性緩衝剤が3−N−モルホ
レンプロパンスルホン性である、請求項1、3、11又
は12の何れか1つに記載のアルファ−アミラーゼアッ
セイ用試薬。 - 【請求項14】 更に少なくとも1つの抗菌剤を含む、
前記の請求項の何れか1つに記載のアルファ−アミラー
ゼアッセイ用試薬。 - 【請求項15】 抗菌剤を、セチルトリメチルアンモニ
ウムブロミド、バクトリム、アジ化ナトリウム及びそれ
らの混合物からなる群より選択する、請求項14に記載
のアルファ−アミラーゼアッセイ用試薬。 - 【請求項16】 アルファ−グルコシダーゼが、試薬1
ml当たり約2.2Uの量で存在する、前記の請求項の
何れか1つに記載の、安定な、単一液体のアルファ−ア
ミラーゼ用試薬。 - 【請求項17】 ポリオールがソルビトールである、前
記の請求項の何れか1つに記載のアルファ−アミラーゼ
用試薬。 - 【請求項18】 pH約7を有し且つ、1リットル当た
り、下記の成分を下記の濃度で含む溶液を含む、請求項
1に記載の、安定な、単一液体のアルファ−アミラーゼ
用試薬: a) 3−N−モルホレンプロパンスルホン酸 −約10.46g b) NaOH,4M −約4.8ml c) CaCl2 (H2 O)2 −約1.03g d) NaCl2 −約2.92g e) ソルビトール −約50g f) アジ化ナトリウム −約1g g) ポリオキシエチレン(23)ラウリル エーテル(6%溶液) −約5ml h) エチリデンブロックした基質 −約2mg/ml i) アルファ−グルコシダーゼ (Bacillus Stearothermophilus 由来) −約2.2U/ml。
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US07/878,347 US5384245A (en) | 1992-05-04 | 1992-05-04 | Stable, single-liquid alpha-amylase reagent |
US878347 | 1992-05-04 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPH0716099A true JPH0716099A (ja) | 1995-01-20 |
Family
ID=25371843
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP5127808A Pending JPH0716099A (ja) | 1992-05-04 | 1993-05-06 | 改良された安定な単一液体アルファ−アミラーゼ用試薬 |
Country Status (7)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US5384245A (ja) |
EP (1) | EP0568959B1 (ja) |
JP (1) | JPH0716099A (ja) |
AT (1) | ATE159761T1 (ja) |
CA (1) | CA2095200C (ja) |
DE (1) | DE69314844T2 (ja) |
ES (1) | ES2108161T3 (ja) |
Cited By (1)
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US7183069B2 (en) * | 2002-03-07 | 2007-02-27 | Toyama University | Reagent, method and apparatus for measuring amylase activity |
US20080050451A1 (en) * | 2006-06-16 | 2008-02-28 | Mabry Helen C | Methods for assessing dehydration and shock, assays and kits for the methods |
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JPH03500603A (ja) * | 1987-07-17 | 1991-02-14 | モドロビッチ,アイバン エンドレ | 安定な一液性α―アミラーゼ検定用試薬 |
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- 1993-04-29 CA CA002095200A patent/CA2095200C/en not_active Expired - Fee Related
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