JP2018086010A - テロメラーゼ阻害のための改変オリゴヌクレオチド - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、テロメラーゼの阻害のために有用な化合物に関する。より具体的には、本発明は、改変オリゴヌクレオチドを提供し、それはテロメラーゼのRNA成分を標的とし、そして増強された細胞取り込み特性を有する。
(治療用適用のためのオリゴヌクレオチドの開発)
核酸の医療用の使用には、大きな関心がある。例えば、アンチセンス、リボザイム、アプタマー、およびRNA干渉(RNAi)技術はすべて、潜在的な治療用適用のために開発されてきた。インビボ送達のための核酸(特にオリゴヌクレオチド)の設計は、結合強度、標的特異性、血清安定性、ヌクレアーゼに対する耐性、および細胞取り込みを含む種々の因子の考慮を必要とする。インビボ使用に適切な特性を有するオリゴヌクレオチドを製造するために、多くのアプローチ(例えば、改変骨格化学、送達ビヒクルにおける調合、および多くの他の部分への結合)が提唱された。全身送達に適した特性を有する治療用オリゴヌクレオチドは、特に有益である。
・ペプチド核酸(PNA)(Nielsen、Methods Mol.Biol.、208:3−26、2002を参照のこと)、
・ロックド(locked)核酸(LNA)(Peterson & Wengel、Trends Biotechnol.、21(2):74−81、2003を参照のこと)、
・ホスホロチオネート(Eckstein、Antisense Nucleic Acid Drug Dev.、10(2):117−21、2000を参照)、
・メチルホスホネート(Thiviyanathanら、Biochemistry、41(3):827−38、2002を参照のこと)、
・ホスホラミデート(Gryaznovら、Biochem.Biophys.Acta、1489(1):131−40、1999;Pruzanら、Nucleic Acids Res.、30(2):559−68、2002を参照のこと)および、
・チオホスホラミデート(Gryaznovら、Nucleosides Nucleotides Nucleic Acids、20(4−7):401−10、2001;Herbertら、Oncogene、21(4):638−42、2002を参照のこと)
が挙げられる。
テロメラーゼは、染色体末端へのテロメア反復配列の付加を触媒するリボ核タンパク質である(Blackburn、1992、Ann.Rev.Biochem.、61:113−129を参照のこと)。テロメア、テロメラーゼ、細胞老化および癌の間の関連を記載する刊行物の広範な本文が存在する(一般的概説として、Oncogene、第21巻、2002年1月、(テロメラーゼに焦点を当てる学術誌の発行全体)を参照のこと)。したがって、テロメラーゼは、癌治療剤のための優れた標的として同定されている(Lichsteinerら、Annals New York Acad.Sci.、886:1−11、1999を参照のこと)。
米国特許第6,444,650号(Antisense compositions for detecting and inhibiting telomerase reverse transcriptase);
米国特許第6,331,399号(Antisense inhibition of tert expression);
米国特許第6,548,298号(Mammalian teromerase);
Van Janta−Lipinskiら、Nucleosides Nucleotides、18(6−7):1719−20、1999(Protein and RNA of human telomerase as targets for modified oligonucleotides);
Gryaznovら、Nucleosides Nucleotides Nucleic Acids、20:401−410、2001(Telomerase inhibitors−oligonucleotide phosphoramidates as potential therapeutic agents); Herbertら、Oncogene、21(4):638−42、2002(Oligonucleotide N3’→P5’ phosphoramidates as efficient telomerase inhibitors);
Pruzanら、Nucleic Acids Research、30(2):559−568、2002(Allosteric inhibitors of telomerase: oligonucleotide N3’−P5’ phosphoramidates);
PCT公開 WO 01/18015(Oligonucleotide N3’−P5’ thiophosphoramidates: their synthesis and use);および
Asaiら、Cancer Research、63:3931−3939、2003(A novel telomerase template antagonist(GRN163)as a potential anticancer agent)。
