JPH04503957A - 脂質とオリゴヌクレオチドの共有結合コンジュゲート - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ３３、薬学的に許容しうる担体と請求項１に記載のコンジュゲートを含有する組 成物。

３４、担体がリポソームである請求項３３に記載の組成物。

３５、等強性である請求項３３に記載の組成物。

３６、滅菌されている請求項３３に記載の組成物。

３７、発病状態にある哺乳動物に請求項３３に記載の組成物の有効量を投与する ことからなる方法。

３８、発病状態がウィルス感染である請求項３７に記載の方法。

３９、組成物中の担体がリポソームである請求項３７に記載の方法。

４０、試料中の予め決めたヌクレオチド配列を有する核酸を検定するための方法 であって、以下からなる方法：（ａ）予め決めた配列にハイブリダイズすること ができるヌクレオチド配列を有する請求項２８に記載のコンジュゲートを得：（ ｂ）このラベルされたコンジュゲートを支持体に固定し：（ｃ）試料中に核酸が 存在しているときにはこの核酸とコンジュゲートのオリゴヌクレオチド部分のハ イブリダイゼーシヨンを引き起こすであろう条件のもとで、試料と固定化コンジ ュゲートを接触させ：そして （ｄ）ラベルされたオリゴマーの存在を検出する。

４１、工ａ（ｅ）の後に、固定化コンジュゲートを、コンジュゲートのオリゴヌ クレオチド部分を切断してラベルおよび未ラベルのオリゴマーフラグメントを生 成させることができる制限エンドヌクレアーゼと消化条件のもとで接触させる工 程をさらに含み、そして工程（ｄ）におけるオリゴマーがオリゴマーフラグメン トである請求項４０に記載の方法。

４２、混合物からオリゴヌクレオチドを分離するための方法であって、以下から なる方法： （ａ）分離しようとするオリゴヌクレオチド内に含まれている配列にハイブリダ イズすることができるヌクレオチド配列を有する請求項１に記載のコンジュゲー トを得； （ｂ）このコンジュゲートを支持体に固定し：（Ｃ）混合物中のオリゴヌクレオ チドとフンシュゲートのオリゴヌクレオチド部分のハイブリダイゼーシヨンを引 き起こす条件のもとで、混合物と固定化コンジュゲートを接触させ；そして（ｄ ）ハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドを分離する。

４３、混合物からオリゴヌクレオチドを分離するための方法であって、以下から なる方法： （ａ）疎水性の相において、分離しようとするオリゴヌクレオチド内に含まれて いる配列にハイブリダイズすることができるヌクレオチド配列を有するコンジュ ゲートを得；（ｂ）親水性の相において、混合物を得：（ｃ　）　ａ　合物中の オリゴヌクレオチドとコンジュゲートのオリゴヌクレオチド部分のハイブリダイ ゼーシヨンを引き起こす条件のもとで、混合物を含む相とコンジュゲートを含む 相を接触させ；そして（ｄ）混合物を含む相からハイブリダイズしたオリゴヌク レオチドを抽出し、これを別の親水性の相に移す。

４４、請求項１に記載のコンジュゲートとラベル部分を含有するリポソーム。

４５、抗体がリポソームのオリゴヌクレオチドに結合してリポソームの安定性を 変化させるように、ヒトからの血清試料と請求項４４に記載のリポソームを接触 させ、そしてラベルの存在または非存在を測定することからなるヒトの全身性エ リテマトーデスを検出スるための方法。

４６６　抗体がリポソームのオリゴヌクレオチドに結合してラベルを放出させ、 そして放出されたラベルの量を測定する請求項４５に記載の方法。

明　細　書 本発明は、脂質とオリゴヌクレオチドの共有結合フンシュゲート、ならびにこれ を医薬、精製および診断の分野で利用することに関する。

アンチセンスＲＮＡまたはＤＮＡの使用は、真核遺伝子発現を操作するのに有用 であることがわかった。この方法は、細胞中の標的ｍＲＮＡの一部に対して相補 性の配列を導入することにより、ＤＮＡからＲＮＡを経てタンパク質に至る情報 の流れを遮断することに基づいている。このオリゴマーが細胞によって吸収され ると、細胞質において標的メソセンジャーの翻訳を遮断することによって機能す るか、または、核に侵入してＤＮＡに結合することによって核のプロセツシング もしくは転写を妨げることができる。また、ウィルス感染の場合には、アンチセ ンスオリゴマーはウィルスゲノム上のオリゴマーの標的部位に依存してウィルス の複製を遮断することにより機能することができる。遺伝子発現を不活性化する 相補性の核酸はアンチセンス核酸と呼ばれている。

細胞膜を通過する効率的な核酸の輸送は、アンチセンス核酸法にとって、ならび に単純なトランスフェクション実験において極めて重要である。アンチセンスオ リゴヌクレオチドの最近の概説については、ｖａｎ　ｄｅｒ　Ｋｒｏｌら［Ｂｉ ｏＴｅｃｈｎｉ　ｕｅｓ　６！：　９５８　（１９８８）］およびＺｏｎ［Ｐｈ ａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ　Ｒｅｓ、　５：　５３９　（１９８８）］を参照。

細胞およびリポソームによるヌクレオチドの取込みは、通常、ヌクレオチドの高 い電荷密度のゆえに非効率的な過程である。導入効率を改善するために多数の方 法が用いられている。即ち、リン酸カルシウム媒介の遺伝子移転［Ｃｈｅｎ、　 Ｃ，Ａ、およびＯｋａｙａｍａ、Ｈ，、ＢｉｏＴｅｃｈｎ［ＤｅＰａｍｐｈ　ｉ 　ｌ　ｉｓ、　Ｍ、　Ｌ、ら、　ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　ｔｇ：　６６２ 　（１９８８）］、アデノウィルスベクターの利用［Ｂｅｒｋｎｅｒ、に、Ｌ、 、　ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　６：　６１６　（１９８８）］、電気穿孔法 ［Ａｎｄｒｅａｓｏｎ、　Ｇ、　Ｌ、およびＥｖａｎｓ、Ｇ、Ａ、、　ＢｉｏＴ ｅｃｈｎｉｑｕｅ介の遺伝子移転［Ｍａｎｎｉｎｏ、　Ｒ，Ｊ、およびＧｏｕｌ ｄ−Ｆｏｇｅｒｉｔｅ、Ｓ、、　ＢｉｏＴｅｃｈｎ籾μ狙６：　６８２　（１９ Ｈ）］である。しかし、これらの方法は全て、細胞毒性、潜在的に病原性である ウィルス因子の導入、再現性の乏しさ、簡便でないこと、あるいはＤＮＡ放出の 非効率性に関係した１またはそれ以上の問題を有している。

比較的最近になって、細胞受容体リガンドタンパク質ｊこ共有結合させたＤＮＡ 、例えば表皮成長因子に対するＤＮＡなどが、細胞膜−異的にＤＮＡを放出させ るための手段として研究された（ＥＰ　２７３，０８５；　１９ｇ８年７月６日 公開）。さらに、糖−リジンコンジュゲートとコンプレックス化したＤ　Ｎ　Ａ 　［Ｗｕ、　Ｇ、　Ｙ、およびＷｕ、　Ｃ，Ｈ，、Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ 、　２６３：　１４６２１　（１９８ｇ）］、およびリポソーム中に捕捉された 正に荷電した脂質、即ち塩化Ｎ−Ｅｌ−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル ］−Ｎ、Ｎ。

Ｎ−トリメチルアンモニウムとコンプレックス化したＤ　Ｎ　Ａ　［Ｆｅｌｇｎ ｅｒ、　Ｐ、　Ｌ、ら、　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＬｔＳＡ 　８４：　７４１３　（１９８７）ｌは、トランスフェクション効率を高めるこ とが示された。

タンパク質−ＤＮＡコンジュゲートは天然に見い出され、ウィルス複製に重要で ある［ＶａｒｔａｐｅｔｉａｎおよびＢｏｇｄａｎｏｖ、　Ａ、Ａ、Ｐｒｏｇ、 Ｎｕｃｌ。

Ａｃ１ｄ　Ｒｅｓ、Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、　３４：　２１０　（１９８７）コ。標 的、切断またはリポータ−グループ（ペプチド、ビオチン、蛍光染料およびＥＤ ＴＡ−Ｆｅを含む）にＤＮＡを結合させた非天然のハイブリッドが調製されてい る［Ｚｕｃｋｅｒｍａｎｎら、Ｊ、Ａｍ、Ｃｈｅｍ、Ｓｏｃ、１１０：　６５９ ２　（１９８ｇ）；　ＨａｒａｌａｍｂｉｄＩＳら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　 Ｌｅｔｔ、２８：　５１９９　（１９８７）；　Ｃｏｎｎｏｌｌｙ、Ｎｕｃｌ、 Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、１５：　３１３１　（１９８７）；＾ｇｒａｗａｌら、Ｎ ｕｃｌ、Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、１４：　６２２７ホスフアチジルヌクレオシドは 脂質代謝における生合成中間体であり、その誘導体の多数が興味ある生物学的活 性を示す［５ｈｕｔｏ、　Ｓ。

ら、　Ｃｈｅｍ、Ｐｈａｒａ＋、Ｂｕｌｌ、　３６：　２０９　（１９８８）− 抗白血病活性のための５′−（３−ｓｎ−ホスファチジル）ヌクレオシド；　５ ｈｕｔｏらの米国特許Ｎｏ、４゜７９７、４７９（１９８９年１月ｌＯ日発行） −ホスホリパーゼＤの存在下にＬ−グツセロリン脂質をヌクレオシドと反応させ ることによって調製した腫瘍治療のためのリン脂質−ヌクレオシドのコンプレッ クス；　Ｍａｔｓｕｓｈｉｔａ、Ｔ、ら、　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、　４１：　 ２７０７　（１９８１）−高められた異化安定性のための１−β−Ｄ−アラビノ フラ／シルシトシン、９−β−Ｄ−アラビノフラノシルアデニンおよびツベルシ ジンのヌクレオシド　５°−ジホスフェート−Ｌ−１，２−シバルミチン誘導体 ；　Ｔｕｒｃｏｔｔｅ、　Ｊ、　Ｇ、ら。

虹庄αｌ」肋勘μＬ配口年：　６０４　（１９８０）および剋！：　６１９　（ １９８０）−抗癌活性のための１−β−Ｄ−アラビノフラノシル部分を戊むシチ ジンジホスフェート　ジアシルグリセロールの類似体］。最近では、コレステロ ールーヌクレオシドコンジニゲートがリポソームで応用するために報告されてい る［Ｈａｓｈｉｄａら、　Ｃｈｅｍ、Ｐｈａｒｍ、Ｂｕｌｌ、　３８：　３１８ ｅ　（１９８８）］。

エーテル脂質類似体とＤＮＡ相互作用物質、即ちアドリアマイシン、４−ヒドロ ペルオキシシクロホスファミド、およびシスプラチンの組合せ体が、加酸的に抗 騰瘍活性を増強することが見い出されている［Ｎｏ５ｅｄａら、　Ｃａｎｃｅｒ 　Ｒｅｓ、　４８：　１７８８−１７９１　（１９ｇＢ）］。

インビボでの治療目的に適用することができるトランスフェクション法、例えば 、活性な核酸の外来配列を生きた生物に適用して細胞代謝のある種の欠損を治療 することができる方法が開発されている。

