JPH05505941A - オリゴヌクレオチド―輸送剤ジスルフィド結合体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

オリゴヌクレオチド−輸送剤ジスルフィド結合体１、技術分野 本発明は生存細胞又は生物へのオリゴヌクレオチドの配送を増強するための構成 物及び方法に関する。本発明の構成物は、少なくとも１つのジスルフィド結合を 含む分子リンカ−を介して、細胞膜又は血液−脳関門を通過しての輸送を容易に する薬剤と結合したオリゴヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチド結合体を含 む。本発明はまた少なくとも１つのジスルフィド結合を有する分子リンカ−を含 むオリゴヌクレオチド結合体を含み、ここで該分子リンカ−は細胞外条件では安 定性を与えるが、細胞内条件では不安定である。好ましい態様においては、構成 物が細胞内に取り込まれる際に、又はその後にジスルフィド結合が開裂する。本 発明はまた、本発明のオリゴヌクレオチド結合体を細胞に与えることからなる、 細胞内における核酸配列の発現を阻害する方法に関する。特定の態様においては 、オリゴヌクレオチドは核酸配列とハイブリダイズすることができる。さらに本 発明は、細胞と本発明のオリゴヌクレオチド結合体とを接触させることからなる 細胞内の核酸配列を検出する方法に関し、ここでオリゴヌクレオチドは核酸配列 とハイブリダイズすることができ、また核酸配列は検出可能なように標識されて いる。さらに、本発明はまた診断プローブ中にオリゴマー−ジスルフィド結合体 を利用する外因性感染剤の核酸配列の存在を検出する方法をも含む。好ましい面 においては、診断プローブ中に利用されるオリゴマー−ジスルフィド結合体は共 有架橋剤を含み、その結果診断又は検出アッセイにおける感度が増加し、バック グランドが減少する。本発明は医薬組成物及び治療方法も提供する。 チオール基を含むタンパク質入が４−ジチオピリジル基を含むタンパク質Ｂと反 応して４−ジチオピリドンを放出して結合体を生じる、分子間ジスルフィド交換 反応を介するタンパク質結合体の製造方法が開示されている（Ｋｉｎｇ　ｅｔ　 ａｌ、、１９７８、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　１７：１４９９−１５０６）。 タンパク質抗原を異なるタンパク質担体にカップリングさせて抗原の免疫原性を 増強又は抑制するのに用い得ること、及びペプチドホルモンとタンパク質担体と の結合体はホルモンーリセプター相互作用を明らかにするのに有用であることが 示唆されていた。 ジスルフィド結合を介してオリゴヌクレオチドを核酸、タンパク質、及びチオー ル特異的蛍光プローブと結合させる方法が報告されている（Ｃｈｕ　ａｎｄ　Ｏ ｒｇｅｌ、１９８８．Ｎｕｃｌ、Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、１６：３６７１−３６９ ０：Ｚｕｃｋｅｒｍａｎ　ｅｔ　ａｌ、、１９８７．Ｎｕｃｌ、Ａｃ１ｄｓ　Ｒ ｅｓ、１５：５３０５−５３２１；Ｃｏｎｎｏｌｌｙ、１９８５、Ｎｕｃｌ、Ａ ｃｆｄｓ　Ｒｅｓ、１３：４４８５−４５０１；Ｃｈｅｎｇ　ｅｔ　ａｌ、、Ｌ ９８３．Ｎｕｃｌ、Ａｃ１ｄｓＲｅｓ、１１：６５９−６６９）、このようなジ スルフィド結合は一般に分子間ジスルフィド交換反応によって導入された。詳細 には、Ｓ−８結合部分を含む付加物が他の分子上にある遊離のチオール基と交換 されて所望のジスルフィドを生成する。ジスルフィド結合を介してタンパク質又 はフルオログラフィープローブ又は色素体プローブと結合したこのようなオリゴ ヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドと相補的配列との間のハイブリダイゼーシ ョンの程度をｉｎ　Ｖｊｔｒｏでアッセイするのに用いることができることが示 唆されている（Ｃｈｕ　ａｎｄ　Ｏｒｇｅ　１，１９８８、Ｎｕｃｌ、Ａｃ１ｄ ｓ　Ｒｅｓ、１６：３６７１−３６９０；Ｚｕｃｋｅｒｍａｎ　ｅｔ　ａｌ、、 １９８７．Ｎｕｃｌ。 Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、１５：５３０５−５３２１；Ｃｏｎｎｏｌｌｙ、１９８５ ．Ｎｕｃｌ、Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、１３：４４８５−４５０１；Ｃｈｅｎｇ　ｅ ｔ　ａｌ、、１９８３．Ｎｕｃｌ、Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、１１：６５９−６６９ ）。 最近、ジスルフィド結合を介してスタフィロコッカスのヌクレアーゼに結合した オリゴヌクレオチドを含む結合体が報告された（Ｃｏｒｅｙ　ｅｔ　ａｌ、、１ ９８９．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　２８：８２７７−８２８６；Ｃｏｒｅｙ　 ａｎｄ　５ｃｈｕｌｔｚ、１９８７，５ｃｉｅｎｃｅ　２３８：１４０１−１４ ０３）。この結合体は特にオリゴヌクレオチド結合部位近くの部位で１本鎖ＤＮ Ａを開裂するハイブリッド酵素として作用することが示された。 ジスルフィド結合のような化学的に開裂可能な結合を介して有機の塩基性基と結 合したビオチン化モノヌクレオチド又はモノヌクレオシドもまた最近報告されて いる（Ｈｅｒｍａｎ、米国特許第４，７７２．６９１号、１９８８年９月２０日 発行）。このような構成物は生理的な粗混合物から目的とする大分子を単離する のに有用であることが示唆された。詳細には、ビオチン化ヌクレオチドは、目的 とする分子をその有機の塩基性基を介して目的とする分子に対して親和性を有す る大分子と接触させ、その結果ビオチン化ヌクレオチド−親和性大分子−目的の 大分子複合体を形成することが示唆された。このような複合体を固定化アビジン と接触させると、アビジンがビオチン部分に結合する。開裂可能な結合を介して ヌクレオチドを開裂して、親和性大分子−目的の大分子複合体を得て、これから 目的の大分子を得ることができる。 その他の報告では、ＤＮＡの他の分子へのジスルフィド結合を報告している。Ｃ ｈｕ及びＯｒｇｅｌ　（１９８８，Ｎｕｃｌ、Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、１６：３６ ７１）は、とりわけ１６−ｍｅｒオリゴヌクレオチドのパーオキシダーゼへの、 そしてウィルスＲＮＡのＩｇＧへの開裂可能なジスルフィド結合を介する結合を 報告しており、これらを固相、又は好ましくは溶液中での検出アッセイに使用し 得ることを示唆している。Ｃｈｅｎｇら（１９８３，Ｎｕｃｌ、Ａｃ１ｄｓ　Ｒ ｅｓ、１１　（３）：６５９）はＧ−尾部化プラスミドＤＮＡ　（ヘルペスシン プレックスウィルス−１チミジンキナーゼ遺伝子又は大腸菌クロラムフェニコー ルアセチルトランスフェラーゼ遺伝子）のα２マクログロブリン（サセプター媒 介型エンドサイトーシスを受けやすいタンパク質）へのジスルフィド結合体を報 告している。 標準的動物細胞内においては、グルタチオン（システィン含有ペプチド）が還元 型で高濃度（１−５ｍＭ）で見いだされる（総説：Ｍｅｉｓｔｅｒ　ａｎｄ　Ａ ｎｄｅｒｓｏｎ、１９８３．Ａｎｎ、Ｒｅｖ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、５２　：　７１ １−７６０）ｏ　この遊離のチオールはその組成にかかわらず開裂性ジスルフィ ドをチオールへと変える強力な酸化還元活性を有する。 ２．２．薬剤の細胞への輸送 多くの治療剤の有用性はその標的細胞群への取り込まれ易さに依存することが広 く認められている（総説：Ｇｒｅｇｏｒｉａｄｉｓ、１９７８．Ｎａｔｕｒｅ　 （Ｌｏｎｄｏｎ）２６５　：４０７−４１１）。ある場合には細胞が医薬に対し て不透過性となり、抗微生物医薬が細胞内の微生物の存在部位に入れなくなる医 薬耐性の問題が生じる。 標的とする部位に医薬を有効に送達するための１つのアプローチは、投与部位か ら作用部位へと直接輸送することのできる担体に医薬を付着させることを必要と する（総説：Ｇｒｅｇｏｒｉａｄｉｓ、１９８９．医薬担体システム、　Ｆ、　 Ｈ，Ｄ、　Ｒｏｅｒｄｉｎｋ及びＫｏｏｎ編集、Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｌｙ　＆　５ ｏｎｓ、Ｌｔｄ、、ｐｐ、ｌ−３１）。このような担体は次の３つのカテゴリー に分けられる：　（１）線状ポリマー；　（２）細胞；及び（３）３次元システ ム（例えばリポソーム）。線状ポリマーは通常加水分解しうる結合を介して医薬 と共有結合される（総説：Ｈｏｅｓ　ａｎｄ　Ｆｅｉ　ｊｅｎ、１９８９．医薬 担体システム。 Ｆ、Ｈ，Ｄ、Ｒｏｅｒｄｉｎｋ及びＡ、Ｍ、Ｋｏｏｎ編集、Ｊ。 ｈｎ　Ｗｉ　Ｉｅｙ　＆　５ｏｎｓ、Ｎ、Ｙ、、ｐｐ、５７−１０９）。結合体 が標的領域に入ると、医薬と担体との間の結合が開裂して医薬を放出する。ある アプローチにおいては担体は生物分解性である。このような担体の例としては、 細胞内でタンパク質分解酵素によって開裂するタンパク質、グリコシダーゼによ って開裂するポリサッカライド、又は加水分解的に不安定なエステル結合を含む ビニルポリマーがある。このアプローチの成功はポリマー担体のコンホメーショ ン及び医薬−担体結合の安定性を含む多くの要因に依存する。また医薬−担体結 合の不完全な開裂という危険性もある。他のアプローチでは、加水分解可能な結 合を介して非生物分解性ポリマーを医薬に結合することを必要とする。 共有結合を介して医薬を担体に結合する１例として、種々の長さのペプチドリン カ−を介してポリ［：Ｎ−（２−ヒドロキシプロピル）メタクリルアミド］　（ ポリＨＰＭＡ）がｐ−ニトロアニリンに結合したものが含まれる。ｐ−ニトロア ニリンの放出速度はリンカ−の長さに依存することが見いだされた。 その他の例には、ジスルフィド結合を介するメトトレキセートのポリ（Ｄ−リシ ン）への結合体がある（Ｓｈｅｎ　ｅｔ　ａｌ、、１９８５．Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃ ｈｅｍ、２６０：１０９０５−１０９０８）。ポリ（Ｄ−リシン）と直接結合し たメトトレキセートをインキュベーションすることは細胞成長に細胞毒性効果を 及ぼさなかった。しかしながら、ジスルフィド結合を付加すると、このような結 合体を細胞に加えたときの細胞毒性効果が現れた。 特定の標的部位に医薬を送達するのに細胞が用いられ得る。例えば、赤血球は細 胞内皮系に医薬を送達するのに有用である。しかしながら、細胞が担うことので きる医薬の範囲と標的への近づきやすさの点において細胞には限界がある。 第３のアプローチ、すなわちリポソームや小球のような３次元システムの使用は 、十分に保護された空間中に医薬を含むという利点を有している。しかしながら 、これらのシステムは、組織の選択性における限界とサイズによっては通常の膜 関門を通過することができないという点で不利である。 Ｗｕ及びＷｕ　（１９８７，Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、２６２　（１０）：４４ ２９−４４３２）は、リセプター媒介型エンドサイトーシスによってアシアロオ ロソムコイド（ＡＳＯＲ）のりセブターを有する肝細胞にマーカープラスミドＤ ＮＡを送達するために、プラスミドＤＮＡ　（ｐｓＶ２　ＣＡＴ）に非共有結合 的に錯体形成したアシアロオロソムコイド及びポリーＬ−リシンのジスルフィド 結合体を開示している。 Ｈｓｔｅｔｌｅｒら（ＰＣＴ公開Ｎｏ、　ＷＯ９０１０Ｏ５５５）は抗ウイルス ヌクレオチド類似体の脂質誘導体を開示している。 ２．２．１．血液−脳関門を通過する医薬の輸送一定の標的部位への医薬の接近 は大きな解剖学的関門によっても妨げられる。このような関門の１例は血液−脳 関門である。編毛細血管の内皮細胞は融合膜を有しており、神経膠細胞の層が毛 細血管を密に取り巻いている。従って、中枢神経細胞に接近するためには、主と して脂質を含む関門を医薬が貫通しなければならない。その結果、高度に脂溶性 の化合物は投与後速やかに脳に到達するが、より極性な化合物ははるかに遅い速 度で貫通することが見いだされた。 血液−脳関門を通過して医薬を輸送するための多くのアプローチが研究されてき た。１つのアプローチにおいては、医薬のヒドロキシル、カルボキシル及び第１ アミン基を脂溶性物質でブロックすることによって、親水性医薬を脂溶性医薬に 変換する（ＰＣＴ出願公開Ｎｏ、ＷＯ３９／１０１３４．１９８８年４月２５日 公開にまとめられている）。しかしながら、このような物質の輸送はやはり比較 的遅いことが観察されている。他のアプローチでは、親水性医薬を通過させるた めに血液−脳関門を一時的に開かせる高張性物質を動脈内注射することを含む（ Ｎｅ　ｕｗａ　１　ｔｅｔ　ａｌ、、１９８０．Ａｎｎ、Ｉｎｔ、Ｍｅｄ、９３ ：１３７−１３９）。しかしながら高張性物質は毒性で血液−脳関門を損傷する 可能性がある。最近採られた他のアプローチでは、クセブタ−媒介型トランスサ イトーシスによって比較的高速で血液−脳関門を通過することのできる輸送可能 なペプチドと、例えばジスルフィド結合によって結合した神経薬学的医薬として 作用するペプチドを含むキメラペプチドを使用する（ＰＣＴ出願公開Ｎ。 