本発明の組成物および方法は、オリゴヌクレオチドおよび少なくとも1つの共有結合した脂質基を含む、テロメラーゼ阻害化合物に関する。本発明の化合物は、非改変オリゴヌクレオチドと比較して、優れた細胞取り込み特性を有する。これは、上記非改変形態と比較して、より少ない量の結合オリゴヌクレオチドの使用で、同等の生物学的効果を獲得し得ることを意味する。ヒトの治療用の設定に適用される場合、このことは毒性危険性の低減、および費用節約に言い換えられ得る。本発明の化合物は、細胞(癌細胞を含む)においてテロメラーゼを阻害し、それによる効果は、上記細胞の増殖を阻害することである。したがって、本発明の化合物の第一の適用は、癌治療としての適用であり、そして本発明は、このように利用し得る上記化合物の薬学的な処方を提供する。
本発明は例えば、以下の項目を提供する。
(項目1)
以下の構造:
O−(x−L)n
を含む化合物であって、
Oは、ヒトテロメラーゼRNA配列(配列番号1)に対して相補的な、少なくとも5塩基を含む、オリゴヌクレオチドであり;
xは、任意のリンカーであり;
Lは、脂質部分であり;
そしてnは、1〜5の整数であり、n>1である場合、各々の(x−L)成分は独立して選択される、化合物。
(項目2)
項目1に記載の化合物であって、Oは、ヒトテロメラーゼRNA配列(配列番号1)に対して相補的な、少なくとも10塩基を含む、化合物。
(項目3)
項目2に記載の化合物であって、Lは、置換脂肪酸、非置換脂肪酸およびステロールからなる群より選択される脂質を含む、化合物。
(項目4)
項目3に記載の化合物であって、Lは、フッ素で置換された脂肪酸である、化合物。
(項目5)
項目2に記載の化合物であって、Lは、置換炭化水素もしくは非置換炭化水素である、化合物。
(項目6)
項目5に記載の化合物であって、Lは、フッ素で置換された炭化水素である、化合物。
(項目7)
項目1に記載の化合物であって、n=1であり、そして前記x−L成分は、前記オリゴヌクレオチドOの5’末端に対して共有結合する、化合物。
(項目8)
項目1に記載の化合物であって、n=1であり、そして前記(x−L)成分は、前記オリゴヌクレオチドOの3’末端に対して共有結合する、化合物。
(項目9)
項目1に記載の化合物であって、n=2であり、1つの独立して選択された(x−L)成分は前記5’末端に共有結合し、そして1つの独立して選択された(x−L)成分は前記3’末端に共有結合する、化合物。
(項目10)
項目1に記載の化合物であって、n=1であり、そして前記(x−L)成分は前記オリゴヌクレオチドOの核酸塩基に共有結合する、化合物。
(項目11)
項目1に記載の化合物であって、前記オリゴヌクレオチドOのヌクレオシド間の結合は、N3’→P5’ホスホラミデート結合である、化合物。
(項目12)
項目1に記載の化合物であって、前記オリゴヌクレオチドOのヌクレオシド間の結合は、N3’→P5’チオホスホラミデート結合である、化合物。
(項目13)
項目1に記載の化合物であって、オリゴヌクレオチドOは、ヒトテロメラーゼRNA配列(配列番号1)に対して相補的な、少なくとも10塩基を含む、化合物。
(項目14)
項目1に記載の化合物であって:
前記オリゴヌクレオチドOのヌクレオシド間の結合は、N3’→P5’チオホスホラミデート結合であり;
Oの配列は、ヒトテロメラーゼRNA配列(配列番号1)に対して相補的な、少なくとも12塩基を含み;
n=1であり;
(x−L)は、Oの5’末端もしくは3’末端に共有結合し;そして、
Lは、脂肪酸である、化合物。
(項目15)
項目14に記載の化合物であって、xは、グリセロールリンカーもしくはアミノグリセロールリンカーである、化合物。
(項目16)
項目15に記載の化合物であって、該化合物の構造は、以下:
である、化合物。
(項目17)
項目14に記載の化合物であって、Lは、アミド結合を通じて前記オリゴヌクレオチドLの3’末端に直接的に結合する、化合物。
(項目18)
項目17に記載の化合物であって、該化合物の構造は、以下:
である、化合物。
(項目19)
テロメラーゼ酵素の活性を阻害する方法であって、該方法は、該テロメラーゼ酵素と項目1に記載の化合物とを接触させる工程を包含する、方法。
(項目20)
細胞内においてテロメラーゼ酵素の活性を阻害する方法であって、該方法は、該細胞と項目1に記載の化合物とを接触させる工程を包含する、方法。
(項目21)
項目20に記載の方法であって、前記細胞は、癌細胞である、方法。
(項目22)
癌細胞の増殖を阻害する方法であって、該方法は、該細胞と項目1に記載の化合物とを接触させる工程を包含する、方法。
(項目23)
薬学的に受容可能な賦形剤で処方される、項目1に記載の化合物を含む、薬学的組成物。
(項目24)
医療における、項目1に記載の化合物の使用。
(項目25)
癌を処置するための、項目1に記載の化合物の使用。
O−(x−L)n