例えば、Ｃｈｅｎｇら［Ｎｕｃｌ、　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　１１：　６５４− ６９９　（１９８（）］は、］α２−マクログロブリに結合させたクロラムフェ ニコール−アセチルトランスフェラーゼ遺伝子の構築物が３７３−４細胞におい て内在化されることを報告している。しかし、この内在化されたＤＮＡが宿主細 胞において機能を発揮しつることについてはその証拠が示されていない。Ｅ　Ｐ 　２７３，０８５（１９８８年７月６日公開）は、細胞膜を通って外来ヌクレオ チドが侵入することを促進するが、細胞の認識に関しては僅かしか特異性を有し ていない細胞帰着性または細胞標的性因子に核酸を結合させることについて開示 している。このような標的性因子には、低密度リポタンパク質、成長因子、ウィ ルス抗原、および毒素類のＢ鎖が含まれる。

固体支持法によって化学的に合成したオリゴデオ牛ジヌクレオチドのＨＰＬＣ精 製のために疎水性の５°−保護基を使用することが近９５−７９９　（１９８８ ）］。

本発明の目的は、細胞膜を通過してＤＮＡを導入するための効率の高い担体を提 供することである。

別の目的は、活性なオリゴおよびポリヌクレオチド、例えば細胞内でｍＲＮＡと ハイブリダイズすることができ、従って細胞もしくはウィルスの機能を阻害する ことができるアンチセンス１）ＮＡを内在化させるためのトランスフェクション 法を提供することである。

−さらに別の目的は、ＤＮＡ−脂質コンプレックスよりもさらに安定かつ細胞性 リパーゼ類の基質である物質であり、従って、膜結合性の細胞内の細胞質酵素と 接触したときに分子が切断されて細胞により利用される薬物を放出する物質を提 供することである。

他の目的は、このような物質を封入したリポソームを提供することである。

さらに他の目的は、この物質を一体化した抗体と核酸の検定法を提供することで ある。

これらおよび他の目的は当業者には明らかであろう。

これらの目的は、脂質とオリゴヌクレオチドの共有結合フンシュゲートならびに その薬学的に許容しうる塩を提供することによって達成される。このオリゴヌク レオチドは、病原性の核酸または腫瘍遺伝子に十分に相補性であるヌクレオチド 配列を有し、それらにハイブリダイズするものであるのが好ましい。

別の態様では、本発明はラベルされたコンジュゲートおよび固体支持体に固定化 されたコンジュゲートを提供するものである。

さらに別の態様では、本発明は上記コンジュゲートを宿主細胞に導入するための 方法であって、該フンシュゲートで宿主細胞をトランスフェクシヨンすることか らなる方法を提供するものである。

他の態様では、本発明はこのフンシュゲートと薬学的に許容しうる担体（この担 体はリポソームであるのが好ましい）を含有する組成物を提供するものである。

さらに他の態様では、本発明は上記組成物の有効量を病的状態にある植物、動物 またはヒトに投与することからなる方法を提供するものである。

また、別の態様では、本発明は試料中の予め決めたヌクレオチド配列を有する核 酸を検定するための方法であって、以下からなる方法を提供するものである： （ａ）予め決めた配列にハイブリダイズすることができるヌクレオチド配列を有 するラベルされたコンジュゲートとしてコンジュゲートを得： （ｂ）このラベルされたフンシュゲートを支持体に固定し；（ｃ）試料中に核酸 が存在しているときにはこの核酸とコンジュゲートのオリゴヌクレオチド部分の ハイブリダイゼーシヨンを引き起こすであろう条件のもとで、試料と固定化コン ジュゲートを接触させ：そして （ｄ）ラベルされたオリゴマーの存在を検出する。

さらに、別の態様では、本発明は混合物からオリゴヌクレオチドを分離するため の方法であって、以下からなる方法を提供するものである： （ａ）分離しようとするオリゴヌクレオチド内に含まれている配列にハイブリダ イズすることができるヌクレオチド配列を有するコンジュゲートを得； （ｂ）このコンジュゲートを支持体に固定し；（Ｃ）混合物中のオリゴヌクレオ チドとフンシュゲートのオリゴヌクレオチド部分のハイブリダイゼーションを引 き起こす条件のもとで、混合物と固定化コンジュゲートを接触させ；そして（ｄ ）ハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドを分離する。

また、他の態様では、本発明は混合物からオリゴヌクレオチドを分離するための 方法であって、以下からなる方法を提供するもので（ａ）疎水性の相において、 分離しようとするオリゴヌクレオチド内に含まれている配列にハイブリダイズす ることができるヌクレオチド配列を有するコンジュゲートを得；（ｂ）親水性の 相において、混合物を得：（ｃ）混合物中のオリゴヌクレオチドとコンジュゲー トのオリゴヌクレオチド部分のハイブリダイゼーシヨンを引き起こす条件のもと で、混合物を含む相とコンジュゲートを含む相を接触させ；そして（ｄ）混合物 を含む相からハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドを抽出し、これを別の親水 性の相に移す。

さらに、他の態様では、本発明はヒトの全身性エリテマトーデスを検出するため の方法であって、ヒト由来の血清試料をフンシュゲートとラベルを含有するリポ ソームと接触させ（この接触は、抗体がリポソーム上のオリゴヌクレオチドと結 合してリポソームの安定′性を変えるように行う）、ラベルの存在または非存在 を測定することからなる方法を提供するものである。

本明細書の発明は、目的のヌクレオチド配列を含有するか、または目的の配列に ハイブリダイズするに十分な相補性を有するオリゴヌクレオチドと脂質の共有結 合コンジュゲートに関する。この脂質は、それに化学的に結合した核酸配列を通 常はエンドサイト−シスによって宿主細胞中に内在化させるように作用し、内在 化の後に細胞中でのオリゴヌクレオチドの生化学的機能を抑制することがないよ うに十分に不安定な結合によってオリゴヌクレオチドに結合される。実際には、 好ましいコンジュゲートは、このコンジュゲートを切断してオリゴヌクレオチド を放出させる細胞性酵素の基質である。

この脂質は、オリゴヌクレオチドの任意の部分、例えば塩基のアミノ基、ホスフ ェートのヒドロキシル基、またはオリゴヌクレオチドの５゛もしくは３′末端の ヒドロキシル基などに適切に共有結合させる。しかし、その５゛ヒドロキシル基 に結合させるのが好ましい。

本明細書において「脂質」なる用語は、水には不溶性であるが生物学的な疎水性 溶媒には可溶性であり、脂肪酸エステル、脂肪族アルコール、ステロールもしく はワックスに関連し、そして動物によって利用されうる、脂肪および脂肪から導 かれる物質を意味する。このような脂質の例には、脂肪酸およびそのエステル、 グリセリド、例えばトリグリセリド、グリセリルエーテル、リン脂質、スフィン ＝ｒ脂質、脂肪族アルコール、ワックス、テルペン、およびステロイドが含まれ る。脂質には天然から導かれるものと合成によって製造されるものが含まれる。

本発明において特に重要であるのは、フンシュゲートが標的としている宿主細胞 にとって内生である酵素によって特異的に認識されるオリゴヌクレオチドと脂質 の間の共有結合である切断部位または脂質内の切断部位を含有するコンジュゲー トである。即ち、この部位での切断は結合を開裂させるか、または脂質を加水分 解してこのコンジュゲートをさらに水溶性にする。この切断部位は酵素加水分解 に感受性であるのが好ましい。また、酵素は細胞膜ししくは核膜に位置している か、または細胞質中に存在しているのが好ましい。

本発明において最も好ましい脂質はリン脂質であり、ここでは切断部位を認識す る酵素はリパーゼ、好ましくはホスホリパーゼである。さらに、好ましい切断部 位は、リン原子とオリゴヌクレオチドの５゛−ヒドロキシル酸素原子の間の結合 （ホスホリパーゼＤの場合）、またはリン原子とグリセロール側の酸素原子の間 の結合（ホスホリパーゼＣの場合）である。ホスホリパーゼＣおよびＤは至る所 に存在する膜結合性の細胞質酵素であり、ある種のリン酸エステル結合の加水分 解を触媒し、それによりコンジユゲートを切断してオリゴヌクレオチドを細胞質 に放出させる。ホスホリパーゼの概説については、Ｄｅｎｎｉｓ、　Ｅ、　Ａ、 　［”Ｔｈｅ　Ｅｎｚｙｍｅｓ″、　Ｖｏｌ、　ｘｖｌ、　Ｉ）、　３０７−３ ５３　（Ｎｅｗ　Ｙ。

ｒｋ：　Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ＋　！ｎｃ、＋　１９８３）］を参照。

オリゴヌクレオチド上に脂質の残余を残すように脂肪酸を切断する他のリパーゼ よりもホスホリパーゼＣまたはＤによって切断を最大にするのが好ましい。

本発明に適したリン脂質には、例えば、ホスホグリセリド、プラスマロゲン、お よびその他のホスファチジン酸、スフィンゴミエリン、および３’−０−アミノ アシルホスファチジルグリセロールが含まれる。

コンジユゲートの「オリゴヌクレオチド」部分とは、目的のヌクレオチド配列、 または目的のヌクレオチド配列にハイブリダイズするに十分に相補性であるヌク レオチド配列を有する２個またはそ詐以上のデオキシリボヌクレオチドまたはり ボヌクレオチドからなる分子を意味する。通常、オリゴヌクレオチドは、受容宿 主細胞において生化学的機能を発揮し、モして／または細胞機序の働きを変える ことができるものである。その正確な大きさは、オリゴヌクレオチドの最終的な 機能または用途に依存する多数の因子に依存するであろう。例えば、オリゴヌク レオチドをアンチセンスオリゴマーとして利用するときには、その特異性を確保 するために、この配列はｍＲＮＡ集団の中で唯一であり、かつ標的ＲＮＡに相補 性でなければならない。

１４ヌクレオチドの鎖長がオリゴヌクレオチドの配列特異性を規定するに十分で あろうと計算されている。Ｔｓ’Ｏら［「制御された薬物放出への生物学的アプ ローチｊ　、　Ｖｏｌ、５０７．　Ａｎｎ、Ｎ、Ｙ、Ａｃａｄ、５ｃｉｅｎｃｅ ｓ　（１９８７）］を参照。オリゴヌクレオチドの長さが増加すると形成される 二重螺旋の安定性が増加し、従ってその阻害作用が増加する。

他方、極めて長いオリゴマーは、オリゴヌクレオチド配列中の５〜１０個の連続 塩基だけが関与する塩基対合によって２またはそれ以上のｍＲＮＡと相互作用す ることができ、従ってオリゴヌクレオチドの特異性を低下させる。通常の使用の ためには、オリゴヌクレオチドは少なくとも５個の塩基を含有し、より好ましく は約５個〜約３０個の塩基を含有し、最も好ましくは約１４個〜約２５個の塩基 を含有する。

本発明におけるオリゴヌクレオチドは、目的のヌクレオチド配列を含有するか、 またはそれにハイブリダイズするに十分相補性であるように選ばれる。即ち、こ のオリゴヌクレオチド配列は、目的のヌクレオチド配列の正確な配列を反映する 必要はない。例えば、非相補性のヌクレオチドフラグメントをオリゴヌクレオチ ドの５′末端に結合させてもよい：この配列の残りの部分は目的のヌクレオチド 鎖に相補性である。別法では、非相補性の塩基またはより長い配列をオリゴヌク レオチド中に配置することができる（この配列が標的核酸とハイブリダイズする ことができるという条件のもとて）。

