JPH0491796A

JPH0491796A - アデノシンデアミナーゼ分別定量用試薬

Info

Publication number: JPH0491796A
Application number: JP20707290A
Authority: JP
Inventors: Yasuko Tanabe; 田辺　康子; Shinichi Tejima; 手嶋　真一; Tsuneo Haniyu; 羽生　恒男
Original assignee: Toyobo Co Ltd
Current assignee: Toyobo Co Ltd
Priority date: 1990-08-03
Filing date: 1990-08-03
Publication date: 1992-03-25
Anticipated expiration: 2013-12-14
Also published as: JP2836218B2

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】（産業上の利用分野）本発明は、体液例えば血清中のアデノシンデアミナーゼ
アイソザイムを簡便に分別定量する試薬に関する。

（従来の技術）アデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡ）は、核酸代謝に関与
し、アデノシンを脱アミノ化してイノシンとアンモニア
を生成する酵素である。この酵素は、各種悪性腫瘍、肝
疾患、炎症性疾患、細胞性免疫疾患などにおいて、その
臨床的異議が重要視されているが、遺伝的に異なる２種
のアイソザイム（ＡＤＡＩとＡＤＡ２　）が存在し、近
来そのアイソザイムレベルで検査した時の個々のアイソ
ザイムレベルの高低と各種疾患との関連性が注目される
ようになってきた。例えば、倉田ら（臨床病理　３２巻
８７５頁　１９８４　）は、血清中のＡＤＡをセファデ
ックスＧ−２００を用いたゲル濾過法により分析し、ア
イソザイムと病態との関係を検討し、アイソザイム測定
の有用性を示唆している。

又、最近では後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）、成人
下細胞白血病（ＡＴＬ）の患者血清中におけるアイソザ
イム測定の有用性も注視されている。

既存のＡＤＡアイソザイム測定方法としては、大別する
と次の４種の方法が知られている。

■　カラムクロマトグラフィーによる分別法■　電気泳
動による分別法 ■　基質親和性の差による分別法 ■　阻害剤使用による分別法以上の方法のうち■■の方法ではアイソザイムを個別的
に分離し、各フラクションの活性を測定するので精密で
はあるが操作が繁雑であり、時間とコストがかかるので
自動分析用には不適である。

又、■の方法では各アイソザイムの基質親和性（ミカエ
リス定数）が、著しく異なることに着目しており、簡便
に測定できる方法であるが、ＡＤＡ活性値の算出法にお
いて、基質濃度の差による活性値の差を活性比として表
し方程式をたてて算出しなければならず、手間がかかる
。

■の阻害剤を使用する方法（特開平１−２０２２９７号
公報参照）では、ＡＤＡＩの阻害剤エリスロ−９（２−
ヒドロキシ−３−ノニル）アデニンを用いて全ＡＤＡ活
性値（ａ）から該阻害剤を用いた時のＡＤＡ活性値（ｔ
））を控除して、ＡＤＡＩＯ値（ａ−ｂ）及びＡ［ＩＡ
２（ｂ）を求めているが、その際の定量法としては、以
下の方法があげられている。

（イ）グルタミン酸脱水素酵素（ＧＬＩＩＨ）−還元型
ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡｏｆｌ）
法（Ｄ）　ＧＬＤＨ−還元型ニコチンアミドアデニンジヌ
クレオチドりん酸（ＮＡＤＰ）ｌ　）法（ｈ）キサンチ
ンオキシダーゼ（ＸＯＤ）−プリンヌクレオチドホスホ
リラーゼ（ＰＮＰ　）法（イ）（ロ）の方法では、ＡＤ
Ａの作用によって生成されたアンモニアを測定する方法
であるが、これは体液中の内因性アンモニアの影響を大
きくうけるために精度、正確性において問題があり、Ａ
ＤＡ分別定量を正確におこなえなかった。（ｈ）の方法
では、ＡＤＡにより生成されたイノシンをＰＮＰにより
キサンチンにしてテトラゾリウム塩（ホルマザン色素）
の存在下、ＸＯＤを作用させ生したホルマザンの吸光度
を測定する方法であるが、測定感度が低く、更に難溶性
ホルマザン色素を使用する為、器具や測定ラインへの色
素沈着の間肚があり、（イ）（υ）の方法と同様にＡＤ
Ａ分別定量を正確に行えなかった。

（発明が解決しようとする課Ｂ）本発明の目的は、ＡＤＡアイソザイム活性を測定する方
法において、簡便な測定かつ平易な算出方法で更に内因
性アンモニアの影響、測定感度不足及び測定ライン等へ
の色素沈着の問題を解決し、阻害剤を用いた高感度発色
系を用いることにより、新規でかつ正確性の高いＡＤＡ
分別定量用試薬を提供することにある。