により表され得、Oはオリゴヌクレオチドを表し、xは任意のリンカー基であり、Lは脂質部分を表し、そしてnは1〜5の整数である。代表的には、n=1もしくはn=2であるが、n>1である場合、それぞれの脂質部分Lは独立して選択される。上記脂質部分は、代表的には、3’末端および5’末端のうちの1つ(もしくはn=2の場合、それぞれ)においてオリゴヌクレオチドに共有結合するが、他の部位(1つもしくはそれ以上の塩基を含む)にも結合し得る。
において、脂質部分であるLは、パルミトイルアミド(パルミチン酸に由来する)であり、アミノグリセロールリンカーを通じて、オリゴヌクレオチドOの5’チオリン酸基に結合する。第2の例示的な構造:
において、Lは、オリゴヌクレオチドの3’アミノ基を通じて、パルミトイルアミドに結合する。
(配列表)
添付の配列表の配列番号1は、ヒトテロメラーゼRNA成分(hTR)(Fengら、Science 269(5228):1236−1241、1995、およびGenBank、登録番号U86046、もまた参照のこと)を提供する。種々のオリゴヌクレオチド(それらの配列は、配列番号1の中に含まれる領域に相補的である)は、それらが相補的である配列番号1の中の配列の位置を参照することにより、本開示全体にわたって参照される。
(A.定義)
「アルキル基」とは、1個〜20個の炭素原子を有するアルキル基もしくは置換アルキル基(例えば、メチル、エチル、プロピルなど)をいう。低級アルキルとは、代表的にはC1〜C5をいう。中級アルキル(intermediate alkyl)は、代表的にはC6〜C10をいう。「アシル基」とは、RCOの構造を有する基をいい、ここでRはアルキルである。低級アシルは、Rが低級アルキルである、アシルである。
本発明の化合物は、以下の式:
O−(x−L)n
により表され得、Oはオリゴヌクレオチドを表し、xは任意のリンカー基であり、Lは脂質部分を表し、そしてnは1〜5の整数である。
オリゴヌクレオチド成分Oは、テロメラーゼのRNA成分に結合することによりテロメラーゼ酵素の阻害に影響するものがこの成分である、という点で、化合物の「エフェクター」成分として考えられ得る。したがって、Oの配列は、テロメラーゼRNAの配列(これは、配列番号1に示される)に対して相補的である領域を含むように選択される。テロメラーゼRNA成分に対して相補的な領域は、理論上は上記テロメラーゼRNAの任意の部分を標的とし得るが、上記テロメラーゼRNAの特定の領域が、阻害性オリゴヌクレオチドのための好ましい標的である。1つの好ましい標的領域は、配列番号1のヌクレオチド30〜67にわたる領域であり、これは「テンプレート領域」(配列番号1のヌクレオチド46〜56にわたる配列5’−CUAACCCUAAC−3’の11ヌクレオチド領域)を含む。上記テンプレート領域は、テロメラーゼが染色体末端へ付加するテロメア反復配列を特定するように機能し、テロメラーゼ酵素の活性に不可欠である作用をする(Chenら、Cell、100:503−514、2000; Kimら、Proc.Natl.Acad.Sci.、USA 98(14):7982−7987、2001を参照のこと)。したがって、上記テンプレート領域の全てまたは一部に対して相補的な配列を含むオリゴヌクレオチド部分を含む本発明の化合物が、特に好ましい。別の好ましい標的領域は、hTR(Pruzanら、Nucl.Acids Research、30:559−568、2002を参照のこと)のヌクレオチド137〜179にわたる領域である。この領域内では、141〜153にわたる配列が、好ましい標的である。PCT公開 WO 98/28442において、テロメラーゼを阻害するための、長さが少なくとも7ヌクレオチドのオリゴヌクレオチドの使用が記載されており、そのオリゴヌクレオチドは、テンプレート領域の外側のhTR配列のアクセス可能な部分(hTRのヌクレオチド137〜196、290〜319、および350〜380が挙げられる)に対して相補的であるように設計される。
。
3’−[−NH−P(=O)(−XR)−O−]−5’
およびそれらの薬学的に受容可能な塩により表され得、ここでXは、OまたはSであり、Rは、水素、アルキル、およびアリールからなる群より選択される。
本発明の化合物は、脂質成分と結合していない対応するオリゴヌクレオチドよりも、細胞内でテロメラーゼ阻害を生じるのに有効である。脂質成分Lは、とりわけ細胞膜を通じる通過を促進することにおいて、化合物の細胞取り込みを増強するように機能すると考えられる。このことが生じる機構は、完全には解明されていないが、1つの可能性は、脂質成分が、単分子形態もしくは凝集(ミセル)形態のいずれかとしてその後の内在化を使って、化合物が細胞膜に結合するのを容易にさせ得る。しかしながら、正確な機構の理解は、本発明が使用されるのには必要とされない。
に列挙される。
CF3(CF2)n−(CH2)m−(ここで、mは少なくとも1、好ましくは少なくとも2であり、そしてn=1〜30((例えば、フロオロトリデカン:CF3(CF2)9(CH2)3));および
CH3(CH2)a(CF2)b(CH2)c−(ここで、a、b、およびcは、独立して1〜30である)
が挙げられる。
に、列挙される。
が、挙げられる。
CF3(CF2)n−(CH2)mCO−;および
CH3(CH2)a(CF2)b(CH2)cCO−
が挙げられ、ここで、