また、本明細書における「オリゴヌクレオチド」なる用語には、塘−リン酸ジエ ステル骨格を修飾して細胞性ヌクレアーゼに対する感受性を減少させ、そして必 要とされる細胞による吸収を増加させたオリゴヌクレオチドが含まれる。１つの 例は、ｖａｎ　ｄｅｒ　Ｋｒｏｌら（上記）によりその表１に記載されているよ うなメチルホスホネート類であり、ここでは酸素原子の１つがメチル基で置換さ れてリン原子上に４つの異なる置換基を有する結果になっている。ＨＳ　Ｖ−１ の即時型のｍＲＮＡ−４および−５に指向性のオリゴマーメチルホスホネート類 は、クリームの形態でマウスのＨ３Ｖ感染した耳に適用したときにヘルペス性病 変の発現を防止し、４０　ｍｇ／　ｋｇ体重までの濃度で静脈内注射したときに マウスに毒性ではないことがわかった［Ｍｉｌｌｅｒら、Ａｎｔｉ−Ｃａｎｃｅ ｒ　Ｄｒｕｇ　Ｄｅｓｉｇｎ　３：　１１７−１２８　（１９８７）；　Ｔｓ’ Ｏら（上記）コ。さらに、ホスホロチオエート類はウィルス増殖、セにＨＩＶの 強力な阻害物質であることがわかった［Ｍａｔｓｕｋｕｒａら、　Ｐｒｏｃ、Ｎ ａｔｌ。

Ａｃａｄ、　Ｓｃｒ、ＵＳＡ　８４：　７７０８−７７１（１（１９８７）；Ａ ｇｒａｗａｌら、Ｐｒｏｃ、ＮａｔｌＡｃａｄ。

Ｓｃｉ、ＵＳＡ　８５：　７０７９−７０Ｈ（１９８８）］。

さらに、「オリゴヌクレオチド」の定義には、相補配列に対する親和性を増加さ せる脂質に加えて共有結合させた試薬を含むオリゴヌクレオチドが含まれる。例 えば、アンチセンスｖＳｖオリゴヌクレオチドの３′末端にポリ（Ｌ−リジン） を結合させ、これを用いてその抗ウィルス活性を高めることができる。また、ホ スホロチオエート　オリゴマーをポリ（Ｌ−リジン）に結合させて有効用量を低 くすることができる。さらに、ホスホロチオエート　オリゴヌクレオチドは、ヌ クレアーゼによる切断に対して安定であり、水に極めてよく溶解し、そして対応 するメチルホスホネート類似体よりも相補ＤＮＡ配列と効率的にハイブリダイズ するので本発明において有用である。例えば、Ｍ　ａｒｃｕｓ−Ｓ　ｅｋｕｒａ ら［Ｎｕｃｌ、Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　１５：　５７４９−５７６３（１９８７ ）］を参照。アクリジンなどの挿入試薬をオリゴヌクレオチドの３′末端に付加 して標的に対するその親和性を高めることができる。その他の方法には、アンチ センスオリゴマーに、標的の核酸を不可逆的に修飾するための反応性物質［アル キル化試薬、金属錯体、例えばＥＤＴＡ−Ｆｅ（ＩＩ）、０−フェナントロリン −Ｃｕ（１）、またはポルフィリン−Ｆｅ（ＩＩ）などが含まれる］を結合させ ることが含まれる。

このような化合物は、分子酸素と還元剤の存在下でヒドロキシルラジカルを生成 し、標的の核酸骨格を攻撃した後に相補鎖を切断する。

さらに、ブソラレン誘導体、アジドフエナ／ル、およびプロフラビンなどの光架 橋剤をオリゴマーに結合させることができる。

好ましい態様では、本フンシュゲートは以下の式で示される：Ｌ−（［（ｘ−ｚ ）］ｎ−［ｘ−ｐ（＝ｙ）ｏ−＋、）、−Ａ（式中、しはステロイド部分、Ｒ３ 、またはＲ，−Ｘ−ＣＨ（Ｒ，）−ＣＨ（−Ｘ−Ｒ，）−ＣＨ。

（ここで、Ｒ８はＣ，−Ｃ，。アルキル、Ｃ、−Ｃ，。モノ、ジもしくはポリ不 飽和アルキル、Ｃ３−Ｃ，シクロアルキル、またはＣ，−Ｃゎモ／、ジもしくは ポリ不飽和シクロアルキル基であす、Ｒｔ、Ｒ３、およびＲ４は独立してＨ，Ｒ ，、またはα−アミノアシルである）であり： Ｘは０．５ＳＮＨ，Ｃ（＝Ｏ）、Ｃ（＝Ｏ）ＯｌＯＣ（＝Ｏ）、ＮＨＣ（＝○） 、またはＣ（＝○）ＮＨであり；ＹはＯまたはＳであり； ＺはＣ，−Ｃ，。飽和またはモノ、ジもしくはポリ不飽和アルキレン部分であり ： ｎ、ｍおよびｙは独立して０〜約１０の整数であり；そしてＡは以下からなる群 から選ばれる： （ヌクレオチド間のリン酸から） （Ｎ−塩基から）、または ［式中、Ｂは脱保護した塩基であり、ｐは約５〜３０の整数であり、ｑおよびｒ は約１〜２８の整数であり（ただし、ｑ＋ｒは約４〜２９である）、Ｓおよびｔ はＯ〜約２９の整数であり（ただし、ｓ＋ｔは約４〜２９である）、ＥはＸまた はＺＸであり、モしてＤは以下からなる群から選ばれる（ここで、環窒素からの 結合がオリゴヌクレオチドの糖部分に結合している）： コ）。

本明細書で用いる「アルキル」および「シクロアルキル」なる用語は、直鎖およ び分岐鎖のアルキル基ならびに直鎖もしくは分岐鎖のアルキル基が環に付いてい るシクロアルキル基を意味する。「モキレン（２価アルキル）部分は、それらの 鎖のどこかに１またはそれ以上の炭素−炭素の二重もしくは三重結合を含んでい る炭化水素を意味する。Ｌが不飽和の環式または非環式のＲ２である化合物の例 には、テルペン類、例えばフィトール、ゲラニオール、リモネン、ファルネソー ルおよびスクアレンなど、ビタミン類、例えばビタミンＡ、Ｄ、に、およびβ− カロチン、ならびにプロスタグランジン類が含まれる。

Ｌがステロイド部分であるときには、それはステロールであるのが好ましく、さ らに好ましくはそのＣ８位のヒドロキシル基でオリゴヌクレオチドに結合してい るステロール（エーテルまたはエステルとして）である。適当なステロイド類の 例には、コレステロール、ラノステロール、植物性ステロール、または菌類ステ リン、例えばエルゴステロールなどが含まれる。

ＬがＲ，−’Ｘ−ＣＨ（Ｒ，）−ＣＨ（−Ｘ−Ｒ，）−ＣＨ，であり、Ｒ２、Ｒ ３およびＲ４がＲ１と定義されるときには、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４が結合して付 加的な炭素−炭素結合を形成していてもよい。好ましくは、Ｒ２およびＲ３は独 立してＨまたはＣ１゜−Ｃ２゜の飽和または不飽和のアルキル基であり、Ｒ４は ＨまたはＲｏであり、ＸはＯ，ＮＨ，ＮＨＣ（＝Ｏ）、Ｃ（＝Ｏ）、０Ｃ（＝Ｏ ）、まｆ、ｌ１ｃｃ＝ｏ’）○、最も好ましくはＯであり、ＹはＯであり、２は エチレンまたはカルボキシエチレンであり、ｎＳｍおよびｙはＯ〜２、より好ま しくはｙは１または２、ｍは１または２、およびｎは０または１であり、ｐは約 １０〜２５であり、ｑおよびｒは約１〜２３（ただし、その合計は約９〜２４で ある）であり、Ｓおよびｔは０〜約２４（ただし、その合計は約９〜２４である ）である。好ましくは、Ａはその５°末端で結合したオリゴヌクレオチドであり 、さらに好ましくはＸは０である。

ＡがＮ−塩基から結合しているときには、アデニン残基のＮ６から、またはシト シン残基のＮ４からであるのが好ましい。Ｒ２、Ｒ１および／またはＲ４、好ま しくはＲ２がα−アミノアシル部分であるときには、Ｈはいずれかのアミノ酸か ら、より好ましくは天然のアミノ酸から、そして最も好ましくはリジンから得ら れるのが好ましい。

標的鎖の翻訳を不活性化するために立体的に限定された挿入塩基を含有するオリ ゴヌクレオチドを得るのが所望であるときには、上記式中の塩基Ａの少なくとも １つは実質的に平面の塩基である。このように誘導体化されたオリゴヌクレオチ ドはその相補ＲＮＡまたはＤＮＡ鎖とハイブリダイズし、修飾されたヌクレオシ ドは対合しないままであるが、それでも立体化学的に正確に規定される方法で二 重螺旋中の隣接塩基対の間に挿入される。本発明によって可能になった立体的に 正確な標的化に照らして、この挿入部分を、相補ドメイン中の予め決めた部位を 共有結合修飾することが可能な反応性基で置換する。このような反応性基には、 架橋剤およびリン酸結合の切断剤が含まれる。これらの反応性基は立体的に制限 されており、標的の相補配列以外の部位で細胞成分または核酸と相互作用する可 能性が比較的少ない。

これに関連して「実質的に平面の」なる用語は、この基の立体的な大きさが、実 質的に相補性の核酸鎖中に存在する境界塩基と糖骨格によって定まる立体的な間 隙に近似される封筒状空隙の範囲内にあることを意味する。通常、この封筒状空 隙は、幅と奥行が約３０〜５０オングストロームであり、厚みが約３〜７オング ストロームである。その例には以下の構造を有するヌクレオシドが含まれる：Ｒ １ 〔式中、Ｒ３は芳香族ポリサイクルであり、ＹはＣまたはＮであり、Ｒ１はＮま たは＝　Ｃ（Ｒ、）−であり、Ｒ１およびＲ１はＨ５ハロゲン、ニトロ、アルキ ル、ヒドロキシアルキルまたはアルキルエーテル基（ここで、アルキル基は１〜 １０個の炭素原子を有する）であり、モしてＲ，はリボースまたはデオキシリボ ース糖である］。

（以下、余白） 目的の核酸配列にはｍＲＮＡおよびＤＮＡが含まれ、これらは核酸の制限酵素消 化物またはその他のフラグメント、例えば制限フラグメント長多形（ＲＦＬＰ） 中に存在していてよい。核酸または核酸群は任意の供給源から、例えばｐＢ　Ｒ ３２２などのプラスミドから、クローンしたＤＮＡもしくはＲＮ　Ａから、また は細菌、酵母、ウィルスおよび高等生物（植物もしくは動物など）を含む任意の 供給源由来の天然ＤＮＡもしくはＲＮＡから得ることができる。治療目的には、 標的ｍＲＮＡと効率的かつ特異的な相互作用、オリゴヌクレオチドの効率的な細 胞取込みおよび画分化、ならびに異なる細胞区画における十分な安定性を有する ようにアンチセンスオリゴヌクレオチドを選択すべきである。

診断目的には、このオリゴヌクレオチドは、ＡＩＤＳＳＩＩ瘍遺伝子、成長因子 、β−グロビンなどを含むウィルス感染の原因であるものなど、診断の際に有用 なタンパク質、例えば病原タンパク質をコードしている配列を含有していてよい 。さらに、タンパク質をコードしていない池の核酸が目的であってもよい（例え ば、転写もしくは翻訳コントロールドメインまたは法医学に有用な配列など）。