、ＷＯ３９／１０１３４．１９８８年４月２５日公開）。 標的とする核酸配列の発現を調節するために、選択された細胞性又はウィルス性 の標的核酸配列と相補的なオリゴヌクレオチドを使用するいくつかのアプローチ が採られてきた。ウィルス複製を阻害するための特定の核酸配列の使用に関する いくつかの報告がなされてきた（例えば、Ｇｏｏｄｃｈｉｌｄ　ｅｔ　ａｌ、。 １９８８、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、Ｕ、Ｓ、Ａ、８５：５５０ ７−５５１１；Ｗｉｃｋｓｔｒｏｍ　ｅｔ　ａｌ、、１９８８．Ｐｒｏｃ、Ｎａ ｔｌ、Ａｃ５ｄ、Ｓｃｉ、Ｕ、Ｓ、Ａ、８５：１０２８−１０３２；Ｋａｗａｓ ａｋｉ、１９８５、Ｎｕｃｌ、Ａｃｆｄｓ　Ｒｅｓ、１３：４９１１を参照され たい）。しかしながら、細胞による非修飾オリゴマーの吸収が乏しいこと（Ｚａ ｍｅｃｎｉｋ　ｅｔ　ａｌ、、１９８６．Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃ ｉ、Ｕ、Ｓ、Ａ、８３　：４１４３−４１４６）、及びそれらの細胞性ヌクレア ーゼへの感受性並びに培地および血清中に存在するヌクレアーゼ（Ｗｉｃｋｓｔ ｒｏｍ、１９８８．Ｊ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、ａｎｄ　Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ｍｅｔｈ、 １３：９７−１０２）のために、これをｉｎ　ｖｉｖ。 及びｉｎ　ｖｉｔｒｏの両方で使用することに制限があった。 膜透過性でヌクレアーゼ耐性な修飾オリゴヌクレオチドを開発する試みがいくつ かの研究所でなされてきた。１つのアプローチは非イオン性オリゴヌクレオチド 類似体の開発を含む。このような類似体の例としては、メチルホスホネー）（Ｓ ｍｉｔｈ　ｅｔａｌ、　、　１９８６．　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、 　Ｓｃｉ。 Ｕ、Ｓ、Ａ、８３：２７８７−２７９１；Ａｇｒｉｓ　ｅｔ　ａｌ、、１９８６ ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　２５：６２６８−６２７５；Ｊａｙａｒａｍａｎ 　ｅｔ　ａｌ、、１９８１．Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、Ｕ、Ｓ、 Ａ、７８　：１５３７−１５４１）；ホスホロチオニー）（Ａｇａｒｗａｌ　ｅ ｔａｌ、、１９８８．Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、Ｕ、Ｓ、Ａ、８ ３：４１４３−４１４６：Ｍａｔｓｕｋｕｒａ　ｅｔ　ａｌ、、１９８７．Ｐｒ ｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、Ｕ、Ｓ、Ａ、８４　：　７７０６−７７１ ０　；Ｍａｒｅｕｓ−８ｅｋｕｒａ　ｅｔ　ａｌ、、１９８７．Ｎｕｃｌ、Ａｃ １ｄｓ　Ｒｅｓ、１５：５７４９−５７６３）；及びホスホラミデート（Ａｇａ ｒｗａｌ　ｅｔ　ａｌ、、１９８８．Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｉ。 Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｕ、　Ｓ、　Ａ、　８３：４１４３−４１４６）を含む 。 ホスホロチオエートが相補的な標的核酸配列と結合することに加えて、ＨＩＶ逆 転写酵素へのプライマーの結合の阻害をも指示するかも知れないと考えられてき た（Ｍａｔｓｕｋｕｒａ　ｅｔａｌ、、１９８７．Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａ ｄ、Ｓｃｉ。 Ｕ、Ｓ、Ａ、８４　ニア７０６−７７１０）。部分的にチオール化したポリシチ ジル酸を含む、ポリヌクレオチドを用いるポリメラーゼについての抗鋳型（ａｎ ｔｉｔｅｍｐｌａｔｅ）阻害もまた報告されている（総説：５ｔｅｉｎ　ａｎｄ 　Ｃｏｈｅｎ、１９８８　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、４８：２６５９−２６６８） 。 細胞によるオリゴヌクレオチドの取り込み効率を増加する分子にオリゴヌクレオ チドを結合させることを含むアプローチもある。このような結合体の例としては 、コレステリル結合オリゴヌクレオチド（Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ　ｅｔ　ａｌ、、 １９８９．Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ　１．Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、Ｕ、Ｓ、Ａ、８６　：６ ５５３−６５５６）及びポリーＬ−リシン結合体（Ｌｅｍａ　ｉ　ｔ　ｒｅｅｔ 　ａｌ、、１９８７．Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、Ｕ、Ｓ、Ａ、８ ４：６４８−６５２）を含む。その他の例としては、膜輸送の効率を増加するた めに最終産物に両親媒を与えるような基と、結合手を介して結合したオリゴヌク レオチドを含む（ＰＣＴ公開Ｎｏ、ＷＯ３８１０９８１０，１９８８年１２月１ ５日公開）。 今までに採られた他のアプローチは、反応性オリゴヌクレオチド、すなわち標的 の核酸を修飾することのできる反応性薬剤と結合したアンチセンスオリゴヌクレ オチドの使用を含む。このような反応性薬剤の１グループには、隣接する塩基対 間の内部に挿入することによって二本鎖に結合するが、或いは外部ヌクレオチド とリン酸要素とにそれぞれ結合することのできる挿入剤である。 オリゴヌクレオチド及びオリゴヌクレオチド類似体と結合する挿入剤の例には、 アクリジン、アンスリジウム及び光活性化プソラレンを含む（総説：Ｚｏｎ、１ ９８Ｂ、Ｐｈａｒｍ、Ｒｅｓ、５：５３９−５４９）。オリゴヌクレオチドに結 合するこのような反応性グループのその他の例には、ＥＤＴＡ−Ｆｅ　（Ｉ　Ｉ ）　、。 −フェナントロリン−Ｃｕ（、Ｉ）、又はポリフィリン−Ｆｅ　（ＩＩ）のよう な金属錯体を含む（総説：Ｋｒｏｌ　ｅｔ　ａｌ、。 １９８８、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　６：９５８−９７６）。これらの化合 物は分子状酸素及び還元剤の存在下にヒドロキシルラジカルを生じることができ る。生じたラジカルは標的の核酸骨格を攻撃した後に相補鎖を開裂させることが できる。このような化合物を用いる問題点の１つは、このようなオリゴヌクレオ チドが反応性であるので、自己分解するかも知れないということでプリンオリゴ デオキシリボヌクレオチド及びピリミジンオリゴデオキシリボヌクレオチドのい ずれもが二本鎖ＤＮＡと結合することが知られている（Ｇｒｉｆｆｉｎ　ａｎｄ 　Ｄｅｒｖａｎ。 １９８９．５ｃｉｅｎｃｅ　２４５：９６７−９７１）ａプリンオリゴヌクレオ チドは三重らせん形成により二重らせんＤＮＡ中のプリンとアンチパラレルに結 合することが示された（Ｂｅａｌａｎｄ　Ｄｅｒｖａｎ、１９９１，５ｃｉｅｎ ｃｅ　２５１：１３６０−１３６３）　。 ピリミジンオリゴヌクレオチドｌ　５−１８ヌクレオチドは配列特異的依存性で 二重らせんＤＮＡ中のホモプリン部分と結合するｉ　ことが示された（Ｍｏｓｅ ｒ　ａｎｄ　Ｄｅｒｖａｎ、１９８７．５ｃｉｅｎｃｅ　２３８：６３４−６５ ０）Ｏこれらのオリゴヌクレオチドは大溝中において、ワトソンークリックの二 重らせんＤＮＡのプリン鎖に平行に結合する。二重らせんＤＮＡに対するピリミ ジンオリゴヌクレオチドの結合親和性及び特異性はｐＨ１有機共溶媒、加えるカ チオン及び温度に敏感であることが示された。 ホモピリジンオリゴヌクレオチドの配列特異性は、ＤＮＡ開裂部分を備えるとき 染色体をマツピングするための道具としてこれらオリゴヌクレオチドを有用にす る（Ｍｏｓｅｒ　ａｎｄ　Ｄｅｒｖａｎ、１９８７，５ｃｉｅｎｃｅ　２３８： ６４５−６５０）。小モル濃度のホモピリミジンオリゴデオキシリボヌクレオチ ドもまた、原核生物の修飾酵素よる二重らせんＤＮＡの認識及びホモプリン標的 部位において真核生物の転写を阻害することが示された（Ｍａｈｅｒ　ｅｔ　ａ ｌ、、１９８９．５ｃｉｅｎｃｅ２４５　ニア２５−７３０）。最近になって、 ２ｏ塩基トリブレツトに関する研究の結果は、三重らせんはホモプリンから混合 配列へと伸びることができることを示唆している（Ｇｒｉｆｆｉｎａｎｄ　Ｄｅ ｒｖａｎ、１９８９．５ｃｉｅｎｃｅ　２４５：９６７−９７１）。 のオリゴヌクレオチド結合体は、少なくとも１つのジスルフィド結合を含む分子 リンカ−を介して、細胞の外層膜及び／又は血液−脳関門を通過しての輸送を容 易にする薬剤（これ以後”輸送剤“という）と結合したオリゴヌクレオチドから なる。本発明の構成物はまた少なくとも１つのジスルフィド結合を有する分子リ ンカ−を含むオリゴヌクレオチド結合体からなり、ここで該分子リンカ−は細胞 外条件では安定性を与えるが、細胞内条件では不安定である。好ましい面におい ては、構成物が細胞内に輸送される際に、又はその後にジスルフィド結合が開裂 する。本発明の特定の態様においては、結合体のオリゴヌクレオチド部分は６− ５０ヌクレオチドからなり、８−３０ヌクレオチドの大きさが最も好ましい。本 発明の好ましい態様においては、結合体のオリゴヌクレオチド部分は６−５０ヌ クレオチドからなり、そして標的細胞内の核酸配列の少なくとも一部分とハイブ リダイズすることができる。輸送剤はコレステロール、ペプチド、タンパク質、 脂質、サツカリド、ヌクレオシド及びその類似体、抗体、及び生体適合性ポリマ ーを含む群から選択できるが、これに限定されるものではない。特定の態様にお いては輸送剤はコレステロールである。 本発明はまた、医薬的に受容し得る担体中に有効量の本発明のオリゴヌクレオチ ド結合体を含む医薬組成物を提供する。本発明の医薬組成物を投与することから なる各種の疾病及び障害を治療する方法も提供する。したがって、本発明は少な くとも１つのジスルフィド結合を含む分子リンカ−を介して輸送剤と結合したオ リゴヌクレオチドからなる構成物を細胞に提供することからなる、治療的に有効 なオリゴヌクレオチドの細胞への送達を増強することを含む治療法に関する。 他の態様においては、本発明は本発明のオリゴヌクレオチド結合体からなる有効 量の構成物を細胞に与えることからなる、原核生物又は真核生物細胞内における 核酸配列の発現を阻害する方法に関する。ある態様においては、細胞内の核酸配 列の発現は、オリゴヌクレオチドが細胞内の核酸配列とハイブリダイズすること によって阻害される。その他の態様においては、このような構成物は細胞中のポ リメラーゼの作用を阻害することによって細胞中の核酸の発現を阻害する。さら に他の態様においては、このような構成物は細胞中の二本鎖核酸配列と三重らせ んを形成することによって細胞中の核酸配列の発現を阻害する。特に、この構成 物は有効な抗ウィルス、抗真菌、又は抗バクテリア剤となりつる。 さらに、この構成物は細胞性ガン遺伝子のような細胞性遺伝子の発現を阻害する のに用いることができる。 本発明はまた、本発明のオリゴヌクレオチド結合体からなる構成物を生存細胞に 与えることによって、原核生物又は真核生物細胞中の核酸配列を検出する方法に 関し、ここでそのオリゴヌクレオチドは（ａ）検出可能な標識と結合されており 、そして（ｂ）細胞中の核酸配列とハイブリダイズすることができる。 本発明はまた、ヒト体液、細胞、又は組織抽出物中にある病原体の内因性又は外 因性の標的ＤＮＡ、或いは病理学的状態と関連する遺伝子配列の存在をスクリー ニングする間接結合アッセイからなるオリゴヌクレオチド−ジスルフィド結合体 を診断プローブに用いる核酸配列の検出方法に関し、ここではジスルフィドリン カ−を介してオリゴヌクレオチドに結合したリポーターグループを含むオリゴヌ クレオチドプローブが標的ＤＮＡ配列を含む物質に加えられて、リポータ−グル ープは放出されて、これに還元剤を加えることによってハイブリッド標的／プロ ーブＤＮＡ複合体から測定される。 間接結合アッセイを改変して、遊離チオール基を有するリンカ−グループを含む オリゴヌクレオチドプローブを支持体膜に結合したＤＮＡとハイブリダイズさせ ることができる。次いで酸化条件の下でジスルフィド結合を形成することによっ て、遊離チオール基を含むリポータ−グループを、標的ＤＮＡと複合体を形成し たオリゴヌクレオチドリンカーの遊離チオール基に結合させることができる。所 望するならば、リポータ−グループ・標的ＤＮＡ結合を次いで還元的条件にさら すことによって開裂して、次にリポータ−グループを検出することができる。 診断的検出アッセイにおけるオリゴヌクレオチドは、治療的用途の結合オリゴヌ クレオチドと同様に、ハイブリダイゼーションによって引き起こされる特異的架 橋剤を導入することによって感度を増加し、バックグランドを減少するように修 飾することができる（例えば、Ｍｅｙｅｒ　ｅｔ　ａｌ、、１９８９．