mは少なくとも1、好ましくは少なくとも2であり、そしてn=1〜30であり、
a、b、およびcは、独立して、1〜30
である。
で図示され、これはC14脂質成分に結合するホスホラミデートオリゴヌクレオチドの3’アミノ末端を示す。図式Aにおいて、Lはテトラデカン酸(ミリスチン酸)であり、L基とO基との間の結合は、アミドである。図式Bにおいて、Lはテトラデカンであり、そしてL基とO基との間の結合は、アミンである。
O成分とL成分との間の結合は、直接的な結合であるか、または任意のリンカー部分xを介した結合であり得る。リンカー基は、化合物の化学合成を容易にするのに役立ち得る(以下の合成の節で議論される)。リンカー基がO成分とL成分との結合を仲介しなくても、オリゴヌクレオチド成分O上に、L成分が共有結合し得る複数の部位がある。適切な結合点としては、5’末端および3’末端、1個以上の糖環(sugar ring)、ヌクレオシド骨格、およびオリゴヌクレオチドの核酸塩基が挙げられる。代表的には、L部分はオリゴヌクレオチドの3’末端または5’末端に結合する。
によって、示され得る:
ここで、R’=H、OH、NH2またはSHであり;Y=O、SまたはNRであり;R=Hまたはアルキルであり;そしてnおよびmは1〜18の間の独立した整数である。
ビス−アミノグリセロールリンカーについては、R’=OHであり、Y=NHであり、そしてmおよびnはそれぞれ1であり:
O−アルキルグリセロールリンカーについては、R=Hである:
本発明の化合物の例は、図1に示される。簡単にするために、オリゴヌクレオチドOの1塩基のみ示され、それとともに一般的な塩基Bで示され、そしてRはオリゴヌクレオチドの残りの部分に対する結合点を示す。3’末端に結合する化合物は、3’窒素とともに示され、この3’窒素は、好ましいチオホスホラミデートおよびホスホラミデート化学と一致する。図1A〜図1Lは、5’末端もしくは3’末端に結合した飽和脂質基を有する化合物を示す。図1M〜図1Pは、モノ不飽和脂質基またはポリ不飽和脂質基を有する化合物を示す。図1Q〜図1Rは、塩基を通じてオリゴヌクレオチド(この場合、グアノシン)と結合した脂質基を有する化合物を示す。図1Sおよび図1CCは、それぞれ、3’結合コレステロール脂質部分および5’結合コレステロール脂質部分を示す。図1Uおよび図1Vは、5’結合ポリフッ素化置換脂肪酸誘導体を示し、そして図1Wは、5’結合ポリフッ素化炭化水素を示す。図1X〜図1Zは、酸素を含む、5’脂質部分を示す。示される脂質基の各々について、本明細書で使用される命名法は、以下:
図1A: 3’−ミリストイルアミド
図1B: 3’−パルミトイルアミド
図1C: 3’−ステアロイルアミド
図1D: 3’−パルミトイルアミド−プロピル−チオホスフェート
図1E: 3’−リシル−ビス−ステアロイルアミド
図1F: 5’−パルミトイルアミド−アミノグリセロール−チオホスフェート
図1G: 5’−パルミトイルアミド−ビス−アミノグリセロール−チオホスフェート
図1H: 5’−ステアロイルアミド−アミノグリセロール−チオホスフェート
図1I: 3’−ドデシル
図1J: 3’−ビス−ドデシル
図1K: 3’−ビス−デシル
図1L: 3’−エイコサノイルアミド
図1M: 3’−オレイニルアミド
図1N: 3’−リノレニルアミド
図1O: 3’−リノレイルアミド
図1P: 3’−トリチル
図1Q: N2−テトラデシルグアノシン
図1R: N2−オクタデシルグアノシン
図1S: 3’−コレステリルアミド−アミノグリセロール−チオホスフェート
図1T: 5’−(12−OH)−ステアロイル−チオホスフェート
図1U: 5’−C11−テフロン(登録商標)−チオホスフェート
図1V: 5’−C13−テフロン(登録商標)−チオホスフェート
図1W: 5’−OH−C10−テフロン(登録商標)−チオホスフェート
図1X: 5’−OH−パルミチル−チオホスフェート
図1Y: 5’−バチル−チオホスフェート
図1Z: 3’−バチル−チオホスフェート
図1AA: 3’−パルミトイルアミド−アミノグリセロール−チオホスフェート
図1BB: 3’−チオクチルアミド
図1CC: 5’−コレステリルアミド−アミノグリセロール−チオホスフェート
図1DD: 5’−(2−OH)−ヘキサデカノール−チオホスフェート
である。
本発明の化合物のオリゴヌクレオチド成分は、選択される化学の型についての標準的なプロトコルを使用して、合成され得る。好ましいN3’→P5’ホスホラミデート化学およびN3’→P5’チオホスホラミデート化学を有するオリゴヌクレオチドの合成法は、それぞれ、McCurdyら、(1997)Tetrahedron Letters、38:207−210、およびPongracz & Gryaznov、(1999)Tetrahedron Letters、49:7661−7664に記載される。
and Medicinal Chemistry 9:1241−1247を参照のこと)。異なる鎖長のアミノ改変物質およびチオール改変物質の両方が、オリゴヌクレオチドの合成のために市販されている。N3’→P5’ホスホラミデート結合およびN3’→P5’チオホスホラミデート結合を有するオリゴヌクレオチドは、(もっとも慣用的なオリゴヌクレオチド化学で見出される3’ヒドロキシ基ではなく)3’アミン基を含み、そしてそれゆえ、これらのオリゴヌクレオチドは、上記オリゴヌクレオチドの3’末端へ脂質基を結合するための、独特の機会を提供する。