（課題を解決するための手段）本発明は、（ａ）アデノシン、ら）プリンヌクレオチド
ホスホリラーゼ（以下ＰＮＰと略する）　、（ｃ）リン
酸またはリン酸塩、（ｄ）キサンチンオキシダーゼ（以
下ＸＯＤと略する）　、（ｅ）ペルオキシダーゼ（以下
ＰＯＤと略する）　、（ｆ）水素供与体、（劾アニリン
誘導体および（社）エリスロ−９−（２−ヒドロキシ−
３−シェル）アデニン（以下ＥＨＮ＾と略する）、コフ
ォルマイシンおよびデオキシコフォルマイシンからなる
群から選ばれた少なくとも一種の化合物を含むことを特
徴とするアデノシンデアミナーゼ分別定量用試薬である
。

本発明のアデノシンデアミナーゼ分別定量用試薬は、ア
デノシン、ＰＮＰ、リン酸またはリン酸塩、Ｘ０Ｏ１Ｐ
Ｏ［ｌ、水素供与体およびアニリン誘導体からなる全Ａ
ＤＡを定量する試薬に、ＡＤＡＩの阻害剤としてＥｌ（
ＮＡ、コフォルマイシンおよびデオキシコフォルマイシ
ンからなる群から選ばれた少なくとも一種の化合物を添
加したものである。

したがって、前記の全ＡＤＡを定量する試薬によって、
全ＡＤＡ活性値（ａｌを測定しておき、次に本発明の試
薬によってＡＤＡ２の活性値い）を測定すれば、八〇Ａ
Ｉの活性値は（ａ−ｂ）によって、算出できるので、Ａ
ＤＡＩとＡＤＡ２を分別定！することができる。

本発明に用いる阻害剤（ＥＨＮＡ、コフォルマイシンお
よびデオキシコフォルマイシンからなる群から選ばれた
少なくとも一種）の量は、反応液中０．０５ｍＭ〜０．
５＋Ｍが好ましい。

本発明に用いるアデノシンの量は反応液中５〜２２−門
となる量が好ましい。

本発明に用いるＰＮＰは微住物由来のものなどがある。

本発明の試薬中、ＰＮＰの量は反応液中０．１３０ｕ／
ｄとなる量が好ましい。

本発明に用いるＸＯＤはミルク由来のもの、微生物由来
のものなどがあり、たとえば生ミルク由来のＸＯＤが挙
げられる。本発明の試薬中、Ｘ０ＤＯ量は反応液中０．
０１．−１．、Ｏｕ　／　ｄとなる量が好ましい。

本発明に使用するペルオキシダーゼは植物由来のもの、
微生物由来のものなどがあり、たとえば西洋ワサビ由来
のものを挙げることができる。本発明の試薬中ＰＯＤの
量は反応液中０．０ｌ−５０ｕ　／　ｍとなる量が好ま
しい。

本発明に用いる水素供与体は、過酸化水素、ペルオキシ
ダーゼ、アニリン誘導体との反応に際し、水素を供与す
る化合物であればよく、例えば４−アミノアンチピリン
、３−メチル−２−ヘンジチアゾリン−ヒドラゾン誘導
体などがある。本発明の試薬中、水素供与体の量は反応
液中０．１〜１０ｍＭとなる量であれば良い。

本発明に使用するアニリン誘導体としては、アニリン、
Ｎ、Ｎ−ジメチルアニリン、Ｎ、Ｎ−ジエチルアニリン
、Ｎ、Ｎ−ジエチル−ｍ−トルイジン、ＮＮ−ジメチル
−ｍ−アンシジン、Ｎ−エチル−Ｎ−（３メチル　フェ
ニル）−Ｎ’−アセチル　エチレンジアミン、Ｎ−エチ
ル−Ｎ−（β−ヒドロキレエチル）−ｍ−トルイジン、
Ｎ−エチル−Ｎ（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル
）−ｍトルイジン、Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピルｍ
−トルイジン、Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピル−３，
５−ジメトキシアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ（２−ヒドロ
キシ−３−スルホプロピル）　−３，５ジメトキシアニ
リン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホ
プロピル）　−ｍ−アニシジン等がある。

本発明の試薬中、アニリン誘導体の量は反応液中０．１
−５０ｍＭとなる量が好ましい。

本発明の試薬は通常、ｐＨ６−８の緩衝液とともに使用
する。

本発明の試薬の液性の調整に用いる緩衝液はアデノシン
デアミナーゼの活性測定域で緩衝能を示すものであれば
特に制限されない。たとえばリン酸緩衝液、グツド緩衝
液、トリス緩衝液等が挙げられる。

本発明の試薬には必要により、スーパーオキサイドジス
ムターゼ（以下ＳＯＤと略する）、アスコルビン酸オキ
シダーゼ（以下ＡＳＯと略する）またはカタラーゼを添
加しても良い。