Ｊ、Ａｍ 、　Ｃｈｅｍ、　Ｓｏｃ、　Ｉ　Ｉｆ　：８５１７−８５１９；Ｂｉｒｇｅｔ　 ａｌ、、１９９０．Ｎｕｃｌ、Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、１８：２９０１−２９０７ ；Ｕｈｌｍａｎｎ　ａｎｄ　Ｐｅｙｍａｎ＋　１９９０．Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｒ ｅｖｉｅｗｓ　９０　（４）：５４３）。 上記の間接結合アッセイの別の改変では、リポータ−グループとジスルフィドリ ンカ−とを含むプローブを、膜に結合した二本ｔ　ＭＤＮＡに配列特異的に結合 させるような核酸類似体と組み合ゎ川　せて使用して、これによって三重らせん 構造を形成する。 仁　間接結合アッセイのさらに他の改変では、二本鎖オリゴヌクレオチド（これ は同種のＤＮＡ−結合性タンパク質によって認識さ７　れる結合部位配列を含ん でいる）を用いて、ＤＮＡ結合性タンパク質と特異的に結合させ、これを単離す る。さらに、このアッセｉ　イを改変して、チオール基で誘導化した市販の固体 支持体樹脂を用いて、次いでこれをオリゴヌクレオチド上のチオール基に結合さ せてジスルフィド結合を形成させ、次いでＤＮＡ結合性タンパク質を固定化標的 ＤＮＡ配列に結合させることができる。 ３．１．定義 本明細書中で定義する”オリゴヌクレオチド”とは、少なくとも６ヌクレオチド 、最大約５０ヌクレオチドからなるＤＮＡ又はＲＮＡ配列である。オリゴヌクレ オチドは一本鎖又は二本鎖である。オリゴヌクレオチドは塩基部分、糖部分、又 はリン酸骨格で修飾されていてもよい。オリゴヌクレオチドはまたペプチドのよ うな他の付属基を含んでいてもよい。リン酸骨格の一部は他の部分で置換されて いてもよい。 ”ペプチド”とは少なくとも１個のアミノ酸を含むタンパク質の断片である。ペ プチドはいずれの反応性部位、例えばアミド結合、及びペプチド中の１又はそれ 以上のアミノ酸で修飾されていてもよい。ペプチドはまた他の付属基を含んでい てもよい。本明細書中で使用する”オリゴヌクレオチドジスルフィド結合体“の 語は、ジスルフィド基を介して他の物質と結合したオリゴヌクレオチドを意味す る。本明細書で使用する”リポータ−グループの語は、検出されつる物質を意味 する。”リポータ−グループ”の語は酵素、蛍光標識、放射性標識、及びヒオチ ン・アビジン標識を含むが、これに限定されるものではない。 ４、

【図面の簡単な説明】

図１は、）レステ０−ルーＴｃ−Ｒ−８−８−Ｒ−ＣＡＧＴＧＡＴＴの構造を示 す。 図２は、コレステｏ−ルーＴＣ−Ｒ−８−３−Ｒ−ＣＡＧＴＧＡＴＴＴＴＴＴＴ ＣＴＣＣＡＴと共にインキュベートしたＨ９３８細胞の細胞質（Ｃ）及び核（Ｎ ）分画から回収したオリゴヌクレオチド中でジスルフィド結合が還元されたこと を示すオートラジオグラムである。サンプルは３７℃でコレステロール−ＴＣ− Ｒ−８−８−Ｒ−ＣＡＧＴＧＡＴＴＴＴＴＴＴＣＴＣＣＡＴと０．４及び４８時 間インキュベーションして回収した。ＳＭは出発物質を表し、Ｒは１０ｍＭジチ オトレイトール（Ｄ　Ｄ　Ｔ）を１ｎＶｉｔｒＯで還元したサンプルを表す。 図３は、コレステロールーＴＣ−Ｒ−３−３−Ｒ−ＣＡＧＴＧＡＴＴＴＴＴＴＴ ＣＴＣＣＡＴをＨ９３Ｂ細胞と共に０，４及び４８時間インキュベーションした 後に、細胞の培地から回収したコレステｏ−ルーＴＣ−Ｒ−８−８−Ｒ−ＣＡＧ ＴＧＡＴＴＴＴＴＴＴＣＴＣＣＡＴのオートラジオグラムを示す。ＳＭは出発物 質を表し、Ｒは１０ｍ、Ｍ　ＤＤＴを用いてｉｎ　ｖｉｔｒｏで還元したサンプ ルを表す。実験は二重で行った。 図４は、コレステロール−ＴＣ−Ｒ−３−３−Ｒ−ＣＡＧＴＧＡＴＴＴＴＴＴＴ ＣＴＣＣＡＴをＲＰＭＩ培地＋培地＋１下インキュベートした結果を示す。実験 は二重に行った。”Ｃ”はコントロール、すなわちＲＰＭＩ＋１５％熱不活性化 ＦＣ５中でインキュベートしなかった化合物を表す。 ５、発明の詳細な説明 本発明は生存細胞又は生物へのオリゴヌクレオチドの送達を増強するための構成 物及び方法に関する。本発明の構成物はオリゴヌクレオチド結合体からなる。こ れらのオリゴヌクレオチド結合体は、少なくとも１つのジスルフィド結合を含む 分子リンカ−を介して、細胞の外層膜及び／又は血液−脳関門を通過しての輸送 を可能にする薬剤（ここでは″輸送剤”という）と結合したオリゴヌクレオチド からなる。本発明のある面においては、オリゴヌクレオチド結合体は少なくとも １つのジスルフィド結合を有する分子リンカ−を含み、ここで該分子リンカ−は 細胞外条件では安定性を与えるが、細胞内条件では不安定である。好ましい面に おいては、構成物が細胞内に輸送される際に、又はその後にジスルフィド結合が 開裂する。 本発明はまた、医薬的に受容し得る担体中に有効量の本発明のオリゴヌクレオチ ド結合体を含む医薬組成物を提供する。本発明の医薬組成物を投与することから なる各種の疾病及び障害を治療する方法も提供する。 他の態様においては、本発明は本発明のオリゴヌクレオチド結合体からなる有効 量の構成物を細胞に与えることからなる、原核生物又は真核生物細胞内における 核酸配列の発現を阻害する方法酸物を生存細胞に与えることによって、原核生物 又は真核生物細胞中の核酸配列を検出する方法に関し、ここでそのオリゴヌクレ オチドは（ａ）検出可能な標識と結合されており、そして（ｂ）細胞中の核酸配 列とハイブリダイズすることができる。 本発明はまた、ヒト体液、細胞、又は組織抽出物中にある病原体生物の外因性の 標的ＤＮＡの存在をスクリーニングする間接結合アッセイからなるオリゴヌクレ オチド−ジスルフィド結合体を診断プローブに用いる核酸配列の検出方法に関し 、ここではジスルフィドリンカ−を介してオリゴヌクレオチドに結合したリポー タ−グループを含むオリゴヌクレオチドプローブが標的ＤＮＡ配列を含む物質に 加えられて、リポータ−グループは放出されて、これに還元剤を加えることによ ってハイブリッド標的／プローブＤＮＡ複合体から測定される。 間接結合アッセイを改変して、遊離チオール基を有するリンカ−グループを含む オリゴヌクレオチドプローブを支持体膜に結合したＤＮＡ又はＲＮＡとハイブリ ダイズさせることができる。次いで酸化条件の下でジスルフィド結合を形成する ことによって、遊離チオール基を含むリポータ−グループを、標的ＤＮＡと複合 体を形成したオリゴヌクレオチドリンカーの遊離チオール基に付着させることが できる。所望するならば、ジスルフィド結合を次いで開裂して、リポータ−グル ープを検出することができる。 診断的検出アッセイにおけるオリゴヌクレオチドは、治療的用途の結合オリゴヌ クレオチドと同様に、ハイブリダイゼーションにより誘発される特異的架橋剤を 導入することによって感度を増加し、バックグランドを減少するように改変する ことができる（例えば、Ｍｅｙｅｒ　ｅｔ　ａｌ、、１９８９．Ｊ、Ａｍ、Ｃｈ ｅｍ、　Ｓａｃ、　ｌｉｌ：８５１７−８５１９；Ｂｉｒｇ　ｅｔａｌ、、１９ ９０．　Ｎｕｃｌ、Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、１８：２９０Ｌ−２９０７；Ｕｈｌｍ ａｎｎ　ａｎｄ　Ｐｅｙｍａｎ、１９９０、Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｒｅｖｉｅｗｓ 　９０　（４）　：５４３）。 上記の間接結合アッセイのその他の改変では、二本鎖ＤＮＡへ特異的に結合する ヌクレオチド配列をも含む、リポータ−グループとジスルフィドリンカ−を含む プローブを使用して、これによって三重らせん構造を形成する。例えば、このよ うな類似体は５−メチルシトシン（Ｍａｙｅｒ　ｅｔ　ａｌ、、１９８９．５ｃ ｉｅｎｃｅ　２４５　：　７２５−７３０）を含むが、これに限定されるもので はない。 間接結合アッセイのさらに他の改変では、二本鎖オリゴヌクレオチド（これは同 種のＤＮＡ−結合性タンパク質によって認識される結合部位配列を含んでいる） を用いて、ＤＮＡ結合性タンパク質と特異的に結合させ、これを単離する。 さらに、結合アッセイは、チオール基で誘導化した市販の固体支持体樹脂を用い て、次いでこれをオリゴヌクレオチド上のチオール基に結合させてジスルフィド 結合を形成させることにより行われる。次いでオリゴヌクレオチドを標的ＤＮＡ に結合させ、これをこのような標的ＤＮＡ配列の単離に用いることができる。次 いで還元的条件にさらすことによって、結合複合体を固体支持体から放出するこ とができる。 ５．１．オリゴヌクレオチド−輸送剤結合体本発明は生存細胞によるオリゴヌク レオチドの取り込みを容易にするための構成物を提供する。好ましい態様におい ては、輸送過程を介していったん細胞に取り込まれたら、オリゴヌクレオチド結 合体中のジスルフィド結合は細胞内還元によって開裂することができ、輸送剤か らオリゴヌクレオチドを遊離する。得られる産物は遊離チオールであり、これは 細胞内の強い還元的条件下でその興味のある標的を探すことができる。 本発明の結合体中の分子リンカ−は好ましくは、その末端の片側又は両側、或い は内部にオリゴヌクレオチドと輸送剤との間に、少なくとも１つのジスルフィド 結合を有する炭化水素からなる。分子リンカ−はへテロ原子、アミノ酸又はペプ チド、ヌクレオシド又はヌクレオチドなどを含んでいてもよい。或いは、分子リ ンカ−は単なるジスルフィド結合からなる。■又はそれ以上のジスルフィド基を 含む分子リンカ−はオリゴヌクレオチドの５′又は３′末端のいずれか、或いは 内部に導入することができる。特定の態様においては、分子リンカ−はオリゴヌ クレオチド内のピリミジンの５′位、プリンの８′位、又は糖の２′位に導入す ることができる。 （本頁以下余白） 他の特定の態様においては、分子リンカ−は以下の式：％式％ ＹはＨ，ＣＨ３，アルキル、アリール又はＣであり；そしてＲ１はＨ，ＣＨ３， アルキル又はアリールであるを有する。 上記の分子リンカ−はｉｎ　ｖｉｖｏで制御しうるｔ　ｌ／２を有しており、こ れをプロドラッグ／輸送成分として使用することを容易にしている。本発明のオ リゴヌクレオチド結合体中にこれらの分子リンカ−を使用すると、細胞外の条件 下では分子リンカ−中に見られるジスルフィド結合に安定性を与えるが、細胞内 の条件下ではジスルフィド結合の開裂を可能にする。これにより細胞への輸送前 のオリゴヌクレオチド結合体の安定性が増加するが、この構成物を細胞内に輸送 する間、或いはその後にジスルフィド結合が開裂できる。 ジスルフィド結合のｉｎ　ｖｉｖｏにおける安定性の制御は、分子リンカ−中の ジスルフィド結合に隣接する基を変更することによってなされる。ジスルフィド 結合近くに電子吸引性基を有すると安定性が増加する。好ましい態様においては 、ＸはＯ又はＮＦ２であり、ＹはＣＨ２ＣＨ２又はＣＯであり、そしてＲ１はＨ 又はＣＨ，である。 本発明のオリゴヌクレオチド結合体中の上記の分子リンカ−を使用すると、細胞 外の条件下で、すなわち組織培養培地中でｔｌ／２が２４時間より大きく、また 細胞内でのｔ１／２は１時間以内であった。細胞内の条件下とは対照的なこの細 胞外の条件下における大きな安定性は約−２００ｍＶから約−２３０ｍＶの範囲 にある酸化還元電位によって示される。これは本出願の実施例７．８において記 載する。 オリゴヌクレオチドは当業界で公知の種々の方法を用いて輸送剤に結合すること ができる（たとえば、Ｃｈｕ　ａｎｄ　Ｏｒｇｅｌ、１９８８．Ｎｕｃｌ、Ａｃ １ｄｓ　Ｒｅｓ、１８：３６７１−３６９０；Ｚｕｃｋｅｒｍａｎｎ　ｅｔ　ａ ｌ、、１９８７、Ｎｕｃｌ、Ａｃｔｄｓ　Ｒｅｓ、１５：５３０５−５３２１） 。ある態様においては、オリゴヌクレオチドが少なくとも１つのジスルフィド結 合を有するように、オリゴヌクレオチドとジスルフィド結合を含む二官能性試薬 とを反応させてジスルフィド結合を導入することができる。このような試薬は２ −ヒドロキシエチルジスルフィドシスタミン（Ｃｈｕ　ａｎｄ　Ｏｒｇｅ　１． ｌ　９８８、Ｎｕｃｌ、Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、１６：３６７１−３６９０）、２ ．２°　−ジピリジルジスルフィド（Ｃｈｕ　ａｎｄ　Ｏｒｇｅｌ、１９８８． Ｎｕｃｌ、Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、１６：３６７１−３６９０）、１．　６−ヘキ サンジチオール（Ｚｕｃｋｅｒｍａｎｎ　ｅｔ　ａｌ、、１９８７．Ｎｕｃｌ、 Ａｃ１ｄｓＲｅｓ、１５：５３０５−５３２１）、２−イミノチオラン（Ｋｉｎ ｇ　ｅｔ　ａｌ、、１９７８．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ１７：１４９９−１５ ０６）、及び６，６′−ヒドロキシルへキシルジスルフィドを含むが、これに限 定されない。ジスルフィド結合を有するオリゴヌクレオチドを次いで遊離チオー ル基を含む輸送剤と反応させる。或いは、二官能性薬剤を輸送剤と反応させて、 得られる生成物を次いで遊離チオール基を含むオリゴヌクレオチドと反応させて オリゴヌクレオチド−輸送剤結合体を生成する。或いは、ジスルフィドを結合片 として用い、次いでタンパク質又はＤＮＡ　（ＲＮＡ）のいずれかと架橋反応す ることのできる二官能性試薬を用いることもできる。