本発明のコントロールは、標的核酸の翻訳のアンチセンス阻害のための物質とし ての用途を有しているのが最も好ましい。このような用途は既に他のアンチセン スオリゴヌクレオチドを用いて広く検討されており［ｖａｎ　ｄｅｒ　Ｋｒｏｌ ら（上記）およびＶｏ　８３１０１４５１（１９８３年４月２８日公開）を参照 〕、これと実質的に同じ方法により、本発明のオリゴヌクレオチドは、アンチセ ンスＲＮＡ中の２次または３次構造がハイブリダイゼーションの程度または速度 に影響を及ぼすこともあることに留意しながら、標的ＲＮＡまたはＤＮＡの配列 および２次構造の情報に基づく論理的かつ特異的な計画を用いて使用されるであ ろう。この使用のためには、オリゴヌクレオチドは病原性核酸または膿瘍遺伝子 、より好ましくは、植物（野菜など）、動物（家畜、スポーツ用および農場動物 、例えばイヌ、ネコ、ウシ、ブタなど）、またはヒトに感染するウィルスまたは 寄生生物の核酸にハイブリダイズすることができるヌクレオチド配列を有してい る。例えば、アンチセンス　オリゴヌクレオチド（修飾または未修飾）を用いて 、ラウス肉腫ウィルス、水庖性口内炎ウィルス、Ａ型インフルエンザウィルス、 単純庖疹ウィルス、ヒト免疫不全ウィルス、ならびに植物ウィルス、例えばジャ ガイモウィルスＸ　コートタンパク質遺伝子およびキュウリモザイクウィルス　 コートタンパク質遺伝子のウィルス感染を阻害し、寄生生物感染、例えばマラリ ア感染を阻害し、そして原始膿瘍遺伝子ｃ−ｍｙｃ（白血病治療のため）、サル 肉腫ウィルス、β−グロビンおよびβ−チューブリン遺伝子の発現を減少させる ことができる。阻害作用を有するウィルス配列の公表された例には、ラウス肉腫 ウィルスに対する配列［Ｚａｉｅｃｎｉｋおよび５ｔｅｐｈｅｎトＴ−細胞リン ホトロピノクウイルスＩＩＩ型に対する配列［Ｚａｍｅｃｎｉｋら、Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ、ｓｃｉ、ＵｓＡ　８３：　４１４３−４１４６　（１９８ ６）；　１０８７１０７３００（１９８７年１２月３日公開）］、および単純庖 疹ウィルスＩ型に対する配列［Ｓｍ１ｔｈら、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、ＵＳＡ　８３：　２７８７−２７９１　（１９８６）］が含まれる。

病原性核酸を不活性化するための有用なオリゴヌクレオチドの定義内に含まれる のは、標的の核酸と反応してそれを不活性または非機能的にする官能基を含み、 標的の病原性配列に相補性であるオリゴヌクレオシドアルキルまたはアリールホ スホネート類似体である。これらの誘導体はＥ　Ｐ　２６６、０９９（１９８８ 年５月４日公開）に記載されている。

他の態様においては、本オリゴヌクレオチドは、フンシュゲートが標的としてい る宿主細胞にとって内生である酵素によって特異的に認識される切断部位である ヌクレオチド配列またはこの部位にハイブリダイズすることができるヌクレオチ ド配列を有している。例゛えば、本オリゴヌクレオチドはＲＮアーゼ−Ｈ酵素に よって認識される配列を包含していてもよい。この酵素はインビボでＲＮＡ／Ｄ ＮＡハイブリッドのＲＮＡ部分を切断し、次いでｍＲＮＡを分解する結果になる 。即ち、アンチセンスオリゴマーの作用をＲＮアーゼ−Ｈ活性によって触媒的に 高めることができる。

ブレーｍＲＮＡのスプライス点はスプライス過程に関与する小さなリボ核タンパ ク質粒子のＲＮ　Ａと相互作用するので、このメソセンジ皐−のこれら領域が相 補性オリゴマーにとって理想的な標的である。即ち、本発明には、スプライス点 の部位に指向性のアンチセンスＤＮＡまたはこれらの類似体が、特にこのような アンチセンスＤＮＡがＨＩ’Ｖの増殖［Ａｇｒａｗａｌら、　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ ｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　８５：　７０７９−７０８３（１９８８）コ、 Ｈ３Ｖの増殖［Ｓｍ１ｔｈら＋　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、Ｉ］ ＳＡことが見い出されたときに含まれる。さらに、本発明は、ｍＲＮＡのキャッ プ部位または開始コドン領域と相互作用するように設計された相補性のオリゴマ ーに関する。また、リポソーム付着部位をブロックするアンチセンス　オリゴマ ーがこの目的に極めて有効であることが示されている。

本発明のオリゴヌクレオチドは通常の方法を用いて、例えばリン酸トリエステル 法もしくはリン酸ジエステル法［それぞれ、Ｎａｒａｎｇ＋Ｓ、　Ａ、ら、　Ｍ ｅｔｈ、Ｅｎｚｙｍｏｌ、　６８：　９０　（１９７９）およびＢｒｏｗｎ、　 Ｅ、　Ｌ、ら、肋遅いＥｎｚｙｍｏｌ、競：　１０９　（１９７９）に記載され ているコ、またはそれらの自動化された態様を用いて適切に調製される。このよ うな自動化された態様の１つでは、ホスホルアミダイトが出発物質として用いら れ、これはＢ　ｅａｕｃａｇｅら［Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　Ｌｅｔｔｅｒｓ　 ２２：　１８５９−１８６２　（１９８１）コの記載のようにして合成すること ができる。修飾された固体支持体上でオリゴヌクレオチドを合成するための方法 の１つが、米国特許Ｎ　ｏ、　４．４５８．０６６（１９８４年７月３日発行） に記載されている。また、生物学的供給源から単離されたオリゴヌクレオチド、 例えば制限エンドヌクレアーゼ消化物を利用することも可能である。

本コンジュゲートは適当な方法のいずれかによって調製する。例えば、Ｌｉｎｄ ｈおよびＳ　ｔａｖｉｎｋｉ［Ｊ、　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　 、　５ｙｎｐ、　Ｓｅｒ、　Ｎｏ。

１８、１８９　（１９８７）］が記載しているように、Ｈ−ホスホネート法を用 いてリン脂質フンシュゲートを合成することができる。また、Ｂ　ｅａｕｃａｇ ｅおよびＣａｒｕｔｈｅｒｓ［Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　Ｌｅｔｔ、　、１８５ ９（１９８１）］ならびにＭｃＢｒｉｄｅおよびＣａｒｕｔｈｅｒｓ［Ｔｅｔｒ ａｈｅｄｒｏｎ　Ｌｅｔｔ、　、　２４５（１９８３）］が記載しているような ホスホルアミダイトの化学を用いて同化合物の合成を行うことができる。Ｈ−ホ スホネート法を用いる主な利点は酸化法の融通性である。アミンの存在下に四塩 化炭素を用いて酸化を行うときにはホスホロアミダイトが利用可能であり、一方 、イオウによる酸化はホスホロチオエート類似体を導き、アルコールの存在下で の四塩化炭素によってリン酸トリエステルが得られる［Ｆｒｏｅｈｌｅｒ、Ｔｅ ｔｒａｈｅｄｒｏｎ　Ｌｅｔｔ、２７：　５５７５　（１９８６）コ。

通常の固体支持ＤＮＡ合成プロトコールによるオリゴデオキシヌクレオチドへの 脂質の化学的結合を、脱ブロックの条件（即ち、濃アンモニア）に通常は安定で ある脂質に対して使用することができる。このような脂質には、エーテル脂質ま たはアミド脂質（その骨格にアミド官能基を含むステロール類およびトリグリセ リド類を包含する）が含まれる。エステル結合を含む脂肪酸由来の脂質は、通常 、このような条件に安定ではないであろう。この後者の脂質は、Ｃｈｕら［＋！ ｕｃ１．Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　１１：　６５１３−６５２９　（１９８３）］ の方法を用いてコンジュゲート化することができる。この方法は、脂質が遊離の 第一または第ニアミ７基を含んでいることを必要とする。この脂質は、例えばホ スファチジルエタノールアミン、ホスファチジル３’−０−アミノアシルグリセ ロールおよびホスファチジルセリンの場合のように側鎖にこのようなアミノ基を 既に含有していてもよく、また、このようなアミ７基を含むように誘導してもよ い。Ｃｈｕらの方法を用いて、このアミノ脂質をオリゴマー−５゛−ホスフェー トに結合させて脂質オリゴヌクレオチドのコンジュゲートを得る。また、ヌクレ オシド脂質コンジュゲートの合成に対して報告されているように［５ｈｕｔｏら （上記）を参照］、ホスホリパーゼＤを用いて酵素的にリン脂質をオリゴヌクレ オチドに適切に結合させることもできる。

本発明のコンジュゲートの用途の１つは、宿主細胞をトランスフェクシジンして その中にＤＮＡを安定に導入するためのものである。

このトランスフエフシランは、室温で少なくとも約１５時間、好ましくは約２０ 〜３０時間撹拌することなどによって、細胞をコンジュゲートと単に接触させる ことからなる。

別の用途は、病的状態の原因である核酸をブロックするヌクレオチド配列を有す るオリゴヌクレオチドの使用によって緩和または治療される病的状態を有する哺 乳動物を処置するためのものである。

このような状態の例には、腫瘍遺伝子によって引き起こされる状態、およびＡＩ ＤＳ、ヘルペス、肝炎などのウィルスによって引き起こされる感染が含まれる。

処置される哺乳動物は任意の哺乳動物種であってよく、例えば家畜および農場動 物（霊長類を含む）、およびスポーツまたは愛玩動物、ならびにヒトであってよ い。しかし、処置される好ましい種はヒトである。

本コンジュゲートは任意の適切な方法によって患者に投与され、これには非経口 、舌下、局所、肺内、および鼻内投与が含まれる。

具体的な投与経路は、例えば必要とされる治療の種類に依存するであろう。非経 口投与の例には、筋肉内、皮下、静脈内、動脈内、および腹腔内投与が含まれる 。

治療に用いられるフンシュゲートは、個々の患者の臨床状態、治療を必要とする 状態の原因、コンジュゲートの放出部位、投与方法、投与計画、および開業医に は既知のその他の因子を考慮に入れ、適切な医学的慣例に一致するように用量化 および製剤化されるであろう。即ち、本発明のための「有効量」はこのような考 慮によって決定される。

一般的には、１用量あたりに非経口投与されるコンジュゲートの合計の薬学的有 効量は約１μｇ／ｋｇ／日〜１００　ｔａｇ／　ｋｇ／日の範囲内であろうが、 上に記したように、これは多分に治療的判断に支配されるであろう。適切な用量 を選ぶ際の重要因子は、感染の排除もしくは腫瘍の減少によって、または開業医 が適切と考えるその他の基準によって測定されるような、得られる結果である。

非経口投与用には、通常、望ましい純度のフンシュゲートを、単位投与注射剤形 （溶液、懸濁液、または乳濁液）として、薬学的に許容しうる担体、賦形剤また は安定剤、即ち使用する用量および濃度で受入体に非毒性であり、製剤の他の成 分と適合する物質と混合することによって製剤化する。このような物質には、疎 水性ポリマー、単糖、三糖、および他の炭水化物（セルロースもしくはその誘導 体、グルコース、マンノース、またはデキストリンを含む）、糖アルコール（マ ンニトールまたはソルビトールなど）、および／または非イオン性界面活性剤（ ツイーン、プルロニック、またはＰＥＧなど）が含まれる。

通常、この製剤は、コンジュゲートを一様かつ緊密に液体担体、均質なリン脂質 混合物（リポソーム封入用）、または細かく分割した固体担体と接触させ、次い で必要ならこの生成物を所望の製剤形にすることによって調製する。