において提供される。この例において、n=14の場合、脂肪酸はパルミチン酸である:3−アミノ−1,2−プロパンジオールと塩化パルミトイルとの反応に続いて、ジメトキシトリチル化およびスクシニル化により、固体支持体に結合するために使用される中間体が提供される。Rは、長鎖アルキルアミン微細孔性ガラスである。
本発明の結合体は、テロメラーゼ酵素活性および/またはテロメラーゼ活性を有する細胞の増殖を、阻害もしくは低下せるために使用され得る。これらに関連して、酵素活性もしくは細胞増殖の阻害または低下とは、酵素または細胞が結合体で処理されていない対照実験と比較して、測定された活性がより低いレベルであることをいう。特定の実施形態において、測定された活性の阻害もしくは低下は、少なくとも10%の低下もしくは阻害である。当業者は、少なくとも20%、50%、75%、90%または100%の測定された活性の低下または阻害が、特定の適用に対して好ましくあり得ることを理解する。本発明の化合物のテロメラーゼを阻害する能力は、無細胞アッセイ(生化学的アッセイとして言及される)および細胞中で決定し得る。
本発明の化合物の重要な治療用適用は、テロメラーゼを発現する細胞、特に腫瘍細胞の増殖の阻害である。細胞内でテロメラーゼ活性を阻害する本発明の化合物は、他の公知のテロメラーゼ阻害化合物のように(テロメラーゼ陽性細胞株の危機を誘発し)、細胞増殖の中止および死をもたらす。しかしながら、重要であるのは、テロメラーゼを発現しない正常なヒト細胞(例えば、繊維芽細胞起源のBJ細胞)において、本発明の化合物で処理することにより、危機も他の毒性も誘発されないことである。化合物が腫瘍細胞の増殖を特異的に阻害する能力は、インビトロで腫瘍細胞株を使用してか、またはインビボでの異種移植動物モデルにおいて、アッセイされ得る。
本発明は、テロメラーゼ活性を特異的および強力に阻害する化合物を提供し、それゆえ、それはテロメラーゼ陽性細胞(例えば、腫瘍細胞)の増殖を阻害するために使用され得る。極めて多種多様な癌細胞(皮膚、結合組織、脂肪、***、肺、胃、膵臓、卵巣、子宮頚部、子宮、腎臓、膀胱、結腸、前立腺、中枢神経系(CNS)、網膜および血液原生腫瘍(例えば、骨髄腫、白血病およびリンパ腫)の癌由来の細胞が挙げられる)が、テロメラーゼ陽性であることが示されている。
以下の実施例は、本発明の化合物の合成および活性を示し、オリゴヌクレオチド成分Oが好ましいチオホスホラミデート化学もしくはホスホラミデート化学を使用して合成される。特定の実施例において、脂質部分は、リンカーとともにかまたはリンカーを伴わないかのいずれかで、3’末端もしくは5’末端または両方に結合する。これらの化合物の一般構造は、以下:
のように表され得、ここで、R1およびR2は独立してHまたは脂質部分(L)のいずれかであり、YはO(ホスホラミデートオリゴヌクレオチド)またはS(チオホスホラミデートオリゴヌクレオチド)であり、nは代表的には4と49との間の整数であり、そしてBは塩基(それぞれのヌクレオシドサブユニットに対して独立して選択される)を表す。任意のリンカーは、本構造においては示されない。
(A.一般的な方法)
オリゴヌクレオチドN3’→P5’ホスホラミデート(NP)およびチオホスホラミデート(NPS)を、ABI394合成機でアミダイト転移反応(amidite transfer reaction)を使用し、それぞれ、McCurdyら、(1997)Tetrahedron Letters、38:207−210およびPongracz & Gryaznov、(1999)Tetrahedron Letters 49:7661−7664に記載される手順に従って、1μモルのスケールで合成した。完全に保護された単量体構成単位は、3’−アミノトリチル−ヌクレオシド−5’−(2−シアノエチル−N,N−ジイソプロピルアミノ)ヌクレオシドホスホラミダイト、具体的には、3’−デオキシ−チミジン、2’,3’−ジデオキシ−N2−イソブチリル−グアノシン、2’,3’−ジデオキシ−N6−ベンゾイル−アデノシン、および2’,3’−ジデオキシ−N4−ベンゾイル−シチジンであり、Transgenomic,Inc.(Omaha、Nebraska)より購入した。3’−アミノトリチル−5’−スクシニル−ヌクレオシドを、長鎖微細孔性ガラス(LCAA−CPG)を含むアミノ基と結合させ、そして固体支持体として使用した。合成は、5’から3’の方向で実施した。NP骨格を有するオリゴヌクレオチドを、ヨウ素/H2O酸化段階を含む、標準的な1μM(ABI Perkin Elmer)手順を使用して合成し、NPS骨格を有するオリゴヌクレオチドを、アセトニトリル:2,6−ルチジンの1:1混合物中の二硫化フェニルアセチル(PADS)の0.1M溶液を硫化剤として使用する、硫黄プロトコルを使用して調製した。結合時間は、両方の型の骨格の調製に対して25秒であった。