特定の態様においては、以 下の実施例の部６に記載する結合法、又はその改変した方法を用いることもでき る。他の特定の態様においては、試薬二Ｎ−スクシニミジル３−（２−ピリジル ジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ；Ｐｉｅｒｃｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、 ）を用いて結合を行うことができる（例えば、Ｊｕｎｇ　ｅｔ　ａｌ、、１９８ １、Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ｒｅｓ、Ｃｏｍｍｕｎ、１０１：５９９ −６０６）。５ＰＤＰはアミド結合を形成することによって、遊離アミノ基を容 易に修飾する。同時に、この修飾はジスルフィド交換を含む第２の反応に使用す るための活性化ジスルフィドを導入する。カップリングは２−チオビリジノンの 置換を介する、遊離チオール基を含む物質とのジスルフィド交換によって達成さ れる。得られる生成物は還元可能なジスルフィド結合を介して結合された２つの 分子を含む。 ５．２１本発明による結合体のオリゴヌクレオチド部分本発明による結合体のオ リゴヌクレオチド部分はＤＮＡ又はＲＮＡ、−末鎖又は二本鎖でありうる。好ま しい面においては、オリゴヌクレオチドは一本鎖ＤＮＡである。本発明の特定の 態様においては、結合体のオリゴヌクレオチド部分は６−５０ヌクレオチドから なり、８−３０ヌクレオチドの大きさが最も好ましい。 本発明の好ましい態様では、結合体のオリゴヌクレオチド部分は６−５０ヌクレ オチドからなり、標的細胞中の核酸配列の少なくとも一部とハイブリダイズする ことができる。オリゴヌクレオチドはその構造上のいかなる位置においても当業 界で一般に知られた置換基で修飾することができる。 オリゴヌクレオチドは以下の群：５−フロロウラシル、５−ブロモウラシル、５ −クロロウラシル、５−ヨードウラシル、ヒボキサンチン、キサンチン、４−ア セチルシトシン、５−（カルボキシヒドロキシルメチル）ウラシル、５−カルボ キシメチルアミノメチル−２−千オウリジン、５−カルボキシメチルアミノメチ ルウラシル、ジヒドロウラシル、ベーターＤ−ガラクトシルケオシン、イノシン 、Ｎ６−イツペンテニルアデニン、ｌ−メチルグアニン、１〜メチルイノシン、 ２，２−ジメチルグアニン、２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、３−メ チルシトシン、５−メチルシトシン、Ｎ６−アデニン、７−メチルグアニン、５ −メチルアミノメチルウラシル、５−メトキシアミノメチル−２＝チオウラシル 、ベーターＤ−マンノシルケオシン、５′　−メトキシカルボキシメチルウラシ ル、５−メトキシウラシル、２−メチルチオ−Ｎ６−イツペンテニルアデニン、 ウラシル−５−オキシ酢酸（Ｖ）、ワイブトキソシン、プソイドウラシル、ケオ シン、２−チオシトシン、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシル、 ４−チオウラシル、５−メチルウラシル、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエス テル、ウラシル−５−オキシ酢酸（Ｖ）、５−メチル−２−チオウラシル、３− （３−アミノ−３−Ｎ−２−カルボキシプロピル）ウラシル、（ａｃｐ３）ｗ、 及び２゜６−ジアミツプリンから選択される少なくとも１つの修飾塩基部分を含 むが、これに限定されるものではない。 その他の態様においては、オリゴヌクレオチドは以下の群：アラビノース、２− フロロアラビノース、キシロース、及びヘキソースから選択される少なくとも１ つの修飾糖部分を含むが、これに限定されない。 さらに他の態様では、オリゴヌクレオチドは以下の群：ホスホロチオエート、ホ スホロジチオエート、ホスホラミドチオエート、ホスホラミデート、ホスホロジ チオエート、メチルホスホネート、アルキルホスホトリエステル、ホルムアセタ ール、又はこれらの類似体から選択される少なくとも１つの修飾ホスフェート骨 格を含む。 さらに他の態様では、オリゴヌクレオチドはα−アノマーオリゴヌクレオチドで ある。α−アノマーオリゴヌクレオチドは相補的ＲＮＡと特異的な二本鎖ハイブ リッドを形成し、これは通常のβ−ユニットとは対照的に鎖が互いに平行となる （Ｇａｕｔｉｅｒ　ｅｔ　ａｌ、、１９８７．Ｎｕｃｌ、Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ。 １５　：６６２５−６６４１）。 オリゴヌクレオチドの塩基部分、糖部分、及び／又はホスフエ−ト骨格部分にジ スルフィド結合を有する分子リンカ−を介して、オリゴヌクレオチドは輸送剤と 結合していてもよい。 ５．３１本発明による結合体の輸送剤 本発明の輸送剤は、これと結合したオリゴヌクレオチドの標的細胞への送達を増 加する。輸送剤はｉｎ　ｖｉｖｏで細胞膜、又は血液−脳関門を通過しての結合 オリゴヌクレオチドの輸送を容易にする。好ましい態様では、ジスルフィド結合 の細胞内還元によって、輸送剤は標的細胞に取り込まれた後にオリゴヌクレオチ ドから開裂する。輸送剤が細胞膜を通過して細胞内へ入ることを容易にする好ま しい態様では、輸送剤は吸着性エンドサイト−シス（疎水性又は静電的）、クセ ブタ−媒介型エンドサイトーシス、又は膜融合性（例えば、リポソーム、ウィル スゴースト粒子、融合活性を有するタンパク質など）によって細胞内に入るよう な、当業界で公知の分子でありうる。輸送剤として用い得る受動的輸送プロセス の媒介物は、親油性物質、ポリリシン又はオリゴリシンのようなポリカチオン、 その他のポリアミンなどを含むが、これに限定されない。輸送剤として用い得る クセブタ−媒介型エンドサイトーシスを受けやすい化合物は、トランスフェリン 、上皮増殖因子、及び当業界で公知のその他のものを含むが、これに限定されな い。輸送剤はコレステロール、ペプチド、タンパク質脂質（例えば、少なくとも １２個の炭素原子を有する脂肪酸、トリグリセリド、リン脂質、グルココルチコ イド）、サツカリド（例えば、マンノース、グルコース、ガラクトース）、抗体 、ヌクレオシド又はヌクレオチド類似体、及び生体適合性ポリマー（例えば、セ ルロース、ポリエチレングリコール、ポリビニルアルコール）を含む群から選択 できるが、これに限定されない。特定の態様においては、輸送剤は１８個の炭素 原子を有する脂肪酸である。他の特定の態様においては、輸送剤はコレステロー ルである。 このような化合物の特定な例は以下のような構造を有する；コレステロール−ジ ヌクレオチド−Ｒ，−３−８−Ｒ２−オリゴヌクレオチド（ここでＲ２及びＲ２ は炭化水素鎖であり、Ｒ１はＲ２と同じであってもよい）。特定の面においては 、オリゴヌクレオチドはその５′末端でジスルフィド結合を介してコレステロー ルと結合している。 ある態様においては、本発明の結合体は血液−脳関門の通過を容易にする輸送剤 を含む。血液−脳関門は主として脂質からなっているので、この態様では輸送剤 が親油性であることが好ましい。 このような輸送剤はコレステロール、疎水性ペプチド、少なくとも１２個の炭素 原子を有する脂肪酸、トリグリセリド、及び生体適合性ポリマー（例えば、セル ロース、ポリエチレングリコール、ポリビニルアルコール）を含むが、これらに 限定されるものではない。この態様の他の面では、輸送剤はＰＣＴ国際公開Ｎｏ 、Ｗ○８９／１０１３４　（１９８９年１１月２日公開）に開示されているよう な、血液−脳関門を通過することのできるペプチドでありうる。 上記の輸送剤はその構造のいずれの位置においても当業界で一般的な置換基で修 飾することができる。ペプチド、タンパク質、コレステロール、及び脂質類似体 はアルキル、シクロアルキル、アリール、アルカリール、ヒドロキシアルキル、 エステル、エーテル、アミド、ハロ、ニトロ、シアノ、及びカルボン酸を含む置 換基で置換できるが、これに限定されない。 さらに、他のヌクレオチド配列にハイブリダイゼーションによって引き起こされ る架橋を提供する誘導化ヌクレオシド又はヌクレオチド類似体を本発明の結合オ リゴヌクレオチドに導入するこ本発明は、有効量の本発明のオリゴヌクレオチド 結合体を含む構成物を培養中又はｉｎ　ｖｉｖｏの生存細胞に与えることからな る原核性又は真核性の植物又は動物細胞中の核酸配列の発現を阻害する方法に関 する。ひとつの態様においては、細胞中の核酸配列の発現は、オリゴヌクレオチ ドが細胞中の核酸配列とハイブリダイズすることによって阻害される。他の態様 では、このような構成物は細胞中のポリメラーゼの作用を阻害することによって 細胞中の核酸の発現を阻害することができる。さらに他の態様では、このような 構成物は細胞中の二本鎖核酸配列と三重らせんを形成することによって細胞中の 核酸配列の発現を阻害することができる。 核酸配列は原核生物又は真核生物細胞、正常又は新生物細胞中に存在する。好ま しい態様においては、細胞は哺乳動物細胞である。核酸配列は細胞にとって内因 性であってもよく、又は細胞中に見いだされるものであるが、病原体生物にとっ て特異的なものであってもよい。さらに、核酸配列はＤＮＡ又はＲＮＡ配列であ ってもよい。 本発明の構成物は治療剤として有用であり、例えばバクテリア又はウィルス又は 真菌タンパク質、又はガン遺伝子のような細胞性タンパク質、また自己免疫疾患 に役割を果たすと考えられているＴ細胞リセブターの発現を阻害するために用い ることができる。 或いは、この構成物は農業目的に使用することができる。例えば、このような構 成物は特定の酵素活性の修飾のような植物の表現型の特徴を変えるのに使用する ことができる。 最も好ましい面においては、オリゴヌクレオチドは細胞中に入る間、又はその後 に輸送剤から開裂する。 ある態様では、本発明のオリゴヌクレオチド結合体からなる有効量の構成物を細 胞に与えることによって、核酸配列の発現を阻害することができ、ここで結合体 のオリゴヌクレオチド部分は６−５０ヌクレオチドからなり、８−３０ヌクレオ チドの大きさが最も好ましく、核酸配列の少なくとも一部とハイブリダイズする ことができる。この態様においては、オリゴヌクレオチド配列は”アンチセンス ”又は相補的であり、したがって核酸配列とハイブリダイズすることができる。 色々な面において、核酸配列は一本鎖、二本鎖、又は多数鎮咳酸中に含まれる。 オリゴヌクレオチド結合体が、二本鎖核酸上に含まれるオリゴヌクレオチドと相 補的な配列と結合する場合には三重らせんが形成される。 核酸配列の発現を阻害するための特定の面においては、もしも核酸配列が二本鎖 ＤＮＡの配列中に含まれる場合には、オリゴヌクレオチド配列は核酸配列の相補 鎖の配列と相補的である。他の特定の面においては、オリゴヌクレオチド配列は 核酸配列から翻訳されたＲＮＡと相補的でありうる。 核酸配列の発現を阻害するための他の態様においては、結合体のオリゴヌクレオ チドは核酸配列又はそれと相補的な鎖と相補的な配列を有する必要はない。何故 ならば、例えば、ランダムな配列又はホモポリマーであるある種のオリゴヌクレ オチドは、ウィルス由来のもののようなある種の非相補的核酸配列の発現を阻害 することができるからである（例えば、Ａｒａｄｉ、Ｊ、ａｎｄＨｏ、Ｙ、に、 、１９８５．Ｃａｎｃｅｒ　Ｂｉｏｃｈｅｍ。 Ｂｉｏｐｈｙｓ、７　：　３４９−３５９　；Ｍａｊｕｍｄａｒ、Ｃ。 、ｅｔ　ａｌｌ、１９８９．Ｂｉｏｃｈｅｍ、２８　（３）：１３４０−１３４ ６）。 特定の態様では、病原体生物の核酸配列の発現を阻害することができる。特定の 面においては、本発明の結合体のオリゴヌクレオチドは病原体生物のＤＮＡ又は ＲＮＡ配列の少なくとも一部と相補的でこれとハイブリダイズすることのできる 配列を含む。 ２、治療への適用 有効量の本発明のオリゴヌクレオチド結合体を含む構成物を被験者に投与するこ とによって、各種の疾病及び障害を治療することができる。好ましい面において は、構成物がいったん細胞に取り込まれたら、ジスルフィド結合が開裂してオリ ゴヌクレオチドが放出される。オリゴヌクレオチドがウィルスの核酸配列の発現 を阻害する、本発明の結合体を投与することによって治療されるウィルス性疾病 及び障害は、肝炎ウィルスＢ、サイトメガロウィルス、ヘルペスシンプレックス ウィルス■又はＬＩ、ヒト免疫不全ウィルス・タイプＩ又はＩＬインフルエンザ ウィルス、呼吸器シンジチア（ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ　５ｙｎｃｙｔｆａｌ） ウィルス、及びヒトパピローマウィルスによって引き起こされるものを含むが、 これに限定されない。本発明の結合体を投与することによって治療しうる悪性腫 瘍は、肺ガン（例えば、小細胞肺ガン腫）、結腸直腸ガン、前立腺ガン、乳癌、 白血病、及びリンパ腫を含むが、これに限定されない。例えば、悪性腫瘍の治療 においては、結合体のオリゴヌクレオチド部分は異常に発現したガン遺伝子をコ ードする遺伝子、又は悪性腫瘍の状態を維持するために必要な成長因子をコード する遺伝子と相補的で（かつこれとハイブリダイゼーションできる）ありうる。 輸送剤が血液−脳関門の通過を容易にする特定の態様では、構成物は神経学的障 害の治療に使用できる。 