好ましい担体は非経口担体であり、受入体の血液と等張である製剤がさらに好ま しい。コンジュゲートが所望の純度を有しているときに、これを生理学的に許容 しうる担体、賦形剤または安定剤と混合することによって保存または投与用に調 製する。このような物質は使用される用量および濃度で受入体に非毒性であり、 コンジュゲートの水溶性に依存するであろう。コンジュゲートが水溶性であると きには、それは好ましくはｐＨ約７〜８でリン酸または他の有機酸の塩などの緩 衝液で製剤化してよい。コンジュゲートがそれほど水溶性ではないときには、そ の溶解性を増加させるために０．０４〜０．０５％（ｗ／ｖ）の量で非イオン系 界面活性剤（ツイーン、プルロニックまたはＰＥＧ、例えばツイーン８０など） と製剤化することにより、微細乳濁液として調製してよい。

所望により、他の成分、例えば抗酸化剤（アスコルビン酸など）；低分子量（約 １０残基を越えない）ポリペプチド（ポリアルギニン末たはトリペプチドなど） ：タンパク質（血清アルブミン、ゼラチンまたは免疫グロブリンなど）；親水性 ポリマー（ポリビニルピロリドンなど）；アミノ酸（グリシン、グルタミン酸、 アスパラギン酸またはアルギニンなど）：単糖、三糖および他の炭水化物（セル ロースもしくはその誘導体、グルコース、マンノースまたはデキストリンなど） ：キレート化剤（ＥＤＴＡなど）：および糖アルコール（マンニトールまたはソ ルビトールなど）を添加してもよい。

治療投与に使用するコンジュゲートは滅菌されていなければならない。滅菌は滅 菌濾過メンプラン（例えば、０．２ミクロンのメンブラン）で濾過することによ り容易に達成される。通常、本コンジニゲートは凍結乾燥形で、または水溶液も しくは乳濁液として保存される。

また、本発明フンシュゲートについての言及の全てにこの化合物の薬学的に許容 しつる塩が含まれ、ある種の上記賦形剤、担体または安定剤の使用によってこの ような塩が形成される結果になることは理解されよう。薬学的に許容しうる塩の 例には、アルカリ土類（ナトリウムまたはマグネシウムなど）、アンモニウムま たはＮＸ、°（ここで、ＸはＣ１，□４アルキルである）の塩が含まれる。その 他の薬学的に許容しうる塩には、何機カルボン酸、例えば酢酸、乳酸、酒石酸、 リンゴ酸、イセチオン酸、ラクトビオン酸およびコハク酸；有機スルホン酸、例 えばメタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸およびｐ−）ル エンスルホン酸：ならびに無機酸、例えば塩酸、硫酸、リン酸およびスルファミ ン酸が含まれる。ヒドロキシ基を有する化合物の生理学的に許容しうる塩には、 この化合物のアニオンとＮａ−１ＮＨ，”、およびＮＸ、°（ここで、ＸはＣ１ −、アルキル基である）などの適当なカチオンの組合せが含まれる。

通常、治療用のフンシュゲート組成物は、滅菌出入口を備えた容器、例えば皮下 注射針で突き通しうる栓を備えた静脈内溶液バッグまたはバイアル中に入れられ る。

また、本発明のコンジュゲートは持続放出系によって適切に投与される。持続放 出組成物の適当な例には、例えばフィルムまたはマイクロカプセルなどの一定の 形状を有する形態の半透過性ポリマーマトリックスが含まれる。持続放出マトリ ックスには、ポリラクチド［米国特許Ｎ　ｏ、　３．７７３．９１９、ＥＰ　５ ８，４８１］、Ｌ−グルタミン酸とγ−エチルーＬ−グルタメートのコポリｖ− ［Ｌｌ、　Ｓｉｄｍａｎら、　Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ　！２：　５４７−５５ ６　（１９８３）］、ポリ（２−ヒドロキシエチルメタクリレート）ｊＲ，Ｌａ ｎｇｅｒら、　Ｊ、Ｂｉｏｍｅｄ、Ｍａｔｅｒ、Ｒｅｓ、　１５：　１６７−２ ７７　（１９８１）；およびＲ１Ｌａｎｇｅｒら、　Ｃｈｅｍ、Ｔｅｃｈ、　１ ２：　９８−１０５　（１９８２）］、エチレンビニルアセテート［Ｒ，Ｌａｎ ｇｅｒら（同上）コ、またはボッ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸［ＥＰ　１ ３３，９８８］が含まれる。

さらに、持続放出コンジュゲート製剤にはリポソームに捕捉させたコンジュゲー トが含まれる。このような系は、生物学的に活性な物質を食作用によって組織中 に、特に網内細胞系の組織中に導入することができるという利点を有している。

コンジュゲートを含有するリポソームは自体既知の方法によって製造されるが、 これら方法Ｐｒｅｓｓ　（１９８４）；　ＥＰ　５２，３２２：　ＥＰ　３６， ６７６；　ＥＰ　８ｇ、０４６：　ＥＰ　１４３，９４９；　ＥＰ　１４２，６ ４１；日本特許出願８３−１１８００８；米国特許Ｎｏ、　４．４８５．０４５ ．　Ｎｏ。

４、７７４．０８５．　Ｎｏ、　４．５４４．５４５；およびＥＰ　１０２，３ ２４゜さらに、このリポソームは、ＷａｎｇおよびＨｕ　ａ　ｎｇ　［Ｐｒ０ｃ 、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ８４　：　７８５１−７８５５　（１９ ８７）］の教示のように、細胞による取込みを増加させるために抗体被覆されて いてもよい。得られたリポソームは、例えばラクトースなどの安定剤を添加した 後に数週間または数カ月まで水相中で保存することができる。

生成するリポソームの大きさは、例えば、活性成分および脂質成分の構造、脂質 成分の混合比、ならびに水性分散液中のこれら成分の濃度に依存する。即ち、例 えば脂質成分の濃度を増加または減少させることによって、小さいかまたは大き いリポソームの含量が高い水相を得ることができる。通常、このリポソームは脂 質含量が約３０モル％コレステロール以上である小さな（約２００〜８００オン グストローム）単一模型のものであり、最適な治療法のために選択比率を調節す る。

非経口投与のためには、リポソームを含有する水性分散液を通常の濃厚剤（例え ば、ヒドロキシプロピルセルロース）、適当な保存剤および抗酸化剤と適切に混 合し、これを皮膚または粘膜に適用するためのローションまたはゲルの形態で使 用することができる。非経口用には、リポソームに富む水性分散液を適当な担体 液、例えば所望によりｐＨ７，２〜７．４に緩衝化された滅菌したカルシウム不 含の等張な塩化ナトリウムまたはグルコース溶液に懸濁させることができる。

体重が約７０ｋｇのヒトに適用する用量は、約０．１〜５００ｍｇの捕捉された フンシュゲートを含有する約２００ｍｇ〜１ｇのリポソームの範囲内であると概 算される。しかし、封入される物質の最高および最低用量、水相中のリン脂質の 濃度、ならびに封入リン脂質の割合は臨床試験で実験的に確かめられる結果に従 って変化してよく、「有効量」はそのようにして得られた治療結果に従ってよい 。

本発明に係るリポソームの医薬投与系は、リン脂質およびコンジュゲートを含有 するバイアルまたはビンを含むキットを構成していてもよい。

アンチセンスオリゴマーを癌治療に使用しようとするときには、コンジュゲート 療法は５−フルオロウラシルなどの通常の化学療法薬物と組合せて有用となるこ ともある。アンチセンスオリゴマーがＡＩＤＳ治療に有用であるようにするとき には、ＡＺＴ、ＣＤ−４およびその他の実験的ＡＩＤＳ治療薬物と組合せると有 用なものとなろう。

本発明のコンジュゲートを診断用に使用しようとするときには、これを適当なラ ベル部分でラベルする。通常はオリゴヌクレオチドがラベルされる。適当なラベ ルには、放射活性ラベル、例えば３１Ｐ１１ｔｓ■、ｓｓ３など、ならびに非放 射活性ラベル、例えばビオチン、チロキシン、酵素（例えば、ヒドロラーゼ、ペ ルオキシダーゼまたはホスファターゼ）など、および種々の化学ルミネセンス物 質、例えばルシフェリン、または蛍光化合物、例えばフルオレセインおよびその 誘導体が含まれる。

ラベルしたコンジュゲートが有用である診断法の１つは、固体支持体上へのオリ ゴマープローブの固定化によって、試料中の予め決めたヌクレオチド配列を有す る核酸を検定する方法である。脂質部分を介してプローブを疎水性表面に固定化 すると、例えばサザーン・プロットまたはドツト・プロットを用いるときよりも 水リボヌクレオチドがよりハイブリダイズしやすくなる。また、本方法において は、サザーン・プロｙ）に必要なヌクレオチドの固定化のための加熱に代えて、 コンジュゲート溶液でフィルターを洗浄することが必要になるだけである。

本発明の方法は、ラベルされた形態のコンジュゲートを支持体、好ましくはアガ ロースゲルまたは濾過膜などの固体マドｌルックス上に固定化し、試料中に核酸 が存在しているときにはこの核酸がコンシュゲートのオリゴヌクレオチド部分と ハイブリダイズするように試料を固定化コンジュゲートと接触させることからな る。ハイブリダイゼーションの条件は周知であり、これにはＭａｎｉａｔｉｓ　 ［Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎ ｕａｌ（Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ：　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　）ＩａｒｂｏｒＬａｂ ｏｒａｔｏｒｙ、　１９８２）］が記載している条件が含まれる。このようなハ イブリダイゼーションの後に、通常は支持体を洗浄してハイブリダイズしていな い物質を除去し、次いでラベルしたオリゴマーの存在を測定する。

ここで「試料」なる用語は、検定しようとする核酸を含んでいるか、または含ん でいる可能性があるあらゆる液体または生物学的試料を意味する。即ち、この用 語には、ヒトまたは動物の体液、例えば血液、血清、尿、羊水、組織抽出物、脳 を髄液などの液体が含まれる。

上記の診断法は、感染性疾患、遺伝子障害または細胞障害、例えば癌などに関係 した特別の核酸配列（例えば、腫瘍遺伝子）の検出に有用である。遺伝子障害に は、あらゆる生物由来のゲノムＤＮＡ中の特異的な欠損および／または突然変異 、例えば鎌型赤血球貧血、資性線維症、α−地中海貧血、β−地中海貧血などが 含まれる。感染性疾患は、原因微生物に特徴的な特異的なりＮＡ配列の臨床試料 中での存在によって診断することができる。これらには、サルモネラ属、クラミ ジア属およびナイセリア属などの細菌、肝炎ウィルスなどのウィルス、ならびに マラリアの原因となるプラスモジウム属などの寄生生物が含まれる。

疾患が鎌型赤血球貧血およびβ−地中海貧血などのように特異的な核酸配列中の 少なくとも１つの特異的な制限部位の存在または非存在を特徴とするときには、 これを制限酵素の使用によって検出することもできる。即ち、上記の方法におい て、支持体を洗浄した後に制限エンドヌクレアーゼで固定化コンジュゲートを処 理してコンジュゲートのオリゴヌクレオチド部分内の制限部位を切断し、ラベル および未ラベルのオリゴマーフラグメントを得る［米国特許Ｎｏ、４゜７２５、 ５３７（１９８８年２月１６日発行）の記載のようにコ。次いで、ラベルしたオ リゴマーフラグメントを検出する。即ち、疾患が鎌型赤血球貧血であるときには Ｄ　ｄｅ　Ｉ　［Ｇｅｅｖｅｒら、　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、 　７８：　５０８１−５０８５　（１９８１）］またはＭｓｔｌｌ［０ｒｋｉｎ ら、Ｎ、Ｅｎｇｌ、Ｊ、Ｍｅｄ、３０７：　３２−３６（１９８２）］を用いる ことができる。