本発明の試薬には酵素反応または呈色反応を円滑に行わ
せるために、他の化合物を添加しても良い。このような
化合物として、たとえば安定化剤、界面活性剤、賦活剤
等が挙げられる。

本発明の試薬は以下の測定反応を利用する。

過酸化水素子水素供与体＋アニリン誘導体ＥＯ □キノン色素（本）全ＡＤＡを測定する試薬によって、ＡＤＡＩおよ
びＡＤＡ２を測定し、本発明の試薬によってＡＤＡ２を
測定する。

本発明は上記式から明らかなように、アデノシンからア
デノシンデアミナーゼ２により生成したイノシンに、Ｐ
ＮＰ、リン酸またはリン酸塩を作用させ、生成するヒボ
キサンチンにＸＯＤを作用させて過酸化水素とキサンチ
ンを生成させる。生したキサンチンにさらにＸＯＤを作
用させて過酸化水素と尿酸に分解させ、ヒポキサンチン
により生した過酸化水素との総量をペルオキシダーゼ、
水素供与体およびアニリン誘導体を用いてキノン色素を
測定する。キノン色素の測定は通常、５４０〜６５０ｎ
ｍの波長の吸光度測定を行う。

本発明の試薬は、試料に全測定試薬を１度に加えて反応
させる１ステツプ法、試料に試薬を２回に分けて加えて
反応を行う２ステツプ法に使用する。特にＰＩＩＰ、　
ＸＯＤ、　ＰＯＤ、、ＡＤＡｌｉｆｆｌＩＦ剤オヨヒ必
要によりＳＯＤを含む試薬を第１試薬とし、アデノシン
、水素供与体、アニリン誘導体を含む試薬を第２試薬と
する２ステツプ法が好ましい。２ステツプ法では、第１
ステツプにおいて試料中に存在する若干量のキサンチン
、ヒボキサンチンおよびアスコルビン酸等をＰＮＰ、　
ＸＯＤまたカタラーゼ、ＡＳＯでもって前処理をおこな
い、試料中のキサンチン、ヒボキサンチン、アスコルビ
ン酸の影響を回避することが出来る。第２ステツプでは
基質のアデノシンを含む試薬が用いられて、アデノシン
デアミナーゼの酵素反応と呈色反応が同時に行われる。

レート法ではこの呈色反応の単位時間当りの呈色の増加
を測定する。また、測定感度の向上のためＳＯＤを添加
することが好ましい。

本発明に必要により使用するＳＯＤは動物由来のもの、
微生物由来のものがあり、たとえば牛血清由来のものを
挙げることができる。本発明の試薬中、ＳＯＤの量は反
応液中２−１０００ｕ　／　ａｆとなる量であれば良い
。本発明に必要により使用するＡＳＯは植物由来のもの
などがあり、例えばキュウリ由来のものを挙げることが
できる。

（実施例）以下、本発明を実施例により詳細に説明する。

実施例１下記組成を用いて、下記方法により、血清３種の吸光度
変化を測定した。結果を第１表に示す。

組成Ａ（全ＡＤＡ測定用試薬）第１試液０．２５ＭＩＪン酸緩衝液（ｐＨ６，５）ＰＮＰ　　６
１１／ａｔ！ｘｏｎ　　０．１５Ｕ／　ｄＰＯＤ　　２０Ｕ／１ｄＮ−エチル−Ｎ（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル
）−ｍ−トＪレイジン２Ｊ第２試液０．２５Ｍ’Ｊン酸緩衝液（ｐ）１６．５）アデノシン
２０＃１Ｍ４−アミノアンチピリン１鋼阿組成り（本発明のＡＤＡ２測定用試薬）第１試液０．２５？ｌリン酸緩衝液（ｐＨ６，５）ＰＮＰ　　　
６Ｕ／蔽ＫＯＤ　　Ｏ，Ｉ５［Ｊ／ｄＰＯＤ　　２０１Ｊ／〆Ｎ−エチル−Ｎ（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル
）−ｍ−）ルイジン２ｍＭＥＨＮＡ　０．４ｍＭ第２試液０．２５？Ｉリン酸緩衝液（ｐＨ６，５）アデノシン２
０ｍＭ４−アミノアンチピリン１ｍＭ測定法試料５０μｌに上記第】試液１．５１ｄ及び第２試液１
．５ｄを添加し、第２試液分注後３〜５分後の１分間当
りの吸光度変化を、試薬ブランクを対照として、３７°
Ｃ波長５５０ｎｍで測定した。