これらの障害はまた本発明によって提供されるように、このような疾病、障害又 は悪性腫瘍の存在と関連する核酸配列を検出することによって検出することがで きる。 ３、医薬的適用 治療的用途のためには、全身性、局部性、又は限局性投与を含む各種の投与方法 用に製剤化された本発明による有効量のオリゴヌクレオチド結合体を含む医薬組 成物が提供される。その方法及び製剤化は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’　ｓ　Ｐｈａ ｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ　５ｃｉｅｎｃｅｓ、Ｍｅａｄｅ　Ｐｕｂｌ　ｔｓｈｉ ｎｇＣｏ、、Ｅａｓｔａｎ、ＰＡ、最新版に記載されている。 全身性投与のためには注射が好ましく、筋肉内、静脈内、腹腔内、及び皮下注射 がある。注射用には、本発明の構成物は脱イオン水、水、リン酸緩衝液、又はエ タノール、好ましくは／＼シンクはリンガ−のような生理的適合性緩衝液などの 溶液で製剤化される。さらに、構成物は固形で製剤されて、使用直前に再溶解、 又は懸濁してもよい。凍結乾燥形態もまた含まれる。 全身性投与は経粘膜、又は経皮法であってもよく、また経口投与でもよい。経粘 膜又は経皮投与のためには、通過する関門に適した浸透剤が製剤中に用いられる 。このような浸透剤は当業界で公知であり、例えば、経粘膜投与用には胆汁酸塩 及びフシジン酸誘導体を含む。さらに、浸透を容易にするために界面活性剤を使 用することもできる。経粘膜投与は例えば、鼻スプレー、又は座薬を用いて行う ことができる。経口投与には構成物をカプセル、錠剤、及びトニックのような慣 用的経口投与形態に製剤化する。 局部性投与のためには、本発明の構成物を当業界で一般に知られた軟膏、軟膏剤 ゲル、又はクリームに製剤化する。或いは、構成物はリポソームのような小胞の 内腔中に製剤化することができる。 特定の面においては、その５′末端でジスルフィドを含む分子リンカ−を介して 輸送剤と結合しており、かつｉｎ　ｖｉｖｏでの分解を防ぐために、その３°末 端をメトキシエチルアミンで末端キャップしているオリゴヌクレオチドが静脈内 投与される。 構成物は当業界で公知の各種方法を用いて植物に投与することができる（Ｓｈｅ ｗｍａｋｅｒ　ｅｔ　ａｌ、、米国特許第４゜発明の構成物は適当なベクターに 導入して、エレクトロポレーション、形質転換、接種などによって植物中に投与 できる。 ４、診断及び検出への応用 オリゴヌクレオチドが少なくとも６個のヌクレオチドからなり、細胞内の核酸配 列の少なくとも一部とハイブリダイズすることができ、かつ検出可能なように標 識されている、有効量の本発明のオリゴヌクレオチド結合体を、細胞内にあるこ れと相補的な核酸配列とハイブリダイズさせることによって検出又は診断薬とし て使用することができる。この態様においては、有効量のこのようなオリゴヌク レオチド結合体は培養又はｉｎ　ｖｉｖｏにおける生存性原核生物又は真核生物 細胞内の核酸配列を検出するのに使用することができる。 オリゴヌクレオチドに結合する検出可能な標識は、放射性基、酵素、蛍光基、及 び抗体を含む群から選択されるが、これに限定されるものではない。細胞内に入 った後で、標識されたオリゴヌクレオチドは細胞内の相補的核酸配列とハイブリ ダイズし、当業界で公知の方法を用いて検出される。 本発明はまた、オリゴヌクレオチド−ジスルフィド結合体を核酸をベースとした 診断プローブとして用いる、外因性感染因子又このような方法の１つは、支持体 膜に結合したオリゴヌクレオチドを結合させることによって、ヒトの体液、組織 又は細胞抽出物中の標的ＤＮＡの存在をスクリーニングする間接アッセイからな る。ジスルフィドリンカ−をを介してオリゴヌクレオチドと結合したリポータ− グループを含むオリゴヌクレオチドプローブを、標的ＤＮＡ配列を含むＤＮＡ混 合物に加える。ジチオトレイトールのような還元剤を加えることにより、標的Ｄ ＮＡ／オリゴヌクレオチドプローブからアルカリ性ホスファターゼのような酵素 （ただしこれに限定されない）を含むリポータ−グループが放出される。次いで リポータ−グループを例えば分光測光的に測定することにより、標的ＤＮＡの存 在を定性的及び定量的に測定する。 本発明の他の態様では、遊離チオール基を有するリンカ−を含むオリゴヌクレオ チドプローブを用いて、あらかじめ固体支持体膜に固定化しておいた標的ＤＮＡ とハイブリダイズさせる診断アッセイを用いることができる。得られる非結合Ｄ ＮＡプローブを次いで洗浄して、オリゴヌクレオチドリンカー複合体の遊離チオ ール基に、遊離チオール基を含むリポータ−グループを付着させてジスルフィド 結合を形成する。次にリポータ−グループの検出によって標的ＤＮＡの存在を測 定する。他の態様においては、標的ＤＮＡよりもむしろ、オリゴヌクレオチドを 固体支持体に固定化することができる。 プローブ中にジスルフィド結合が導入される特定の態様においては、診断アッセ イの感度を増加し、バックグランドを減少する　。 ために、特定のハイブリダイゼーションによって引き起こされる架橋剤をオリゴ ヌクレオチドプローブ中に導入することができる。 架橋剤を使用すると、ａ）プローブの区別を増加するための架橋剤の使用、ｂ） バックグランドの減少のための変性（ｄｅｎａｔｕｒｉｎｇ）洗浄工程の導入、 及びＣ）ハイブリッドＤＮＡの融点又はその近くでハイブリダイゼーション及び 架橋を実施して、標的ＤＮＡにおける二次構造を減少し、かつプローブ特異性が 増加する、などの新規な診断アッセイの改変が可能となる。 本発明の他の特定な態様では、二本鎖ＤＮＡへの配列特異的結合に基づく診断ア ッセイに使用するために、ジスルフィドリンカ−を含むプローブを、５メチルシ トシンのような塩基類似体と組み合わせて使用することを含む。このような塩基 類似体はＤＮＡとハイブリダイゼーションして三重らせんを形成し、これによっ て極めて骨が折れ、かつまた至るところにあるヌクレアーゼに敏感なＲＮＡを単 離する必要を回避することができる。さらに、このような三重らせんプローブは 当業界で公知の各種リポータ−グループと結合でき、二本鎖ＤＮＡの特定領域の 検出及び定量化を容易にする。三重らせん構造を形成するプローブはまた、オリ ゴヌクレオチドをヌクレアーゼに対して安定にする変更（ａ　１　ｔ　ｅｒｅｄ ）ヌクレオチド間結合のような別の修飾を導入することもできる。このような安 定なオリゴヌクレオチドは、通常ヌクレオチド活性を含む細胞又は組織抽出物の 存在下で行われるアッセイに有用である。 本発明の別の態様は、ヒトの体液、細胞又は組織抽出物中に見られる相補的ＤＮ Ａ配列と結合させるために、ジスルフィド結合を形成することによって、チオー ル基で誘導体化した固体支持体に付着させるためにチオール基を有するオリゴヌ クレオチドを用いることからなる。この特定の態様においては、固体支持体は以 下のうちの１つからなる：５ｕｌｆｏｌｉｎｋ＠カップリング・ゲル・カラム、 トレシル活性化アガロース、ＩｍｍｕｎｏＰｕｒｅ■エポキシ活性化アガロース 、及びＴＮＢチオールアガロース（Ｐｉｅｒｃｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏｍｐ ａｎｙ）。 本発明の他の態様は、同種のＤＮＡ結合性タンパク質によって認識される結合部 位配列を含む二本鎖オリゴヌクレオチドからなり、これは細胞又は組織抽出物か ら単離したタンパク質混合物中のＤＮＡ結合性タンパク質と特異的に結合する上 記のアッセイに用いることができる。 以下に記載する実施例は説明のためのものであり、本発明を限定するものではな い。 ６、実施例；コレステロール−ＴＣ−Ｒ−３−３−Ｒ−ＣＡＧＴＧＡＴＴ及びコ レステロール−Ｔ　Ｃ−Ｒ−Ｓ　−Ｓ’　−Ｒ−ＣＡ　Ｇ　ＴＧＡＴＴＴＴＴＴ ＴＴＴＣＴＣＣＡＴの製造とアッセイこの実施例では、ジスルフィド結合を介し てコレステロールと結合した２つのオリゴヌクレオチド、コレステロール−ＴＣ −Ｒ−３−３−Ｒ−ＣＡＧＴＧＡＴＴ　（１）及びコレステロール−ＴＣ−Ｒ− ５−８−Ｒ−ＣＡＧＴＧＡＴＴＴＴＴＴＴＴＴＣＴＣＣＡＴ（ＩＩ）（式中、− Ｒ−３−５−Ｒ−は０３Ｐ　ＣＨ２ＣＨ２Ｓ−ＳＣＨ，ＣＨ２ＰＯ，であり、Ｔ Ｃはチミン及びシトシンヌクレオチド、Ａはアデニンヌクレオチド、Ｇはグアニ ンヌクレオチドを表す）の製造を記載する。化合物ＩＩを用いて実施した還元分 析試験の結果は、ジスルフィド結合が還元剤で開裂することを示唆した。化合物 ＩＩを用いて実施した取り込み及び血清安定性試験の結果は、化合物ＩＩが細胞 によって取り込まれ、かつ安定であることを示唆した。化合物ＩＩが細胞によっ て取り込まれるとジスルフィド結合が開裂する。 ２−ジメトキシトリチル−２−ヒドロキシエチルジスルフィドを２−クロロ−４ Ｈ−１，２，３−ベンゾジオキサホスホリン−４−オンと反応させることによっ て、２−ジメトキシトリチル−２−ヒドロキシエチル・水素ホスホネートを製造 した。 ２−ジメトキシトリチル−２−ヒドロキシエチルジスルフィドは以下の方法で製 造した。２−ヒドロキシエチルジスルフィド（２，５ｇ、１６．２ｍモル）をト リエチルアミン（１０ｍｌ）を含むメチレンクロリド（５０ｍｌ）の０℃溶液に 加えた。Ｎ、　Ｎ−ジメトキシトリチル（０，１５ｇ）及び４，４°　−ジメト キシトリチルクロリド（６，５ｇ、１９．４ｍモル）を加えた。０℃で２時間後 、反応物を飽和炭酸水素ナトリウム溶液で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥して乾 燥状態まで濃縮した。残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィー（Ｓｔｉｌｌ 　ｅｔ　ａｌ、、１９７８、Ｊ、Ｏｒｇ、Ｃｈｅｍ、４３　：２９２３−２９２ ５）で、メチレンクロリド中の１％トリエチルアミンで溶出して精製し、２−ジ メトキシトリチル−２−ヒドロキシエチルジスルフィド・水素ホスホネート（２ ，７ｇ、３７％収率）を油状物として得た。 ２−ジメトキシトリチル−２−ヒドロキシエチルジスルフィド（２，３ｇ、１５ ｍモル）を２−クロロ−４Ｈ−１，２，３−ベンゾジオキサホスホリン−４−オ ン（メチレンクロリド中のＬＭ溶液１５ｍ１，１５ｍモル）の***液に加えた。 ２時間後に反応物を炭酸水素トリエチルアンモニウム（ＴＥＡＢ）１Ｍ溶液で洗 浄した。有機溶液を分離漏斗で分離し、硫酸ナトリウムで乾燥し、溶媒を減圧で 除去した。残渣をシリカゲルのフラッシュカラムクロマトグラフィーで、２％ト リエチルアミン／メチレンクロリド、及び２％トリエチルアミン１５％メタノー ル／メチレンクロリドで溶出した。生成物の分画をＩＭ　ＴＥＡＢ溶液で洗浄し 、硫酸ナトリウムで乾燥し、溶媒を除去して、２−ジメトキシトリチル−２−ヒ ドロキシエチルジスルフィド・水素ホスホネート（５８％収率）を得た。 ６．２．リン酸水素コレステリルトリエチルアンモニウム塩の製メチレンクロリ ド５０ｍ１中のコレステロール（３，４ｇ、８．８ｍモル）を、０℃のメチレン クロリド溶液（１００ｍ１）又は２−クロロ−４Ｈ−１，２，３−ベンゾジオキ サホスホリン−４−オン（ＬＭのメチレンクロリド２０ｍ１中に２０ｍモル）及 びピリジン（１，６ｍｌ、２０ｍモル）に加えた。３０分後に、反応物をＩＭの 炭酸水素トリエチルアンモニウム（ＴＥＡＢ）に注いだ。有機溶液を分離し、Ｉ Ｍ　ＴＥＡＢで洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥し、濃縮した。残渣をフラッシュ カラムクロマトグラフィーで精製し、メチレンクロリド中の１０％メタノール、 及びメチレンクロリド中の１５％メタノールで溶出した。生成物の分画をＬＭ　 ＴＥＡＢで洗浄し、乾燥し、濃縮して、白色固形物の形状のリン酸水素コレステ リルトリエチルアンモニウム塩（１，０５ｇ、２１．６％収率）を得た。 Ｆｒｏｅｈｌｅｒら（１９８８，Ｎｕｃｌ、Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、１４：５３９ ９−５４０７）の記載する方法によって、Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ自動ＤＮＡ合成機 を用い、標準的水素ホスホネート化学を用いて、ｄ−ＣＡＧＴＧＡＴＴの５°位 にリン酸水素を導入した。ジメトキシトリチル基を除去して続いて上記のように Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ自動ＤＮＡ合成機を用い標準的水素ホスホネート化学を用い て、ＴＣをＲ−８−８−Ｒ−ＣＡＧＴＧＡＴＴに付加した。ＴＣ−Ｒ−８−８− Ｒ−ＣＡＧＴＧＡＴＴを次いでリン酸水素コレステリルトリエチルアンモニウム 塩のトリエチルアンモニウム塩と反応させた。反応生成物の構造は図１に示す。 １０Ｕのターミナルトランスフェラーゼ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｎｕｃｌｅ ａｒ）を用いて、１０μｃｉのａ−”Ｐ−ＵＴＰ　（Ａｍｅｒｓｈａｍ、３００ ０Ｃｉ／ｍモル）を導入することによって、コレステロール−ＴＣ−Ｒ−３−３ −Ｒ−ＣＡＧＴＧＡＴＴ　（Ｉ）の３′末端を標識した。