THF:イソ酪酸無水物:2,6−ルチジンの18:1:1の混合物を、キャップ形成剤として使用した。3つの方法を使用して、脂質部分をオリゴヌクレオチドに結合させた:方法(i)3’末端に脂質部分を導入するために、合成機でホスホラミダイト試薬を使用する結合;方法(ii)5’結合の生成のための伸長合成の開始前に脂質基を結合させる、改変された固体支持体(前述の図式Cにおいて例示される)の使用;および方法(iii)固体支持体上にある状態での遊離の3’アミノ基の反応、その後の脱保護。これらの方法のさらなる詳細を、以下に提供する。オリゴヌクレオチドを、3’末端または核酸塩基に結合した脂質基に対しては濃アンモニアで、または5’末端に結合した脂質基に対しては、エタノール:濃アンモニアの1:1の混合物で、55℃にて6時間〜8時間脱保護した。この粗生成物を、Pharmasia NAP−25ゲル濾過カラムで脱塩するか、またはエタノールで1M塩化ナトリウムから沈殿させ、次いで真空中で凍結乾燥した。
上で述べたように、脂質基をオリゴヌクレオチドへ結合させるために、種々の方法が用いられ得る。特定の方法の詳細は、以下のとおりである:
(方法(i))この方法では、結合した脂質基を含むホスホラミダイト試薬を、オリゴヌクレオチド合成プロセスの間に3’ヌクレオシドとして付加し、結果として脂質基がそのオリゴヌクレオチドの3’末端に結合させる。2つの脂肪酸を含むホスホラミダイトの合成およびそれに続く結合は、このアプローチを例示する。
アセトニトリル−塩化メチレンの1:4混合物(400ml)に溶解させた1.0g(13.3ミリモル)の3−アミノ−プロパノールに、10mlのジイソプロピルエチルアミンおよび4.06ml(13.3ミリモル)の塩化パルミトイルを加えた。その反応物を一晩攪拌した後、追加の塩化メチレンを加え、そして反応物を次に、飽和炭酸水素ナトリウム、ブライン、および水で順に洗浄した。その有機相を硫酸ナトリウムで乾燥させ、そしてエバポレートして乾燥させた。得られた500mg(1.6ミリモル)の白色固体を、乾燥アセトニトリルで共蒸発(coevaporation)させることにより共沸させ、50mlの塩化メチレンに溶解させた。1.1mlのジイソプロピルエチルアミン(4当量)を加えた後、390μl(1.7ミリモル)の2−シアノエチルジイソプロピルクロロホスホラミダイトを滴下した。その反応混合物を1時間攪拌して、透明な溶液を得た。その反応混合物を、飽和炭酸水素ナトリウムおよびブラインで順に洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥させ、そしてエバポレートして乾燥させた。その生成物を、酢酸エチル:塩化メチレン:トリエチルアミンの45:45:10 v/v溶媒系を使用して、シリカゲルクロマトグラフィーにより精製した。0.7g(90%)のワックス様の固形物を、DNA合成機で使用する前に、P2O5でデシケーター中で乾燥させた。31P NMR(CDCl3)148.45ppm、ES MS(MH+)514。DNA合成機において結合させるために、無水アセトニトリル−塩化メチレンの9:1混合物中で、0.1M溶液を調製した。この合成により、図1Dに示される結合オリゴヌクレオチドの生成のために使用した試薬が得られる。
1g(10.97ミリモル)の3−アミノ−プロパンジオールを10mlのピリジン中に懸濁し、2mlのDMF中の3.017g(10.97ミリモル)の塩化パルミトイルを、激しく攪拌しながら滴下した。15分間の攪拌の後、そのゲルを濾過し、風乾させた。その固体を温エタノールおよび温2−プロパノールで、白色粉末物として再結晶させた。その白色固形物をピリジンで共蒸発させ、次いで30mlの乾燥ピリジンに溶解した。2.89g(8.55ミリモル)の塩化DMTを加え、そしてその反応混合物を、反応をTLCで追跡しながら30分間攪拌した。メタノールでクエンチした後、ピリジンはエバポレートし、そしてその反応を炭酸水素ナトリウムで飽和した塩化メチレンからワークアップした。得られた油状物を、溶解液として4:1のヘキサン/酢酸エチルを使用してシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製した。得られた2.4g(3.64ミリモル)の黄色油状物をピリジンで共沸し、100mlの塩化メチレンおよび4当量のジイソプロピルエチルアミン(2.5ml)に溶解した。攪拌したその溶液に、920μl(4ミリモル)の2−シアノエチルジイソプロピルクロロホスホラミダイトを滴下した。その反応をTLCで追跡し、そして2時間後に完了したことを見出し、上記のようにワークアップした。その生成物を、酢酸エチル:塩化メチレン:トリエチルアミンの45:45:10溶媒系を使用して、シリカゲルクロマトグラフィーにより精製した。得られた固体を、DNA合成機で使用する(アセトニトリル中の0.1M溶液)前に、デシケーターの中で乾燥させた。31P NMR(CDCl3)149.9、150.2ppm、ES MS(MNa+)854.57。この合成物により、図1AAに示される結合オリゴヌクレオチドの生成のために使用した試薬が得られる。