別の態様の診断においては、上記のようにして調製したコンジュゲートとラベル を導入したリポソーム（例えば、封入による）をヒトの全身性エリテマトーデス の検出に用いる。この方法は、エリテマトーデスの自己抗体が存在しているとき には（活性なエリテマトーデスを宵する患者に含まれている）それらがリポソー ムのオリゴヌクレオチドと結合するような条件のもとで、ヒト患者からの血清を リポソームと接触させ（ここでは、本コンジュゲートはエリテマトーデス特異的 な抗原として作用する）、それによってリポソームを安定化または不安定化させ 、そしてラベルの存在または非存在を測定することからなる。オリゴヌクレオチ ドへの結合がリポソームを不安定化するときには、ラベルが放出され、この放出 ラベルの量を測定する。結合がリポソームを安定化するときには、ラベルは存在 せず、検出されないであろう。通常、この検定は血清を室温で１分間インキュベ ートすることからなり、通常の微量滴定プレートで行うことができ、多数の血清 を短時間でスクリーニングすることを可能にする。インキュベートに用いる条件 は、Ｊ　ａｎｏｆｆら［ＣＩ　ｉｎ、　Ｃｈｅｍ。

２９：　１５８７−１５９２　（１９８３）］およびＥ　Ｐ　９０，７３５（１ ９８３年１０月５日発行）に記載されているエリテマトーデスの比色試験に用い られている条件が適当である。これらの参考文献はリポソーム安定化の態様を開 示している。

エリテマトーデスの検出に好ましいコンジュゲートのオリゴヌクレオチドは２本 鎖であるが、これはその方が抗体によぐ精舎するためである。これは、当業者に は周知であるように、ヘアピン２本鎖核酸を合成することによって得ることがで きる。

本発明のコンジュゲートを用いる別の方法は、各種成分の混合物から核酸（例え ば、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド）を分離、単離または精製する ことにある。この方法は、脂質が存在していることによるコンジュゲート上のオ リゴヌクレオチドの変化した物理的性質を利用する。使用されるコンジュゲート は、精製される核酸内に含まれる配列に実質的に相補性であるオリゴヌクレオチ ド上のヌクレオチド配列を有するコンジ一ゲートである。

このような使用の１つでは、フンシュゲートの脂質を利用してオリゴヌクレオチ ドを疎水性表面を有する固体支持体、例えばプラスチック、シラン処理ガラス、 アルキルセファロースもしくはその他の疎水性相互作用クロマトグラフィー支持 体、またはＲＰ−ＨＰＬＣマトリックス（例えば、Ｃ８Ｖｙｄｅｃなどのアルキ ルシリカゲル）に固定化する。この目的のために、フンシュゲートをリン酸緩衝 液などの緩衝液中に溶解し、得られた溶液をカラムで洗浄することが必要になる だけである。このような水性条件下では脂質はカラムに吸着されるであろう。次 いで、この固体支持体を相補性の標的核酸を含む試料で処理すると、この核酸は 当業者には周知であるようなハイブリダイゼーションを可能にする条件のもとて 支持体にハイブリダイズする。このハイブリダイゼーションの後、混合物を適用 するのに用いた条件とは異なる温度または塩条件のもとて支持体を洗浄して、所 望の核酸を変性し、それを単離する。次いで、カラムをアセトニド・リルまたは その他の有機溶媒で洗浄することによってフンシュゲートをカラムから回収する ことができる。

核酸を分離するための本方法の別のこのような利用においては、水と混和しない 相から相補性の標的核酸を移送するためにフンシュゲートの脂質部分を利用する 。即ち、分離しようとするオリゴヌクレオチド内に含まれる配列にハイブリダイ ズすることができるヌクレオチド配列を有するフンシュゲートを抽出用の適当な 容器中、オクタツールなどの疎水性の相中に得、Ｕ−管などで有機相から水相に 移す。同様に、標的核酸を含有する混合物を容器中、水などの親水性の相中に得 る。また、この容器は、所望の核酸を移すための核酸を全く含まない水相、好ま しく・は純水をも含んでいる。本コンジュゲートは水性および疎水性の両相に部 分的に可溶性であり、そのオリゴヌクレオチド部分は適当なハイブリダイゼーシ ョン条件のもとて標的鎖にハイブリダイズし、次いでこの鎖を疎水性の相から純 粋な親水性の相に移送する。この方法は実質的に特異的かつ選択的なりＮＡ抽出 法である。

以下・の実施例を参照することによって本発明をさらに完全に理解することがで きよう　Ｌか（し、これらを本発明の範囲を限定するものと考えてはならない。

１．２−ジーＯ−ヘキサデシルーｒａｃ−グリセロール（Ｓ　ｉｇｍａ）　（３ ４２ｍｇ：０．６３ＩＩモル）をピリジンから２回蒸発させ、次いでピリジンと 塩化メチレン（１：　１）（６ｍｌ）に溶解した。フラスコをアルゴンで満たし た後、この溶液を室温で撹拌しながらｖａｎ　Ｂｏｏａ＋試薬［Ｍａｒｕｇｇら 、　Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　Ｌｅｔｔ、　２７：　２６６１　（１９８＆）］ （１，２５Ｍのジオキサン溶液を０．５２ｍ１）で処理した。酸性モリブデン染 色で可視化を行うＥＭシリカゲル６０Ｆ、ｓ、前被覆プレートによる薄層クロマ トグラフィーによって測定して反応が完結していたら（出発物質はＲｆＯ８５３ を有し、生成物はＲｆｏ、２４を有する）、この溶液を塩化メチレン（１０ｍｌ ）で希釈し、次いで１Ｍ炭酸水素トリエチルアンモニウム（ＴＥＡＢ）水溶液を 用いて数回振盪した。この有機層を無水・硫酸ナトリウムで乾ｔＬ、ｌ！過し、 そして真空下で蒸発させた。

５ｉ０−．５〜２０％メタノール／塩化メチレン（１％トリエチルアミンを含む 、次いでトリエチルアミンの代わりに１％酢酸を含む）を用い、８Ｍシリカゲル ６０（７０〜２３０メツシユ）を用いて行うカラムクロマトグラフィーとそれに 続いて行うＩＭ　ＴＥＡＢによる最も純粋な分画の抽出によって、１．２−ジー Ｏ−ヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロ−３−Ｈホスホネートを白色に近いトリエ チルアンモニウム塩として得た（７６％収率）。

Ｖａｒｉａｎ　ＶＸＲ−３００Ｓ分光計を用いて’ＨＮＭＲスペクトルを取り、 ＴＭＳを内部標準として用いてｐｐｍ（ｄ）で記録した。この結果は以下の通り である：’ＨＮＭＲ（ｄ）：６．８６（ｄ、Ｊ＝６１６Ｈｚ、Ｈ−Ｐ）：３．９ ０（ｄｄ、Ｊ＝４．２および７．７Ｈｚ、Ｈ，Ｃ−０Ｐ）；３．６０−３．４０ （ｍ、７Ｈ，Ｈ，Ｃ−０−ＨＣ−Ｈ，Ｃ−ＯＨｔＣ）；２．８２（ｑ、Ｊ＝７． ２Ｈｚ、６Ｈ２（ＨｔＣ）ｓ　Ｎ）：１．５４（ｍ、４Ｈ１２（ＣＨｔＣＣｏ） ）：　１．２５（ｂｓ、２６Ｈ）；　１．１９（ｔ、Ｊ＝７．２Ｈｚ、９Ｈ１（ Ｈ−ＣＣ）ｓ　Ｎ）；　Ｏ。

８７　（ｂ　ｔ　、Ｊ　＝６．３　Ｈｚ、６Ｈ，２（ＨｓＣＣ３ｓ））。

２７：　４６９　（１９８６）］　；　Ｆ　ｒｏｅｈｌｅｒ、　Ｂ、　Ｃ，ら［ Ｎｕｃｌ、Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　１４：　５３９９（１９８６）コ；　Ｆ　ｒ ｏｅｈｌｅｒ、　Ｂ、　Ｃ、およびＭａｔｔｅｕｃｃｉ、　Ｍ、　Ｄ、　［＆　 Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ　ｊ：　２８７　（１９８７）］　；　Ｇａｒｅｇｇ、 　Ｐ、　Ｊ　、ら［Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　Ｌｅｔｔ、　２７：　４０５１　 （１９８６）］が開示している方法において、誘導体化され調整された多孔性ガ ラスを支持体として用い、Ｂ　１ｏｓｅａｒｃｈ　Ｍｏｄｅｌ　４０００　ＤＮ Ａ合成機によってポリマー結合ヌクレオチドＨ−ホスホネートの合成を行った。

オリコブオキシヌクレオチドの脱トリチル化によって、上記Ａのリン酸水素脂質 生成物とのフンシュゲート化に適した遊離の５゛ヒドロキシル基を得た。この生 成物をピリジン／アセトニトリル（１：　１）に溶解しく２５ｍｇ／ｍｌ）、上 記文献に記載の結合条件のもと、塩化ピバロイルを活性化物質として用いてポリ マー結合オリゴデオキシヌクレオチドとフンシュゲート化した。最終的な結合時 間を２倍にしても、モして／または結合サイクルを繰返しても生成物の収率ある いは純度に明確な作用はほとんど認められなかった。調製した化合物は以下の通 りである：ＥＬ−Ｔ、。； ＥＬ−ＡＧＣＴＡＧＣＴ　。

ＥＬ−ＡＧＣＴＡＧＣＴＴＴＴＴＡＧＣＴＡＧＣＴ　。

ＥＬ−ＣＡＧＴＧＡＴＧＴＧＴ　。

ＥＬ−ＡＣＡＣＡＴＣＡＣＴＧ ［ここで、ＥＬはＤＮＡの５′ヒドロキシル基に結合している１、２−ジーＯ− ヘキサデシル−３−グリセリルホスフェートである］。

上記文献の方法を用いて切断および脱保護した後、薄層クロマト°　グラフィー 、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、ＲＰ−ＨＰＬＣ。

および酵素分解によって生成物を分析した。

Ｃ，ポリアクリルアミドゲル電気泳動 ＥＬ−ＤＮＡの試料をホルムアミド含有の緩衝液に溶解し、９０°Ｃで１分間加 熱し、１５％アクリルアミド、７Ｍ尿素ゲルにかけた。

５０ｍＡ（約４００Ｖ）で２．５時間移動さセタ後、ＵＶ照照射下テルル写真を 取った。脂質含有のＥＬ−ＤＮＡ（ｔ、’Ｖて影を付けて可視化）は対応する脂 質不含のＤＮＡに比べて移動度が低く、主バンドを取り囲む幅広の縞として観察 された。それぞれの場合において、この主バンドは、ＥＬ−ＤＮＡのＤＮＡの２ 倍の長さの通常のオリゴマーとほぼ同じ移動度であった。

脂質含有の生成物は対応する非脂質ＤＮＡに比べて移動度の低い不明瞭なスミア として現れたので、ポリアクリルアミドゲル電気泳動は有用性が低いことが証明 された。縞となったＥＬ−ＤＮＡの相対量を通常パターンのＤＮＡバンドと比較 することにより、脂質導入の極めて粗い測定が得られるにすぎなかった。

Ｄ、薄層クロマトグラフィー 試料を分析ＴＬＣプレー）（ＳｉＣ，：ｎＰｒＯＨ：濃Ｎ　Ｈ４０Ｈ水溶液：Ｈ ２Ｏ５５：　１０　：　３５）ｌ：かけ、Ｕｖと染色（アルコール性ｐ−アニス アルデヒドとその後の加熱）の両方によって可視化した。