ターミナルトランスフ ェラーゼティリングバッファーを用いて、反応混合物を１時間、３７℃でインキ ュベートした。次いで反応混合物を１０ｍＭＴｒｉｓ、１ｍＭ　ＥＤＴＡ、ｐＨ ７，５で希釈した。 ａ’　３２ｐ−コレステロール−ＴＣ−Ｒ−３−８−Ｒ−ＣＡＧＴＧＡＴＴ　５ ０，０００ｃｐｍを生理的条件下：５０ｍＭＴｒｉｓ中の１０ｍＭ　ＭｇＣｌａ 、ｌ　００ｍＭ　ＮａＣ１，ｐＨ７，５で、ｌ及びｌｏｍＭのジチオトレイトー ル（ＤＴＴ）で約３７℃、１時間処理した。あり得る改変をコントロールするた めに、デオキシ−ＣＡＧＴＧＡＴＴを１及び１０ｍＭ　ＤＴＴで処理した。次い で反応物を等容量の７Ｍ　ウレアローディングバッファー（２０％　蔗糖、０． １％　キシレンシアツール、０．１％　ブロモフェノールブルー、Ｏ，ＬＸ　Ｔ ＢＥバッファー）で希釈し、２０％／８Ｍ　ウレアポリアクリルアミドゲル上で 分析した。増感スクリーンを用いて一７０℃でオートラジオグラフィーでバンド を可視化した。 結果を図２の”Ｒ”レーンに示す。この結果は、オリゴヌクレオチドを１０ｍＭ 　ＤＴＴで処理すると、ジスルフィド結合が定量的に開裂することを示唆してい る。 ６．５．３２Ｐで内部標識されたコレステロール−ＴＣ−Ｒ−３−３−Ｒ−ＣＡ ＧＴＧＡＴＴＴＴＴＴＴＴＴＣＴＣＣＡＴの製造γ−３２Ｐ−ＡＴＰとＴ４ポリ ヌクレオチドキナーゼとを用いて、オリゴデオキシリボヌクレオチド５’　−Ｔ ＴＴＴＴＴＴＣＴＣＣＡＴ−３′の５′末端を標識した。このオリゴヌクレオチ ドは２−３′のほとんどのジエステル結合でのメトキシエチルアミン末端キャッ プを含み、水素ホスホネート化学によって製造した（Ｆｒｏｅｈｌｅｒ、１９８ ６．Ｔｅｔ、Ｌｅｔｔｅｒｓ　２７：５５７５−５５７８）ａＭａｎｉａｔｉｓ ら（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎ ｕａｌ、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａａｔ。 ｒｙ、１９８２．ｐ、１２２）の方法を用いて、オリゴデオキシリボヌクレオチ ドをγ−”Ｐ−ＡＴＰ　（Ｉ　ＣＮ　；　７０００　Ｃｉ／ｍモル）及びＴ４ポ リヌクレオチドキナーゼと反応させることによって、オリゴデオキシリボヌクレ オチドをホスホリル化した。 ホスホリル化の後、サンプルを６５℃で１５分間加熱した。１０倍過剰量の鋳型 ５°−ＴＧＧＣＴＧＡＴＧＧＡＧＡＡＡＡＡＡＡＴＣＡＣＴＧＧＡＧ　ＡＣＣＴ Ｃ−３°及び１００倍過剰のコレステロール−ＴＣ−Ｒ−５−３−Ｒ−ＣＡＧＴ ＧＡＴＴを溶液に加えた。この混合物を８５℃にまで３分間加熱し、１５℃にま で１時間冷却した。ＩＯＵのＴ４　ＤＮＡリガーゼとＡＴＰ　（最終濃度１ｍＭ ）とを加えて、ライゲーション反応を１５℃で一夜継続した。ライゲーションし た生産物を１５％／８Ｍウレアポリアクリルアミドゲル電気泳動で精製した。生 産物をオートラジオグラフィーで可視化し、ゲルから切り出した。３２ｐで標識 したオリゴヌクレオチドをｌｏｍＭ　Ｔｒｉｓ、ｐＨ７，５，１ｍＭＥＤＴＡ中 で一夜かけてゲルから溶出した。サンプルを脱塩してＣ８クイツクｓｅｐカラム （Ｂａｋｅｒ）を用いて濃縮し、３０％アセトニトリル／水で３２ｐ−標識のオ リゴデオキシリボヌクレオチドを溶出した。次いで溶媒を除去して、生産物を滅 菌水１００μｌ中に再懸濁した。 ６、　６．１２Ｐで内部標識されたコレステロール−ＴＣ−Ｒ−８−３−Ｒ−Ｃ ＡＧＴＧＡＴＴＴＴＴＴＴＴＴＣＴＣＣＡＴのＨ９３８取り込み及び還元分析研 究 １０％熱不活性化ウシつ児血清（Ｆｅ２）−ＲＰＭＩ培地中のメトキシエチルア ミン（ＭＥＡ）ホスホラミデートで３′末端を末端キャップした３２ｐで標識し たコレステロール−ＴＣ−Ｒ−５−５−Ｒ−ＣＡＧＴＧＡＴＴＴＴＴＴＴＴＴＣ ＴＣＣＡＴ：　（４Ｘ１０’ｃｐｍ）とともにＨ９３８細胞（３ｘｌＯ’細胞／ ｍ１）３００μ■をインキュベートした。０，４．及び４８時間目に細胞懸濁液 １００μｍを取り出し、以下に記載する分画実験に供した。 ＩＨ胞１００μｍをエツペンドルフミクロ遠心管中、６０００ｒｐｍ、４℃、５ 分間でペレット化した。上清５μｍを取り出し、電気泳動分析に供した。ペレッ トをリン酸緩衝液（ＰＢＳ）中に再懸濁し、ＩＯＵ　ＤＮａｓｅを加えた。次い で３７℃で１０分間消化を行った。５ｍＭ　ＥＤＴＡを加えて反応を停止した。 細胞懸濁液をエツベンドルフ遠心管中、６０００ｒｐｍ、４℃、５分間でペレッ ト化した。細胞ペレットを１００μＩ　ＰＢＳで洗浄し、エッペンドルフ遠心管 中、６０００ｒｐｍ、４℃で５分間、再遠心した。この工程を３回繰り返した。 細胞ペレットを１５ｍＭ　ＫＣＩ、２ｍＭ　ＭｇＣｌ２，０．１ｍＭ　ＥＤＴＡ 及び０．２％　ＮＰ−４０を含む２０ａｌの１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ、ｐＨ７，５中 に再懸濁した。サンプルを氷上に１分間置き、次いで３０秒間撹拌した。これを 繰り返した。この抽出物を次いでエッペンドルフ遠心管中、３０００ｒｐｍ、４ ℃で５分間遠心した。 上滑を除去し、上記６．３．の項で記載した７Ｍ　ウレアローディングバッファ ー中に希釈した。ペレット化した核を次いで１５ｍＭ　ＫＣＩ、２ｍＭ　ＭｇＣ ｌ２，０．１ｍＭ　ＥＤＴＡ及び１００ｍＭ　ＮａＣ１を含む２０μｍの１０ｍ Ｍ　Ｔｒｉｓ、ｐＨ７，５中で、６５℃、５分間破砕した。次いで等容量の７Ｍ ウレアローディングバッファーを加えた。 この分画からのサンプルを次いで、２０％ポリアクリルアミド／８Ｍ　ウレアゲ ルを用いる電気泳動で分析した。増感スクリーンを用いて、−７０℃でのオート ラジオグラフィーでバンドを可視化した。図２に示すように、細胞質及び核の分 画から還元したオリゴヌクレオチド中では結合が還元されたことが観察された。 細胞培養の培地からのオリゴヌクレオチドには還元は観察されなかった（図３を 参照せよ）。 ８．７．”Ｐ−標識コレスチロール−ＴＣ−Ｒ−３−３−Ｒ−ＣＡＧＴＧＡＴＴ ＴＴＴＴＴＴＴＣＴＣＣＡＴの血清安定性３’　−ＭＥＡ末端キャップ化された ３２ｐ−内部標識コレスチロール−ＴＣ−Ｒ−８−３−Ｒ−ＣＡＧＴＧＡＴＴＴ ＴＴＴＴＴＴＣＴＣＣＡＴを用いて、１５％熱不活性化ＦＣ８で補充したＲＰＭ Ｉ培地中におけるヌクレアーゼと還元安定性を試験した。３゛−ＭＥＡ末端キャ ップ化された！２ｐ−内部標識コレスチロールーＴＣ−Ｒ−Ｓ−８−Ｒ−ＣＡＧ ＴＧＡＴＴＴＴＴＴＴＴＴＣＴＣＣＡＴ　（４Ｘ　１０５ｃ　ｐｍ）を細胞培地 ２０μｍ中に加えた。０．３０，６０．及び１８０分後に５μｍを取り出した。 これを５μｍ　７Ｍ　ウレアローディングバッファー中に希釈し、氷上に保存し た。次いでサンプルを２０％ポリアクリルアミド／８Ｍウレアゲルを用いて分析 した。増感スクリーンを用いて、−７０℃でオートラジオグラフィーでバンドを 可視化した。図４に示すように、Ｆｅ２を含む培地中でジスルフィド結合は還元 に安定で３°及び５’　ＣＡＧＣＡＧＣＸＧＣ３’の製造この実施例では、ヌク レオチド内での位置がＸ＝Ｏ，ＰＯＣＨ２ＣＨ２０ＣＨ２ＣＨ２Ｓ　Ｓ　ＣＨ＊ 　ＣＨｔ　ＯＣＨ２ＣＨ２０Ｐ　Ｏｓ　テあるジスルフィド類似体に変更されて いる２つのオリゴヌクレオチドの製造を記載する。結果はこの種のものが還元的 に開裂することを示唆する。取り込み及び血清安定性試験を実施し、この類似体 は細胞に取り込まれ、かつ安定であることを示唆している。いったん細胞内に入 ると、この結合は開裂する。 ？、１．　（ヒドロキシエトキシ）エタンチオールの製造水中の（ヒドロキシエ トキシ）エチルクロリド（１０ｇ、８０ｍモル）の撹拌溶液にチオウレア（９， １ｇ、１２０ｍモル）を加えた。冷却器を付けて、混合物を一夜、アルゴン下で 還流させた。その後反応物を室温まで冷却し、５Ｎ　ＮａＯＨ（１００ｍ１．５ ００ｍモル）を加えた。反応物を再び３時間還流した。溶液を放冷し、アルゴン 下に注意深く濃塩酸を加えて、ｐＨ４にした。この時点で油状物が生成し、これ を水層から分離した。水層をＣＨＣｌ３で３回抽出した。有機物質（初めの油状 物も含む）を集めて、飽和塩溶液で抽出した。有機分画を硫酸ナトリウムで乾燥 し、濾過し、溶媒を減圧下で除去し、ヒドロキシエトキシエタンチオールを油状 物として得た（７．８ｇ、８０％収率）。 ７．２．　（ヒドロキシエトキシ）エチルジスルフィドの製造（ヒドロキシエト キシ）エタンチオール（３，７５ｇ、３０゜８ｍモル）をＩＮ　ＮａＯＨ（３３ ｍ１．３３ｍモル）中に溶解した。溶液を湿式アイスバスで０°Ｃまで冷却した 。９０分かけて固体ヨウ素（３，１２ｇ、１２．３２ｍモル）をゆっくりと加え た；すなわち、少量を加えてヨウ素の色が消散した後に、次の少量を加えた。ヨ ウ素添加が終了したら、反応物を氷上で３時間撹拌し、次いで室温まで暖めた。 この混合物をＣＨＣｌ５で３回抽出した。有機層を集めて、飽和塩溶液で抽出し 、硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒を減圧下で除去し、（ヒドロキシエトキシ） エチルジスルフィドを清澄な粘性油状物として得た（２．２２ｇ、５０％収率） 。 ７．３．モノ−（２−ジメトキシトリチル）−（ヒドロキシエトキシ）エチルジ スルフィドの製造 （ヒドロキシエトキシ）エチルジスルフィド（２１１ｍｇ、０．８７ｍモル）を ピリジン５ｍｌ中に再懸濁し、溶媒を減圧下で除去した。これを２回繰り返した 。次いでジスルフィドをピリジン５ｍｌに再懸濁し、マグネティックスターラー 棒を入れて、溶液を撹拌した。次いで２−ジメトキシトリトルクロリド（２９４ ｍｇｔ　ｏ、８７ｍモル）加えて、反応をｔｉｃ（溶媒系：５％イソプロパツー ル／メチレンクロリド／１％　ＴＥＡ）でモニターした。反応終了後メタノール １ｍｌで冷却し、３０分間撹拌した。溶媒を減圧下で除去した。油状固形物をメ チレンクロリド２５ｍ１に再懸濁し、水で３回抽出し、飽和塩溶液で１回抽出し 、硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒を減圧下で除去し、保護されたジスルフィド を１％ＴＥＡを含むメチレンクロリド中の０−５％インプロパツールのグラジェ ントを用いるシリカゲルのフラッシュクロマトグラフィーで精製し、溶出した。 七ノー（２−ジメトキシトリチル）−（ヒドロキシエトキシ）エチルジスルフィ ド（２２４ｍｇ、０．４１ｍモル、４７％収率）を得た。 モノ−（２−ジメトキシトリチル）−（ヒドロキシエトキシ）エチルジスルフィ ド（１）（４９ｍｇ、０．０９ｍモル）をピリジン５ｍｌに再懸濁し、溶媒を減 圧下で除去した。 １をメチレンクロリド２ｍｌ中に再懸濁した。この溶液を０℃に冷却したピリジ ン／メチレンクロリド（０，２２５ｍモル）（ｔ　：　１）中の２−クロロ−４ Ｈ−１，２，３−ベンゾジオキサホスホリン−４−オンの撹拌溶液に加えた。こ れを３０分間撹拌し、この時点でＬＭ　ＴＥＡＢＳｐＨ７，５を２０ｍｌゆっく りと加えた。これを２時間撹拌した。反応物を２５ｍ１のＬＭ　ＴＥＡＢＳｐＨ ７，５中に注いだ。水層をメチレンクロリドで３回抽出し、溶媒を減圧下で除去 した。モノ−（２−ジメトキシトリチル）−（ヒドロキシエトキシ）エチルジス ルフィド・水素ホスホネート（２）を、アセトニトリル／水／ＴＥＡ溶媒系を用 いるシリカゲルのフラッシュクロマトグラフィーで精製した。収率は３８．９ｍ ｇ１０．０５４５ｍモル（６１％）であった。 Ｆｒｏｅｈｌｅｒら（１９８６，Ｎｕｃｌ、Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、１４：５３９ ９−５４０７）に記載の方法によって、Ｂｉ。 ５ｅａｒｃｈ自動ＤＮＡ合成機を用い標準的水素ホスホネート化学を用いて、水 素ホスホネート（２）をＧＣの５°位に導入した。次いでジメトキシトリチル基 を除去し、オリゴデオキシヌクレオチド合成を続けた。ホスホジエステルへの酸 化は上記のようにＣＣ１，を用いて実施した。 α−３２Ｐ−ＡＴＰ及びＴ４ポリヌクレオチドキナーゼを用いて、オリゴヌクレ オチド５’　−ＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＴ−３’　の５゛末端を標識した。ホスホ リル化の後、サンプルを６５℃で１５分間加熱した。この溶液に、１０倍過剰の 鋳型及び１００倍過剰のＣＡＧＣＡＧＣＸＧＣを加えた。この混合物を８５℃に まで３分間加熱し、１時間かけて４°Ｃまでゆっくりと冷却した。ｌ０ＵＴ４　 ＤＮＡリガーゼ及びＡＴＰ　（最終濃度１ｍＭ）を加え、ライゲーション反応を 一夜続けた。ライゲートした生成物を１５％変成ポリアクリルアミドゲルの電気 泳動で精製した。生成物をオートラジオグラフィーで可視化し、ゲルから切り出 した。３２ｐで標識したオリゴヌクレオチドをゲルから溶出し、脱塩してＣ８逆 層クロマトグラフィーを用いて濃縮した。生成物を水中の３０％アセトニトリル で溶出した。溶媒を次いで除去して生成物を滅菌水１００μｌに再懸濁した。 Ｈ９３８細胞（３ｘｌＯ’細胞／ｍｌ）　３００　ｔｔ　ｌを、１２ｐで内部標 識した３’　−ＭＥＡ−末端キャップ化オリゴヌクレオチド（Ｉ　Ｉ）（４ｘｌ 　Ｏ’ｃｐｍ）とともにインキュベートした。０．４及び４８時間後に細胞懸濁 液１００μｍを取り出して、下記の分画実験に供した。 細胞１００μｍをエッペンドルフミクロ遠心管中、６０００ｒｐｍ、４℃５分間 でペレット化した。