1g(10.97ミリモル)の3−アミノ−1,2−プロパンジオールを10mlのピリジンに懸濁した。2mlのDMF中の3.017g(10.97ミリモル)の塩化パルミトイルを、激しく攪拌しながら滴下した。15分間の攪拌の後、そのゲルを濾過し、風乾させた。その固体を温エタノールおよび温2−プロパノールで、白色粉末物として再結晶させた。その白色固形物をピリジンで共蒸発させ、次いで30mlの乾燥ピリジンに溶解した。3.2g(9.46ミリモル)の塩化DMTを加え、そしてその反応混合物を、反応をTLCで追跡しながら30分間攪拌した。メタノールでクエンチした後、ピリジンをエバポレートし、そしてその反応を炭酸水素ナトリウムで飽和した塩化メチレンからワークアップした。得られた油状物を、4:1のヘキサン/酢酸エチルを使用したシリカゲルクロマトグラフィーにより精製した。得られた2.5g(3.95ミリモル)の黄色油状物を30mlの塩化メチレンに溶解し、そして次いで475mgの無水コハク酸および483mgのジメチルアミノピリジンを加え、そしてその反応混合物を1時間攪拌した。その反応をTCLによりモニタリングし、そして必要な場合にはさらに無水コハク酸を加えた。その塩化メチレン溶液を冷クエン酸ナトリウム緩衝液(pH=4)で洗浄し、そしてその有機相を硫酸ナトリウムで乾燥させ、次いでエバポレートして乾燥させた。得られた最終生成物は、2.0g(24.9%)であった。
1g(10.97ミリモル)の3−アミノ−プロパンジオールを、10mlのピリジンに懸濁した。10mlのDMF中の3.32g(10.97ミリモル)の塩化ステアロイルを、激しく懸濁しながら滴下した。15分間の攪拌の後、そのゲルを濾過し、風乾させた。その固形物を温エタノールおよび温2−プロパノールで、白色粉末として再結晶させた。その白色固体をピリジンで共蒸発させ、次いで30mlの乾燥ピリジンに溶解した。2.89g(8.55ミリモル)の塩化DMTを加え、そしてその反応混合物を、反応をTLCで追跡しながら30分間攪拌した。メタノールでクエンチした後、ピリジンをエバポレートさせ、そしてその反応を炭酸水素ナトリウムで飽和した塩化メチレンでワークアップした。得られた油状物を、溶解液として4:1のヘキサン/酢酸エチルを使用してシリカゲルクロマトグラフィーにより精製した。得られた2.4g(3.64ミリモル)の黄色油状物を30mlの塩化メチレンに溶解し、そして次いで437mgの無水コハク酸および444mgのジメチルアミノピリジンを加え、そしてその反応混合物を1時間攪拌した。その反応物をTLCによりモニタリングし、そして必要な場合にはさらに無水コハク酸を加えた。その塩化メチレン溶液を冷クエン酸ナトリウム緩衝液(pH=4)で洗浄し、そしてその有機相を硫酸ナトリウム乾燥させで、次いでエバポレートさせ乾燥させた。得られた最終生成物は、1.2g(14.4%)であった。
100mlのペプチド合成容器において、20gのLCAA−CPG(Transgenomic,Inc.、約200ミリモル/g −NH2ローディング)を乾燥ジメチルホルムアミドで洗浄した。別々のフラスコ中で、5.55ミリモルの前述の上記(ii/a)または(ii/b)で記載した生成物を、40mlのクロロホルムに溶解し、3mlのジイソプロピルエチルアミンおよび2.13g(8.3ミリモル)のヨウ化2−クロロ−1−メチルピリジニウムを加えた。この懸濁液をペプチド合成容器(栓を開いた状態)の中の乾燥CPGへ、その溶液がそのCPGを通って約半分浸漬するまで注いだ。次いで、栓と上蓋を閉じ、そして上記溶液が上記CPGを完全に覆うまで、振盪した。(必要な場合は、さらにクロロホルムが加えられ得るが、その体積は最小限にとどめるようにすべきである。)この容器を次いで、振盪器に配置し、そして反応を室温で一晩進行させた。CPGを濾過し、そして次いで塩化メチレン、メタノール、およびアセトニトリルで洗浄した。未反応のアミノ基を、THF−2,6−ルチジン−イソ酪酸無水物の18:1:1およびCap B(N−メチルイミダゾール/THF)の1:1の溶液を使用して振盪器で室温にて1時間、キャップした。さらなる濾過の後、そのビーズをメタノール、塩化メチレンおよびアセトニトリルで洗浄した。そのローディングを、メタノール過塩素酸を使用して非ブロック化したサンプルの、498nmでのジメトキシトリチルカチオンの吸光度を、標準的な方法によって決定し、そしてそれが50〜60μモル/gであると見出した。
本明細書中で記載されるように結合オリゴヌクレオチドを、上記およびAsaiら(2003)に記載されるように、生化学的Flashplateアッセイおよび細胞ベースアッセイにおいて、それらのテロメラーゼを阻害する能力について試験した。その結果を、以下の表に示す。この表において、以下の略語を使用する:
オリゴヌクレオチド配列:
1=TAGGGTTAGACAA、hTR(配列番号1)の42〜54塩基に対して相補的
2=CAGTTAGGGTTAG、hTR(配列番号1)の38〜50塩基に対して相補的
化学:
NPは、オリゴヌクレオチドがホスホラミデートのヌクレオシド間結合を有することを示す
NPSは、オリゴヌクレオチドがチオホスホラミデートのヌクレオシド間結合を有することを示す
結合:
5’は、脂質部分がオリゴヌクレオチドの5’末端に結合することを示す