プロパツール／アンモニア／水の溶離液を用いて、異なった種を明瞭な個々のス ポットとして得た。通常、粗製の合成産物は、ＥＬＤＮＡ、ＤＮＡ、そして時に は微量の比較的低Ｒｆの未同定の物質に対応する２または３個のスポットを示し た。全ての場合の主物質（ＵＶおよび染色）は、高Ｒｆ（０，５５〜０．７０） のＥＬ−ＤＮＡであった。対応する通常のオリゴマーはＥＬ−ＤＮＡのすぐ上か またはすぐ下に移動した。これら化合物の相対的な位置は一定であるが、それら のＲｆ値は変化した。Ｒｆの相違に加えて、モリブデン染色による反応によって 生成するスポットの色が異なっていた。ＥＬ−ＤＮＡは紫色に観察されたが、Ｄ 　Ｎ、Ａは暗青色であった（未同定の副スポットと同じ）。

Ｅ　逆相ＨＰＬＣ Ｗａｔｅｒｓ　Ｍｏｄｅｌ　５１０システムおよび１０ｕｍ　Ｃ８Ｐａｒｔｉｓ ｉｌ−１０，４−６Ｘ２５０＋ｎ＋ａ分析カラムを用いてＲＰ−ＨＰＬＣを行っ た。ＲＰ−ＨＰＬＣ試料を、１００％の「Ａ」緩衝ｒ＆［２５ｍＭリン酸トリエ チルアンモニウム（ＴＥＡＰ）水溶液、ｐＨ７，０，５％ＣＨ，ＣＮ］中で適用 した。増加量のｒＢｊ緩衝液［２５ＩＩＩＭＴＥＡＰ小溶液、ｐＨ７゜０．７５ ％ＣＨｓＣＮコを用いて、２．０ｍｌ／分の流速でカラムから試料を溶離した。

ピークを２５４　ｎｍで検出し、自動分画収集器を用いて集めた。

アセトニトリル勾配を有するＴＥＡＰ緩衝水溶液による溶離によって、それぞれ の反応混合物中に存在する少量の不純な通常ＤＮＡからのＥＬ−ＤＮＡの良好な 分離が得られた。これら条件のもとでは、脂質を欠＜ＤＮＡはそれらの長さに依 存して１０〜２０％のｒＢＪで溶出した。通常のＤＮＡとは対照的に、比較的長 いリポオリゴヌクレオチドは比較的短いものの前に溶出した。以下に５種類のＥ Ｌ−ＤＮＡの溶出結果を示す（「Ｂ」の％）：　ＥＬ−ＡＧＣＴＡＧＣＴＴＴＴ ＴＡＧＣＴＡＧＣＴ（５７％）＋　ＥＬ−ＣＡＧＴＧＡＴＧＴＧＴ（６２％）； 　ＥＬ−ＡＣＡＣＡＴＣＡＣＴＧ（６４％）、ＥＬ−Ｔ、。（６５％）；　ＥＬ −ＡＧＣＴＡＧＣＴ（６８％）。

この方法は、最も詳細な生成物の情報を与えた。アセトニトリル勾配を有するＴ ＥＡＰ緩衝液を用いることにより、合成物質中の脂質の存在または非存在が直ち に明らかになった。全ての場合において、アセトニトリルの割合の低いところで 溶出する少量のＤＮＡ（および通常分布する比較的短いオリゴマー）と遅く溶出 するより多量のＥＬ−ＤＮＡが存在した。小さい分析ＨＰＬＣカラムは、単一の 幅広の尾を有する脂質−ＤＮＡ物質のピークを与えた。このＨＰＬＣ物質を単離 した後にざらに薄層クロマトグラフィーを行って、この遅く溶出するＨＰＬＣビ ークと高Ｒｆの紫色に染まったＴＬＣスポットが同一であることを確認した。

Ｆ、鼠泉逍化 酵素消化によってＥＬ−ＤＮＡの１つ（ＥＬ−ＣＡＧＴＧＡＴＧＴＧＴ）の特徴 をさらに調べた。ヘビ毒ホスホジェステラーゼ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎ ｎｈｓｉｍ　ＧｍｂＨ）はＤＮＡ骨格のほぼ完全な加水分解を触媒した［３６℃ で３０分；５０ＩＩＭトリス、ｐＨ８，１０ａ＋Ｍ　ＭｇＣＩｔコ。

しかし、ウシ膵臓ホスホジェステラーゼ（Ｓｉｇａ＋ａ）はこのＩＩ！質−ＤＮ Ａを無傷のまま残した［３７℃で１．５時間；５０１ＩＩＭトリス、ｐＨ８，１ ０ｔａ　Ｍ　Ｍ　ｇ　Ｃｌ　ｔ　］。これらの結果は、３゛末端に遊離のヒドロ キシル基を有するが５°末端がプロ！りされているＤＮＡに予想されるものであ る。ＥＬ−ＣＡＧＴＧＡＴＧＴＧＴは、標準的な条件［１００ｍＭトリス、ｐＨ ８，１０＋ｏＭ　ＣａＣＩｔ　；　３６℃コのもとてホスホリパーゼＣ（Ｓｉｇ ｍａ　；　Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｃｅｒｅｕｓ由来）およびホスホリパーゼＤ（Ｓ ｉｇｍａ　；キャベツ由来）の両方に対する基質としてコンピテントではないこ とがわかった。消化生成物のＲＰ−ＨＰＬＣ分析はそれぞれの酵素と無傷のＥＬ −ＤＮＡだけを示した。

Ｇ、熱変性プロフィール 正常なりＮＡ（ＣＡＧＴＧＡＴＧＴＧＴ／ＡＣＡＣＡＴＣＡＣＴＧ）、ＥＬ−Ｄ ＮＡ（ＥＬ−ＣＡＧＴＧＡＴＧＴＧＴ／ＥＬ−ＡＣＡＣＡＴＣＡＣＴＧ）、また はＤＮＡ／ＥＬ−ＤＮＡの混合物（ＥＬ−ＣＡＧＴＧＡＴＧＴＧＴ／ＡＣＡＣＡ ＴＣＡＣＴＧおよびＣＡＧＴＧＡＴＧＴＧＴ／ＥＬ−ＡＣＡＣＡＴＣＡＣＴＧ） を緩衝液［１００ｍＭ　ＮａＣ１、ｌ　Ｑ　ｍＭ　Ｎ　ａｔＨＰ　Ｏ４，１ｍＭ 　ＥＤＴＡ、ｐＨ７，２；それぞれの鎖を２μＭ］（１ｍｌ）中に含む試料を、 遮蔽したｌｅａキコベット中に入れた。試料の全ては、脱塩（Ｓ　Ｅ　Ｐ−ＰＡ Ｋ　Ｃ−１８ミ二カラム）してＨＰＬＣ精製した物質であった。隔離したセル区 画を１０℃から８０℃まで１℃ずつ加温し、それぞれの温度に達したときに１分 間平衡化させた。２６０ｎｍでのＵＶ吸収を温度の関数として自動的に記録した 。

ＥＬ−ＣＡＧＴＧＡＴＧＴＧＴ／ＡＣＡＣＡＴＣＡＣＴＧ（３８℃）およびＣＡ ＧＴＧＡＴＧＴＧＴ／ＥＬ−ＡＣＡＣＡＴＣＡＣＴＧ（３３°Ｃ）のＴｍは、正 常な２本鎖ＣＡＧＴＧＡＴＧＴＧＴ／ＡＣＡＣＡＴＣＡＣＴＧ（４１℃）のＴｍ に比べて減少した。ＤＮＡ−リガンドコンジ二ゲートのＴｍ減少については多数 の報告がある。例えば、Ｋ　ｅｍｐｅら［Ｎｕｃｌ、Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　１ ３：　４５　（１９８５）］を参照。このＴｍ低下の程度の変化は、それぞれの ２本鎖の脂質保持末端におけるＧＣとＡＴの含量の相違を単に反映しているのか もしれない。さらに重要なことは、両ＤＮＡ鎖に脂質を有すると（ＥＬ−ＣＡＧ ＴＧＡＴＧＴＧＴ／ＥＬ−ＡＣＡＣＡＴＣＡＣＴＧ　；　Ｔｍ　５０℃）、Ｔｍ が脂質を含まないＤ　Ｎ　Ａに対するものよりも顕著に高くなるということであ る。これらの結果は、１個の脂質だけを保持している２本鎖では得られることの ない、２本鎖のそれぞれの末端に脂質が存在しているときのある種のより高次な 脂質構造の情報を示しているのかもしれない。

塩化カルシウム　トランスフェクション法を用いてＮ　Ｉ　Ｈ／３　Ｔ３マウス 線維芽細胞をｒａｓ腫瘍遺伝子で形質転換しうることが知られている［Ｇｒａｈ ａｍおよびＶａｎ　ｄｅｒ　Ｅｂ、　Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　５２：　４５６−４６ ７　（１９７３）およびＷｉｇｌｅｒら、　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓ ｃｉ、ＵＳＡ　７６：　１３７３−１３７６　（１９７９）を参照］。この形質 転換された細胞は、接触阻止が失われて無胸腺マウスにおいて増殖することがで きる冷凍細胞のフォーカスを形成する。

本実施例では、ヒトｒａｓ腫瘍遺伝子（例えば、プラスミドから単離する）を上 記方法のいずれかによりリン脂質に共有結合させるか（窒素結合を含む）、また は好ましくは脂質−オリゴヌクレオチドコンジュゲートに連結する。後者の場合 には、コンジュゲートのオリゴヌクレオチドの３”末端とヒトｒａｓ腫瘍遺伝子 （直線化したプラスミドに含まれる）の５゛末端を補足し、これらをつなぐリン カ−を作成する。このコンジュゲートのオリゴヌクレオチド部分、リンカ−１お よび直線化したプラスミドを通常のキナーゼ法でホスホリル化し、Ｔ４リガーゼ を用いて一緒に連結する。

全面単層のＮＩＨ／３Ｔ３細胞を血清を含まないＤ　ｕｌｂｅｃｃｏの改良Ｅａ ｇｌｅ培地（ＤＭＥＭ）で２回洗浄し、このＤＭＥＭ培地中で４時間インキュベ ートする。次いで、脂質−ｒａｓコンジュゲートの１つをこの培地に加え、３７ ℃で３時間インキュベートする。次に、１０％ウシ胎児血清を含む完全ＤＭＥＭ 培地を１０：１（ν／ｖ）の量でベトリ皿に加え、３７°Ｃで一晩放置する。次 の日に、この細胞を１／２０．１／４０および１／８０希釈に分け、１７日間増 殖させ、その後にフォーカスを数える。

ｒａｓ腫瘍遺伝子を細胞中に内在化させ、核に至らしめ、そして発現させてｒａ ｓ腫瘍遺伝子産物を生成させることができ、コンジュゲートがＮＩＨ／３Ｔ３細 胞を安定に形質転換することができることがわかる。

要約すると、本発明はオリゴヌクレオチドを適当な細胞に運搬し、それを標的と し、そしてその中に内在化させる（通常はエンドサイト−シスによる）ためのオ リゴヌクレオチドと脂質のコンシュケートに関するものである。内在化の後にこ のフンシュゲートは、例えばコンジュゲート上の適当な切断部位を認識する細胞 性リンく−ゼによって切断される。即ち、本発明のフンシュゲートは、例えば治 療薬物、予防薬物、抗ウイルス薬物、細胞毒などの種々の活性を有するポリペプ チドを発現するオリゴマーを細胞に特異的１こ放出させることができる細胞特異 的な薬物として作用させるのに適して０る。