上溝５μｌを取り出し、電気泳動分析に供した。ペレットを リン酸緩衝液（ＰＢＳ）中に再懸濁し、ＩＯＵ　ＤＮａｓｅ　Ｉを加えた。次い で３７℃で１０分間消化を行った。５ｍＭ　ＥＤＴＡを加えて反応を停止した。 細胞懸濁液を遠心（６Ｋ、５分）でペレット化した。細胞ペレットを１００μＩ 　ＰＢＳで洗浄し、再遠心した（６Ｋ、５分）。 この工程を３回繰り返した。細胞ペレットを１５ｍＭ　ＫＣＩ。 ２ｍＭ　ＭｇＣ１ｚ、０．１ｍＭ　ＥＤＴＡ及び０．２％　ＮＰ−４０を含む２ ０μｍのｌｏｍＭ　Ｔｒｉｓ、ｐＨ７，５中に再懸濁した。サンプルを氷上に１ 分間置き、次いで３０秒間撹拌した。これを繰り返した。この抽出物を次いで３ Ｋ、４℃で５分間遠心した。上清を除去し、７Ｍ　ウレアローディングバッファ ー中に希釈した。ペレット化した核を次いで１５ｍＭ　ＫＣＩ。 ２ｍＭ　ＭｇＣｌ２．ｏ、１ｍＭ　ＥＤＴＡ及びｌｏｏｍＭＮａｃｌを含む２０ μｍの１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ、ｐＨ７，５中で、６５°Ｃ，５分間破砕した。次い で等容量の７Ｍ　ウレアローディングバッファーを加えた。 この分画からのサンプルを次いで、２０％変性ポリアクリルアミドゲルを用いる 電気泳動で分析した。増感スクリーンを用０て、−７０℃でのオートラジオグラ フィーでノくンドを可視化した。 ７．８．オリゴヌクレオチドの血清安定性３’−ＭＥＡ末端キャップ化された１ ２Ｐ−内部標識された（■ＩＩ）を用いて、１０％　ＨＩ−ＦＣ８中におけるヌ クレアーゼと還元安定性を試験した。３２ｐ−内部標識された（Ｉ　Ｉ）　（４ Ｘ１０’ｃｐｍ）２μｌを細胞培地２μｌ中に加えた。０．　０．　５．１，３ 及び２４時間後に５μｍを取り出した。これを５μｍ７Ｍ　ウレアローディング バッファー中に希釈し、氷上に保存した。次いでサンプルを２０％変性ポリアク リルアミドゲルを用０グラフイーでバンドを可視化した。いずれのオリゴヌクレ オチドも細胞外では２４時間よりも大きいｔ　１／２を有したが、細胞関連のオ リゴヌクレオチドは１時間以内のｔ１／２で還元された。 ここに開示する特定の態様は本発明のいくつかの面を説明するためのものである から、ここに記載し、請求する本発明はこれらの態様に範囲を限定されるもので はない。いかなる均等な態様も本発明の範囲に含まれる。実際、ここに記載した ものに加えて、上記の記載から本発明の多くの改変が当業者には明らかであろう 。 かかる改変も付属の請求の範囲に含まれる。 各種の文献がここに引用されているが、その開示内容（よすべて参照として本明 細書に包含される。 匡 匡 く ヒ く ヒ ０　４　４ｇ　（ｈｒｓ） ＳＭＲＣＮＣＮＣＮ ＳＭＲＯ４４８０４４８（ｈｒｓ） ＣＯ３０６０１８００３０６０１５１０（ｍｉｎｉ）要約書 本発明は細胞へのオリゴヌクレオチドの送達を増強する構成物及び方法に関する 。本発明の構成物は、少なくとも１つのジスルフィド結合を含む分子リンカ−を 介して、細胞の外層膜及び／又は血液−脳関門を通過しての輸送を容易にする薬 剤（ここでは”輸送剤“という）と結合したオリゴヌクレオチド結合体からなる 。 好ましい面においては、構成物か細胞内に輸送された後にジスルフィド結合が開 裂する。本発明のオリゴヌクレオチド結合体を含む医薬組成物は各種の疾患およ び障害を治療するのに存用である。 細胞内の核酸配列の発現を阻害する方法、及び細胞内の核酸配列を検出する方法 もまた提供される。特定の態様においては、ジスルフィド結合を含むリンカ−を 介してコレステロールと結合したオリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドを 原核生物又は真核生物細胞内の相補的配列とハイブリダイゼーションさせること によって、治療的及び診断的用途に用いることができる。 国際調査報告 １１．１．＋１０９．１．＾、＋０．．．ＰＣＴ’Ｌ’Ｓ９１；Ｏ：：：、。

Claims (131)

【特許請求の範囲】
1. １．細胞の外層膜を通過しての輸送を容易にする薬剤に結合したオリゴヌクレオ チドまたはその類似体を含むオリゴヌクレオチド複合体であって、ここで結合が 少なくとも一つのジスルフィド結合を含む分子リンカーを介していることを特徴 とするオリゴヌクレオチド複合体。
2. ２．薬剤が細胞膜を通過しての受動輸送をし得る請求項１に記載のオリゴヌクレ オチド結合体。
3. ３．薬剤が細胞膜を通過しての能動輸送し得る請求項１に記載のオリゴヌクレオ チド結合体。
4. ４．薬剤が細胞膜の融合を促進し得る請求項１に記載のオリゴヌクレオチド結合 体。
5. ５．薬剤がコレステロールである請求項１に記載のオリゴヌクレオチド結合体。
6. ６．輸送剤がヌクレオシドまたはヌクレオシド類似体である請求項１に記載のオ リゴヌクレオチド結合体。
7. ７．輸送剤が抗体である請求項１に記載のオリゴヌクレオチド結合体。
8. ８．輸送剤が親油性である請求項１に記載のオリゴヌクレオチド結合体。
9. ９．輸送剤が、少なくとも１２個の炭素原子を含む脂肪酸、トリグリセリド、リ ン脂質、及びグルココルチコイドからなる群から選ばれた脂質である請求項８に 記載のオリゴヌクレオチド結合体。
10. １０．輸送剤がペプチドまたはタンパク質である請求項１に記載のオリゴヌクレ オチド結合体。
11. １１．タンパク質が上皮増殖因子である請求項１０に記載のオリゴヌクレオチド 結合体。
12. １２．タンパク質がトランスフェリンである請求項１０に記載のオリゴヌクレオ チド結合体。
13. １３．輸送剤がポリカチオンである請求項１に記載のオリゴヌクレオチド結合体 。
14. １４．輸送剤がサッカリドである請求項１に記載のオリゴヌクレオチド結合体。
15. １５．サッカリドがマンノース、グルコース及びガラクトースからなる群から選 ばれる請求項１４に記載のオリゴヌクレオチド結合体。
16. １６．輸送剤が生体適合性ポリマーである請求項１に記載のオリゴヌクレオチド 結合体。
17. １７．ジスルフィド結合が膜を通過しての輸送の際にまたはその後に開裂される 請求項１に記載のオリゴヌクレオチド結合体。
18. １８．ジスルフィド結合が膜を通過しての輸送の際にまたはその後に開裂される 請求項５に記載のオリゴヌクレオチド結合体。
19. １９．ジスルフィド結合が膜を通過しての輸送の際にまたはその後に開裂される 請求項６に記載のオリゴヌクレオチド結合体。
20. ２０．ジスルフィド結合が膜を通過しての輸送の際にまたはその後に開裂される 請求項８に記載のオリゴヌクレオチド結合体。
21. ２１．ジスルフィド結合が膜を通過しての輸送の際にまたはその後に開裂される 請求項１０に記載のオリゴヌクレオチド結合体。
22. ２２．ジスルフィド結合が膜を通過しての輸送の際にまたはその後に開裂される 請求項１４に記載のオリゴヌクレオチド結合体。
23. ２３．ジスルフィド結合が膜を通過しての輸送の際にまたはその後に開裂される 請求項１６に記載のオリゴヌクレオチド結合体。
24. ２４．オリゴヌクレオチドが６〜５０個の塩基からなるＤＮＡである請求項１に 記載のオリゴヌクレオチド結合体。
25. ２５．オリゴヌクレオチドが６〜５０個の塩基からなるＤＮＡである請求項２に 記載のオリゴヌクレオチド結合体。
26. ２６．オリゴヌクレオチドが６〜５０個の塩基からなるＤＮＡである請求項３に 記載のオリゴヌクレオチド結合体。
27. ２７．オリゴヌクレオチドが６〜５０個の塩基からなるＤＮＡである請求項５に 記載のオリゴヌクレオチド結合体。
28. ２８．オリゴヌクレオチドが６〜５０個の塩基からなるＤＮＡである請求項６に 記載のオリゴヌクレオチド結合体。
29. ２９．オリゴヌクレオチドが６〜５０個の塩基からなるＤＮＡである請求項７に 記載のオリゴヌクレオチド結合体。
30. ３０．オリゴヌクレオチドが６〜５０個の塩基からなるＤＮＡである請求項８に 記載のオリゴヌクレオチド結合体。
31. ３１．オリゴヌクレオチドが６〜５０個の塩基からなるＤＮＡである請求項１０ に記載のオリゴヌクレオチド結合体。
32. ３２．オリゴヌクレオチドが６〜５０個の塩基からなるＤＮＡである請求項１３ または１１に記載のオリゴヌクレオチド結合体。
33. ３３．オリゴヌクレオチドが６〜５０個の塩基からなるＤＮＡである請求項１４ に記載のオリゴヌクレオチド結合体。
34. ３４．オリゴヌクレオチドが６〜５０個の塩基からなるＤＮＡである請求項１６ に記載のオリゴヌクレオチド結合体。
35. ３５．オリゴヌクレオチドが細胞内の核酸配列にハイブリッドを形成し得る請求 項２４に記載のオリゴヌクレオチド結合体。
36. ３６．オリゴヌクレオチドが細胞内の核酸配列にハイブリッドを形成し得る請求 項２７に記載のオリゴヌクレオチド結合体。
37. ３７．オリゴヌクレオチドが細胞内の核酸配列にハイブリッドを形成し得る請求 項２８に記載のオリゴヌクレオチド結合体。
38. ３８．オリゴヌクレオチドが細胞内の核酸配列にハイブリッドを形成し得る請求 項２９に記載のオリゴヌクレオチド結合体。
39. ３９．オリゴヌクレオチドが細胞内の核酸配列にハイブリッドを形成し得る請求 項３０に記載のオリゴヌクレオチド結合体。
40. ４０．オリゴヌクレオチドが細胞内の核酸配列にハイブリッドを形成し得る請求 項３１に記載のオリゴヌクレオチド結合体。
41. ４１．オリゴヌクレオチドが細胞内の核酸配列にハイブリッドを形成し得る請求 項３２に記載のオリゴヌクレオチド結合体。
42. ４２．オリゴヌクレオチドが細胞内の核酸配列にハイブリッドを形成し得る請求 項３３に記載のオリゴヌクレオチド結合体。
43. ４３．オリゴヌクレオチドが細胞内の核酸配列にハイブリッドを形成し得る請求 項３４に記載のオリゴヌクレオチド結合体。
44. ４４．核酸配列が病原生物の核酸配列である請求項３５に記載のオリゴヌクレオ チド結合体。
45. ４５．核酸配列が病原生物の核酸配列である請求項３６に記載のオリゴヌクレオ チド結合体。
46. ４６．核酸配列が細胞に内因性であり、そして細胞が哺乳類のものである請求項 ３５に記載のオリゴヌクレオチド結合体。
47. ４７．核酸配列が細胞に内因性であり、そして細胞が哺乳類のものである請求項 ３６に記載のオリゴヌクレオチド結合体。
48. ４８．哺乳類中の血液−脳関門を通過しての輸送を容易にする薬剤に接合された オリゴヌクレオチドまたはその類似体を含むオリゴヌクレオチド結合体であって 、ここでその結合が少なくとも一つのジスルフィド結合を含む分子リンカーを介 していることを特徴とするオリゴヌクレオチド結合体。
49. ４９．薬剤が親油性である請求項４８に記載のオリゴヌクレオチド結合体。
50. ５０．薬剤がコレステロールである請求項４８に記載のオリゴヌクレオチド結合 体。
51. ５１．薬剤がペプチドである請求項４８に記載のオリゴヌクレオチド結合体。
52. ５２．オリゴヌクレオチドが６〜５０個の塩基からなるＤＮＡである請求項４８ に記載のオリゴヌクレオチド結合体。
53. ５３．オリゴヌクレオチドが脳細胞内の核酸配列にハイブリッドを形成し得る請 求項５２に記載のオリゴヌクレオチド結合体。
54. ５４．有効量の請求項１に記載のオリゴヌクレオチド結合体及び医薬的に許容し 得る担体を含むことを特徴とする医薬組成物。
55. ５５．有効量の請求項２に記載のオリゴヌクレオチド結合体及び医薬的に許容し 得る担体を含むことを特徴とする医薬組成物。
56. ５６．有効量の請求項３に記載のオリゴヌクレオチド結合体及び医薬的に許容し 得る担体を含むことを特徴とする医薬組成物。
57. ５７．有効量の請求項４に記載のオリゴヌクレオチド結合体及び医薬的に許容し 得る担体を含むことを特徴とする医薬組成物。
58. ５８．有効量の請求項５に記載のオリゴヌクレオチド結合体及び医薬的に許容し 得る担体を含むことを特徴とする医薬組成物。
59. ５９．有効量の請求項６に記載のオリゴヌクレオチド結合体及び医薬的に許容し 得る担体を含むことを特徴とする医薬組成物。
60. ６０．有効量の請求項７に記載のオリゴヌクレオチド結合体及び医薬的に許容し 得る担体を含むことを特徴とする医薬組成物。
61. ６１．有効量の請求項８に記載のオリゴヌクレオチド結合体及び医薬的に許容し 得る担体を含むことを特徴とする医薬組成物。
62. ６２．有効量の請求項９に記載のオリゴヌクレオチド結合体及び医薬的に許容し 得る担体を含むことを特徴とする医薬組成物。
63. ６３．有効量の請求項１０に記載のオリゴヌクレオチド結合体及び医薬的に許容 し得る担体を含むことを特徴とする医薬組成物。
64. ６４．有効量の請求項１１に記載のオリゴヌクレオチド結合体及び医薬的に許容 し得る担体を含むことを特徴とする医薬組成物。
65. ６５．有効量の請求項１２に記載のオリゴヌクレオチド結合体及び医薬的に許容 し得る担体を含むことを特徴とする医薬組成物。
66. ６６．有効量の請求項１３に記載のオリゴヌクレオチド結合体及び医薬的に許容 し得る担体を含むことを特徴とする医薬組成物。
67. ６７．有効量の請求項１４に記載のオリゴヌクレオチド結合体及び医薬的に許容 し得る担体を含むことを特徴とする医薬組成物。
68. ６８．有効量の請求項１５に記載のオリゴヌクレオチド結合体及び医薬的に許容 し得る担体を含むことを特徴とする医薬組成物。