3’は、脂質部分がオリゴヌクレオチドの3’末端に結合することを示す
ヒト癌細胞型(すべてATCCより入手可能):
HT−3およびA431:子宮頚部癌
U−251:多形性グリア芽腫
DU145およびLNCaP:前立腺癌
Caki:腎臓明細胞癌
NCIH522:肺腺癌
Ovcar−5:卵巣癌
Hep3B:肝細胞癌
。
。
非結合オリゴヌクレオチドとともに本発明の2系統の化合物を、個々の詳細な研究のために選択した。選択した化合物(図9に示される)は、以下のとおりであった:
化合物A(非結合):配列TAGGGTTAGACAA(この配列は、hTR(配列番号1)の42〜54塩基に対して相補的である)のチオホスホラミデートオリゴヌクレオチド(図9A)
化合物B:3’パルミトイルアミドに結合した化合物Aのオリゴヌクレオチド(図9B)
化合物C:5’−パルミトイルアミド−アミノグリセロール−チオホスフェートに結合した化合物Aのオリゴヌクレオチド(図9C)。
これらの化合物の研究を、本実施例および以下の実施例で報告する。
上記表で示されるように、上記非結合オリゴヌクレオチドAは、その標的に対して、70℃の融解温度、および生化学アッセイにおける0.15nMのテロメラーゼ阻害のIC50値(ここでは、細胞取り込みは問題ではない)を伴って、非常に高い親和性結合を示した。化合物Aは、複数の異なる腫瘍細胞株においてテロメラーゼ阻害に対する低いマイクロモルのIC50を伴って(本実験では、HT−3細胞において1.6μM)、無傷細胞への良好な取り込み性を有するが、これは生化学的な効力と比較して、無傷細胞において約10,000倍の効力の損失を示す。オリゴヌクレオチド(それぞれ、化合物Cおよび化合物B)の5’末端または3’末端のいずれかへの脂質基の付加は、Tmを緩やかに低下させ(依然として、65.5℃〜66.5℃で、非常に高いままである)、そして上記非結合化合物Aと比較して生化学的効力を6分の1〜11分の1低下させた。しかしながら、非常に重要なことは、無傷細胞における脂質結合化合物Bおよび脂質結合化合物Cの効力は、これら化合物の生化学的効力と比較して、わずか約100分の1しか低下していないことである。より多くの細胞取り込みの結果として、化合物Bおよび化合物Cは、HT−3細胞において、上記非結合オリゴヌクレオチド(化合物A)と比較して、少なくとも10倍高い効力を示した。
非結合オリゴヌクレオチド化合物Aおよび脂質結合オリゴヌクレオチド化合物Cの、動物中において増殖する腫瘍中のテロメラーゼを阻害する能力を、以下の実験において比較した。DU−145腫瘍細胞を、胸腺欠損(nu/nu)マウスの両方の側腹部に接種した。その腫瘍(2腫瘍/マウス)が50mm3〜100mm3の大きさに達したとき、このマウスにPBS、FITC標識した化合物A、またはFITC標識した化合物C(両方の化合物を、40mg/kgで投与した)の単回尾静脈注射した。静脈注射の24時間後、マウスを屠殺し;一方の腫瘍を蛍光画像化用に収集し、他方の腫瘍をTRAPアッセイによるテロメラーゼ活性用に分析した。
骨髄腫を有する患者の血漿は、癌細胞によって産生される、特徴的な高いレベル(「骨髄腫スパイク」またはMタンパク質として検出される)の抗体を含む。Mタンパク質レベルの減少は、疾患の寛解と相関する。本実験では、非結合オリゴヌクレオチド化合物Aおよび脂質結合オリゴヌクレオチド化合物Cの、骨髄腫細胞を注入した動物におけるMタンパク質のレベルを減少させる能力を比較した。照射NOD/SCIDマウスに106個のCAG骨髄腫細胞を注入し、そして次いで、PBS、PBS中の化合物A、またはPBS中の化合物Cの腹腔内(IP)注射で処置した。化合物Aを、25mg/kg/日(175mg/kg/週×5週間)で投与し;化合物Cを、最初の2週間は25mg/kg/日で投与し、3週目はそのままでおき、そして次いで最後の2週間は1週間に3日間25mg/kg/日で投与した(5週間にわたって100mg/kg/週の平均投与量)。処置の終了時(接種の35日後)、そのマウスを屠殺し、そして骨髄腫タンパク質の決定のため、各々の群(4〜5匹のマウス/群)内で血漿をプールした。図6に示されるように、化合物Cの40%低い投与量にもかかわらず、化合物C群は低いレベルの骨髄腫タンパク質を示した(マウス1匹あたりに正規化した値)。
以下の実験では、非結合オリゴヌクレオチド化合物Aおよび脂質結合オリゴヌクレオチド化合物Cの、動物におけるヒト腫瘍の増殖を阻害する能力を比較した。NOD/SCIDマウスにCAG骨髄腫細胞を皮下接種し、そして腫瘍増殖の14日後、PBS、化合物A(25mg/kg/日 M−F、または125mg/kg/週)、または化合物C(25mg/kg MWF、または75mg/kg/週)のIP注射で処置した。図7に示されるように、40%低い投与量にもかかわらず、化合物Cは化合物Aよりもより大きな抗腫瘍効力を示した。(この研究において、化合物Aを、このモデルにおいて抗腫瘍効力に関連する以前の投与量(175mg/kg/週)よりも30%低い投与量で投与した)。
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