また、このオリゴマーは細胞の調節機序に影響を与える力翫、遺伝子欠損を補足 するか、またはマーカーとして作用するものであってもよい。

国際調査報告 ｍ＃ＭｍｍＭ畷＾−ｓｍｕｔ噂””ＰＣＴ／ＩＪＳ９０／（ｌｉ○Ｑ：）１内１ ＃ｌ＋１１１ｍＭＩｌＡ帥１１１Ｍ＋、＠ＰＨ・ＰＣＴ／υ５９０１０１００２ 国傑調査報告 １１Ｊｓ　９００１００２ Ｓ＾　３５１０６

Claims (46)

【特許請求の範囲】
1. １．脂質とオリゴヌクレオチドの共有結合コンジュゲートおよびその薬学的に許 容しうる塩。
2. ２．脂質がオリゴヌクレオチドの５′末端に結合している請求項１に記載のコン ジュゲート。
3. ３．脂質がオリゴヌクレオチドの５′ヒドロキシル基に結合している請求項２に 記載のコンジュゲート。
4. ４．脂質が、コンジュゲートが標的としている宿主細胞にとって内生である酵素 によって特異的に認識される切断部位を有する請求項１に記載のコンジュゲート 。
5. ５．切断部位が酵素加水分解に感受性である請求項４に記載のコンジユゲート。
6. ６．酵素が細胞膜または核膜に位置している請求項５に記載のコンジュゲート。
7. ７．酵素が細胞質に存在している請求項４に記載のコンジュゲート。
8. ８．切断部位がオリゴヌクレオチドの５′ヒドロキシル基に由来する酸素原子で ある請求項４に記載のコンジュゲート。
9. ９．脂質がリン脂質であり、酵素がリパーゼである請求項３に記載のコンジュゲ ート。
10. １０．リパーゼがホスホリパーゼである請求項９に記載のコンジュゲート。
11. １１．ホスホリパーゼがホスホリパーゼＣもしくはＤまたはその両方である請求 項１０に記載のコンジュゲート。
12. １２．切断部位がオリゴヌクレオチドの５′ヒドロキシル基に由来する酸素原子 である請求項１１に記載のコンジュゲート。
13. １３．切断部位がリン脂質のホスホリル基のグリセロール側の酸素原子である請 求項１１に記載のコンジュゲート。
14. １４．以下の式で示される請求項１に記載のコンジュゲート：Ｌ−｛［（Ｘ−Ｚ ）］ｎ−［Ｘ−Ｐ（＝Ｙ）Ｏ−１ｍ｝ｙ−Ａ｛式中、Ｌはステロイド部分、Ｒ１ 、またはＲ２−Ｘ−ＣＨ（Ｒ４）−ＣＨ（−Ｘ−Ｒ３）−ＣＨ２（ここで、Ｒ１ はＣ１−Ｃ３０アルキル、Ｃ２−Ｃ３０モノ、ジもしくはポリ不飽和アルキル、 Ｃ３−Ｃ８シクロアルキル、またはＣ４−Ｃ８モノ、ジもしくはポリ不飽和シク ロアルキル基であり、Ｒ２、Ｒ３、およびＲ４は独立してＨ、Ｒ１、またはα− アミノアシルである）であり； ＸはＯ、Ｓ、ＮＨ、Ｃ（＝Ｏ）、Ｃ（＝Ｏ）Ｏ、ＯＣ（＝Ｏ）、ＮＨＣ（＝Ｏ） 、またはＣ（＝Ｏ）ＮＨであり；ＹはＯまたはＳであり； ＺはＣ２−Ｃ１０飽和またはモノ、ジもしくはポリ不飽和アルキレン部分であり ； ｎ、ｍおよびｙは独立して０〜約１０の整数であり；そしてＡは以下からなる群 から選ばれる： ▲数式、化学式、表等があります▼（５′末端から）▲数式、化学式、表等があ ります▼（３′末端から）▲数式、化学式、表等があります▼（３′エノール６ 員環から）▲数式、化学式、表等があります▼ （ヌクレオチド間のリン酸から） ▲数式、化学式、表等があります▼ （Ｎ−塩基から）、または ▲数式、化学式、表等があります▼（Ｎ−塩基から）［式中、Ｂは脱保護した塩 基であり、ｐは約５〜３０の整数であり、ｑおよびｒは約１〜２８の整数であり （ただし、ｑ＋ｒは約４〜２９である）、ｓおよびｔは０〜約２９の整数であり （ただし、ｓ＋ｔは約４〜２９である）、ＥはＸまたはＺＸであり、そしてＤは 以下からなる群から選ばれる（ここで、環窒素からの結合がオリゴヌクレオチド の糖部分に結合している）： ▲数式、化学式、表等があります▼、 ▲数式、化学式、表等があります▼、▲数式、化学式、表等があります▼、▲数 式、化学式、表等があります▼、▲数式、化学式、表等があります▼または▲数 式、化学式、表等があります▼］｝。
15. １５．ＬがＲ２−Ｘ−ＣＨ（Ｒ４）−ＣＨ（−Ｘ−Ｒ３）−ＣＨ２である請求項 １４に記載のコンジュゲート。
16. １６．Ｒ２およびＲ３が独立してＨまたはＣ１０−Ｃ２０の飽和または不飽和の アルキル基であり、Ｒ４がＨまたはＲ１であり、ＸがＯ、ＮＨ、ＮＨＣ（＝Ｏ） 、Ｃ（＝Ｏ）、ＯＣ（＝Ｏ）、またはＣ（＝Ｏ）Ｏであり、そしてＹがＯである 請求項１５に記載のコンジュゲート。
17. １７．Ｚがエチレンまたはカルボキシエチレンであり、ｎ、ｍおよびｙが０〜２ であり、そしてＡがその５′末端で結合したオリゴヌクレオチドである請求項１ ６に記載のコンジュゲート。
18. １８．ＸがＯであり、ｙが１または２であり、ｍが１または２であり、ｎが０ま たは１であり、そしてｐが約１０〜２５である請求項１７に記載のコンジュゲー ト。
19. １９．Ａがアデニン残基のＮ６またはシトシン残基のＮ４で結合している請求項 １５に記載のコンジユゲート。
20. ２０．オリゴヌクレオチドが少なくとも５個の塩基からなる請求項１に記載のコ ンジュゲート。
21. ２１．オリゴヌクレオチドが約１０〜約３０個の塩基を有する請求項２０に記載 のコンジュゲート。
22. ２２．オリゴヌクレオチドが約１４〜約２５個の塩基を有する請求項２１に記載 のコンジュゲート。
23. ２３．少なくとも１個の塩基が実質的に平面のピリミジノン塩基である請求項１ ４に記載のコンジュゲート。
24. ２４．オリゴヌクレオチドが、病原性核酸または腫瘍遺伝子に十分に相補性であ ってこれらとハイプリダイズするヌクレオチド配列を含有する請求項１に記載の コンジュゲート。
25. ２５．核酸がウイルスの核酸である請求項２４に記載のコンジュゲート。
26. ２６．オリゴヌクレオチドが、コンジュゲートが標的としている宿主細胞にとっ て内生である酵素によって特異的に認識される切断部位であるヌクレオチド配列 またはこの部位とハイプリダイズすることができるヌクレオチド配列を有する請 求項１に記載のコンジュゲート。
27. ２７．オリゴヌクレオチドが、ｍＲＮＡスプライス部位であるヌクレオチド配列 またはこの部位とハイプリダイズすることができるヌクレオチド配列を含有する 請求項１に記載のコンジュゲート。
28. ２８．ラベルされている請求項１に記載のコンジュゲート。
29. ２９．固体支持体上に固定されている請求項１に記載のコンジュゲート。
30. ３０．固体支持体が疎水性表面を有する請求項２９に記載のコンジュゲート。
31. ３１．請求項１に記載のコンジュゲートを宿主細胞にトランスフェクションする ことからなる方法。
32. ３２．請求項１に記載のコンジュゲートでトランスフェクションされた宿主細胞 。
33. ３３．薬学的に許容しうる担体と請求項１に記載のコンジュゲートを含有する組 成物。
34. ３４．担体がリボソームである請求項３３に記載の組成物。
35. ３５．等張性である請求項３３に記載の組成物。
36. ３６．滅菌されている請求項３３に記載の組成物。
37. ３７．発病状態にある哺乳動物に請求項３３に記載の組成物の有効量を投与する ことからなる方法。
38. ３８．発病状態がウイルス感染である請求項３７に記載の方法。
39. ３９．組成物中の担体がリボソームである請求項３７に記載の方法。
40. ４０．試料中の予め決めたヌクレオチド配列を有する核酸を検定するための方法 であって、以下からなる方法：（ａ）予め決めた配列にハイプリダイズすること ができるヌクレオチド配列を有する請求項２８に記載のコンジュゲートを得；（ ｂ）このラベルされたコンジュゲートを支持体に固定し；（ｃ）試料中に核酸が 存在しているときにはこの核酸とコンジュゲートのオリゴヌクレオチド部分のハ イブリダイゼーションを引き起こすであろう条件のもとで、試料と固定化コンジ ュゲートを接触させ；そして （ｄ）ラベルされたオリゴマーの存在を検出する。
41. ４１．工程（ｃ）の後に、固定化コンジュゲートを、コンジュゲートのオリゴヌ クレオチド部分を切断してラベルおよび未ラベルのオリゴマーフラグメントを生 成させることができる制限エンドヌクレアーゼと消化条件のもとで接触させる工 程をさらに含み、そして工程（ｄ）におけるオリゴマーがオリゴマーフラグメン トである請求項４０に記載の方法。
42. ４２．混合物からオリゴヌクレオチドを分離するための方法であって、以下から なる方法： （ａ）分離しようとするオリゴヌクレオチド内に含まれている配列にハイプリダ イズすることができるヌクレオチド配列を有する請求項１に記載のコンジュゲー トを得； （ｂ）このコンジュゲートを支持体に固定し；（ｃ）混合物中のオリゴヌクレオ チドとコンジュゲートのオリゴヌクレオチド部分のハイブリダイゼーションを引 き起こす条件のもとで、混合物と固定化コンジュゲートを接触させ；そして（ｄ ）ハイプリダイズしたオリゴヌクレオチドを分離する。
43. ４３．混合物からオリゴヌクレオチドを分解するための方法であって、以下から なる方法： （ａ）疎水性の相において、分離しようとするオリゴヌクレオチド内に含まれて いる配列にハイプリダイズすることができるヌクレオチド配列を有するコンジユ ゲートを得；（ｂ）親水性の相において、混合物を得；（ｃ）混合物中のオリゴ ヌクレオチドとコンジュゲートのオリゴヌクレオチド部分のハイブリダイゼーシ ョンを引き起こす条件のもとで、混合物を含む相とコンジュゲートを含む相を接 触させ；そして（ｄ）混合物を含む相からハイプリダイズしたオリゴヌクレオチ ドを抽出し、これを別の親水性の相に移す。
44. ４４．請求項１に記載のコンジュゲートとラベル部分を含有するリポソーム。
45. ４５．抗体がリポソームのオリゴヌクレオチドに結合してリポソームの安定性を 変化させるように、ヒトからの血清試料と請求項４４に記載のリポソームを接触 させ、そしてラベルの存在または非存在を測定することからなるヒトの全身性エ リテマトーデスを検出するための方法。
46. ４６．抗体がリポソームのオリゴヌクレオチドに結合してラベルを放出させ、そ して放出されたラベルの量を測定する請求項４５に記載の方法。