69. ６９．有効量の請求項１６に記載のオリゴヌクレオチド結合体及び医薬的に許容 し得る担体を含むことを特徴とする医薬組成物。
70. ７０．有効量の請求項１７に記載のオリゴヌクレオチド結合体及び医薬的に許容 し得る担体を含むことを特徴とする医薬組成物。
71. ７１．有効量の請求項２４に記載のオリゴヌクレオチド結合体及び医薬的に許容 し得る担体を含むことを特徴とする医薬組成物。
72. ７２．有効量の請求項２５に記載のオリゴヌクレオチド結合体及び医薬的に許容 し得る担体を含むことを特徴とする医薬組成物。
73. ７３．有効量の請求項２６に記載のオリゴヌクレオチド結合体及び医薬的に許容 し得る担体を含むことを特徴とする医薬組成物。
74. ７４．有効量の請求項２７に記載のオリゴヌクレオチド結合体及び医薬的に許容 し得る担体を含むことを特徴とする医薬組成物。
75. ７５．有効量の請求項２８に記載のオリゴヌクレオチド結合体及び医薬的に許容 し得る担体を含むことを特徴とする医薬組成物。
76. ７６．有効量の請求項２９に記載のオリゴヌクレオチド結合体及び医薬的に許容 し得る担体を含むことを特徴とする医薬組成物。
77. ７７．有効量の請求項３０に記載のオリゴヌクレオチド結合体及び医薬的に許容 し得る担体を含むことを特徴とする医薬組成物。
78. ７８．有効量の請求項３１に記載のオリゴヌクレオチド結合体及び医薬的に許容 し得る担体を含むことを特徴とする医薬組成物。
79. ７９．有効量の請求項３２に記載のオリゴヌクレオチド結合体及び医薬的に許容 し得る担体を含むことを特徴とする医薬組成物。
80. ８０．有効量の請求項３３に記載のオリゴヌクレオチド結合体及び医薬的に許容 し得る担体を含むことを特徴とする医薬組成物。
81. ８１．有効量の請求項３４、３５または３６に記載のオリゴヌクレオチド結合体 及び医薬的に許容し得る担体を含むことを特徴とする医薬組成物。
82. ８２．有効量の請求項３７、３８または３９に記載のオリゴヌクレオチド結合体 及び医薬的に許容し得る担体を含むことを特徴とする医薬組成物。
83. ８３．有効量の請求項４０、４１または４２に記載のオリゴヌクレオチド結合体 及び医薬的に許容し得る担体を含むことを特徴とする医薬組成物。
84. ８４．有効量の請求項４３または４４に記載のオリゴヌクレオチド結合体及び医 薬的に許容し得る担体を含むことを特徴とする医薬組成物。
85. ８５．有効量の請求項４８に記載のオリゴヌクレオチド結合体及び医薬的に許容 し得る担体を含むことを特徴とする医薬組成物。
86. ８６．細胞に有効量の請求項１、２または３に記載のオリゴヌクレオチド結合体 を与えることを特徴とする細胞内の核酸配列の発現を阻害する方法。
87. ８７．細胞に有効量の請求項４、５または１７に記載のオリゴヌクレオチド結合 体を与えることを特徴とする細胞内の核酸配列の発現を阻害する方法。
88. ８８．細胞に有効量の請求項２４に記載のオリゴヌクレオチド結合体を与えるこ とを特徴とする細胞内の核酸配列の発現を阻害する方法。
89. ８９．細胞に有効量の請求項２５に記載のオリゴヌクレオチド結合体を与えるこ とを特徴とする細胞内の核酸配列の発現を阻害する方法。
90. ９０．細胞に有効量の請求項２６に記載のオリゴヌクレオチド結合体を与えるこ とを特徴とする細胞内の核酸配列の発現を阻害する方法。
91. ９１．細胞に有効量の請求項２７に記載のオリゴヌクレオチド結合体を与えるこ とを特徴とする細胞内の核酸配列の発現を阻害する方法。
92. ９２．細胞に有効量の請求項２４に記載のオリゴヌクレオチド結合体を与えるこ とを含み、オリゴヌクレオチドが核酸配列にハイブリッドを形成し得ることを特 徴とする細胞内の核酸配列の発現を阻害する方法。
93. ９３．薬剤が細胞膜を通過して受動輸送される請求項９２に記載の方法。
94. ９４．薬剤が細胞膜を通過して能動輸送される請求項９２に記載の方法。
95. ９５．薬剤がコレステロールである請求項９２に記載の方法。
96. ９６．輸送剤が親油性である請求項９２に記載の方法。
97. ９７．輸送剤がヌクレオシドまたはヌクレオシド類似体である請求項９２に記載 の方法。
98. ９８．輸送剤がペプチドまたはタンパク質である請求項９２に記載の方法。
99. ９９．輸送剤が抗体である請求項９２に記載の方法。
100. １００．輸送剤がサッカリドである請求項９２に記載の方法。
101. １０１．輸送剤がポリカチオンである請求項９２に記載の方法。
102. １０２．輸送剤が生体適合性ポリマーである請求項９２に記載の方法。
103. １０３．ジスルフィド結合が膜を通過しての輸送の際にまたはその後に開裂され る請求項９２に記載の方法。
104. １０４．請求項２４、２５または２６に記載のオリゴヌクレオチド結合体を生存 細胞に与えることを含み、ここでオリゴヌクレオチドが細胞内の核酸配列にハイ ブリッドを形成でき、しかもオリゴヌクレオチドが検出可能に標識されることを 特徴とする細胞内の核酸配列の存在を検出する方法。
105. １０５．請求項２７、２８または２９に記載のオリゴヌクレオチド結合体を生存 細胞に与えることを含み、ここでオリゴヌクレオチドが細胞内の核酸配列にハイ ブリッドを形成でき、しかもオリゴヌクレオチドが検出可能に標識されることを 特徴とする細胞内の核酸配列の存在を検出する方法。
106. １０６．請求項３０、３１または３２に記載のオリゴヌクレオチド結合体を生存 細胞に与えることを含み、ここでオリゴヌクレオチドが細胞内の核酸配列にハイ ブリッドを形成でき、しかもオリゴヌクレオチドが検出可能に標識されることを 特徴とする細胞内の核酸配列の存在を検出する方法。
107. １０７．請求項３３または３４に記載のオリゴヌクレオチド結合体を生存細胞に 与えることを含み、ここでオリゴヌクレオチドが細胞内の核酸配列にハイブリッ ドを形成でき、しかもオリゴヌクレオチドが検出可能に標識されることを特徴と する細胞内の核酸配列の存在を検出する方法。
108. １０８．請求項５４に記載の医薬組成物を患者に投与することを特徴とする疾患 または障害を有する患者の治療方法。
109. １０９．請求項７１に記載の医薬組成物を患者に投与することを特徴とする疾患 または障害を有する患者の治療方法。
110. １１０．請求項７４に記載の医薬組成物を患者に投与することを特徴とする疾患 または障害を有する患者の治療方法。
111. １１１．請求項８５に記載の医薬組成物を患者に投与することを特徴とする疾患 または障害を有する患者の治療方法。
112. １１２．式： コレステロール−ジヌクレオチド−Ｒ１−Ｓ−Ｓ−Ｒ２−オリゴヌクレオチド （式中、Ｒ１及びＲ２は炭化水素鎖であり、Ｒ１はＲ２と同じであってもよい） を有する化合物。
113. １１３．有効量の請求項４１に記載のオリゴヌクレオチド結合体及び医薬的に許 容し得る担体を含むことを特徴とする医薬組成物。
114. １１４．請求項３２に記載のオリゴヌクレオチド結合体を生存細胞に与えること を含み、ここでオリゴヌクレオチドが細胞内の核酸配列にハイブリッドを形成で き、しかもオリゴヌクレオチドが検出可能に標識されることを特徴とする細胞内 の核酸配列の存在を検出する方法。
115. １１５．分子リンカーが式： Ｙ−ＸＣＨ２ＣＨＲ１−ＳＳ−ＣＨＲ１ＣＨ２Ｘ−Ｙ（式中、 ＸはＯ、▲数式、化学式、表等があります▼、▲数式、化学式、表等があります ▼、ＮＲ１、ＣＨ２、Ｃ（Ｒ１）２、または▲数式、化学式、表等があります▼ であり、▼ ＹはＨ、アルキル、アリールまたは▲数式、化学式、表等があります▼（ＸがＮ Ｒ１、ＣＨ２またはＣ（Ｒ１）２である場合）であり、且つＲ１はＨ、ＣＨ３、 アルキルまたはアリールである）を有する請求項１に記載のオリゴヌクレオチド 結合体。
116. １１６．ＸがＯまたはＮＨ２であり、 Ｙが−ＣＨ２ＣＨ２−またはＣ＝Ｏであり、且つＲ１がＨまたはＣＨ３である請 求項１１５に記載の分子リンカー。
117. １１７．ａ）オリゴヌクレオチドを、ジスルフィド結合を含むリンカーを介して 固体支持体に結合し、 ｂ）オリゴヌクレオチドに結合された固体支持体を、試料中の核酸配列がオリゴ ヌクレオチドにハイブリッドを形成し得るような条件下で核酸を含む試料と接触 させ、ｃ）洗浄して試料中のオリゴヌクレオチドにハイブリッドを形成しない核 酸配列を除去し、 ｄ）還元条件にさらすことによりジスルフィド結合を開裂し、そして ｅ）工程（ｄ）により放出されたハイブリッドを形成した核酸−オリゴヌクレオ チド結合体を回収する ことを特徴とする核酸配列の単離方法。
118. １１８．ａ）二本鎖オリゴヌクレオチドを、ジスルフィド結合を含むリンカーを 介して固体支持体に結合し、 ｂ）オリゴヌクレオチドに結合された固体支持体を、試料中のＤＮＡ結合タンパ ク質がオリゴヌクレオチドに結合し得るような条件下でタンパク質を含む試料と 接触させ、ｃ）洗浄して試料中のオリゴヌクレオチドに結合しないタンパク質を 除去し、 ｄ）還元条件にさらすことによりジスルフィド結合を開裂し、そして ｅ）工程（ｄ）により放出された結合タンパク質−オリゴヌクレオチド結合体を 回収する ことを特徴とするＤＮＡ結合タンパク質の単離方法。
119. １１９．ａ）核酸配列を含むと推測されるＤＮＡを固体支持体に固定化し、ｂ） リポーターグループを含むオリゴヌクレオチドジスルフィド結合体をＤＮＡとハ イブリッド形成し、ｃ）固体支持体を洗浄してＤＮＡにハイブリイドを形成しな かったオリゴヌクレオチドージスルフィド結合体を除去し、ｄ）還元条件にさら すことによりリポーターグループをオリゴヌクレオチド−ＤＮＡ結合体から開裂 し、そしてｅ）リポーターグループを検出し、それにより核酸配列を検出する ことを特徴とする核酸配列の検出方法。
120. １２０．ａ）遊離チオール基を含むオリゴヌクレオチドを固体支持体に固定化し 、 ｂ）固定化されたオリゴヌクレオチドを、試料中の核酸配列がオリゴヌクレオチ ドにハイブリッドを形成し得るような条件下で核酸を含む試料と接触させ、 ｃ）固体支持体を洗浄してハイブリイドを形成しなかった核酸を除去し、 ｄ）固体支持体を、ジスルフィド結合がオリゴヌクレオチドの遊離チオールとそ の化合物の遊離チオールとの間に形成される酸化条件下で、リポーターグループ を含み、遊離チオールを含む化合物と接触させ、 ｅ）固体支持体を洗浄して未結合化合物を除去し、そしてｆ）結合リポーターグ ループを検出し、それにより核酸配列を検出することを特徴とする試料中の核酸 配列の検出方法。
121. １２１．ａ）ＤＮＡを固体支持体に固定化し、ｂ）固定化されたＤＮＡを、ＤＮ Ａがオリゴヌクレオチドにハイブリッドを形成し得るような条件下で遊離チオー ル基を含むオリゴヌクレオチドと接触させ、 ｃ）固体支持体を洗浄してハイブリイドを形成しなかったオリゴヌクレオチドを 除去し、 ｄ）固体支持体を、ジスルフィド結合がオリゴヌクレオチドの遊離チオールとそ の化合物の遊離チオールとの間に形成される酸化条件下で、リポーターグループ を含み、遊離チオールを含む化合物と接触させ、 ｅ）固体支持体を洗浄して未結合化合物を除去し、そしてｆ）結合リポーターグ ループを検出し、それにより核酸配列を検出することを特徴とする核酸配列の検 出方法。
122. １２２．オリゴヌクレオチドがハイブリダイゼーション誘発架橋剤を含む請求項 １１７または１２０に記載の方法。
123. １２３．オリゴヌクレオチド結合体がハイブリダイゼーション誘発架橋剤を含む 請求項１１９に記載の方法。
124. １２４．オリゴヌクレオチドジスルフィド結合体が一種以上のヌクレオチド類似 体を含み、その結果、ハイブリダイゼーション条件下で、二本鎖ＤＮＡへの配列 特異的結合が生じることができ、それにより三重らせん構造を形成する請求項１ １９に記載の方法。
125. １２５．オリゴヌクレオチドが一種以上のヌクレオチド類似体を含み、その結果 、ハイブリダイゼーション条件下で、二本鎖ＤＮＡへの配列特異的結合が生じる ことができ、それにより三重らせん構造を形成する請求項１２０または１２１に 記載の方法。
126. １２６．オリゴヌクレオチド結合体がハイブリダイゼーション誘発架橋剤を含む 請求項３５に記載の方法。
127. １２７．オリゴヌクレオチドがハイブリダイゼーション誘発架橋剤を含む請求項 １１７に記載の方法。
128. １２８．患者からの試料中、疾患または障害の存在に関連する核酸配列を検出す ることを含み、ここで検出が請求項１１９、１２０または１２１に記載の方法に より行われることを特徴とする疾患または障害の診断方法。
129. １２９．リンカーが式： Ｙ−ＸＣＨ２ＣＨＲ１−ＳＳ−ＣＨＲ１ＣＨ２Ｘ−Ｙ（式中、 ＸはＯ、▲数式、化学式、表等があります▼、▲数式、化学式、表等があります ▼、ＮＲ１、ＣＨ２、Ｃ（Ｒ１）２、または▲数式、化学式、表等があります▼ であり、ＹはＨ、アルキル、アリールまたはＣ（ＸがＮＲ１、ＣＨ２またはＣ（ Ｒ１）２である場合）であり、且つＲ１はＨ、ＣＨ３、アルキルまたはアリール である）を有する請求項１０８に記載の方法。
130. １３０．ＸがＯまたはＮＨ２であり、 Ｙが−ＣＨ２ＣＨ２−またはＣ＝Ｏであり、且つＲ１がＨまたはＣＨ３である請 求項１２９に記載の方法。
131. １３１．分子リンカーが約−２００ｍＶ〜約−２３０ｍＶの範囲の酸化還元電位 を有する請求項１に記載のオリゴヌクレオチド結合体。