（各血清につきｎ＝５測定）実施例２下記組成を用いて、実施例１と同様の方法により、血清
３種の吸光度変化で測定した。結果を第１表に示す。

組成Ｃ（全ＡＤＡ測定用試薬）第１試液０．２５ＭＩＪン酸緩衝液（ｐＨ６，５）ＰＮＰ　　６
０／ｄＸＯＤ　　Ｏ，１５Ｕ／　ｄＰＯＤ　　２０Ｕ　／　ｄＮ−エチル−Ｎ（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル
）−ｍ−）シイジン２際１ＳＯＤ　　２０００　／　ｘｉ！第２試液０．２５台リン酸緩衝液（ｐＨ６，５）アデノシン２０
ｍＭ４−アミノアンチピリン１蒙門組成り（本発明のＡＤＡ２測定用試薬）第１試液０．２５門リン酸緩衝液（ｐＨ６，５）ＰＮＰ　　６０
／ａｆＸＯＤ　　０．１．５Ｕ／ｄＰｏ１１　２００／ＩＩＲＮ−エチル−Ｎ（２−ヒドロキシ−３−スルホブロビル
）−ｍ−）ルイジン２ｍＭ５００　２００Ｕ／ｄＥＨＮＡ　　Ｏ，４ｗ１ＦＩ第２試液０．２５Ｍリン酸緩衝液（ｐｌ＋６．５）アデノシン２
０−Ｍ４−アミノアンチピリンＩｍＭ比較例下記組成を用いて、下記方法により血清３種の吸光度変
化を測定した。結果を第１表に示す。

組成ａ（全ＡＤＡ測定用試薬）トリス緩衝液　　　　　５０＋＊ＦＩアデノシン　　　　　　６＋ｍＭ α−ケトグルタル＃　　］、、３１１ＭＮＡＤＰＨ０，
２６ｍＭＧＬ［ｌＨ５０Ｌｌ　／　ｄ組成り　（ＡＤＡ２測定用試薬）トリス緩衝液　　　　　５０ｍとアデノシン　　　　　　６■Ｈ α−ケトグルタル＃　　１．３１１ＭＮＡＤＰ）Ｉ　　　　　　　　　　　　　　　Ｏ，２６
ｍＭＧＬＤＩＩ　　　　　　　　　　　　　５００／　
ｄＥＨＮＡ　　　　　　　　　　　　　　　　　Ｏ，ｌ
■Ｈ測定法試料２０μ！、試液３Ｍ１を加え、試液分注後３〜５分
の１分間当りの吸光度変化を、試薬ブランクを対照にし
て３７°Ｃ１波長５４０ｎｓで測定した。

以下余白（注１）ｘは１分間当りの吸光度変化について５回測定
した平均値を示す。

（注２　）　５０は５回の吸光度変化の測定値＆ｘから
求めた標準偏差を示す。

（注３　）　ＣＶはＳＤ／　ｘ　ｘ　１００による求め
た値であって、この値が小さいほどバラツキが小さいこ
とを示す。

第１表に示した結果から、本発明の試薬は比較例に比べ
て吸光度変化が大きく、すなわち感度が高く、また、バ
ラツキが少なく、正確な測定ができていることがわかる
。また、本発明の試薬は、ＡＤＡＩ阻害率（ＡＤＡ２／
全ＡＩ）Ａ　Ｘ　１００　）が、比較例とほぼ同じであ
り、本測定系を用いても、従来どおり問題なく、分別定
量がおこなわれていることがわかる。

（発明の効果）本発明のＡＤＡ分別定量用試薬を用いた測定方法は従来
法に比べて感度が著しく向上する。特に、アンモニアに
ＧＬＤＨとＮＡＤＰＦＩを加えてＡＤＡを測定する方法
に比べて、約３倍の感度を有する。本発明ではアンモニ
アを中間体としないため内因性のアンモニアや乳酸脱水
素酵素等の共存物質の影響をうけず、精度の高い測定を
行うことができる。又、Ｘ０Ｄ−ＰＮＰ法と比較しても
、本発明の試薬を用いる方法は酵素反応により生成した
過酸化水素をイノ１オキシダーゼ、水素供与体、アニリ
ン誘導体により測定する方法であるから、ホルマザン色
素を使用しないので色素沈着の問題がなく、測定感度も
高く、精度や正確性に優れている。

特許出願人　　東洋紡績株式会社

Claims

【特許請求の範囲】

（１）（ａ）アデノシン、（ｂ）プリンヌクレオチドホ
スホリラーゼ、（ｃ）リン酸またはリン酸塩、（ｄ）キ
サンチンオキシダーゼ、（ｅ）ペルオキシダーゼ、（ｆ
）水素供与体、（ｇ）アニリン誘導体および（ｈ）エリ
スロ−９−（２−ヒドロキシ−３−ノニル）アデニン、
コフォルマイシンおよびデオキシコフォルマイシンから
なる群から選ばれた少なくとも一種の化合物を含むこと
を特徴とするアデノシンデアミナーゼ分別定量用試薬。